KR20190097972A - 우울증 동물 모델, 그의 제조 방법 및 용도 - Google Patents

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Abstract

우울증 동물 모델, 그의 제조 방법 및 용도에 관한 것이다. 일 실시예에 따른 우울증 동물 모델을 제조하는 방법에 따르면 종래 우울증 동물 모델의 제조 방법과 달리 외부 스트레스 자극 없이 우울증 동물 모델을 얻을 수 있으므로, 다인성 병인을 가진 우울증이나 불안 증상을 보이지 않는 우울증의 연구, 항우울제의 개발 및 스크리닝, 우울증의 발병 기전 연구에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

우울증 동물 모델, 그의 제조 방법 및 용도{Depressive disorder animal model, method for producing the same and uses thereof}
우울증 동물 모델, 그의 제조 방법 및 용도에 관한 것이다.
우울증(Depressive disorder)은 생각의 내용, 사고과정, 동기, 의욕, 관심, 행동, 수면, 신체활동 등 전반적인 정신 기능이 저하된 상태를 지칭한다. 우울증은 현재 세계적으로 유병률이 날로 증가하는 질환 중 하나로, 한국 역시 2006-2010년 건강보험 진료비 지급 자료를 분석한 결과, 우울증 환자가 17% 정도 증가하였고, 한해 평균 4%씩 증가하였다. 또한 세계 보건기구(WHO)에서는 2020년 세계 5대 부담 질병에 우울증을 포함시켰다. 이처럼 우울증으로 인한 무기력감, 자살, 집중력 및 기억력의 감퇴는 개인의 건강뿐만 아니라 생산성 저하로 이어져 사회의 막대한 경제적 손실을 야기할 수 있어 심각한 상황이므로, 우울증을 연구할 수 있는 우울증 동물 모델에 대한 연구가 필요하다.
종래 연구개발된 우울증 동물 모델은 보통 다양한 스트레스 자극을 급성 또는 만성으로 부여함으로써 동물에서 우울증을 유도하였다. 다양한 스트레스 자극으로는 신체 구금, 전기 자극, 태아 스트레스, 모노아민 박탈 약물, 엔도톡신, 염증성 사이토카인과 같은 염증성 물질의 투여가 있다. 이와 같은 방법으로 제조된 종래 우울증 동물 모델의 경우 스트레스 자극을 급성 또는 만성적으로 줘야 하므로 동물 윤리적인 문제가 발생하고 스트레스의 종류가 다양하므로 표준화하기 어려운 한계점이 있다. 또한, 모노아민 시스템의 변화에 국한된 기전을 가지고 있어 이종의 표현형(heterogeneous phenotype)을 갖는 우울증을 모두 반영할 수 없는 문제와 동물 모델이 불안 증상을 동반하는 문제가 있다. 즉, 기존의 우울증 동물 모델은 스트레스 자극 없이 발병하는 우울증 환자를 설명할 수 없었고, 다인성 병인을 가진 우울증을 연구하기에 부족하다.
따라서, 종래 우울증 동물 모델의 문제점으로 지적되어 왔던 상기 한계점들을 극복할 수 있는 동물 모델 및 이의 제조 방법에 대한 연구가 필요한 실정이다.
일 양상은 외부 스트레스 자극을 주지 않고,는, 그리고 중추신경계의 모노아민 신경전달물질의 변화를 유도하지 않는 새로운 우울증 동물 모델을 제조하는 방법으로서, 안지오텐신 전환 효소 억제제를 투여하는 단계를 포함하는 우울증 동물 모델을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
다른 양상은 상기 방법에 의해서 제조된 우울증 동물 모델을 제공하는 것이다.
다른 양상은 상기 우울증 동물 모델에 항우울제의 후보약물을 투여하는 단계를 포함하는 항우울제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
일 양상은 동물에 안지오텐신 전환 효소 억제제를 투여하는 단계를 포함하는 우울증 동물 모델을 제조하는 방법을 제공한다.
본 명세서에서 용어 "우울증(Depressive disorder)"은 의욕 저하와 우울감을 주요 증상으로 하여 다양한 인지 및 정신 신체적 증상을 일으켜 일상 기능의 저하를 가져오는 질환을 지칭하며, 감정, 생각, 신체 상태, 그리고 행동 등에 변화를 일으키는 심각한 질환이다.
본 명세서에서 용어 "안지오텐신 전환 효소(angiotensin converting enzyme: ACE) 억제제"는 안지오텐신 I으로부터으로부터 다이펩타이드(dipeptide, His-Leu)를 절단함으로서 혈관 수축 작용을 갖는 안지오텐신 Ⅱ로 전환시키는 역할을 하는 안지오텐신 전환 효소의 작용을 억제하는 기능을 작용제를 지칭한다. 안지오텐신 전환 효소 억제제는 조절 T 세포를 감소시킬 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 안지오텐신 전환 효소 억제제는 조절 T 세포를 감소시킬 수 있는 것이라면 어떠한 것에 제한되는 것은 아니고, 알라세프릴(Alacepril), 베나제프릴(Benazepril), 캅토프릴(Captopril), 실라자프릴(Cilazapril), 델라프릴(Delapril), 에날라프릴(Enalapril), 포시노프릴(Fosinopril), 이미다프릴(Imidapril), 리시노프릴(Lisinopril), 모엑시프릴(Moexipril), 페린도프릴(Perindopril), 퀴나프릴(Quinapril), 라미프릴(Ramipril), 테모카프릴(Temocapril) 및 조페노프릴(Zofenopril)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상, 또는 이들의 염을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 캅토프릴은 혈압 치료제로 사용된다.
상기 방법에서, 안지오텐신 전환 효소 억제제의 투여량은 통상의 기술자에 의하여 적절한 범위로 결정할 수 있다. 구체적으로, 상기 안지오텐신 전환 효소 억제제는 약 40mg/kg/일 이상, 예를 들어 약 4025mg/kg/일 내지 10055mg/kg/일, 약 4030mg/kg/일 내지 9050mg/kg/일, 약 4035mg/kg/일 내지 8045g/kg/일, 약 3840mg/kg/일 내지 4270mg/kg/일, 약 40mg/kg/일 내지 60mg/kg/일, 또는 약 40mg/kg/일 내지 50mg/kg/일의 농도로 투여되는 것일 수 있다. 상기 투여량은 한번에 투여되거나 수회에 나누어 투여될 수 있다.
상기 방법에서, 상기 안지오텐신 전환 효소 억제제는 21일 이상 투여되는 것일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서 상기 안지오텐신 전환 효소 억제제를 21일 이상 투여할 때부터 우울증 증세가 나타나는 것을 확인하였다. 따라서, 상기 안지오텐신 전환 효소 억제제는 21일부터 우울증 증상을 회복하고자 할 때까지 투여할 수 있다., 예컨대 21일 내지 ---일 동안 투여되는 것일 수 있다.
상기 "투여"는 동물에 어떠한 형태의 경로를 통해서도 수행될 수 있다. 상기 안지오텐신 전환 효소 억제제가 동물에 투여되어 효과를 나타낼 수 있는 한 제한 없이 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 구체적으로, 주사제로서 피하 주사, 복강내 주사, 혈관내 주사 등으로 투여하거나, 제제화하여 경구투여하거나, 사료 또는 식수에 첨가하여 섭취시키는 방식으로 투여할 수 있다.
상기 방법에서, 외부 스트레스 자극 없이 우울증 동물 모델을 제조하는 것일 수 있다. 종래 우울증 동물 모델을 제조하기 위해서, 외부의 신체적 및/또는 정신적 스트레스 자극, 예를 들어 신체 구금, 전기 자극, 태아 스트레스 등을 급성 또는 만성으로 받게 하였다. 이와 같은 방법으로 제조된 종래 우울증 동물 모델의 경우 스트레스 자극을 급성 또는 만성적으로 줘야 하므로, 동물 윤리적인 문제가 발생한다. 또한, 주어지는 스트레스의 종류가 다양하므로 우울증의 원인이나 증상을 표준화하기 어려운 한계점이 있다. 본 발명의 방법은 외부 스트레스 자극 없이 우울증 동물 모델을 제조하는 것을 특징으로 하므로, 동물 윤리적인 문제가 발생하지 않고 스트레스 자극 없이 우울증을 유발할 수 있어 스트레스 자극 없이 발병하는 우울증에 대해 연구할 수 있는 동물 모델을 제조할 수 있다.
