KR20230134134A - 다가 클로로톡신 키메라 항원 수용체 - Google Patents

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Abstract

다가 CLTX-CAR을 발현하고 또한 생존 인자를 발현하는 γδ T 세포, 다가 CLTX-CAR 및 생존 인자를 발현하는 γδ T 세포 집단, 이의 약학 조성물, 및 대상체에게 유효량의 다가 CLTX-CAR γδ T 세포를 투여하는 단계 및 화학요법제, 예컨대 생존 인자가 저항성을 부여하는 화학요법제를 공동 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 암 또는 종양을 치료하는 방법이 기재된다.

Description

다가 클로로톡신 키메라 항원 수용체
관련 출원
본 출원은 2021년 1월 20일에 출원된 미국 가출원 번호 63/139,709 및 2021년 4월 8일에 출원된 미국 가출원 번호 63/172,247의 이익을 주장한다. 상기 출원의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
발명의 배경
키메라 항원 수용체(CAR)는 세포외 종양 인식/표적화 도메인, 세포외 링커/힌지 도메인, 막관통 도메인, 및 세포내 T 세포 활성화 및 공동 자극 신호전달 도메인으로 구성된다. 대부분의 CAR 종양 표적화 도메인은 특정 항원에 결합하는 항체의 특이성을 이용하는 항체 서열로부터 유래된 단일 쇄 가변 단편(scFv)이다. 예컨대, 항-CD19 표적된 CAR KYMRIAHTM 및 YESCARTATM은 각각 급성 림프모구성 백혈병(ALL) 및 미만성 거대 B 세포 림프종의 치료를 위한 승인된 요법이며, 뮤린 항-인간 CD19 항체로부터 유래된 scFv를 포함한다(Guedan et al. (2019), Mol Ther Methods Clin Dev 12:145-156).
WO2018107134 및 WO2017066481(각각의 내용은 명백히 본원에 참조로 포함됨)은 세포외 항원 결합 도메인으로서 클로로톡신(CLTX)을 포함하는 키메라 항원 수용체를 기술한다. CLTX는, 다형 교모세포종(GBM)에서 매트릭스 메탈로프로테이나제 2(MMP2) 및 클로라이드 채널 CLCN3의 변경된 발현을 특이적으로 표적하는, 전갈 독으로부터 유래된 작은 천연 펩티드이다. CLTX는 또한 특히 흑색종, 소세포 폐 암종, 신경모세포종, 유방암, 신장암, 간암, 폐암, 난소암 및 수모세포종에 결합한다. 클로로톡신의 1차 구조는 8개의 시스테인을 포함한 36개의 아미노산을 포함하고, 단쇄의 디술파이드 함유 펩티드로 분류된다. WO2018107134는 특히 클로로톡신을 발현하도록 조작된 감마 델타(γδ) T 세포를 기술한다.
감마-델타(γδ) T 세포는 항원 프라이밍 또는 주요 조직적합성 복합체(MHC) 분자의 존재 없이 광범위한 항원을 인식할 수 있기 때문에 T 림프구의 중요한 서브세트이다. 이들은 세포독성 활성을 통해 직접적으로 또는 다른 면역 세포 유형의 활성화를 통해 간접적으로 세포를 표적하여 이를 사멸시킬 수 있다. γδ T 세포 기능적 반응은, 스트레스(예컨대, 화학요법제 환경)에 대한 반응으로 시토카인 생성을 촉진하고 병원균 제거, 염증 및 조직 항상성을 조절하는, 스트레스 항원의 인식을 포함한 여러 요인에 의해 유도된다. 종양에 대한 γδ T 세포의 세포독성은 종양 세포에서 천연 킬러 그룹 2D 리간드(NKG2DL)를 포함한 세포 표면 수용체의 발현을 통해 유도될 수 있다.
면역요법의 최근 발전이 두개외 종양 치료에 유망한 것으로 나타났지만, GBM은 15개월 미만의 일관된 중앙값 생존을 가지므로 이러한 발전에 영향을 받지 않았다. GBM 뿐만 아니라 다른 액체 및 고형 암 및 종양에 대한 추가 치료, 특히 추가 CAR T 세포 요법에 대한 요구가 당업계에 남아있다.
본 발명은 적어도 부분적으로 세포외 항원 결합 도메인에 2개의 CLTX 펩티드를 포함하는 CAR로 형질도입된 γδ T 세포가 단일 CLTX 펩티드를 갖는 비교 가능한 세포와 비교하여 교모세포종(GBM) 세포에 대한 증가된 지속성 뿐만 아니라 증가된 세포독성을 나타낸다는 놀라운 발견에 기초한다. 증가된 세포독성은 세포가 엔도도메인 내에 세포내 신호전달 도메인을 포함하지 않는 경우에도 관찰되었다. 또한, 2개 초과의 CLTX 펩티드(예컨대, 3개 이상의 CLTX 펩티드)를 갖는 T 세포의 형질도입은 활성화를 향상시키지 않았고, 세포 표면 상에 적절하거나 기능적으로 제시되지 않는 CAR을 야기하는 것으로 나타났다. 또한, 본 발명은 적어도 부분적으로 세포외 항원 결합 도메인에 2개의 CLTX 펩티드를 포함하는 CAR로 형질도입된 T 세포(dCLTX-CAR 세포)가 세포외 항원 결합 도메인에 단일 CLTX 펩티드를 포함하는 세포(sCLTX-CAR γδ T 세포)에 비해 2배 초과의 CD69 활성화를 나타내었다는 놀라운 발견에 기초한다. 2개의 CLTX 펩티드의 존재가 부가적이고 단일 CLTX 펩티드보다 더 큰, 예컨대 2배 더 큰 CD69 활성화를 야기할 것이라고 예측되었을 수 있지만, CAR에 단지 2개의 CLTX 펩티드의 존재가 단일 CLTX 펩티드를 갖는 비교 가능한 CAR보다 2배 초과의 더 큰 활성화를 야기하였다는 것은 놀라운 일이다. 이 데이터는 세포외 항원 결합 도메인에 다중 CLTX 펩티드(2개의 CLTX 펩티드)가 존재하면 T 세포 활성화에 상승 효과가 있고 예기치 않게 교모세포종 세포에 대해 더 큰 지속성 및 더 큰 세포독성을 나타낸다는 것을 시사한다.
본 발명은 다가 CLTX-CAR(세포외 항원 결합 도메인에 하나 초과의 CTLX 펩티드를 포함하는 CAR)을 발현하고 또한 화학요법제에 대해 저항성을 부여하는 DNA, RNA, 또는 폴리펩티드인 생존 인자를 발현하는 γδ T 세포, 다가 CLTX-CAR 및 생존 인자를 발현하는 γδ T 세포 집단, 다가 CLTX-CAR γδ T 세포를 포함하는 약학 조성물, 및 유효량의 다가 CLTX-CAR γδ T 세포를 투여하고 화학요법제, 예컨대 생존 인자가 저항성을 부여하는 화학요법제를 공동 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 암 또는 종양을 치료하는 방법을 포괄한다. 다가 CLTX-CAR은 바람직하게는 세포외 항원 결합 도메인에 2개의 CLTX 펩티드를 포함한다. 2개의 CLTX 펩티드를 포함하는 CLTX-CAR은 본원에서 "2가 CLTX-CAR" 또는 "이중 CLTX-CAR" 또는 "dCLTX-CAR"로 지칭될 수 있다(이러한 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용됨). 특정 측면에서, 다가 CLTX-CAR(예컨대, dCLTX-CAR)은 세포내 신호전달 도메인을 포함하지 않는다.
본 발명은 다가 CLTX 키메라 항원 수용체(다가 CLTX-CAR) 및 생존 인자를 발현하는 조작된 γδ T 세포를 포함하며, 생존 인자는 화학요법제에 대해 저항성을 부여하는 DNA, RNA, 또는 폴리펩티드이고, γδ T 세포는 다가 CLTX-CAR 및 생존 인자의 발현을 지시하는 단일 벡터를 포함하고, 추가로
a. 다가 CLTX-CAR은
i. CLTX 펩티드, CLTX 유사 폴리펩티드, 및 CLTX 펩티드의 기능적 변이체(이들의 조합 포함)의 펩티드 중 적어도 2개를 포함하는 세포외 항원 결합 도메인으로서,
적어도 2개의 CLTX 펩티드, CLTX 유사 폴리펩티드, 및 CLTX 펩티드의 기능적 변이체, 또는 이들의 임의의 조합은 링커 펩티드에 의해 부착되고; 임의적으로 링커 펩티드는 30개 미만의 아미노산 길이 또는 15개 미만의 아미노산 길이인 세포외 항원 결합 도메인;
ii. 막관통 도메인;
iii. 막관통 도메인을 세포외 항원 결합 도메인에 부착시키는 임의의 세포외 힌지 도메인;
iv. 임의의 세포내 신호전달 도메인; 및
v. 임의적으로, 공자극 도메인을 포함한다. 특정 측면에서, 다가 CLTX-CAR은 CLTX 펩티드, CLTX 유사 폴리펩티드, CLTX 펩티드의 기능적 변이체, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 2개의 펩티드를 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 다가 CLTX 키메라 항원 수용체(다가 CLTX-CAR) 및 생존 인자를 발현하는 조작된 γδ T 세포에 관한 것이며, 생존 인자는 화학요법제에 대해 저항성을 부여하는 폴리펩티드이고, γδ T 세포는 다가 CLTX-CAR 및 생존 인자의 발현을 지시하는 단일 벡터를 포함하고, 추가로
a. 다가 CLTX-CAR은
i. 링커 펩티드에 의해 부착된 적어도 2개의 CLTX 펩티드를 포함하는 세포외 항원 결합 도메인으로서; 임의적으로, 링커 펩티드는 30개 미만의 아미노산 길이 또는 15개 미만의 아미노산 길이인 세포외 항원 결합 도메인;
ii. 막관통 도메인;
iii. 막관통 도메인을 세포외 항원 결합 도메인에 부착시키는 임의의 세포외 힌지 도메인;
iv. 임의적으로, 세포내 신호전달 도메인; 및
v. 임의적으로, 공자극 도메인을 포함한다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 조작된 γδ T 세포 집단을 포괄한다. 특정 측면에서, 다가 CLTX-CAR은 세포외 항원 결합 도메인에 2개의 CLTX 펩티드를 포함한다. 특정 측면에서, 다가 CLTX-CAR(예컨대, dCLTX-CAR)은 세포내 신호전달 도메인을 포함하지 않는다. 특정한 추가 측면에서, 링커 펩티드는 Flag 펩티드, myc 펩티드, 또는 HA 펩티드이다.
또 다른 추가 측면에서, 본 발명은 2가 CLTX 키메라 항원 수용체 (또는 2가 CLTX CAR) 및 생존 인자를 발현하는 조작된 γδ T 세포에 관한 것이며, 생존 인자는 화학요법제에 대해 저항성을 부여하는 폴리펩티드이고, γδ T 세포는 2가 CLTX-CAR 및 생존 인자의 발현을 지시하는 단일 벡터를 포함하고, 추가로
a. 2가 CLTX-CAR은
i. 링커 펩티드에 의해 부착된 2개의 CLTX 펩티드를 포함하는 세포외 항원 결합 도메인으로서; 임의적으로, 링커 펩티드는 30개 미만의 아미노산 길이 또는 15개 미만의 아미노산 길이인 세포외 항원 결합 도메인;
ii. 막관통 도메인;
iii. 막관통 도메인을 세포외 항원 결합 도메인에 부착시키는 임의의 세포외 힌지 도메인;
iv. 임의의 세포내 신호전달 도메인; 및
v. 임의의 공자극 도메인을 포함한다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 조작된 γδ T 세포 집단을 포괄한다. 특정한 구체적 측면에서, 2가 CLTX CAR은 공자극 도메인을 포함하고 세포내 신호전달 도메인을 포함하지 않는다. 추가 측면에서, 2가 CLTX CAR은 세포내 신호전달 도메인을 포함하지 않고 공자극 도메인을 포함하지 않는다. 또 다른 추가 측면에서, 링커 펩티드는 Flag 펩티드, myc 펩티드, 또는 HA 펩티드이다.
본 발명은 추가로 본원에 기재된 다가 CLTX-CAR γδ T 세포 (또는 다가 CLTX-CAR γδ T 세포 집단)를 포함하는 약학 조성물 뿐만 아니라, 암 또는 종양의 치료를 필요로 하는 대상체에게 본원에 기재된 바와 같은 다가 CLTX-CAR γδ T 세포를 포함하는 조성물을 투여하는 단계 및 상기 대상체에게 유효량의 화학요법제를 공동 투여하는 단계를 포함하는, 상기 대상체에서 암 또는 종양을 치료하는 방법을 포함하며; 예컨대 유효량은 암 또는 종양 세포에서 스트레스 항원 발현을 증가시키기에 충분한 양이다. 또한, 본원에 기재된 바와 같은 2가 CLTX-CAR γδ T 세포 (또는 2가 CLTX-CAR γδ T 세포 집단)를 포함하는 약학 조성물 뿐만 아니라 암 또는 종양의 치료를 필요로 하는 대상체에게 본원에 기재된 바와 같은 2가 CLTX-CAR γδ T 세포를 포함하는 조성물을 투여하는 단계 및 상기 대상체에게 유효량의 화학요법제를 공동 투여하는 단계를 포함하는, 상기 대상체에서 암 또는 종양을 치료하는 방법을 포괄하며; 예컨대 유효량은 암 또는 종양 세포에서 스트레스 항원 발현을 증가시키기에 충분한 양이다.
특정 측면에서, 생존 인자는 화학요법제에 대해 저항성을 부여하는 폴리펩티드이다. 화학요법제에 대해 저항성을 부여하는 폴리펩티드는, 예컨대 알킬 구아닌 트랜스퍼라제(AGT), O6 메틸구아닌 DNA 메틸트랜스퍼라제(MGMT), P140K MGMT(본원에서 MGMTp140k로도 지칭됨), L22Y-DHFR, 티미딜레이트 신타제, 디히드로폴레이트 리덕타제, 다중 약물 저항성-1 단백질(MDR1), 5' 뉴클레오티다제 II, 디히드로폴레이트 리덕타제, 및 티미딜레이트 신타제로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 예컨대, 폴리펩티드는 임의의 화학요법제, 예컨대 알킬화제에 대해 저항성을 부여할 수 있다. 추가 측면에서, 폴리펩티드는 트리메토트렉세이트, 테모졸로미드, 랄티트렉세드, S-(4-니트로벤질)-6-티오이노신, 6-벤지구아니딘, 니트로소우레아, 포테무스틴, 시타바린, 및 캄프토테신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 화학요법제에 대해 저항성을 부여한다.
다가 CLTX-CAR 또는 2가 CLTX-CAR은 추가로 자살 유전자를 발현할 수 있다. 자살 유전자의 비제한적 예는 티미딘 키나제, 예컨대 단순 포진 바이러스 티미딘 키나제(HSV-TK)이다.
다가 CLTX-CAR은 2개의 CLTX 펩티드, 3개의 CLTX 펩티드, 4개의 CLTX 펩티드 또는 4개 초과의 CLTX 펩티드를 포함할 수 있다. 특정 측면에서, 다가 CLTX-CAR은 2개의 CLTX 펩티드를 포함한다. 추가 측면에서, 다가 CLTX-CAR은 2개의 CLTX 펩티드, 3개의 CLTX 펩티드 또는 4개의 CLTX 펩티드를 포함하고, 생존 인자는 MGMT 또는 MGMTp140k이다. 또 다른 측면에서, 다가 CLTX-CAR은 2개의 CLTX 펩티드를 포함하고, 생존 인자는 MGMT이다. 특정 측면에서, CLTX-CAR은 dCLTX-CAR이고, 생존 인자는 MGMT 또는 MGMTp140k이고, dCLTX-CAR은 세포내 신호전달 도메인을 포함하지 않는다. 추가 측면에서, CLTX-CAR은 dCLTX-CAR이고, 생존 인자는 MGMT 또는 MGMTp140k이고, dCLTX-CAR은 공자극 도메인(예컨대, CD28 공자극 도메인)을 포함하고 세포내 신호전달 도메인을 포함하지 않는다. 또 다른 추가 측면에서, CLTX-CAR은 dCLTX-CAR이고, 생존 인자는 MGMT 또는 MGMTp140k이고, dCLTX-CAR은 세포내 신호전달 도메인을 포함하지 않고 공자극 도메인을 포함하지 않는다.
다가 CLTX-CAR은 CD28 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인; 및/또는 CD3 제타(본원에서 CD3z 또는 CD3ζ로도 지칭됨) 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인; 및/또는 CD8, CD28 및/또는 CD137로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질의 힌지 영역을 포함하는 힌지 도메인을 포함할 수 있다. 특정 측면에서, 공자극 도메인이 존재하고, CD28 공자극 도메인 및/또는 4-1BB 공자극 도메인을 포함한다. 다가 CLTX-CAR은 추가로 세포외 신호 펩티드를 포함할 수 있으며; 예컨대 신호 펩티드는 CD8, CD28, GM-CSF, CD4, CD137, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질의 신호 펩티드이다. 예시적인 링커 펩티드는 c-myc, FLAG, 및 (GSSS)n이다.
다가 CLTX-CAR 또는 2가 CLTX-CAR은 CD28 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인; 및/또는 CD8, CD28, 및/또는 CD137로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질의 힌지 영역을 포함하는 힌지 도메인을 포함할 수 있다. 다가 또는 2가 CLTX-CAR은 추가로 세포외 신호 펩티드를 포함할 수 있으며; 예컨대, 신호 펩티드는 CD8, CD28, GM-CSF, CD4, CD137, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질의 신호 펩티드이다. 다가 또는 2가 CLTX CAR은 링커 펩티드를 포함할 수 있으며; 예시적인 링커 펩티드는 c-myc, FLAG, HA, 및 (GSSS)n이다.
특정 실시양태에서, 다가 CLTX-CAR은 세포내 신호전달 도메인을 포함하지 않거나 포함한다. 추가 측면에서, 다가 CLTX-CAR은 CD3 제타 신호전달 도메인을 포함하지 않거나 포함한다. 추가 실시양태에서, 다가 CLTX-CAR은 공자극 도메인(예컨대, CD28 공자극 도메인)을 포함하고 CD3 제타 신호전달을 포함하지 않는다.
또한, 엔도도메인이 세포내 신호전달 도메인을 포함하지 않거나 포함하는 2가 CLTX-CAR이 구체적으로 포괄된다. 추가 측면에서, 2가 CLTX-CAR의 엔도도메인은 CD3 제타 신호전달 도메인을 포함하지 않거나 포함한다. 추가 실시양태에서, 2가 CLTX-CAR은 공자극 도메인(예컨대, CD28 공자극 도메인)을 포함하고 CD3 제타 신호전달을 포함하지 않는다. 또한, CD3 제타 신호전달을 포함하지 않고 공자극 도메인(예컨대, CD28 공자극 도메인)을 포함하지 않는 2가 CLTX-CAR이 포괄된다.
치료 방법은, 예컨대 두개내 종양의 치료를 위한 것일 수 있다. 예컨대, 종양은 교모세포종과 같은 신경교종일 수 있다. 특정 측면에서, 다가 CLTX-CAR γδ T 세포 또는 이의 조성물은 두개내로 투여된다. 화학요법제에 반응하여 종양 세포에 의해 발현되는 스트레스 항원은, 예컨대 NKG2DL(NKG2D 리간드)일 수 있다. NKG2DL의 비제한적 예는 MIC-A, MIC-B, ULBP-1, ULBP-2, ULBP-3 및 ULBP-4를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 특히 2가 CLTX-CAR γδ T 세포를 포함하는 다가 CLTX-CAR γδ T 세포는 비교 가능한 sCLTX-CAR 감마 델타 T 세포와 비교하여 종양 세포에 대해 향상된 세포독성을 가질 수 있다. 추가 측면에서, 다가 CLTX-CAR γδ T 세포, 특히 2가 CLTX-CAR γδ T 세포는 비교 가능한 sCLTX-CAR γδ T 세포와 비교하여 향상된 지속성을 가질 수 있다. "비교 가능한 sCLTX-CAR"은 항원 인식 도메인에 단일 CLTX 펩티드를 포함한다는 점을 제외하고 비교되는 다가 CLTX-CAR γδ T 세포와 동일하다. 비교 가능한 sCLTX-CAR을 포함하는 조성물은 비교되는 다가 CLTX-CAR γδ T 세포의 조성물과 동일하다(예컨대, 세포의 수가 동일함; 부형제가 동일함, 투여 방식이 동일함 등).
특정 측면에서, 다가 CLTX-CAR γδ T 세포 또는 이의 조성물은 비교 가능한 sCLTX-CAR γδ T 세포 또는 이의 조성물보다 (생존 인자가 저항성을 부여하는) 화학요법제 환경에서 종양 세포에 대해 향상된 세포독성을 갖는다. 추가 측면에서, 다가 CLTX-CAR γδ T 세포 또는 이의 조성물은 비교 가능한 sCLTX-CAR γδ T 세포 또는 이의 조성물과 비교하여 향상된 활성화(예컨대, CD69 활성화)를 갖는다. 예컨대, 2가 CLTX-CAR γδ T 세포 또는 이의 조성물은 비교 가능한 sCLTX-CAR γδ T 세포 또는 이의 조성물보다 (생존 인자가 저항성을 부여하는) 화학요법제 환경에서 종양 세포에 대해 향상된 세포독성을 가질 수 있다. 추가 측면에서, 2가 CLTX-CAR γδ T 세포 또는 이의 조성물은 세포내 신호전달 도메인을 포함하지 않으며, 비교 가능한 sCLTX-CAR γδ T 세포 또는 이의 조성물과 비교하여 향상된 세포독성을 갖는다. 추가 측면에서, 2가 CLTX-CAR γδ T 세포 또는 이의 조성물은 공자극 도메인(예컨대, CD28 공자극 도메인)을 포함하고 세포내 신호전달 도메인을 포함하지 않으며, 비교 가능한 sCLTX-CAR γδ T 세포 또는 이의 조성물과 비교하여 향상된 세포독성을 갖는다. 또 다른 추가 측면에서, 2가 CLTX-CAR γδ T 세포는 공자극 도메인(예컨대, CD28 공자극 도메인)을 포함하지 않고 세포내 신호전달 도메인을 포함하지 않으며, 비교 가능한 sCLTX-CAR γδ T 세포 또는 이의 조성물과 비교하여 향상된 세포독성을 갖는다.
추가 측면에서, 다가 CLTX-CAR γδ T 세포 또는 이의 조성물은 비교 가능한 sCLTX-CAR γδ T 세포 또는 이의 조성물과 비교하여 향상된 지속성을 갖는다. 예컨대, 2가 CLTX-CAR γδ T 세포 또는 이의 조성물은 비교 가능한 sCLTX-CAR γδ T 세포 또는 이의 조성물과 비교하여 향상된 지속성을 갖는다. 추가 측면에서, 2가 CLTX-CAR γδ T 세포는 세포내 신호전달 도메인을 포함하지 않으며, 비교 가능한 sCLTX-CAR γδ T 세포 또는 이의 조성물과 비교하여 향상된 지속성을 갖는다. 추가 측면에서, 2가 CLTX-CAR γδ T 세포는 세포내 신호전달 도메인을 포함하지 않으며, 세포내 신호전달 도메인, 예컨대 CD3z 신호전달 도메인을 포함하는 비교 가능한 2가 CLTX-CAR γδ T 세포와 비교하여 향상된 지속성을 갖는다. 또 다른 추가 측면에서, 2가 CLTX-CAR γδ T 세포는 공자극 도메인(예컨대, CD28 공자극 도메인)을 포함하고 세포내 신호전달 도메인을 포함하지 않으며, 세포내 신호전달 도메인, 예컨대 CD3z 신호전달 도메인을 포함하는 비교 가능한 2가 CLTX-CAR γδ T 세포와 비교하여 향상된 지속성을 갖는다. 추가 실시양태에서, 2가 CLTX-CAR γδ T 세포는 공자극 도메인(예컨대, CD28 공자극 도메인)을 포함하지 않고 세포내 신호전달 도메인을 포함하지 않으며, 세포내 신호전달 도메인, 예컨대 CD3z 신호전달 도메인을 포함하는 비교 가능한 2가 CLTX-CAR γδ T 세포와 비교하여 향상된 지속성을 갖는다.
본 발명은 추가로 화학요법제로 치료를 받고 있는 대상체에서 종양 세포에 대한 CLTX-CAR γδ T 세포의 세포독성을 향상시키는 방법을 포괄하며, 방법은 본원에 기재된 바와 같은 적어도 2개의 CLTX 펩티드 및 생존 인자를 발현하도록 γδ T 세포를 조작하는 단계 및 추가로 조작된 γδ T 세포를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 다가 CLTX-CAR γδ T 세포 (또는 이의 조성물)는 비교 가능한 sCLTX-CAR γδ T 세포 (또는 이의 조성물)와 비교하여 향상된 세포독성을 갖는다. 또 다른 추가 측면에서, 본 발명은 화학요법제로 치료를 받고 있는 대상체에서 종양 세포에 대한 CLTX-CAR 감마 델타 T 세포의 활성화(예컨대, CD69 활성화)를 증가시키는 방법을 포괄하며, 방법은 적어도 2개의 CLTX 펩티드 및 생존 인자를 발현하도록 감마 델타 T 세포를 조작하는 단계 및 추가로 조작된 γδ T 세포를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 다가 CLTX-CAR γδ T 세포 (또는 이의 조성물)는 비교 가능한 sCLTX-CAR γδ T 세포 (또는 이의 조성물)에 비해 향상된 활성화를 나타낸다. 특정한 구체적 측면에서, 방법은 본원에 기재된 바와 같은 2개의 CLTX 펩티드(2가 CLTX-CAR) 및 생존 인자를 발현하도록 γδ T 세포를 조작하는 단계를 포함하며, 2가 CLTX-CAR γδ T 세포 (또는 이의 조성물)는 비교 가능한 sCLTX-CAR γδ T 세포 (또는 이의 조성물)와 비교하여 향상된 세포독성을 갖는다. 특정 실시양태에서, 2가 CLTX-CAR은 세포내 신호전달 도메인을 포함하지 않는다. 또 다른 측면에서, 2가 CLTX-CAR은 공자극 도메인(예컨대, CD28 공자극 도메인)을 포함하고 세포내 신호전달 도메인은 포함하지 않는다. 추가 측면에서, 2가 CLTX-CAR은 공자극 도메인(예컨대, CD28 공자극 도메인)을 포함하지 않고 세포내 신호전달 도메인을 포함하지 않는다.
본 발명은 추가로 화학요법제로 치료를 받고 있는 대상체에서 CLTX-CAR γδ T 세포의 지속성을 향상시키는 방법을 포함하며, 방법은 본원에 기재된 바와 같은 적어도 2개의 CLTX 펩티드 및 생존 인자를 발현하도록 γδ T 세포를 조작하는 단계 및 추가로 조작된 γδ T 세포를 개체에 투여하는 단계를 포함하며, 다가 CLTX-CAR γδ T 세포 (또는 이의 조성물)는 비교 가능한 sCLTX-CAR γδ T 세포 (또는 이의 조성물)와 비교하여 향상된 지속성을 갖는다. 특정 측면에서, 다가 CLTX-CARγδ T 세포는 신호전달 도메인을 포함한다. 또 다른 추가 측면에서, 다가 CLTX-CAR은 신호전달 도메인을 포함하지 않는다. 추가 측면에서, 다가 CLTX-CAR은 CD3z 신호전달 도메인을 포함하지 않는다. 특정한 구체적 측면에서, 방법은 본원에 기재된 바와 같은 2개의 CLTX 펩티드(2가 CLTX-CAR) 및 생존 인자를 발현하도록 γδ T 세포를 조작하는 단계를 포함하며, 2가 CLTX-CAR γδ T 세포 (또는 이의 조성물)는 비교 가능한 sCLTX-CAR γδ T 세포 (또는 이의 조성물)와 비교하여 향상된 지속성을 갖는다. 특정 실시양태에서, 2가 CLTX-CAR은 세포내 신호전달 도메인을 포함하지 않는다. 또 다른 측면에서, 2가 CLTX-CAR은 공자극 도메인(예컨대, CD28 공자극 도메인)을 포함하고 세포내 신호전달 도메인은 포함하지 않는다. 추가 측면에서, 2가 CLTX-CAR은 공자극 도메인(예컨대, CD28 공자극 도메인)을 포함하지 않고 세포내 신호전달 도메인을 포함하지 않는다.
본 발명은 추가로 본원에 기재된 바와 같은 다가 CLTX-CAR 또는 2가 CLTX-CAR을 코딩하는 핵산 또는 벡터를 포함한다. 특정 측면에서, 핵산 또는 벡터는 생존 인자를 추가로 코딩한다.
도 1은 MGMT를 발현하는 세포에서 이중 CLTX-CAR(dCLTX-CAR)을 나타내는 개략도이다. dCLTX-CAR의 2개의 CLTX 펩티드는 c-myc("Myc") 펩티드 링커에 의해 연결된다. 또한, 힌지 영역, 막횡단 영역, 세포내 공자극 도메인 및 세포내 신호전달 도메인이 나타나 있다.
도 2는 예시적인 CLTX-CAR 구축물의 구축물 맵이다. 왼쪽부터 시작하여 CLTX-CAR 구축물은 임의적으로 CD8 리더 서열("CD8L"), Myc 또는 Flag 펩티드에 의해 연결된 1개 또는 2개의 CLTX 펩티드(예컨대, 각각 CLTX 및 "Null", 및 CLTX 및 CLTX), CD8 힌지 영역("CD8H"), CD28 막관통 도메인("CD28tm"), CD28 공자극 도메인("CD28co"), CD3 제타 신호전달 도메인("CD3ζ" 또는 "Z") 또는 신호전달 도메인 없음("noZ"), P2A 펩티드, 및 MGMT 또는 EGFP를 포함할 수 있다. 도시된 CLTX-CAR 구축물은 하기 dCLTX(이중 CLTX 펩티드) 구축물을 포함한다:
a. CLTX-Myc-CLTX-CD8H-CD28co-Z-EGFP;
b. CLTX-Myc-CLTX-CD8H-CD28co-noZ-EGFP;
c. CLTX-Myc-CLTX-CD8H-CD28co-Z-MGMT;
d. CLTX-Myc-CLTX-CD8H-CD28co-noZ-MGMT;
e. CLTX-Flag -CLTX-CD8H-CD28co-Z-EGFP;
f. CLTX-Flag-CLTX-CD8H-CD28co-noZ-EGFP;
g. CLTX-Flag-CLTX-CD8H-CD28co-Z-MGMT; 및
h. CLTX-Flag-CLTX-CD8H-CD28co-noZ-MGMT.
