KR20190094359A - 키메라성 클로로톡신 수용체 - Google Patents

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안토니오 디 스타시
얀시 지. 길레스피
라리사 페레보에바
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Abstract

본 발명은 CTX 또는 이의 임의의 기능적 변이체 또는 CTX-유사 펩타이드 또는 이의 임의의 기능적 변이체의 융합 단백질을, CAR의 세포외 항원 인식 모이어티로서 포함하는 키메라성 항원 수용체(들)(CAR(들))를 제공한다. CTX, CTX-유사 펩타이드 또는 전술한 것들의 기능적 변이체를 포함하는 CAR(들)은 총칭하여 본 명세서에서 "CTX-CAR(들)"로 지칭된다. 상기 CTX-CAR(들)은 세포외 도메인내 추가의 모이어티 또는 도메인, 막횡단 도메인 및 적어도 하나의 세포내 신호전달 도메인을 추가로 포함할 수 있다. 상기 CTX-CAR(들)은 면역 효과기 세포와 같은, 그러나, 이에 한정되지 않는, 숙주 세포에서 발현될 수 있다. 본 발명은 또한 본원에 기술된 CTX-CAR을 발현하도록 조작된 면역 효과기 세포를 이를 필요로 하는 환자에게 제공함으로써 (예를 들어, 암 치료 방법과 같은) 치료 방법을 제공한다. 본 발명은 또한, 본원에 기술된 CTX-CAR을 발현하도록 조작된 면역 효과기 세포, 생존 인자 및 선택적으로 스트레스-유도 항원 수용체를 이를 필요로 하는 환자에게 제공함으로써 (예를 들어, 암 치료 방법과 같은) 치료 방법 및 추가의 치료적 처치를 제공한다.

Description

키메라성 클로로톡신 수용체
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 현재 계류중인 2016년 12월 9일자로 제출된 미국 가출원 제62/432,404호에 우선권을 부여하고 그 이익을 주장한다.
항원-특이적 T 세포를 이용한 면역요법은 임상전 모델과 I상 임상 시험 및 II상 임상 시험에서 악성종양의 치료에 도움이 될 것으로 보인다. 종양-특이적 T 세포를 생성시키는 하나의 매력적인 전략은 항원 인식 모이어티를 포함하는 세포외 도메인, 막횡단 도메인 및 적어도 하나의 세포내 신호전달 도메인(예를 들어, 종종 보조자극 분자 엔도도메인에 연결된 T-세포 수용체 CD3-제타 사슬로부터 유래된 세포내 신호전달 도메인)을 포함하는 키메라성 항원 수용체(CAR)에 의한 유전자 변형에 의한 것이다.
클로로톡신(CTX)은 곤충 및 다른 무척추동물에 대한 선택적 마비 활동으로 명명된 인섹토톡신(insectotoxins)의 펩타이드 계열에 속한다. 클로로톡신의 주요 구조는 8개의 시스테인을 포함하여 36개의 아미노산을 포함하며, 짧은-사슬의, 이황화물 함유 펩타이드로 분류된다. 연구 결과, CTX에는 종양 결합 활성이 있음이 밝혀졌다. CTX가 흑색종, 신경모세포종, 수모세포종 및 소세포 폐암종을 포함한 신경외배엽 기원의 다른 종양 세포뿐만 아니라 신경교종 세포에 결합하는 것으로 밝혀졌다. 그러나, 상기 동일 연구에 따르면 CTX는 뇌, 피부, 신장 및 폐로부터의 정상 조직 또는 파킨슨 병 및 알츠하이머 병과 같은 신경계 질환에서 유래한 다른 비-종양형성 조직에 결합할 수 없는 것으로 나타났다. 연구에 따르면 CTX가 항혈관형성 특성을 나타내는 것으로 나타났다. CTX의 정확한 표적 또는 표적들은 확인되지 않지만, CTX는 신경교종 세포(CLC-3)와 같은 특정 암세포에서 발견되는 특정 유형의 염화물 채널에 작용할 수 있다고 믿어진다. 다른 CTX 표적에는 기질 금속단백분해효소-2(MMP-2) 및 Annexin A2가 포함될 수 있다. 연구에 따르면 또한, CTX가 뇌에 들어가는 정확한 기전이 아직 확인되지는 않았지만 CTX는 세포 침투특성을 지니며, 순환계를 통해 뇌에 들어갈 수도 있는 것으로 나타났다.
항원 인식 모이어티로서 CTX 및 CTX-유사 펩타이드(및 이들의 기능적 변이체)를 포함하는 신규의 CARs를 설계하기 위한 종양 세포의 다양한 형태에 대한 CTX의 우선적인 결합을 활용하는 것이 바람직할 것이다.
본 발명은 CTX 또는 그의 임의의 기능적 변이체의 융합 단백질 또는 CTX-유사 펩타이드 또는 그의 임의의 기능적 변이체를 CAR의 세포외 항원 인식 모이어티로서 포함하는 키메라성 항원 수용체(들)(CAR(s))를 제공한다. CTX, CTX-유사 펩타이드 또는 전술한 것들의 기능적 변이체를 포함하는 CAR(들)은 총칭하여 본 명세서에서 "CTX-CAR(들)"로 지칭된다. 상기 CTX-CAR(들)은 세포외 도메인내 추가의 모이어티 또는 도메인, 막횡단 도메인 및 적어도 하나의 세포내 신호전달 도메인을 추가로 포함할 수 있다. 상기 CTX-CAR(들)은 면역 효과기 세포와 같은, 그러나, 이에 한정되지 않는, 숙주 세포에서 발현될 수 있다. 특정 구현예에서, 면역 효과기 세포는 T 세포, NK 세포 또는 γδ-T 세포이다. 본 발명은 또한 본 명세서에 기술된 CTX-CAR을 발현하도록 조작된 면역 효과기 세포를 이를 필요로 하는 환자에게 제공함으로써 (예를 들어, 암 치료 방법과 같은) 치료 방법을 제공한다.
도 1은 실시예 1(상부 패널)에 기재된 바와 같은 바람직한 CTX-CAR 및 상응하는 noCTX-CAR(하부 패널)의 디자인을 나타내는 재조합 작제물 지도를 나타낸다.
도 2는 막에 삽입된 도 1의 CTX-CAR 및 상응하는 noCTX-CAR을 도시한다.
도 3은 본 발명에 따른 추가의 CTX-CAR의 디자인을 나타내는 재조합 작제물 지도를 도시한다.
도 4는 실시예 1에 기술된 CTX-CAR 또는 상응하는 noCTX-CAR(각각 도 1에 예시된 바와 같음)를 포함하는 재조합 레트로바이러스를 얻기 위한 293T 세포의 트랜스펙션 효율을 나타내는 선 그래프이다. 음영 그래프는 CTX-CAR 및 noCTX-CAR로 트랜스펙션된 293T 세포를 나타내며, 음영이 없는 그래프는 트랜스펙션되지 않은 293T 세포를 나타낸다. 293T 세포를 72시간 후에 수집하고, (CAR 발현에 특이적인) 항-CH2CH3 항체로 염색하였다.
도 5는 실시예 1의 CTX-CAR 또는 대응하는 noCTX-CAR(각각 도 1에 예시된 바와 같음) 로 형질도입된 Jurkat 및 감마 델타 T-세포의 형질도입 효율을 나타내는 막대 그래프이다. Jurkat과 γδT 세포 확장은 CTX-CAR 및 noCTX-CAR 바이러스에 의해 형질도입되었다. 72시간 후에 세포를 수집하고 CH2CH3 항체로 염색하였다.
도 6은 본 명세서에 개시된 다양한 폴리펩타이드 및 아미노산 서열을 나타낸다.
도 7은 인간 일차 세포주(인간 성상세포; HA 및 αβ T-세포; T LC)와 비교하여 인간 신경교종 세포주(U87; U251; 및 LN229)에 선택적으로 결합하는 본 발명의 CTX-CAR을 발현하는 Jurkat 세포를 도시한다. 검정색 막대는 CTX-CAR에 의한 형질도입을 나타내고, 흰색 막대는 noCTX-CAR에 의한 형질도입을 나타낸다.
도 8a는 CTX가 없는 CAR(noCTX-CAR)를 발현하는 효과기 세포, 모의 형질도입된 효과기 세포(Mock) 및 Jurkat 세포(Jurkat) 와 비교하여, 신경교종 세포주 U251GL에 대한 본 발명의 CTX-CAR을 발현하는 효과기 세포(CTX-CAR)의 개선된 세포독성을 나타낸다. 데이터는 혼합된 배양액내 죽은 세포의 수와 서로 관련된 특정 루시퍼라제 감소%로 표시된다.
도 8b는 CTX가 없는 CAR(noCTX-CAR)를 발현하는 효과기 세포, 모의 형질도입된 효과기 세포(Mock) 및 Jurkat 세포(Jurkat) 와 비교하여, 신경교종 세포주 U87GL에 대한 본 발명의 CTX-CAR을 발현하는 효과기 세포(CTX-CAR)의 개선된 세포독성을 나타낸다. 데이터는 혼합된 배양액내 죽은 세포의 수와 서로 관련된 특정 루시퍼라제 감소%로 표시된다.
정의
명세서 및 첨부된 청구의 범위에서 사용된 바와 같이, 단수 형태는 문맥 상 명확하게 다르게 지시하지 않는 한 복수 대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "지지체"에 대한 언급은 복수의 지지체를 포함한다. 본 명세서 및 이하의 청구 범위에서, 반대의 의도가 명백하지 않는 한, 하기의 의미를 갖는 것으로 정의되는 다수의 용어가 참조될 것이다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "키메라성 항원 수용체(들)(CAR)"은 예를 들어 인공 T-세포 수용체, T-바디, 단일-사슬 면역수용체, 키메라성 T-세포 수용체 또는 키메라성 면역수용체를 지칭하며, 특정 면역 효과기 세포(예를 들어, 항원 인식 도메인) 상에 인공 특이성을 이식하는 조작된 수용체를 포함한다. CAR은 단클론 항체의 특이성을 T 세포 상에 부여하여, 예를 들어 입양 세포 치료에 사용하기 위해 다수의 특이적 T 세포를 생성시키는데 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, CAR은 예를 들어 종양 관련 항원에 대한 세포의 특이성을 지시한다. 일부 구현예에서, CAR은 세포내 활성화 도메인, 막횡단 도메인, 및 길이가 변할 수 있고 종양 관련 항원 인식 모이어티일 수 있는 항원 인식 도메인을 포함하는, 세포외 도메인을 포함한다. 특정 양태에서, CAR은 CTX 폴리펩타이드, CTX-유사 폴리펩타이드 또는 막횡단 도메인 및 세포내 신호전달 도메인/엔도도메인(특정 구현예에서 CD3-제타(CD3ζ)를 포함함)에 융합된 상기의 기능적 변이체를 포함하는 세포외 도메인을 포함한다. 다른 CAR 디자인의 특이성은 수용체(예를 들어, 펩타이드)의 리간드에서 유도될 수 있다. 특정 경우, 항원-인식 도메인의 간격은 활성화-유도된 세포사를 감소시키기 위해 변형될 수 있다. 특정 경우에, CAR의 세포내 신호전달 도메인은 CD3ζ 이외에 FcR, CD27, CD28, CD137, DAP10, 및/또는 OX40과 같은 추가의 공동-자극 신호전달을 위한 도메인을 포함한다. 어떤 경우에는, 공동-자극 분자, 이미징(예를 들어, 양전자 방출 단층촬영)을 위한 리포터 유전자, CAR을 발현하는 숙주 세포가 추가의 치료 환경에 의해 형성되는 치료 환경에서 생존하도록 하는 유전자 생성물, 프로-드럭 첨가시에 CAR을 발현하는 숙주 세포를 조건부로 절제하는 유전자 생성물, 호밍 수용체, 케모카인, 케모카인 수용체, 사이토카인 및 사이토카인 수용체를 포함한 분자들이 CAR과 공동-발현될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "면역 효과기 세포"는 면역 반응, 예를 들어 면역 효과기 반응의 촉진에 관여하는 세포를 지칭한다. 면역 효과기 세포의 예로는 T 세포, 알파/베타 T 세포(αβ T-세포) 및 감마/델타 T 세포(γδ T-세포), 종양-침윤 림프구(TIL), 림포킨-활성화 살해(LAK) 세포, 기억 T 세포, 조절 T 세포, 세포독성 T 림프구(CTL), 자연 살해 T(NKT) 세포 B 세포, 자연 살해(NK) 세포, 비만 세포 및 골수-유래 식세포가 포함된다. 상기 세포들로 분화하는 줄기 세포도 또한 사용될 수 있다. 본 명세서에 사용되는 용어 "면역 효과기 기능” 또는 "면역 효과기 반응"은 표적 세포의 면역 공격을 증진 또는 촉진하는 예를 들어, 면역 효과기 세포의 기능 또는 반응을 의미한다. 예를 들어, 면역 효과기 기능 또는 반응은 표적 세포의 살해 또는 성장 또는 증식 억제를 촉진하는 T-세포 또는 NK 세포와 같은 면역 효과기 세포의 특성을 지칭하지만, 이에 한정되지는 않는다. T 세포의 경우, 1차 자극 및 공동-자극은 면역 효과기 기능 또는 반응의 비-포괄적인 예이다. 나이브(naive), 줄기-세포 유사, 기억 또는 기억-유형 T 세포의 면역 효과기 기능 또는 반응에는 항원-의존성 증식이 포함되지만, 이에 한정되지는 않다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "클로로톡신” 및 "CTX"는 상호교환적으로 사용되며, 아미노산 서열 MCMPCFTTDHQMARKCDDCCG GKGRGKCYG PQCLCR)(SEQ ID NO: 1)(UniProt 수탁 # P45639)을 갖는 36개의 아미노산을 포함하는 전갈 독소 펩타이드를 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "클로로톡신-유사 펩타이드” 또는 "CTX-유사 펩타이드"는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용되며, CTX와 유사한 일차 구조를 갖는 다른 펩타이드를 지칭하며, 하기 펩타이드를 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다:
Bs8(UniProt# P15229; RCKPCFTTDP QMSKKCADCC GGKGKGKCYG PQCLC); SEQ ID NO: 6;
인섹토톡신-I4(UniProt# P60269; MCMPCFTTDH NMAKKCRDCC GGNGKCFGPQ CLCNR); SEQ ID NO: 7;
Lqh 8/6(UniProt# P55966; RCSPCFTTDQ QMTKKCYDCC GGKGKGKCYG PQCICAPY); SEQ ID NO: 8;
인섹토톡신-I3(UniProt# P60268; MCMPCFTTDH QTARRCRDCC GGRGRKCFGQ CLCGYD); SEQ ID NO: 9;
인섹토톡신-I5A(UniProt# P15222; MCMPCFTTDP NMAKKCRDCC GGNGKCFGPQ CLCNR); SEQ ID NO: 10;
MeuCITx(UniProt# P86401; TEAMCMPCFT TDHNMAKKCR DCCGGNGKCF GYQCLCNRG); SEQ ID NO: 11, 특히 아미노산 4-38(신호 펩타이드 아미노산 잔기 1 내지 3의 제거로 인해 생성됨);
GaTx1(UniProt# P85066; CGPCFTTDHQ MEQKCAECCG GIGKCYGPQC LCNR); SEQ ID NO: 12;
인섹토톡신-I5(UniProt# P60270; MCMPCFTTDP NMANKCRDCC GGGKKCFGPQ CLCNR); SEQ ID NO: 13;
인섹토톡신-I1(UniProt# P15220; MCMPCFTTRP DMAQQCRACC KGRGKCFGPQ CLCGYD); SEQ ID NO: 14;
Bm12-b(UniProt# Q9BJW4; MKFLYGIVFI ALFLTVMFAT QTDGCGPCFT TDANMARKCR ECCGGNGKCF GPQCLCNRE); SEQ ID NO: 15, 특히 아미노산 25-59(신호 펩타이드 아미노산 잔기 1-24의 제거로 인해 생성됨);
BmK CT(UniProt# Q9UAD0; MKFLYGIVFI ALFLTVMFAT QTDGCGPCFT TDANMARKCR ECCGGIGKCF GPQCLCNRI); SEQ ID NO: 16, 특히 아미노산 25-59(신호 펩타이드 아미노산 잔기 1-24의 제거로 인해 생성됨);
AaCtx(UniProt# P86436; MCIPCFTTNP NMAAKCNACC GSRRGSCRGP QCIC); SEQ ID NO: 17;
MeuCITx-1(UniProt# P86402; MCMPCFTTRP DMAQQCRDCC GGNGKCFGYQ CLCNR); SEQ ID NO: 18;
Bs14(UniProt# P59887; CGPCFTKDPE TEKKCATCCG GIGRCFGPQC LCNRGY); SEQ ID NO: 19;
AmmP2(UniProt# P01498; CGPCFTTDPY TESKCATCCG GRGKCVGPQC LCNRI); SEQ ID NO: 20; 및
BtlTx3 (UniProt# P81761; MKFLYGVILI ALFLTVMTAT LSEARCGPCF TTDPQTQAKC SECCGRKGGVCKGPQCICGI QY) SEQ ID NO: 21, 특히 아미노산 25-61(신호 펩타이드 아미노산 잔기 1-24의 제거로 인해 생성됨) 및 아미노산 25-62(신호 펩타이드 아미노산 잔기 1-24 및 프로-펩타이드 아미노산 잔기 62의 제거로 인해 생성됨).