상기 방법에서, 모노아민계 신경전달물질의 변화를 유도하지 않고 우울증 동물 모델을 제조하는 것일 수 있다. 종래 우울증 동물 모델을 제조하기 위해서, 중추신경계의 모노아민계 신경전달물질(도파민, 노르에피네프린, 세로토닌 등)의 변화를 유도하였다. 이와 같은 방법으로 제조된 종래 우울증 동물 모델의 경우 모노아민 가설에 기초하여 모노아민계의 변화에 국한된 기전을 가지므로, 다인성 병인을 가진 우울증을 연구하기에는 한계가 있었다. 상기 방법은 모노아민계 신경전달물질의 변화를 유도하지 않고 우울증 동물 모델을 제조하는 것을 특징으로 하므로, 다인성 병인을 가진 우울증에 대해 연구할 수 있는 동물 모델을 제조할 수 있다.
상기 방법에서, 동물은 인간에게 나타나는 각종 질환을 지닌 동물로, 몇 세대를 요하는 장기간의 유전 연구나 직접 인간을 대상으로 실험이 어려운 장기이식 실험 등 인체 질환 규명과 치료법 개발에 사용되는 동물 모델에 해당할 수 있는 인간을 제외한 동물을 제한 없이 포함한다. 구체적으로, 마우스, 랫트, 모르모트, 원숭이, 개, 고양이, 토끼, 소, 양, 돼지, 양 및 염소로 구성된 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. 상기 동물 중 마우스는 번식능력, 발육능력, 및 환경 적응능력이 좋고 자손의 수가 많아 실험군에 속하는 개체 수를 많이 확보할 수 있어 믿을만한 결과를 얻을 수 있으며, 조작이 간편한 장점이 있다.
다른 양상은 상기 방법에 의해서 제조된 우울증 동물 모델을 제공한다.
상기 우울증 동물 모델은 우울증 울증상, 또는 우울증 유사 행동(depressive-like behavior)을 나타내는 것일 수 있다. 본 명세서에서 "우울증 증상", 또는 "우울증 유사 행동"은 우울감, 자살 사고, 의욕상실, 무기력감, 피로감, 수면 장애, 성기능 장애, 집중력 저하, 식욕장애, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 우울증 증상 또는 우울증 유사 행동은 FST 및/또는 TST에 의해 평가할 수 있으며, 본 발명에 따른 우울증 동물 모델은 FST 및 TST에서 대조군인 정상 마우스동물에 비해 부동 시간의 증가를 나타내었다.
상기 우울증 동물 모델에 있어서, 불안 및 사회성의 변화를 나타내지 않는 것일 수 있다. 본 명세서에서 "사회성의 변화"란 사회성의 증가, 또는 감소를 의미할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 우울증 동물 모델은 SI 및 LD에서 대조군인 정상 동물과 유사한 수준의 불안 및 사회성을 나타내었다. 종래 우울증 동물 모델은 불안 및/또는 사회성의 변화를 보였으나, 상기 우울증 동물 모델은 불안 및/또는 사회성의 변화를 나타내지 않기 때문에, 본 발명의 동물 모델은 기존 우울증 동물 모델과 구별되는 병리 메커니즘(pathomechanism)을 갖는 새로운 것모델일 수 있다.
상기 우울증 동물 모델에 있어서, 안지오텐신 전환 효소 억제제의 투여 중단에 의해 우울증 증상이 회복되는 것일 수 있다. 상기 동물 모델은 안지오텐신 전환 효소 억제제의 투여를 중단, 또는 지속함으로써 우울증 증상을 조절할 수 있으므로, 우울증 연구에 유용하게 사용할 수 있다.
상기 우울증 동물 모델에 있어서, 말초 면역계의 변화에 의해 우울증 증상이 나타날 수 있다. 예를 들어, 상기 우울증 동물 모델은 정상 동물에 비해서 조절 T 세포 집단(Treg)이 감소하거나, 헬퍼 T 세포가 감소하거나, 전염증성 사이토카인의 수준이 증가될 수 있다.
상기 우울증 동물 모델에 있어서, 해마에서 소교세포 수가 증가하거나, 분지형 소교세포가 증가되거나, 글루코코르티코이드 수용체 단백질의 수준이 감소할 수 있다. 해마는 우울증에 관여하는 것으로 알려진 뇌의 영역의 하나이다.
상기 우울증 동물 모델에 있어서, 시상 하부에서 염증성 사이토카인의 변화가 없거나, 소교세포의 수와 형태가 변화하지 않을 수 있다. 시상 하부는 해마와 마찬가지로 우울증에 관여하는 것으로 알려진 뇌의 영역의 하나이다.
상기 우울증 동물 모델에 있어서, 우울증이 우울증 관련 인자, 예컨대 bdnf(Brain-derived neurotrophic factor)와 관련이 없거나, KYN 경로와 관련이 없거나, 세로토닌과 관련이 없을 수 있다. 구체적으로, 우울증이 해마에서 KYN 경로 관련 인자인 ido, kat, 및 kmo의 발현을 변화시키지 않거나, 해마에서 세로토닌 수용체인 5-HT1A 및 5-HT2A의 발현을 변화시키지 않거나, 안지오텐신 수용체인 AT1bR, AT1bR, 및 AT2R의 발현을 변화시키지 않을 수 있다.과 관련이 없을 수 있다.
상기 우울증 동물 모델에 있어서, 우울증은 해마에서 HPA 축(Hypothalamic-pituitary-adrenal axis) 활성화와 관련이 없을 수 있다. HPA 축은 주요 신경내분비계로서 스트레스에 대한 반응, 소화, 면역계, 감정과 기분, 성, 에너지 저장 및 소모를 포함하는 다양한 신체 과정을 조절하는 역할을 한다.
즉, 본 발명에 따른 우울증 동물 모델은 시존의 우울증 동물모델과 구별되는 새로운 병리 메커니즘을 갖는 것일 수 있다.
다른 양상은 상기 우울증 동물 모델에 항우울제의 후보약물을 투여하는 단계; 및 우울증 증상이 완화되는지 여부를 확인하는 단계를 포함하는 항우울제의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명에서 "후보약물"은 새롭게 합성된 또는 공지된 화합물합물로, 우울증의 예방 또는 치료에 효과를 나타낼 것으로 기대되는 물질을 제한 없이 포함할 수 있다.
상기 후보약물을 투여하여 우울증 증상, 예컨대 우울감, 자살 사고, 의욕상실, 무기력감, 피로감, 수면 장애, 성기능 장애, 집중력 저하, 또는 식욕장애의 완화가 관찰된다면 해당 후보약물이 우울증의 예방 또는 치료에 효과가 있는 물질로 판단할 수 있다.
상기 후보약물의 "투여"는 적절한 방법으로 개체에 소정의 물질을 도입하는 것을 의미한다. 상기 후보약물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강내 투여, 정맥내, 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여될일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
상기 스크리닝 방법에서, 우울증 증상이 완화되는지 여부를 확인하는 단계는 당업계에 공지된 방법, 예컨대 상기 우울증 동물 모델의 혈액 중 우울증 관련 표지의 농도의 측정, 개방형 필드 테스트(open field test: OFT), 명-암 탐험 평가(Light-dark exploration), 꼬리 매달기 테스트 (tail suspension test: TST), 사회적 상호 작용 테스트(Social interaction test: SI), 잠재적 억제 테스트(Latent inhibition: LI), 강제 수영 테스트 (Forced swim test: FST), 과당 선호 테스트(Sucrosepreference test), 사전 파동 억제 (Prepulse Inhibition: PPI) 테스트, 또는 이들의 조합에 의해 수행될 수 있다.