도시된 CLTX-CAR 구축물은 또한 하기의 sCLTX(단일 CTLX 펩티드) 구축물을 포함한다:
a. CLTX-Myc-CD8H-CD28co-Z-EGFP;
b. CLTX-Myc-CD8H-CD28co-noZ-EGFP;
c. CLTX-Myc-CD8H-CD28co-Z-MGMT;
d. CLTX-Myc-CD8H-CD28co-noZ-MGMT;
e. CLTX-Flag-CD8H-CD28co-Z-EGFP;
f. CLTX-Flag-CD8H-CD28co-noZ-EGFP;
g. CLTX-Flag-CD8H-CD28co-Z-MGMT; 및
h. CLTX-Flag-CD8H-CD28co-noZ-MGMT.
도 3은 항-Myc 모노클로날 항체를 사용한 세포 표면 염색의 유동 세포측정 분석을 나타내고, dCLTX-CAR의 CLTX 세포 표면 국소화를 나타낸다. 세포는 또한 dCLTX-CAR 및 마커 유전자의 공동 발현을 나타내는 GFP에 대해 게이팅된다.
도 4는 EGFP를 발현하는 dCLTX-CAR 저캇(Jurkat) T 세포("CMC-EGFP") 및 MGMT를 발현하는 dCLTX-CAR 저캇 T 세포("CMC-MGMT")가 EGFP를 발현하는 sCLTX-CAR 저캇 T 세포("CTX-EGFP")와 비교하여 향상된 CD69 활성화를 나타낸다는 것을 나타내는 막대 그래프이다. dCLTX-CAR 세포는 2개의 CTLX 펩티드 사이에 Flag 펩티드를 포함하였다.
도 5는 24시간 동안 U251 GBM 세포와 함께 공동 배양되고 항-CD69 항체로 염색된 렌티바이러스 형질도입된 저캇 T 세포의 유동 세포측정 분석을 나타낸다.
도 6은 시간(일) 경과에 따른 LTX-CAR 형질도입된 저캇 세포 백분율(왼쪽: 1xCLTX-Myc 및 오른쪽: 2xCLTX-Myc)의 그래프를 나타낸다.
도 7은 γδ T 세포와 함께 공동 배양된 GBM 세포의 사진을 나타낸다. 왼쪽 상단 패널은 U25-GFP 세포 단독을 나타낸다. 1xCLTX-Flag-noZ 및 2xCLTX-Flag-noZ로 처리된 GBM 세포는 각각 왼쪽 하단 및 오른쪽 하단에 표시된다.
도 8은 24-48시간 동안 상이한 비율로 U251-GFP 또는 U87-GFP 세포와 함께 공동 배양된 후 아넥신 V 및 7-AAD로 염색된 형질도입된 γδ T 세포의 유동 세포측정 분석을 나타낸다.
도 9는 24시간 동안 U251 GBM 세포와 함께 공동 배양되고 항-CD69 항체로 염색된 CLTX-CAR 형질도입된 저캇 T 세포의 유동 세포측정 분석을 나타낸다. 대조군 세포(NTC), 녹색 형광 단백질 대조군(GFP), 1xCLTX-Z-GFP(단일 CLTX 펩티드, CD3z 신호전달 도메인, 및 GFP, 태그 없음), 1xCLTX-noZ-GFP(단일 CLTX 펩티드, CD3z 신호전달 도메인 없음, 및 GFP, 태그 없음), 1xCLTX-Flag-Z (단일 CLTX 펩티드, Flag 펩티드, 및 CD3z 신호전달 도메인), 1xCLTX-Flag-NoZ (단일 CLTX 펩티드, Flag 펩티드, 및 CD3z 신호전달 도메인 없음), 2xCLTX-Flag-Z (2개의 CLTX 펩티드, Flag 펩티드, 및 CD3z 신호전달 도메인) 및 2xCLTX-Flag-noZ (2개의 CLTX 펩티드, Flag 펩티드, 및 CD3z 신호전달 도메인 없음)에 대한 데이터가 표시된다. 도 9(상단 패널)는 Flag 또는 Myc 펩티드를 갖는 1xCLTX 구축물 및 2개의 CLTX 펩티드를 연결하는 Flag 또는 Myc 펩티드를 갖는 2xCLTX 구축물을 나타내는 개략도를 나타낸다. 도면에 나타난 바와 같이, CD3z 신호전달 도메인이 없는(noZ) CLTX-CAR 구조물로 형질도입된 저캇 T 세포는 U251 공동 배양 시 CD69 활성화를 나타내지 않았다. 태그 없이 1xCLTX-CAR로 형질도입된 저캇 T 세포는 형질도입되지 않은 세포와 비교하여 CD69의 적당한 활성화를 나타내었다. Flag 태그를 갖는 1xCLTX-CAR 또는 2xCLTX-CAR로 형질도입된 저캇 T 세포는 더 크게 상승된 CD69 활성화를 나타내었다.
도 10a-10d는 시간(일) 경과에 따른 CLTX-CAR 형질도입된 저캇 세포 백분율의 그래프이다. 도 10a는 시간(일) 경과에 따른 1xCTX-Myc-Z-MGMT 세포(1개의 CLTX 펩티드, Myc 펩티드, CD3z 신호전달 도메인, 및 MGMT) 및 1xCTX-Myc-noZ-MGMT 세포(1개의 CLTX 펩티드, Myc 펩티드, CD3z 신호전달 도메인 없음, 및 MGMT)의 백분율을 나타내는 그래프이다.
도 10b는 시간(일) 경과에 따른 2xCTX-Myc-Z-MGMT 세포(2개의 CLTX 펩티드, Myc 펩티드, CD3z 신호전달 도메인, 및 MGMT) 및 2xCTX-Myc-noZ-MGMT 세포(2개의 CLTX 펩티드, Myc 펩티드, CD3z 신호전달 도메인 없음, 및 MGMT)의 백분율을 나타내는 그래프이다. 도 10c는 시간(일) 경과에 따른 1xCTX-Flag-Z-MGMT 세포(1개의 CLTX 펩티드, Flag 펩티드, CD3z 신호전달 도메인, 및 MGMT) 및 1xCTX-Flag-noZ-MGMT 세포(1개의 CLTX 펩티드, Flag 펩티드, CD3z 신호전달 도메인 없음, 및 MGMT)의 백분율을 나타내는 그래프이다. 도 10d는 시간(일) 경과에 따른 2xCTX-Flag-Z-MGMT 세포(2개의 CLTX 펩티드, Flag 펩티드, CD3z 신호전달 도메인, 및 MGMT) 및 2xCTX-Flag-noZ-MGMT 세포(2개의 CLTX 펩티드, Flag 펩티드, CD3z 신호전달 도메인 없음, 및 MGMT)의 백분율을 나타내는 그래프이다. 도 10a-10d에 나타난 바와 같이, 신호전달 도메인을 갖지 않는 세포는 CD3z 신호전달 도메인을 갖는 세포보다 더 큰 지속성을 가졌고, CD3z 신호전달 도메인과 함께 2개의 CLTX 펩티드(이중 CLTX)를 갖는 세포는 단지 1개의 CLTX 펩티드를 갖는 비교 가능한 세포보다 더 큰 지속성을 나타내었다.
도 11a 및 11b는 제3, 6, 9, 12, 15 및 18일에 내부 리포터로서 향상된 녹색 형광 단백질(EGFP)을 발현하는 CLTX-CAR 형질도입된 저캇 세포의 유동 세포측정 분석을 나타낸다. 나타낸 데이터는 대조군 세포(NTC), 1xCTX-Flag-Z-EGFP(1개의 CLTX 펩티드, Flag 펩티드, CD3z 신호전달 도메인, 및 EGFP) 및 1xCTX-Flag-noZ-EGFP(1개의 CLTX 펩티드, Flag 펩티드, 신호전달 도메인 없음, 및 EGFP)에 대한 것이다. 1xCTX-Flag-noZ-EGFP는 1xCTX-Flag-Z-EGFP 세포보다 더 큰 지속성을 나타내었다. 구체적으로, 1xCLTX-Flag-Z-EGFP 형질도입된 저캇 T 세포는 시간 경과에 따라 세포 표면에서 CLTX-CAR을 발현하는 세포의 백분율이 감소한 반면, EGFP는 여전히 세포에서 세포내에 존재하는 것으로 나타났다.
도 12a 및 12b는 도 11a 및 11b에 나타낸 유동 세포측정 분석으로부터 시간(일) 경과에 따른 1xCLTX-CAR 형질도입된 저캇 세포의 백분율의 그래프이다. 도 12a는 시간(일) 경과에 따른 1xCTX-Flag-Z-EGFP 세포 및 GFP 단독(대조군)으로 형질도입된 세포의 백분율을 나타내는 그래프이다. 도 12b는 시간(일) 경과에 따른 1xCTX-Flag-noZ-EGFP 및 GFP로 형질도입된 세포를 나타내는 그래프이다.
도 13은 2:1의 이펙터/표적(E/T) 및 4:1의 E/T에서의 공동 배양에서 GBM 세포에 결합하는 대조군 γδ T 세포(γδ T 세포 NTC) 및 2xCLTX-CAR-noZ-γδ T 세포의 사진을 나타낸다. 맨 왼쪽 패널은 U87G-GBM 세포 단독을 나타낸다. 2xCLTX-CAR-FLAG-noZ-γδ T 세포는 대조군 γδ T 세포보다 더 큰 GBM 세포 결합을 나타내었다.
도 14는 4시간 동안 2.1의 E/T에서 U87-GFP 교모세포종 세포와 공동 배양한 후 7-AAD로 염색한 대조군(γδ T NTC), 2xCLTX-CAR-noZ-γδ T(CAR-γδ T) 세포의 유동 세포측정 분석을 나타낸다. 세포는 GFP 및 7-AAD에 대해 분류된다. U87GFP GBM 세포는 GFP+이고 죽은 세포는 7-AAD+이다. 맨 왼쪽 패널은 U87G-GBM 세포 단독을 나타낸다. 도 15는 2xCLTX-CAR-noZ-γδ T가 CD3z 신호전달 도메인 없이도 대조군 γδ T 세포(CAR 없음)와 비교하여 U87 교모세포종 세포에 대해 향상된 세포독성을 나타내었다는 것을 나타낸다.
도 15는 2xCLTX-CAR-noZ γδ T 세포에 의한 U251MG GBM 세포의 순차적인 사멸을 나타내는 저속 촬영 뮤비로부터의 일련의 정지 이미지를 나타낸다. 이미지에서 녹색 세포 (또는 회색 스케일로 표시되는 바와 같이 더 밝은 세포)는 종양 세포이다. 적색 화살표는 γδ T 세포가 시간 경과에 따라 상이한 종양 세포에 결합하여 사멸시키는 것을 나타낸다(이미지에서 T1, T2, T3, T4 및 T5 및 Kill-1, Kill-2, Kill-3, Kill-4 및 Kill-5 참조). 이미지는 시간 경과에 따라 촬영되었다(왼쪽에서 오른쪽으로, 이미지 사이의 화살표로 표시됨).
도 16은 세포에서 3xCLTX-CAR 및 4xCLTX-CAR을 나타내는 개략도이다. 3xCLTX-CAR에서 3개 CLTX 펩티드는 도시된 바와 같이 Flag 펩티드 및 Myc 펩티드로 연결되어 있다. 4xCLTX-CAR에서 4개의 CLTX 펩티드는 도시된 바와 같이 HA, Flag 펩티드 및 Myc 펩티드로 연결되어 있다. 또한, 힌지 영역, 막횡단 영역, 임의의 세포내 공자극 도메인, 및 임의의 세포내 신호전달 도메인이 표시된다. 3xCLTX-CAR 구축물의 경우, 구축물은 하기를 포함한다:
a. CTX-Myc-CTX-Flag-CTX-CD8H-CD28co-Z-EGFP;
b. CTX-Myc-CTX-Flag-CTX-CD8H-CD28co-noZ-EGFP;
c. CTX-Myc-CTX-Flag-CTX-CD8H-CD28co-Z-MGMT; 및
d. CTX-Myc-CTX-Flag-CTX-CD8H-CD28co-noZ-MGMT
4xCLTX-CAR 구축물의 경우, 구축물은 하기를 포함한다:
a. CTX-Myc-CTX-Flag-CTX-HA-CTX-CD8H-CD28co-Z-EGFP;
b. CTX-Myc-CTX-Flag-CTX-HA-CTX-CD8H-CD28co-noZ-EGFP;
c. CTX-Myc-CTX-Flag-CTX-HA-CTX-CD8H-CD28co-Z-MGMT; 및
d. CTX-Myc-CTX-Flag-CTX-HA-CTX-CD8H-CD28co-noZ-MGMT.
도 17a-17c는 대조군(NTC) 세포, 3xCLTX-Z-EGFP 저캇 세포 및 4xCLTX-Z-EGFP 저캇 세포에 대한 항-Myc 모노클로날 항체를 사용한 세포 표면 염색의 유동 세포측정 분석을 나타내고, 또한 U251 GBM 세포와 함께 24시간 동안 공동 배양하고 항-CD69 항체로 염색한 후 CD69 활성화를 나타낸다. 세포는 또한 GFP에 대해 게이팅된다. 도 17b 및 17c는 3xCLTX 및 4xCLTX CAR이 세포 표면에 정상적으로 제시되지 않는다는 것을 나타낸다(GFP+는 측정되지만 Myc는 아님). 또한, 3xCLTX 또는 4xCLTX 형질도입된 저캇 세포에서 종양 세포와 함께 공동 배양한 후 CD69 활성화가 관찰되지 않았다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 기술자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기술된 것과 유사하거나 등가인 임의의 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 물질이 이제 기술된다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용되는 바와 같이, 단수 형태는 문맥상 명백하게 달리 지시하지 않는 한 복수 지시대상을 포함한다. 따라서, 예컨대 "세포"에 대한 언급은 복수의 세포를 포함한다. 본 명세서 및 이어지는 청구범위에서, 반대 의도가 명백하지 않는 한, 하기 의미를 갖는 것으로 정의되는 다수의 용어를 참조할 것이다.
비율, 농도, 양 및 다른 수치 데이터가 범위 형식으로 본원에서 표현될 수 있다는 점에 유의해야 한다. 이러한 범위 형식은 편의 및 간결함을 위해 사용된 것으로, 범위의 한계로서 명시적으로 언급된 수치 뿐만 아니라 그 범위 내에 포괄되는 모든 개별 수치 또는 하위 범위가 각각 명시적으로 언급된 것처럼 포함되도록 유연하게 해석되어야 함을 이해하여야 한다. 예컨대, "약 0.1% 내지 약 5%"의 농도 범위는 명시적으로 인용된 약 0.1 중량% 내지 약 5 중량%의 농도를 포함할 뿐만 아니라 표시된 범위 내의 개별 농도(예컨대, 1%, 2%, 3% 및 4%) 및 하위 범위(예컨대, 0.5%, 1.1%, 2.2%, 3.3% 및 4.4%)를 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 용어 "약"은 변형되는 수치(들)의 ±1%, ±2%, ±3%, ±4%, ±5%, ±6%, ±7%, ±8%, ±9%, 또는 ±10% 또는 그 초과를 포함할 수 있다. 또한, 어구 "약 'x' 내지 'y'"는 "약 'x' 내지 약 'y'"를 포함한다. 숫자, 비율, 농도, 양, 범위 및 다른 수치 데이터는 문맥과 불일치하지 않는 한 용어 "약"에 의해 변형되는 것으로 해석되어야 한다.
용어 "약물 저항성 면역요법" 또는 DRI는 항암 면역 세포, 바람직하게는 γδ T 세포가 화학요법 약물의 독성 효과에 저항하도록 유전적으로 조작되어 화학요법과 면역요법의 조합 투여를 가능하게 하는 암 치료 전략이다. 화학요법 저항성 또는 화학저항성의 획득은 암 치료 분야에서 널리 공지된 현상이다. 화학요법제에 대한 이러한 저항성은 약물 저항성 유전자에 영향을 미치는 특정 DNA, RNA, 또는 폴리펩티드의 발현, 약물 저항성을 전달하는 유전자의 발현, 화학요법제에 대해 저항성을 부여하는 폴리펩티드의 발현으로부터 발생할 수 있다. 본원에 기재된 DRI 전략은 암 면역요법에 사용될 수 있는 면역 세포에 대해 저항성을 부여하기 위해 화학저항성을 사용한다. 예컨대, DRI γδ T 세포는 화학요법제에 대해 저항성을 부여하는 DNA, RNA, 또는 폴리펩티드를 포함하지만 이에 제한되지 않는 본원에 기재된 바와 같은 생존 인자를 발현하도록 유전적으로 조작된 γδ T 세포를 포함한다. 화학요법제에 대해 저항성을 부여하는 폴리펩티드는 본원에서 "생존 폴리펩티드"로 지칭될 수 있다. 다가 CLTX-CAR을 포함하는 DRI γδ T 세포는 다가 CLTX-CAR DRI γδ T 세포로 지칭될 수 있다.
용어 "생존 인자"는 화학요법제 및/또는 화학요법제 치료 레지먼에 대해 저항성을 부여하고/하거나 생존 인자를 포함하는 세포가 치료 환경(예컨대, 화학요법 치료 환경)에서 생존할 수 있게 하는 당업계에서 현재 공지되어 있거나 이후에 발견될 임의의 작용제를 지칭한다. 어구 "저항성을 부여한다" 등은 화학요법제에 대한 저항성의 획득 또는 화학요법제에 대한 저항성의 개선을 포괄한다. "생존 인자"는 γδ T 세포에 의해 발현될 때 화학요법제에 대해 저항성을 부여하는 작용제를 포함한다. 따라서, "생존 인자"는 γδ T 세포에 의해 발현되고(예컨대, 약물 저항성 유전자에 의해 코딩되고) 화학요법제에 대해 저항성을 부여하는 DNA, RNA, 또는 폴리펩티드일 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이, γδ T 세포는 화학요법제에 대해 저항성을 부여하는 생존 인자를 코딩하는 유전자, 유전자 단편, DNA, siRNA, 또는 mRNA를 발현하는 벡터를 포함함으로써 화학요법 약물에 대해 저항성을 부여하는 DNA, RNA, 또는 폴리펩티드를 발현하도록 조작될 수 있다. 또 다른 측면에서, 생존 인자는 화학요법제에 대해 저항성을 부여하는 DNA이다. 추가 측면에서, 생존 인자는 화학요법제에 대해 저항성을 부여하는 RNA(예컨대, RNAi, siRNA, micoRNA 또는 mRNA)이다.
특정 측면에서, 생존 인자는 화학요법제에 대해 저항성을 부여하는 폴리펩티드이며; 예컨대, 폴리펩티드는 γδ T 세포에 의해 발현될 때 저항성을 부여한다. 특정 실시양태에서, 생존 인자는 MGMT, 다중약물 저항성 단백질 1(MDR1) 또는 5' 뉴클레오티다제 II(NT5C2)이다. 다른 생존 인자는, 예컨대 디히드로폴레이트 리덕타제(L22Y-DHFR) 및 티미딜레이트 신타제의 약물 저항성 변이체를 포함한다. 특정 측면에서, 생존 인자는 MGMT이다. 저항성을 부여하는 다른 폴리펩티드는 치료 환경의 특성(즉, 본 개시내용의 세포 조성물과 조합하여 환자에게 제공되는 다른 치료 레지먼)에 따라 세포에 의해 사용되거나 발현될 수 있다. MGMT는 구아닌의 O6 위치로부터 돌연변이유발 부가물을 제거하여 DNA의 알킬화 병변을 복구한다. 이러한 돌연변이유발 부가물은 알킬화제(테모졸로미드를 포함하지만 이에 제한되지 않음)에 의해 유발될 수 있다. 따라서, MGMT는 테모졸로미드와 같은 알킬화제에 대해 저항성을 부여하는 폴리펩티드이다. 생존 인자는 본원에 기재된 특정 화학요법제를 포함하지만 이에 제한되지 않는 화학요법제에 대해 저항성을 부여하는 폴리펩티드일 수 있다.
"투여"는 본 발명의 화합물, 세포 집단을 포함하는 생물학적 물질, 또는 이들의 조합, 또는 전술된 임의의 화합물, 생물학적 물질(예컨대, 세포 집단) 또는 이들의 조합을 포함하는 조성물을 인간 또는 동물 대상체에 도입하는 것을 의미한다. 화합물의 바람직한 투여 경로 중 하나는 정맥내이다. 또 다른 바람직한 경로는 비경구이다. "비경구"는 안와내, 주입, 동맥내, 피막내, 심장내, 피내, 근육내, 복강내, 폐내, 척수내, 흉골내, 척추강내, 두개내, 자궁내, 정맥내, 지주막하, 피막하, 피하, 경점막 또는 경기관을 포함하는 주사와 관련된 투여 경로를 지칭한다. 화합물의 다른 예시적인 투여 경로는 복강내 또는 흉막내, 또는 뇌에 대한 카테터를 통한 것일 수 있다. 그러나, 경구, 국소, 피하, 복막, 동맥내, 흡입, 질, 직장, 비강, 뇌척수액으로의 도입, 두개내 또는 신체 구획으로의 적하와 같은 임의의 투여 경로가 사용될 수 있다. 고형 종양과 같은 표적 조직 부위로 직접 주사하는 것도 고려된다. 예컨대, 신경교종 또는 다른 두개내 종양의 치료를 위해 γδ T 세포의 두개내 투여가 사용될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "암"은 비정상인 세포가 조절 없이 분열하는 질환에 대한 일반적인 용어로서 일반적인 의미로 주어져야 한다. 암세포는 주변 조직을 침범할 수 있고, 혈류 및 림프계를 통해 신체의 다른 부분으로 퍼질 수 있다. 정상적인 세포가 특정되고 제어되고 조정된 단위로 행동하는 능력을 상실하면 종양이 형성된다. 일반적으로, 고형 종양은 일반적으로 낭종 또는 액체 영역을 함유하지 않는 비정상적인 조직 덩어리이다(일부 뇌종양은 액체로 채워진 낭종 및 중앙 괴사 영역을 가짐). 단일 종양은 심지어 빗나간 상이한 과정과 함께 그 안에 상이한 세포 집단을 가질 수 있다. 고형 종양은 양성(암성이 아님) 또는 악성(암성)일 수 있다. 상이한 유형의 고형 종양은 이를 형성하는 세포 유형에 따라 명명된다. 고형 종양의 예는 육종, 암종 및 림프종이다. 백혈병(혈액암)은 일반적으로 고형 종양을 형성하지 않는다. 암종은 피부 또는 내부 기관을 따라 늘어서 있거나 이를 덮고 있는 조직에서 시작되는 암이다. 신경교종은 뉴런을 제자리에 유지하고 잘 기능하도록 돕는 신경교로 불리는 뇌의 지지("교질") 조직으로부터 발생하는 종양이다. 육종은 골, 연골, 지방, 근육, 혈관 또는 다른 결합 또는 지지 조직에서 시작되는 암이다. 백혈병은 골수와 같은 혈액 형성 조직에서 시작하여 많은 수의 비정상적인 혈액 세포가 생성되어 혈류로 들어가게 하는 암이다. 림프종은 면역계의 세포에서 시작되는 암이다.
대표적인 암은 특히 급성 림프모구성 백혈병, 성인; 급성 림프모구성 백혈병, 소아기; 급성 골수성 백혈병, 성인; 부신피질 암종; 부신피질 암종, 소아기; AIDS 관련된 림프종; AIDS 관련된 악성종양; 항문암; 성상세포종, 소아기 소뇌; 성상세포종, 소아기 대뇌; 담관암, 간외; 방광암; 방광암, 소아기; 골암, 골육종/악성 섬유성 조직구종; 교모세포종, 소아기; 교모세포종, 성인; 뇌간 신경교종, 소아기; 뇌종양, 성인; 뇌종양, 뇌간 신경교종, 소아기; 뇌종양, 소뇌 성상세포종, 소아기; 뇌종양, 대뇌 성상세포종/악성 신경교종, 소아기; 뇌종양, 뇌실막종, 소아기; 뇌종양, 수모세포종, 소아기; 뇌종양, 천막위 원시 신경외배엽 종양, 소아기; 뇌종양, 시각 경로 및 시상하부 신경교종, 소아기; 뇌종양, 소아기 (기타); 유방암; 유방암 및 임신; 유방암, 소아기; 유방암, 남성; 기관지 선종/카르시노이드, 소아기: 카르시노이드 종양, 소아기; 카르시노이드 종양, 위장; 암종, 부신피질; 암종, 섬세포; 미지의 원발성 암종; 중추신경계 림프종, 원발성; 소뇌 성상세포종, 소아기; 대뇌 성상세포종/악성 신경교종, 소아기; 자궁경부암; 소아암; 크롬 림프구성 백혈병; 만성 골수성 백혈병; 만성 골수증식성 장애; 힘줄집의 투명 세포 육종; 결장암; 결장직장암, 소아기; 피부 T 세포 림프종; 자궁내막암; 뇌실막종, 소아기; 상피암, 난소; 식도암; 식도암, 소아기; 종양의 유잉 패밀리; 두개외 생식 세포 종양, 소아기; 고환외 생식 세포 종양; 간외 담관암; 안암, 안내 흑색종; 안암, 망막모세포종; 담낭암; 위(Gastric) (위(Stomach))암; 위(Gastric) (위(Stomach))암, 소아기; 위장 카르시노이드 종양; 생식 세포 종양, 두개외, 소아기; 생식 세포 종양, 고환외; 생식 세포 종양, 난소; 임신성 융모성 종양; 신경교종. 소아기 뇌간; 신경교종, 소아기 시각 경로 및 시상하부; 털세포 백혈병; 두경부암; 간세포(간)암, 성인(원발성); 간세포(간)암, 소아기(원발성); 호지킨 림프종, 성인; 호지킨 림프종, 소아기; 임신 중 호지킨 림프종; 하인두암; 시상하부 및 시각 경로 신경교종, 소아기; 안내 흑색종; 섬세포 암종 (내분비 췌장); 카포시 육종; 신장암; 후두암; 후두암, 소아기; 백혈병, 급성 림프모구성, 성인; 백혈병, 급성 림프모구성, 소아기; 백혈병, 급성 골수성, 성인; 백혈병, 급성 골수성, 소아기; 백혈병, 크롬 림프구성; 백혈병, 만성 골수성; 백혈병, 털세포; 입술 및 구강암; 간암, 성인(원발성); 간암, 소아기 (원발성); 폐암, 비소세포; 폐암, 소세포; 림프모구성 백혈병, 성인 급성; 림프모구성 백혈병, 소아기 급성; 림프구성 백혈병, 만성; 림프종, AIDS 관련; 림프종, 중추신경계(원발성); 림프종, 피부 T 세포; 림프종, 호지킨, 성인; 림프종, 호지킨; 소아기; 림프종, 임신 중 호지킨; 림프종, 비-호지킨, 성인; 림프종, 비-호지킨, 소아기; 림프종, 임신 중 비-호지킨; 림프종, 원발성 중추신경계; 마크로글로불린혈증, 발덴스트롬; 남성 유방암; 악성 중피종, 성인; 악성 중피종, 소아기; 악성 흉선종; 수모세포종, 소아기; 흑색종; 흑색종, 안내; 메르켈 세포 암종; 중피종, 악성; 원발 불명 전이성 편평 경부암; 다발성 내분비 신생물 증후군, 소아기; 다발성 골수종/형질 세포 신생물; 균상 식육종; 골수이형성 증후군; 골수성 백혈병, 크롬; 골수성 백혈병, 소아기 급성; 골수종, 다발성; 골수증식성 장애, 만성; 비강 및 부비동암; 비인두암; 비인두암, 소아기; 신경모세포종; 신경섬유종; 비-호지킨 림프종, 성인; 비-호지킨 림프종, 소아기; 임신 중 비-호지킨 림프종; 비소세포 폐암; 구강암, 소아기; 구강 및 입술암; 구인두암; 골의 골육종/악성 섬유성 조직구종; 난소암, 소아기; 난소 상피암; 난소 생식 세포 종양; 난소 저악성 잠재성 종양; 췌장암; 췌장암, 소아기, 췌장암, 섬세포; 부비동 및 비강암; 부갑상선암; 음경암; 크롬 친화성 세포종; 송과체 및 천막위 원시 신경외배엽 종양, 소아기; 뇌하수체 종양; 형질 세포 신생물/다발성 골수종; 흉막폐모세포종; 임신 및 유방암; 임신 및 호지킨 림프종; 임신 및 비-호지킨 림프종; 원발성 중추신경계 림프종; 원발성 간암, 성인; 원발성 간암, 소아기; 전립선암; 직장암; 신장 세포(신장)암; 신장 세포암, 소아기; 신우 및 요관, 이행 세포암; 망막모세포종; 횡문근육종, 소아기; 타액선 암; 타액선 암, 소아기; 육종, 종양의 유잉 패밀리; 육종, 카포시; 골의 육종(골육종)/악성 섬유성 조직구종; 육종, 횡문근육종, 소아기; 육종, 연조직, 성인; 육종, 연조직, 소아기; 세자리 증후군; 피부암; 피부암, 소아기; 피부암(흑색종); 피부 암종, 메르켈 세포; 소세포 폐암; 소장암; 연조직 육종, 성인; 연조직 육종, 소아기; 원발 불명 편평 경부암, 전이성; 위(Stomach) (위(Gastric))암; 위(Stomach) (위(Gastric))암, 소아기; 천막위 원시 신경외배엽 종양, 소아기; T 세포 림프종, 피부; 고환암; 흉선종, 소아기; 흉선종, 악성; 갑상선암; 갑상선암, 소아기; 신우 및 요관의 이행 세포암; 영양막 종양, 임신; 원발 부위 불명 암, 소아기; 소아기의 비정상적 암; 요관 및 신우, 이행 세포암; 요도암; 자궁 육종; 질암; 시각 경로 및 시상하부 신경교종, 소아기; 외음부암; 발덴스트롬의 마크로글로불린혈증; 및 윌름스 종양을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
종양은 악성 또는 양성으로 분류될 수 있다. 두 경우 모두 세포의 비정상적인 응집 및 증식이 있다. 악성 종양의 경우, 이러한 세포는 보다 공격적으로 행동하여 침습성이 증가하는 특성을 획득한다. 궁극적으로, 종양 세포는 자신이 기원한 미세한 환경으로부터 벗어나 (일반적으로 성장에 도움이 되지 않는 상이한 환경을 갖는) 신체의 또 다른 영역으로 퍼지고 이 새로운 위치에서 급속한 성장 및 분열을 계속할 수 있는 능력을 얻을 수도 있다. 이것을 전이라고 한다. 악성 세포가 전이되면 치유 또는 치료를 달성하기가 더 어렵다. 양성 종양은 침습하는 경향이 적고 전이 가능성이 적다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "융합 단백질"은, 예컨대 적어도 2개의 CLTX 펩티드 및 적어도 하나의 이종 부분, 즉 자연에서 자연적으로 연결되지 않은 부분을 포함하는, 예컨대 항원 인식 도메인을 포함하는 키메라 분자를 지칭한다. 아미노산 서열은 일반적으로 융합 폴리펩티드에서 합쳐지는 별도의 단백질에 존재할 수 있거나 이들은 일반적으로 동일한 단백질에 존재할 수 있지만 융합 폴리펩티드에서 새로운 배열로 배치된다. 예컨대, 융합 단백질은 화학적 합성에 의해, 또는 펩티드 영역이 원하는 관계로 코딩된 폴리뉴클레오티드를 생성 및 번역함으로써 생성될 수 있다. 본원에 기재된 다가 CLTX-CAR은 적어도 2개의 CLTX 펩티드를 포함하는 융합 단백질일 수 있다.