용어 “투여"는 본 발명의, 화합물, 세포 모집단을 포함하는 생물학적 재료(예컨대, 본 발명의 CTX-CAR을 발현하는 숙주 세포), 또는 이들의 조합을 인간 또는 동물 대상체로 도입하는 수단을 의미한다. 화합물의 하나의 바람직한 투여 경로는 정맥내 투여이다. 화합물의 다른 바람직한 투여 경로는 복강내 또는 간내, 또는 뇌로의 카테터를 통한 경로일 수 있다. 그러나, 경구, 국소, 피하, 복강, 동맥-내, 흡입, 질, 직장, 비강, 뇌척수액으로의 도입, 또는 신체 구획으로의 점적과 같은 임의의 투여 경로가 사용될 수 있다. 고형 종양과 같은 표적 조직 부위로의 직접 주사도 고려된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "치료적 유효량"은 치료되는 질환, 병태 또는 장애의 하나 이상의 증상을 어느 정도 완화시킬, 투여되는 화합물 또는 치료적 활성 조성물의 양을 지칭한다. 조절되지 않은 세포 분열과 관련된 암 또는 병리학에 관련하여, 치료적 유효량은 (1) 종양의 크기를 감소시키는 효과, (2) 비정상적인 세포 분열, 예를 들어 암 세포 분열을 억제하는 효과(즉, 어느 정도 감속시키는 것, 바람직하게는 중지시키는 것), (3) 암세포 전이를 예방 또는 감소시키는 효과, 및/또는 (4) 관련된 병리와 연관된, 또는 예를 들어, 암 및 혈관신생을 포함하는, 조절되지 않거나 비정상적인 세포 분열에 의해 유발된 하나 이상의 증상을 어느 정도 완화(또는, 바람직하게는 제거)시키는 효과를 갖는 양을 지칭한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 질병(또는 병태 또는 장애)의 "치료하는” 또는 "치료"라는 용어는 질병에 걸리기 쉬울 수 있지만 아직 질병의 증상을 경험하거나 나타내지 않은 인간 대상체 또는 동물 대상체에서 발생하는 질병을 예방하고, 질병을 억제하고(질병 진전을 늦추거나 억제), 질병의 증상 또는 부작용의 경감(완화 치료 포함)을 제공하고/제공하거나, 질병의 퇴행을 야기하는 것을 지칭한다. 암과 관련하여, 상기 용어들은 또한 암에 걸린 개인의 기대수명이 길어질 수 있거나, 질병의 증상 중 하나 이상이 감소될 것이라는 것을 의미한다. 암과 관련하여 "치료하는"은 또한 암 감소, 대상체에서의 항-종양 반응의 강화 또는 연장을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, “조합”, "조합 치료” 및/또는 "조합 치료 요법"의 임의의 투여 형태는 동시에, 별도로 또는 조합된 제형으로, 또는 분, 시간 또는 일 단위로 분리된 상이한 시간에 순차적으로 투여될 수 있지만, 어떤 식 으로든 함께 작용하여 원하는 치료 반응을 제공할 수 있는, 적어도 2개의 치료적 활성 약제 또는 조성물을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "증진시키는"은 대상체 또는 종양 세포가 본 명세서에 개시된 치료에 반응하는 능력을 향상시키는 것을 지칭한다. 예를 들어, 증진된 반응은 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 또는 그 이상의 반응 증가를 포함할 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "증진"은 본 발명의 CTX-CAR 및 화학요법, 약물-내성 면역적격 세포 및 면역 체크포인트 억제제를 포함하는 조합 요법과 같은 치료에 반응하는 대상체의 수를 증가시키는 것을 지칭할 수도 있다. 예를 들어, 증진된 반응은 치료에 반응하는 대상체의 총 백분율을 의미할 수 있으며, 상기 백분율은 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 또는 그 이상이다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 “대상체” 및 “환자”는 인간, 포유동물(예를 들어, 고양이, 개, 말 등), 살아있는 세포 및 기타 살아있는 유기체를 포함한다. 살아있는 유기체는 예를 들어 단일 진핵 세포와 같이 간단할 수도 있고, 포유동물과 같이 복잡할 수도 있다. 전형적인 환자는 포유동물, 특히 영장류, 특히 인간이다. 수의학 용도의 경우, 소, 양, 염소, 소, 돼지 등과 같은 가축; 닭, 오리, 거위, 칠면조 등과 같은 가금류; 및 가축화된 동물, 특히 개 및 고양이와 같은 애완동물과 같은 다양한 대상체들이 적합할 것이다. 진단 또는 연구 용도를 위해, 설치류(예를 들어, 마우스, 랫트, 햄스터), 토끼, 영장류, 돼지, 예컨대 근교계 돼지 등을 포함하는 다양한 포유동물들이 적합한 대상체가 될 수 있다. 바람직하게는, 시스템은 샘플 및 대상체를 포함한다. 용어 "생 숙주"는 살아 있고 죽지 않은, 상기 언급된 숙주 또는 유기체를 지칭한다. 용어 "생 숙주"는 살아있는 숙주로부터 절제된 일부(즉, 간 또는 다른 기관)가 아닌 전체 숙주 또는 유기체를 지칭한다.
본 명세서에서 상호 교환 적으로 사용되는 용어 "감마 델타 T 세포", "γδT 세포"또는 "γδT"는 그 표면 상에 별개의 T 세포 수용체 (TCR)를 발현하는 T 세포의 작은 서브 세트를 지칭한다. 대다수의 T 세포에는 α- 및 β-TCR 사슬이라고하는 두 개의 당 단백질 쇄로 구성된 TCR이 있다. 대조적으로, γδ T-세포에서, TCR은 하나의 γ-사슬 및 하나의 δ-사슬로 구성된다. 이 T-세포 그룹은 대개 αβ T-세포보다 훨씬 덜 일반적이지만, 상피세포내 림프구(IEL)라고 알려진 림프구 집단 내에서 가장 높은 농도로 장 점막에서 발견된다. γδ T-세포를 활성화시키는 항원 분자는 아직 많이 알려져 있지 않다. 그러나, γδ T-세포는 일부가 MHC 부류 IB 분자를 인식하지만, 펩타이드 에피토프의 항원 가공 및 MHC 제시를 필요로 하지 않는 것으로 보아 특이하다. 또한, γδ T-세포는 지질 항원의 인식에 중요한 역할을 하고, MIC-A 및 MIC-B와 같은 스트레스-관련 항원에 반응하는 것으로 여겨진다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "항체"는 면역글로불린 또는 그의 일부를 지칭하고, 공급원에 관계없이 항원-결합 부위, 기원 종, 생산 방법 및 특성을 포함하는 임의의 폴리펩타이드를 포함한다. 항체는 중쇄 및/또는 경쇄 또는 그의 단편으로 구성될 수 있다. 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체는 다클론의, 단클론의, 다중특이적, 인간, 인간화된, 영장류화, 또는 키메라성 항체, 단일사슬 항체, 에피토프-결합 단편, 예를 들어 Fab, Fab' 및 F(ab')2, Fd, Fvs, 단일-사슬 Fvs(scFv), 단일-사슬 항체, 디설파이드-결합 Fvs(sdFv), VL 또는 VH 도메인 중 어느 하나를 포함하는 단편, Fab 발현 라이브러리에 의해 생성된 단편 및 항-이디오타입(항-Id) 항체를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. ScFv 분자는 당 업계에 공지되어 있고, 예를 들어, 미국 특허 제5,892,019호에 기술되어 있다. 본 발명의 항체 분자는 면역글로불린 분자의 임의의 유형(예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 부류(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 하위부류일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "생물학적 치료제” 또는 "생물의약품"은 생물학적 공급원으로부터 제조되거나 추출된 임의의 의약품을 지칭한다. 생물의약품은 화학적으로 합성된 의약품과 구별된다. 생물의약품의 예로는 백신, 혈액 또는 혈액 성분, 알레르겐, 체세포, 유전자 치료제, 조직, 항체 치료제 및 융합 단백질을 포함하는 재조합 치료 단백질, 및 살아있는 세포가 포함된다. 생물학적 제제는 당류, 단백질 또는 핵산 또는 이들 물질의 복합체 조합으로 구성되거나, 세포 및 조직과 같은 살아있는 물질일 수 있다. 생물학적 제제는 인간, 동물 또는 미생물과 같은 다양한 천연 공급원으로부터 분리되며, 생물공학 방법 및 기타 기술로 생산될 수 있다. 생물학적 치료제의 특정 예는 면역자극제, T 세포 성장 인자, 인터루킨, 항체, 융합 단백질 및 암 백신과 같은 백신을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "암"은 비정상적인 세포가 통제없이 분열하는 질병에 대한 일반적인 용어로서, 그의 일반적인 의미로 부여된다. 특히, 및 본 발명의 구현예의 문맥에서, 암은 혈관신생-관련 암, 예컨대 신경교종을 지칭하지만, 이에 한정되지 않는다. 암 세포는 근처의 조직에 침투할 수 있으며, 혈류와 림프계를 통해 신체의 다른 부위로 퍼질 수 있다. 많은 종류의 암이 있다. 암종은 피부에서 또는 내부 장기를 정렬하거나 덮는 조직에서 시작되는 암이다. 신경아교종은 뉴런을 제 위치에 유지하고 잘 기능하는데 도움이 되는 신경아교(glia)라고 불리는, 뇌의 지지(“아교질") 조직에서 발생하는 종양이다. 육종은 뼈, 연골, 지방, 근육, 혈관 또는 기타 결합 조직 또는 지지 조직에서 시작되는 암이다. 백혈병은 골수와 같은 혈액-생성 조직에서 시작하여 수많은 비정상적인 혈액 세포가 생성되어 혈류로 들어가도록 하는 암이다. 림프종은 면역 체계의 세포에서 시작되는 암이다.
정상 세포가 특정의, 제어된, 및 조정된 유닛으로서 동작할 수 있는 능력을 잃는 경우, 종양이 형성된다. 일반적으로, 고형 종양은 보통 낭종 또는 액체 영역을 포함하지 않는 비정상 조직이다(일부 뇌종양은 낭종과 중추 괴사 영역에 액체가 채워져 있다). 단일 종양은 그 안에 다른 세포 집단을 가지고 있을 수 있으며, 서로 다른 과정이 잘못되어 있다. 고형 종양은 양성(암성이 아님), 또는 악성(암성)일 수 있다. 고형 종양의 다른 유형은 그 유형을 형성하는 세포의 유형에 따라 명명된다. 고형 종양의 예는 육종, 신경교종, 암종 및 림프종이다. 백혈병(혈액 암)은 일반적으로 고형 종양을 형성하지 않는다.
대표적인 암으로는 하기를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다: 급성 림프구성 백혈병, 성인; 급성 림프구성 백혈병, 소아; 급성 골수성 백혈병, 성인; 부신피질 암종; 부신피질 암종, 소아; AIDS-관련 림프종; AIDS-관련 악성종양; 항문 암; 성상세포종, 소아의 소뇌; 성상세포종, 소아 뇌; 담관 암, 간 외; 방광암; 방광암, 소아; 골암, 골육종/악성 섬유성 조직구종; 교모세포종, 소아; 교아세포종, 성인; 뇌 줄기 신경교종, 소아; 뇌종양, 성인; 뇌종양, 뇌간 신경교종, 소아; 뇌종양, 소뇌 성상세포종, 소아; 뇌종양, 대뇌 성상세포종/악성 신경교종, 소아; 뇌 종양, 뇌교종, 소아; 뇌종양, 수모세포종, 소아; 뇌 종양, 천막상부 원시신경 외배엽 종양, 소아; 뇌 종양, 시각 경로 및 시상하부 신경교종, 소아; 뇌종양, 소아(기타); 유방암; 유방암 및 임신; 유방암, 소아; 유방암, 남성; 기관지 선종/유암종, 소아; 유암종, 소아; 유암종, 위장; 암종, 부신피질; 암종, 섬 세포; 알려지지 않은 1차 암종; 중추 신경계 림프종, 1차; 소뇌 성상세포종, 소아; 대뇌 성상세포종/악성 신경교종, 소아; 자궁경부암; 소아 암; 만성 림프성 백혈병; 만성 골수성 백혈병; 만성 골수증식성 질환; 건초(Tendon Sheaths)의 투명세포육종; 대장 암; 결장직장암, 소아; 피부 T-세포 림프종; 자궁내막암; 뇌실막세포종, 소아; 상피 암, 난소; 식도암; 식도암, 소아; 유잉의 종양 패밀리; 간외 담관암; 안암, 안구내 흑색종; 안암, 망막아세포종; 담낭 암; 위장(위) 암; 위장(위) 암, 소아; 위장관 유암종; 생식 세포 종양, 두개외, 소아; 생식 세포 종양, 고환 외; 생식 세포 종양, 난소; 임신성 융모성 종양; 신경교종. 소아 뇌간; 신경교종. 소아 시각 경로 및 시상하부; 모상세포 백혈병; 두경부암; 간세포(간암), 성인(원발성); 간세포 암(간암), 소아(원발성); 호지킨 림프종, 성인; 호지킨 림프종, 소아; 임신 중 호지킨 림프종; 하인두 암; 시상하부 및 시각 경로 신경교종, 소아; 안구내 흑색종; 섬 세포 암(내분비 췌장); 카포시 육종; 신장 암; 후두암; 후두 암, 소아; 백혈병, 급성 림프모구성, 성인; 백혈병, 급성 림프모구성, 소아; 백혈병, 급성 골수성, 성인; 백혈병, 급성 골수성, 소아; 백혈병, 만성 림프성; 백혈병, 만성 골수성; 백혈병, 모상세포; 입술 및 구강 암; 간암, 성인(원발성); 간암, 소아(원발성); 폐암, 비소세포; 폐암, 소세포; 림프모구성 백혈병, 성인 급성; 림프모구성 백혈병, 소아기 급성; 만성 림프성 백혈병; 림프종, 에이즈-관련; 림프종, 중추 신경계(원발성); 림프종, 피부 T-세포; 림프종, 호지킨, 성인; 림프종, 호지킨; 소아; 림프종, 임신 중 호지킨; 림프종, 비-호지킨, 성인; 림프종, 비-호지킨, 소아; 림프종, 임신 중 비호지킨; 림프종, 일차 중추 신경계; 마크로글로불린혈증, 발덴스트롬; 남성 유방암; 악성 중피종, 성인; 악성 중피종, 소아; 악성흉선종; 수모세포종, 소아; 흑색종; 흑색종, 안구내; 메르켈세포암; 중피종, 악성; 잠재적 원발성 전이 편평 경부암(Metastatic Squamous Neck Cancer with Occult Primary); 다발성 내분비 신생물 증후군, 소아; 다발성 골수종/혈장 세포 신생물; 균상식육종; 골수이형성 증후군; 골수성 백혈병, 만성; 골수성 백혈병, 소아기 급성; 골수종, 다중; 만성 골수증식성 질환; 비강 공동과 부비동 부비강암; 비인두암; 비인두암, 소아; 신경모세포종; 신경섬유종; 비호지킨 림프종, 성인; 비호지킨 림프종, 소아; 임신 중 비호지킨 림프종; 비소세포 폐암; 구강 암, 소아; 구강 및 입술 암; 구인두암; 뼈의 골육종/악성 섬유성 조직구종; 난소 암, 소아; 난소 상피 암; 난소 세균 세포 종양; 난소암종의 저악성 잠재종양; 췌장암; 췌장암, 소아', 췌장암, 섬 세포; 부비동 부비강 및 비강 암; 부갑상선 암; 음경 암; 크론친화세포종; 송과체 및 대뇌 원시 신경외배엽 종양, 소아; 뇌하수체 종양; 혈장 세포 신생물/다발성 골수종; 흉막폐아세포종; 임신과 유방암; 임신과 호지킨 림프종; 임신과 비-호지킨 림프종; 원발성 중추 신경계 림프종; 원발성 간암, 성인; 원발성 간암, 소아; 전립선 암; 직장 암; 신장 세포(신장) 암; 신세포 암, 소아; 신우 및 요관, 전이세포 암; 망막아세포종; 횡문근육종, 소아; 침샘 암; 침샘 암, 소아; 육종, 유잉 계열의 종양; 육종, 카포시; 육종(골육종)/뼈의 악성 섬유성 조직구종; 육종, 횡문근육종, 소아; 육종, 연조직, 성인; 육종, 연조직, 소아; 세자리(Sezary) 증후군; 피부암; 피부암, 소아; 피부암(흑색종); 피부 암종, 메르켈 세포; 소세포 폐암; 소장 암; 연조직 육종, 성인; 연조직 육종, 소아; 안구 원발성, 전이성을 가진 편평한 경부암; 위(위장) 암; 위(위장) 암, 소아; 천막위 원시 신경외배엽 종양, 소아; T-세포 림프종, 피부; 고환암; 흉선종, 소아; 흉선종, 악성; 갑상선 암; 갑상선 암, 소아; 신우 및 요관의 전이 세포 암; 융모성 종양, 임신; 미지의 원발성 부위, 암, 소아; 소아기의 비정상적인 암; 요관 및 신우, 전이세포 암; 요도 암; 자궁 육종; 질 암; 시각 경로 및 시상하부 신경아교종, 소아; 외음부암; 발덴스트롬의 마크로 글로불린혈증; 및 빌름 종양, 다른 것 중에서.
종양은 양성 또는 악성 종양으로 분류될 수 있다. 두 경우 모두 세포의 비정상적인 응집 및 증식이 있다. 악성종양의 경우, 이들 세포는 보다 적극적으로 행동하여, 증가된 침습성을 얻는다. 궁극적으로, 종양 세포는 그들이 유래된 미시적 환경에서 벗어나 신체의 다른 영역으로 퍼져 나갈 수 있는 능력을 얻을 수 있으며(정상적으로는 성장에 도움이 되지 않는 매우 다른 환경에서), 급속 성장 및 새로운 위치의 분열을 계속한다. 이를 전이라고 한다. 일단 악성 세포가 전이되면 치료를 달성하는 것이 더욱 어렵다. 양성 종양은 침입하는 경향이 적고, 전이할 가능성이 적다.
본 명세서에 사용된 용어 "융합 단백질"은 예를 들면, 항원 인식 도메인, 예를 들어 CTX, 및 적어도 하나의 이형 부분, 즉, 본래 자연스럽게 연결되지 않는 부분을 포함하는 키메라성 분자를 지칭한다. 아미노산 서열은 보통 융합 폴리펩타이드에 함께 결합된 별도의 단백질에 존재할 수 있거나, 또는 보통 동일한 단백질 내에 존재할 수도 있지만 융합 폴리펩타이드에서 새로운 배열로 위치된다. 융합 단백질은 예를 들어, 화학적 합성에 의해, 또는 펩타이드 영역이 원하는 관계로 코딩되는 폴리뉴클레오타이드를 생성 및 번역함으로써 생성될 수 있다.
용어 "암을 감소”, "암의 억제”, "암을 억제하는” 및 이와 유사한 용어는 상호교환적으로 사용되며, 종양 덩어리의 크기 또는 부피의 감소, 대상체내 전이된 종양의 수 감소, 암세포의 증식 상태(암세포가 증식하는 정도) 감소 등 중 하나 또는 그 이상을 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "발현된” 또는 "발현"은 DNA 서열의 2개의 핵산 가닥 중 하나의 영역에 적어도 부분적으로 상보적인 RNA 분자를 제공하기 위한 DNA 서열로부터의 전사를 의미한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "발현된” 또는 "발현"은 또한 단백질, 폴리펩타이드, 또는 그의 일부 또는 단편을 얻기 위해 상기 RNA 분자로부터의 번역을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "프로모터"는 RNA 폴리머라제에서의 전사 개시 부위를 결정하는 DNA 서열을 지칭한다. "프로모터-인접 요소"는 약 200 염기쌍의 전사 시작 부위 내의 조절 서열일 수 있다.
용어 "재조합 세포”는 본래 세포에서 정상적으로 존재하지 않는 및/또는 본래 서로 공유 결합되지 않는, 핵산 세그먼트들의 새로운 조합을 가진 세포를 지칭한다. 당업자가 이용할 수 있는 광범위한 핵산 조작 기술을 이용하여 새로운 핵산 세그먼트 조합이 유기체에 도입될 수 있다. 재조합 세포는 단일 진핵 세포, 또는 단일 원핵 세포 또는 포유류 세포일 수 있다. 재조합 세포에는 게놈외 벡터가 보유될 수 있다. 게놈외 핵산 벡터는 세포의 게놈에 삽입하지 않는다. 재조합 세포는 게놈내 벡터 또는 그의 일부를 추가로 보유할 수 있다. 용어 "게놈내"는 재조합 세포의 게놈 내에 통합된 핵산 구조체를 정의한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "재조합 핵산” 및 "재조합 DNA"는 진핵 세포 또는 원핵 세포에서 자연적으로 발견되지 않고 및/또는 진핵 세포 또는 원핵 세포에서 자연적으로 서로 공유 결합하지 않는 적어도 2종의 핵산 서열의 조합을 지칭한다. 재조합 핵산 서열은 숙주 세포에서 발현되는 핵산, 핵산 벡터, 유전자 발현 조절 요소, 복제 기점, 발현시 항생제 내성을 부여하는 적합한 유전자 서열, 단백질-코딩 서열 등을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 용어 "재조합 폴리펩타이드"는 자연발생 폴리펩타이드와 그의 위치, 농도, 순도 또는 구조가 구별되도록 재조합 DNA 기술(예컨대, 재조합 핵산 사용)에 의해 생산된 폴리펩타이드를 포함하여 의미한다. 일반적으로, 상기 재조합 폴리펩타이드는 본래 정상적으로 관찰되는 양과는 다른 양으로 세포 내에 존재할 것이다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 “작동가능하게” 또는 "작동가능하게 결합된"은 원하는 기능을 수행하도록 하는 코딩 및 제어 서열의 구성을 지칭한다. 따라서, 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 제어 서열은 코딩 서열의 발현을 수행할 수 있다. 코딩 서열은 DNA 폴리머라제가 프로모터 서열을 결합시키고 코딩 서열을 코딩된 단백질로 번역될 수 있는 mRNA로 전사시킬 때 세포에서 전사 조절 영역에 작동가능하게 연결되거나 그의 제어 하에 있다. 제어 서열은 그의 발현을 지시하도록 기능하는 한, 코딩 서열과 인접할 필요는 없다. 따라서, 예를 들어, 프로모터 서열과 코딩 서열 사이에 개재하는 아직 번역되지 않은 전사된 서열이 존재할 수 있으며, 프로모터 서열은 여전히 코딩 서열에 "작동가능하게 연결된" 것으로 간주될 수 있다.