일 실시예에 따른 우울증 동물 모델을 제조하는 방법에 따르면 종래 우울증 동물 모델의 제조 방법과 달리 외부 스트레스 자극 없이 우울증 동물 모델을 얻을 수 있으므로, 다인성 병인을 가진 우울증이나 불안 증상을 보이지 않는 우울증의 연구, 항우울제의 개발 및 스크리닝, 우울증의 발병 기전 연구에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 우울증 유사 행동에 대한 캅토프릴의 용량 의존 효과를 확인하기 위한 TST 결과(A) 및 FST 결과(B)를 나타낸 그래프이다.
도 2는 우울증 유사 행동에 대한 캅토프릴의 시간 경과 효과를 확인하기 위한 TST 결과(A) 및 FST 결과(B)를 나타낸 그래프이다.
도 3은 불안 및 사회성에 대한 캅토프릴의 효과를 확인하기 위한 EPM 결과(A) 및 LD 결과(B)를 나타낸 그래프이다.
도 4는 불안 및 사회성에 대한 캅토프릴의 효과를 확인하기 위한 SI 결과를 나타낸 그림과 그래프이다.
도 5는 캅토프릴 세척의 효과를 평가하기 위한 TST 결과(A) 및 FST 결과(B)를 나타낸 그래프이다.
도 6은 이미프라민을 공동으로 처리함으로써 항우울 효과를 평가하기 위한 TST 결과(A) 및 FST 결과(B)를 나타낸 그래프이다.
도 7은 이미프라민을 후처리함으로써 캅토프릴에 의해 유도된 항우울 효과를 평가하기 위한 TST 결과(A) 및 FST 결과(B)를 나타낸 그래프이다.
도 8은 정상 대조군(CON)과 CHC 마우스에서의 유세포분석 결과 및 총 림프구에 대한 CD4+ CD25+ Foxp3+ 세포의 백분율을 나타낸 그래프이다.
도 9는 CHC 마우스의 장간막 림프절에서 tbx21, gata3, 및 foxp3의 mRNA 발현 수준을 qPCR로 확인한 그래프이다.
도 10은 CHC 마우스와 정상 마우스(CON)의 혈청에서 TNF-α의 mRNA 발현 수준을 각각 qPCR로 확인한 그래프이다.
도 11은 CHC 마우스와 정상 마우스(CON)의 혈청에서 IL-1β의 mRNA 발현 수준을 각각 qPCR로 확인한 그래프이다.
도 12는 CHC 마우스와 정상 마우스(CON)의 혈청에서 IL-6의 mRNA 발현 수준을 각각 qPCR로 확인한 그래프이다.
도 13은 CHC 마우스와 정상 마우스(CON)의 혈청에서 IL-17의 mRNA 발현 수준을 각각 qPCR로 확인한 그래프이다.
도 14는 CHC 마우스와 정상 마우스(CON)의 혈청에서 IL-4의 mRNA 발현 수준을 각각 qPCR로 확인한 그래프이다.
도 15는 CHC 마우스와 정상 마우스(CON)의 혈청에서 IL-10의 mRNA 발현 수준을 각각 qPCR로 확인한 그래프이다.
도 16은 CHC 마우스와 정상 마우스(CON)의 혈청에서 IFN-γ의 mRNA 발현 수준을 각각 qPCR로 확인한 그래프이다.
도 17은 CHC 마우스와 정상 마우스(CON)에서 안지오텐신 Ⅱ의 순환 수준을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 18은 CHC 마우스의 해마에서 우울증과 관련된 마커인 bdnf(Brain-derived neurotrophic factor), KYN 경로 관련 인자인 ido, kat, 및 kmo, 전-염증성 사이토카인 TNF-α, IL-1
Figure pat00001
, 및 IL-6, 세로토닌 수용체인 5-HT1A 및 5-HT2A, 안지오텐신 수용체인 AT1bR, AT1bR, 및 AT2R, 및 소교세포 기능 표현형 마커인 cx3cr1, cd200r, 및 p2ry12의 mRNA 발현 수준을 qPCR로 확인한 그래프이다.
도 19는 이미프라민 공동-처리군(+co-Imi), 우울증 마우스(CHC), 및 정상 마우스(CON)에서 tnf-α 및 il-6의 mRNA 발현 수준을 나타낸 그래프이다.
도 20은 정상 마우스(CON), 우울증 마우스(CHC), 및 이미프라민 공동-처리군(Co-Imi+CHC)의 해마에서 Iba-1에 대한 면역조직화학 연구를 수행한 결과를 나타낸 사진이다: 20X(좌측), 40X(우측). 또한 영역 mm2당 Iba-1 양성 세포의 수를 카운팅한 그래프이다.
도 21은 정상 마우스(CON)와 우울증 마우스(CHC)의 해마에서 GR 단백질의 수준을 확인한 사진 및 그래프이다.
도 22는 우울증 마우스의 시상 하부에서 전-염증성 사이토카인인 tnf-α, il-1β, 및 il-6의 mRNA 발현 수준을 qPCR로 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 23은 정상 마우스(CON) 및 우울증 마우스(CHC)의 시상 하부의 소교세포에서 Iba-1에 대한 면역조직화학 결과를 나타낸 사진이다: 4X 이미지.
도 24는 정상 마우스(CON) 및 우울증 마우스(CHC)의 해마에서 세로토닌(5-히드록시트립타민: 5-HT) 및 이의 주요 대사 산물인 히드록시인돌아세트산(hydroxyindoleacetic acid: HIAA)의 수준을 HPLC로 측정한 그래프이다.
도 25는 정상 마우스(CON) 및 우울증 마우스(CHC)의 시상 하부에서 코르티코트로핀-방출 호르몬(corticotropin-relieasing hormone: CRH)의 mRNA 발현을 qPCR로 확인한 그래프이다.
도 26은 정상 마우스(CON) 및 우울증 마우스(CHC)에서 혈청 글루코코르티코이드(Gc) 수준을 EIA 분석에 의해 측정한 그래프이다.
이하 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 우울증 동물 모델 제작
1.1 실험 동물
모든 실험에 20-25g의 7주령 수컷 C57BL/6 마우스 (Orient Bio Inc. Seoul, Korea)를 사용하였다. 케이지 당 5마리의 동물을 22±0.5℃에서 12 시간 동안의 명-암 사이클에서 번갈아 가며 유지하였다. 음식과 물은 자유롭게 섭취하게 하였다. 동물들은 실험이 시작되기 1주일 전에 실험실에 순응하도록 하였다. 모든 실험 절차는 CHA 대학의 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC130018 및 IACUC130025)의 승인을 받았다.
1.2 우울증 동물 모델 제작 및 우울증 확인
우울증 동물 모델을 제작하기 위하여, 상기 1.1과 같이 준비된 마우스에 캅토프릴을 투여하였다.
구체적으로, 캅토프릴 투여의 용량 의존 효과를 측정하기 위해, 캅토프릴(Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri)을 25mg/kg/일 또는 40mg/kg/일의 농도로 식수에 용해시켜 마우스에 투여했다.
또한, 캅토프릴 투여의 시간 경과 효과를 측정하기 위해, 캅토프릴 40mg/kg을 7일, 14일 및 21일 동안 식수에 용해시켜 마우스에 투여했다.
상기와 같이 제작한 마우스가 우울증 유사 행동을 나타내어 우울증 동물 모델로 사용될 수 있는지 여부를 확인하기 위하여, 다음과 같은 행동 실험을 수행하였다.
마우스는 행동 실험을 수행하기 전 적어도 30분 동안 실험실에 적응하도록 하였다. 모든 실험은 연속적인 실험으로 오전 9시부터 오후 4시 사이의 명(light) 단계에서 실시하였고, 하루에 한 번 실험을 수행하였다. 대조군(control: CON)은 아무 처리를 하지 않은 정상 마우스를 지칭한다. 만성 억제 스트레스군(chronic restraint stress: CRS)은 환기를 위한 코 구멍이 있는 50 mL 코닝 튜브에 넣어 하루에 2 시간(오전 11시-오후 1시)씩 21 일 동안 연속으로 억제 스트레스(restraint stress)를 부여한 마우스를 지칭한다. CRS군은 종래 우울증 마우스를 제조하는 방법인 억제 스트레스에 의해 마우스가 우울증을 갖도록 한 것으로, 양성 대조군으로서 사용하였다.