다가 CLTX-CAR γδ T 세포 및 화학요법제의 투여를 포함하는 본원에 기재된 치료 방법은 암 또는 종양을 감소시키기 위해 사용될 수 있다. 용어 "암을 감소시키는", "암의 억제", "암을 억제하는", "암 재발을 방지하는" 및 유사한 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 종양 덩어리의 크기 또는 부피의 감소, 대상체에서 전이된 종양의 수의 감소, 암세포의 증식 상태(암 세포가 증식하는 정도)의 감소, 이전 종양의 재발 또는 새로운 전이의 발달의 방지 중 하나 이상을 지칭한다.
다가 CLTX-CAR γδ T 세포 및 화학요법제의 투여를 포함하는 본원에 기재된 치료 방법은 종양을 감소시키기 위해 사용될 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "종양을 감소시키는"은 종양 덩어리의 크기 또는 부피의 감소, 대상체에서 전이된 종양의 수의 감소, 암세포의 증식 상태(암 세포가 증식하는 정도)의 감소 등을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "화학요법제"는 암세포와 상호작용하여 세포의 증식 상태를 감소시키고/시키거나, 예컨대 세포 분열 또는 DNA 합성을 손상시키거나 DNA를 손상시킴으로써 빠르게 분열하는 세포를 효과적으로 표적화함으로써 세포를 사멸시킬 수 있는 화합물 또는 이의 유도체를 지칭한다. 화학요법제의 예는 알킬화제(예컨대, 사이클로포스파미드, 이포스파미드, 테모졸로미드); 대사 길항제(예컨대, 메토트렉세이트(MTX), 5-플루오로우라실 또는 이의 유도체); 치환된 뉴클레오티드; 치환된 뉴클레오시드; DNA 탈메틸화제(항대사물로도 공지됨; 예컨대, 아자시티딘); 항종양 항생제(예컨대, 미토마이신, 아드리아마이신); 식물 유래된 항종양제(예컨대, 빈크리스틴, 빈데신, TAXOL®, 파클리탁셀, 아브락산); 시스플라틴; 카르보플라틴; 에토포시드 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 이러한 작용제는 추가로 항암제 트리메토트렉세이트(TMTX); 테모졸로미드(TMZ); 랄티트렉세드; S-(4-니트로벤질)-6-티오이노신(NBMPR); 6-벤지구아니딘(6-BG); 니트로소우레아 니트로소우레아 (라비노피라노실-N-메틸-N-니트로소우레아 (아라노스), 카르무스틴(BCNU, BiCNU), 클로로조토신, 에틸니트로소우레아 (ENU), 포테무스틴, 로무스틴(CCNU), 니무스틴, N-니트로소-N-메틸우레아(NMU), 라니무스틴(MCNU), 세무스틴, 및 스트렙토조신(스트렙토조토신)); 시타라빈; 및 캄프토테신; 또는 이들의 임의의 것의 치료 유도체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "키메라 항원 수용체(들) (CAR(s))"는, 예컨대 인공 T 세포 수용체, T-바디, 단일 쇄 면역수용체, 키메라 T 세포 수용체 또는 키메라 면역수용체를 지칭하며, 인공 특이성(예컨대, 항원 인식 도메인)을 특정 면역 이펙터 세포, 예컨대 γδ T 세포에 이식하는 조작된 수용체를 포괄한다. 일부 실시양태에서, CAR은 세포내 활성화 도메인, 막관통 도메인, 및 길이가 다양할 수 있고 항원 인식 도메인을 포함하는 세포외 도메인을 포함한다. 또한, 본원에 기재된 바와 같이, CAR은 세포내 신호전달 도메인이 결여될 수 있다. 다가 CLTX-CAR에서, 항원 인식 도메인은 1개 초과의 CLTX 펩티드, 예컨대, 2, 3, 4, 5개 또는 그 초과의 CLTX 펩티드를 포함할 수 있다. 항원 인식 도메인 내에 CLTX 펩티드를 포함하는 CAR은 본원에서 CLTX-CAR로 지칭된다. "다가 CLTX-CAR"은 항원 인식 도메인에 1개 초과의 CLTX 펩티드를 포함하는 CTLX-CAR이고; 예컨대, 1개 초과의 CLTX 펩티드는 펩티드 또는 펩티드들에 의해 연결될 수 있다. 이러한 연결 펩티드는 본원에서 "링커 펩티드" 또는 "연결 펩티드"로 지칭된다. CLTX 펩티드 쌍을 연결하는 링커 펩티드는 항원 인식 도메인에서 상이한 CLTX 펩티드 쌍을 연결하는 펩티드와 동일하거나 상이할 수 있으며; 예컨대, 3개의 CLTX 펩티드를 포함하는 다가 CLTX-CAR에서, 2개의 펩티드(예컨대, 제1 및 제2 펩티드)를 연결하는 링커 펩티드는 (예컨대, 제2 펩티드 및 제3 펩티드를) 연결하는 링커 펩티드와 동일하거나 상이할 수 있다. 용어 "이중 CLTX-CAR" 또는 "dCLTX-CAR" 또는 "2가 CAR" 또는 "2xCLTX-CAR"은 항원 인식 도메인에 2개의 CLTX 펩티드를 포함하는 CAR을 지칭하고; 2개의 CLTX 펩티드는 링커 펩티드에 의해 부착될 수 있다. "단일 CLTX-CAR" 또는 "sCLTX-CAR" 또는 "1xCLTX-CAR"은 항원 인식 도메인에 단지 하나의 CLTX 펩티드를 포함하는 CAR을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "클로로톡신" 및 "CLTX" 또는 "CTX"는 상호교환적으로 사용되며, 아미노산 서열: (UniProt Accession # P45639)을 갖는 36개의 아미노산을 포함하는 전갈 독 펩티드, 클로로톡신을 지칭한다. 이론에 구애됨이 없이, CLTX 펩티드 결합 도메인은 신경교종, 간암, 난소암 및 표적을 발현하는 다른 암을 포함하지만 이에 제한되지 않는 고형 종양으로 γδ T 세포의 트래피킹을 향상시키는 역할을 할 수 있다. CLTX 펩티드는 또한 흑색종, 소세포 폐 암종, 신경모세포종, 유방암, 신장암, 간암, 폐암, 난소암 및 수모세포종으로의 트래피킹을 향상시킬 수 있다.
다른 CAR 설계의 특이성은 수용체의 리간드(예컨대, 펩티드)로부터 유도될 수 있다. 특정 경우에서, 항원 인식 도메인의 간격을 변형하여 활성화 유발된 세포사를 감소시킬 수 있다. 특정 경우에서, CAR의 세포내 신호전달 도메인은 CD3ζ에 더하여 FcR, CD27, CD28, CD 137, DAP 10, 및/또는 OX40과 같으나 이에 제한되지 않는 추가의 공동 자극 신호전달을 위한 도메인을 포함한다. 일부 경우에서, 공동 자극 분자, 이미징을 위한 리포터 유전자(예컨대, 양전자 방출 단층촬영용), 추가의 치료적 처치에 의해 생성되는 치료 환경에서 CAR을 발현하는 숙주 세포가 생존할 수 있도록 하는 유전자 생성물, 프로드럭의 첨가 시 CAR을 발현하는 숙주 세포를 조건부로 제거하는 유전자 생성물, 귀소 수용체, 케모카인, 케모카인 수용체, 시토카인 및 시토카인 수용체를 포함하는 분자가 CAR과 공동 발현될 수 있다.
또한, 본원에 기재된 바와 같이, CLTX-CAR은 세포내 신호전달 도메인을 포함하지 않는 CLTX-CAR일 수 있다.
또한, 본 발명은 CLTX 펩티드의 하나 초과의 기능적 변이체를 포함하는 다가 CAR을 포괄하며, 기능적 변이체는 동일하거나 상이할 수 있다. 또한, 본 발명은 하나 초과의 CLTX 유사 펩티드를 포함하는 다가 CAR을 포함하며, CLTX 유사 펩티드는 동일하거나 상이할 수 있다. 또한, 본 발명은 세포외 항원 결합 도메인에 CLTX 펩티드, CLTX 유사 폴리펩티드, 및 CLTX 펩티드의 기능적 변이체 중 하나 초과(예컨대, 2개)을 포함하는 다가 CAR을 포괄한다. 예컨대, 2가 CAR은 2개의 CLTX 펩티드, 또는 2개의 CLTX 유사 폴리펩티드, 또는 CLTX 펩티드의 2개의 기능적 변이체, 또는 이들의 조합(예컨대, 1개의 CLTX 펩티드 및 1개의 CLTX 유사 폴리펩티드)을 포함할 수 있다.
CLTX 펩티드의 "기능적 변이체"는 클로로톡신(CLTX)(예컨대, 서열번호 1)과 실질적인 또는 상당한 서열 동일성 또는 유사성을 갖는 펩티드이며, 기능적 변이체는 클로로톡신 펩티드의 생물학적 활성을 보유한다. 예컨대, CLTX의 기능적 변이체를 포함하는 CAR은 CLTX-CAR의 생물학적 활성 중 적어도 일부를 보유하고; 예컨대, 모 CLTX-CAR과 유사한 정도, 동일한 정도 또는 더 높은 정도로 표적 세포를 인식하는 능력을 보유한다. 용어 "CLTX의 기능적 변이체" 및 "CLTX 펩티드의 기능적 변이체"는 본원에서 상호교환적으로 사용된다. CLTX 펩티드의 기능적 변이체는 CLTX 펩티드(예컨대, 서열번호 1)와 적어도 약 65% 동일하거나, 적어도 약 80% 동일하거나, 약 90% 동일하거나, 약 95% 동일하거나, 약 99% 동일한 아미노산 서열일 수 있거나 이를 가질 수 있다. 예컨대, 본원에 기재된 바와 같은 다가 CAR은 세포외 항원 인식 도메인 내의 CLTX의 적어도 하나의 기능적 변이체를 활용할 수 있으며(항원 인식 모이어티는 CLTX 펩티드, CLTX의 또 다른 기능물 또는 CLTX 유사 펩티드를 추가로 포함할 수 있음), CLTX의 이러한 기능적 변이체는 서열번호 1과 70%, 80%, 90%, 95% 또는 그 초과의 상동성을 갖는 서열을 포함한다.
기능적 변이체는, 예컨대 원하는 CTX-CAR 기능적 변이체를 생성하기 위해 당업자에게 공지된 바와 같이 선택될 수 있는 적어도 하나의 아미노산 변형(예컨대, 제한 없이, 결실, 삽입 및 치환)을 갖는 CLTX의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 서열번호 1의 아미노산 서열에 대한 보존적 변형 (및 코딩 뉴클레오티드에 대한 상응하는 변형)은 자연 발생 CLTX와 유사한 기능적 및 화학적 특징을 갖는 기능적 변이체를 생성할 것이다.
어구 "보존적 아미노산 치환" 또는 "보존적 돌연변이"는 하나의 아미노산을 공통 특성을 갖는 다른 아미노산으로 대체하는 것을 지칭한다. 보존적 돌연변이의 예는 동일한 아미노산 하위 그룹 내의 아미노산의 아미노산 치환, 예컨대 양전하가 유지될 수 있도록 아르기닌 대신 리신 및 그 반대; 음전하가 유지될 수 있도록 아스파르트산 대신 글루탐산 및 그 반대; 유리 -OH가 유지될 수 있도록 트레오닌 대신 세린; 및 유리 -NH2가 유지될 수 있도록 아스파라긴 대신 글루타민의 치환을 포함한다. "보존적 아미노산 치환"은 해당 위치에서 아미노산 잔기의 극성 또는 전하에 거의 또는 전혀 영향이 없도록 천연 아미노산 잔기를 비천연 잔기로 치환하는 것을 포함할 수 있다. 또한, 폴리펩티드 내의 임의의 천연 잔기는 알라닌으로 치환될 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 또한 생물학적 시스템에서의 합성보다는 화학적 펩티드 합성에 의해 전형적으로 도입되는 비-자연 발생 아미노산 잔기를 포함한다. 이는 펩티도미메틱스(peptidomimetics) 및 다른 역방향 또는 도립 형태의 아미노산 모이어티를 포함한다. 본원에 기재된 핵산 및 폴리펩티드 분자는 화학적으로 합성될 수 있을 뿐만 아니라 재조합 수단에 의해 생성될 수 있음을 당업자는 이해할 것이다. 자연 발생 잔기는 일반적인 측쇄 특성에 기초하여 1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, lie; 2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; 3) 산성: Asp, Glu; 4) 염기성: His, Lys, Arg; 5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro; 및 6) 방향족: Tip, Tyr, Phe의 부류로 나뉠 수 있다. 특히 이러한 비-보존적 아미노산이 유사한 활성을 갖는 관련된 폴리펩티드에서 발생할 때 비-보존적 아미노산 치환이 또한 고려된다. 예컨대, 비-보존적 치환은 아미노산 부류 중 하나의 구성원을 또 다른 부류의 구성원으로 교환하는 것을 포함할 수 있다. 이러한 치환된 잔기는 관련된 CLTX 폴리펩티드 동원체와 상동성인 CLTX 또는 CLTX 유사 펩티드 기능적 변이체의 영역으로, 또는 분자의 비-상동성 영역으로 도입될 수 있다. 이러한 변화를 만들 때, 아미노산의 수치요법 지수가 고려될 수 있다. 각각의 아미노산에는 소수성 및 전하 특징에 기초하여 수치요법 지수가 할당되었으며, 이는 하기와 같다: 이소류신(+4.5); 발린 (+4.2); 류신(+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스틴(+2.5); 메티오닌(+1.9); 알라닌(+1.8); 글리신(- 0.4); 트레오닌(-0.7); 세린 (-0.8); 트립토판 (-0.9); 티로신(-1.3); 프롤린 (-1.6); 히스티딘(-3.2); 글루타메이트(-3.5); 글루타민(-3.5); 아스파르테이트(-3.5); 아스파라긴(-3.5); 리신(-3.9); 및 아르기닌(-4.5). 단백질에 상호작용하는 생물학적 기능을 부여하는데 있어 수치요법 아미노산 지수의 중요성은 당업계에서 이해되고 있다(Kyle et a!., J. Mol. Biol., 157: 105- 131 , 1982). 특정 아미노산은 유사한 수치요법 지수 또는 점수를 갖는 다른 아미노산으로 치환될 수 있고, 여전히 유사한 생물학적 활성을 보유할 수 있는 것으로 공지되어 있다. 수치요법 지수에 기초한 변화를 만들 때, 수치요법 지수가 +/- 2 이내인 아미노산의 치환이 사용될 수 있으며; 대안적 실시양태에서, 수치요법 지수는 +/- 1 이내이고; 또 다른 대안적 실시양태에서, 수치요법 지수는 +/- 0.5 이내이다. 유사한 아미노산의 치환이 친수성에 기초하여 효과적으로 이루어질 수 있다는 것도 당업계에서 이해된다. 인접한 아미노산의 친수성에 의해 지배되는 폴리펩티드의 가장 큰 국소 평균 친수성은 단백질의 생물학적 특성과 상관관계가 있다. 하기 친수성 값이 아미노산 잔기에 할당되었다: 아르기닌(+3.0); 리신(+3.0); 아스파르테이트(+3.0.+-.1); 글루타메이트(+3.0.+- .1); 세린 (+0.3); 아스파라긴(+0.2); 글루타민(+0.2); 글리신(0); 트레오닌(-0.4); 프롤린 (-0.5 1); 알라닌(-0.5); 히스티딘(-0.5); 시스테인(-1.0); 메티오닌(-1.3); 발린 (-1.5); 류신(-1.8); 이소류신(-1.8); 티로신(-2.3); 페닐알라닌(-2.5); 트립토판 (-3.4). 유사한 친수성 값에 기초하여 변화를 만들 때, 친수성 값이 +/- 2 이내인 아미노산의 치환이 사용될 수 있다; 대안적 실시양태에서, 친수성 값은 +/-1 이내이고; 또 다른 대안적 실시양태에서, 친수성 값은 +/- 0.5 이내이다.
(보존적이든 비-보존적이든) 원하는 아미노산 치환은 이러한 치환이 필요한 시점에 당업자에 의해 결정될 수 있다. 예컨대, 아미노산 치환은 본 개시내용의 CLTX-CAR의 활성(예컨대, 이펙터 기능 및/또는 면역 이펙터 기능)을 증가 또는 감소시키기 위해 CLTX의 중요한 잔기를 확인하거나 특정 결합 표적에 대한 CLTX의 친화성을 증가 또는 감소시키기 위해 사용될 수 있다.
한 실시양태에서, CLTX의 기능적 변이체는 위치 1, 3, 10, 13, 14, 17, 25 및 36(서열번호 1을 참조한 위치)에 상응하는 위치에서 하나 이상의 치환을 함유하는 것이다. 이러한 실시양태의 한 측면에서, 표시된 위치에서 이러한 CLTX 기능적 변이체에 대한 바람직한 치환은 하기를 포함한다: 위치 1에서 Met 대신 Arg; 위치 3에서 Met 대신 Lys 또는 Ser; 위치 10에서 His 대신 Pro 또는 Gln; 위치 13에서 Ala 대신 Ser 또는 Thr; 위치 14에서 Arg 대신 Lys; 위치 17에서 Asp 대신 Ala 또는 Tyr; 위치 25에서 Arg 대신 Lys; 및 위치 36에서 Arg에 대한 Ala. 이러한 실시양태의 특정 측면에서, CTX의 기능적 변이체는 표시된 위치로부터 6개 이하의 치환, 표시된 위치로부터 4개 이하의 치환 또는 표시된 위치로부터 2개 이하의 치환을 함유한다.
한 실시양태에서, CLTX의 기능적 변이체는 위치 23 및 24(서열번호 1을 참조한 위치)에서 아미노산의 결실과 함께 또는 없이 위치 9-11, 14-15, 17-18, 25 및 29에 상응하는 위치에서 하나 이상의 치환을 함유하는 변이체이다. 이러한 실시양태의 한 측면에서, 표시된 위치에서 이러한 CTX 기능적 변이체에 대한 바람직한 치환은 하기를 포함한다: 위치 9에서 Asp 대신 Arg; 위치 10에서 His 대신 Pro 또는 Gln; 위치 11에서 Gln 대신 Asn 또는 Asp; 위치 14에서 Arg 대신 Lys, Gln 또는 Asn; 위치 15에서 Lys 대신 Arg 또는 Gln; 위치 17에서 Asp 대신 Asn, Ala, Arg 또는 Tyr; 위치 18에서 Asp 대신 Glu 또는 Ala; 위치 25에서 Arg 대신 Tyr, Lys, He, Gly 또는 Asn; 위치 29에서 Tyr 대신 Phe; 및 위치 36에서 Arg 대신 Asn 또는 Ala. 이러한 실시양태의 또 다른 측면에서, 표시된 위치에서 이러한 CTX 기능적 변이체에 대한 바람직한 치환은 하기를 포함한다: 위치 9에서 Asp 대신 Arg; 위치 10에서 His 대신 Pro; 위치 11에서 Gln 대신 Asn; 위치 14에서 Arg 대신 Lys 또는 Gln; 위치 15에서 Lys 대신 Gln; 위치 17에서 Asp는 Arg; 위치 18에서 Asp 대신 Ala; 위치 25에서 Arg 대신 Asn; 위치 29에서 Tyr 대신 Phe; 및 위치 36에서 Arg 대신 Asn. 이러한 실시양태의 특정 측면에서, CTX의 기능적 변이체는 표시된 위치로부터 6개 이하의 치환, 표시된 위치로부터 4개 이하의 치환 또는 표시된 위치로부터 2개 이하의 치환을 함유한다.
한 실시양태에서, CLTX의 기능적 변이체는 위치 23 및 24(서열번호 1을 참조한 위치)에서 아미노산의 결실과 함께 또는 없이 위치 1, 3, 9-15, 17-18, 21, 25-26, 29-31 및 36에 상응하는 위치에서 치환을 함유하는 것이다. 이러한 실시양태의 한 측면에서, 표시된 위치에서 이러한 CTX 기능적 변이체에 대한 바람직한 치환은 하기를 포함한다: 위치 1에서 Met 대신 Arg; 위치 3에서 Met 대신 Lys, Ser 또는 Gly; 위치 9에서 Asp 대신 Arg; 위치 10에서 His에 대한 Pro 또는 Gln; 위치 11에서 Gln 대신 Asn 또는 Asp; 위치 12에서 Met 대신 Tyr; 위치 13에서 Ala 대신 Ser, Thr 또는 Glu; 위치 14에서 Arg 대신 Lys, Gln 또는 Asn; 위치 15에서 Lys 대신 Arg 또는 Gln; 위치 17에서 Asp 대신 Asn, Ala, Arg 또는 Tyr; 위치 18에서 Asp 대신 Glu 또는 Ala; 위치 21에서 Gly 대신 Arg 또는 Lys;, 위치 25에서 Arg 대신 Tyr, Lys, Ile, Gly 또는 Asn; 위치 27에서 Gly 대신 Lys; 위치 29에서 Tyr 대신 Phe; 위치 30에서 Gly 대신 Phe; 위치 31에서 Asp 대신 Gly 또는 Tyr; 및 위치 36에서 Arg 대신 Asn 또는 Ala. 이러한 실시양태의 특정 측면에서, CLTX의 기능적 변이체는 표시된 위치로부터 12개 이하의 치환, 표시된 위치로부터 10개 이하의 치환, 표시된 위치로부터 8개 이하의 치환, 표시된 위치로부터 6개 이하의 치환, 표시된 위치로부터 4개 이하의 치환 또는 표시된 위치로부터 2개 이하의 치환을 함유한다.
또 다른 실시양태에서, CLTX의 기능적 변이체는 서열번호 1의 아미노산 2-36의 서열을 갖는 폴리펩티드이다. 이러한 실시양태의 한 측면에서, CLTX 변이체는 아미노산 1, 3, 10, 13, 14, 17, 25 및 36에 대해 기재된 아미노산 치환, 상기에서 아미노산 9-11, 14-15, 17-18, 25 및 29에 대해 기재된 아미노산 치환, 또는 상기에서 아미노산 1, 3, 9-15, 17-18, 21, 25-26, 29-31 및 36에 대해 기재된 아미노산 치환을 가질 수 있다.
또 다른 실시양태에서, CLTX의 기능적 변이체는 서열번호 1의 아미노산 1-35의 서열을 갖는 폴리펩티드이다. 이러한 실시양태의 한 측면에서, CLTX 변이체는 아미노산 1, 3, 10, 13, 14, 17, 25 및 36에 대해 기재된 아미노산 치환, 상기에서 아미노산 9-11, 14-15, 17-18, 25 및 29에 대해 기재된 아미노산 치환, 또는 상기에서 아미노산 1, 3, 9-15, 17-18, 21, 25-26, 29-31 및 36에 대해 기재된 아미노산 치환을 가질 수 있다. 또 다른 실시양태에서, CLTX의 기능적 변이체는 서열번호 1의 아미노산 2-35의 서열을 갖는 폴리펩티드이다. 이러한 실시양태의 한 측면에서, CLTX 변이체는 아미노산 1, 3, 10, 13, 14, 17, 25 및 36에 대해 기재된 아미노산 치환, 상기에서 아미노산 9-11, 14-15, 17-18, 25 및 29에 대해 기재된 아미노산 치환, 또는 상기에서 아미노산 1, 3, 9-15, 17-18, 21, 25-26, 29-31 및 36 대해 기재된 아미노산 치환을 가질 수 있다.
"클로로톡신 유사 펩티드"는 CLTX와 유사한 1차 구조를 갖는 펩티드이며, 예컨대 WO2018107134(이의 내용은 명백히 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 것을 포함한다. 이러한 펩티드는 Bs8(Uniprot Acc. No. PI 5229), 인섹토톡신-I4(UniProt Acc No P60269), Lqh 8/6 (UniProt Acc No. P55966), 인섹토톡신-13(UniProt Acc No P60268), 인섹토톡신-I5A(UniProt Acc No PI 5222), MeuCITx(UniProt Acc No P86401), GaTx1(UniProt Acc No P85066), 인섹토톡신-I5(UniProt Acc No P60270), 인섹토톡신-I1(UniProt Acc No P15220); Bml2-b(UniProt Acc No Q9BJW4); BmK CT(UniProt Acc No Q9UAD0; 특히 아미노산 25-59; 신호 펩티드 아미노산 잔기 1-24의 제거로부터 생성됨); AaCtx(UniProt Acc No P86436), MeuCITx-1(UniProt Acc No P86402); Bsl4(UniProt Acc No P59887); AmmP2(UniProt Acc No P01498); BtlTx3(UniProt Acc No Ρ81761, 특히 아미노산 25-6; 신호 펩티드 아미노산 잔기 1-24의 제거로부터 생성됨) 및 아미노산 25-62; 신호 펩티드 아미노산 잔기 1-24 및 프로-펩티드 아미노산 잔기 62의 제거로부터 생성됨)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
용어 "항원 인식 도메인", "항원 인식 모이어티", "항원 결합 도메인", "항원 결합 모이어티" 등의 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 유사하게, 용어 "막관통 도메인", "막횡단 모이어티", "막횡단 영역" 등은 상호교환적으로 사용되며; 용어 "힌지 도메인", "힌지 모이어티" 및 "힌지 영역" 등은 상호교환적으로 사용되며; 용어 "세포내 신호전달 도메인", "신호전달 도메인", "신호전달 모이어티", "신호전달 영역" 등은 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
대상체에게 작용제 또는 조성물을 투여하는 맥락에서 어구 "치료학적 유효량" 또는 "유효량"은 대상체에게 투여될 때 질환, 장애 또는 병태의 임의의 증상, 측면 또는 특징에 대해 임의의 검출 가능한 긍정적 효과를 가질 수 있는 양을 지칭하고; 작용제 또는 조성물은 단독으로 또는 약학 조성물의 일부로서 단일 용량으로 또는 일련의 용량의 일부로서 투여될 수 있다. 치료학적 유효량 또는 유효량은 관련된 생리학적 효과를 측정함으로써 확인될 수 있고, 투여 레지먼 및 대상체의 상태의 진단적 분석 등과 관련하여 조정될 수 있다. 조절되지 않은 세포 분열과 관련된 암 또는 병리와 관련하여, 치료학적 유효량 또는 유효량은 (1) 종양의 크기 감소(즉, 종양 퇴행), (2) 비정상적인 세포 분열, 예컨대 암 세포 분열 억제(즉, 어느 정도 늦춤, 바람직하게는 중지), (3) 암세포의 전이 방지 또는 감소, (4) 예컨대, 암을 포함하는 조절되지 않거나 비정상적인 세포 분열과 관련되거나 부분적으로 이에 의해 의해 유발되는 병리와 관련된 하나 이상의 증상의 어느 정도의 경감 (또는 바람직하게는 제거), (5) 대상체의 생존 또는 기대 수명 증가, 및/또는 (6) 재발 위험 감소의 효과를 갖는 양을 지칭할 수 있다. "유효량"은 또한 본 발명의 치료학적 활성 조성물의 투여 시 바람직한 PD 및 PK 프로파일 및 바람직한 면역 세포 프로파일링을 초래하는 양이다. "유효량"은 또한 인용된 효과 또는 결과를 달성하는 양이며; 예컨대, 단독으로 또는 또 다른 작용제와 조합될 때 종양의 크기를 감소시키고/시키거나 종양 세포에서 스트레스 항원 발현을 증가시키고/시키거나 세포독성 효과를 갖는 양일 수 있는 화학요법제의 유효량이다.
본원에서 사용되는 바와 같이 질환 (또는 병태 또는 장애)를 "치료하는" 또는 "치료"라는 용어는 질환을 억제(이의 발달을 늦춤 또는 저지)시키고, 질환의 증상 또는 부작용으로부터 경감(완화 치료 포함)을 제공하고, 재발을 방지하거나 지연시키고, 질환의 퇴행을 유발하는 것을 지칭한다. 암과 관련하여 이러한 용어는 또한 암에 걸린 개체의 기대 수명이 증가할 수 있거나 질환의 하나 이상의 증상이 감소될 것임을 의미한다. 암과 관련하여, "치료하는"은 또한 대상체에서 항종양 반응을 향상시키거나 연장하는 것을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "조합", "조합 요법" 및/또는 "조합된 치료 레지먼" 또는 "공동 투여" 또는 "공동 투여하는" 등의 임의의 형태의 투여는 적어도 2개의 치료학적 활성 약물 또는 조성물의 투여(예컨대, γδ T 세포 및 화학요법제, 또는 이의 약학 조성물의 투여)를 개별 또는 조합된 제형으로 동시에 또는 실질적으로 동시에, 또는 몇 분, 몇 시간, 몇 일, 몇 주 또는 몇 개월 분리된 상이한 시간에 순차적으로 투여하는 것을 지칭하며, 그러나 어떻게 해서든, 예컨대 동일한 치료 레지먼의 일부로 원하는 치료 반응을 제공하기 위해 함께 작용한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "향상시키다", "향상시키는", "향상된" 등은 언급된 반응 또는 결과의 증가를 지칭한다. 예컨대, "세포독성을 향상시키는"은 세포독성을 증가시키는 것을 지칭하고, "활성화를 향상시키는"은 활성화를 증가시키는 것을 지칭한다. 마찬가지로, 향상된 지속성은 지속성을 증가시키는 것을 의미한다. 용어 "향상시키는" 등은 또한 대상체 또는 종양 세포가 본원에 개시된 치료에 반응하는 능력을 개선하는 것을 포괄할 수 있다. 향상된 반응은 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 또는 그 초과의 반응성(세포독성, 활성화 및/또는 지속성)의 증가를 포함할 수 있다. 향상된 반응성은 암 또는 종양에 대한 향상된 세포독성 및/또는 향상된 T 세포 활성화 및/또는 향상된 지속성을 포괄할 수 있다.