코딩 서열 및 제어 서열과 같은 핵산 서열에 관한, 용어 "이종성" 및 "외인성"은 일반적으로 재조합 작제물의 영역 또는 특정 염색체 좌와 연관되지 않은, 및/또는 일반적으로 특정 세포와 연관되지 않은 서열을 지칭한다. 따라서, 핵산 작제물의 "이종성" 영역은 본질적으로 다른 분자와 관련하여 발견되지 않는 또 다른 핵산 분자 내의 또는 이에 부착된 핵산의 식별가능한 세그먼트이다. 예를 들어, 작제물의 이종성 영역은 본질적으로 코딩 서열과 관련하여 발견되지 않는 서열에 의해 플랭킹되는 코딩 서열을 포함할 수 있다. 이종성 코딩 서열의 또 다른 예는 코딩 서열 자체가 자연적으로 발견되지 않는 작제물(예를 들어, 천연 유전자와 상이한 코돈을 갖는 합성 서열)이다. 유사하게, 숙주 세포에 정상적으로 존재하지 않는 작제물로 형질전환된 숙주 세포는 본 발명의 목적 상 이종성으로 간주될 것이다.
바람직하게는, 프로모터가 서열의 부가 또는 결실에 의하여 변형, 또는 합성 및 천연 서열의 조합일 수 있는 서열뿐만 아니라 천연 및 합성 서열을 포함한 다른 서열로 대체될 것이다. 많은 진핵 세포 프로모터는 TATA 박스 및 상류 프로모터 요소의 두 가지 유형의 인식 서열을 포함한다. 전사 개시 부위의 상류에 위치한 전자는, 정확한 부위에서 전사를 개시하기 위해 RNA 폴리머라제를 유도하는데 관여하며, 후자는 전사 비율을 결정하는 것으로 보이며, TATA 박스의 상류에 있다. 강화제 요소는 또한 연결된 프로모터로부터 전사를 자극할 수 있지만, 많은 것은 특정 세포 유형에서만 독점적으로 작용한다. SV40, Rous 육종 바이러스(RSV) 및 CMV 프로모터와 같은 바이러스로부터 유도된 많은 증강인자/프로모터 요소는 광범위한 세포 유형에서 활성이며, "구성적” 또는 "유비쿼터스"로 지칭된다. 클로닝 부위에 삽입된 핵산 서열은 관심있는 폴리펩타이드를 코딩하는 임의의 오픈 리딩 프레임을 가질 수 있지만, 단, 코딩 서열이 관심 폴리펩타이드를 코딩하는 경우, 적절한 mRNA 분자의 생성을 차단할 수 있고 및/또는 비정상적으로 스플라이싱된 또는 비정상적인 mRNA 분자를 생성할 수 있다.
주로 사용되는 종결 영역은 상대적으로 상호교환가능한 것으로 나타나기 때문에, 편리함 중 하나가 될 것이다. 종결 영역은 관심 대상인 의도된 핵산 서열에 고유한 것일 수 있거나, 다른 원천으로부터 유래될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이 용어 "벡터"는 단일 가닥, 이중 가닥, 원형 또는 수퍼코일 DNA 또는 RNA로 이루어진 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다. 전형적인 벡터는 기능적 유전자 발현을 허용하기 위해 적절한 거리에서 작동가능하게 연결된 하기의 요소들로 구성될 수 있다: 복제 기원, 프로모터, 인핸서, 5' mRNA 리더 서열, 리보솜 결합 부위, 핵산 카세트, 종결 및 폴리아데닐화 부위, 및 선택 마커 서열. 상기 요소들 중 하나 이상은 특정 용도에서 생략될 수 있다. 벡터는 또한 발현되는 핵산 서열의 삽입을 위한 제한 부위를 포함할 수 있는 핵산 카세트를 함유할 수 있다. 기능적 벡터에서 핵산 카세트는 번역 개시 및 종결 부위를 포함하여 발현될 핵산 서열을 함유한다.
특정 코딩 서열(예를 들어, 본 발명의 CTX-CAR에 대한 코딩 서열)이 적절한 제어 서열과 함께 벡터 내에 위치하도록 벡터가 구성되며, 상기 제어 서열과 관련하여 코딩 서열의 위치선정 및 배향은 코딩 서열이 작동가능하게 연결되고/연결되거나 제어 서열의 “제어 하에” 전사되도록 한다. 관심의 특정 단백질을 코딩하는 서열의 변형은 상기 목적을 달성하는데 바람직할 수 있다. 예를 들어, 어떤 경우에는 서열을 변형하여 적절한 배향으로 제어 서열에 작동가능하게 연결되거나 리딩 프레임을 유지할 필요가 있을 수 있다. 제어 서열 및/또는 다른 조절 서열은 벡터에 삽입되기 전에 코딩 서열에 결찰될 수 있다. 대안적으로, 코딩 서열은 이미 제어 서열을 함유하는 발현 벡터 및 제어 서열의 조절 제어 하에 리딩 프레임에 있는 적절한 제한 부위에 직접 클로닝될 수 있다.
용어 "형질전환", "형질도입” 및 "트랜스펙션"은 모두 수용체 세포 또는 세포들로의 폴리뉴클레오티드의 도입을 나타낸다.
본 발명은 CTX 또는 그의 임의의 기능적 변이체 또는 CTX-유사 펩타이드 또는 이의 임의의 기능적 변이체를 세포외 항원 인식 모이어티로서 포함하는 CAR(들)을 제공한다. CTX, CTX-유사 펩타이드 또는 상기한 것들의 기능적 변이체를 포함하는 CAR은 총칭하여 본원에서 "CTX-CAR(들)"로 지칭된다. 특정 구현예에서, CTX-CAR은 단일 CTX, CTX-유사 펩타이드 또는 상기한 것의 기능적 변이체를 포함한다. 특정 구현예에서, CTX-CAR은 하나 이상의 CTX 폴리펩타이드, CTX-유사 펩타이드 또는 상기의 기능적 변이체, 예컨대 1 내지 5개(예를 들어, 1 내지 2개 또는 2 내지 3개 또는 2 내지 4개)의 CTX 폴리펩타이드, CTX-유사 펩타이드 또는 상기의 기능적 변이체를 포함한다. 상기의 기능적 변이체를 포함하는, 다중 CTX 폴리펩타이드 및 CTX-유사 펩타이드가 존재하는 경우, 이들은 세포외 도메인에서 순차적으로 또는 비-순차적으로 위치될 수 있으며, 비-순차적으로 위치할 때 본원에 기재된 바와 같은 펩타이드 링커에 의해 선택적으로 분리될 수 있다. 상기 CTX-CAR(들)은 세포외 도메인에 추가의 모이어티 또는 도메인, 막횡단 도메인 및 적어도 하나의 세포내 신호전달 도메인을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 CTX-CAR은 일반적으로 하기 구조를 갖는다: i) CTX 또는 이의 임의의 기능적 변이체 또는 CTX-유사 펩타이드 또는 이의 임의의 기능적 변이체를 포함하는 항원 인식 도메인/모이어티를 포함하는 세포외 도메인(본 명세서에서는 "엑토도메인"으로 지칭됨), ii) 막횡단 도메인 및 iii) 세포내 신호전달 도메인(본 명세서에서는 "엔도도메인"으로 지칭됨). 특정 구현예에서, 1 내지 30개의 1아미노산을 갖는 펩타이드 링커가 CTX-CAR에 존재하여 CAR의 다양한 도메인을 분리할 수 있다. 예를 들어, 펩타이드 링커는 항원 인식 도메인/모이어티와, 세포외 도메인내에 존재할 수 있는 다른 도메인 사이, 항원 인식 도메인/세포외 도메인과 막횡단 도메인 사이에, 또는 막횡단 도메인과 세포내 신호전달 도메인 사이에 존재할 수 있다. 펩타이드 링커는 모든 도메인 사이에, 또는 도메인들/모이어티들의 부분 사이에만 존재할 수 있다. 또한, 세포내 신호전달 도메인이 하나 이상의 원소를 포함할 때, 링커 펩타이드는 엔도도메인 내의 개별 원소의 일부 또는 전부 사이에 존재할 수 있다.
본 발명의 CTX-CAR의 세포내 신호전달 도메인은 CTX-CAR이 위치하는 숙주 세포의 정상 효과기 기능 중 적어도 하나의 활성화를 담당한다. 용어 "효과기 기능"은 분화된 세포의 특수 기능을 지칭한다. 숙주 세포가 면역 효과기 세포일 때, 본 발명의 CTX-CAR의 세포내 신호전달 도메인은 정상 면역 효과기 기능 중 적어도 하나의 활성화를 담당한다. 예를 들어, T 세포의 면역 효과기 기능은 사이토카인 분비를 포함하지만, 이에 한정되지 않는 세포용해 활성 또는 헬퍼 활성일 수 있다. 순진한 줄기-세포 유사, 기억, 또는 기억-유형 T 세포의 면역 효과기 기능에는 항원-의존적인 증식이 포함되지만 이에 한정되지는 않다. 따라서, 용어 "세포내 신호전달 도메인"은 효과기 기능 신호를 변환하고 세포가 특화된 기능(예를 들어, 효과기 기능 및/또는 면역 효과기 기능)을 수행하도록 지시하는 CTX-CAR 부분을 지칭한다. 일반적으로 전체 세포내 신호전달 도메인이 사용되지만, 많은 경우에 전체 세포내 신호전달 도메인을 사용할 필요는 없을 것이다. 세포내 신호전달 도메인의 절단된 부분이 사용을 발견할 수 있는 한, 상기 절단된 부분이 여전히 효과기 기능/면역 효과기 기능 신호를 변환하는 한, 상기 절단 부분은 손상되지 않은 신호전달 도메인 대신에 사용될 수 있다. 따라서, 세포내 신호전달 도메인이라는 용어는 효과기 기능/면역 효과기 기능 신호를 변환하기에 충분한 세포내 신호전달 도메인의 임의의 절단된 부분을 포함하여 의미한다. 세포내 신호전달 도메인의 예로는 T-세포 수용체의 제타 사슬(CD3 제타; CD247) 또는 그의 임의의 동족체(예를 들어, 에타, 델타, 감마 또는 엡실론), MB1 사슬, B29, FcRIII, RcRI 및 신호전달 및/또는 보조자극 분자의 조합, 예컨대 CD3 제타 사슬 및 CD28, CD27, 4-1BB, DAP-10, OX40 및 이들의 조합, 및 다른 유사한 분자 및 상기의 돌연변이, 예컨대 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프(ITAMs)의 변형으로부터의 신호전달 도메인을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 특정 구현예에서, 신호전달 도메인은 서열 RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPP R(SEQ ID NO: 26)로 나타낼 수 있는 CD3 제타 서열을 포함한다. FcγRIII 및 FcRI와 같은 활성화 단백질 계열의 다른 구성원의 세포내 신호전달 부분이 사용될 수 있다. 당업자는 대응하는 신호전달 도메인을 결정할 수 있을 것이다. 또한, 신호전달 도메인 서열 중 임의의 것은 1 내지 5개의 아미노산 변형을 포함할 수 있으며, 이는 본원에서 논의된 바와 같이 선택될 수 있다.
바람직하게는, CTX-CAR의 세포내 신호전달 도메인은 보조자극 신호전달 도메인을 코딩하는 서열을 포함한다. 예를 들어, 세포내 신호전달 도메인은 주 신호전달 도메인을 코딩하는 서열 및 보조자극 신호전달 도메인을 코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 보조자극 도메인은 41BB, OX40 및/또는 CD28로부터의 기능적 신호전달 도메인이다. OX40의 보조자극 도메인은 서열 ALYLLRRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI(SEQ ID NO: 24)를 가질 수 있다. CD28로부터의 보조자극 도메인은 서열 RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS(SEQ ID NO: 25)를 가질 수 있다. 41BB로부터의 보조자극 도메인은 서열 KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL(SEQ ID NO: 27)을 가질 수 있다. 바람직하게는, 코딩된 보조자극 신호전달 도메인은 CD27, CD28, 4-1BB(CD137), OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, 림프구 기능-관련 항원-1(LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, CD83에 특이적으로 결합하는 리간드, CDS, ICAM-1, GITR, BAFFR, HVEM (LIGHTR), SLAMF7, NKp80 (KLRF1), CD160, CD19, CD4, CD8α, CD8β, IL2Rβ, IL2Rγ, IL7Rα, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CDlld, ITGAE, CD103, ITGAL, CDlla, LFA-1, ITGAM, CDl lb, ITGAX, CDl lc, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Lyl08), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, NKp44, NKp30, NKp46, 또는 NKG2D 중 하나 이상으로부터 선택된 단백질의 기능적 신호전달 도메인을 포함한다. 당업자는 상기 폴리펩타이드로부터 상응하는 막횡단 영역을 결정할 수 있을 것이다. 또한, 임의의 보조자극 도메인 서열은 본원에서 논의된 바와 같이 선택될 수 있는, 1 내지 5개의 아미노산 변형을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 신호전달 도메인은 CD3 제타-CD28-OX40, CD3 제타-41BB, 또는 CD28-41BB 및 CD3 제타-CD28-41BB를 포함한다.
바람직하게는, 항원 인식 도메인을 포함하는 세포외 도메인은 세포외 스페이서 및/또는 막횡단 도메인을 통해 세포내 신호전달 도메인에 연결된다. 세포외 스페이서는 바람직하게는 막횡단 단백질의 세포외 영역의 전부 또는 일부를 포함한다. 바람직하게는, 세포외 스페이서 서열은 인간 면역글로불린, 즉 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM의 힌지 영역 및/또는 (CH1, 링커 영역, CH2 및/또는 CH3 도메인을 포함할 수 있는) 면역글로불린 중쇄 불변 영역의 일부, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 특정 구현예에서, 세포외 스페이서는 인간 IgD의 힌지 영역의 전부 또는 일부를 포함한다. 특정 구현예에서, 세포외 스페이서는 인간 IgG1의 힌지 영역의 전부 또는 일부를 포함한다. 특정 구현예에서, 세포외 스페이서는 인간 IgD의 힌지 영역의 전부 또는 일부 및 인간 IgG1의 힌지 영역의 전부 또는 일부를 포함한다. 특정 구현예에서, 세포외 스페이서는 인간 IgD의 힌지 영역의 전부 또는 일부 및 인간 IgG1의 중쇄 불변 영역의 CH2 및 CH3 도메인의 전부 또는 일부를 포함한다. 특정 구현예에서, 세포외 스페이서는 인간 IgD의 힌지 영역의 전부 또는 일부, 인간 IgG1의 힌지 영역의 전부 또는 일부 및 인간 IgG1의 중쇄 불변 영역의 CH2 및 CH3 도메인의 전부 또는 일부를 포함한다. 특정 구현예에서, 세포외 스페이서는 인간 IgG1의 힌지 영역의 전부 또는 일부 및 인간 IgG1의 중쇄 불변 영역의 CH2 및 CH3 도메인의 전부 또는 일부를 포함한다. 특정 구현예에서, 세포외 스페이서는 인간 IgD의 힌지 영역의 전부, 인간 IgG1의 힌지 영역의 전부 또는 일부를 포함하고, 중쇄 불변 영역은 인간 IgG1의 CH2 및 CH3 도메인의 전부 또는 일부를 포함한다. 바람직하게는, 힌지 영역 아미노산 서열은 본원에서 논의된 바와 같이 선택될 수 있는, 아미노산 서열이 1 내지 5개의 아미노산 변형을 포함하는, IgD 또는 IgG1과 같은 면역글로불린으로부터의 힌지 영역 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게는, 중쇄 불변 영역의 CH2 및 CH3 도메인은 IgG1과 같은 면역글로불린으로부터의 CH2 및 CH3 도메인 면역글로불린 중쇄 불변 영역 아미노산 서열을 포함하며, 상기 아미노산 서열은 1 내지 5개의 아미노산 변형을 포함하며, 본원에서 논의된 바와 같이 선택될 수 있다. 전술한 것 중 임의의 것에서, 세포외 스페이서는 SEQ ID NO: 2(Ser-Gly-Gly-Gly) 또는 SEQ ID NO: 3(Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)의 서열을 갖는 링커와 같은 링커를 추가로 포함할 수 있으며, 이는 세포외 스페이서를 CTX 또는 CTX-유사 펩타이드(또는 전술한 임의의 것의 기능적 변이체)를 포함하는 세포외 도메인에 연결시키는 1 내지 10 복제본으로 가지며 존재할 수 있다.
특정 구현예에서, 항원 인식 도메인은 가요성 링커를 통해 막횡단 도메인에 연결된다. 가요성 링커는 세포외 스페이서 이외에, 또는 본원에 기술된 세포외 공간 대신에 존재할 수 있다. 특정 구현예에서, 세포외 도메인/항원 인식 도메인은 가요성 링커를 통해 세포외 스페이서에 연결된다. 바람직하게는, 가요성 링커는 예를 들어 글리신 및 세린을 포함한다. 바람직하게는, 가요성 링커는 SEQ ID NO: 2(Ser-Gly-Gly-Gly)n 또는 SEQ ID NO: 3(Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)n의 서열을 갖는 폴리펩타이드를 포함하며, 여기서 n은 1~10의 정수이다. 바람직하게는, 각각의 가요성 링커는 약 1~25개 아미노산, 바람직하게는 약 1~15개 아미노산, 바람직하게는 약 1~10개 아미노산, 바람직하게는 약 4~24개 아미노산, 바람직하게는 약 5~20개 아미노산, 바람직하게는 약 5~15개 아미노산, 및 바람직하게는 약 5~12개 아미노산을 포함하는 폴리펩타이드이다. 바람직하게는, 링커는 (Ser-Gly-Gly-Gly)n이고, 여기서 n은 3이다.