꼬리 매달기 테스트 (Tail suspensiontest : TST )
TST 장치는 상단에 부착된 후크가 있는 찬장으로 구성된다. 마우스의 꼬리 둘레에 접착 테이프를 감아 장치의 후크에 꼬리를 고정시킴으로써 마우스를 정지시켰다. 꼬리는 꼬리가 접히지 않도록 주의깊게 매달았고, 꼬리의 끝은 후크의 끝에서 2cm 떨어지도록 하였다. 꼬리를 올라간 마우스의 데이터는 테스트에서 제외하였다. 7 분간의 테스트 기간 동안 움직이지 않는 시간을 측정하였다. 두 관찰자들은 각 군에 대해 모르는 상태이고, 움직이지 않는 시간(부동 시간)을 측정하였다.
강제 수영 실험(Forced swimming test: FST)
우울증 유사 행동을 반영하는, 피할 수 없는 스트레스 상황에 대처하는 마우스의 능력을 평가하기 위하여 FST를 수행하였다. 마우스를 2L Pyrex 비이커 (직경 13cm, 높이 24cm)에 개별적으로 놓고, 17cm의 깊이로 23℃의 물을 채웠다. 모든 마우스를 6 분 동안 강제로 수영 시켰고, 실험의 마지막 5분 동안 부동 시간을 측정했다. 부동 시간은 마우스가 허우적거리지 않고 떠있거나 머리를 수면 위로 유지하는데 필요한 움직임만을 취하면서 소요된 시간으로 정의한다. 두 관찰자들은 각 군에 대해 모르는 상태이고, 움직이지 않는 시간을 측정하였다.
도 1은 우울증 유사 행동에 대한 캅토프릴의 용량 의존 효과를 확인하기 위한 TST 결과(A) 및 FST 결과(B)를 나타낸 그래프이다.
도 1에 나타낸 바와 같이, TST와 FST 의 결과가 일치하였다. 정상 마우스(CON)과 비교하여, 40mg/kg의 캅토프릴 투여군[Cap(40mg/kg)]에서 부동 시간이 유의적으로 증가하였으나, 25mg/kg의 캅토프릴 투여군[Cap(25mg/kg)]에서는 부동 시간이 변화하지 않았다. 양성 대조군(CRS)과 비교하여, 40mg/kg의 캅토프릴 투여군[Cap(40mg/kg)]의 부동 시간은 유사한 수준으로 측정되거나 더 긴 부동 시간을 나타내었다.
따라서, TST 및 FST 결과에 의해 40mg/kg의 캅토프릴 투여군에서 우울증 유사 행동이 나타났음을 확인하였다.
도 2는 우울증 유사 행동에 대한 캅토프릴의 시간 경과 효과를 확인하기 위한 TST 결과(A) 및 FST 결과(B)를 나타낸 그래프이다.
도 2에 나타낸 바와 같이, TST와 FST의 결과가 일치하였다. 정상 마우스(CON)와 비교하여, 40mg/kg 캅토프릴의 7일 투여군[Cap(7d)], 40mg/kg 캅토프릴의 14일 투여군[Cap(14d)]의 부동 시간은 변화하지 않았으나, 40mg/kg 캅토프릴의 21일 투여군[Cap(21d)]의 부동 시간은 유의적으로 증가하였다. 양성 대조군(CRS)과 비교하여, 40mg/kg 캅토프릴의 21일 투여군[Cap(21d)]의 부동 시간은 유사한 수준으로 측정되거나 더 긴 부동 시간을 나타내었다.
따라서, TST 및 FST 결과에 의해 40mg/kg의 캅토프릴을 21일 이상 투여함으로써 마우스에서 우울증 유사 행동이 나타났음을 확인하였다.
상기 결과를 종합하여, 만성 고농도 캅토프릴(chronic high-dose captopril: CHC)의 처리에 의해 마우스가 우울증 유사 행동을 나타냄을 확인하였다. 이하에서 우울증 마우스를 "CHC"로 지칭하고, 이는 40mg/kg/일 농도의 캅토프릴을 21일 이상 동안 투여한 군으로 정의한다.
실험예 1. 우울증 마우스의 불안 및 사회성 평가
상기 실시예 1에 따라 제작한 우울증 마우스에서 불안 및 사회성을 평가하기 위하여, 다음과 같은 실험을 수행하였다.
위로 올려진 십자 형태의 미로(elevated plus maze: EPM )
EPM 장치는 흰색 무광택 플렉시 유리로 만든 4 개의 열린 지붕 팔 (30Х5cm)로 구성된다. 두 개의 반대편 팔은 20-cm 높이 벽으로 닫혀있고(닫힌 팔), 나머지 두 팔은 벽을 갖지 않는다(열린 팔). 4 개의 팔은 중앙에 5Х5cm의 정사각형을 중심으로 서로 90°로 배치된다. 장치는 바닥에서 30cm 높게 상승된다. 초기에 마우스는 실험 장치로부터 열린 팔 중 하나를 향하여 장치의 중앙에 놓여졌고, 장치를 자유롭게 5 분 동안 탐험할 수 있게 하였다. 열린 팔과 닫힌 팔을 출입하는 수를 기록하고 각 팔에서 소비된 시간을 EthoVision XT9 비디오 추적 시스템을 사용하여 기록하였다.
명-암 탐험(Light-dark exploration: LD)
불안 유사 행동을 평가하기 위해 밝은 빛과 열린 공간을 피하는 경향을 조사하는 LD를 수행하였다. 구체적으로, 이 평가에 사용된 장치는 밀폐된 암실에 연결된 하나의 개방된 밝은 챔버로 구성된 박스 (30Х30Х30cm)이다. 챔버는 작은 사각형 구멍 (7Х7cm)으로 연결된다. 어두운 챔버로부터 멀어지는 방향으로 밝은 챔버의 모서리에 마우스를 위치시키고, 챔버 사이의 이동 횟수 및 어두운 챔버에서 머문 시간을 수동으로 10 분 동안 측정하였다.
사회적 상호작용(social interaction: SI )
SI는 공지된 방법으로 수행하였다. 구체적으로, 시도 1(empty)에서, 마우스를 한쪽 끝에 비어있는 와이어 메쉬 케이지가 있는 영역에 두었다. 마우스가 없는 경우 그들의 움직임을 2.5분 동안 모니터링하였다. 시도 2(social)에서, 마우스를 철망 케이지에 넣고 실험 대상 마우스를 넣고 2.5 분간 움직임을 기록하였다. 사회적 회피 행동 테스트에서 활동도는 EthoVision XT9 비디오 추적 시스템을 사용하여 비디오를 기록하고 분석하였다.
도 3은 불안 및 사회성에 대한 캅토프릴의 효과를 확인하기 위한 EPM 결과(A) 및 LD 결과(B)를 나타낸 그래프이다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 정상 마우스(CON)와 비교하여, CHC 마우스가 열린 팔에 머문 시간과 어두운 영역에서 머문 시간에 유의적인 차이가 없었다.
도 4는 불안 및 사회성에 대한 캅토프릴의 효과를 확인하기 위한 SI 결과를 나타낸 그림과 그래프이다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 정상 마우스(CON)와 CHC 마우스가 어두운 영역에서 머문 시간은 비슷한 수준으로, 사회적 상호작용은 유사한 양상을 나타내어 유의적인 차이가 없었다.
따라서, 캅토프릴은 우울증 마우스에서 불안 및 사회성에 영향을 주지 않음을 확인하였다.
실험예 2. 캅토프릴 세척의 효과 평가
캅토프릴 세척(washout)의 효과를 평가하기 위해, 캅토프릴 세척 마우스에서 우울증 증상을 확인하였다. 구체적으로, 21일 동안 캅토프릴을 투여한 CHC 마우스에 대하여 22일차부터는 식수에서 캅토프릴을 제거하고 7일 동안 일반 식수를 제공하여 캅토프릴 세척 마우스를 제작하였다.
캅토프릴 세척 마우스(CHC+Washout), 정상 마우스(CON), 및 우울증 마우스(CHC)에 대하여 상기 실시예에 기재한 바와 같은 방법으로 TST 및 FST를 수행하였다.