다가 CLTX-CAR γδ T 세포 (또는 이의 조성물), 예컨대, 2가 CLTX-CAR γδ T 세포 (또는 이의 조성물)에 의해 표시되거나 나타나는 향상된 활성화 및/또는 향상된 세포독성은 비교 가능한 sCLTX-CAR 또는 이의 조성물의 활성화 또는 세포독성에 기초하여 예측될 부가 효과와 비교하여 부가 효과보다 더 큰 부가 효과 또는 상승 효과를 포괄할 수 있다. 본원에 정의되는 바와 같이, "상승 효과"는 부가 효과보다 더 크다. 부가 효과는 시너지를 결정하기 위한 기준선으로 간주되며, 시너지가 존재하지 않을 때 조합에 기초하여 이론적으로 예상되거나 예측되는 효과이다(Roell et al. (2017), Front. Pharmacol. 8(158); https://doi.org/10.3389/fphar.2017.00158; 이의 내용은 명백히 본원에 참조로 포함됨). 예컨대, 다가 CLTX-CAR γδ T 세포 (또는 이의 조성물)가 세포외 항원 결합 도메인에 단지 2개의 CLTX 펩티드를 포함하는 경우, 세포독성 또는 활성화에 대한 상승 또는 부가보다 더 큰 효과는 비교 가능한 sCLTX-CAR 또는 이의 조성물의 세포독성 또는 활성화의 2배 초과이다. 특정 실시양태에서, dCLTX-CAR 또는 이의 조성물의 부가 보다 더 큰 또는 상승 효과는 2배 초과이다. 특정한 구체적 실시양태에서, dCLTX-CAR 또는 이의 조성물의 부가 보다 더 큰 또는 상승 효과는 비교 가능한 sCLTX-CAR 또는 이의 조성물보다 적어도 약 2.5-배 (또는 적어도 약 2.5배), 적어도 약 3-배(또는 적어도 약 3배), 적어도 약 3.5-배 (또는 적어도 약 3.5배), 적어도 약 4-배(또는 적어도 약 4배), 및 적어도 약 4.5-배 (또는 적어도 약 4.5배) 더 크다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "대상체" 및 "환자"는 인간, 포유동물(예컨대, 고양이, 개, 말 등), 살아 있는 세포 및 다른 살아 있는 유기체를 포함한다. 살아 있는 유기체는 포유동물일 수 있다. 전형적인 환자는 포유동물, 특히 영장류, 특히 인간이다. 수의학 적용을 위해, 매우 다양한 대상체, 예컨대 소(cattle), 양, 염소, 소(cow), 돼지 등과 같은 가축; 닭, 오리, 거위, 칠면조 등과 같은 가금류; 및 길들여진 동물, 특히 개 및 고양이와 같은 애완동물이 적합할 것이다. 진단 또는 연구 적용을 위해, 설치류(예컨대, 마우스, 래트, 햄스터), 토끼, 영장류 및 근친 교배된 돼지 등과 같은 돼지를 포함하는 매우 다양한 포유동물이 적합한 대상체가 될 것이다. 바람직하게는, 시스템은 샘플 및 대상체를 포함한다. 용어 "살아 있는 숙주"는 상기에서 언급된 살아 있고 죽지 않은 숙주 또는 유기체를 지칭한다. 용어 "살아 있는 숙주"는 전체 숙주 또는 유기체를 지칭하며 살아 있는 숙주로부터 절개된 단지 일부(예컨대, 간 또는 다른 기관)는 지칭하지 않는다. 바람직한 측면에서, 대상체 또는 환자는 인간 대상체 또는 환자이다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "γδ T 세포" 또는 "감마 델타 T 세포"는 표면에 특유한 T 세포 수용체(TCR)를 발현하는 T 세포의 서브세트를 지칭한다. 대부분의 T 세포는 α- 및 β-TCR 쇄로 불리는 2개의 당단백질 쇄로 구성된 TCR을 갖는다. 대조적으로, γδ T 세포에서 TCR은 하나의 γ-쇄 및 하나의 δ-쇄로 구성된다. 이 T 세포 그룹은 일반적으로 αβ T 세포보다 훨씬 덜 일반적이다. γδ T 세포는 항원 처리 및 펩티드 에피토프의 MHC 제시를 필요로 하지 않는다는 점에서 T 세포 유형 중에서 독특하다. 또한, γδ T 세포는 지질 항원을 인식하는 데 중요한 역할을 하고 MIC-A 및 MIC-B와 같은 스트레스 관련된 항원 및 NKG2D 수용체의 다른 리간드에 반응하는 것으로 여겨진다.
인간 γδ T 세포는 또한 항원 제시 능력을 나타낼 수 있다. 수지상 세포(DC)와 유사하게, 혈액 Vγ9Vδ2 T 세포는 미생물 및 종양으로부터의 신호에 반응하고 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 자극할 수 있다. γδ T-APC는 항원을 직접적으로 CD8+ T 세포에 교차 제시하는 것으로 여겨진다. 세포내 단백질 분해 및 엔도솜 산성화는 단핵구 유래된 DC와 비교하여 γδ T 세포에서 상당히 지연된다. 항원은 IRAP(인슐린 조절된 아미노 펩티다제) 양성 초기 및 후기 엔도솜을 통해 수송되며, MHC-I 로딩 구획으로 유입되기 전에 프로테아솜에 의한 분해를 위해 세포질로 내보내는 과정으로 이루어진다. 활성화된 γδ T 세포는 아마도 C/EBPα(CCAAT/인핸서 결합 단백질 α) 의존적 메커니즘에서 스캐빈저 수용체 CD36을 통해 종양 항원 및 아폽토시스 또는 살아 있는 암세포를 포식하고, 종양 항원 특이적 CD8+ T 세포 반응을 일으킬 수 있다. γδ T 세포는 또한 TNF-α 생성을 통해 DC 성숙을 유도할 수 있다. 전반적으로, γδ T 세포는 제시를 위해 광범위한 항원을 처리하고 다른 면역 세포를 자극할 수 있다. 따라서, 감염 또는 암에 대한 반응에서 γδ T 세포 영향은 인간 γδ T 세포 기반 면역요법의 임상 반응을 개선하기 위한 새로운 전략을 설계하는 데 활용될 수 있다.
예컨대, 화학요법제 또는 DDR 억제로부터 발생되는 증가된 종양 면역원성(예컨대, NKG2D 수용체에 대한 리간드의 증가된 상향조절)은 γδ T 세포 매개된 종양 면역감시 및 궁극적으로 γδ T 세포에 의한 종양 세포 사멸에 독특하게 기여한다.
세포 조성물 또는 세포 집단은, 예컨대 γδ T 세포 또는 조작된 γδ T 세포가 농축될 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "농축된"은 본원에서 개시되는 바와 같이 농축 전 동일한 하나 이상의 세포 유형의 총 백분율에 비해 샘플에 존재하는 하나 이상의 세포독성 면역 세포 유형(예컨대, γδ T 세포 및/또는 NK 세포)의 총 백분율 증가를 지칭한다. 예컨대, 하나 이상의 유형의 세포독성 면역 세포에 대해 "농축된" 샘플은 샘플에서 하나 이상의 세포독성 면역 세포 유형을 약 10% 내지 100% 포함할 수 있는 반면, 농축 전 샘플에서 하나 이상의 세포독성 면역 세포 유형의 총 백분율은 예컨대 0% 내지 10%였다. 바람직하게는, 농축된 샘플은 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 50%, 60% ,70%, 80%, 90% 또는 100%의 하나 이상의 유형의 세포독성 면역 세포를 포함한다. 샘플은 표준 기술, 예컨대 유동 세포측정 기술을 이용하여 하나 이상의 세포 유형에 대해 농축될 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "고도로 농축된"은 하나 이상의 세포독성 면역 세포 유형이 샘플에서 세포독성 면역 세포 유형의 적어도 약 70% 내지 약 100%를 포함할 수 있도록 샘플에서 하나 이상의 세포독성 면역 세포 유형의 총 백분율을 증가시키는 것을 지칭하는 반면, 농축 전의 동일한 유형의 세포독성 면역 세포의 총 백분율은 예컨대 0% 내지 10%였다. 바람직하게는, 고도로 농축된 샘플은 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 그 초과의 하나 이상의 유형의 세포독성 면역 세포를 포함한다. 샘플은 표준 기술, 예컨대 유동 세포측정 기술을 이용하여 하나 이상의 세포 유형에 대해 고도로 농축될 수 있다.
세포 조성물 또는 집단은, 예컨대 γδ T 세포 또는 조작된 γδ T 세포, 또는 이들의 임의의 서브세트의 확장된 집단을 포함할 수 있다. 샘플에서 하나 이상의 세포독성 면역 세포의 확장과 관련하여 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "확장된" 및 "확장"은 샘플에서 하나 이상의 세포독성 면역 세포의 수를, 예컨대 약 적어도 2배, 바람직하게는 약 5배, 바람직하게는 적어도 10배, 바람직하게는 약 적어도 50배 또는 그 초과로 증가시키는 것을 의미한다. 세포독성 면역 세포 집단의 확장은 당업계에 공지된 임의의 수의 방법에 의해 달성될 수 있다. 예컨대, T 세포는 피더 림프구 및 인터류킨-2(IL-2) 또는 인터류킨-15(IL-15) (IL-2가 선호됨)의 존재 하에 비-특이적 T 세포 수용체 자극을 이용하여 빠르게 확장될 수 있다. 비-특이적 T 세포 수용체 자극은 약 30 ng/ml의 OKT3, 마우스 모노클로날 항-CD3 항체(ORTHO-MCNEIL®(뉴저지주 라이탄)로부터 입수 가능)를 포함할 수 있다. 대안적으로, T 세포는 300 IU/ml IL-2 또는 IL-15(IL-2가 바람직)와 같은 T 세포 성장 인자의 존재 하에 인간 백혈구 항원 A2(HLA-A2) 결합 펩티드, 예컨대 0.3 μM MART-1:26-35 (27 L) 또는 gp100:209-217 (210M)와 같은 벡터로부터 임의적으로 발현될 수 있는 암의 하나 이상의 항원(에피토프(들)와 같은 이의 항원 부분 또는 세포 포함)으로 시험관내에서 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 자극에 의해 신속하게 확장될 수 있다. γδ T 세포를 확장시키는 방법은, 예컨대 WO2017035375 및 WO2011053750(이의 내용은 명백히 본원에 참조로 포함됨)에 기술되어 있다.
γδ T 세포는 또한 인간 유도된 만능 줄기 세포(hiPSC)로부터 유래될 수 있다. 만능 줄기 세포는, 예컨대 암을 갖는 환자로부터 단리될 수 있다. 다른 측면에서, 만능 줄기 세포는 암을 갖는 환자 이외의 공급원으로부터 단리될 수 있다. γδ T 세포를 포함하는 임의적으로 농축되고/되거나 임의적으로 확장된 조성물은 또한 자연 킬러(NK) 세포를 포함하고, 임의적으로 단핵구, 대식세포 및 수지상 세포를 포함하지만 이에 제한되지 않는 다른 면역적격 세포를 추가로 포함할 수 있다. 유도된 만능 줄기 세포로부터 γδ T 세포를 생성하는 방법은, 예컨대 문헌(Watanabe et al. 2017, Stem Cells Transl Med 7(1): 34-44 and Zeng et al. (2019), PLoS One 14(5): e0216815; 각각의 내용은 명백히 본원에 참조로 포함됨)에 기술되어 있다.
본원에서 사용되는 바와 같은 세포의 "단리된" 및 "단리된 집단"이라는 용어는 대상체에서 발견되는 조직 또는 상태로부터 제거된 세포 또는 복수의 세포를 지칭한다. 이 용어는 세포 표면 마커, 염료 또는 라벨과 같은 리포터 마커(이에 제한되지 않음)와 같은 파라미터에 따라 분리된 세포를 추가로 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "발현된" 또는 "발현"은 유전자의 2개의 핵산 가닥 중 하나의 영역에 적어도 부분적으로 상보적인 RNA 핵산 분자를 제공하기 위한 유전자로부터의 전사를 지칭한다. 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "발현된" 또는 "발현"은 또한 단백질, 폴리펩티드, 또는 이의 일부 또는 단편을 제공하기 위한 상기 RNA 핵산 분자로부터의 번역을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "벡터"는 단일 가닥, 이중 가닥, 원형 또는 수퍼코일 DNA 또는 RNA로 구성된 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 전형적인 벡터는 기능적 유전자 발현을 허용하기 위해 적절한 거리에서 작동 가능하게 연결된 하기 요소로 구성될 수 있다: 복제 기점, 프로모터, 인핸서, 5' mRNA 리더 서열, 리보솜 결합 부위, 핵산 카세트, 종결 및 폴리아데닐화 부위, 및 선별 가능한 마커 서열. 이러한 요소 중 하나 이상은 특정 적용에서 생략될 수 있다. 벡터는 또한 발현될 핵산 서열의 삽입을 위한 제한 부위를 포함할 수 있는 핵산 카세트를 함유할 수 있다. 기능적 벡터에서 핵산 카세트는 번역 개시 및 종결 부위를 포함하여 발현될 핵산 서열을 함유한다. 벡터는 특정 코딩 서열(예컨대, 본 개시내용의 다가 CLTX-CAR에 대한 코딩 서열)이 적절한 제어 서열과 함께 벡터에 위치하도록 구축되며, 제어 서열에 대한 코딩 서열의 위치 결정 및 배향은 코딩 서열이 작동 가능하게 연결되고/되거나 제어 서열의 "제어 하에" 전사되도록 한다. 특정 관심 단백질을 코딩하는 서열의 변형은 이러한 목적을 달성하는 데 바람직할 수 있다. 예컨대, 일부 경우에서 적절한 배향으로 제어 서열에 작동 가능하게 연결되거나 리딩 프레임을 유지하기 위해 서열을 변형해야 할 수도 있다. 제어 서열 및/또는 다른 조절 서열은 벡터에 삽입되기 전에 코딩 서열에 리게이션될 수 있다. 대안적으로, 코딩 서열은 이미 제어 서열 및 제어 서열과 함께 및 조절 조절하에 있는 리딩 프레임 내에 있는 적절한 제한 부위를 함유하는 발현 벡터로 직접적으로 클로닝될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "프로모터"는 RNA 폴리머라제로부터 전사 개시 부위를 결정하는 DNA 서열을 지칭한다. "프로모터 근위 요소"는 전사 시작 부위의 약 200개 염기쌍 내의 조절 서열일 수 있다.
용어 "재조합 세포"는 본질적으로 서로 공유적으로 연결되지 않은 핵산 세그먼트의 새로운 조합을 갖는 세포를 지칭한다. 핵산 세그먼트의 새로운 조합은 당업자에게 이용 가능한 다양한 핵산 조작 기술을 이용하여 유기체로 도입될 수 있다. 재조합 세포는 단일 진핵 세포, 단일 원핵 세포, 또는 포유동물 세포일 수 있다. 재조합 세포는 게놈외 벡터를 포함할 수 있다. 게놈외 핵산 벡터는 세포의 게놈에 삽입되지 않는다. 재조합 세포는 게놈내인 벡터 또는 이의 일부를 추가로 포함할 수 있다. 용어 "게놈내"는 재조합 세포의 게놈 내에 포함된 핵산 구축물을 정의한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "재조합 핵산" 및 "재조합 DNA"는 진핵 또는 원핵 세포에서 자연적으로 발견되지 않는 적어도 2개의 핵산 서열의 조합을 지칭한다. 핵산 서열은 핵산 벡터, 유전자 발현 조절 요소, 복제 기점, 발현될 때 항생제 저항을 부여하는 적합한 유전자 서열, 단백질 코딩 서열 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 용어 "재조합 폴리펩티드"는 위치, 순도 또는 구조에서 자연 발생 폴리펩티드와 구별되도록 재조합 DNA 기술에 의해 생성되는 폴리펩티드를 포함하는 것을 의미한다. 일반적으로, 이러한 재조합 폴리펩티드는 자연에서 정상적으로 관찰되는 것과 상이한 양으로 세포에 존재할 것이다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "작동 가능하게" 또는 "작동 가능하게 연결된"은 원하는 기능을 수행하기 위한 코딩 및 제어 서열의 구성을 지칭한다. 따라서, 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된 제어 서열은 코딩 서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 코딩 서열은 DNA 폴리머라제가 프로모터 서열에 결합하고 코딩 서열을 코딩된 단백질로 번역될 수 있는 mRNA로 전사할 때 세포의 전사 조절 영역에 작동 가능하게 연결되거나 이의 제어 하에 있다. 제어 서열은 코딩 서열의 발현을 지시하는 기능을 하는 한 코딩 서열과 인접할 필요가 없다. 따라서, 예컨대, 개재하는 번역되지는 않지만 전사되는 서열이 프로모터 서열과 코딩 서열 사이에 존재할 수 있고, 프로모터 서열은 여전히 코딩 서열에 "작동 가능하게 연결된" 것으로 간주될 수 있다.
용어 "이종" 및 "외인성"은, 코딩 서열 및 제어 서열과 같은 핵산 서열과 관련되므로, 재조합 구축물의 영역 또는 특정 염색체 유전자좌와 정상적으로 관련되지 않고/않거나 특정 세포와 정상적으로 관련되지 않는 서열을 나타낸다. 따라서, 핵산 구축물의 "이종" 영역은 자연에서 다른 분자와 관련하여 발견되지 않는 또 다른 핵산 분자 내에 있거나 이에 부착된 핵산의 확인 가능한 세그먼트이다. 예컨대, 구축물의 이종 영역은 자연에서 코딩 서열과 관련하여 발견되지 않는 서열이 옆에 있는 코딩 서열을 포함할 수 있다. 이종 코딩 서열의 또 다른 예는 코딩 서열 자체가 자연에서 발견되지 않는 구축물(예컨대, 천연 유전자와 상이한 코돈을 갖는 합성 서열)이다. 유사하게, 숙주 세포에 일반적으로 존재하지 않는 구축물로 형질전환된 숙주 세포는 본 발명의 목적을 위해 이종으로 간주될 것이다.
바람직하게는, 프로모터는 서열의 추가 또는 결실에 의해 변형되거나, 천연 및 합성 서열 뿐만 아니라 합성 및 천연 서열의 조합일 수 있는 서열을 포함하는 대안적 서열로 대체될 것이다. 많은 진핵 프로모터는 2가지 유형의 인식 서열: TATA 상자와 상류 프로모터 요소를 함유한다. 전사 개시 부위의 상류에 위치된 전자는 RNA 폴리머라제가 올바른 부위에서 전사를 개시하도록 지시하는 데 관여하고, 후자는 전사 속도를 결정하는 것으로 보이며 TATA 상자의 상류에 있다. 인핸서 요소는 또한 연결된 프로모터로부터의 전사를 자극할 수 있지만, 많은 것이 특정 세포 유형에서만 독점적으로 기능한다. 바이러스로부터 유래된 많은 인핸서/프로모터 요소, 예컨대 SV40, 로우즈 육종 바이러스(RSV) 및 CMV 프로모터는 광범위한 세포 유형에서 활성적이며 '구성적' 또는 '유비쿼터스'"로 명명된다. 클로닝 부위에 삽입된 핵산 서열은 관심 있는 폴리펩티드를 코딩하는 임의의 오픈 리딩 프레임을 가질 수 있으며, 단 코딩 서열이 관심 있는 폴리펩티드를 코딩하는 경우, 적절한 mRNA 분자의 생성을 차단하고/하거나 비정상적으로 스플라이싱되거나 비정상적인 mRNA 분자를 생성할 수 있는 숨겨진 스플라이싱 부위가 없어야 한다.
주로 사용되는 종결 영역은 종결 영역이 상대적으로 상호교환 가능한 것으로 나타나기 때문에 편리한 것이다. 종결 영역은 의도된 관심 핵산 서열에 고유하거나 또 다른 공급원으로부터 유래될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "표적 요법"은 면역계의 임의의 측면을 표적화하는 임의의 치료 분자를 지칭한다.
용어 "형질전환", "형질도입" 및 "형질도입"은 모두 폴리뉴클레오티드를 수용자-세포 또는 세포들에 도입하는 것을 나타낸다.
본 발명은 다가 CLTX 키메라 항원 수용체(CLTX-CAR)를 발현하고 생존 인자를 발현하는 조작된 γδ T 세포를 제공하며, 생존 인자는 화학요법제에 대해 저항성을 부여하는 DNA, RNA, 또는 폴리펩티드이다. 본 발명은 추가로 다가 CLTX 키메라 항원 수용체(CLTX-CAR) 및 화학요법제에 대해 저항성을 부여하는 폴리펩티드를 발현하는 조작된 γδ T 세포를 제공하며, γδ T 세포는 CLTX-CAR 및 화학요법제에 대해 저항성을 부여하는 폴리펩티드의 발현을 지시하는 단일 벡터를 포함한다. 상기 기재된 바와 같이, 다가 CLTX-CAR의 항원 결합 도메인은 적어도 2개의 CLTX 펩티드를 포함하고, 적어도 2개의 CLTX 펩티드는 링커 펩티드에 의해 부착되고; 임의적으로, 링커 펩티드는 1-30개의 아미노산 길이이거나 링커 펩티드는 15개 미만의 아미노산 길이이다. 특정 측면에서, 다가 CLTX-CAR은 2개의 CLTX 펩티드 (또는 다시 말해서 "단지 2개의 CLTX 펩티드"), 3개의 CLTX 펩티드 (또는 다시 말해서 "단지 3개의 CLTX 펩티드"), 또는 4개의 CLTX 펩티드 (또는 다시 말해서 "단지 4개의 CLTX 펩티드")를 포함한다. 이와 관련하여 "단지 2개의 CLTX 펩티드" 등은 항원 인식 도메인이 2개 초과의 CLTX 펩티드를 포함하지는 않지만 항원 인식 도메인 내의 CLTX 펩티드의 수가 2개인 한 추가의 아미노산, 펩티드, 링커 펩티드 등을 포함할 수 있음을 의미한다. 이러한 CLTX-CAR(들)은 추가로 세포외 도메인에 추가의 모이어티 또는 도메인을 포함할 수 있다. 본원에 기재된 다가 CLTX-CAR은 막관통 도메인, 힌지 도메인, 및 임의적으로 적어도 하나의 세포내 신호전달 도메인 뿐만 아니라 공자극 도메인을 추가로 포함할 수 있다. 특정 측면에서, 다가 CLTX-CAR은 막관통 도메인, 힌지 도메인, 적어도 하나의 세포내 신호전달 도메인 뿐만 아니라 적어도 하나의 공자극 도메인을 포함한다. 추가 측면에서, 다가 또는 2가 CLTX-CAR은 막관통 도메인, 힌지 도메인을 포함하고, 세포내 신호전달 도메인은 포함하지 않는다. 본 발명에 따른 다가 CLTX-CAR은 i) 적어도 2개의 CLTX 펩티드 (또는 CLTX 펩티드, CLTX 펩티드의 기능적 변이체 또는 CLTX 유사 펩티드 중 적어도 2개)를 포함하는 항원 인식 도메인/모이어티를 포함하는 세포외 도메인(본원에서 "엑토도메인"으로도 지칭됨), ii) 힌지 도메인; iii) 막관통 도메인 및 iii) 세포내 신호전달 도메인(세포내 신호전달 도메인은 "엔도도메인" 또는 수용체의 기능적 말단의 일부임)의 구조를 가질 수 있다. 특정 다가 CLTX-CAR은 i) 적어도 2개의 CLTX 펩티드 (또는 CLTX 펩티드, CLTX 펩티드의 기능적 변이체 또는 CLTX 유사 펩티드 중 적어도 2개)를 포함하는 항원 인식 도메인/모이어티를 포함하는 세포외 도메인(본원에서 "엑토도메인"으로도 지칭됨), ii) 힌지 도메인; iii) 막관통 도메인 및 iv) 신호전달 도메인을 포함하지 않는 엔도도메인을 포함할 수 있다. 또한, 본원의 특정 2가 CLTX-CAR은 i) 단지 2개의 CLTX 펩티드 (또는 CLTX 펩티드, CLTX 펩티드의 기능적 변이체 또는 CLTX 유사 펩티드 중 2개)를 포함하는 항원 인식 도메인/모이어티를 포함하는 세포외 도메인(본원에서 "엑토도메인"이라고도 함), ii) 힌지 도메인; iii) 막관통 도메인 및 iv) 신호전달 도메인을 포함하지 않는 엔도도메인을 포함할 수 있다. 추가 측면에서, 본원의 특정 2가 CLTX-CAR은 i) 단지 2개의 CLTX 펩티드 (또는 CLTX 펩티드, CLTX 펩티드의 기능적 변이체 또는 CLTX 유사 펩티드 중 2개)를 포함하는 항원 인식 도메인/모이어티를 포함하는 세포외 도메인(본원에서 "엑토도메인"으로도 지칭됨), ii) 힌지 도메인; iii) 막관통 도메인 및 iv) 공자극 도메인을 포함하지만 신호전달 도메인은 포함하지 않는 엔도도메인을 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, CAR의 다양한 도메인을 분리하기 위해 1 내지 30개 아미노산의 펩티드 링커가 CLTX-CAR에 존재할 수 있다. 또 다른 측면에서, 펩티드 링커는 15개 미만의 아미노산 길이이다. 예컨대, 펩티드 링커는 항원 인식 도메인/모이어티와 세포외 도메인에 존재할 수 있는 다른 도메인 사이, 항원 인식 도메인/세포외 도메인과 힌지 도메인 사이, 힌지 도메인과 막관통 도메인 사이, 또는 막관통 도메인과 세포내 신호전달 도메인 사이에 존재할 수 있다. 펩티드 링커는 모든 도메인 사이에 또는 단지 도메인/모이어티의 일부 사이에만 존재할 수 있다. 또한, 세포내 신호전달 도메인이 하나 초과의 요소를 포함하는 경우, 링커 펩티드는 엔도도메인의 일부 또는 모든 개별 요소 사이에 존재할 수 있다. 다가 CLTX-CAR의 각각의 링커 펩티드는 동일하거나 상이할 수 있다. 2개의 CLTX 펩티드 (또는 CLTX 펩티드, CLTX 펩티드의 기능적 변이체 또는 CLTX 유사 펩티드 중 적어도 2개)를 연결 (또는 사이에 위치)할 수 있는 예시적인 링커 펩티드는 30개 이하의 아미노산 길이, 20개 이하의 아미노산 길이 또는 15개 이하의 아미노산 길이일 수 있다. 이러한 링커 펩티드의 비제한적 예는 FLAG, 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌(HA), c-myc, polyHis; Strep 태그, Strep II 태그, FLAG 태그, 글루타티온 S-트랜스퍼라제(GST) 태그, 녹색 형광 단백질(GFP) 태그, 헤마글루티닌 A(HA) 태그, 히스티딘(His) 태그, 루시퍼라제 태그, 말토스 결합 단백질(MBP) 태그, c-Myc 태그, 단백질 A 태그, 단백질 G 태그, 인간 혈청 알부민(HSA), 또는 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌이다. 특정 측면에서, 펩티드 링커는 c-myc(예컨대, EQKLISEEDL(서열 번호: 2)의 아미노산 서열을 가짐) 또는 FLAG(예컨대, DYKDDDDK(서열 번호: 3)의 아미노산 서열을 가짐)이다. 링커 펩티드의 또 다른 예는 (GSSS)n이고, 여기서 n은 1 내지 10의 정수이다. 추가의 또 다른 실시양태에서, 링커 펩티드는 HA이며, 예컨대 GLFGAIAGFIENG(서열번호 14) 또는 EGMIDGWYG(서열번호 15)의 아미노산 서열을 갖는다.
본 발명의 CLTX-CAR의 세포내 신호전달 도메인은 CLTX-CAR이 위치되는 숙주 세포의 정상적인 이펙터 기능 중 적어도 하나의 활성화를 담당한다. 용어 "이펙터 기능"은 분화된 세포의 특화된 기능을 지칭한다. 숙주 세포가 면역 이펙터 세포인 경우, 본 발명의 CLTX-CAR의 세포내 신호전달 도메인은 정상적인 면역 이펙터 기능 중 적어도 하나의 활성화를 담당한다. T 세포의 면역 이펙터 기능은, 예컨대 시토카인의 분비를 포함하지만 이에 제한되지 않는 세포용해 활성 또는 헬퍼 활성일 수 있다. 따라서, 용어 "세포내 신호전달 도메인"은 이펙터 기능 신호를 변환하고 세포가 특화된 기능(예컨대, 이펙터 기능 및/또는 면역 이펙터 기능)을 수행하도록 지시하는 CLTX-CAR의 부분을 지칭한다. 일반적으로 전체 세포내 신호전달 도메인이 사용될 것이지만, 많은 경우에 전체 세포내 신호전달 도메인을 사용할 필요가 없을 것이다. 세포내 신호전달 도메인의 말단절단된 부분이 사용될 수 있는 정도까지, 이러한 말단절단된 부분이 이펙터 기능/면역 이펙터 기능 신호를 여전히 변환하는 한, 이러한 말단절단된 부분은 온전한 신호전달 도메인 대신에 사용될 수 있다. 따라서, 용어 "세포내 신호전달 도메인"은 이펙터 기능/면역 이펙터 기능 신호를 변환하기에 충분한 세포내 신호전달 도메인의 임의의 말단절단된 부분을 포함하는 것을 의미한다. 세포내 신호전달 도메인의 예는 T 세포 수용체의 제타 쇄(CD3 제타; CD247) 또는 이의 임의의 상동체(예컨대, 에타, 델타, 감마 또는 엡실론), MB1 쇄, B29, FcRIII, FcRI, 및 신호전달 및/또는 공동 자극 분자, 예컨대 CD3 제타 쇄 및 CD28, CD27, 4- IBB, DAP-10, OX40, 및 이들의 조합의 조합 뿐만 아니라 다른 유사한 분자 및 단편 뿐만 아니라 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프(들)(ITAM)를 변형시키는 것과 같은 전술된 것에 대한 돌연변이를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 특정 실시양태에서, 신호전달 도메인은 서열: 로 표시될 수 있는 CD3 제타 서열을 포함한다. FcγRIII 및 FcRI와 같은 활성화 단백질 패밀리의 다른 구성원의 세포내 신호전달 부분이 사용될 수 있다. 당업자는 상응하는 신호전달 도메인을 결정할 수 있을 것이다. 또한, 임의의 신호전달 도메인 서열은 본원에서 논의되는 바와 같이 선택될 수 있는 1 내지 5개의 아미노산 변형을 함유할 수 있다.
특정 측면에서, 엔도도메인은 세포내 신호전달 도메인을 포함하지 않는다.