바람직하게는, 본 발명의 CTX-CAR은 당 업계에 공지된 임의의 분자의 막횡단 도메인에 상응하거나, 이로부터 유도되거나, 이로부터 수득된 막횡단 도메인을 포함한다. 예를 들어, 막횡단 도메인은 CD8 분자 또는 CD28 분자의 도메인과 상응할 수 있다. CD8은 T-세포 수용체(TCR)에 대한 보조-수용체 역할을 하는 막횡단 당단백질이며, 세포독성 T-세포의 표면 상에 주로 발현된다. CD8의 가장 일반적인 형태는 CD8α와 CD8β 사슬로 구성된 이량체로 존재한다. CD28은 T-세포 상에서 발현되며, T-세포 활성화에 필요한 보조-자극 신호를 제공한다. CD8 폴리펩타이드로부터의 막횡단 도메인은 서열 IYIWAPLAGT CGVLLLSLVI TLYC(SEQ ID NO: 23), 특히 SEQ ID NO: 23의 아미노산 1~21, 1~23 또는 1~24를 가질 수 있다. CD28은 CD80(B7.1)과 CD86(B7.2)에 대한 수용체이다. CD28 폴리펩타이드로부터의 막횡단 도메인은 서열 FWVLVVVG GVLACYSLLV TVAFIIFWV(SEQ ID NO: 22)를 가질 수 있다. 바람직하게는, CD8 및 CD28은 인간이다. 본 발명의 CTX-CAR의 바람직한 막횡단 도메인은 T-세포 수용체의 알파, 베타 또는 제타 사슬, CD28, CD3 엡실론, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154, KIRDS2, OX40, CD2, CD27, LFA-1 (CDlla, CD18), ICOS (CD278), 4-1BB (CD137), GITR, CD40, BAFFR, HVEM (LIGHTR), SLAMF7, NKp80 (KLRF1), CD160, CD19, IL2Rβ, IL2R γ, IL7Rα, ITGA1, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CDlld, ITGAE, CD103, ITGAL, CDl la, LFA-1, ITGAM, CDllb, ITGAX, CDl lc, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, TNFR2, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), SLAMF6 (NTB-A, Lyl08), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, PAG/Cbp, NKp44, NKp30, NKp46, NKG2D, 및/또는 NKG2C로부터 선택되는 폴리펩타이드로부터의 막횡단 도메인의 전부 또는 일부를 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 당업자는 상기 폴리펩타이드로부터 상응하는 막횡단 영역을 결정할 수 있을 것이다.
CTX-CAR은 상기 언급된 막횡단 도메인 중 임의의 하나 및 임의의 하나 이상의(예를 들어, 1, 2, 3 또는 4개)의 상기 언급된 세포내 T-세포 신호전달 도메인을 임의의 조합으로 포함할 수 있다. 예를 들어, CTX-CAR은 CD28 막횡단 도메인 및 CD28 및 CD3ζ의 세포내 T-세포 신호 도메인을 포함할 수 있다. 또한, 임의의 막횡단 도메인 서열은 본원에서 논의된 바와 같이 선택될 수 있는, 1 내지 5개의 아미노산 변형을 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 CTX-CAR은 CTX 또는 CTX-유사 펩타이드 또는 상기의 기능적 변이체, 항원 인식 도메인을 세포외 스페이서에 연결시키는 임의의 링커를 포함하는 항원 인식 도메인; 면역글로불린 분자 및/또는 면역글로불린 중쇄 불변 영역의 전부 또는 일부로부터의 힌지 영역의 전부 또는 일부를 포함하는 세포외 스페이서; 면역 효과기 세포의 막횡단 영역으로부터 유래된 막횡단 영역; 및 본원에 기재된 바와 같은 적어도 하나의 신호전달 도메인 및 임의의 보조자극 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. CTX를 포함하는 항원 인식 도메인, (Ser-Gly-Gly-Gly)3(SEQ ID NO: 2)를 포함하는 링커; IgD 힌지 및 IgG1의 CH2CH3 도메인으로부터 유래된 힌지 영역을 포함하는 세포외 스페이서; CD-28의 막횡단 영역으로부터 유래된 막횡단 영역; 및 CD28/Ox40 및 CD3ζ를 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 본 발명의 바람직한 CTX-CAR의 작제물이 도 1에 도시된다. 도 1(하부 패널)은 CTX가 없는 CTX 작제물 또는 CTX-유사 펩타이드 또는 랜덤 펩타이드 서열(MRLNLIK)(SEQ ID NO: 5)을 포함하는 전술한 기능적 변이체, (Ser-Gly-Gly-Gly)3(SEQ ID NO: 2)를 포함하는 링커; IgD의 힌지 및 IgG1의 CH2CH3 도메인 유래의 힌지 영역을 포함하는 세포외 스페이서; CD-28의 막횡단 영역으로부터 유래된 막횡단 영역; 및 CD28/Ox40 및 CD3ζ를 포함하는 세포내 신호전달 영역을 도시한다. 도 2는 막에 삽입된 도 1의 CTX-CAR 및 noCTX-CAR을 도시한다.
본 발명의 다른 바람직한 CTX-CAR은 도 3에 도시되어 있다. 도 3의 상단에 있는 작제물의 CTX-CAR은 CTX를 포함하는 항원 인식 도메인, (Ser-Gly-Gly-Gly)3(SEQ ID NO: 2)를 포함하는 링커; IgD 힌지 및 IgG1의 CH2CH3 도메인으로부터 유래된 힌지 영역을 포함하는 세포외 스페이서; CD-28의 막횡단 영역으로부터 유래된 막횡단 영역; 및 CD3ζ만을 함유하는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 전형적인 제1 세대 CTX-CAR을 도시한다. 도 3의 하단에 있는 작제물은 (Ser-Gly-Gly-Gly)3(SEQ ID NO: 2)를 포함하는 링커인 CTX를 포함하는 항원 인식 도메인; IgD 힌지 및 IgG1의 CH2CH3 도메인으로부터 유래된 힌지 영역을 포함하는 세포외 스페이서; CD-28의 막횡단 영역으로부터 유래된 막횡단 영역을 포함하며; 및 기능적 세포내 신호전달 도메인이 결여된 CTX-CAR을 도시한다.
본원에 기재된 CTX-CAR의 기능적 부분은 본 발명의 범위에 포함된다. 용어 "기능적 부분"은 CTX-CAR와 관련하여 사용될 때, CTX-CAR의 생물학적 활성을 보유하는, 본 발명의 CAR의 임의의 부분 또는 단편을 지칭한다(모체 CTX-CAR). 기능적 부분은 예를 들어 표적 세포를 인식하거나, 질환을 모체 CTX-CAR과 유사한 정도, 동일한 정도, 또는 더 높은 정도로 검출, 치료 또는 예방하는 능력을 보유하고 있는 CTX-CAR의 부분을 포함한다. 모체 CTX-CAR을 코딩하는 핵산 서열과 관련하여, CTX-CAR의 기능적 부분을 코딩하는 핵산 서열은 예를 들어 모체 CAR의 약 10%, 25%, 30%, 50%, 68%, 80%, 90%, 95% 또는 그 이상을 포함하는 단백질을 코딩할 수 있다. CTX-CAR의 기능적 부분은 그 부분의 아미노 또는 카복시 말단 또는 양 말단에 부가적인 아미노산을 함유할 수 있으며, 부가적인 아미노산은 모체 CTX-CAR의 아미노산 서열에서 발견되지 않는다. 바람직하게는, 부가적인 아미노산은 기능적 부분의 생물학적 기능을 방해하지 않으며, 예를 들어 표적 세포를 인식하고, 암을 검출하고, 암을 치료 또는 예방한다. 더욱 바람직하게는, 추가의 아미노산은 모체 CTX-CAR의 생물학적 활성과 비교하여, CTX-CAR의 생물학적 활성을 개선시킨다.
본 발명은 또한 본 발명의 CTX-CAR의 기능적 변이체를 제공한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "기능적 변이체"는 본 발명의 CTX-CAR과 실질적 또는 상당한 서열 동일성 또는 유사성을 갖는 CTX-CAR, 폴리펩타이드, 또는 단백질을 지칭하며, 이 기능적 변이체는 그것이 변종인 CTX-CAR(모체 CTX-CAR)의 생물학적 활성을 보유한다. 기능적 변이체는 예를 들어, 모체 CTX-CAR과 유사한 정도, 동일 정도 또는 더 높은 정도로 표적 세포를 인식하는 능력을 보유하고 있는 모체 CTX-CAR의 변이체를 포함한다. 본 발명의 모체 CAR을 코딩하는 핵산 서열과 관련하여, CTX-CAR의 기능적 변이체를 코딩하는 핵산 서열은 모체 CTX-CAR을 코딩하는 핵산 서열과 예를 들어, 약 10% 동일, 약 25% 동일, 약 30% 동일, 약 50% 동일, 약 65% 동일, 약 80% 동일, 약 90% 동일, 약 95% 동일 또는 약 99% 동일할 수 있다.
기능적 변이체는 예를 들어, 당업자 중 한명에게 공지된 바와 같이 선택될 수 있는 적어도 하나의 아미노산 변형(예컨대, 결실, 삽입 및 치환을 포함하지만, 이에 한정되지 않음)을 갖는 CTX-CAR의 아미노산 서열을 포함하여, 원하는 CTX-CAR 기능적 변이체를 생성시킬 수 있다. 아미노산 변형을 선택하기 위한 지침이 본원에 제공된다.
일 구현예에서, 본 발명의 CTX-CAR은 세포외 항원 인식 모이어티로서 CTX를 이용한다. 일 구현예에서, 본 발명의 CTX-CAR은 세포외 항원 인식 모이어티로서 CTX-유사 펩타이드를 이용한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 CTX-CAR은 세포외 항원 인식 모이어티로서 CTX의 기능적 변이체를 이용한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 CTX-CAR은 세포외 항원 인식 모이어티로서 CTX의 기능적 변이체를 사용하며, CTX의 상기 기능적 변이체는 CTX(SEQ ID NO: 1)와 비교하여 하나 이상의 아미노산 변형(예컨대, 결실, 삽입 및 치환, 이에 한정되지 않음)을 함유한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 CTX-CAR은 세포외 항원 인식 모이어티로서 CTX의 기능적 변이체를 사용하며, CTX의 상기 기능적 변이체는 SEQ ID NO: 1과 70%, 80%, 90%, 95% 또는 그 이상의 상동성을 갖는 서열을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 CTX-CAR은 세포외 항원 인식 모이어티로서 CTX-유사 펩타이드의 기능적 변이체를 이용한다. 또 다른 구현예에서, 본원의 CTX-CAR은 세포외 항원 인식 모이어티로서 CTX-유사 펩타이드의 기능적 변이체를 이용하며, CTX-유사 펩타이드의 상기 기능적 변이체는 SEQ ID NO: 6~21의 CTX-유사 펩타이드와 비교하여, 하나 이상의 아미노산 변형(예컨대 결실, 삽입 및 치환, 이에 한정되지 않음)을 함유한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 CTX-CAR은 세포외 항원 인식 모이어티로서 CTX-유사 펩타이드의 기능적 변이체를 이용하며, CTX-유사 펩타이드의 상기 기능적 변이체는 SEQ ID NO: 6~21의 서열과 70%, 80%, 90%, 95% 또는 그 이상의 상동성을 갖는다.
특정 구현예에서, CTX 또는 CTX-유사 펩타이드의 기능적 변이체는 모체 폴리펩타이드(CTX 또는 CTX-유사 펩타이드)에 존재하는 시스테인 잔기를 모두(일반적으로 6개) 보유한다. 특정 구현예에서, 기능적 변이체는 모체 폴리펩타이드(CTX 또는 CTX-유사 펩타이드)와 관련하여 1~6개 아미노산 변형(예를 들어, 치환, 변형 또는 결실)을 갖는다. 특정 구현예에서, 기능적 변이체는 1~2, 3~4 또는 5~6개의 변형을 갖는다. 특정 구현예에서, 아미노산 변형은 모체 폴리펩타이드(CTX 또는 CTX-유사 펩타이드)에 존재하는 시스테인 잔기(일반적으로 6개)를 포함하지 않는다.
당업자에게 공지된 바와 같이, 원하는 CTX 및/또는 CTX-유사 펩타이드 기능적 변이체를 생성하기 위해, 아미노산 변형(예컨대, 결실, 삽입 및 치환, 이에 한정되지 않음)이 선택될 수 있다. 예를 들어, 유사한 성질을 가진 아미노산의 보존적 치환 또는 치환들이 용인될 것으로 기대된다. 또한, 관련 폴리펩타이드에서 발견되는 특정 결실, 삽입 및 치환은 잘 용인될 것으로 기대된다.
SEQ ID NO: 1 및 6~21의 아미노산 서열에 대한 보존적 변형 (및 코딩 뉴클레오타이드에 대한 상응하는 변형)은 자연발생 CTX 또는 CTX-유사 펩타이드의 특성들과 유사한 기능적 및 화학적 특성을 갖는 CTX 또는 CTX-유사 펩타이드의 기능적 변이체를 생성할 것이다. "보존적 아미노산 치환” 또는 "보존적 돌연변이"라는 문구는 하나의 아미노산을 통상적인 특성을 갖는 또 다른 아미노산으로 대체하는 것을 의미한다. 보존적 돌연변이의 예로는 동일한 아미노산 하위그룹내 아미노산의 아미노산 치환, 예를 들어 아르기닌에 대하여 라이신 및 그 반대의 경우로 양전하가 유지될 수 있는 아미노산 치환; 아스파르트산에 대하여 글루탐산 및 그 반대의 경우로 음전하가 유지될 수 있는 아미노산 치환; 트레오닌에 대하여 세린으로, 유리-OH가 유지될 수 있도록 하는 아미노산 치환; 및 아스파라긴에 대하여 글루타민으로, 유리 -NH2가 유지될 수 있도록 하는 아미노산 치환이 포함된다. "보존적 아미노산 치환"은 천연 아미노산 잔기가 비천연 잔기로 치환되어 그 위치에서 아미노산 잔기의 극성 또는 전하에 거의 또는 전혀 영향을 미치지 않는 것을 포함할 수 있다. 또한, 폴리펩타이드의 임의의 천연 잔기는 또한 알라닌으로 치환될 수 있다.
보존적 아미노산 치환은 또한 생물학적 시스템에서의 합성에 의한 것보다는 화학적 펩타이드 합성에 의해 전형적으로 혼입되는 비-자연 발생 아미노산 잔기를 포함한다. 여기에는 펩타이도미메틱(peptidomimetics) 및 아미노산 잔기의 다른 역전 또는 반전 형태가 포함된다. 본원에 기술된 핵산 및 폴리펩타이드 분자는 화학적으로 합성될뿐만 아니라 재조합 수단에 의해 생성될 수 있음이 당업자에 의해 인식될 것이다.
자연 발생 잔기는 공통적인 측쇄 성질에 기초하여 하기와 같은 부류로 세분될 수 있다: 1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile; 2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; 3) 산성: Asp, Glu; 4) 염기성: His, Lys, Arg; 5) 사슬 방향에 영향을 주는 잔기: Gly, Pro; 및 6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.
비-보존적 아미노산이 유사한 활성을 갖는 관련 폴리펩타이드에서 발생하는 경우, 특히 비-보존적 아미노산 치환도 또한 고려된다. 예를 들어, 비-보존적 치환은 다른 부류의 구성원에 대한 아미노산 부류 중 하나의 구성원의 교환을 포함할 수 있다. 상기 치환된 잔기는 관련된 CTX 폴리펩타이드 오르토로그와 상 동성인 CTX 또는 CTX-유사 펩타이드 기능적 변이체의 영역으로, 또는 분자의 비-상동성 영역으로 도입될 수 있다.
상기 변화를 형성할 때, 아미노산의 수치료 지수(hydropathic index)가 고려될 수 있다. 각 아미노산은 그들의 소수성 및 전하 특성에 기초하여 수치료 지수를 부여받았으며, 이들은 이소류신(+4.5); 발린(+4.2); 류신(+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스틴(+2.5); 메티오닌(+1.9); 알라닌(+1.8); 글리신(-0.4); 트레오닌(-0.7); 세린(-0.8); 트립토판(-0.9); 티로신(-1.3); 프롤린(-1.6); 히스티딘(-3.2); 글루타메이트(-3.5); 글루타민(-3.5); 아스파테이트(-3.5); 아스파라긴(-3.5); 라이신(-3.9); 및 아르기닌(-4.5)이다. 단백질 상에 상호작용하는 생물학적 기능을 부여하는데 있어 수치료 아미노산 지수의 중요성이 본 기술 분야에서 이해된다(Kyte 등, J. Mol. Biol., 157: 105-131, 1982). 특정 아미노산이 유사한 수치료 지수 또는 점수를 갖는 다른 아미노산으로 대체될 수 있고, 여전히 유사한 생물학적 활성을 보유하는 것으로 알려져 있다. 수치료 지수에 근거한 변화를 형성할 때, 수치료 지수가 +/-2 이내인 아미노산의 치환이 사용될 수 있으며; 또 다른 구현예에서, 수치료 지수는 +/-1이고; 또 다른 대안적인 구현예에서, 수치료 지수는 +/-0.5 이내이다.
유사 아미노산의 치환이 친수성을 기초로 효율적으로 이루어질 수 있음이 또한 당 업계에서 이해된다. 인접 아미노산의 친수성에 의해 지배되는 폴리펩타이드의 가장 큰 국소 평균 친수성은 단백질의 생물학적 특성과 관련이 있다. 하기의 친수성 값이 아미노산 잔기에 할당되었다: 아르기닌(+3.0); 라이신(+3.0); 아스파테이트(+3.0 ± 1); 글루타메이트(+3.0 ± 1); 세린(+ 0.3); 아스파라긴(+0.2); 글루타민(+0.2); 글리신(0); 트레오닌(-0.4); 프롤린(-0.5 ± 1); 알라닌(-0.5); 히스티딘(-0.5); 시스테인(-1.0); 메티오닌(-1.3); 발린(-1.5); 류신(-1.8); 이소류신(-1.8); 티로신(-2.3); 페닐알라닌(-2.5); 트립토판(-3.4). 유사한 친수성 값에 기초한 변화를 만들 때, 친수성 값이 +/- 2 이내 인 아미노산의 치환이 사용될 수있다; 다른 실시 양태에서, 친수성 값은 ± 1이고; 또 다른 실시 예에서, 친수성 값은 ± 0.5 이내이다.
원하는 아미노산 치환(보존적 또는 비-보존적)은 상기 치환이 요구되는 시점에 당업자에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 아미노산 치환은 CTX 또는 CTX-유사 폴리펩타이드의 중요한 잔기를 확인하거나, CTX 또는 CTX-유사 폴리펩타이드의 특정 결합 표적과의 친화성을 증가 또는 감소시켜 본 발명의 CTX 또는 CTX-유사 폴리펩타이드의 활성(예를 들어, 효과기 기능 및/또는 면역 효과기 기능)을 증가 또는 감소시키는데 사용될 수 있다.
일 구현예에서, CTX의 기능적 변이체는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열에 대해 50%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 그 이상의 동일성을 공유하는 것이다. 일 구현예에서, CTX의 기능적 변이체는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열에 대해 80%, 90%, 95% 또는 그 이상의 동일성을 공유하는 것이다. 일 구현예에서, CTX의 기능적 변이체는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열에 대해 95% 이상의 동일성을 공유하는 것이다.
일 구현예에서, CTX-유사 폴리펩타이드의 기능적 변이체는 SEQ ID NO: 6~21 중 하나의 아미노산 서열에 대해 50%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 그 이상의 동일성을 공유하는 것이다. 일 구현예에서, CTX-유사 폴리펩타이드의 기능적 변이체는 SEQ ID NO: 6~21 중 하나의 아미노산 서열에 대해 80%, 90%, 95% 또는 그 이상의 동일성을 공유하는 것이다. 일 구현예에서, CTX-유사 폴리펩타이드의 기능적 변이체는 SEQ ID NO: 6~21 중 하나의 아미노산 서열과 95% 또는 그 이상의 동일성을 공유하는 것이다.