도 5는 캅토프릴 세척의 효과를 평가하기 위한 TST 결과(A) 및 FST 결과(B)를 나타낸 그래프이다.
도 5에 나타낸 바와 같이, TST와 FST의 결과가 일치하였다. 정상 마우스에 비해 부동 시간이 유의적으로 증가한 우울증 마우스에 비하여, 캅토프릴 세척 마우스의 부동 시간은 유의적으로 감소하였다.
따라서, 캅토프릴의 투여를 중단한 후 7일 동안의 캅토프릴 세척에 의해 우울증 유사 행동이 정상 수준으로 회복되었음을 확인하였다.
실험예 3. 이미프라민 공동-처리에 의한 항우울 효과 평가
이미프라민(imipramine)은 삼환계 항우울제이다. 캅토프릴과 이미프라민의 공동-처리에 의한 항우울 효과를 평가하기 위하여, 이미프라민(Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri) 20 mg/kg을 생리적으로 정상인 식염수에 용해시키고 캅토프릴을 투여하는 동안 하루 1 회 복강내로 처리 함으로써 이미프라민 공동-처리군을 제작하였다.
이미프라민 공동-처리군(co-Imi+CHC), 정상 마우스(CON), 및 우울증 마우스(CHC)에 대하여 상기 실시예에 기재한 바와 같은 방법으로 TST 및 FST를 수행하였다.
도 6은 이미프라민을 공동으로 처리함으로써 항우울 효과를 평가하기 위한 TST 결과(A) 및 FST 결과(B)를 나타낸 그래프이다.
도 6에 나타낸 바와 같이, TST와 FST의 결과가 일치하였다. 정상 마우스(CON)에 비해 부동 시간이 유의적으로 증가한 우울증 마우스(CHC)에 비하여, 이미프라민 공동-처리군(co-Imi+CHC)의 부동 시간은 정상 마우스와 유사한 수준으로 감소하였다.
따라서, 캅토프릴의 투여에 의해 나타난 우울증 유사 행동이 항우울제인 이미프라민을 캅토프릴과 공동으로 처리하는 경우, 정상 수준으로 감소하였으므로 캅토프릴에 의해 유도된 우울증은 항우울제의 처리에 의해 회복되므로,복될 수 캅토프릴의 투여에 의해 나타난 우울증 유사 행동이 다른 질병에 의해 발생한 움직임 문제가 아닌 것을 확인하였다.
실험예 4. 이미프라민 -후처리에 의한 항우울 효과 평가
캅토프릴에 의한 우울증 유도 후 이미프라민을 처리하여 이의 항우울 효과를 평가하기 위하여, 상기 실시예와 같이 캅토프릴을 21일 동안 처리한 후에 이미프라민(Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri) 20 mg/kg을 추가적으로 처리하였다. 이미프라민을 생리적으로 정상인 식염수에 용해시키고 캅토프릴 투여를 중단한 후 14일 동안 하루 1 회 복강내로 처리 함으로써 이미프라민 후-처리군을 제작하였다.
이미프라민 후-처리군(CHC+post-Imi), 정상 마우스(CON), 및 우울증 마우스(CHC)에 대하여 상기 기재한 바와 같은 방법으로 TST 및 FST를 수행하였다.
도 7은 이미프라민을 후처리함으로써 캅토프릴에 의해 유도된 항우울 효과를 평가하기 위한 TST 결과(A) 및 FST 결과(B)를 나타낸 그래프이다.
도 7에 나타낸 바와 같이, TST와 FST의 결과가 일치하였다. 정상 마우스(CON)에 비해 부동 시간이 유의적으로 증가한 우울증 마우스(CHC)에 비하여, 이미프라민 후-처리군(CHC+post-Imi)의 부동 시간은 정상 마우스와 유사하거나 그 이하의 수준으로 감소하였다.
따라서, 캅토프릴의 투여에 의해 나타난 우울증 유사 행동이, 캅토프릴의 투여 중단 후에 항우울제인 이미프라민을 처리함으로써 정상 수준으로 감소하였으므로 캅토프릴에 의해 유도된 우울증은 항우울제의 처리에 의해 회복될 수 있음을 확인하였다.
실험예 5. 캅토프릴에 의해 유도된 우울증 유사 행동과 말초 면역계의 관련성 확인
먼저, 조절 T 세포(regulatory　T　cells: Tregs) 집단에 대한 캅토프릴의 효과를 확인하기 위해, CHC 마우스의 비장에서 Treg 집단을 유세포분석으로 측정하였다.
구체적으로, 마우스의 비장을 37℃에서 30분 동안 RPMI 배지 (Gibco, Carlsbad, CA)에서 콜라게나제 IV (SigmaAldrich, St.Louis, MO)와 DNase I (Sigma-Aldrich)로 소화시키고, 40㎛ 거즈(BD Biosciences, San Jose, CA)를 사용하여 여과시켜서 단일 세포 현탁액을 생성하였다. 세포를 고정하고 투과성으로 만들고 마우스 조절 T 세포 염색 키트 (eBioscience, San Diego, CA, 88-8118-40)로 염색 하였다. 조절 T 세포를 측정하고 제조자의 지시에 따라 분석 하였다. 표면 단백질인 CD4, CD25 및 세포 내 단백질 FoxP3에 대한 항체를 사용하여 5x106/mL의 세포를 면역 표지 하였다. 요약하면, 세포를 CD4-FITC 및 CD25-PE 또는 아이소 타입 매치된 대조 항체에서 20 내지 23.5℃에서 20 분 동안 어둠 속에서 배양 하였다; 세포를 1 mL의 염색 완충액으로 세척하고 어둠 속에서 20-23.5℃에서 10 분 동안 마우스 조절 T 세포 염색 키트에 제공된 고정 완충액으로 세척하였다. 세포를 투과성 완충액으로　20-23.5℃에서 1 시간 동안 처리한 다음 1 mL의　염색 완충액으로 세척하였다. 세척 후, 세포를 APC 접합 항 마우스 FoxP3 또는 아이소 타입 대조군에서 적어도 30 분 동안 어둠 속 20-23.5℃에서 배양하였다. 배양이 끝나면 세포를 세척하고 염색 완충액에 재현탁하였다. BD FACS Calibur로 데이터 수집을 수행하고 데이터를 FlowJo 소프트웨어 (Treestar Inc., Ashland, OR)로 분석하였다.
도 8은 정상 대조군(CON)과 CHC 마우스에서의 유세포분석 결과 및 총 림프구에 대한 CD4+ CD25+ Foxp3+ 세포의 백분율을 나타낸 그래프이다. 각 군에서 n=3이다.
도 8에 나타낸 바와 같이, 고농도 캅토프릴의 만성 투여는 마우스의 비장에서 Treg 집단을 유의적으로 감소시킨 것을 확인하였다.
또한, 마우스의 장간막 림프절에서 T 세포의 다양한 아형과 관련이 있는 mRNA 마커를 분석하기 위하여, 마우스의 장간막 림프절을 절단하여 T 헬퍼 1 세포(Th1)의 마커인 tbx21, T 헬퍼 2 세포(Th2)의 마커인 gata3, 및 Treg의 마커인 foxp3의 mRNA 발현 수준을 qPCR로 측정하였다.
구체적으로, 상기와 같이 21 일 동안 캅토프릴을 투여한 후 장간막 림프절을 해부하였다. RNA 추출을 위해, 동결 조직을 조직 100mg 당 1mL의 QIAzol 시약(Qiagen, Valencia, CA)으로 균질화하였다. 클로로포름을 가하여 RNA를 함유하는 상을 분리하고, 이소프로필 알콜을 첨가하여 RNA를 침전시켰다. 침전된 RNA 펠렛을 공기 건조 후 DEPC-처리수 (Bioneer, 성남, 한국)에 재용해시켰다. 260nm에서의 흡광도에 의해 RNA 농도의 정량화를 수행하였다. RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit (Thermo scientifc)를 사용하여 1㎍의 messenger RNA (mRNA)를 20μL의 반응 믹스에서 cDNA로 역전사시켰다. 정량적 PCR은 Power SYBR® Green PCR Master Mix (Life technologies, Warrington, UK)를 사용하여 수행하였다. 본 명세서에서 사용한 프라이머 서열은 표 1에 열거하였다. 사이클 조건은 95℃에서 5분 동안의 초기 효소 활성화, 95℃에서 20초 동안의 변성, 어닐링, 및 40초 동안의 PCR에 결합된 SYBR Green의 검출을 포함하는 연장 56℃에서의 반응이다. GAPDH(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase)를 정규화를 위한 대조군으로 사용하였다. PCR 단편의 상대적 양은 비교 CT 방법을 사용하여 계산하였다. 각 군에서 n=8-15이다.