특정 측면에서, CLTX-CAR의 세포내 신호전달 도메인 또는 엔도도메인은 공동 자극 신호전달 도메인을 코딩하는 서열을 포함한다. 예컨대, 세포내 신호전달 도메인 또는 엔도도메인은 1차 신호전달 도메인을 코딩하는 서열 및 공동 자극 신호전달 도메인을 코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 공자극 도메인은 41BB, OX40 및/또는 CD28로부터의 기능적 신호전달 도메인이다. OX40로부터의 공자극 도메인은 서열: 을 가질 수 있다. CD28로부터의 공자극 도메인은 서열: 을 가질 수 있다. 4IBB로부터의 공자극 도메인은 서열: 을 가질 수 있다. 바람직하게는, 코딩된 공동 자극 신호전달 도메인은 CD27, CD28, 4-1BB(CD137), OX40, C.D30, CD40, PD-1, ICOS, 림프구 기능 관련된 항원-1(LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, CD83과 특이적으로 결합하는 기간드, CDS, ICAM-1, GITR, BAFFR, HVEM(LIGHTR), SLAMF7, NKp80(KLRF1), CD160, CD19, CD4, CD8ct, CD8fi, IL2Rp, IL2Ry, IL7Ra, ITGA4, VLA1 , CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CDIId, ITGAE, CD103, ITGAL, CDl8, LFA-1, ITGAM, CD1 lb, ITGAX, CD1 lc, 1TGB I, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, TNFR2, TRANCE/RA KL, DNAM1(CD226), SLAMF4(CD 244. 2B4), CD84, CD96(Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9(CD229), CD 160(BY55), PSGL1, CD 100(SEMA4D), CD69, SLAMF6(NTB-A, Lyl08), SLAM(SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME(SLAMF8), SELPLG(CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, NKp44, NKp30, NKp46, 또는 NKG2D 중 하나 이상으로부터 선택되는 단백질의 기능적 신호전달 도메인을 포함한다. 당업자는 이들 폴리펩티드로부터 상응하는 막횡단 영역을 결정할 수 있을 것이다. 또한, 임의의 공자극 도메인 서열은 1 내지 5개의 아미노산 변형을 함유할 수 있으며, 이는 본원에서 논의되는 바와 같이 선택될 수 있다. 특정 실시양태에서, 신호전달 도메인은 CD3 제타-CD28-OX40, CD3 제타-4IBB, 또는 CD28-41BB 및 CD3 제타-CD28-41BB를 포함한다.
항원 인식 도메인을 포함하는 세포외 도메인은 세포외 스페이서(본원에서 세포외 힌지 도메인으로도 지칭됨) 및/또는 막관통 도메인을 통해 세포내 신호전달 도메인에 연결될 수 있다. 세포외 항원 결합 도메인 및 막관통 도메인은 세포외 힌지 도메인 또는 세포외 스페이서 서열에 의해 연결될 수 있다. 바람직하게는, 세포외 스페이서 또는 세포외 힌지 도메인 서열은 인간 면역글로불린, 즉 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM의 힌지 영역 및/또는 면역글로불린 중쇄 불변 영역(CH1, 링커 영역, CH2 및/또는 CH3 도메인을 포함할 수 있음)의 일부 또는 이들의 임의의 조합 중 하나 이상을 포함한다. 특정 실시양태에서, 세포외 스페이서 또는 힌지 도메인은 인간 IgD의 힌지 영역의 전부 또는 일부를 포함한다. 특정 실시양태에서, 세포외 스페이서 또는 힌지는 인간 IgG1의 힌지 영역의 전부 또는 일부를 포함한다. 특정 실시양태에서, 세포외 스페이서 또는 힌지는 인간 IgD의 힌지 영역의 전부 또는 일부 및 인간 IgG1의 힌지 영역의 전부 또는 일부를 포함한다. 특정 실시양태에서, 세포외 스페이서 또는 힌지는 인간 IgD의 힌지 영역의 전부 또는 일부 및 인간 IgG1의 중쇄 불변 영역의 CH2 및 CH3 도메인의 전부 또는 일부를 포함한다. 특정 실시양태에서, 세포외 스페이서 또는 힌지는 인간 IgD의 힌지 영역의 전부 또는 일부, 인간 IgG1의 힌지 영역의 전부 또는 일부 및 인간 IgG1의 중쇄 불변 영역의 CH2 및 CH3 도메인의 전부 또는 일부를 포함한다. 특정 실시양태에서, 세포외 스페이서 또는 힌지는 인간 IgG1의 힌지 영역의 전부 또는 일부 및 인간 IgG1의 중쇄 불변 영역의 CH2 및 CH3 도메인의 전부 또는 일부를 포함한다. 특정 실시양태에서, 세포외 스페이서 또는 힌지는 인간 IgD의 힌지 영역의 전부, 인간 IgG1의 힌지 영역의 전부 또는 일부를 포함하고 중쇄 불변 영역은 인간 IgG1의 CH2 및 CH3 도메인의 전부 또는 일부를 포함한다. 바람직하게는, 힌지 영역 아미노산 서열은 IgD 또는 IgG1과 같은 면역글로불린으로부터의 힌지 영역 아미노산 서열을 포함하고, 아미노산 서열은 본원에서 논의되는 바와 같이 선택될 수 있는 1 내지 5개의 아미노산 변형을 포함한다. 바람직하게는, 중쇄 불변 영역의 CH2 및 CH3 도메인은 면역글로불린, 예컨대 IgG1로부터의 CH2 및 CH3 도메인 면역글로불린 중쇄 불변 영역 아미노산 서열을 포함하고, 아미노산 서열은 본원에서 논의되는 바와 같이 선택될 수 있는 1 내지 5개의 아미노산 변형을 포함한다. 다른 측면에서, 세포외 스페이서 또는 세포외 힌지 도메인은 CD8a, CD28, CD137, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질의 힌지 영역을 포함한다. 특정 측면에서, 세포외 스페이서 또는 세포외 힌지 도메인은 CD8a의 힌지 도메인을 포함한다. 전술된 것 중 임의의 것에서, 세포외 스페이서는 링커, 예컨대 Ser-Gly-Gly-Gly(서열번호 8) 또는 Ser-Gly-Gly-Gly-Gly(서열번호 9)의 서열을 갖는 링커를 추가로 포함할 수 있으며, 이는 세포외 스페이서를 세포외 항원 결합 도메인에 연결하는 1 내지 10개의 카피를 갖고 존재할 수 있다.
특정 실시양태에서, 항원 인식 도메인은 유연성 링커를 통해 막관통 도메인에 연결된다. 유연성 링커는 본원에 기재된 세포외 스페이서에 더하여 또는 세포외 스페이서 대신에 존재할 수 있다. 특정 실시양태에서, 세포외 도메인/항원 인식 도메인은 유연성 링커를 통해 세포외 스페이서에 연결된다. 바람직하게는, 유연성 링커는, 예컨대 글리신 및 세린을 포함한다. 바람직하게는, 유연성 링커는 서열번호 10(Ser-Gly-Gly-Gly)n 또는 서열번호 8(Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)의 서열을 갖는 폴리펩티드로 구성되며, 여기서 n은 1 내지 10의 정수이다. 바람직하게는, 각각의 유연성 링커는 약 1-25개 아미노산, 바람직하게는 약 1-15개 아미노산, 바람직하게는 약 1-10개 아미노산, 바람직하게는 약 4-24개 아미노산, 바람직하게는 약 5-20개 아미노산, 바람직하게는 약 5-15개 아미노산, 바람직하게는 약 5-12개 아미노산을 포함하는 폴리펩티드이다. 바람직하게는, 링커는 (Ser-Gly-Gly-Gly)n이며, 여기서 n은 3이다.
본 발명의 CLTX-CAR은 당업계에 공지된 임의의 분자의 막관통 도메인에 상응하거나, 이로부터 유도되거나, 이로부터 수득되는 막관통 도메인을 포함할 수 있다. 예컨대, 막관통 도메인은 CD8 분자 또는 CD28 분자의 도메인에 상응할 수 있다. CD8은 T 세포 수용체(TCR)의 보조 수용체 역할을 하는 막횡단 당단백질이며, 주로 세포독성 T 세포 표면에서 발현된다. CD8의 가장 일반적인 형태는 CD8과 CD8β 쇄로 구성된 이량체로 존재한다. CD28은 T 세포에서 발현되며, T 세포 활성화에 필요한 공동 자극 신호를 제공한다. CD8 폴리펩티드로부터의 막관통 도메인은 서열 IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC(서열번호 11), 특히 서열번호 13의 아미노산 1-21, 1-23 또는 1-24를 가질 수 있다. CD28은 CD80(B7.1) 및 CD86(B7.2)에 대한 수용체이다. CD28 폴리펩티드로부터의 막관통 도메인은 서열 FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV(서열번호 12)를 가질 수 있다. 바람직하게는 CD8 및 CD28은 인간이다. 본 발명의 CLTX-CAR의 바람직한 막관통 도메인은 T 세포 수용체의 알파, 베타 또는 제타 쇄, CD28, CD3 엡실론, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154, KIRDS2, OX40, CD2, CD27, LFA-1(CDIIa, CD18), ICOS(CD278), 4-IBB(CD137), GITR, CD40, BAFFR, HVEM(LIGHTR), SLAMF7, NKp80(KLRFl), CD160, CDI9, IL2Rβ, 1L2Rγ, IL7Rα, ITGA1, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CDIId, ITGAE, CD 103, ITGAL, CD1 la, LFA-1, ITGAM, CDllb, ITGAX, CD1 lc, ITGBl , CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, TNFR2, DNAM1(CD226), SLAMF4(CD244, 2B4), CD84, CD96(Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9(CD229), CD 160(BY55), PSGLI, CD100(SEMA4D), SLAMF6(NTB-A, Lyl08), SLAM(SLAMF1, CD 150, IPO-3), BLAME(SLAMF8), SELPLG(CD 162), LTBR, PAG/Cbp, NKp44, NKp30, NKp46, NKG2D, 및/또는 NKG2C로부터 선택되는 폴리펩티드로부터의 막관통 도메인의 전부 또는 일부를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 당업자는 이러한 폴리펩티드로부터 상응하는 막횡단 영역을 결정할 수 있을 것이다.
다가 CLTX-CAR은 임의의 조합으로 상기 언급된 막관통 도메인 중 임의의 하나 및 상기 언급된 세포내 T 세포 신호전달 도메인 중 임의의 하나 이상(예컨대, 1, 2, 3 또는 4개), 및 임의의 상기 언급된 힌지 도메인 및 임의의 상기 언급된 공자극 도메인을 포함할 수 있다. 예컨대, CLTX-CAR은 CD28 및 CD3제타의 CD28 막관통 도메인 및 세포내 T 세포 신호전달 도메인을 포함할 수 있다. 또한, 임의의 막관통 도메인 서열은 본원에서 논의되는 바와 같이 선택될 수 있는 1 내지 5개의 아미노산 변형을 함유할 수 있다.
본 발명의 예시적인 CLTX-CAR은 적어도 2개의 CLTX 펩티드 (또는 CLTX 펩티드, CLTX 펩티드의 기능적 변이체 또는 CLTX 유사 펩티드 중 적어도 2개)를 포함하는 항원 인식 도메인을 포함할 수 있다. 또 다른 예시적인 CLTX CAR은 2개의 CLTX 펩티드를 포함하는 항원 인식을 포함한다. CLTX-CAR은 하기 중 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다: 항원 인식 도메인을 힌지 도메인에 연결하는 임의의 링커; CD8a, CD28 또는 CD137의 힌지 영역의 전부 또는 일부를 포함하는 힌지 도메인; 바람직하게는 CD8a의 힌지 영역; CD28로부터의 막횡단 영역; 및/또는 적어도 하나의 신호전달 도메인을 포함하는 임의의 세포내 신호전달 영역 (또는 엔도도메인); 바람직하게는, CD3제타, 및 본원에 기재된 바와 같은 임의의 공동 자극 신호전달 도메인; 바람직하게는 CD28 및/또는 4-1BB 공자극 도메인. 또 다른 추가 측면에서, 다가 CLTX-CAR은 세포외 신호 펩티드를 포함할 수 있다. 예컨대, 신호 펩티드는 CD8a, CD28, GM-CSF, CD4, CD137, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질의 신호 펩티드일 수 있다. 특정 측면에서, CLTX-CAR은 항원 결합 도메인에 단지 2개의 CLTX 펩티드 또는 단지 3개의 CLTX 펩티드를 포함한다.
특정 측면에서, 다가 CLTX-CAR(예컨대, 2가 CLTX-CAR)은 세포내 신호전달 도메인을 포함하지 않거나 포함한다. 이러한 다가 CLTX-CAR은 적어도 2개의 CLTX 펩티드 (또는 CLTX 펩티드, CLTX 펩티드의 기능적 변이체 또는 CLTX 유사 펩티드 중 적어도 2개)를 포함하는 항원 인식 도메인/모이어티를 포함하는 세포외 도메인(본원에서 "엑토도메인"으로도 지칭됨)을 포함할 수 있다. 특정 측면에서, 세포외 도메인은 2개의 CLTX 펩티드를 포함한다. 또 다른 추가의 비제한적 예에서, 다가 CLTX-CAR은 힌지 도메인 및 막관통 도메인을 추가로 포함할 수 있다. 또 다른 추가 실시양태에서, 다가 CLTX-CAR은 CD3 제타(본원에서 CD3z 또는 CD3ζ로도 지칭됨) 신호전달 도메인을 포함하거나 포함하지 않는다. 이론에 구애됨이 없이, CLTX-CARγδ T 세포에 신호전달 도메인의 부재는 활성화 유도된 세포사(AICD)를 완화하여 CLTX-CARγδ T 세포의 지속성을 증가시킴으로서 이들의 효과를 연장시킬 수 있다. 세포내 신호전달 도메인을 포함하지 않거나 포함하는 다가 CLTX-CAR은 공자극 도메인을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 이론에 구애됨이 없이, 공자극 도메인(예컨대, CD28 공자극 도메인)은 세포막 내에서 구축물을 안정화시키고/시키거나 세포 표면 발현을 향상시키거나 연장시키기 위한 세포내 앵커로서 작용할 수 있다.
본 발명은 추가로 본원에 기재된 바와 같은 다가 CLTX-CAR 또는 2가 CTLX-CAR을 포함하는 핵산 또는 벡터를 포함한다. 핵산 또는 벡터는
i. 링커 펩티드에 의해 부착된 적어도 2개의 CLTX 펩티드를 포함하는 세포외 항원 결합 도메인으로서, 임의적으로 링커 펩티드는 30개 이하의 아미노산 길이이거나 15개 미만의 아미노산 길이인 세포외 항원 결합 도메인;
ii. 막관통 도메인;
iii. 막관통 도메인을 세포외 항원 결합 도메인에 부착시키는 세포외 힌지 도메인;
iv. 임의적으로, 세포내 신호전달 도메인; 및
v. 임의적으로, 공자극 도메인.
을 포함할 수 있다
특정 측면에서, 핵산 또는 벡터는 본원에 기재된 바와 같은 화학요법제에 대해 저항성을 부여하는 DNA, RNA, 또는 폴리펩티드를 추가로 코딩한다. 또 다른 추가 측면에서, 핵산 또는 벡터는 화학요법제에 대해 저항성을 부여하는 폴리펩티드를 코딩한다. 추가 측면에서, 핵산 또는 벡터는 다가 CLTX-CAR과 폴리펩티드 사이의 자가-절단 펩티드를 코딩한다. 자가-절단 펩티드의 예는, 예컨대 돼지 테스코바이러스-1 2A(P2A) 서열, 테세아 아시그나 바이러스 2A(T2A), 말 비염 A 바이러스 2A(E2A), 세포질 다각체병 바이러스(BmCPV 2A), 및 비. 모리(B. mori)의 플라셰리 바이러스(BmIFV 2A)를 포함한다. 특정 측면에서, 핵산 또는 벡터는 다가 CLTX-CAR과 MGMT와 같은 생존 폴리펩티드 사이의 P2A 서열을 코딩한다.
특정한 다가 CLTX-CAR은, 예컨대 링커 펩티드에 의해 분리된 2개의 CLTX 펩티드를 포함하는 항원 결합 도메인, CD8a 힌지 도메인, CD28 공자극 도메인, CD3ζ 신호전달 도메인 및 MGMT를 포함한다. 또 다른 추가 실시양태에서, 다가 CLTX-CAR은, 예컨대 링커 펩티드에 의해 분리된 2개의 CLTX 펩티드를 포함하는 항원 결합 도메인, CD8a 힌지 도메인, CD28 공자극 도메인, 신호전달 도메인 없음 및 MGMT를 포함한다. 특정한 다가 CLTX-CAR은, 예컨대 c-myc 또는 Flag 펩티드에 의해 분리된 2개의 CLTX 펩티드를 포함하는 항원 결합 도메인, CD8a 힌지 도메인, CD28 공자극 도메인, CD3ζ 신호전달 도메인 및 MGMT을 포함한다. 또 다른 추가 실시양태에서, 다가 CLTX-CAR은, 예컨대 c-myc 또는 Flag 펩티드에 의해 분리된 2개의 CLTX 펩티드를 포함하는 항원 결합 도메인, CD8a 힌지 도메인, CD28 공자극 도메인, 신호전달 도메인 없음 및 MGMT를 포함한다. CAR-T 검출 및/또는 농축을 위해 세포외 c-myc 또는 Flag 펩티드 또는 다른 단백질 태그가 포함될 수 있다.
본 발명에 따른 다가 CLTX-CAR은 당업계에 공지된 임의의 수단에 의해 생성될 수 있지만, 바람직하게는 재조합 DNA 기술을 이용하여 생성된다. 다가 CLTX-CAR의 여러 영역을 코딩하는 핵산 서열은 분자 클로닝의 표준 기술(게놈 라이브러리 스크리닝, PCR, 프라이머 보조된 리게이션, 부위 지정된 돌연변이유발 등)에 의해 완전한 코딩 서열로 제조되고 조립될 수 있다. 생성된 코딩 영역은 바람직하게는 발현 벡터에 삽입되고 면역 이펙터 세포, 바람직하게는 T 림프구 세포주, 가장 바람직하게는 감마 델타 T 세포(γδ T 세포) 및 이러한 세포로 분화하는 줄기 세포와 같은 적합한 발현 숙주 세포주를 형질전환하는데 사용되며, 또한 사용될 수 있다. 바람직하게는, γδ T 세포가 숙주 세포주로서 사용된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "핵산 구축물" 또는 "핵산 서열"은 T 세포(이로 제한되지 않음)와 같은 발현 숙주 세포주로 형질전환 또는 도입되고 발현되어 생성물(예컨대, 키메라 수용체)을 생성할 수 있는 DNA 분자와 같은 핵산 분자를 의미하는 것으로 의도된다. 따라서, 본 발명은 추가로 본 발명의 다가 CLTX-CAR을 코딩하는 단리되거나 정제된 핵산 서열을 제공한다. "핵산 서열"은 DNA 또는 RNA의 중합체, 즉 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있고 비-천연 또는 변경된 뉴클레오티드를 함유할 수 있는 폴리뉴클레오티드를 포괄하는 것으로 의도된다. 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "핵산" 및 "폴리뉴클레오티드"는 리보뉴클레오티드(RNA) 또는 데옥시리보뉴클레오티드(DNA)와 같은 임의의 길이의 뉴클레오티드의 중합체 형태를 지칭한다. 이러한 용어는 분자의 1차 구조를 지칭하므로 이중 및 단일 가닥 DNA, 이중 및 단일 가닥 RNA를 포함한다. 이 용어는 뉴클레오티드 유사체 및 변형된 폴리뉴클레오티드, 예컨대, 메틸화 및/또는 캡핑된 폴리뉴클레오티드(이에 제한되지 않음)로부터 제조된 RNA 또는 DNA의 유사체를 등가물로서 포함한다. 본 발명에 사용된 핵산 구축물에서, 프로모터는 본 발명의 CLTX-CAR을 코딩하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결되며, 즉 키메라 수용체를 코딩하는 DNA로부터 메신저 RNA의 전사를 촉진하도록 위치된다. 프로모터는 게놈 기원이거나 합성적으로 생성될 수 있다. T 세포에서 사용하기 위한 다양한 프로모터는 당업계에 널리 공지되어 있다. 프로모터는 구성적이거나 유도성일 수 있으며, 유도는, 예컨대 특정 세포 유형 또는 특정 수준의 성숙과 관련된다. 대안적으로, 다수의 널리 공지된 바이러스 프로모터가 또한 적합하다. 관심 있는 프로모터는 β-액틴 프로모터, SV40 초기 및 후기 프로모터, 면역글로불린 프로모터, 인간 시토메갈로바이러스 프로모터, 레트로바이러스 프로모터 및 프렌드(Friend) 비장 초점 형성 바이러스 프로모터를 포함한다. 프로모터는 인핸서와 관련되거나 관련되지 않을 수 있으며, 인핸서는 자연적으로 상이한 프로모터와 관련된 특정 프로모터와 관련될 수 있다.
본 발명은 또한 단일 CLTX 키메라 항원 수용체 (또는 sCLTX CAR 또는 1xCLTX CAR) 및 생존 인자를 발현하는 조작된 γδ T 세포에 관한 것이며, 생존 인자는 화학요법제에 대해 저항성을 부여하는 폴리펩티드이고, γδ T 세포는 단일 CLTX-CAR 및 생존 인자의 발현을 지시하는 단일 벡터를 포함하고, 추가로
a. CLTX-CAR은
i. 1개의 CLTX 펩티드를 포함하는 세포외 항원 결합 도메인,
ii. 세포외 링커 펩티드로서, 링커 펩티드는 30개 미만의 아미노산 길이, 또는 15개 미만의 아미노산 길이이고, 링커 펩티드는 CTLX 펩티드와 막관통 도메인 사이 또는 CLTX 펩티드와 세포외 힌지 도메인 사이에 위치되는 세포외 링커 펩티드;
iii. 막관통 도메인;
iv. 막관통 도메인을 세포외 항원 결합 도메인에 부착시키는 임의의 세포외 힌지 도메인;
v. 임의적으로, 세포내 신호전달 도메인; 및
vi. 임의적으로, 공자극 도메인
을 포함한다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 조작된 γδ T 세포 집단을 포함한다. 특정 측면에서, 세포내 신호전달 도메인이 존재한다. 추가 측면에서, 링커 펩티드는 CTLX 펩티드를 막관통 도메인에 직접 또는 간접적으로 연결한다. 추가 측면에서, 링커 펩티드는 CLTX 펩티드 및 세포외 힌지 도메인을 직접 또는 간접적으로 연결한다. 또 다른 측면에서, 링커 펩티드는 15개의 아미노산 길이이다. 특정 측면에서, 링커 펩티드는 Flag 펩티드, myc 펩티드, 또는 HA 펩티드이다. 특정 실시양태에서, 단일 CLTX-CAR은 신호전달 도메인을 포함하고, 링커 펩티드는 링커 펩티드가 없는 다른 동일한 단일 CLTX-CAR과 비교하여 향상된 활성화를 갖는다. 본 발명은 추가로 단일 CLTX-CAR을 발현하는 γδ T 세포를 포함하는 약학 조성물 뿐만 아니라 본원에 기재된 바와 같은 암 또는 종양을 치료하는 방법을 포괄한다.
본 발명은 추가로 단일 CLTX 키메라 항원 수용체 (또는 sCLTX CAR 또는 1xCLTX CAR) 및 생존 인자를 발현하는 조작된 γδ T 세포를 포함하며, 생존 인자는 화학요법제에 대해 저항성을 부여하는 폴리펩티드이고, γδ T 세포는 단일 CLTX-CAR 및 생존 인자의 발현을 지시하는 단일 벡터를 포함하고, 추가로
a. CLTX-CAR은
i. 1개의 CLTX 펩티드를 포함하는 세포외 항원 결합 도메인,
ii. 막관통 도메인;
iii. 막관통 도메인을 세포외 항원 결합 도메인에 부착시키는 임의의 세포외 힌지 도메인;
iv. 임의적으로 공자극 도메인
을 포함하고;
단일 CLTX-CAR은 세포내 신호전달 도메인을 포함하지 않는다. 본 발명은 또한 본원에 기재된 조작된 γδ T 세포 집단을 포괄한다. 본 발명은 또한 공자극 도메인(예컨대, CD28 공자극 도메인)을 포함하고 세포내 신호전달 도메인을 포함하지 않는 단일 CTLX-CAR을 포함한다. 본 발명은 추가로 단일 CLTX-CAR을 발현하는 γδ T 세포를 포함하는 약학 조성물 뿐만 아니라 본원에 기재된 바와 같은 암 또는 종양을 치료하는 방법을 포함한다.
본 발명의 CLTX-CAR(예컨대, 다가 CTLX-CAR, 2가 CLTX-CAR, 또는 sCLTX-CAR)을 제조하기 위한 다양한 조작은 시험관내에서 수행될 수 있고, CLTX-CAR 키메라 구축물은 표준 형질전환 또는 형질감염 방법을 이용하여 적절한 숙주 세포에서 클로닝 및 발현을 위해 벡터에 도입될 수 있다. 따라서, 각각의 조작 후, DNA 서열의 결합으로부터 생성된 구축물이 클로닝되고, 벡터가 단리되고, 서열이 원하는 키메라 수용체를 코딩하는지 확인하기 위해 서열이 스크리닝된다. 서열은 제한 분석, 시퀀싱 등에 의해 스크리닝될 수 있다. 따라서, 본 발명은 본원에 기재된 다가 CLTX-CAR을 코딩하는 벡터 또는 이의 기능적 등가물을 포함한다.
당업자에게 널리 공지된 바와 같이, 대상체로부터 이들 세포를 단리하고 확장하기 위한 다양한 방법이 쉽게 이용 가능하다. 예컨대, 세포 표면 마커 발현을 사용하거나 상업적으로 이용 가능한 키트를 사용한다. 키메라 구축물은 네이키드 DNA로서 또는 적합한 벡터로 대상체 자신의 T 세포에 도입될 수 있는 것으로 고려된다. 네이키드 DNA를 사용한 전기천공에 의해 T 세포를 안정적으로 형질감염시키는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 네이키드 DNA는 일반적으로 발현을 위해 적절한 배향으로 플라스미드 발현 벡터에 함유된 본 발명의 키메라 수용체를 코딩하는 DNA를 지칭한다. 유리하게는, 네이키드 DNA의 사용은 본 발명의 키메라 수용체를 발현하는 T 세포를 생성하는데 필요한 시간을 감소시킨다.
따라서, 본 발명은 본 발명의 다가 CTX-CAR(들), 2가 CLTX-CAR 및 sCLTX-CAR 뿐만 아니라 이들의 기능적 변이체를 코딩하는 벡터를 함유하는(즉, 이로 형질전환되거나 형질도입된) 숙주 세포를 포함한다. 바람직하게는, 숙주 세포는 CLTX-CAR의 발현을 위한 면역 이펙터 세포, 바람직하게는 T 세포, T 림프구 세포주, 가장 바람직하게는 자가 T 림프구 세포주, 제3자 유래된 T 세포주/클론, 형질전환된 체액성 또는 이종 면역학적 이펙터 세포주이다. 자연 킬러(NK) 세포, 대식세포, 호중구, 종양 침윤 림프구(TIL), 림포카인 활성화된 킬러(LAK) 세포, 메모리 T 세포, 조절자}-T 세포, 세포독성 T 림프구(CTL), 감마 델타 T 세포(γδ T 세포) 및 이들 세포로 분화하는 줄기 세포가 또한 사용될 수 있다. 바람직하게는, γδ T 세포가 숙주 세포주로서 사용된다. 형질감염 또는 형질도입된 T 세포가 원하는 조절 및 원하는 수준으로 표면 막 단백질로서 키메라 수용체를 발현할 수 있다는 것이 확립되면, 키메라 수용체가 숙주 세포에서 원하는 신호 유도를 제공하는 기능을 하는지 여부를 결정할 수 있다. 이어서, 형질도입된 T 세포는 대상체에서 항-종양 반응을 활성화시키기 위해 대상체에 재도입되거나 투여된다.
한 실시양태에서, 본 발명은 본 개시내용의 다가 CLTX-CAR(들), 2가 CLTX-CAR 또는 sCLTX-CAR 및 생존 인자, 예컨대 본원에 개시된 바와 같은 화학치료제에 대해 저항성을 부여하는 폴리펩티드를 코딩하는 (즉, 이의 발현을 지시하는) 하나의 벡터를 포함하는(즉, 이로 형질전환되거나 형질도입된) 숙주 세포, 예컨대 γδ T 세포를 포함한다. 본 개시내용의 임의의 CLTX-CAR이 사용될 수 있다. γδ T 세포는 자연적으로 스트레스 유발된 항원(예컨대, NKG2D(이에 제한되지 않음))에 대한 수용체를 발현할 수 있으며; 바람직하게는, 스트레스 유발된 항원(이에 스트레스 유발된 항원 수용체가 결합함)의 발현은 화학요법제의 투여에 의해 증가된다. 예컨대, γδ T 세포는 자연적으로 NKG2D를 발현할 수 있고, 그 자체로 화학요법제의 투여를 포함하는 치료 방법에 활용될 수 있으며, 화학요법제의 투여는 종양 또는 암 세포에서 NKG2DL의 발현을 증가시킨다. 또 다른 측면에서, γδ T 세포는 스트레스 유발된 항원 수용체(예컨대, NKG2D(이에 제한되지 않음))를 코딩하는(즉, 이의 발현을 지시하는) 벡터(CLTX-CAR을 코딩하는 동일한 벡터 또는 상이한 벡터)를 포함할 수 있다.
상기 기재된 바와 같이, γδ T 세포는 CLTX CAR, 예컨대 다가 CLTX-CAR을 발현하고, 추가로 생존 인자를 발현하고/하거나 생존 인자로 처리되었으며, 생존 인자는 화학요법제에 대해 저항성을 부여하는 DNA, RNA, 또는 폴리펩티드이다. 특정 측면에서, 세포는 생존 인자를 발현하며, 생존 인자는 (γδ T 세포에 대해) 화학요법제에 대해 저항성을 부여하여 γδ T 세포가 화학요법제에 의해 생성되는 치료 환경에서 생존하도록 하고/하거나 γδ T 세포가 화학요법제를 포함하는 종양 환경에서 생존하도록 하는 폴리펩티드이다. 바람직한 측면에서, 단일 벡터는 다가 CLTX-CAR 및 화학요법제에 대해 저항성을 부여하는 폴리펩티드를 코딩한다. 특정한 구체적 실시양태에서, 단일 벡터는 다가 CLTX-CAR 및 알킬 구아닌 트랜스퍼라제(AGT), P140K MGMT, O6 메틸구아닌 DNA 메틸트랜스퍼라제(MGMT), L22Y-DHFR, 티미딜레이트 신타제, 디히드로폴레이트 리덕타제, 다중 약물 저항성-1 단백질(MDR1), 5' 뉴클레오티다제 II, 디히드로폴레이트 리덕타제, 및 티미딜레이트 신타제로 이루어진 군으로부터 선택되는 생존 폴리펩티드를 코딩한다. 또 다른 추가 측면에서, 단일 벡터는 다가 CLTX-CAR 및 MGMT를 코딩한다. 또 다른 측면에서, 단일 벡터는 다가 CLTX-CAR 및 MGMT를 코딩하며, 다가 CLTX-CAR은 항원 인식 도메인에 2개의 CLTX 펩티드를 포함한다. 특정 실시양태에서, 다가 CLTX-CAR 및 생존 인자 (및 임의적으로, 스트레스 유발된 항원 수용체)의 발현을 지시하는 벡터를 포함하는 숙주 세포는 단리된 또는 정제된 γδ T 세포이다. 본원에서 논의되는 바와 같이, 숙주 세포는 숙주 세포, 예컨대 γδ T 세포가 화학요법제에 의해 생성된 치료 환경에서 생존할 수 있도록 하는 생존 폴리펩티드를 발현하도록 조작될 수 있다. 생존 폴리펩티드를 발현하는 이러한 세포는 본원에서 약물 저항성(DR) 세포로 지칭되며, 치료에서의 이들의 사용은 본원에서 "약물 저항성 면역요법"(DRI)으로 지칭된다. DR 세포 및 DRI는 WO 2011/053750에 기술되어 있으며, 이의 교시는 본 출원에 참조로 포함된다. 생존 폴리펩티드는 화학요법제를 포함하는 치료 레지먼에 대해 저항성을 제공하고/하거나 본원에 기재된 생존 폴리펩티드 및 다가 CLTX-CAR을 포함하는 세포가 화학요법제에 의해 생성되는 치료 환경에서 생존할 수 있게 하는 당업계에 공지된 임의의 폴리펩티드일 수 있다.