일 구현예에서, CTX의 기능적 변이체는 위치 1, 3, 10, 13, 14, 17, 25 및 36(SEQ ID NO: 1을 기준으로 한 위치)에 상응하는 위치에 하나 이상의 치환체를 함유하는 것이다. 상기 구현예의 일 양태에서, 지시된 위치에서의 상기 CTX 기능적 변이체에 대한 바람직한 치환은 하기를 포함한다: 위치 1의 Met에 대한 Arg; 위치 3의 Met에 대한 Lys 또는 Ser; 위치 10의 His에 대한 Pro 또는 Gln; 위치 13의 Ala에 대한 Ser 또는 Thr; 위치 14의 Arg에 대한 Lys; 위치 17의 Asp에 대한 Ala 또는 Tyr; 위치 25의 Arg에 대한 Lys; 및 위치 36의 Arg에 대한 Ala. 상기 구현예의 특정 양태에서, CTX의 기능적 변이체는 지시된 위치로부터 6개 이하의 치환, 지시된 위치로부터 4개 이하의 치환 또는 지시된 위치로부터 2개 이하의 치환을 함유한다.
일 구현예에서, CTX의 기능적 변이체는 위치 23 및 24(SEQ ID NO: 1을 기준으로 한 위치)에서 아미노산의 결실을 갖거나 갖지 않는 위치 9~11, 14~15, 17~18, 25 및 29에 상응하는 위치에 하나 이상의 치환체를 함유하는 것이다. 상기 구현예의 일 양태에서, 지시된 위치에서의 상기 CTX 기능적 변이체에 대한 바람직한 치환은 하기를 포함한다: 위치 9의 Asp에 대한 Arg; 위치 10의 His에 대한 Pro 또는 Gln; 위치 11의 Gln에 대한 Asn 또는 Asp; 위치 14의 Arg에 대한 Lys, Gln 또는 Asn; 위치 15의 Lys에 대한 Arg 또는 Gln; 위치 17의 Asp에 대한 Asn, Ala, Arg 또는 Tyr; 위치 18의 Asp에 대한 Glu 또는 Ala; 위치 25의 Arg에 대한 Tyr, Lys, Ile, Gly 또는 Asn; 위치 29의 Tyr에 대한 Phe; 및 위치 36의 Arg에 대한 Asn 또는 Ala. 상기 구현예의 또 다른 양태에서, 지시된 위치에서의 상기 CTX 기능적 변이체에 대한 바람직한 치환은 하기를 포함한다: 위치 9의 Asp에 대한 Arg; 위치 10의 His에 대한 Pro; 위치 11의 Gln에 대한 Asn; 위치 14의 Arg에 대한 Lys 또는 Gln; 위치 15의 Lys에 대한 Gln; 위치 17의 Asp에 대한 Arg; 위치 18의 Asp에 대한 Ala; 위치 25의 Arg에 대한 Asn; 위치 29의 Tyr에 대한 Phe; 및 위치 36의 Arg에 대한 Asn. 상기 구현예의 특정 양태에서, CTX의 기능적 변이체는 지시된 위치로부터 6개 이하의 치환, 지시된 위치로부터 4개 이하의 치환 또는 지시된 위치로부터 2개 이하의 치환을 함유한다.
일 구현예에서, CTX의 기능적 변이체는 위치 23 및 24(SEQ ID NO: 1을 기준으로 한 위치)에서 아미노산의 결실을 갖거나 갖지 않는 위치 1, 3, 9~15, 17~18, 21, 25~26, 29~31 및 36에 상응하는 위치에 치환체를 함유하는 것이다. 상기 구현예의 일 양태에서, 지시된 위치에서의 상기 CTX 기능적 변이체에 대한 바람직한 치환은 하기를 포함한다: 위치 1의 Met에 대한 Arg; 위치 3의 Met에 대한 Lys, Ser 또는 Gly; 위치 9의 Asp에 대한 Arg; 위치 10의 His에 대한 Pro 또는 Gln; 위치 11의 Gln에 대한 Asn 또는 Asp; 위치 12의 Met에 대한 Tyr; 위치 13의 Ala에 대한 Ser, Thr 또는 Glu; 위치 14의 Arg에 대한 Lys, Gln 또는 Asn; 위치 15의 Lys에 대한 Arg 또는 Gln; 위치 17의 Asp에 대한 Asn, Ala, Arg 또는 Tyr; 위치 18의 Asp에 대한 Glu 또는 Ala; 위치 21의 Gly에 대한 Arg 또는 Lys; 위치 25의 Arg에 대한 Tyr, Lys, Ile, Gly 또는 Asn; 위치 27의 Gly에 대한 Lys; 위치 29의 Tyr에 대한 Phe; 위치 30의 Gly에 대한 Phe; 위치 31의 Asp에 대한 Gly 또는 Tyr; 위치 36의 Arg에 대한 Asn 또는 Ala. 상기 구현예의 특정 양태에서, CTX의 기능적 변이체는 지시된 위치로부터 12개 이하의 치환, 지시된 위치로부터 10개 이하의 치환, 지시된 위치로부터 8개 이하의 치환, 지시된 위치로부터 6개 이하의 치환, 지시된 위치로부터 4개 이하의 치환, 또는 지시된 위치로부터 치환이 2개 이하의 치환을 함유한다.
또 다른 구현예에서, CTX의 기능적 변이체는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 2~36의 서열을 갖는 폴리펩타이드이다. 상기 구현예의 일 양태에서, CTX 변이체는 아미노산 1, 3, 10, 13, 14, 17, 25 및 36에 대해 기재된 아미노산 치환, 상기 아미노산 9~11, 14~15, 17~18, 25 및 29에 기재된 아미노산 치환 또는 상기 아미노산 1, 3, 9~15, 17~18, 21, 25~26, 29~31 및 36에 대해 기재된 아미노산 치환을 가질 수 있다.
또 다른 구현예에서, CTX의 기능적 변이체는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 1~35의 서열을 갖는 폴리펩타이드이다. 상기 구현예의 일 양태에서, CTX 변이체는 아미노산 1, 3, 10, 13, 14, 17, 25 및 36에 대해 기재된 아미노산 치환, 상기 아미노산 9~11, 14~15, 17~18, 25 및 29에 기재된 아미노산 치환 또는 상기 아미노산 1, 3, 9~15, 17~18, 21, 25~26, 29~31 및 36에 대해 기재된 아미노산 치환을 가질 수 있다.
또 다른 구현예에서, CTX의 기능적 변이체는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 2~35의 서열을 갖는 폴리펩타이드이다. 상기 구현예의 일 양태에서, CTX 변이체는 아미노산 1, 3, 10, 13, 14, 17, 25 및 36에 대해 기재된 아미노산 치환, 상기 아미노산 9~11, 14~15, 17~18, 25 및 29에 기재된 아미노산 치환 또는 상기 아미노산 1, 3, 9~15, 17~18, 21, 25~26, 29~31 및 36에 대해 기재된 아미노산 치환을 가질 수 있다.
본 발명에 따른 CTX-CAR은 당 업계에 공지된 임의의 수단에 의해 제조될 수 있지만, 바람직하게는 재조합 DNA 기술을 사용하여 제조된다. CTX-CAR의 여러 영역을 코딩하는 핵산 서열이 준비되고 분자 클로닝의 표준 기술(게놈 라이브러리 스크리닝, PCR, 프라이머-보조 결찰, 부위-지정 돌연변이유발 등)에 의해 완전한 코딩 서열로 조립될 수 있다. 결과 코딩 영역은 바람직하게는 발현 벡터 내로 삽입되고, CTX-CAR의 발현을 위해 적당한 발현 숙주 세포주, 예컨대 면역 효과기 세포, 바람직하게는 T 림프구 세포주, 및 가장 바람직하게는 자가 T 림프구 세포주, 제3 당 유래된 T 세포주/클론, 형질전환된 체액성 또는 이종면역성 효과기 세포주를 형질전환하는데 사용된다. 자연 킬러 (NK) 세포, 대식세포, 호중구, 종양 침윤 림프구 (TIL), 임포킨 키나제 (LAK) 세포, 기억 T 세포, 조절 T 세포, 세포 독성 T 림프구 (CTL), 감마 델타 T 세포 T 세포) 및 이들 세포로 분화하는 줄기 세포도 사용할 수 있다. 바람직하게는 γδ-T 세포가 숙주 세포주로서 사용된다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "핵산 작제물” 또는 "핵산 서열"은 발현 숙주 세포주, 예컨대 제한 없이, T 세포로 형질전환되거나 도입될 수 있는, 및 생성물(예를 들어, 키메라성 수용체)을 생성하도록 발현될 수 있는 핵산 분자, 예컨대 DNA 분자를 의미하는 것으로 의도된다. 따라서, 본 발명은 추가로 본 발명의 CTX-CAR을 코딩하는 단리된 또는 정제된 핵산 서열을 제공한다. "핵산 서열"은 DNA 또는 RNA의 중합체, 즉 단일-가닥 또는 이중-가닥일 수 있고 비-천연 또는 변형된 뉴클레오타이드를 함유할 수 있는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 것으로 의도된다. 본 명세서에 사용된 용어 "핵산” 및 "폴리뉴클레오타이드"는 리보뉴클레오타이드(RNA) 또는 데옥시리보뉴클레오타이드(DNA) 중 임의의 길이의 중합체 형태의 뉴클레오타이드를 지칭한다. 이 용어는 분자의 1차 구조를 지칭하며, 따라서 이중 나선 및 단일 가닥 DNA, 이중 및 단일 가닥 RNA를 포함한다. 상기 용어는 등가물로서 뉴클레오타이드 유사체 및 변형된 폴리뉴클레오타이드, 예컨대 제한없이, 메틸화된 및/또는 캡핑된 폴리뉴클레오타이드로부터 제조된 RNA 또는 DNA의 유사체를 포함한다. 본 발명에 사용된 핵산 작제물에서, 프로모터는 본 발명의 CTX-CAR을 코딩하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결되며, 즉, 프로모터는 키메라성 수용체를 코딩하는 DNA로부터 메신저 RNA의 전사를 촉진하도록 위치한다. 프로모터는 게놈 기원이거나 합성으로 생성될 수 있다. T 세포에 사용하기 위한 다양한 프로모터가 당 업계에 잘 알려져 있다. 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있으며, 유도는 예를 들어 특정 세포 유형 또는 특정 수준의 성숙과 관련된다. 대안적으로, 다수의 잘 알려진 바이러스 프로모터가 또한 적합하다. 관심의 프로모터는 β-액틴 프로모터, SV40 초기 및 후기 프로모터, 면역글로불린 프로모터, 인간 사이토메갈로바이러스 프로모터, 레트로바이러스 프로모터 및 프렌즈 비장 포커스-형성 바이러스 프로모터를 포함한다. 프로모터는 인핸서와 관련될 수도 있고 관련되지 않을 수도 있으며, 인핸서는 자연적으로 특정 프로모터와 결합되거나 상이한 프로모터와 결합될 수 있다.
본 발명의 CTX-CAR을 제조하기 위한 다양한 조작은 시험 관내에서 수행될 수 있으며, 바람직하게는 CTX-CAR 키메라성 작제물이 표준 형질전환 또는 트랜스펙션 방법을 사용하여 적절한 숙주 세포에서 클로닝 및 발현을 위한 벡터로 도입된다. 따라서, 각각의 조작 후, DNA 서열의 결합으로부터 생성된 작제물이 클로닝되고, 벡터가 단리되고, 서열이 스크리닝되어, 목적하는 키메라성 수용체를 코딩하는지를 스크리닝한다. 상기 서열은 제한 분석, 시퀀싱 등에 의해 스크리닝될 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 CTX-CAR 또는 이의 기능적 등가물을 코딩하는 벡터를 포함한다.
본 발명의 작제물을 발현시키기 위한 적절한 숙주 세포는 활성화시 표적 세포를 살해할 수 있는 임의의 면역 효과기 세포, 바람직하게는 T 림프구 세포주, 및 가장 바람직하게는 자가 T 림프구 세포주, 제3 당 유래된 T 세포주/클론, 형질전환 체액성 또는 이종 면역성 효과기 세포주를 포함한다. 자연 킬러 (NK) 세포, 대식세포, 호중구, 종양 침윤 림프구 (TIL), 임포킨 키나제 (LAK) 세포, 기억 T 세포, 조절 T 세포, 세포 독성 T 림프구 (CTL), 감마 델타 T 세포 T 세포) 및 이들 세포로 분화하는 줄기 세포도 사용할 수 있다. 바람직하게는 γδ-T 세포가 숙주 세포주로서 사용된다.
당해 기술 분야의 숙련자에게 잘 알려진 바와 같이, 대상체로부터 상기 세포를 단리 및 확장시키기 위해 다양한 방법들이 용이하게 이용가능하다. 예를 들어, 세포 표면 마커 발현을 사용하거나, 상업용으로 사용가능한 키트를 사용한다. 키메라성 작제물은 네이키드 DNA 또는 적합한 벡터에서 대상체의 자신의 T 세포로 도입될 수 있는 것으로 고려된다. 네이키드 DNA를 사용하여 전기천공에 의해 T 세포를 안정적으로 트랜스펙션시키는 방법은 당 업계에 공지되어있다. 네이키드 DNA는 일반적으로 발현을 위한 적절한 배향으로 플라스미드 발현 벡터에 함유된 본 발명의 키메라성 수용체를 코딩하는 DNA를 지칭한다. 유리하게는, 네이키드 DNA의 사용은 본 발명의 키메라성 수용체를 발현하는 T 세포를 생산하는데 필요한 시간을 감소시킨다.
따라서, 본 발명은 본 발명의 CTX-CAR(들)을 코딩하는 벡터뿐만 아니라 그의 기능적 변이체를 함유하는(즉, 이에 의해 형질전환되거나 형질도입된) 숙주 세포를 포함한다. 바람직하게는 숙주 세포는 면역 효과기 세포, 바람직하게는 T 림프구 세포주, 및 가장 바람직하게는 자가 T 림프구 세포주, 제3 당 유래된 T 세포주/클론, CTX-CAR 발현을 위한 형질전환 체액성 또는 이종 면역성 효과기 세포주를 포함한다. 자연 킬러 (NK) 세포, 대식세포, 호중구, 종양 침윤 림프구 (TIL), 임포킨 키나제 (LAK) 세포, 기억 T 세포, 조절 T 세포, 세포 독성 T 림프구 (CTL), 감마 델타 T 세포 T 세포) 및 이들 세포로 분화하는 줄기 세포도 사용할 수 있다. 바람직하게는 γδ-T 세포가 숙주 세포주로서 사용된다. T-세포, 트랜스펙션된 또는 형질도입된 T 세포가 목적하는 조절 및 목적하는 수준의 표면 막 단백질로서 키메라성 수용체를 발현할 수 있다는 것이 확인되면, 키메라성 수용체가 숙주 세포에서 기능하여 원하는 신호 유도를 위해 제공되는지 여부를 결정할 수 있다. 이어서, 형질도입된 T 세포가 환자에게 재도입되거나 투여되어, 대상체에서 항-종양 반응을 활성화시킨다.
일 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 CTX-CAR(들)을 코딩하는(즉, 발현을 유도하는) 적어도 하나의 벡터뿐만 아니라 이의 기능적 변이체를 포함하는(즉, 형질전환된 또는 형질도입된) 숙주 세포 및 본 명세서에 개시된 바와 같은 생존 인자를 포함한다. 본 발명의 임의의 CTX-CAR이 사용될 수 있다. 또한, 적어도 하나의 벡터는 응력-유도 항원 수용체(예컨대, NKG2D, 이에 한정되지 않음)를 코딩(즉, 발현 유도)할 수 있다. 본원에서 논의된 바와 같이, 생존 인자는 숙주 세포가 부가적인 치료적 처치에 의해 생성되는 치료 환경에서 생존하는 것을 허용한다. 특정 구현예에서, 단일 벡터는 CTX-CAR 및 생존 인자를 코딩한다. 특정 구현예에서, 단일 벡터는 CTX-CAR, 생존 인자 및 스트레스-유도 항원 수용체를 코딩한다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 벡터는 CTX-CAR, 생존 인자 및 스트레스-유도 항원 수용체를 코딩한다(예를 들어, CTX-CAR 및 생존 인자를 코딩하는 벡터 및 스트레스-유도 항원 수용체를 코딩하는 벡터).
특정 구현예에서, 키메라성 항원 수용체(CAR) 및 생존 인자(및 임의로 스트레스-유도 항원 수용체)의 발현을 지시하는 적어도 하나의 벡터를 포함하는 숙주 세포가 분리되거나 정제된다. 특정 구현예에서, 키메라 항원 수용체 (CAR) 및 생존 인자 (및 선택적으로 스트레스-유도 항원 수용체)의 발현을 지시하는 하나 이상의 벡터를 포함하는 숙주 세포는 γδT 세포이다. 바람직하게는 본 발명의 CTX-CAR을 발현하는 숙주 세포는 면역 효과기 세포, 바람직하게는 T 세포 또는 NK 세포이며, 바람직하게는 γδ-T 세포. 상기 숙주 세포는 임의로 숙주 세포, 예를 들어, 면역 효과기 세포가 추가적인 치료적 처치(예를 들어, 화학요법)에 의해 생성되는 치료 환경에서 생존하는 것을 허용하는 생존 인자(예컨대, 하나 이상의 화학요법제에 대한 내성을 부여하는 폴리펩타이드)를 발현하도록 조작될 수 있다. 상기 세포는 본원에서 약제 내성(drug resistant, DR) 세포로 지칭되며, 치료법에서 그들의 용도는 본원에서 "약물 내성 면역요법"(DRI)으로 언급된다. DR 세포 및 DRI는 WO 2011/053750에 기재되어 있으며, 그의 교시는 본원에 참고로 포함된다. 상기 생존 인자는 치료 계획에 대한 내성을 제공하고 및/또는 본원의 생존 인자 및 CTX-CAR을 포함하는 세포가 치료 환경(예컨대, 화학요법 치료 환경)에서 생존하도록 한다. 특정 구현예에서, 추가의 치료적 처치는 뉴클레오시드-유사체 화학요법 약물, 알킬화제, 항대사제, 항생제, 토포이소머라제 억제제, 유사분열 억제제, 분화제 또는 호르몬 치료제에 의한 처치이며, 생존 인자는 추가적인 치료적 처치에 대한 내성을 제공한다. 특정 구현예에서, 생존 인자는 MGMT, 다약제 내성 단백질 1(MDR1) 또는 5'뉴클레오티다제 II(NT5C2)이다. 다른 생존 인자는 예를 들어, 디하이드로폴레이트 리덕타제(L22Y-DHFR) 및 티미딜레이트 신타제의 약물 내성 변이체를 포함한다. 바람직하게, 생존 인자는 MGMT이다. 그러나, 다른 생존 인자는 치료 환경의 성질(즉, 본 발명의 세포 조성물과 조합하여 환자에게 다른 치료 요법이 주어지고 있는 것)에 따라 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "추가적인 치료적 처치에 의해 생성되는 치료 환경에서 생존하는"이라는 문구는 "추가적인 치료적 처치의 존재 하에서 생존"이라는 문구와 상호교환가능하게 사용될 수 있으며, 각각의 문구는 숙주 세포가 추가적인 치료적 처치에서 사용되는 제제와의 직접적인 접촉시 생존하는 능력 또는 그의 기능을 여전히 수행하면서 추가적인 치료적 처치/제제의 사용으로 인한 본 발명의 세포 조성물의 환경에서의 세포독성의 존재 하에서 생존하는 능력을 지칭한다. 일 구현예에서, 추가적인 치료적 처치는 추가적인 치료제에 의한 처치이다. DRI와 함께 사용하기 위한 추가의 치료제는: 알킬화제(예를 들어, 시클로포스파미드, 이포스파미드, 멜팔란); 대사 길항제(예를 들어, 메토트렉세이트(MTX), 5-플루오로우라실 또는 이의 유도체); DNA 탈메틸화제(항대사물질; 예를 들어, 아자시티딘); 치환된 뉴클레오타이드; 치환된 뉴클레오시드; 항종양 항생제(예를 들어, 미토마이신, 아드리아마이신); 식물-유래 항종양제(예를 들어, 빈크리스틴, 빈데신, TAXOL®, 파클리탁셀, 아브락산); 시스플라틴; 카보플라틴; 에토포시드; 등을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 상기 제제는 항암제 트리메토트렉세이트(TMTX); 테모졸로미드(TMZ); 랄티트렉세드(raltitrexed); S-(4-니트로벤질)-6-티오이노신(NBMPR); 6-벤질구아니딘(6-BG); 니트로소우레아(예를 들어, BCNU로도 알려져 있는 비스-클로로에틸니트로소우레아 및 CCNU로도 알려져 있는 카르무스틴, +/-프로카르바진 및 빈크리스틴(PCV 처방) 및 포테무스틴); 독소루비신; 시타라빈; 캄토테신; 및 그의 임의의 치료적 유도체를 추가로 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명의 CTX-CAR을 발현하는 T 세포, NK 세포 및 바람직하게는 γδ-T 세포와 같은 DR 면역 효과 세포는 본 명세서에 기재된 CTX-CAR 및 생존 인자, 및 선택적으로 다른 요소(예를 들어, 자살 유전자 및/또는 스트레스-유도 항원 수용체)를 코딩하거나 발현할 수 있는 핵산 작제물을 혼입함으로써 제조될 수 있다. 특정 구현예에서, 단일 핵산 작제물은 CTX-CAR 및 생존 인자뿐만 아니라 추가의 임의적 요소(예를 들어, 자살 유전자 및/또는 스트레스-유도 항원 수용체)를 코딩한다. 특정 구현예에서, 별도의 핵산 작제물은 각각의 CTX-CAR 및 생존 인자, 및 임의의 다른 요소(예를 들어, 자살 유전자 및/또는 스트레스-유도 항원 수용체)를 코딩한다. 특정 구현예에서, 단일 핵산 작제물은 CTX-CAR 및 생존 인자를 코딩하고, 하나 이상의 핵산 작제물은 추가의 임의적 요소(예를 들어, 자살 유전자 및/또는 스트레스-유도 항원에 대한 수용체)를 코딩한다.