프라이머 정방향(5'->3') 역방향(5'->3') PCR
생성물(bp)
Tbx21 CAACAACCCCTTTGCCAAAG TCCCCCAAGCAGTTGACAGT 108 bp
Gata3 AGAACCGGCCCCTTATCAA AGTTCGCGCAGGATGTCC 71
Foxp3 GAACCCAATGCCCAACCCTAG TTCTTGGTTTTGAGGTCAAGGG 1311
BDNF TGCAGGGGCATAGACAAAAGG CTTATGAATCGCCAGCCAATTCTC 109
IDO TGTGAATGGTCTGGTCTC CTGTGCCCTGATAGAAGT 238
KAT GTTCTCCACACACAAGTCTC GGATCCATCCTGTCAGTCA 524
KMO GGTCGCCTTCACCAGAATAA ATCCAGGCAGGTCTTCTCAA 176
TNF-α GAGTCCGGGCAGGTCTACTTT CAGGTCACTGTCCCAGCATCT 234
IL-1
Figure pat00002
 GGCTGGACTGTTTCTAATGC ATGGTTTCTTGTGACCCTGA 133
IL-6 CCACTTCACAAGTCGGAGGCTTA GCAAGTGCATCATCGTTGTTCATAC 111/172
5-HT1A CTGTTTATCGCCCTGGATG ATGAGCCAAGTGAGCGAGAT 157
5-HT2A CCGCTTCAACTCCAGAACCAAAGC CTTCGAATCATCCTGTACCCGAA 108
AT1aR GGACACTGCCATGCCCATAAC TGAGTGCGACTTGGCCTTTG 144
AT1bR CTGCTATGCCCATCACCATCTG GATAACCCTGCATGCGACCTG 147
AT2R GCACCAATGAGTCCGC AGGGAGGGTAGCCAAA 214
Cx3cr1 TGGCCCAGCAAGCATAG CATGTCTGCTACCCTCACAAA 93
Cd200r AAATGCAAATTGCCAAAATTAGA GTATAGCTAGCATAAGGCTGCATTT 73
P2ry12 GGGCGTACCCTACAGAAACA TGTTGACACCAGGCACATCC 204
CRH GTTAGCTCAGCAAGCTCACAG GCCAAGCGCAACATTTCATTT 69
도 9는 CHC 마우스의 장간막 림프절에서 tbx21, gata3, 및 foxp3의 mRNA 발현 수준을 qPCR로 확인한 그래프이다.
도 9에 나타낸 바와 같이, Th2의 마커인 gata3와 Treg의 마커인 foxp3의 mRNA 발현은 CHC 마우스의 장간막 림프절에서 유의적으로 감소하였고, Th1의 마커인 tbx21 mRNA 발현에 유의한 변화는 없었다.
또한, CHC와 염증과 관련된 혈청 사이토카인의 관련성을 확인하기 위해서, CHC 마우스와 정상 마우스(CON)의 혈청에서 전-염증성 사이토카인 및 항-염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-17, IL-4, IL-10 및 IFN-γ의 mRNA 발현 수준을 Bio-Rad Bio-Plex® assay (Bio-Rad, Hercules, USA)를 이용하여 확인하였다.
도 10-16은 CHC 마우스와 정상 마우스(CON)의 혈청에서 TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-17, IL-4, IL-10 및 IFN-γ의 mRNA 발현 수준을 각각 qPCR로 확인한 그래프이다.
도 10-16에 나타낸 바와 같이, 캅토프릴의 투여는 염증성 사이토카인 TNF-α, IL-17, IL-4, IL-10 및 IFN-γ의 mRNA 발현 수준에는 유의한 영향을 주지 않았다. 한편, IL-1β 및 IL-6의 mRNA 발현 수준은 정상 대조군(CON)에 비해서 CHC 마우스에서 유의적으로 증가하였다.
또한, 안지오텐신 전환 효소 억제제인 캅토프릴이 혈청 안지오텐신 Ⅱ의 수준에 영향을 주는지 확인하기 위해서, 효소면역측정법(Enzyme Immunoassay: EIA)으로 CHC 마우스와 정상 마우스(CON)에서 혈청에서 안지오텐신 Ⅱ의 순환 수준을 측정하였다. 구체적으로, 마우스를 희생시키고 심장 찌르기로 전혈을 채취하였다. 전혈에서 혈청을 분리하고 분석을 수행할 때까지 -80℃에서 보관하였다. 보관된 혈?에서 안지오텐신 Ⅱ EIA 키트를 사용하여 제조사(Pheonix Pharmaceuticals, Burlingame,CA, USA)의 지침에 따라 혈청 안지오텐신 Ⅱ의 수준을 측정하였다. 각 군에서 n=8-10이다.
도 17은 CHC 마우스와 정상 마우스(CON)에서 혈청 안지오텐신 Ⅱ의 순환 수준을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 17에 나타낸 바와 같이, 안지오텐신 I을 안지오텐신 Ⅱ로 전환하는 안지오텐신 전환 효소에 대한 억제제인 캅토프릴을 투여했음에도 불구하고, CHC 마우스는 정상 마우스(CON)에 비해 안지오텐신 Ⅱ의 혈청 농도가 더 높게 확인되었다.
종합하면, 캅토프릴의 투여에 의해 말초 면역계에 변화가 생겼고, 캅토프릴에 의해 유도된 우울증 유사 행동은 말초 면역계과 연관되어 있음을 확인하였다.
실험예 6. 캅토프릴의 투여가 소교세포의 활성에 미치는 영향 평가
해마는 우울증과 관련된 주요 뇌 영역으로 알려져 있다. 해마에서 캅토프릴의 효과를 확인하기 위해서, 염증성 사이토카인과 소교세포의 변화를 평가하였다.
구체적으로, 캅토프릴의 투여에 의해 제작된 CHC 마우스의 해마에서, 우울증과 관련된 마커인 bdnf(Brain-derived neurotrophic factor), KYN 경로 관련 인자인 ido, kat, 및 kmo, 전-염증성 사이토카인 TNF-α, IL-1β, 및 IL-6, 세로토닌 수용체인 5-HT1A 및 5-HT2A, 안지오텐신 수용체인 AT1bR, AT1bR, 및 AT2R, 및 소교세포 기능 표현형 마커인 cx3cr1, cd200r, 및 p2ry12의 mRNA 발현 수준을 qPCR로 확인하여 도 18에 나타내었다.
도 18에 나타낸 바와 같이, 전-염증성 사이토카인인 tnf-α 및 il-6의 mRNA 발현 수준이 해마에서 증가하였다. 반면, bdnf, KYN 경로 관련 인자, 소교세포 기능 표현형 마커, 안지오텐신 수용체 및 세로토닌 수용체 마커는 해마에서 캅토프릴의 고용량 만성 투여에 의해 변화하지 않았다.
따라서, 캅토프릴의 처리에 의해 제작한 본 발명의 우울증 마우스는 우울증 관련 인자이며 항우울 연구의 주요 타겟으로 생각되는 BDNF, 세로토닌, 및 KYN 경로와는 관련이 없음을 확인하였다.
또한, 캅토프릴의 처리에 의해 해마에서 증가한 TNF-α 및 IL-6의 mRNA 발현 수준이 항우울제인 이미프라민의 처리에 의해 정상 수준으로 회복되는지 확인하기 위해서, 상기 실시예에서 기술한 바와 같이 이미프라민 공동-처리군(+Co-Imi)에서 TNF-α 및 IL-6의 mRNA 발현 수준을 확인하여 도 19에 나타내었다. CT 값은 대조군을 1로 한 비율로 정규화하였고 RQ 값은 대조군의 퍼센트로서 각각의 전사 인자의 비율을 나타낸다. 각 군에서 n=7-12이다.