예시적인 화학요법제는 뉴클레오시드 유사체 화학요법 약물, 알킬화제, 항대사제, 항생제, 토포이소머라제 억제제, 유사분열 억제제, 분화제 또는 호르몬 요법제이고, 생존 인자는 화학요법제에 대해 저항성을 제공한다. 추가 측면에서, 화학요법제는 알킬화제이다. 특정 실시양태에서, 생존 폴리펩티드는 MGMT, 다중약물 저항성 단백질 1(MDRI), 또는 5' 뉴클레오티다제 II(NT5C2)이다. 또 다른 측면에서, 생존 폴리펩티드는 MGMT이고, 화학요법제는 카르무스틴(BCNU), 로무스틴(CCNU), 및 테모졸로미드와 같은 알킬화제이다. 특정 측면에서, 화학요법제는 테모졸로미드(TMZ)이다. 추가 측면에서, 생존 폴리펩티드는 MDR1이고, 화학요법제는 안트라사이클린, 빈카 알칼로이드, 에피포도필로톡신, 캄프토테신, 메토트렉세이트(MTX), 사퀴나비르, 및 미톡산트론(MX)이다(Sodani et all. (2011). Multidrug resistance associated proteins in multidrug resistance. Chin J Cancer 31(2): 58-72). NT5C2는 티오퓨린 화학요법에 대해 저항성을 제공하는 것으로 당업계에 공지된 폴리펩티드이다(Tzoneva et al. (2013), Activating mutations in the NT5C2 nucleotidase gene drive chemotherapy resistance in relapsed ALL, Nat Med. 19(3): 368-371). 다른 생존 폴리펩티드는, 예컨대 디히드로폴레이트 리덕타제(L22Y-DHFR) 및 티미딜레이트 신타제의 약물 저항성 변이체를 포함한다. 특정 측면에서, 생존 폴리펩티드는 MGMT이다. 그러나, 공동 투여되는 화학요법제, 치료 환경의 특성(즉, 본 개시내용의 세포 조성물과 조합하여 환자에게 어떤 다른 치료 요법이 제공되고 있는지)에 따라 다른 생존 인자가 사용될 수 있다.
추가 측면에서, 화학요법제는 알킬화제; 대사 길항제; DNA 탈메틸화제; 치환된 뉴클레오티드; 치환된 뉴클레오시드; 항종양 항생제; 식물 유래된 항종양제 또는 니트로소우레아이다. 바람직하게는, 화학요법제는 시스플라틴; 카르보플라틴; 에토포시드; 메토트렉세이트(MTX); 트리메토트렉세이트(TMTX); 테모졸로미드; 다카르바진(DTIC), 랄티트렉세드; S-(4-니트로벤질)-6-티오이노신(NBMPR); 6-벤지구아니딘(6-BG); 니트로소우레아(라비노피라노실-N-메틸-N-니트로소우레아(아라노스), 카르무스틴(BCNU, BiCNU), 클로로조토신, 에틸니트로소우레아 (ENU), 포테무스틴, 로무스틴(CCNU), 니무스틴, N-니트로소-N-메틸우레아(NMU), 라니무스틴(MCNU), 세무스틴, 스트렙토조신(스트렙토조토신)); 시타라빈; 캄프토테신; 및 이들의 임의의 것의 치료 유도체로부터 선택된다. 바람직하게는, γδ T 세포는 알킬 구아닌 트랜스퍼라제(AGT), P140KMGMT, O6 메틸구아닌 DNA 메틸트랜스퍼라제(MGMT), L22Y-DHFR, 티미딜레이트 신타제, 디히드로폴레이트 리덕타제, 또는 다중 약물 저항성-1 단백질(MDR1)을 코딩하도록 유전적으로 변형되었다. 바람직하게는, γδ T 세포는 알킬화제; 대사 길항제; DNA 탈메틸화제; 치환된 뉴클레오티드; 치환된 뉴클레오시드; 항종양 항생제; 식물 유래된 항종양제 및 니트로스우레아로부터 선택되는 적어도 2개의 화학요법제에 대해 저항성이도록 유전적으로 변형되었다. 바람직하게는, γδ T 세포는 시스플라틴; 카르보플라틴; 에토포시드; 메토트렉세이트(MTX); 트리메토트렉세이트(TMTX); 테모졸로미드; 다카르바진(DTIC), 랄티트렉세드; S-(4-니트로벤질)-6-티오이노신(NBMPR); 6-벤지구아니딘(6-BG); 니트로소우레아(라비노피라노실-N-메틸-N-니트로소우레아(아라노스), 카르무스틴(BCNU, BiCNU), 클로로조토신, 에틸니트로소우레아 (ENU), 포테무스틴, 로무스틴(CCNU), 니무스틴, N-니트로소-N-메틸우레아(NMU), 라니무스틴(MCNU), 세무스틴, 스트렙토조신(스트렙토조토신)); 시타라빈; 캄프토테신; 및 이들의 임의의 것의 치료 유도체로부터 선택되는 적어도 2개의 화학요법제에 대해 저항성이도록 유전적으로 변형되었다. 바람직하게는, 화학요법제는 TMZ, 메토트렉세이트, DTIC, BCNU, CCNU, MCNU, NMU 또는 ENU이다.
예컨대, 화학요법제(예컨대, 대상체에게 투여되는 화학요법제)에 대해 저항성을 부여하는 폴리펩티드를 포함하는 생존 인자는 화학요법제에 의해 생성되는 치료 환경에서 이를 발현하는 숙주 세포의 생존을 촉진할 수 있거나, 숙주 세포가 치료의 일부로서 화학요법제의 투여로 인한 환경 또는 종양 미세환경에서 독성의 존재 하에 생존할 때 화학요법제의 존재 하에서의 생존을 촉진할 수 있다. DRI (및 화학요법제에 대해 저항성을 부여하는 폴리펩티드를 발현하는 γδ T 세포)와 함께 사용하기 위한 화학요법제는 알킬화제(예컨대, 사이클로포스파미드, 이포스파미드, 멜팔란); 대사 길항제(예컨대, 메토트렉세이트(MTX), 5-플루오로우라실 또는 이의 유도체); DNA 탈메틸화제(항대사물로도 공지됨; 예컨대, 아자시티딘): 치환된 뉴클레오티드; 치환된 뉴클레오시드; 항종양 항생제(예컨대, 미토마이신, 아드리아마이신); 식물 유래된 항종양제(예컨대, 빈크리스틴, 빈데신, TAXOL®, 파클리탁셀, 아브락산); 시스플라틴; 카르보플라틴; 에토포시드 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 이러한 작용제는 항암제 트리메토트렉세이트(TMTX); 테모졸로미드(TMZ); 랄티트렉세드; S-(4-니트로벤질)-6-티오이노신(NBMPR); 6-벤지구아니딘(6-BG); 니트로소우레아(예컨대, BCNU 및 카르무스틴으로도 공지된 비스-클로로에틸니트로소우레아, CCNU로도 공지된 로무스틴, +/- 프로카르바진 및 빈크리스틴(PCV 레지먼) 및 포테무스틴); 독소루비신; 시타라빈; 캄프토테신; 및 이들의 임의의 것의 치료 유도체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본원에 기재된 조작된 γδ T 세포는 자살 유전자를 추가로 발현할 수 있다. 본원에 사용된 "자살 유전자"는 본원에 기재된 CLTX-CAR 발현 세포가, 예컨대 케스케이딩 염증 반응 또는 오프-표적 세포독성으로부터 보호하기 위해 세포 또는 이의 조성물이 투여되는 대상체로부터 근절될 수 있는 메커니즘을 지칭한다. 자살 유전자 시스템은, 예컨대 단순 포진 바이러스 티미딘 키나제(HSVTK)/간시클로비르(GCV) 자살 유전자 시스템, 자살 유도성 카스파제 유전자 시스템(Budde et al., PLoS One 2013 8(12):82742), 코돈 최적화된 CD20(Marin et al., Hum. Gene Ther. Meth. 2012 23(6)376-86), CD34, 말단절단된 EGFR(Wang X, Chang W-C, Wong C W, et al. A transgene-encoded cell surface polypeptide for selection, in vivo tracking, and ablation of engineered cells. Blood. 2011; 118(5):1255-1263. doi:10.1182/blood-2011-02-337360), 말단절단된 CD19, 또는 폴리펩티드 RQR8(Philip et al, 및 WO2013153391A, 본원에 참조로 포함됨)일 수 있다. 자살 유전자의 추가 예는 2A 유사 서열을 통해 선별 가능한 마커 역할을 하는 말단절단된 인간 CD19에 연결된 iC9로 이루어진 τ-레트로바이러스 SFG.i카스파제9.2A.DeltaCD19이다. 카스파제 9 자살 유전자의 AP1903 유도성 활성화는 인간 FK506 결합 단백질(FKBP)로부터 유도된 약물 결합 도메인에 융합된 키메라 단백질(iC9)을 발현함으로써 달성된다. iC9는 FKBP 도메인을 교차 연결하고 iCasp9 신호전달을 시작하며 유전자 변형된 세포의 아폽토시스를 유도하는 API 903에 노출될 때까지 세포 내부에서 휴지 상태에 있는다. 유전자 및 API 903은 벨리쿰 파라슈티칼스(Bellicum Pharmaceuticals, 텍사스주 휴스톤)에서 입수할 수 있다.
본 발명의 CLTX-CAR 또는 다가 CLTX-CAR을 발현하는 DR γδ T 세포는 본원에 기재된 CLTX-CAR을 코딩하고 발현할 수 있는 핵산 구축물을 포함함으로써 생성될 수 있고, 임의적으로 폴리펩티드에 저항성을 부여하는 DNA, RNA, 또는 폴리펩티드, 및 임의적으로 다른 요소(예컨대, 자살 유전자 및/또는 스트레스 유발된 항원에 대한 수용체)를 추가로 발현할 수 있다. 특정 실시양태에서, 단일 핵산 구축물은 다가 CLTX-CAR 및 화학요법제에 대해 저항성을 부여하는 폴리펩티드 뿐만 아니라 추가적인 임의의 요소(예컨대, 자살 유전자 및/또는 스트레스 유발된 항원에 대한 수용체)를 코딩한다. 특정 실시양태에서, 별도의 핵산 구축물은 각각의 다가 CLTX-CAR 및 화학요법제에 대해 저항성을 부여하는 폴리펩티드, 및 임의의 다른 요소(예컨대, 자살 유전자 및/또는 스트레스 유발된 항원에 대한 수용체)를 코딩한다. 특정 실시양태에서, 단일 핵산 구축물은 다가 CLTX-CAR 및 화학요법제에 대해 저항성을 부여하는 폴리펩티드를 코딩하고, 하나 이상의 핵산 구축물은 추가적인 임의의 요소(예컨대, 자살 유전자 및/또는 스트레스 유발된 항원에 대한 수용체)를 코딩한다.
CLTX-CAR, 예컨대 다가 CLTX-CAR을 발현하는 γδ T 세포는 스트레스 유발된 항원에 대한 수용체를 추가로 발현할 수 있다. 특정 측면에서, γδ T 세포는 자연적으로 스트레스 유발된 항원, 예컨대 NKGD2를 발현한다. 다른 측면에서, γδ T 세포는 스트레스 유발된 항원을 발현하도록 조작된다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 CLTX-CAR 또는 다가 CTX-CAR을 발현하는 숙주 세포는 NKGD2와 같은 스트레스 유발된 항원 수용체를 코딩하는 유전자를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, NKGD2 수용체를 포함하지만 이에 제한되지 않는 스트레스 유발된 항원 수용체는 γδ T 세포에서 증가된 수준으로 유도된다.
숙주 세포, 예컨대 CTLX-CAR 또는 다가 CLTX-CAR을 발현하는 γδ T 세포, 예컨대 다가 CLTX-CAR 및 화학요법제에 대해 저항성을 부여하는 DNA, RNA, 또는 폴리펩티드를 발현하는 γδ T 세포는 조성물의 일부로서 투여된다. 조성물은 조작된 γδ T 세포 및 추가의 면역계 세포를 포함할 수 있다. 예컨대, 조성물은 본원에 기재된 바와 같은 다가 CLTX-CAR을 발현하는 γδ T 세포를 포함할 수 있고, NK 세포 및/또는 αβ T 세포를 추가로 포함할 수 있다. 특정 측면에서, 조성물은 본원에 기재된 다가 CLTX-CAR을 발현하는 조작된 γδ T 세포 및 추가의 면역계 세포를 포함하며, γδ T 세포는, 예컨대 유동 세포측정으로 결정 시 총 세포 집단의 50%, 60% 또는 70% 이상으로 존재한다. 또 다른 추가 측면에서, γδ T 세포는, 예컨대 유동 세포측정으로 결정 시 총 생존 세포 집단의 50%, 60% 또는 70% 이상으로 존재한다. 특정 실시양태에서, 조성물은 조작된 γδ T 세포 및 NK 세포를 포함하며, γδ T 세포는 총 세포 집단 또는 총 생존 세포 집단의 50%, 60% 또는 70% 이상으로 존재하고, NK 세포는 25% 이하로 존재한다(예컨대, 유동 세포측정으로 결정 시). 특정 실시양태에서, 조성물은 조작된 γδ T 세포 및 αβ T 세포를 포함하며, γδ T 세포는, 예컨대 유동 세포측정으로 결정 시 총 세포 집단 또는 총 생존 세포 집단의 50%, 60% 또는 70% 이상으로 존재한다. 추가 측면에서, 조성물은, 예컨대 유동 세포측정으로 결정 시 총 세포 집단 또는 총 생존 세포 집단의 5% 이하로 αβ T 세포를 포함한다. 특정 실시양태에서, 조성물은 조작된 γδ T 세포, αβ T 세포 및 NK 세포를 포함하며, γδ T 세포는, 예컨대 유동 세포측정으로 결정 시 총 세포 집단 또는 총 생존 세포 집단의 50%, 60% 또는 70% 이상으로 존재한다. 특정 실시양태에서, 유동 세포측정으로 결정 시, αβ T 세포는 총 세포 집단 또는 총 생존 세포 집단의 5% 이하로 존재하고, NK 세포는 총 세포 집단 또는 총 생존 세포 집단의 25% 이하로 존재한다.
바람직하게는, 임의적으로 농축되고/되거나 임의적으로 확장된 γδ T 세포 집단을 포함하는 환자에게 투여하기 위한 치료 조성물은 약 5x108개 이하의 γδ T 세포/환자 체중 kg을 포함한다. 바람직하게는, 임의적으로 농축되고/되거나 임의적으로 확장된 γδ T 세포 집단을 포함하는 환자에게 투여하기 위한 치료 조성물은 약 5x107개 이하의 γδ T 세포/환자 체중 kg을 포함한다. 바람직하게는, 임의적으로 농축되고/되거나 임의적으로 확장된 γδ T 세포 집단을 포함하는 환자에게 투여하기 위한 치료 조성물은 약 5x106개 이하의 γδ T 세포/환자 체중 kg을 포함한다.
치료될 환자 또는 또 다른 공급원으로부터 γδ T 세포를 단리하는 방법은, 예컨대 문헌[Lamb L. S., U.S. Pat. 7,078,034, 전부 참조로 본원에 포함됨]에 기술되어 있다.
상기 기재된 바와 같이, 예컨대 화학요법제에 대해 저항성을 부여하는 폴리펩티드(예컨대, MGMT 폴리펩티드)를 포함하는 생존 인자의 사용은 본 개시내용의 조작된 γδ T 세포(DR γδ T 세포 포함)를 포함하는 조성물이 종양이 스트레스를 받을 때 화학요법제에 의해 생성되는 치료 환경에서 생존할 수 있게 한다. 특정 실시양태에서, (예컨대, 화학요법제에 의한) 종양에 대한 스트레스 효과는 γδ T 세포 상의 NKG2D 수용체와 같은 수용체에 의해 인식되는 스트레스 항원의 발현을 증가시킨다. 화학요법으로 스트레스 항원을 유도하고 조절 T 세포를 감소시키는 이중 효과는 개별 레지먼에 비해 종양 감소를 크게 개선한다. 유전자 변형(생존 폴리펩티드 발현) 및/또는 본원에 기재된 바와 같은 생존 인자를 사용한 치료는 화학요법 레지먼, 예컨대 TMZ의 림프구 고갈 효과로부터 본 개시내용의 조성물을 보호하고, 악성 세포가 화학요법에 의해 최대로 스트레스를 받을 때 손상되지 않은 T 세포 세포독성 기능과 조합된 TAA를 통해 본 개시내용의 세포 조성물이 종양에 특이적으로 접근할 수 있게 한다. 본 발명에 따른 CLTX-CAR 또는 다가 CLTX-CAR과 조합된 DRI의 사용은 본원에서 "DRI CLTX-CAR" 요법으로 지칭되며, 화학요법(예컨대, TMZ) 단독 치료 또는, 예컨대 γδ T 세포 주입 단독과 비교 시 생존을 상당히 연장하고 종양 부담 및 재발 시간을 감소시키는 것으로 여겨지며, 유의한 불리한 전신적 또는 신경학적 결과 없이 그렇게 한다.
본원에 기재된 조성물은 약학 조성물로서 전달될 수 있거나, 추가로 약학적으로 허용될 수 있는 적절한 담체 또는 희석제와 함께 생체내 투여에 적합한 임플란트로 제조될 수 있다. 이러한 조성물 또는 임플란트를 제조하는 수단은 당업계에 기술되어 있다. 적절한 경우, 본원에 기재된 조작된 γδ T 세포는 각각의 투여 경로에 대한 통상적인 방법으로 캡슐, 용액, 주사제, 흡입제 또는 에어로졸과 같은 반고체 또는 액체 형태의 제제로 제형화될 수 있다. 표적 조직 또는 기관에 도달할 때까지 조성물의 방출 및 흡수를 방지하거나 최소화하기 위해, 또는 조성물의 적시 방출을 보장하기 위해 당업계에 공지된 수단이 이용될 수 있다. 그러나, 바람직하게는, CLTX-CAR을 발현하는 세포를 무력화시키지 않는 약학적으로 허용되는 형태가 사용된다. 따라서, 바람직하게는 본원에 기재된 바와 같은 다가 CLTX-CAR을 발현하는 세포는 균형 염 용액, 예컨대 행크스 균형 염 용액 또는 일반 식염수를 함유하는 약학 조성물로 제조될 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 개시내용의 다가 CLTX-CAR을 발현하는 γδ T 세포를 포함하는 약학 조성물을 포함하고, 특히 다가 CLTX-CAR을 발현하고 폴리펩티드에 대해 저항성을 부여하는 폴리펩티드를 발현하는 γδ T 세포를 포함한다.
약학 조성물은 단독으로 또는 암 치료에 유용한 다른 널리 확립된 작용제, 예컨대 본원에 기재된 바와 같은 화학요법제와 조합하여 사용될 수 있다. 단독으로 전달되든 다른 작용제와 함께 전달되든 간에, 본 발명의 약학 조성물은 특정 효과를 달성하기 위해 다양한 경로를 통해 포유동물, 특히 인간 신체의 다양한 부위에 전달될 수 있다. 당업자는 하나 이상의 경로가 투여에 사용될 수 있지만 특정 경로가 또 다른 경로보다 더 즉각적이고 더 효과적인 반응을 제공할 수 있음을 인식할 것이다. 예컨대, 피내 전달은 흑색종의 치료를 위해 흡입보다 유리하게 사용될 수 있다. 국소 또는 전신 전달은 제형의 체강으로의 적용 또는 적하를 포함하는 투여, 에어로졸의 흡입 또는 취입, 또는 근육내, 정맥내, 문맥내, 간내, 복막, 피하 또는 피내 투여를 포함하는 비경구 도입에 의해 달성될 수 있다.
조성물은 단위 투여 형태로 제공될 수 있으며, 각각의 투여 단위, 예컨대 주사는 미리 결정된 양의 조성물을 단독으로 또는 유성 활성제와 적절하게 조합하여 함유한다. 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 단위 투여 형태는 인간 및 동물 대상체를 위한 단일 용량으로서 적합한 물리적으로 분리된 단위를 지칭하며, 각각의 단위는 적절한 경우 약학적으로 허용되는 희석제, 담체 또는 비히클과 함께 원하는 효과를 생성하기에 충분한 양으로 계산된 미리 결정된 양의 본 발명의 조성물을 단독으로 또는 다른 활성제와 함께 함유한다. 본 발명의 새로운 단위 투여 형태에 대한 사양은 특정 대상체에서 약학 조성물과 관련된 특정 약력학에 의존한다. 바람직하게는, 단독으로 또는 치료제와 조합하여 투여되는 치료학적 유효량 또는 충분한 수의 조작된 γδ T 세포가 장기적이고 특정한 반응이 확립되도록 대상체에게 도입된다. 한 실시양태에서, 반응은 암의 억제를 포함한다. 한 실시양태에서, 반응은 조작된 γδ T 세포 또는 이의 조성물을 사용한 치료의 부재를 초래하는 것보다 더 큰 정도로 종양 크기의 감소 또는 종양 성장 또는 재성장의 제거 또는 전이의 감소이다. 특정 측면에서, 치료학적 유효량은 조작된 CLTX-CAR의 부재와 비교할 때 종양 크기를 적어도 약 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 또는 100% 감소시킨다. 따라서, 치료학적 유효량은 투여 경로를 고려하고 조작된 세포의 수는 원하는 치료 반응을 달성하기에 충분한 수이어야 한다. 또한, 본 개시내용의 CLTX-CAR을 발현하는 각각의 γδ T 세포 또는 본원에 기재된 조성물에 포함된 다른 세포의 양(예컨대, 접촉될 각각의 세포당 양 또는 특정 체중당 양)은 상이한 적용에서 변할 수 있다. 특정한 비제한적 예에서, 세포의 농도는, 임의의 적합한 양 적어도 약 1x105 내지 약 1x1010개의 숙주 세포, 훨씬 더 바람직하게는, 비록 5x10s개보다 많은, 예컨대 초과의 세포 또는 1xl07개보다 적은, 예컨대 미만의 세포의 임의의 적합한 양이 활용될 수 있지만, 약 1x107 내지 약 5x108개의 숙주 세포를 치료받는 대상체에 제공하기에 충분할 수 있다. 투여 일정은 널리 정립된 세포 기반 요법을 기반으로 하거나 대체 연속 주입 전략을 이용할 수 있다.
이들 양은 본 발명의 실시를 위해 본 발명의 방법을 최적화할 때 실시자에 의해 활용되는 일반적인 지침을 제공한다. 이러한 범위에 대한 본원에서의 인용은 특정 적용에서 보증될 수 있는 바와 같이 더 많거나 더 적은 양의 성분의 사용을 결코 배제하지 않는다. 예컨대, 실제 용량 및 일정은 조성물이 다른 약학 조성물과 조합하여 투여되는지 여부에 따라 또는 약동학, 약물 배치 및 대사의 개체간 차이에 따라 달라질 수 있다. 당업자는 특정 상황의 긴급성에 따라 임의의 필요한 조정을 쉽게 할 수 있다. 치료 효과를 위한 적절한 용량은 바람직하게는 일련의 투여 주기에서 투여당 약 105 내지 약 1010개의 숙주 세포일 것이다. 바람직한 투여 레지먼은 0일에 약 1(P ceil에서 시작하여 5일까지 약 1010개 세포의 표적 용량까지 점증적으로 증가하는 상승하는 용량의 4회의 1주 투여 주기로 이루어진다. 적합한 투여 방식은 정맥내, 피하, 강내(예컨대, 저장소 접근 장치에 의해), 복강내 및 종양 덩어리로의 직접 주사를 포함한다.
치료될 암은 신경외배엽 기원일 수 있다. 특정 측면에서, 암은 악성 신경교종, 흑색종, 신경모세포종, 수모세포종 또는 소세포 폐 암종이다. 주입된 세포는 수용자의 종양 세포를 사멸시킬 수 있다. 항체 요법과 달리 CLTX-CAR을 발현하는 숙주 세포는 생체내에서 복제할 수 있어 지속적인 종양 제어로 이어질 수 있는 장기 지속성을 초래한다. 본 발명은 또한 γδ T 세포가 본 발명의 CLTX-CAR 및 생존 폴리펩티드를 일시적으로 발현하도록 변형되는 세포 요법을 포함하며, 세포는 이를 필요로 하는 수용자에게 주입된다. 주입된 세포는 수용자의 종양 세포를 사멸시킬 수 있다. 따라서, 다양한 측면에서, 환자에게 투여된 γδ T 세포는 환자에게 투여된 후 1개월 미만, 예컨대 3주, 2주, 1주 동안 존재한다. 특정 측면에서, 환자에게 투여된 세포 또는 이의 자손은 환자에게 숙주 세포를 투여한 후 적어도 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 12개월, 13개월, 14개월, 15개월, 16개월, 17개월, 18개월, 19개월, 20개월, 21개월, 22개월, 23개월, 2년, 3년, 4년 또는 5년 동안 환자에서 지속된다.
추가 측면에서, γδ T 세포는 포유동물의 생체외 면역화 및/또는 생체내 요법을 위한 일 유형의 백신일 수 있다. 한 측면에서, 포유동물은 인간이다. 생체외 면역화와 관련하여, 하기 중 적어도 하나가 숙주 세포 또는 숙주 세포를 포함하는 약학 조성물을 포함하는 조성물을 포유동물에게 투여하기 전에 시험관내에서 발생한다: i) 숙주 세포의 확장, ii) 다가 CLTX-CAR 및 생존 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 숙주 세포에 도입 및/또는 iii) CLTX-CAR을 발현하거나 발현할 수 있는 세포의 동결보존. 생체외 절차는 당업계에 널리 공지되어 있다. 간략하게, 세포는 환자(예컨대, 인간)로부터 단리되고, 본 개시내용의 CLTX-CAR을 발현하도록 유전적으로 변형된다(즉, 본원에 개시된 CLTX-CAR을 발현하는 벡터로 시험관내에서 형질도입 또는 형질감염됨). CLTX-CAR 변형된 숙주 세포는 치료적 이익을 제공하기 위해 환자에게 투여될 수 있다. 환자는 바람직하게는 인간이고, CLTX-CAR 변형된 숙주 세포는 환자에 대해 자가일 수 있다. 대안적으로, 숙주 세포는 환자에 대해 동종이계, 동계 또는 이종일 수 있다.
조작된 γδ T 세포 및 화학요법제(예컨대, 생존 인자가 저항성을 부여하는 화학요법제)는 공동 투여될 수 있다. 이러한 공동 투여는, 예컨대 동일한 또는 별도의 조성물에서 "동시" 또는 "공동 전달"을 포괄할 수 있다. 다른 측면에서, 공동 투여는 별도의 투여를 포괄하지만 동일한 치료 레지먼의 일부이다. 특정 측면에서, 화학요법제는 조작된 γδ T 세포 이전에 또는 공동으로 투여된다. 추가 측면에서, 조작된 γδ T 세포는 화학요법제와 공동 투여되며, 화학요법제는 종양 또는 암세포 상의 스트레스 리간드(예컨대, NKG2DL)의 발현을 증가시키고; 예컨대, 화학요법제는 스트레스 리간드의 발현을 증가시키는 양 및 방식/레지먼으로 투여된다. 특정 측면에서, 공동 투여는 단독 치료보다 더 효과적일 수 있다. 두 치료의 효과는 부분적으로 부가적이거나 완전히 부가적이거나 부가적보다 클 수 있다. 예컨대, 공동 투여는 화학요법제의 투여 후 약 8시간 내지 약 72시간에 γδ T 세포의 투여를 포괄할 수 있다. 특정 측면에서, 조작된 γδ T 세포는 화학요법제의 투여 후 약 12시간 내지 약 36시간에 투여되며; 예컨대, 조작된 γδ T 세포는 화학요법제의 투여 후 약 24시간에 투여된다. 또 다른 측면에서, 공동 투여는 조작된 γδ T 세포를 화학요법제와 동시에 또는 실질적으로 동시에 투여하는 것을 포괄한다. 본원에서 사용되는 바와 같이 "실질적으로 동일한 시간"은 동일한 치료 세션 내의 투여를 포괄할 수 있다.
조작된 γδ T 세포 및 화학요법제는 활성적인 장애 기간 동안 또는 완화 또는 덜 활성적인 질환 기간 동안 투여될 수 있다.
추가 측면에서, γδ T 세포 및 화학요법제에 더하여 추가의 치료제가 투여된다. γδ T 세포 및 화학요법제 및 임의적으로 추가 치료제의 조합 투여 시, 전술된 것 중 하나 또는 모두의 양 또는 용량은 개별적으로, 예컨대 단일요법으로서 사용되는 각각의 작용제의 양 또는 용량보다 더 높거나 더 낮거나 동일한 양 또는 용량으로 투여될 수 있다. 특정 실시양태에서, 전술된 것 중 하나 또는 모두의 양 또는 용량은 개별적으로, 예컨대 단일요법으로서 사용되는 각각의 작용제의 양 또는 용량보다 더 낮다(예컨대, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40% 또는 적어도 50%). 다른 실시양태에서, 원하는 효과(예컨대, 암의 억제)를 초래하는 전술된 것 중 하나 또는 모두의 양 또는 용량은 동일한 치료 효과를 달성하는 데 필요한 개별적으로, 예컨대 단일요법으로서 사용되는 각각의 작용제의 양 또는 용량보다 더 낮다(예컨대, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 또는 적어도 50% 더 낮음).