바람직하게는 본 발명의 CTX-CAR을 발현하는 숙주 세포(예를 들어 T 세포, NK 세포 및 바람직하게는 γδ-T 세포와 같은 면역 효과기 세포, 및 DR 면역 효과기 세포 포함, 그러나 이에 한정되지 않음)는 스트레스-유도 항원 수용체를 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 CTX-CAR을 발현하는 숙주 세포는 스트레스-유도 항원 수용체를 코딩하는 유전자를 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 CTX-CAR을 발현하는 숙주 세포는 스트레스-유도 항원 수용체를 자연적으로 발현한다. 특정 구현예에서, DR 면역 효과기 세포는 스트레스-유도 항원 수용체를 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 CTX-CAR을 발현하는 DR 면역 효과기 세포는 스트레스-유도 항원 수용체를 자연적으로 발현한다. 전술한 특정 구현예에서, 스트레스-유도 항원 수용체는 NKGD2이다. 특정 구현예에서, NKGD2 수용체를 포함하지만, 이에 한정되지 않는 스트레스-유도 항원 수용체는 DR 면역 효과기 세포를 포함하는, 숙주 세포에서 증가된 수준으로 유도된다.
바람직하게는 본 발명의 CTX-CAR을 발현하는 숙주 세포(예를 들어, T 세포, NK 세포 및 바람직하게는 γδ-T 세포와 같은 면역 효과기 세포, 및 DR 면역 효과기 세포 포함, 그러나 이에 한정되지 않음)는 대상체에게 투여되는 조성물의 성분이다.
일 구현예에서, 상기 조성물은 본 발명의 CTX-CAR을 발현하는 숙주 세포(예를 들어, T 세포, NK 세포 및 바람직하게는 γδ-T 세포와 같은 면역 효과기 세포, 및 DR 면역 효과기 세포 포함, 그러나 이에 한정되지 않음) 및 추가의 면역 시스템 세포를 포함한다. 예를 들어, 상기 조성물은 본 발명의 CTX-CAR을 발현하는 γδ T 세포 및 NK 세포를 포함할 수 있거나, 본 발명의 CTX-CAR을 발현하는 γδ T 세포 및 αβ T 세포 및 NK 세포를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 조성물은 본 발명의 CTX-CAR을 발현하는 γδ T 세포 및 추가의 면역계 세포를 포함하며, 상기 γδ T 세포는 전체 세포 집단의 60% 이상 존재한다. 특정 구현예에서, 상기 조성물은 본 발명의 CTX-CAR을 발현하는 γδ T 세포 및 NK 세포를 포함하며, 상기 γδ T 세포는 전체 세포 집단의 60% 이상 존재한다. 특정 구현예에서, 상기 조성물은 본 발명의 CTX-CAR을 발현하는 γδ T 세포 및 NK 세포를 포함하며, 상기 γδ T 세포는 전체 세포 집단의 60% 이상 존재하고, 상기 NK 세포는 25% 이하 존재한다. 특정 구현예에서, 상기 조성물은 본 발명의 CTX-CAR을 발현하는 γδ T 세포 및 αβ T 세포를 포함하며, 상기 γδ T 세포는 전체 세포 집단의 60% 이상 존재한다. 특정 구현예에서, 상기 조성물은 본 발명의 CTX-CAR을 발현하는 γδ T 세포 및 αβ T 세포를 포함하며, 상기 γδ T 세포는 전체 세포 집단의 60% 이상 존재하고, 상기 αβ T 세포는 5% 이하 존재한다. 특정 구현예에서, 상기 조성물은 본 발명의 CTX-CAR을 발현하는 γδ T 세포 및 αβ T 세포 및 NK 세포를 포함하며, 상기 γδ T 세포는 전체 세포 집단의 60% 이상 존재한다. 특정 구현예에서, 상기 조성물은 본 발명의 CTX-CAR을 발현하는 γδ T 세포 및 αβ T 세포 및 NK 세포를 포함하며, 상기 γδ T 세포는 전체 세포 집단의 60% 이상 존재하고, 상기 αβ T 세포는 5% 이하 존재하고, 상기 NK 세포는 전체 세포 집단의 25% 이하 존재한다.
바람직하게는, 본 발명의 CTX-CAR을 발현하는 숙주 세포(예를 들어, T 세포, NK 세포 및 바람직하게는 γδ-T 세포와 같은 면역 효과기 세포, 및 DR 면역 효과기 세포 포함, 그러나 이에 한정되지는 않음)를 포함하는 조성물은 단일 유형의 면역계 세포의 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 이상을 포함한다. 전술한 일 양태에서, 상기 조성물은 γδ T 세포의 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 이상을 포함하며, 상기 γδ T 세포는 본 발명의 CTX-CAR을 발현한다. 상기 조성물의 일 양태에서, 상기 조성물은 60% 이상의 γδ T 세포, 및 5% 이하의 αβ T 세포 및 25% 이하의 NK 세포를 포함하며, 상기 γδ T 세포는 본 발명의 CTX-CAR을 발현한다. 일 구현예에서, 존재하는 다양한 세포 유형의 백분율은 유동 세포계측법에 의해 결정된다.
생존 인자(예컨대 MGMT 유전자)의 사용은 본 발명의 CTX-CAR을 발현하는 숙주 세포, 본 발명의 (예를 들어, DR 면역 효과기 세포를 포함하는 면역 효과기 세포)를 포함하는 조성물이 종양이 최대한으로 스트레스를 받을 가능성이 있는 시점에서 추가의 치료적 처치에 의해 생성되는 치료 환경에서 생존하도록 한다. 특정 구현예에서 종양에 대한 스트레스 효과는 숙주 세포(예를 들어, γδ T 세포) 상의 NKG2D 수용체와 같은 수용체에 의해 인식되는 스트레스 항원의 발현을 증가시킨다. 스트레스 항원을 유도하고 화학요법으로 조절 T 세포를 감소시키는 이중 효과는 개별 요법보다 종양 감소를 유의하게 개선시킨다. 유전자 변형은 화학요법 레지멘, 예를 들어 TMZ의 림프구제거 효과로부터 본 발명의 조성물을 보호하며, 본 발명의 세포 조성물이 화학요법에 의해 최대로 스트레스받는 시점에 손상되지 않은 T 세포 세포독성 기능과 조합된 TAA를 통해 종양에 특이적으로 접근할 수 있도록 한다. 본 발명에 따른 CTX-CAR과 조합된 DRI의 사용은 본원에서 "DRI CTX-CAR" 요법으로 지칭되며, 화학요법(예를 들어, TMZ) 처치 단독 또는 γδ T 세포 주입과 비교하여, 예를 들어 단독 및 중대한 부작용이나 신경학적 결과 없이 생존을 현저하게 연장시키고 종양 부담을 감소시키는 것으로 여겨진다.
투여를 용이하게 하기 위해, 본 발명의 CTX-CAR을 발현하는 숙주 세포(예를 들어, 면역 효과기 세포, 예컨대 T 세포, NK 세포 및 바람직하게는 γδ-T 세포, 이에 한정되지는 않음)는 약제학적 조성물을 포함하여, 조성물로 제조될 수 있거나, 또는 약학적으로 허용가능할 수 있는 적절한 담체 또는 희석제로 생체내에서 투여하기에 적합한 임플란트로 제조될 수 있다. 상기 조성물 또는 임플란트를 제조하는 수단은 당 업계에 기재되어 있다. 경우에 따라, 본 발명의 CTX-CAR을 발현하는 숙주 세포는 캡슐, 용액, 주사제, 흡입제 또는 에어로졸과 같은 반고체 또는 액체 형태의 제제로 그들의 각 투여경로를 위한 통상적인 방식으로 제형화될 수 있다. 당 업계에 공지된 수단은 조성물이 표적 조직 또는 장기에 도달할 때까지 조성물의 방출 및 흡수를 방지 또는 최소화하거나 조성물의 시간에 맞춰 방출되도록 보장될 수 있다. 그러나, 바람직하게는, 본 발명의 CTX-CAR을 발현하는 숙주 세포를 비효과시키지 않는 약제학적으로 허용가능한 형태가 사용된다. 따라서, 바람직하게는 본 발명의 CTX-CAR을 발현하는 숙주 세포는 평형 염 용액, 바람직하게는 행크스(Hanks) 평형 염 용액 또는 정상 식염수를 함유하는 약제학적 조성물로 제조될 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 CTX-CAR을 발현하는 숙주 세포 및 본 발명의 벡터로 형질전환되거나 형질도입된 숙주 세포를 포함하는 약제학적 조성물을 포함한다. 적합하게는, 상기 숙주 세포는 예를 들어 T 세포, NK 세포 및 바람직하게는 γδ-T 세포와 같은 면역 효과기 세포이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 단독으로 또는 암 치료에 유용한 다른 잘 설정된 제제와 함께 사용될 수 있다. 단독으로 또는 다른 약제와 조합하여 전달되든지, 본 발명의 약제학적 조성물은 다양한 경로를 통해 포유동물, 특히 인간의 신체의 다양한 부위에 전달되어 특정 효과를 달성할 수 있다. 당업자는 하나 이상의 경로가 투여에 사용될 수 있지만, 특정 경로는 다른 경로보다 더 즉각적이고 더 효과적인 반응을 제공할 수 있음을 인식할 것이다. 예를 들어, 피부내 전달은 흑색종의 치료를 위해 흡입보다 유리하게 사용될 수 있다. 국소 또는 전신 전달은 근육 내, 정맥 내, 혈관 내, 간내, 복강 내, 피하 또는 피내 투여를 포함하는 체강 내로의 제형의 도포 또는 점적, 에어로졸의 흡입 또는 통기법, 또는 비경구 투여를 포함하는 투여에 의해 달성될 수 있다.
본 발명의 조성물은 각각의 투여 단위, 예를 들어 주사제가 조성물의 소정량을 단독으로 또는 다른 활성제와 적절히 조합하여 함유하는 단위 투여 형태로 제공될 수 있다. 본원에서 사용된 용어 단위 투여 형태는 인간 및 동물 대상체에 대한 단위 투여용량으로서 적합한 물리적으로 별개의 단위를 지칭하며, 각각의 단위는 본 발명의 조성물의 소정량을 단독으로 또는 필요에 따라 약제학적으로 허용가능한 희석제, 담체 또는 비히클과 관련하여 원하는 효과를 생성하기에 충분한 양으로 계산된, 다른 활성제와 조합하여, 투여될 수 있다. 본 발명의 신규한 단위 투여 형태에 대한 세부 사항은 특정 대상체에서 약제학적 조성물과 관련된 특정 약동학에 의존한다.
바람직하게는, 단독으로 또는 조성물의 일부로서 존재하는 본 발명의 CTX-CAR을 발현하는 치료적 유효량 또는 충분한 수의 숙주 세포를 장기간의 특이적 반응이 성립되도록 대상체에 도입한다. 일 구현예에서, 상기 반응은 암의 억제를 포함한다. 일 구현예에서, 상기 반응은 본 발명의 CTX-CAR에 의한 상기 치료의 부재를 초래하는 것보다 더 큰 정도로 종양 크기 감소 또는 종양 성장의 배제 또는 재성장 또는 전이 감소이다. 바람직하게는, 대상체로 주입된 본 발명의 CTX-CAR을 발현하는 숙주 세포의 양은 본 발명의 CTX-CAR을 발현하는 숙주 세포가 존재하지 않는 동일한 조건과 비교할 때, 종양 크기를 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% 또는 100% 감소시킨다.
따라서, 투여되는 본 발명의 CTX-CAR을 발현하는 숙주 세포의 양은 투여 경로를 고려해야 하며, 본 발명의 CTX-CAR을 발현하는 숙주 세포의 충분한 수가 도입되어 원하는 치료 반응을 달성할 수 있도록 해야 한다. 또한, 본 발명의 CTX-CAR 또는 본원에 기재된 조성물에 포함된 다른 세포(예를 들어, 접촉될 각 세포 당 양 또는 특정 체중 당 양)를 발현하는 각각의 숙주 세포의 양은 상이한 용도에서 다양할 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 CTX-CAR을 발현하는 숙주 세포의 농도는 바람직하게는 적어도 약 lxl05 내지 약 lxl010 숙주 세포, 더욱 바람직하게는, 약 1x107 내지 약 5x108 숙주 세포로 대상체에 제공되기에 충분해야 하지만, 임의의 적합한 양은 약 5x108 초과 세포, 또는 예를 들어, 1x107 미만 세포로 사용될 수 있다. 투여 스케줄은 잘 정립된 세포-기반 요법을 기초로 할 수 있거나, 대체 연속 주입 전략이 사용될 수 있다.
이들 값은 본 발명의 실시를 위한 본 발명의 방법을 최적화할 때 실무자가 이용할 본 발명의 CTX-CAR을 발현하는 숙주 세포의 범위에 대한 일반적인 안내를 제공한다. 이러한 범위의 인용은 특정 용도에서 보증될 수 있는 바와 같이 더 높거나 더 적은 양의 성분의 사용을 결코 배제하지 않는다. 예를 들어, 실제 용량 및 계획은 조성물이 다른 약제학적 조성물과 함께 투여되는지, 또는 약물 동태학, 약물 처분 및 대사의 개인간 차이에 따라 달라질 수 있다. 당업자는 특정 상황의 긴급성에 따라 임의의 필요한 조정을 용이하게 할 수 있다.
치료 효과에 적합한 투여량은 바람직하게는 일련의 투여주기에서 용량 당 약 105 내지 약 1010 숙주 세포일 것이다. 바람직한 용법은 0일째에 약 105 세포부터 시작하여, 5일째 약 1010 세포의 목표 용량까지 점진적으로 증가하여 확대 투여량의 4회의 1주 투여 사이클로 구성된다. 적합한 투여 방식은 정맥 내, 피하, 공동 내(예를 들어, 저장조-접근 장치에 의한), 복강 내, 및 종양 덩어리로의 직접 주사를 포함한다.
본 발명은 또한 암세포를 본 발명의 CTX-CAR을 발현하는 숙주 세포와 접촉시키는 단계를 포함하는, 암의 성장을 억제하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 치료적 유효량의 본 발명의 CTX-CAR을 발현하는 숙주 세포 또는 본 발명의 조성물, 예컨대 상기 숙주 세포를 포함하는 약제학적 조성물을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 환자의 암을 치료하는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 치료될 암은 신경외배엽 기원이다. 바람직하게는, 치료될 암은 악성 신경교종, 흑색종, 신경모세포종, 수모세포종 또는 소세포 폐암종이다.
본 발명은 CTX-CAR 및 선택적으로 상기 기재된 바와 같이 DRI를 가능하게 하기 위한 유전자를 발현하도록 숙주 세포(예를 들어, T 세포, NK 세포 및 바람직하게는 γδ-T 세포와 같은 면역 효과기 세포)가 유전자 조작되는 세포 치료법을 포함하며, 상기 숙주 세포는 이를 필요로 하는 수혜자에게 주입된다. 상기 주입된 세포는 수혜자의 종양 세포를 죽일 수 있다. 항체 요법과는 달리, CTX-CAR을 발현하는 숙주 세포는 생체 내에서 복제할 수 있어 장기 지속성을 유지할 수 있어 지속적인 종양 조절이 가능하다.
본 발명은 또한 본 발명의 CTX-CAR 및 선택적으로 DRI를 가능하게 하기 위한 유전자를 일시적으로 발현하도록 숙주 세포(예를 들어, T 세포, NK 세포 및 바람직하게는 γδ-T 세포와 같은 면역 효과기 세포)가 변형된 세포 치료법을 포함하며, 상기 숙주 세포는 이를 필요로 하는 수혜자에게 주입된다. 상기 주입된 세포는 수혜자의 종양 세포를 죽일 수 있다. 따라서, 다양한 양태에서, 환자에게 투여되는 면역 효과기 세포(예를 들어, T 세포, NK 세포 및 바람직하게는 γδ-T 세포와 같은 면역 효과기 세포)는 면역 효과기 세포를 환자에게 투여한 후, 1개월 미만 동안, 예를 들어, 3주, 2주, 1주동안 존재한다.
이러한 세포 치료법의 다양한 측면에서, 환자에게 투여된 숙주 세포 또는 그 자손은 적어도 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 12개월, 13개월, 14개월, 15개월, 16개월, 17개월, 18개월, 19개월, 20개월, 21개월, 22개월, 23개월, 2년, 3년, 4년 또는 5년 후에 환자에게 투여될 수 있다.