도 19는 이미프라민 공동-처리군(+co-Imi), 우울증 마우스(CHC), 및 정상 마우스(CON)에서 tnf-α 및 il-6의 mRNA 발현 수준을 나타낸 그래프이다.
도 19에 나타낸 바와 같이, 캅토프릴의 처리에 의해 정상 마우스와 비교하여 우울증 마우스에서는 tnf-α 및 il-6의 mRNA 발현 수준이 유의적으로 증가하였고, 증가한 tnf-α 및 il-6의 mRNA 발현 수준은 이미프라민의 공동-처리에 의해 정상 수준으로 회복되었다.
또한, 소교세포의 수와 형태 변화를 분석하기 위해서, Iba-1을 이용한 면역조직화학염색을 수행하였다. 구체적으로, 관류를 위해 CHC 처리 후 마우스를 희생하였다. 모든 마우스는 펜토바르비탈(100mg/kg, i.p.)로 완전히 마취한 후, 생리 식염수를 처리하고 차가운 인산염 완충된 4% 파라포름알데이드(pH 7.4)로 심장을 통해 관류하였다. 뇌 전체를 해부하여 4℃에서 4시간 동안 같은 고정액에서 후고정시켰다. 그런 다음 뇌 블록을 4℃에서 24 시간 동안 30% 수크로오스에서 동결 보존 하였다. 25mm의 두께로 절편을 전자 크리오톰으로 절단하였다. 면역조직화학염색은 Elite ABC Kit(Vector Laboratories)를 사용하여 수행하였다. 절편을 0.1M 소혈청알부민으로 각각 10 분씩 3 회 헹구고, 1% 소혈청알부민과 0.2% TritonX-100을 함유하는 0.1M PBS에서 30 분간 예비 배양 하였다. 0.5% BSA를 함유하는 0.1M PBS로 각각 10-15 분 동안 두 번 헹구고난 후, 0.5% BSA 및 0.05% 소듐 아자이드를 함유하는 0.1M PBS로 희석시킨 항-Iba-1 항체 (1:300; Wako, Cat. # 019-19741)와 4℃에서 배양하였다. 밤새 배양한 후 절편을 헹구고 실온에서 1시간 동안 0.5% BSA를 함유하는 0.1M PBS로 희석한 비오틴화된 항-토끼 IgG 2 차 항체 (벡터) 1:200과 배양 하였다. 헹구고 나서, 절편을 실온에서 1 시간 동안 PBS로 희석 한 ABC 시약 1:200과 배양한 후, PBS로 씻고 0.1M 인산 완충액으로 헹구었다. 마지막으로, 원하는 염색 강도가 나타날 때까지 절편을 SIGMA FAST DAB kit (Sigma)에서 배양하였다. 절편을 0.05 mol/L 인산염 완충액으로 헹군 후 절편을 차등 에탄올로 탈수하고 히스토클리어(Fisher)로 세척한 후 Permount(Fisher)를 사용하여 커버슬립으로 덮었다.
조직학적 분석을 위해, 해마 내의 Iba-1 양성 뉴런의 수는 각 마우스에 대해 세 부분에서 카운팅하였다. 첫번째 부분(양측 귀 2.10 mm, 브레그마 -1.70 mm)부터 시작하여 0.135 mm 증가로 세 개의 관상 단면에서 카운팅하였다. Iba-1에 면역 반응이 있는 세포의 수는 동일한 뇌 영역(Nikon)에서 현미경을 사용하여 두 명의 시각 장애인 관찰자에 의해 카운팅 하였다. 시상 하부의 이미지에서 절편은 양측 귀 3.34 mm, 브레그마- 0.46 mm의 수준에서 양측 귀 1.50 mm, 브레그마-2.30 mm로 0.135 mm의 증가로 측정하였다.
도 20은 정상 마우스(CON), 우울증 마우스(CHC), 및 이미프라민 공동-처리군(Co-Imi+CHC)의 해마에서 Iba-1에 대한 면역조직화학 연구를 수행한 결과를 나타낸 사진이다: 20X(좌측), 40X(우측). 또한 영역 mm2당 Iba-1 양성 세포의 수를 카운팅한 그래프이다.
도 20에 나타낸 바와 같이, 우울증 마우스(CHC)에서는 정상 마우스(CON)에 비해서 Iba-1 양성 세포의 수가 현저히 증가하였다. 캅토프릴과 이미프라민의 공동-처리군(Co-Imi+CHC)에서는 Iba-1 양성 세포의 수가 정상 마우스 수준으로 회복되었다. 또한, 우울증 마우스에서는 분지형(ramified) 소교세포 형태가 나타났다가 캅토프릴과 이미프라민의 공동-처리에 의해 정상 마우스의 소교세포 형태로 회복되었다.
따라서, 캅토프릴의 처리에 의해 해마 내의 소교세포 수가 증가하고 분지형의 소교세포가 많이 발견되었고, 이러한 소교세포의 증가와 분지형태는 항우울제인 이미프라민의 공동-처리에 의해 정상 수준으로 회복되는 것을 확인하였다.
또한, 해마에서 캅토프릴의 영향을 확인하기 위해서 해마 내 글루코코르티코이드 수용체(glucocorticoid receptor: GR)의 단백질 수준을 웨스턴 블롯팅에 의해 측정하였다.
구체적으로, 해마를 절단한 후, 조직을 차가운 Tris 완충 식염수 (TBS, 20 mM Trizma 염기 및 137 mM NaCl, pH 7.5)로 2 회 세척 하였다. 세척 직후, 조직을 0.1mM Na3VO4, 3 mg/ml 아프로티닌 및 20 mM NaF를 함유하는 SDS 용해 완충액 (62.5 mM Trizma 염기, 2% w/v SDS, 10% 글리세롤)으로 용해시켰다. DNA를 자르고 점도를 줄이기 위해 짧은 초음파 처리 후 표준 단백질로 소 혈청 알부민을 사용하는 계면활성제 호환 단백질 분석 시약 (Bio-Rad Laboratories)으로 단백질 농도를 측정했다. DTT(dithiothreitol, 5 mM) 및 브로모페놀블루 (0.1% w/v)를 첨가한 후, 단백질을 끓여서 10% 폴리아크릴아미드 겔(Invitrogen)에서 전기영동으로 분리하고, PVDF 멤브레인(Bio-Rad Laboratories)으로 트랜스퍼하였다. 멤브레인을 실온에서 1시간 동안 진탕기에서 차단시켰다. 차단 완충액은 TBST(트리스 완충 식염수/0.1% Tween-20) 및 5% 탈지유로 구성된다. 1차 항체를 차단 완충 용액에 용해시키고, 멤브레인을 글루코코르티코이드 수용체 (GR; 1:1000, 산타 크루즈, Sc-1004) 및 베타-액틴 (1:1000, Cell Signaling, 4970)에 대한 항체로 4℃에서 밤새 면역블롯하였다. 멤브레인을 차단 완충액에 용해 된 항-토끼 (1:2000, Cell Signaling, 7074)에서 실온에서 80분 동안 배양 하였다. 멤브레인을 ECL-plus 용액(Amersham Pharmacia Biotech)으로 시각화 하였다. 그런 다음, 멤브레인을 화학발광(LAS-4000, Fujiflm)에 노출하여 빛 방출을 검출하였다. 웨스턴 블롯 결과는 필름의 농도 측정 스캐닝을 한 후 ImageJ 1.51 소프트웨어 (National Institutes of Health, Bethesda, MD)를 사용하여 정량화하였다.
도 21은 정상 마우스(CON)와 우울증 마우스(CHC)의 해마에서 GR 단백질의 수준을 확인한 사진 및 그래프이다.
도 21에 나타낸 바와 같이, 정상 마우스와 비교하여 우울증 마우스의 해마에서는 GR 단백질의 수준이 유의적으로 감소하였다.