조작된 γδ T 세포 및 화학요법제는 추가의 치료적 처치, 예컨대 제한 없이 수술, 화학요법(예컨대, DR 세포가 저항성인 화학요법제와 상이한 추가 화학요법제), 체크포인트 억제제, PARP 억제제, 방사선, 면역억제제, 예컨대 사이클로스포린, 아자티오프린, 메토트렉세이트, 미코페놀레이트, 및 FK506, 항체, 또는 면역제거제, 예컨대 CAMPATH, 항-CD3 항체 또는 다른 항체 요법, 시톡신, 플루다라빈, FK506, 라파마이신, 미코페놀산, 스테로이드 및 시토카인과 조합하여 투여될 수 있다. 또 다른 추가 측면에서, 추가 치료제는, 예컨대 WO2018/035413(이의 내용은 명백히 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 바와 같은 체크포인트 억제제이다. 추가 측면에서, 추가 치료제는, 예컨대 WO 2020/097306(이의 내용은 명백히 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 바와 같은 PARP 억제제를 포함하지만 이에 제한되지 않는 DDR 억제제이다.
본 발명은 추가로 화학요법제 환경에서 종양 세포에 대한 클로로톡신(CLTX)-CAR γδ T 세포의 세포독성을 향상시키는 방법을 포괄하며, 방법은 적어도 2개의 CLTX 펩티드를 발현하고 임의적으로 생존 인자, 예컨대 본원에 기재된 바와 같은 화학요법제에 대해 저항성을 부여하는 폴리펩티드를 발현하도록 γδ T 세포를 조작하는 단계를 포함한다. 다가 CLTX-CAR γδ T 세포 또는 이의 조성물은 비교 가능한 sCLTX-CAR γδ T 세포 또는 이의 조성물보다 (생존 폴리펩티드가 저항성을 부여하는) 화학요법제 환경에서 종양 세포에 대해 향상된 세포독성을 갖는다. 본 발명은 또한 화학요법제 환경에서 종양 세포에 대한 클로로톡신(CLTX)-CAR γδ T 세포의 활성화(예컨대, CD69 활성화)를 향상시키는 방법을 포괄하며, 방법은 본원에 기재된 바와 같은 적어도 2개의 CLTX 펩티드 및 생존 폴리펩티드를 발현하도록 γδ T 세포를 조작하는 단계를 포함한다. 다가 CLTX-CAR γδ T 세포 또는 이의 조성물은 비교 가능한 sCLTX-CAR γδ T 세포 또는 이의 조성물보다 향상된 활성화를 갖는다.
본원에 개시된 조합 요법은, 예컨대 경구 또는 비경구를 포함하는 다양한 경로에 의해 환자에게 투여될 수 있고, 정맥내, 근육내, 피하, 안와내, 피막내, 복강내, 직장내, 수조내, 종양내, 혈관내, 피내, 질내(예컨대, 질 좌약), 또는 국소(예컨대, 산제, 경피 패치), 또는 각각 예컨대 피부 패치 또는 경피 이온삼투요법을 이용하여 피부를 통한 수동 또는 촉진 흡수에 의한 경로를 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다.
바람직하게는, 본 발명의 방법을 실시하는데 투여되는 작용제의 총 양은 볼루스로서 또는 상대적으로 짧은 기간에 걸친 주입에 의해 단일 용량으로 대상체에게 투여될 수 있거나, 장기간에 걸쳐 다중 용량이 투여되는 분할 치료 프로토콜을 이용하여 투여될 수 있다. 당업자는 대상체에서 병리학적 상태를 치료하기 위한 조성물의 양이 대상체의 연령 및 일반적인 건강 뿐만 아니라 투여 경로 및 투여될 치료 횟수를 포함하는 많은 요인에 의존한다는 것을 알 것이다. 이러한 요인을 고려하여 숙련된 기술자는 필요에 따라 특정 용량을 조정할 것이다.
본 발명의 약학 조성물은 의도된 투여 방법 또는 경로에 적합하도록 제형화될 수 있으며; 예시적인 투여 경로가 본원에 제시되어 있다. 또한, 약학 조성물은 본 개시내용에 의해 고려되는 질환, 장애 및 병태를 치료하거나 예방하기 위해 본원에 기재된 바와 같은 다른 치료학적 활성제 또는 화합물과 조합하여 사용될 수 있다.
약학 조성물은 전형적으로 치료학적 유효량의 본 발명의 조합 요법에 사용되는 하나 이상의 작용제 및 하나 이상의 약제학적 및 생리학적으로 허용되는 제형 작용제를 포함한다. 적합한 약학적으로 허용되거나 생리학적으로 허용되는 희석제, 담체 또는 부형제는 항산화제(예컨대, 아스코르브산 및 중황산나트륨), 보존제(예컨대, 벤질 알콜, 메틸 파라벤, 에틸 또는 n-프로필, p-히드록시벤조에이트), 유화제, 현탁제, 분산제, 용매, 충전제, 증량제, 세제, 버퍼, 비히클, 희석제 및 /또는 보조제를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 예컨대, 적합한 비히클은 아마도 비경구 투여를 위한 약학 조성물에서 통상적인 다른 물질로 보충된 생리학적 식염수 용액 또는 시트레이트된 완충 식염수일 수 있다. 중성 완충된 식염수 또는 혈청 알부민과 혼합된 식염수가 추가의 예시적인 비히클이다. 당업자는 본원에서 고려되는 약학 조성물 및 투여 형태에 사용될 수 있는 다양한 버퍼를 쉽게 인식할 것이다. 전형적인 버퍼는 약학적으로 허용되는 약산, 약염기 또는 이들의 혼합물을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 예로서, 버퍼 성분은 인산, 타르타르산, 락트산, 숙신산, 시트르산, 아세트산, 아스코르브산, 아스파르트산, 글루탐산 및 이들의 염과 같은 수용성 물질일 수 있다. 허용되는 완충제는, 예컨대 트리스 버퍼, N-(2-히드록시에틸)피페라진-N'-(2-에탄술폰산) (HEPES), 2-(N-모르폴리노)에탄술폰산(MES), 2-(N-모르폴리노)에탄술폰산 나트륨 염(MES), 3-(N-모르폴리노)프로판술폰산(MOPS) 및 N-트리스[히드록시 메틸]메틸-3-아미노프로판술폰산(TAPS)을 포함한다.
약학 조성물이 제형화된 후, 이는 용액, 현탁액, 겔, 에멀젼, 고체 또는 탈수된 또는 동결건조된 분말로서 멸균 바이알에 저장될 수 있다. 이러한 제형은 즉시 사용 가능한 형태, 사용 전에 재구성이 필요한 동결건조된 형태, 사용 전에 희석이 필요한 액체 형태 또는 다른 허용되는 형태로 저장될 수 있다. 바람직하게는, 약학 조성물은 일회용 용기(예컨대, 일회용 바이알, 앰플, 주사기 또는 자동주사기(예컨대, EpiPen®과 유사)에 제공되고, 다른 실시양태에서 다용도 용기(예컨대, 다용도 바이알)가 제공된다. 임플란트(예컨대, 삽입형 펌프) 및 카테터 시스템, 저속 주사 펌프 및 장치를 포함하는 임의의 약물 전달 장치가 IL-10을 전달하는 데 사용될 수 있으며, 이들 모두 숙련된 전문가에게 널리 공지되어 있다. 일반적으로 피하 또는 근육내로 투여되는 데포 주사가 또한 정의된 기간에 걸쳐 본원에 개시된 폴리펩티드를 방출하기 위해 활용될 수 있다. 데포 주사는 일반적으로 고체 또는 오일 기반이며, 일반적으로 본원에 설명된 제형 성분 중 적어도 하나를 포함한다. 당업자는 데포 주사의 가능한 제형 및 용도에 익숙하다.
약학 조성물은 멸균 주사용 수성 또는 유성 현탁액의 형태일 수 있다. 이 현탁액은 본원에 언급된 적절한 분산제 또는 습윤제 및 현탁제를 사용하여 공지 기술에 따라 제형화될 수 있다. 멸균 주사용 제제는 또한 비-독성의 비경구적으로 허용되는 희석제 또는 용매, 예컨대 1,3-부탄 디올 중의 멸균 주사용 용액 또는 현탁액일 수 있다. 사용될 수 있는 허용 가능한 희석제, 용매 및 분산 매질은 물, 링거 용액, 등장성 염화나트륨 용액, Cremophor EL™(BASF, 뉴저지주 파시파니) 또는 포스페이트 완충된 식염수(PBS), 에탄올, 폴리올(예컨대, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜), 및 이들의 적합한 혼합물을 포함한다. 또한, 멸균 고정유는 일반적으로 용매 또는 현탁 매질로 사용된다. 이를 위해 합성 모노- 또는 디글리세리드를 포함한 임의의 블랜드 고정유를 사용할 수 있다. 또한, 올레산과 같은 지방산은 주사제 제조에 사용된다. 특정 주사 가능한 제형의 장기간 흡수는 흡수를 지연시키는 작용제(예컨대, 알루미늄 모노스테아레이트 또는 젤라틴)를 포함함으로써 달성될 수 있다.
약학 조성물은, 예컨대 정제, 캡슐, 트로키, 로젠지, 수성 또는 유성 현탁액, 분산성 산제 또는 과립, 에멀젼, 경질 또는 연질 캡슐, 또는 시럽, 용액, 마이크로비드 또는 엘릭시르와 같은 경구 사용에 적합한 형태일 수 있다. 경구 사용이 의도된 약학 조성물은 약학 조성물의 제조에 대해 당업계에 공지된 임의의 방법에 따라 제조될 수 있으며, 이러한 조성물은 약학적으로 우아하고 맛좋은 제제를 제공하기 위해, 예컨대 감미제, 향미제, 착색제 및 보존제와 같은 하나 이상의 작용제를 함유할 수 있다. 정제, 캡슐 등은 정제 제조에 적합한 비-독성의 약학적으로 허용되는 부형제와 함께 활성 성분을 함유한다. 이러한 부형제는, 예컨대 탄산칼슘, 탄산나트륨, 락토스, 인산칼슘 또는 인산나트륨과 같은 희석제; 과립화제 및 붕해제, 예컨대 옥수수 전분 또는 알긴산; 결합제, 예컨대 전분, 젤라틴 또는 아카시아, 및 윤활제, 예컨대 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 또는 탈크일 수 있다.
경구 투여에 적합한 정제, 캡슐 등은 코팅되지 않거나 위장관에서의 붕해 및 흡수를 지연시켜 지속적인 작용을 제공하기 위해 공지된 기술에 의해 코팅될 수 있다. 예컨대, 글리세릴 모노스테아레이트 또는 글리세릴 디스테아레이트와 같은 시간 지연 물질이 사용될 수 있다. 이는 또한 제어 방출을 위한 삼투성 치료 정제를 형성하기 위해 당업계에 공지된 기술에 의해 코팅될 수 있다. 추가 작용제는 투여된 조성물의 전달을 제어하기 위해 폴리에스테르, 폴리아민산, 히드로겔, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리무수물, 폴리글리콜산, 에틸렌-비닐아세테이트, 메틸셀룰로스, 카르복시메틸셀룰로스, 프로타민 술페이트, 또는 락티드/글리콜리드 공중합체, 폴리락티드/글리콜리드 공중합체 또는 에틸렌비닐아세테이트 공중합체와 같은 생분해성 또는 생체적합성 입자 또는 중합체 물질을 포함한다. 예컨대, 경구 작용제는 각각 코아세르베이션 기술에 의해 또는 계면 중합화에 의해, 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 또는 폴리(메틸메타크롤레이트) 마이크로캡슐을 사용하여 제조된 마이크로캡슐 또는 콜로이드 약물 전달 시스템에 포획될 수 있다. 콜로이드 분산 시스템은 거대분자 복합체, 나노캡슐, 마이크로스피어, 마이크로비드 및 지질 기반 시스템(수중유 에멀젼, 미셀, 혼합 미셀 및 리포솜 포함)을 포함한다. 상기 언급된 제형의 제조 방법은 당업자에게 명백할 것이다.
경구용 제형은 또한 활성 성분이 불활성 고체 희석제, 예컨대 탄산칼슘, 인산칼슘, 카올린 또는 미정질 셀룰로스와 혼합된 경질 젤라틴 캡슐, 또는 활성 성분이 물 또는 오일 매질, 예컨대 땅콩유, 액체 파라핀 또는 올리브유와 혼합된 연질 젤라틴 캡슐로 제공될 수 있다.
수성 현탁액은 이의 제조에 적합한 부형제와 혼합된 활성 물질을 함유한다. 이러한 부형제는 현탁제, 예컨대 나트륨 카르복시메틸셀룰로스, 메틸셀룰로스, 히드록시-프로필메틸셀룰로스, 나트륨 아기네이트, 폴리비닐-피롤리돈, 트라가칸트 검 및 아카시아 검; 분산제 또는 습윤제, 예컨대 자연 발생 포스파티드(예컨대, 레시틴), 또는 알킬렌 옥사이드와 지방산의 축합 생성물(예컨대, 폴리옥시-에틸렌 스테아레이트), 또는 에틸렌 옥사이드와 장쇄 지방족 알콜의 축합 생성물(예컨대, 헵타데카에틸렌옥시세탄올), 또는 에틸렌 옥사이드와 지방산 및 헥시톨로부터 유도된 부분 에스테르의 축합 생성물(예컨대, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 모노올레이트), 또는 에틸렌 옥사이드와 지방산 및 헥시톨 무수물로부터 유도된 부분 에스테르의 축합 생성물(예컨대, 폴리에틸렌 소르비탄 모노올레이트)일 수 있다. 수성 현탁액은 또한 하나 이상의 보존제를 함유할 수 있다.
유성 현탁액은 식물성유, 예컨대 아라키스유, 올리브유, 참기름 또는 코코넛유, 또는 액체 파라핀과 같은 미네랄유에 활성 성분을 현탁시킴으로써 제형화될 수 있다. 유성 현탁액은 증점제, 예컨대 밀랍, 경질 파라핀 또는 세틸 알콜을 함유할 수 있다. 상술한 것과 같은 감미제 및 향미제를 첨가하여 입에 맞는 경구 제제를 제공할 수 있다.
물을 첨가하여 수성 현탁액을 제조하기에 적합한 분산성 분말 및 과립은 분산제 또는 습윤제, 현탁제 및 하나 이상의 보존제와 혼합된 활성 성분을 제공한다. 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁제가 본원에 예시된다.
약학 조성물은 또한 수중유 에멀젼의 형태일 수 있다. 유상은 식물성유, 예컨대 올리브유 또는 아라키스유, 또는 미네랄유, 예컨대 액체 파라핀, 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 적합한 유화제는 자연 발생 검, 예컨대 아카시아 검 또는 트라가칸트 검; 자연 발생 포스파티드, 예컨대 대두, 레시틴, 및 지방산으로부터 유도된 에스테르 또는 부분 에스테르; 헥시톨 무수물, 예컨대 소르비탄 모노올레이트; 및 부분 에스테르와 에틸렌 옥사이드의 축합 생성물, 예컨대 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레이트일 수 있다.
제형은 또한 임플란트, 리포솜, 히드로겔, 프로드럭 및 마이크로캡슐화된 전달 시스템을 포함하는 제어 방출 제형과 같은 신체로부터의 신속한 분해 또는 제거로부터 조성물을 보호하기 위한 담체를 포함할 수 있다. 예컨대, 글리세릴 모노스테아레이트 또는 글리세릴 스테아레이트와 같은 시간 지연 물질을 단독으로 또는 왁스와 함께 사용할 수 있다.
좌약은 상온에서는 고체이지만 직장 온도에서는 액체이므로 직장에서 녹아 약물을 방출하는 적합한 비-자극성 부형제와 약물을 혼합하여 제조될 수 있다. 이러한 물질은 코코아 버터 및 폴리에틸렌 글리콜을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따라 사용하기에 적합한 약학 조성물은 현재 공지되어 있거나 미래에 개발될 임의의 형식(예컨대, 비강 또는 흡입용 스프레이)일 수 있다.
본원에 기재된 치료 방법은 암 치료에 특히 적합하다. 암세포는 주변 조직을 침범할 수 있고 혈류 및 림프계를 통해 신체의 다른 부분으로 퍼질 수 있다. 암에는 몇 가지 주요 유형이 있으며, 예컨대 암종은 피부 또는 내부 기관을 따라 늘어서 있거나 이를 덮고 있는 조직에서 시작되는 암이다. 육종은 골, 연골, 지방, 근육, 혈관 또는 다른 결합 또는 지지 조직에서 시작되는 암이다. 백혈병은 골수와 같은 혈액 형성 조직에서 시작하여 많은 수의 비정상적인 혈액 세포가 생성되어 혈류로 들어가는 암이다. 림프종은 면역계의 세포에서 시작되는 암이다.
치료되는 암 내지 종양은 두개내 종양일 수 있다. 두개내 종양은 신경교종, 수막종, 청신경종, 뇌하수체 선종, 수모세포종, 생식 세포 종양 및 두개인두종을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
일부 측면에서, 본 발명에 따라 치료되는 암은 두개내 및 척수 상의종(뇌실막밑세포종 제외); 저등급 침윤성 천막위 성상세포종/희소돌기아교세포종, 수모세포종, 역형성 신경교종, 교모세포종, CNS의 전이성 병변 및 원발성 CNS 림프종을 포함하지만 이에 제한되지 않는 CNS 종양이다.
일부 측면에서, 치료되는 암은 흑색종이다. 바람직하게는 치료되는 암은 포도막 흑색종이다.
일부 측면에서, 치료되는 암은 신경내분비 또는 부신 종양이다. 예는 기관지폐 질환, GI관, 폐 또는 흉선, 췌장, 부신경절종 또는 크롬 친화성 세포종을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
일부 측면에서, 치료되는 암은 균상 식육종 및 세자리 증후군을 포함하지만 이에 제한되지 않는 비-호지킨 림프종이다.
일부 측면에서, 치료되는 암은 연조직 육종이다. 예는 혈관육종, 절제 불가능한 또는 진행성 복막뒤/복강내 연조직 육종, 횡문근육종, 사지/표면 몸통 및/또는 두경부암, 또는 고립성 섬유성 종양/혈관주위세포종을 포함한다.
일부 측면에서, 치료되는 암은 골암이다. 예는 유잉 육종 및 중간엽 연골육종을 포함한다.
일부 측면에서, 치료되는 암은 자궁 육종, 소세포 폐암(SCLC) 또는 졸링거-엘리슨 증후군이다.
일부 측면에서, 본 발명에 따라 치료되는 암은 난소암, 나팔관(들)의 암, 복막암 및 유방암을 포함하지만 이에 제한되지 않는 부인과 암(예컨대, 여성 생식계의 암)이다. 바람직하게는 본 발명에 따라 치료되는 암은 난소암이다.
일부 측면에서, 본 발명에 따라 치료되는 암은 교모세포종이다.
뇌종양은 뇌 내에서 광범위하게 퍼지지만 일반적으로 뇌 외부로 전이되지는 않는다. 신경교종은 뇌 내부에서 매우 침습적이며 심지어 반구를 가로지른다. 그러나, 이들은 통제되지 않는 방식으로 분열한다. 위치에 따라 악성 병변만큼 생명을 위협할 수 있다. 이에 대한 예는 뇌의 양성 종양일 수 있으며, 이는 두개골 내에서 성장하고 공간을 차지하여 뇌에 대한 압력 증가로 이어질 수 있다.
또한, 전형적으로 본원에 기재된 본 발명의 조합 요법에 사용되는 하나 이상의 작용제의 치료학적 유효량을 포함하는 약학 조성물을 포함하는 키트가 제공된다. 키트는 전형적으로 키트 내용물의 의도된 용도 및 사용 지침을 나타내는 라벨을 포함한다.
본원에 기재된 임의의 조성물 또는 조성물의 조합이 키트에 포함될 수 있다. 비제한적 예에서, 키메라 수용체 발현 구축물, 키메라 수용체 발현 구조물을 생성하기 위한 하나 이상의 시약, 발현 구축물의 형질감염을 위한 세포, 및/또는 발현 구축물의 형질감염을 위한 자가 세포를 수득하기 위한 하나 이상의 기구(이러한 기구는 주사기, 피펫, 겸자 및/또는 임의의 이러한 의학적으로 승인된 기구일 수 있음). 키트는 본 발명의 하나 이상의 적절하게 분취된 조성물 또는 본 발명의 조성물을 생성하기 위한 시약을 포함할 수 있다. 키트의 성분은 수성 매체 또는 동결 건조된 형태에 포장될 수 있다. 키트의 용기 수단은 적어도 하나의 바이알, 시험관, 플라스크, 병, 주사기 또는 성분이 배치될 수 있고 바람직하게는 적절하게 분취될 수 있는 다른 용기 수단을 포함할 수 있다. 키트에 하나 추가의 성분이 있는 경우, 키트는 또한 일반적으로 추가 성분을 별도로 넣을 수 있는 제2, 제3 또는 다른 추가 용기를 함유할 것이다. 그러나, 성분들의 다양한 조합이 바이알에 포함될 수 있다. 본 발명의 키트는 또한 전형적으로 키메라 수용체 구축물 및 임의의 다른 시약 용기를 상업적 판매를 위해 밀폐된 상태로 함유하기 위한 수단을 포함할 것이다. 이러한 용기는, 예컨대 원하는 바이알이 보유되는 사출 또는 취입 성형 플라스틱 용기를 포함할 수 있다.
키트는 일반적으로 하기에 기재된 바와 같이 다양한 성분을 수용하는 물리적 구조의 형태이고, 예컨대 상기 기재된 방법을 실행하는 데 활용될 수 있다. 키트는, 예컨대 하나 이상의 멸균 용기에 제공되는 본 발명의 조합 요법에 사용되는 하나 이상의 치료제(예컨대 조작된 γδ 세포)를 포함하는 조성물을 포함할 수 있으며, 이는 대상체에게 투여하기에 적합한 약학 조성물의 형태일 수 있다. 약학 조성물은 바로 사용할 수 있는 형태 또는, 예컨대 투여 전에 재구성 또는 희석을 필요로 하는 형태로 제공될 수 있다. 조성물이 사용자에 의해 재구성될 필요가 있는 형태인 경우, 키트는 또한 치료제와 함께 또는 별도로 포장된 버퍼, 약학적으로 허용되는 부형제 등을 포함할 수 있다. 조합 요법이 고려되는 경우, 키트는 여러 작용제를 별도로 함유하거나 이미 키트에서 조합될 수 있다.
본 발명의 키트는 그 안에 수용된 성분을 적절하게 유지하는데 필요한 조건(예컨대, 냉장 또는 냉동)을 위해 설계될 수 있다. 키트는 성분에 대한 확인 정보 및 사용 지침(예컨대, 투여 파라미터, 활성 성분(들)의 임상 약리학(작용 메커니즘(들) 포함), 약동학 및 약력학, 부작용, 금기 사항 등)을 포함하는 라벨 또는 포장 삽입물을 함유할 수 있다.
키트의 각각의 성분은 개별 용기 내에 포함될 수 있으며, 다양한 용기 모두가 단일 패키지 내에 포함될 수 있다. 라벨 또는 삽입물은 로트 번호 및 만료 날짜와 같은 제조자 정보를 포함할 수 있다. 라벨 또는 포장 삽입물은, 예컨대 성분을 수용하는 물리적 구조에 통합되거나 물리적 구조 내에 별도로 함유되거나 키트의 성분(예컨대, 앰플, 주사기 또는 바이알)에 부착될 수 있다.
라벨 또는 삽입물은 컴퓨터 판독 가능 매체, 예컨대 디스크(예컨대, 하드 디스크, 카드, 메모리 디스크), 광학 디스크, 예컨대 CD- 또는 DVD-ROM/RAM, DVD, MP3, 자기 테이프, 전자 저장 매체, 예컨대 RAM 및 ROM 또는 이들의 하이브리드, 예컨대 자기/광 저장 매체, FLASH 매체 또는 메모리 유형 카드를 추가로 포함하거나 이에 통합될 수 있다. 일부 실시양태에서, 실제 지침은 키트에 존재하지 않지만, 예컨대 인터넷 사이트를 통해 원격 공급원으로부터 지침을 얻기 위한 수단이 제공된다.
실시예
하기 실시예는 예시로서 제공되며 어떤 식으로든 청구된 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
실시예 1: γδ T 세포 약물 저항성 면역요법을 위한 dCLTX-CAR-MGMT 벡터의 개발
본 발명자들은 유전자 변형된 γδ T 세포의 동시 두개내 투여와 표준 테모졸로미드(TMZ) 유지 화학요법을 조합하여 원발성 GBM의 치료에 대한 새로운 접근법을 개발하였다. 이러한 γδ T 세포는 O-6-메틸구아닌-DNA 메틸트랜스퍼라제(MGMT)로 형질도입되어 알킬화 화학요법에 대한 저항성을 전달하여 종양 NKG2DL 발현이 상당히 상승될 때 TMZ의 치료 농도에서 이펙터 기능을 허용한다. 본 발명자들은 GBM 표적화를 개선하기 위해 클로로톡신 결합 도메인을 갖는 키메라 항원 수용체(CAR) (CLTX-CAR)를 발현하는 렌티벡터 구축물로 γδ T 세포를 변형시켰다. MGMTp140k는 동일한 CLTX-CAR 벡터 내에서 공동 발현되어 CAR-T 세포에 TMZ 저항성을 부여하였다. CLTX-CAR 벡터는 CD8α 신호 펩티드, 단일 또는 이중 CLTX 결합 도메인, Myc-Tag 펩티드, CD8α 힌지 도메인, CD28 막관통 도메인, 및 공자극 도메인에 이어 CD3ζ 활성화 도메인을 함유한다. 본 발명자들은 P2A 펩티드를 사용하여 MGMTp140k를 CAR과 공동 발현하였다. 먼저, 본 발명자들은 저캇 T 세포에서 결합 도메인으로 이중 CLTX 구축물(dCLTX-CAR)을 사용하여 CLTX-CAR의 효율적인 형질도입을 입증하였다. dCLTX-CAR의 세포 표면 국소화는 유동 세포측정에 의해 검증되었다. 모노-CLTX-CAR(sCLTX-CAR) 형질도입된 저캇-세포와 비교할 때, dCLTX-CAR은 증가된 CD69 활성화를 나타내었다(MFI= 4873 대 1078). dCLTX-CAR로 형질도입된 γδ T 세포는 sCLTX-CAR로 형질도입된 γδ T 세포와 비교하여 TMZ 노출 하에 시험관내에서 종양 세포에 대해 더 큰 세포독성을 나타낼 것으로 예상된다. γδ T 세포는 NKG2DL 스트레스 항원 인식을 통해 종양을 인식하고 사멸시키기 때문에, 본 발명자들은 활성화 신호가 없는 CLTX-CAR이 종양 세포에 대한 γδ T 세포의 인식 및 세포 독성을 향상시키고 CAR-T 활성화 유도된 세포사를 완화하기에 충분할 수 있다는 가설을 세웠다. 이어서, 본 발명자들은 CD3ζ 도메인이 없는 dCLTX-CAR 구축물(dCLTX-noZ-CAR)을 개발하였다. 예상대로, dCLTX-noZ-CAR 렌티바이러스 형질도입된 저캇-세포는 전체 dCLTX-CAR에 비해 향상된 세포-세포 결합을 나타내었지만 GBM 세포와 공동 배양했을 때 CD69 발현은 없었다. 전반적으로, 본 발명자들은 TMZ에 대해 저항성을 갖는 dCLTX-CAR T 세포를 생성할 수 있었고 TMZ 노출 하에서 GBM 세포에 대해 개선된 활성화를 나타내었다. dCLTX-CAR과 TMZ 저항성을 조합하는 본 발명자들의 접근법은 동물 모델 실험에서 추가로 검증될 것이며 GBM에 대한 임상 개발을 위한 잠재적인 후보가 될 수 있다.
dCLTX-CAR 구축물을 구축하기 위해, 인간 코돈 최적화된 CLTX, c-Myc 태그, P2A-EGFP, P2A-MGMTp140k 및 다른 CAR 도메인을 코딩하는 지블럭스(gblocks) 이중 가닥 DNA를 IDT DNA로 합성하고, 기브슨(Gibson) 어셈블리 클로닝 키트(New England Biolabs)를 통해 전달 플라스미드 pDL171에 클로닝하였다.
도 3은 저캇 세포에서 렌티바이러스 벡터를 사용한 dCLTX-CAR 및 마커 유전자의 공동-발현에 대한 유동 세포측정 분석을 나타낸다. c-Myc 태그는 CLTX의 대리 마커로 사용되며, dCLTX-CAR의 발현 및 세포 표면 국소화를 나타낸다. EGFP는 P2A 자가 절단 펩티드에 의해 CLTX-CAR과 함께 발현되는 마커 유전자이다.
도 4는 U251MG 세포와의 공동 배양 후 렌티바이러스 dCLTX-CAR 형질도입된 저캇 세포에서 CD69의 활성화를 나타낸다. EGFP, CLTX-EGFP, dCLTX-EGFP 및 dCLTX-MGMT를 코딩하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입된 저캇 세포를 U251MG 세포와 24시간 동안 공동 배양하고, CD69의 활성화를 유동 세포측정으로 측정하였다. 도 4는 세포외 항원 결합 도메인에 2개의 CLTX 펩티드를 포함하는 CAR로 형질도입된 T 세포(dCLTX-CAR 세포)가 세포외 항원 결합 도메인에 단일 CLTX 펩티드를 포함하는 세포(sCLTX-CAR γδ T 세포)에 비해 약 4.5배 더 큰 CD69 활성화를 보여주었음을 나타내었다. 2개의 CLTX 펩티드의 존재가 부가적이고 단일 CLTX 펩티드보다 더 큰, 예컨대 2배 더 큰 CD69 활성화를 초래할 것이라고 예측되었을 수 있지만, CAR에 단지 2개의 CLTX 펩티드의 존재가 단일 CLTX 펩티드를 갖는 비교 가능한 CAR보다 4배 초과로 더 큰 활성화를 초래하였다는 것은 놀라운 일이었다. 이 데이터는 세포외 항원 결합 도메인에서 다중 CLTX 펩티드가 T 세포 활성화에 상승 효과를 가지며 예상외로 더 큰 지속성을 나타내고 교모세포종 세포에 대해 더 큰 세포독성을 나타낸다는 것을 시사하였다. dCLTX-CAR에서 2개의 CLTX 펩티드는 짧은 펩티드, 특히 Flag 펩티드에 의해 분리되었다. 하기 도 9에 나타난 바와 같이, Flag 또는 myc 펩티드를 포함하는 1xCLTX 구축물을 제조한 경우, 1xCLTX-CAR은 펩티드/태그가 없는 CLTX-CAR보다 더 높은 CD69 활성화를 나타내었다. 이 데이터(도 9; 하기에서 더 자세히 논의함)는 증가된 CD69 활성화가 적어도 부분적으로 펩티드 링커(예컨대, FLAG/myc 태그)의 추가로 인한 것일 수 있음을 시사한다.
실시예 2: 다형 교모세포종(GBM)의 약물 저항성 면역요법을 위한 이중 클로로톡신 CAR(dCLTX-CAR/2xCLTX-CAR) 및 MGMT γδ T 세포
유동 세포측정 검정은 하기와 같이 수행되었다.