일 양태에서, 본 발명의 CTX-CAR을 발현하는 완전-인간 숙주 세포(예를 들어, T 세포, NK 세포 및 바람직하게는 γδ-T 세포와 같은 면역 효과기 세포)는 포유류에서의 생체외 면역화 및/또는 생체내 치료를 위한 백신의 일 유형일 수 있다 일 양태에서, 포유동물은 인간이다. 생체 외 면역화와 관련하여, 포유동물 내로 숙주 세포를 포함하는, 숙주 세포 또는 약제학적 조성물을 포함하는 조성물을 투여하기 전에 시험관내에서 하기 중 적어도 하나가 발생한다: i) 숙주 세포의 확대, ii) CTX-CAR을 코딩하는 핵산을 숙주 세포에 도입 및/또는 iii) 상기 CTX-CAR을 발현하거나 발현할 수 있는 숙주 세포의 동결보존. 생체 외 과정은 당 업계에 잘 알려져 있다. 간략하게, 본 발명의 CTX-CAR을 발현하도록 환자(예를 들어, 인간)로부터 세포가 단리되고 유전자 조작되었다(즉, 본 명세서에 개시된 CTX-CAR을 발현하는 벡터로 시험관내에서 형질전환 또는 트랙스펙션됨). CTX-CAR-변형된 숙주 세포는 환자에게 투여되어 치료적 이익을 제공할 수 있다. 환자는 바람직하게는 인간이고, CTX-CAR-변형된 숙주 세포는 환자에 대해 자가조직일 수 있다. 대안적으로, 숙주 세포는 환자에 대해 동종성, 동족성 또는 이종성일 수 있다.
본 발명의 CTX-CAR을 발현하는 숙주 세포는 다른 공지된 작용제 및 치료법과 조합하여 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 하나의 처치의 전달은 제2의 전달이 시작될 때 여전히 일어나기 때문에 투여 측면에서 중첩된다. 이를 때때로 "동시” 또는 "동시 전달"이라고도 한다. 바람직하게는, 하나의 치료의 전달은 다른 치료의 전달이 시작되기 전에 종료된다. 두 경우 모두 조합 투여로 인해 치료가 더 효과적이다. 예를 들어, 두 번째 처치가 더 효과적이며, 예를 들어, 두 번째 처치가 적은 경우에는 동등한 효과가 나타나고, 또는 첫번째 처치의 부재하에 두 번째 처치가 투여되는 경우 나타나는 것보다 큰 정도로 두번째 처치는 증상을 감소시키거나, 또는 첫 번째 처치에 의해 비슷한 상황이 나타난다. 바람직하게는, 전달은 증상의 감소 또는 장애와 관련된 다른 매개변수가 다른 것의 부재시 전달되는 하나의 처치로 관찰되는 것보다 더 크도록 한다. 두 가지 처치의 효과는 부분적으로 첨가제, 전체적으로 첨가제, 또는 첨가제보다 클 수 있다. 상기 전달은 제2 치료제가 전달될 때 전달된 제1 치료의 효과가 여전히 검출될 수 있도록 할 수 있다.
본 발명의 CTX-CAR을 발현하는 숙주 세포, 및 적어도 하나의 부가적인 치료제는 동시에, 동일하거나 별개의 조성물로, 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 순차적 투여를 위해, 본 발명의 CTX-CAR을 발현하는 숙주 세포가 먼저 투여될 수 있고, 추가의 제제가 둘째로 투여될 수 있거나, 또는 투여 순서가 역전될 수 있다.
CTX-CAR 요법, DRI-CTX-CAR 요법 및/또는 다른 치료제, 절차 또는 양상은 활성 장애 기간 동안, 또는 완화 기간 또는 덜 활성인 질병 기간 동안 투여될 수 있다. CTX-CAR 요법 또는 DRI-CTX-CAR 요법은 다른 처치(들) 전에, 다른 처치(들)과 동시에, 다른 처치(들) 후에(처치 후), 또는 장애의 차도가 있는 동안 투여될 수 있다.
조합 투여되는 경우, CTX-CAR 요법 또는 DRI-CTX-CAR 요법 및 추가의 작용제(예를 들어, 제2 또는 제3 작용제), 상기 중 하나 또는 전부의 양 또는 투여용량은 개별적으로, 예를 들어 단독요법으로서, 사용되는 각 작용제의 양 또는 투여용량보다 많거나, 적거나, 또는 동일한 양 또는 용량으로 투여될 수 있다. CTX-CAR 요법의 특정 구현예에서, DRI-CTX-CAR 요법은 추가의 작용제(예를 들어, 제2 또는 제3 작용제), 상기 중 하나 또는 전부의 양 또는 투여용량은 개별적으로, 예를 들어 단독요법으로서, 사용되는 각 작용제의 양 또는 투여용량보다 (예를 들어, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 또는 적어도 50%) 적다. CTX-CAR 요법의 다른 구현예에서, DRI-CTX-CAR 요법은 추가의 작용제(예를 들어, 제2 또는 제3 작용제), 원하는 효과(예를 들어, 암의 억제)를 초래하는, 상기 중 하나 또는 전부의 양 또는 투여용량은 개별적으로, 예를 들어 단독요법으로서 사용되는, 동일한 치료적 효과를 달성하는데 요구되는 각 작용제의 양 또는 투여용량보다 (예를 들어, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 또는 적어도 50% 적다) 적다.
바람직하게는, 본 발명의 CTX-CAR을 발현하는 숙주 세포는 수술, 화학요법, 체크포인트 억제제, 방사선, 면역억제제, 예컨대 사이클로스포린, 아자티오프린(azathioprine), 메토트렉세이트, 미코페놀레이트 및 FK506, 항체 또는 다른 면역제거제, 예컨대 CAMPATH, 항-CD3 항체 또는 다른 항체 요법, 사이톡신, 플루다라빈, FK506, 라파마이신, 마이코페놀산, 스테로이드 및 사이토카인과 같은 추가의 치료제와 조합하여 사용될 수 있지만, 이에 한정되지는 않는다. 특정 구현예에서, 본 발명의 CTX-CAR을 발현하는 숙주 세포는 본원에 기술된 바와 같이 DR로 추가로 변형되고 DRI에서 사용된다.
본 명세서에 기술된 임의의 조성물은 키트에 포함될 수 있다. 비-제한적인 예에서, 키메라성 수용체 발현 작제물, 키메라성 수용체 발현 작제물을 생성하기 위한 하나 이상의 제제, 발현 작제물의 트랜스펙션을 위한 세포, 및/또는 발현 작제물의 트랜스펙션을 위한 자가 세포를 얻기 위한 하나 이상의 장비(상기 장비는 주사기, 피펫, 포셉, 및/또는 의학적으로 승인된 임의의 장치일 수 있음). 키트는 본 발명의 조성물을 생성하기 위한 하나 이상의 적당하게 분취된 본 발명의 조성물 또는 제제를 포함할 수 있다. 키트의 성분은 수성 매질 또는 동결건조된 형태로 포장될 수 있다. 키트의 용기 수단은 성분이 배치될 수 있는, 및 바람직하게는 적절하게 분취될 수 있는, 적어도 하나의 바이알, 시험관, 플라스크, 병, 주사기 또는 다른 용기 수단을 포함할 수 있다. 키트에 하나 이상의 성분이 존재하는 경우, 키트에는 일반적으로 추가 성분이 별도로 배치될 수 있는 두 번째, 세 번째 또는 기타 추가 용기가 포함될 것이다. 그러나, 성분들의 다양한 조합이 바이알에 포함될 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 전형적으로 키메라성 수용체 작제물 및 임의의 다른 시약 용기를 상업적 판매를 위해 밀폐된 상태로 수용하기 위한 수단을 포함할 것이다. 상기 용기는 예를 들어 원하는 바이알이 보유되는 주입 또는 취입 성형된 플라스틱 용기를 포함할 수 있다.
실시예
하기 실시예는 설명의 방법으로 제공되며, 어떠한 방식으로든 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
실시예 1-CTX-CAR 및 noCTX를 생성하기 위한 방법.
관심있는 CAR을 발현하는 T-세포를 조작하기 위해 CTX-CAR 및 noCTX001-CAR 유전자를 G-블록 기술(IDT)을 사용하여 합성하였다. 간단히 말해, CTX-CAR의 합성을 위해 공개적으로 입수할 수 있는 온라인 소프트웨어와 서열 ATGTGTATGCCTTGCTTTACGACCGATCATCAGATGGCTAGAAAGTGTGATGACTGTTGTGGAGGCAAGGGACGAGGGAAATGCTATGGACCTCAATGTTTGTGTCGC(SEQ ID NO: 4)를 갖는 집적 DNA 기술(IDT) 온라인 코돈 최적화 툴을 사용하여 최적화된 코돈을 사용하여 클로로톡신(전갈 독; PRF: 445665) MCMPCFTTDHQMARKCDDCCGGKGRGKCYGPQCLCR(SEQ ID NO: 1)의 아미노산 서열을 뉴클레오타이드로 전환시켰다.
최적화된 뉴클레오타이드 서열은 G-블록 기술(IDT)을 사용하여 합성되었으며, 5'에 CD8-알파 리더 서열, 및 링커 서열 SGGG x3, IgD 힌지 및 IgG1 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 세포외 도메인, CD28로부터의 막횡단 도메인 및 3'에 CD28/Ox40/CD3ζ를 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 갖는 프레임으로 클로닝되었다. CD8α-IgD 힌지, CH2CH3(IgGH1) 및 TM 도메인, CD28/OX40/CD3ζ를 코딩하는 SFG 벡터에 주입 기술(Clontech)을 사용하여 G-블록을 클로닝하고, Sph1 및 Not1 제한 뉴클레아제(NEB)를 사용하여 선형화하였다. noCTX-CAR은 동일한 분자 골격을 이용하지만, CTX(SEQ ID NO: 1) 대신에 무관한 펩타이드(SEQ ID NO: 5)를 포함하고, 기능성 실험에서 음성 대조군으로 사용되도록 디자인되었다. 도 1은 CTX-CAR(상단 패널) 및 noCTX-CAR(하단 패널) 작제물의 디자인을 보여준다.
In-Fusion 키트(Clontech)를 사용하여 두 유전자 모두를 SFG 레트로바이러스 벡터의 SphI 및 NotI 부위에 클로닝하였다. 박테리아 적격 세포(Stellar, Clontech)를 결찰 혼합물에 의해 형질전환시키고, 한천에 도말하였다. 몇 가지 박테리아 클론을 선택하여 플라스미드 미니프렙(Qiagen)을 제조하고, 올바른 플라스미드 작제물을 선택하기 위해 이를 시험하였다. 제한 효소 AfeI, XhoI, NcoI 및 NotI로 절단된 플라스미드 DNA의 제한 패턴에 기초하여 올바른 클론을 선택하고; DNA 단편의 크기를 아가로스 겔 상에서 결정하였다.
실시예 2- CTX -CAR 및 noCTX -CAR을 발현하는 T 세포 및 Jurkat 세포의 생성.
바이러스 상층액을 얻기 위해 gag-pol 및 env(RDF) 플라스미드와 함께 293T-세포의 트랜스펙션에 CTX-CAR 및 noCTX-CAR 벡터를 사용하였다. 생성된 바이러스를 Jurkat E1-6 T-세포주에 형질도입하여 CH2CH3 AB(CAR 분자의 IgD 힌지를 검출)를 사용하여 유동 세포계측법으로 양 CAR의 발현을 시험하였다. 이어서, 양 CAR를 코딩하는 레트로바이러스 벡터에 의해 T-세포의 형질도입을 수행하였다.
간략하게, 293T 세포를 env(RDF114) 및 gag-pol(PEG-PAM)과 함께 a) CTX-CAR 또는 b) noCTX-CAR 플라스미드에 의해 동시-트랜스펙션시켜서, 바이러스 상층액을 얻었다. 72시간 후에 293T를 수집하고, (CAR 발현을 나타내기 위해) CH2CH3 항체로 염색하였다. 도 4의 음영이 없는 부분은, CH2CH3 항체로 염색된, 트랜스펙션되지 않은 293T-세포를 나타내며, 음영 부분은 CTX-CAR로 트랜스펙션된 293T-세포(좌측 패널) 및 noCTX-CAR 트랜스펙션된 293T-세포(우측 패널)를 나타낸다. 결과는 293-T 세포가 두 플라스미드 작제물로 효율적으로 형질도입되었음을 보여준다.
Jurkat 및 γδT-세포 확장은 CTX-CAR 및 noCTX-CAR 바이러스로 형질 도입되었다. 72시간 후에 세포를 수집하고, (CAR 발현을 나타내기 위해) CH2CH3 항체로 염색하였다. CTX-CAR 및 noCTX-CAR를 코딩하는 바이러스로 형질도입된 Jurkat T 세포는 이 실험에서 보여지는 바와 같이, 관심 유전자의 발현이 나타난 세포 표면 상에 두 전이유전자를 발현했다. 감마 델타 T 세포는 생성된 레트로바이러스로 효율적으로 형질도입되었고, 두 CAR의 발현이 확인되었다(도 5).
실시예 3-CTX-CAR을 발현하는 Jurkat 세포는 표적 신경 교종 세포를 선택적으로 결합시킴
본 실시예는 본 발명의 CTX-CAR을 발현하는 효과기 세포가 신경교종 세포에 선택적으로 결합한다는 것을 보여준다. 본 발명의 CTX-CAR 또는 noCTX-CAR을 발현하는 효과기 세포의 결합 특성을 신경교종 세포주 U87, U251 및 LN229를 사용하여, 및 1차 인간 성상세포(ScienCell Research Labs)(HA) 및 1차 αβ T-세포(T LC)를 사용하여 시험하였다. Jurkat 세포는 도 1에 나타낸 및 실시예 1에 기술된 바와 같이 실시예 2에 기술된 프로토콜을 사용하여, CTX-CAR 또는 noCTX-CAR 작제물을 코딩하는 레트로바이러스로 트랜스펙션시켰다.
신경교종 세포주 및 일차 세포주를 표준 조건하에 성장시켰다. 부착 표적 세포를 트립신처리하고, 녹색 형광 염료 칼세인으로 표지화하였다. 본 발명의 CTX-CAR(CTX-CAR) 또는 noCTX-CAR(noCTX-CAR)를 발현하는 Jurkat 세포를 알로피코시아닌(APC)-표지된 항-CH2CH3 항체(CTX-CAR 및 noCTX-CAR 작제물에서 힌지 영역에 결합함)로 염색하였다. 염색 후, 모든 표지된 세포를 세척하고, 계수하고 500,000개의 총 세포/샘플에서 PBS + 1% BSA 200㎕ 중에 1:1의 비율로 혼합하였다. 세포 혼합물을 완만한 교반하에 용액 중에서 RT에서 1시간 동안 배양하였다. 조심스럽게 세척한 후, 세포 혼합물의 샘플을 유동 세포계측법에 적용하였다. 효과기-표적 복합체에 대응하는, 이중-표지화된 세포 집단의 백분율을 이중 염색된 FITC-APC 집단에서 게이팅함으로써 결정하였다.
도 7은 본 발명의 CTX-CAR을 발현하는 효과기 세포가 신경교종 세포주에 우선적으로 결합하고, 1차 인간 성상세포 또는 1차 인간 T-세포에 최소 결합하는 것을 보여준다. 본 발명의 CTX-CAR을 발현하는 효과기 세포의 결합은 상기 noCTX-CAR 작제물을 발현하는 효과기 세포와 비교하여 신경교종 세포에 대한 증가된 결합을 나타내었다. CTX-CAR 작제물 및 no-CTX-CAR 작제물을 발현하는 효과기 세포의 결합은 1차 인간 성상세포 및 1차 인간 T-세포에서 동일하였다.
결과는 본 발명의 CTX-CAR을 발현하는 효과기 세포가 시험된 비-신경교종 세포주에 대한 최소 결합으로 인간 신경교종 세포에 우선적으로 결합함을 입증한다.
실시예 4-CTX-CAR을 발현하는 T- 림프구의 세포 독성.
본 실시예는 본 발명의 CTX-CAR을 발현하는 효과기 세포가 신경교종 세포에 대하여 세포독성을 갖는다는 것을 보여준다. 세포독성은 Bright-Glo 루시퍼라제 세포독성 분석 키트(Promega)를 사용하여 측정하였다. 표적 신경교종 세포주 U251 및 U87을 eGFP 및 반딧불이 루시퍼라제(GL)의 융합 단백질을 발현하는 렌티 바이러스로 감염시켜, 세포를 형광으로 시각화시키고, 생물발광 이미징(U251GL 및 U87GL로 명명됨)으로 정량화하였다.
(T-세포의 활성화 및 확장을 위해) CD3/CD28 비드를 사용하여, 전혈로부터 분리된 PBMC를 하루 동안 활성화시키고, 도 1에 도시된 및 실시예 1에서 기술된 바와 같은 CTX-CAR(CTX) 또는 noCTX-CAR(noCTX) 작제물을 코딩하는 레트로바이러스로 트랜스펙션시켰다. CAR 발현의 효율은 형질도입 후 4일째에 평가하였고, 40%~60% 범위였다. 표적 신경교종 세포주 U251GL 및 U87GL을 완전 배지 100㎕에서 20,000 또는 50,000 세포/웰로 96 웰 플레이트에 접종하였다. CAR 발현 T 세포를 100 ㎖의 배지에서 1:2 및 하기의 표적 대 효과기(T:E) 세포비로 웰에 첨가하고, 1:5, 1:10, 1:20, 37℃에서 밤새 표적 세포와 함께 배양하였다. 대조군으로서, 표적 세포주를 모의 형질전환된 활성화된 PBMC(Mock) 및 Jurkat 세포(Jurkat)와 함께 배양하였다. 배양 후, 96 웰 플레이트를 짧게 회전시키고, 150㎕의 배지를 버렸다. Bright-Glo 키트 시약(세포를 용해시키고 루시퍼라제 기질을 제공하는 역할을 함)을 제조자의 지시에 따라 첨가하였다. 2분 배양 후, 세포 용해물을 평평한 바닥 검정 96 웰 플레이트의 웰로 옮기고, 형광을 H1 하이브리드(Hybrid) 발광계측기(Biotek)로 측정하였다.
도 9a는 본 발명의 CTX-CAR로 형질도입된 효과기 세포가 CTX가 없는 동일한 CAR 작제물로 형질도입된 효과기 세포와 비교하여 U251GL 신경교종 세포에 대해 향상된 세포독성을 갖는 것을 보여준다. 향상된 세포독성은 낮은 T:E 비율에서 향상되었다. 유사한 결과가 도 9b에 도시되어있으며, 이는 U87GL 신경교종 세포에 대한 본 발명의 CTX-CAR로 형질도입된 효과기 세포의 향상된 세포독성을 설명한다.
결과는 본 발명의 CTX-CAR을 발현하는 효과기 세포가 인간 신경교종 세포에 대해 세포독성임을 입증한다.
본 명세서에 언급된 특허 및 과학 문헌은 당업자가 이용할 수 있는 지식을 확립한다. 본 명세서에 인용된 모든 미국 특허 및 공개되거나 미공개된 미국 특허 출원은 참고로 포함된다. 본 명세서에 인용된 모든 공개된 외국 특허 및 특허 출원은 본원에 참고로 포함된다. 본 명세서에 인용된 다른 모든 공개된 참고 문헌, 문서, 원고 및 과학 문헌은 본원에 참고로 포함된다.