또한, 해마 이외의 다른 뇌 영역에 대해 캅토프릴이 미치는 영향을 확인하기 위해서, 우울증과 연관된 것으로 알려진 시상 하부에서 상기와 같은 실험을 반복하였다.
도 22는 우울증 마우스의 시상 하부에서 전-염증성 사이토카인인 tnf-α, il-1β, 및 il-6의 mRNA 발현 수준을 qPCR로 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 22에 나타낸 바와 같이, 우울증 마우스의 시상 하부에서 tnf-α, il-1β, 및 il-6의 mRNA 발현 수준이 변화하지 않았다.
도 23은 정상 마우스(CON) 및 우울증 마우스(CHC)의 시상 하부의 소교세포에서 Iba-1에 대한 면역조직화학 결과를 나타낸 사진이다: 4X 이미지. 상기 이미지는 브레그마 수준-0.46 mm(좌)에서 브레그마 수준-2.06mm(우)에서 취하였다. 각 군에서 n=10-15이고, 스케일바=50μm이다.
도 23에 나타낸 바와 같이, 정상 마우스와 우울증 마우스의 시상 사부의 Iba-1 양성 세포의 수에는 변화가 없었다.
따라서, 캅토프릴의 투여는 우울증 마우스의 시상 하부에서 염증성 사이토카인 및 소교세포에 영향을 주지 않는 것을 확인하였다.
실험예 7. 캅토프릴의 세로토닌 시스템 및 마우스 뇌의 HPA 축에 대한 영향 평가
우울증과 관련된 다른 경로에 대한 만성 고농도 캅토프릴 투여의 효과를 확인하기 위해서, 뇌에서 모노아민계 및 HPA 축과 관련된 인자를 평가하였다. HPA 축(Hypothalamic-Pituitary-Adrenal Axis)은 주요 신경내분비계로서 스트레스에 대한 반응과 소화, 면역계, 감정과 기분, 성, 에너지 저장 및 소모를 포함하는 다양한 신체 과정을 조절하는 것으로 알려져 있다. HPA 축은 우울증에서 항진되어 혈중 코티솔 증가, ACTH 증가 등이 나타나기도 한다.
구체적으로, 21 일 동안의 캅토프릴 투여 후 즉시 마우스를 희생시켰다. 마우스의 뇌 조직 블록을 얼음 속에서 빠르게 해부하고 차가운 0.4M 과염소산으로 균질화한 다음 얼음에서 1 시간 동안 두었다. 4℃에서 30 분 동안 21,130g에서 원심 분리한 후, 상등액을 적절한 컬럼 (# Sc1000-1Kt, SigmaPrep 스핀 컬럼)을 사용하여 여과하였다. 여과된 상등액을 Nova-Pak C18 역상 컬럼에 직접 주입 하였다. 이동상은 pH 3.7에서 0.1M 제1인산나트륨, 0.1mM EDTA, 1mM 소듐 옥틸설페이트, 0.003% 트리메틸아민 및 10% 메탄올로 이루어진다. 각 분석물에 대한 외부 표준 용액은 HPLC 등급의 물에서 0.4M 과염소산과 함께 5-히드록시트립타민 (5-HT, sc-298707, Santa Cruz) 및 5-히드록시인돌-3-아세트산 (5-HIAA; # H8876, Sigma-Aldrich) 용액으로 하였다. 유속은 1 ml/분으로 일정하게 유지하였다. 크로마토그래피 피크 분석은 지연 시간에 따라 일치된 표본에서 알려지지 않은 피크의 동정을 수반하였다.
도 24는 정상 마우스(CON) 및 우울증 마우스(CHC)의 해마에서 세로토닌(5-히드록시트립타민: 5-HT) 및 이의 주요 대사 산물인 히드록시인돌아세트산(hydroxyindoleacetic acid: HIAA)의 수준을 HPLC로 측정한 그래프이다.
도 24에 나타낸 바와 같이, 우울증 마우스의 해마에서 5-HT 및 HIAA의 수준에는 유의적인 변화가 없었다.
도 25는 정상 마우스(CON) 및 우울증 마우스(CHC)의 시상 하부에서 코르티코트로핀-방출 호르몬(corticotropin-relieasing hormone: CRH)의 mRNA 발현을 qPCR로 확인한 그래프이다. 각 군에서 n=5이다.
도 26은 정상 마우스(CON) 및 우울증 마우스(CHC)에서 혈청 글루코코르티코이드(Gc) 수준을 EIA 분석에 의해 측정한 그래프이다. 각 군에서 n=5이다. 데이터를 평균±SEM으로 나타내었다.
도 25 및 도 26에 나타낸 바와 같이, 우울증 마우스의 시상 하부에서의 CRH mRNA 발현 수준과 혈청 글루코코르티코이드 수준에는 유의적인 변화가 없었다.
따라서, 캅토프릴의 투여에 의한 우울증은 세로토닌 시스템 및 마우스 뇌의 HPA 축에 영향을 주지 않는 것을 확인하였다.
상기 결과를 종합하면, 본 발명에서 제조한 우울증 마우스는 우울증 유사 행동을 나타내는데, 이러한 우울증 유사 행동이 말초 면역계의 변화와 연관된다. 말초 면역계의 변화는 Treg 및 Th2 감소와 함께 전염증성 사이토카인, 예컨대 IL-1β, IL-6의 향상을 포함한다. 또한, 본 발명의 우울증 마우스의 해마에서 소교세포 수가 증가하였고 분지형태가 증가하였다. 또한, 본 발명의 우울증 마우스가 우울증 유사 행동을 나타내지만, 우울증 관련 인자인 BDNF, 세로토닌, 및 KYN 경로, HPA 축 활성화와는 관련이 없는 것으로 확인하였다.
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Claims (10)

  1. 인간을 제외한 동물에 안지오텐신 전환 효소(angiotensin converting enzyme: ACE) 억제제를 투여하는 단계를 포함하는 우울증 동물 모델을 제조하는 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 안지오텐신 전환 효소 억제제는 알라세프릴(Alacepril), 베나제프릴(Benazepril), 캅토프릴(Captopril), 실라자프릴(Cilazapril), 델라프릴(Delapril), 에날라프릴(Enalapril), 포시노프릴(Fosinopril), 이미다프릴(Imidapril), 리시노프릴(Lisinopril), 모엑시프릴(Moexipril), 페린도프릴(Perindopril), 퀴나프릴(Quinapril), 라미프릴(Ramipril), 테모카프릴(Temocapril) 및 조페노프릴(Zofenopril)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상, 또는 이들의 염캅토프릴(Captopril)인 것인 방법.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 안지오텐신 전환 효소 억제제는 2540mg/kg/일 내지 5100mg/kg/일의 농도로 21일 이상 동안내지 30일 동안 투여되는 것인 방법.
  4. 청구항 1에 있어서, 외부 스트레스 자극 없이 우울증 동물 모델을 제조하는 것인 방법.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 동물은 마우스, 햄스터, 랫트, 모르모트, 원숭이, 개, 고양이, 토끼, 소, 양, 돼지, 양 및 염소로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  6. 청구항 1에 따른 방법에 의해서 제조된 우울증 동물 모델.
  7. 청구항 6에 있어서, 불안 및 사회성의 변화를 나타내지 않는 것인 동물 모델.
  8. 청구항 6에 있어서, 말초 면역계의 변화에 의해 우울증 증상이 나타나는 것인 동물 모델.
  9. 청구항 6의 우울증 동물 모델에 항우울제의 후보약물을 투여하는 단계; 및
    우울증 증상이 완화되는지 여부를 확인하는 단계를 포함하는 항우울제의 스크리닝 방법.
  10. 청구항 9에 있어서, 상기 확인하는 단계는 상기 동물 모델의 혈액 중 우울증 관련 표지의 농도의 측정, 개방형 필드 테스트(open field test: OFT), 명-암 탐험 평가(Light-dark exploration), 꼬리 매달기 테스트 (tail suspensiontest: TST), 강제 수영 테스트 (Forced swim test: FST), 또는 이들의 조합에 의해 수행되는 것인 방법.
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