ㆍ 활성화
- 렌티바이러스로 형질도입된 저캇 T 세포를 U251 GBM 세포와 24시간 동안 공동 배양하고 항-CD69 항체로 염색함
ㆍ 지속성
- CLTX-CAR로 형질도입된 저캇 세포를 활성화시키고 ~3주 동안 배양하고, CAR+ T 세포%를 측정함
ㆍ 세포독성 검정
- 고효율(>60%)로 형질도입된 γδ T 세포를 U251-GFP 또는 U87-GFP 세포와 상이한 비율로 24-48시간 동안 공동 배양한 후, 아넥신 V 및 7-AAD로 염색함
CLTX-CAR 구축물은 잠재적으로 향상된 종양 표적화를 위해 단일 CLTX(1xCLTX) 또는 다중 CLTX 결합 도메인(예컨대, 2xCLTX-CAR/dCLTX-CAR)을 함유하였다. CAR-T 검출/농축을 위해 (표시된 바와 같이) Myc-태그 또는 Flag-태그를 포함하는 특정 구축물을 제조하였다. CD3ζ 신호전달 도메인을 포함하는 CLTX-CAR 구축물을 준비하였다. 또한, 활성화 유도된 세포사(AICD) 및 긴장성 신호전달의 완화를 위해 CD3ζ 신호전달 도메인이 없는("noZ" 또는 "CD3z 부재") CLTX-CAR 구축물도 제조되었다. 테모졸로미드(TMZ) 저항성을 부여하기 위한 O6-메틸구아닌-DNA 메틸-트랜스퍼라제(p140K-MGMT)의 공동 발현(DeltEx 약물 저항성 면역요법(DRI)). 도 5 내지 8에 나타낸 데이터는 단일 실험을 나타내고, 후속 실험은 유사한 결과를 나타내었다.
CLTX-CAR은 저캇 T 세포를 효율적으로 활성화한다: 저캇 T 세포는 세포외 myc 또는 flag 태그를 갖는 1x 및 2x CLTX-CAR의 렌티바이러스 벡터로 형질도입되었다. 태그가 없는 GFP 대조군 및 1xCLTX-CAR도 포함되었다. 도 5는 CLTX-CAR 구축물이 저캇 T 세포에서 최적화 및 시험되었고 2xCLTX-CAR이 저캇 T 세포를 효율적으로 활성화하였음을 나타낸다. 구체적으로, CD69는 형질도입된 CAR-T 세포에서 활성화되었지만 GFP 대조군 형질도입된 T 세포 또는 형질도입되지 않은 T 세포에서는 활성화되지 않았다. 또한, 세포외 태그(myc 또는 flag)를 갖는 CLTX-CAR이 태그가 없는 CLTX-CAR보다 더 높은 수준의 T 세포 활성화를 나타내는 것으로 관찰되었다. 도 9는 U251 교모세포종 세포와의 공동 배양이 1xCLTX-CAR 및 2xCLTX 저캇 T 세포를 활성화시켰고, 추가로 CD3z 신호전달 도메인이 없는(noZ) 1xCLTX-CAR 또는 2xCLTX-CAR 구축물로 형질도입된 저캇 T 세포가 U251 공동 배양 시 CD69 활성화를 나타내지 않음을 나타낸다. 태그 없이 1xCLTX-CAR로 형질도입된 저캇 T 세포는 형질도입되지 않은 세포와 비교하여 CD69의 적당한 활성화를 나타낸다. Flag 태그를 갖는 1xCLTX-CAR 또는 2xCLTX-CAR로 형질도입된 저캇 T 세포는 종양 세포와의 공동 배양 시 더 크게 상승된 CD69 활성화를 나타낸다.
더 긴 CAR-T 세포 지속성을 갖는 CLTX-CAR 구축물: 저캇 T 세포를 CD3z를 갖거나 갖지 않는 1x 및 2x CLTX-CAR로 형질도입하고, 활성화하고, 약 3주 동안 CAR-T 백분율에 대해 모니터링하였다. 도 6은 저캇 T 세포 지속성에 대한 2개의 CLTX-CAR 구축물의 효과를 나타낸다. CD3z가 없는 CLTX-CAR-T 세포는 CD3z를 갖는 CLTX-CAR-T 세포보다 지속성이 우수하다. 또한, T 세포 지속성은 1xCLTX-CAR에 비해 2xCLTX-CAR에서 개선되었다. 도 10은 저캇 T 세포 지속성에 대한 신호전달 도메인의 부재 뿐만 아니라 2xCLTX의 효과를 나타낸다. 신호전달 도메인을 갖지 않는 세포는 CD3z 신호전달 도메인을 갖는 비교 가능한 세포보다 더 큰 지속성을 가졌고, 2개의 CLTX 펩티드를 갖는 세포(이중 CLTX)는 단지 1개의 CLTX 펩티드를 갖는 비교 가능한 세포보다 더 큰 지속성을 나타내었다. 또한, 도 11 및 12는 신호전달 도메인이 결여된 1xCLTX 세포가 CD3z 신호전달 도메인을 갖는 비교 가능한 세포보다 더 큰 지속성을 가졌음을 나타내며; 구체적으로, 1xCTX-Flag-noZ-EGFP는 1xCTX-Flag-Z-EGFP 세포보다 더 큰 지속성을 나타내었다.
CLTX-CAR은 GBM 세포의 γδ T 세포 사멸을 향상시킨다: CLTX-CAR- γδ T 세포와 48시간 동안 공동 배양한 후, 세포독성의 유동 세포측정 분석을 위해 U251-GFP GBM 세포를 아넥신 V 및 7-AAD로 염색하였다. 도 8에 나타난 바와 같이, GBM 세포의 80% 초과가 CLTX-CAR- γδ T 세포와 공동 배양 시 아폽토시스를 겪거나 사멸되었으며, 이는 형질도입되지 않은 γδ T와 공동 배양 시 42.6%의 아폽토시스를 겪는 GBM 세포와 비교된다. 요약하면, 이러한 결과는 γδ T 세포에서 CLTX-CAR의 효율적인 형질도입 및 발현을 나타내며, 추가로 CLTX-CAR이 심지어 CD3z 공자극 도메인의 부재 하에서도 GBM 세포에 대한 γδ T의 세포독성을 향상시켰음을 나타낸다.
실시예 3: γδ 세포의 렌티바이러스 형질도입 및 CLTX-CAR-γδ T 세포의 세포독성
50% 초과의 γδ T를 갖는 γδ T 세포는 건강한 공여자 성분채집술 제품(Hemacare)으로부터 확장되었고, FBS(Cytiva HyClone), HEPES(Thermo Scientific), MEM NEAA(Cytiva HyClone), 나트륨 피루베이트(Gibco) 및 인간 rIL-12가 보충된 RPMI 배지(Cytiva HyClone)에서 배양되었다. 확장된 γδ T 세포를 CLTX-CAR 발현 렌티바이러스 벡터로 형질도입하고, 형질도입 효율 분석 및 세포독성 검정 전에 적어도 2일 동안 유지하였다. CLTX-γδ T 세포의 형질도입 효율은 γδ TCR 양성 및 Flag 양성 집단에 대해 게이팅된 유동 세포측정에 의해 측정되었다. 세포독성 검정을 위해, 대조군(γδ T 세포 NTC) 및 2xCLTX-CAR-noZ-γδ T 세포를 이펙터 대 표적(E/T) 비율 2:1 또는 4:1로 4시간 동안 현탁액 중의 U251 또는 U87 GBM 세포와 함께 공동 배양한 다음, 7-AAD로 염색하고, 유동 세포측정 분석을 수행하였다.
도 13은 2:1의 이펙터/표적(E/T) 및 4:1의 E/T에서의 공동 배양에서 GBM 세포에 결합하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입된 대조군 γδ T 세포(γδ T 세포 NTC) 및 2xCLTX-CAR-noZ-γδ T 세포의 현미경 사진을 나타낸다. CTLX-CAR γδ T 세포는 GBM 세포에 결합할 수 있었고, 구체적으로 2xCLTX-CAR-FLAG-noZ- γδ T 세포는 대조군 γδ T 세포보다 GBM 세포에 더 큰 결합을 나타내었다. 도 14는 2xCLTX-CAR-noZ-γδ T가 CD3z 신호전달 도메인 없이도 (CAR이 없는) 대조군 γδ T 세포보다 U87 교모세포종 세포에 대해 향상된 세포독성을 나타내었음을 나타낸다.
실시예 4: 2xCLTX-CAR-noZ γδ T 세포에 의한 U251-GFP GBM 세포의 연속 사멸
U251-GFP 세포는 GFP 발현 렌티바이러스 벡터로 형질도입된 U251MG GBM 세포주로부터 확립되었다. 렌티바이러스로 형질도입된 2xCLTX-CAR-noZ-γδ T 세포를 24웰 플레이트에서 U251-GFP GBM 세포와 공동 배양하고, EVOS 온스테이지 인큐베이터(Thermo Scientific)를 갖는 EVOS M5000 이미징 시스템을 사용하여 15시간 동안 1분마다 시간 경과 사진을 캡처하였다.
도 15는 저속 촬영 뮤비로부터의 일련의 정지 이미지를 나타내며, 2xCLTX-CAR-noZ γδ T 세포에 의한 U251MG GBM 세포의 연쇄 사멸을 나타낸다. 이미지에서 녹색 세포 (또는 회색 스케일로 표시되는 바와 같이 더 밝은 세포)는 종양 세포이다. 적색 화살표는 γδ T 세포가 시간 경과에 따라 상이한 종양 세포에 결합하여 사멸시키는 것을 나타낸다(이미지에서 T1, T2, T3, T4 및 T5 및 Kill-1, Kill-2, Kill-3, Kill-4 및 Kill-5 참조). 이미지는 시간 경과에 따라 촬영되었다(왼쪽에서 오른쪽으로, 이미지 사이의 화살표로 표시됨). 이는 단일 2xCLTX-CAR-noZ 변형된 γδ T 세포가 몇 시간 내에 5개 초과의 표적 GBM 세포에 결합, 분리 및 결국 사멸시킬 수 있었음을 나타낸다.
실시예 5: 3개 또는 4개의 CLTX 펩티드를 갖는 CAR은 세포 표면에 정상적으로 제시되지 않음
3개의 탠덤 CLTX 펩티드(3xCLTX-Z-EGFP) 또는 4개의 탠덤 CLTX 펩티드(4xCLTX-Z-EGFP)를 포함하는 CLTX-CAR-EGFP 구축물을 렌티바이러스 벡터에 패키징하고, 저캇 T 세포로 형질도입하였다(예컨대, 도 16 참조). 3xCLTX-Z-EGFP 또는 4xCLTX-Z-EGFP 저캇 T 세포를 U251 GBM 세포와 24시간 동안 공동 배양하고, 유동 세포측정으로 분석하였다.
도 17a-17c는 대조군(NTC) 세포, 3xCLTX-Z-EGFP 저캇 세포 및 4xCLTX-Z-EGFP 저캇 세포에 대한 항-Myc 모노클로날 항체를 사용한 세포 표면 염색의 유동 세포측정 분석을 나타내며, 또한 U251 GBM 세포와 함께 공동 배양한 후 임의의 CD69 활성화를 나타낸다. 세포는 또한 GFP에 대해 게이팅된다. 도 17b 및 17c는 3xCLTX 및 4xCLTX CAR이 높은 GFP+ 집단으로 3x 및 4x CLTX-CAR 렌티벡터로 효율적으로 형질도입되지만 CLTX-CAR은 세포 표면에 정상적으로 제시되지 않는다는 것을 나타낸다(GFP+이지만 Myc+는 아님). 또한, 형질도입된 저캇 세포(GFP+)로부터 CD69 활성화 상태에 변화가 없으며, 이는 세포 표면에서 기능적 CAR 발현이 없음을 나타낸다.
본 발명은 특히 이의 바람직한 실시양태를 참조하여 도시되고 설명되었지만, 첨부된 청구범위에 의해 포괄되는 본 발명의 범위를 벗어남이 없이 형태 및 세부 사항에 있어 다양한 변화가 이루어질 수 있음을 당업자는 이해할 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> IN8bio, Inc. DING, Lei LAMB, Lawrence S. Jr. <120> Multivalent Chlorotoxin Chimeric Antigen Receptors <130> 4226.3007 WO <140> PCT/US22/13130 <141> 2022-01-20 <150> US63/172,247 <151> 2021-04-08 <150> US63/139,709 <151> 2021-01-20 <160> 15 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 36 <212> PRT <213> Leiurus quinquestriatus <400> 1 Met Cys Met Pro Cys Phe Thr Thr Asp His Gln Met Ala Arg Lys Cys 1 5 10 15 Asp Asp Cys Cys Gly Gly Lys Gly Arg Gly Lys Cys Tyr Gly Pro Gln 20 25 30 Cys Leu Cys Arg 35 <210> 2 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu 1 5 10 <210> 3 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FLAG <400> 3 Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 1 5 <210> 4 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly 1 5 10 15 Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr 20 25 30 Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys 35 40 45 Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys 50 55 60 Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg 65 70 75 80 Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala 85 90 95 Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 100 105 110 <210> 5 <211> 42 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Ala Leu Tyr Leu Leu Arg Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala His 1 5 10 15 Lys Pro Pro Gly Gly Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln 20 25 30 Ala Asp Ala His Ser Thr Leu Ala Lys Ile 35 40 <210> 6 <211> 41 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr 1 5 10 15 Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro 20 25 30 Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser 35 40 <210> 7 <211> 42 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met 1 5 10 15 Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe 20 25 30 Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu 35 40 <210> 8 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial linker <400> 8 Ser Gly Gly Gly 1 <210> 9 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial linker <400> 9 Ser Gly Gly Gly Gly 1 5 <210> 10 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial linker; repeated n number of times, wherein n is 1-10 <400> 10 Ser Gly Gly Gly 1 <210> 11 <211> 24 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu 1 5 10 15 Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys 20 <210> 12 <211> 27 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu 1 5 10 15 Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val 20 25 <210> 13 <400> 13 000 <210> 14 <211> 13 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 14 Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly 1 5 10 <210> 15 <211> 9 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 15 Glu Gly Met Ile Asp Gly Trp Tyr Gly 1 5

Claims (83)

  1. 다가 CLTX 키메라 항원 수용체(CLTX-CAR)를 발현하는 조작된 γδ T 세포로서, γδ T 세포는 생존 인자를 발현하고, 생존 인자는 화학요법제에 대해 저항성을 부여하는 DNA, RNA, 또는 폴리펩티드이고, 추가로
    a. 다가 CLTX-CAR은
    i. 링커 펩티드에 의해 부착된 적어도 2개의 CLTX 펩티드를 포함하는 세포외 항원 결합 도메인;
    ii. 막관통 도메인; 및
    iii. 막관통 도메인을 세포외 항원 결합 도메인에 부착시키는 세포외 힌지 도메인; 및
    iv. 임의적으로, 세포내 신호전달 도메인; 및
    v. 임의적으로, 공자극 도메인
    을 포함하는, 조작된 γδ T 세포.
  2. 제1항에 있어서, 생존 인자가 화학요법제에 대해 저항성을 부여하는 폴리펩티드인 γδ T 세포.
  3. 제2항에 있어서, 화학요법제에 대해 저항성을 부여하는 폴리펩티드가 알킬 구아닌 트랜스퍼라제(AGT), O6 메틸구아닌 DNA 메틸트랜스퍼라제(MGMT), P140K MGMT, L22Y-DHFR, 티미딜레이트 신타제, 디히드로폴레이트 리덕타제, 다중 약물 저항성-1 단백질(MDR1), 5' 뉴클레오티다제 II, 디히드로폴레이트 리덕타제, 및 티미딜레이트 신타제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 γδ T 세포.
  4. 제3항에 있어서, 화학요법제에 대해 저항성을 부여하는 폴리펩티드가 MGMT 또는 P140K MGMT인 γδ T 세포.
  5. 제1항에 있어서, 생존 인자가 화학요법제에 대해 저항성을 부여하는 DNA인 γδ T 세포.
  6. 제1항에 있어서, 생존 인자가 화학요법제에 대해 저항성을 부여하는 RNA인 γδ T 세포.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 막관통 도메인이 CD28 막관통 도메인을 포함하는 것인 γδ T 세포.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드 링커가 30개 이하의 아미노산 길이인 γδ T 세포.
  9. 제8항에 있어서, 펩티드 링커가 15개 미만의 아미노산 길이인 γδ T 세포.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 세포내 신호전달 도메인이 존재하는 것인 γδ T 세포.
  11. 제10항에 있어서, 세포내 신호전달 도메인이 CD3 제타 신호전달 도메인을 포함하는 것인 γδ T 세포.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 힌지 도메인이 CD8a, CD28, CD137, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질의 힌지 영역인 γδ T 세포.
  13. 제12항에 있어서, 힌지 도메인이 CD8의 힌지 영역을 포함하는 것인 γδ T 세포.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 공자극 도메인이 존재하고 CD28 및 4-1BB 공자극 도메인, 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 것인 γδ T 세포.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 세포외 도메인이 세포외 신호 펩티드를 추가로 포함하는 것인 γδ T 세포.
  16. 제15항에 있어서, 신호 펩티드가 CD8a, CD28, GM-CSF, CD4, CD137, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질의 신호 펩티드인 γδ T 세포.
  17. 제16항에 있어서, 신호 펩티드가 CD8a 신호 펩티드인 γδ T 세포.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 링커 펩티드가 c-myc인 γδ T 세포.
  19. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 링커 펩티드가 FLAG인 γδ T 세포.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 세포외 항원 결합 도메인이 단지 2개의 CLTX 펩티드를 포함하는 것인 γδ T 세포.
  21. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 세포외 항원 결합 도메인이 단지 3개의 CLTX 펩티드를 포함하는 것인 γδ T 세포.
  22. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 세포외 항원 결합 도메인이 단지 4개의 CLTX 펩티드를 포함하는 것인 γδ T 세포.
  23. 제1항에 있어서, 세포외 항원 결합 도메인이 단지 2개의 CLTX 펩티드를 포함하고, 생존 펩티드가 MGMT 또는 P140K MGMT인 γδ T 세포.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 화학요법제가 알킬화제인 γδ T 세포.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 화학요법제가 트리메토트렉세이트, 테모졸로미드, 랄티트렉세드, S-(4-니트로벤질)-6-티오이노신, 6-벤지구아니딘, 니트로소우레아, 포테무스틴, 시타바린, 및 캄프토테신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 γδ T 세포.
  26. 제1항에 있어서, 세포외 항원 결합 도메인이 단지 2개의 CLTX 펩티드를 포함하는 것인 γδ T 세포.
  27. 제26항에 있어서, CLTX-CAR이 세포내 신호전달 도메인을 포함하지 않는 것인 γδ T 세포.
  28. 제26항 또는 제27항에 있어서, 생존 인자가 화학요법제에 대해 저항성을 부여하는 폴리펩티드인 γδ T 세포.
  29. 제28항에 있어서, 화학요법제에 대해 저항성을 부여하는 폴리펩티드가 알킬 구아닌 트랜스퍼라제(AGT), O6 메틸구아닌 DNA 메틸트랜스퍼라제(MGMT), P140K MGMT, L22Y-DHFR, 티미딜레이트 신타제, 디히드로폴레이트 리덕타제, 다중 약물 저항성-1 단백질(MDR1), 5' 뉴클레오티다제 II, 디히드로폴레이트 리덕타제, 및 티미딜레이트 신타제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 γδ T 세포.
  30. 제29항에 있어서, 화학요법제에 대해 저항성을 부여하는 폴리펩티드가 MGMT 또는 P140K MGMT인 γδ T 세포.
  31. 약학적으로 허용되는 부형제 및 유효량의 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항의 조작된 γδ T 세포를 포함하는 약학 조성물.
  32. 제31항에 있어서, γδ T 세포가 유동 세포측정으로 측정 시 조성물의 총 생존 세포 집단의 약 60% 이상인 약학 조성물.
  33. 제31항에 있어서, αβ T 세포가 유동 세포측정으로 측정 시 조성물의 총 생존 세포 집단의 약 5% 미만인 약학 조성물.
  34. 암 또는 종양의 치료를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항의 조작된 γδ T 세포를 포함하는 조성물 또는 제31항 내지 제33항 중 어느 한 항의 조성물을 투여하는 단계를 포함하고, 상기 대상체에게 화학요법제를 암 또는 종양 세포에서 스트레스 항원 발현을 증가시키기에 충분한 양으로 공동 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 상기 대상체에서 암 또는 종양을 치료하는 것인 방법.
  35. 제34항에 있어서, 종양이 두개내/두개외 종양인 방법.
  36. 제34항에 있어서, 종양이 신경교종인 방법.
  37. 제34항에 있어서, 신경교종이 교모세포종인 방법.
  38. 제34항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 조작된 γδ T 세포가 두개내로 투여되는 것인 방법.
  39. 제34항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 스트레스 항원이 NKG2DL인 방법.
  40. 제34항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 화학요법제가 알킬화제인 방법.
  41. 제34항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 화학요법제가 트리메토트렉세이트, 테모졸로미드, 랄티트렉세드, S-(4-니트로벤질)-6-티오이노신, 6-벤지구아니딘, 니트로소우레아, 포테무스틴, 시타바린, 캄프토테신, 독소루비신, 및 멜팔란으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  42. 제41항에 있어서, 화학요법제가 테모졸로미드(TMZ)인 방법.
  43. 제34항에 있어서, 조작된 γδ T 세포가 비교 가능한 sCLTX-CAR γδ T 세포와 비교하여 종양 세포에 대해 향상된 세포독성을 갖는 것인 방법.
  44. 제34항에 있어서, 조작된 γδ T 세포가 비교 가능한 sCLTX-CAR γδ T 세포와 비교하여 향상된 활성화를 나타내는 것인 방법.
  45. 제43항에 있어서, 향상된 세포독성이 비교 가능한 sCLTX-CAR γδ T 세포의 세포독성으로부터 예측되는 것과 비교하여 부가적인 것을 초과하는 것인 방법.
  46. 제44항에 있어서, 향상된 활성화가 비교 가능한 sCLTX-CAR 감마 델타 T 세포의 세포독성으로부터 예측되는 것과 비교하여 부가적인 것을 초과하는 것인 방법.
  47. 제41항에 있어서, 세포외 항원 결합 도메인이 단지 2개의 CLTX 펩티드를 포함하고, 향상된 활성화가 비교 가능한 sCLTX-CAR 감마 델타 T 세포의 세포독성으로부터 예측되는 것보다 3배 이상 더 큰 것인 방법.
  48. 제34항에 있어서, 조작된 γδ T 세포가 비교 가능한 sCLTX-CAR γδ T 세포와 비교하여 향상된 지속성을 갖는 것인 방법.
  49. 제48항에 있어서, 조작된 γδ T 세포가 세포내 신호전달 도메인을 포함하지 않는 것인 방법.
  50. 제43항에 있어서, 조작된 γδ T 세포가 비교 가능한 sCLTX-CAR γδ T 세포와 비교하여 향상된 지속성을 갖는 것인 방법.
  51. 제43항에 있어서, 조작된 γδ T 세포가 세포내 신호전달 도메인을 포함하지 않는 것인 방법.
  52. 화학요법제로 치료를 받고 있는 대상체에서 종양 세포에 대한 CTX-CAR γδ T 세포의 세포독성을 향상시키는 방법으로서, 방법은 적어도 2개의 CLTX 펩티드 및 생존 인자를 발현하도록 γδ T 세포를 조작하는 단계를 포함하고, 생존 인자는 화학요법제에 대해 저항성을 부여하는 DNA, RNA 또는 폴리펩티드이고, γδ T 세포는 CLTX-CAR 및 생존 인자의 발현을 지시하는 단일 벡터를 포함하고, 추가로
    a. CLTX-CAR은
    i. 링커 펩티드에 의해 부착된 적어도 2개의 CLTX 펩티드를 포함하는 세포외 항원 결합 도메인;
    ii. 막관통 도메인; 및
    iii. 막관통 도메인을 세포외 항원 결합 도메인에 부착시키는 세포외 힌지 도메인;
    iv. 임의적으로, 세포내 신호전달 도메인; 및
    v. 임의적으로, 공자극 도메인
    을 포함하는, 종양 세포에 대한 CTX-CAR γδ T 세포의 세포독성을 향상시키는 방법.
  53. 제52항에 있어서, 생존 인자가 화학요법제에 대해 저항성을 부여하는 폴리펩티드인 방법.
  54. 제52항에 있어서, CLTX-CAR이 단지 2개의 CLTX 펩티드를 포함하는 것인 방법.
  55. 제52항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, CLTX-CAR이 세포내 신호전달 도메인을 포함하지 않는 것인 방법.
  56. 화학요법제로 치료를 받고 있는 대상체에서 종양 세포에 대한 CTX-CAR γδ T 세포의 활성화를 향상시키는 방법으로서, 방법은 적어도 2개의 CLTX 펩티드 및 생존 인자를 발현하도록 γδ T 세포를 조작하는 단계를 포함하고, 생존 인자는 폴리펩티드에 대해 저항성을 부여하는 DNA, RNA, 또는 폴리펩티드이고, γδ T 세포는 CLTX-CAR 및 생존 인자의 발현을 지시하는 단일 벡터를 포함하고, 추가로
    a. CLTX-CAR은
    i. 링커 펩티드에 의해 부착된 적어도 2개의 CLTX 펩티드를 포함하는 세포외 항원 결합 도메인;
    ii. 막관통 도메인; 및
    iii. 막관통 도메인을 세포외 항원 결합 도메인에 부착시키는 세포외 힌지 도메인;
    iv. 임의적으로, 세포내 신호전달 도메인; 및
    v. 임의적으로, 공자극 도메인
    을 포함하는, 종양 세포에 대한 CTX-CAR γδ T 세포의 활성화를 향상시키는 방법.
  57. 제45항에 있어서, 생존 인자가 화학요법제에 대해 저항성을 부여하는 폴리펩티드인 방법.
  58. 제45항 또는 제46항에 있어서, 활성화가 CD69 활성화인 방법.
  59. 제56항에 있어서, CLTX-CAR이 단지 2개의 CLTX 펩티드를 포함하는 것인 방법.
  60. 화학요법제로 치료를 받고 있는 대상체에서 CLTX-CAR γδ T 세포의 지속성을 향상시키는 방법으로서, 방법은 적어도 2개의 CLTX 펩티드 및 생존 인자를 발현하도록 γδ T 세포를 조작하는 단계를 포함하고, 생존 인자는 폴리펩티드에 대해 저항성을 부여하는 DNA, RNA, 또는 폴리펩티드이고, γδ T 세포는 CLTX-CAR 및 생존 인자의 발현을 지시하는 단일 벡터를 포함하고, 추가로
    a. CLTX-CAR은
    i. 링커 펩티드에 의해 부착된 적어도 2개의 CLTX 펩티드를 포함하는 세포외 항원 결합 도메인;
    ii. 막관통 도메인; 및
    iii. 막관통 도메인을 세포외 항원 결합 도메인에 부착시키는 세포외 힌지 도메인;
    iv. 임의적으로, 세포내 신호전달 도메인; 및
    v. 임의적으로, 공자극 도메인
    을 포함하는, CLTX-CAR γδ T 세포의 지속성을 향상시키는 방법.
  61. 제60항에 있어서, 생존 인자가 화학요법제에 대해 저항성을 부여하는 폴리펩티드인 방법.
  62. 제60항에 있어서, CLTX-CAR이 단지 2개의 CLTX 펩티드를 포함하는 것인 방법.
  63. 제60항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, CLTX-CAR이 세포내 신호전달 도메인을 포함하지 않는 것인 방법.
  64. 다가 CLTX-CAR을 코딩하는 핵산으로서, 다가 CLTX-CAR이
    i. 링커 펩티드에 의해 부착된 적어도 2개의 CLTX 펩티드를 포함하는 세포외 항원 결합 도메인;
    ii. 막관통 도메인; 및
    iii. 막관통 도메인을 세포외 항원 결합 도메인에 부착시키는 세포외 힌지 도메인; 및
    iv. 임의적으로, 세포내 신호전달 도메인; 및
    v. 임의적으로, 공자극 도메인
    을 포함하는 핵산.
  65. 제64항에 있어서, 핵산이 생존 인자를 추가로 코딩하고, 생존 인자는 화학요법 약물에 대해 저항성을 부여하는 DNA, RNA, 또는 폴리펩티드인 핵산.
  66. 제65항에 있어서, 생존 인자가 화학요법 약물에 대해 저항성을 부여하는 폴리펩티드인 핵산.
  67. 제66항에 있어서, 폴리펩티드가 알킬 구아닌 트랜스퍼라제(AGT), O6 메틸구아닌 DNA 메틸트랜스퍼라제(MGMT), P140K MGMT, L22Y-DHFR, 티미딜레이트 신타제, 디히드로폴레이트 리덕타제, 다중 약물 저항성-1 단백질(MDR1), 5' 뉴클레오티다제 II, 디히드로폴레이트 리덕타제, 및 티미딜레이트 신타제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 핵산.
  68. 제64항에 있어서, 폴리펩티드가 MGMT 또는 P140K MGMT인 핵산.
  69. 제64항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 막관통 도메인이 CD28 막관통 도메인을 포함하는 것인 핵산.
  70. 제64항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 세포내 신호전달 도메인이 CD3 제타 신호전달 도메인을 포함하는 것인 핵산.
  71. 제64항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 힌지 도메인이 CD8, CD28, CD137, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질의 힌지 영역인 핵산.
  72. 제71항에 있어서, 힌지 도메인이 CD8의 힌지 영역을 포함하는 것인 핵산.
  73. 제64항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 공자극 도메인이 CD28 및 4-1BB 공자극 도메인 중 하나 이상인 핵산.
  74. 제64항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 세포외 도메인이 세포외 신호 펩티드를 추가로 포함하는 것인 핵산.
  75. 제74항에 있어서, 신호 펩티드가 CD8, CD28, GM-CSF, CD4, CD137, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질의 신호 펩티드인 핵산.
  76. 제74항에 있어서, 신호 펩티드가 CD8a 신호 펩티드인 핵산.
  77. 제64항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 링커 펩티드가 c-myc인 핵산.
  78. 제64항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 링커 펩티드가 FLAG인 핵산.
  79. 제64항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 세포외 항원 결합 도메인이 단지 2개의 CLTX 펩티드를 포함하는 것인 핵산.
  80. 제64항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 세포외 항원 결합 도메인이 단지 3개의 CLTX 펩티드를 포함하는 것인 핵산.
  81. 제64항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 세포외 항원 결합 도메인이 단지 4개의 CLTX 펩티드를 포함하는 것인 핵산.
  82. 제64항에 있어서, 세포외 도메인이 2개의 CLTX 펩티드를 포함하고, 화학요법제에 대해 저항성을 부여하는 폴리펩티드가 MGMT인 핵산.
  83. 제64항 또는 제79항에 있어서, CTLX-CAR이 세포내 신호전달 도메인을 포함하지 않는 것인 핵산.
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