본 발명은 그의 바람직한 구현예를 참조하여 구체적으로 도시되고 기술되었지만, 첨부된 청구범위에 포함되는 본 발명의 범위를 벗어나지 않으면서 형태 및 세부사항에서 다양한 변화가 이루어질 수 있음이 당업자에 의해 이해될 것이다. 또한, 본 명세서에 기술된 구현예들 중 어느 것도 상호배타적이지 않고, 첨부된 청구범위에 포함되는 본 발명의 범위를 벗어나지 않으면서 다양한 방식으로 결합될 수 있음을 이해할 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> The UAB Research Foundation <120> CHIMERIC CHLOROTOXIN RECEPTORS <130> 0U0012-301093 <150> US 62/432,404 <151> 2016-12-09 <160> 27 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 36 <212> PRT <213> Leiurus quinquestriatus <400> 1 Met Cys Met Pro Cys Phe Thr Thr Asp His Gln Met Ala Arg Lys Cys 1 5 10 15 Asp Asp Cys Cys Gly Gly Lys Gly Arg Gly Lys Cys Tyr Gly Pro Gln 20 25 30 Cys Leu Cys Arg 35 <210> 2 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial linker <400> 2 Ser Gly Gly Gly 1 <210> 3 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial linker <400> 3 Ser Gly Gly Gly Gly 1 5 <210> 4 <211> 108 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> optimized coding sequence <400> 4 atgtgtatgc cttgctttac gaccgatcat cagatggcta gaaagtgtga tgactgttgt 60 ggaggcaagg gacgagggaa atgctatgga cctcaatgtt tgtgtcgc 108 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> randomly generated peptide <400> 5 Met Arg Leu Asn Leu Ile Lys 1 5 <210> 6 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Gly Asn Gly Lys Cys Phe Gly Tyr Gln Cys Leu 20 25 30 Cys Asn Arg 35 <210> 19 <211> 36 <212> PRT <213> Buthus sindicus <400> 19 Cys Gly Pro Cys Phe Thr Lys Asp Pro Glu Thr Glu Lys Lys Cys Ala 1 5 10 15 Thr Cys Cys Gly Gly Ile Gly Arg Cys Phe Gly Pro Gln Cys Leu Cys 20 25 30 Asn Arg Gly Tyr 35 <210> 20 <211> 35 <212> PRT <213> Androctonus mauretanicus <400> 20 Cys Gly Pro Cys Phe Thr Thr Asp Pro Tyr Thr Glu Ser Lys Cys Ala 1 5 10 15 Thr Cys Cys Gly Gly Arg Gly Lys Cys Val Gly Pro Gln Cys Leu Cys 20 25 30 Asn Arg Ile 35 <210> 21 <211> 62 <212> PRT <213> Buthus tamulus <400> 21 Met Lys Phe Leu Tyr Gly Val Ile Leu Ile Ala Leu Phe Leu Thr Val 1 5 10 15 Met Thr Ala Thr Leu Ser Glu Ala Arg Cys Gly Pro Cys Phe Thr Thr 20 25 30 Asp Pro Gln Thr Gln Ala Lys Cys Ser Glu Cys Cys Gly Arg Lys Gly 35 40 45 Gly Val Cys Lys Gly Pro Gln Cys Ile Cys Gly Ile Gln Tyr 50 55 60 <210> 22 <211> 27 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu 1 5 10 15 Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val 20 25 <210> 23 <211> 24 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23 Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu 1 5 10 15 Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys 20 <210> 24 <211> 42 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 Ala Leu Tyr Leu Leu Arg Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala His 1 5 10 15 Lys Pro Pro Gly Gly Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln 20 25 30 Ala Asp Ala His Ser Thr Leu Ala Lys Ile 35 40 <210> 25 <211> 41 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25 Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr 1 5 10 15 Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro 20 25 30 Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser 35 40 <210> 26 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26 Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly 1 5 10 15 Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr 20 25 30 Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys 35 40 45 Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys 50 55 60 Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg 65 70 75 80 Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala 85 90 95 Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 100 105 110 <210> 27 <211> 42 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27 Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met 1 5 10 15 Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe 20 25 30 Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu 35 40

Claims (66)

  1. 대상체에서 암을 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 키메라성 항원 수용체(CAR)를 포함하는 면역 효과기 세포를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 상기 CAR은 클로로톡신, 클로로톡신의 기능적 변이체, 클로로톡신-유사 펩타이드, 클로로톡신-유사 펩타이드의 기능적 변이체 또는 이들의 조합을 포함하는 세포외 도메인, 막횡단 도메인 및 적어도 하나의 세포내 신호전달 도메인을 포함하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 신호전달 도메인이 CD3 제타, MB1 사슬, B29, FcRIII, FcRI 및 이들의 조합으로 구성된 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 막횡단 도메인이: T-세포 수용체 알파 사슬, T-세포 수용체 베타 사슬, T-세포 수용체 제타 사슬, CD28, CD3 엡실론, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154, KIRDS2, OX40, CD2, CD27, LFA-1, ICOS, 4-1BB, GITR, CD40, BAFFR, HVEM, SLAMF7, NKp80, CD160, CD19, IL2Rβ, IL2Rγ, IL7Rα, ITGA1, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CDlld, ITGAE, CD103, ITGAL, CDl la, LFA-1, ITGAM, CDllb, ITGAX, CDl lc, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, TNFR2, DNAM1, SLAMF4, CD84, CD96, CEACAM1, CRTAM, Ly9, CD160, PSGL1, CD100, SLAMF6, SLAM, BLAME, SELPLG, LTBR, PAG/Cbp, NKp44, NKp30, NKp46, NKG2D, 및 NKG2C로 구성된 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 CAR이 보조자극 도메인을 추가로 포함하는, 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 보조자극 도메인이 CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, 림프구 기능-관련 항원-1, CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, CD83에 특이적으로 결합하는 리간드, CDS, ICAM-1, GITR, BAFFR, HVEM, SLAMF7, NKp80, CD160, CD19, CD4, CD8α, CD8β, IL2Rβ, IL2Rγ, IL7Rα, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CDlld, ITGAE, CD103, ITGAL, CDlla, LFA-1, ITGAM, CDl lb, ITGAX, CDl lc, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1, SLAMF4, CD84, CD96, CEACAM1, CRTAM, Ly9, CD160, PSGL1, CD100, CD69, SLAMF6, SLAM, BLAME, SELPLG, LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, NKp44, NKp30, NKp46, 및 NKG2D로 구성된 그룹으로부터 선택된 폴리펩타이드의 기능적 신호전달 도메인을 포함하는, 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 CAR이 세포외 스페이서를 추가로 포함하는, 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 세포외 스페이서가 인간 IgD 또는 인간 IgG1의 힌지 영역의 전부 또는 일부 및 선택적으로 인간 IgG1로부터의 면역글로불린 중쇄 불변 영역의 전부 또는 일부를 포함하는, 방법.
  8. 제6항에 있어서,
    상기 CAR이 보조자극 도메인을 추가로 포함하는, 방법.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 CAR이 가요성 링커 및 세포외 스페이서를 추가로 포함하는, 방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 가요성 링커가 1 내지 10 복제본으로 존재하는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2의 서열을 갖는, 방법.
  11. 제9항에 있어서,
    상기 세포외 스페이서가 인간 IgD 또는 인간 IgG1의 힌지 영역의 전부 또는 일부 및 선택적으로 인간 IgG1로부터의 면역글로불린 중쇄 불변 영역의 전부 또는 일부를 포함하는, 방법.
  12. 제9항에 있어서,
    상기 CAR이 보조자극 도메인을 추가로 포함하는, 방법.
  13. 제1항에 있어서,
    상기 면역 효과기 세포가 T-세포인, 방법.
  14. 제1항에 있어서,
    상기 면역 효과기 세포가 자연 살해 세포인, 방법.
  15. 제1항에 있어서,
    상기 면역 효과기 세포가 γδT-세포인, 방법.
  16. 제1항에 있어서,
    상기 면역 효과기 세포가 생존 인자를 코딩하는 유전자를 추가로 포함하는, 방법.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 생존 인자가 O 6-메틸구아닌-DNA 메틸트랜스퍼라제, 다중약물 내성 단백질 1,5'뉴클레오티다제 II, 디하이드로폴레이트 환원효소 및 티미딜레이트 신타아제로 구성된 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  18. 제16항에 있어서,
    상기 면역 효과기 세포가 스트레스-유도 항원 수용체를 자연적으로 발현시키는, 방법.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 스트레스-유도 항원 수용체가 NKG2D 수용체인, 방법.
  20. 제16항에 있어서,
    상기 면역 효과기 세포가 추가의 치료적 처치와 조합하여 투여되는, 방법.
  21. 제20항에 있어서,
    상기 추가의 치료적 처치가 트리메토트렉세이트, 테모졸로미드, 랄티트렉세드, S-(4-니트로벤질)-6-티오이노신, 6-벤질구아니딘, 니트로소우레아, 포테무스틴, 시타라빈, 캄토테신, 및 그의 임의의 치료적 유도체로 구성된 그룹으로부터 선택된 제제에 의한 처치인, 방법.
  22. 제20항에 있어서,
    상기 추가의 치료적 처치가 테모졸로미드, 독소루비신, 멜팔란, 니트로소우레아 및 이들의 임의의 조합으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 제제에 의한 처치인, 방법.
  23. 제1항에 있어서,
    상기 면역 효과기 세포가 스트레스-유도 항원 수용체를 코딩하는 유전자를 포함하는, 방법.
  24. 제23항에 있어서,
    상기 스트레스-유도 항원 수용체가 NKG2D 수용체인, 방법.
  25. 제1항에 있어서,
    상기 면역 효과기 세포가 생존 인자를 코딩하는 유전자 및 스트레스-유도 항원 수용체를 코딩하는 유전자를 추가로 포함하는, 방법.
  26. 제25항에 있어서,
    상기 생존 인자가 O 6-메틸구아닌-DNA 메틸트랜스퍼라제, 다중약물 내성 단백질 1,5'뉴클레오티다제 II, 디하이드로폴레이트 환원효소 및 티미딜레이트 신타아제로 구성된 그룹으로부터 선택되고, 상기 스트레스-유도 항원 수용체가 NKG2D 수용체인, 방법.
  27. 제25항에 있어서,
    상기 면역 효과기 세포가 추가의 치료적 처치와 조합하여 투여되는, 방법.
  28. 제27항에 있어서,
    상기 추가의 치료적 처치가 트리메토트렉세이트, 테모졸로미드, 랄티트렉세드, S-(4-니트로벤질)-6-티오이노신, 6-벤질구아니딘, 니트로소우레아, 포테무스틴, 시타라빈, 캄토테신, 및 그의 임의의 치료적 유도체로 구성된 그룹으로부터 선택된 제제에 의한 처치인, 방법.
  29. 제27항에 있어서,
    상기 추가의 치료적 처치가 테모졸로미드, 독소루비신, 멜팔란, 니트로소우레아 및 이들의 임의의 조합으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 제제에 의한 처치인, 방법.
  30. 제1항에 있어서,
    상기 CAR을 포함하는 상기 면역 효과기 세포가 추가의 면역계 세포를 포함하는 조성물의 성분인, 방법.
  31. 제30항에 있어서,
    상기 CAR을 포함하는 상기 면역 효과기 세포가 조성물 중의 전체 세포 집단의 60% 이상 존재하는, 방법.
  32. 제30항에 있어서,
    상기 CAR을 포함하는 상기 면역 효과기 세포는 γδT 세포이고, 상기 추가의 면역계 세포는 자연 살해 세포, αβT 세포 또는 자연 살해 세포와 αβT 세포의 조합인, 방법.
  33. 제32항에있어서,
    상기 γδT 세포가 조성물 중의 총 세포 집단의 60 % 이상으로 존재하는, 방법.
  34. 제32항에 있어서,
    상기 αβT 세포가 전체 세포 집단의 5% 이하로 존재하고, 상기 자연 살해 세포는 조성물의 전체 세포 집단의 이하의 25% 이하로 존재하는, 방법.
  35. 제1항에 있어서,
    상기 암이 신경외배엽 기원인, 방법.
  36. 제1항에 있어서,
    상기 암이 악성 신경교종, 흑색종, 신경모세포종, 수모세포종 또는 소세포 폐암인, 방법.
  37. 하나 이상의 벡터를 포함하는 γδT 세포로서,
    상기 하나 이상의 γδT 세포는 키메라성 항원 수용체(CAR) 및 생존 인자의 발현을 지시하고, CAR은 클로로톡신, 클로로톡신의 기능적 변이체, 클로로톡신-유사 펩타이드, 클로로톡신-유사 펩타이드의 기능적 변이체 또는 이들의 조합을 포함하는 세포외 도메인, 막횡단 도메인 및 적어도 하나의 세포내 신호전달 도메인을 포함하는, γδT 세포.
  38. 제37항에 있어서,
    상기 신호전달 도메인은 CD3 제타, MB1 사슬, B29, FcRIII, FcRI 및 이들의 조합으로 구성된 그룹으로부터 선택되는, γδT 세포.
  39. 제37항에 있어서,
    상기 막횡단 도메인은 T-세포 수용체 알파 사슬, T-세포 수용체 베타 사슬, T-세포 수용체 제타 사슬, CD28, CD3 엡실론, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154, KIRDS2, OX40, CD2, CD27, LFA-1, ICOS, 4-lBB, GITR, CD40, BAFFR, HVEM, SLAMF7, NKp80, CD160, CD19, IL2Rβ, IL2Rγ, IL7Rα, ITGAl, VLAl, CD49a, ITGA4, 1A4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, lTGAD, CDlld, ITGAE, CD103, lTGAL, CDl la, LFA-1, ITGAM, CDllb, ITGAX, CD1 lc, ITGBl, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, TNFR2, DNAM1, SLAMF4, CD84, CD96, CEACAMl, CRTAM, Ly9, CD160, PSGLl, CDlO0, SLAMF6, SLAM, BLAME, SELPLG, LTBR, PAG/Cbp, NKp44, NKp30, NKp46, NKG2D, 및 NKG2C로 구성되는 그룹으로부터 선택되는, γδT 세포.
  40. 제37항에 있어서,
    상기 CAR이 보조 자극 도메인을 추가로 포함하는, γδT 세포.
  41. 제40항에 있어서,
    상기 보조 자극 도메인은 CD27, CD28, 4-1BB(CD137), OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, 림프구 기능-관련 항원-1(LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, CD83과 특이적으로 결합하는 리간드, CDS, ICAM-1, GITR, BAFFR, HVEM(LIGHTR), SLAMF7, NKp80(KLRFl), CD160, CD19, CD4, CD8α, CD8β, lL2Rβ, lL2Rγ, IL7Rα, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, lTGAD, CDlld, ITGAE, CD103, ITGAL, CDlla, LFA-1, ITGAM, CDl lb, ITGAX, CDl le, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAMl(CD226), SLAMF4(CD244, 2B4), CD84, CD96(Tactile), CEACAMl, CRTAM, Ly9(CD229), CD160(BY55), PSGLl, CDl00(SEMA4D), CD69, SLAMF6(NTB-A, Lyl08), SLAM(SLAMFl, CD150, IPO-3), BLAME(SLAMF8), SELPLG(CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, NKp44, NKp30, NKp46, 및 NKG2D로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 폴리펩타이드의 기능적 신호전달 도메인을 포함하는, γδT 세포.
  42. 제37항에 있어서,
    상기 CAR이 세포외 스페이서를 추가로 포함하는, γδT 세포.
  43. 제42항에 있어서,
    상기 세포외 스페이서가 인간 IgD 또는 인간 IgG1의 힌지 영역의 전부 또는 일부 및 선택적으로 인간 IgG1로부터의 면역글로불린 중쇄 불변 영역의 전부 또는 일부를 포함하는, γδT 세포.
  44. 제42항에 있어서,
    상기 CAR이 보조자극 도메인을 추가로 포함하는, γδT 세포.
  45. 제37항에 있어서,
    상기 CAR이 가요성 링커 및 세포외 스페이서를 추가로 포함하는, γδT 세포.
  46. 제45항에 있어서,
    상기 가요성 링커가 1 내지 10부로 존재하는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2의 서열을 갖는, γδT 세포.
  47. 제45항에 있어서,
    상기 세포외 스페이서가 인간 IgD 또는 인간 IgG1의 힌지 영역의 전부 또는 일부 및 선택적으로 인간 IgG1로부터의 면역글로불린 중쇄 불변 영역의 전부 또는 일부를 포함하는, γδT 세포.
  48. 제45항에 있어서,
    상기 CAR이 보조자극 도메인을 추가로 포함하는, γδT 세포.
  49. 제37항에 있어서,
    상기 생존 인자가 O 6-메틸구아닌-DNA 메틸트랜스퍼라제, 다중약물 내성 단백질 1,5'뉴클레오티다제 II, 디하이드로폴레이트 환원효소 및 티미딜레이트 신타아제로 구성된 그룹으로부터 선택되는, γδT 세포.
  50. 제37항에 있어서,
    상기 γδT 세포가 자연적으로 스트레스-유도 항원 수용체를 발현하는, γδT 세포.
  51. 제50항에 있어서,
    상기 스트레스-유도 항원 수용체가 NKG2D 수용체인, γδT 세포.
  52. 제37항에 있어서,
    상기 생존 인자는 상기 γδT 세포가 추가의 치료적 처치에 의해 생성되는 치료 환경에서 생존하도록 허용하는, γδT 세포.
  53. 제52항에 있어서,
    상기 추가의 치료적 처치가 트리메토트렉세이트, 테모졸로미드, 랄티트렉세드, S-(4-니트로벤질)-6-티오이노신, 6-벤질구아니딘, 니트로소우레아, 포테무스틴, 시타라빈, 캄토테신, 및 이들의 임의의 조합으로 구성된 그룹으로부터 선택된 제제에 의한 처치인, γδT 세포.
  54. 제52항에 있어서,
    상기 추가의 치료적 처치가 테모졸로미드, 독소루비신, 멜팔란, 니트로소우레아 및 이들의 임의의 조합으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 제제에 의한 처치인, γδT 세포.
  55. 제37항에 있어서,
    상기 하나 이상의 벡터가 스트레스-유도 항원 수용체를 코딩하는 유전자의 발현을 추가로 지시하는, γδT 세포.
  56. 제56항에 있어서,
    상기 스트레스-유도 항원 수용체가 NKG2D 수용체인, γδT 세포.
  57. 제37항에 있어서,
    단일 벡터가 상기 CAR 및 생존 인자의 발현을 지시하는, γδT 세포.
  58. 제55항에 있어서,
    단일 벡터가 상기 CAR, 생존 인자 및 스트레스-유도 항원 수용체의 발현을 지시하는, γδT 세포.
  59. 제58항에 있어서,
    상기 생존 인자가 O 6-메틸구아닌-DNA 메틸트랜스퍼라제, 다중약물 내성 단백질 1,5'뉴클레오티다제 II, 디하이드로폴레이트 환원효소 및 티미딜레이트 신타아제로 구성된 그룹으로부터 선택되고, 상기 스트레스-유도 항원 수용체는 NKG2D 수용체인, γδT 세포.
  60. 제37항에 있어서,
    상기 γδT 세포가 분리되는, γδT 세포.
  61. 제37항 내지 제60항 중 어느 한 항의 γδT 세포 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  62. 제61항에 있어서,
    추가의 면역계 세포를 추가로 포함하는, 약제학적 조성물.
  63. 제62항에 있어서,
    상기 γδT 세포가 조성물의 총 세포 집단의 60% 이상으로 존재하는, 약제학적 조성물.
  64. 제62항에 있어서,
    상기 추가의 면역계 세포가 자연 살해 세포, αβT 세포 또는 자연 살해 세포와 αβT 세포의 조합인, 약제학적 조성물.
  65. 제64항에 있어서,
    상기 γδT 세포가 조성물의 총 세포 집단의 60% 이상으로 존재하는, 약제학적 조성물.
  66. 제64항에 있어서,
    상기 αβT 세포는 조성물의 총 세포 집단의 5% 이하로 존재하며, 상기 자연 살해 세포는 조성물의 총 세포 집단의 25% 이하로 존재하는, 약제학적 조성물.
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