JP2024503507A - 多価クロロトキシンキメラ抗原受容体 - Google Patents

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Abstract

多価CLTX-CARを発現し、生存因子も発現するγδT細胞、多価CLTX-CARおよび生存因子を発現するγδT細胞の集団、その医薬組成物、ならびに被験体に、多価CLTX-CARγδT細胞の有効量を投与する工程および化学療法剤、例えば生存因子が耐性を付与する化学療法剤を共投与する工程を含む、被験体において癌または腫瘍を治療する方法が記載される。

Description

関連出願
本願は、2021年1月20日に出願された米国仮出願第63/139,709号および2021年4月8日に出願された米国仮出願第63/172,247号の利益を主張する。上記出願の全内容は、参照により本明細書に援用される。
発明の背景
キメラ抗原受容体(CAR)は、細胞外腫瘍認識/標的化ドメイン、細胞外リンカー/ヒンジドメイン、膜貫通ドメインならびに細胞内T細胞活性化および共刺激性シグナル伝達ドメインで構成される。CAR腫瘍標的化ドメインの大部分は、特定の抗原に結合する抗体の特異性を利用する、抗体配列由来の一本鎖可変断片(scFv)である。例えば、抗CD19標的化CAR KYMRIAHTMおよびYESCARTATMは、急性リンパ芽球性白血病(ALL)およびびまん性大B細胞リンパ腫のそれぞれの治療について承認された治療であり、マウス抗ヒトCD19抗体由来のscFvを含む(Guedan et al. (2019), Mol Ther Methods Clin Dev 12:145-156)。
それらのそれぞれの内容が参照により本明細書に明白に援用されるWO2018107134およびWO2017066481には、細胞外抗原結合ドメインとしてクロロトキシン(CLTX)を含むキメラ抗原受容体が記載される。CLTXは、多形グリア芽腫(GBM)上のマトリクスメタロプロテイナーゼ2(MMP2)および塩化物チャンネルCLCN3の改変された発現を特異的に標的化するサソリ毒由来の小さな天然のペプチドである。CLTXはまた、特に黒色腫、小細胞肺癌、神経芽腫、乳癌、腎臓癌、肝臓癌、肺癌、卵巣癌および髄芽腫に結合する。クロロトキシンの一次構造は、8個のシステインを含む36アミノ酸を含み、短鎖ジスルフィド含有ペプチドとして分類される。WO2018107134には具体的に、クロロトキシンを発現するように遺伝子工学で作り変えられたガンマデルタ(γδ)T細胞が記載される。
ガンマデルタ(γδ)T細胞は、Tリンパ球が抗原誘導(antigen priming)または主要組織適合性複合体(MHC)分子の存在なしで広範囲の抗原を認識し得るような、Tリンパ球の重要なサブセットである。それらは、それらの細胞傷害活性を介して直接的にまたは他の免疫細胞型の活性化を介して間接的に細胞を標的化して殺傷し得る。γδT細胞の機能的応答は、サイトカイン産生を促進して、ストレス(例えば化学療法剤環境)に応答して病原体クリアランス、炎症および組織ホメオスタシスを制御するストレス抗原の認識などのいくつかの要因により誘導される。γδT細胞の腫瘍に対する細胞傷害性は、腫瘍細胞上のナチュラルキラーグループ2Dリガンド(NKG2DL)などの細胞表面受容体の発現を介して誘導され得る。
免疫療法における最近の進歩は、頭蓋外腫瘍の治療において見込みを示すが、GBMは、15カ月未満の一致したメジアン生存を有して、これらの進歩を受け付けないままである。GBMならびに他の液体および固形の癌および腫瘍についてのさらなる治療および具体的にさらなるCAR T細胞治療のための分野において、必要性が残る。
発明の概要
本発明は、少なくとも部分的に、細胞外抗原結合ドメイン内に2つのCLTXペプチドを含むCARを形質導入されたγδT細胞が、単一のCLTXペプチドを有する同等の細胞と比較して、グリア芽腫(GBM)細胞に対して増加した持続性および増加した細胞傷害性を示すという驚くべき発見に基づく。エンドドメイン内に細胞が細胞内シグナル伝達ドメインを含まない場合にも、増加した細胞傷害性が観察された。また、2つより多くのCLTXペプチド(例えば3つ以上(three of more)のCLTXペプチド)によるT細胞の形質導入は、活性化を高めずに、細胞表面上に適切または機能的に提示されないCARを生じたことが示される。また、本発明は少なくとも部分的に、細胞外抗原結合ドメイン内に2つのCLTXペプチドを含むCARを形質導入したT細胞(dCLTX-CAR細胞)は、細胞外抗原結合ドメイン内に単一のCLTXペプチドを含む細胞(sCLTX-CARγδT細胞)と比較して、2倍より高いCD69活性化を示したという驚くべき発見に基づく。2つのCLTXペプチドの存在は、相加的であり、単一のCLTXペプチドよりも高い、例えば2倍高いCD69活性化を生じることが予想され得たが、CAR中の2つのみのCLTXペプチドの存在は、単一のCLTXペプチドを有する同等のCARよりも、2倍より高い活性化を生じたことは驚くべきことである。このデータは、細胞外抗原結合ドメイン中の複数のCLTXペプチド(2つのCLTXペプチド)の存在は、T細胞活性化に対して相乗的な効果を有し、予期せずに、グリア芽腫細胞に対してより高い持続性およびより高い細胞傷害性を示すことを示唆する。
本発明は、多価CLTX-CAR(細胞外抗原結合ドメイン中に1つより多くのCTLXペプチドを含むCAR)を発現し、生存因子も発現するγδT細胞、ここで該生存因子は、化学療法剤に対する耐性を付与するDNA、RNAまたはポリペプチドである、多価CLTX-CARおよび生存因子を発現するγδT細胞の集団、多価CLTX-CARγδT細胞を含む医薬組成物、ならびに有効量の多価CLTX-CARγδT細胞を投与し、化学療法剤、例えば生存因子が耐性を付与する化学療法剤を共投与する工程を含む、被験体において癌または腫瘍を治療する方法を包含する。多価CLTX-CARは好ましくは、細胞外抗原結合ドメイン中に2つのCLTXペプチドを含む。2つのCLTXペプチドを含むCLTX-CARは、本明細書において「二価CLTX-CAR」または「二重CLTX-CAR」または「dCLTX-CAR」(これらの用語は本明細書において交換可能に使用される)と称され得る。ある局面において、多価CLTX-CAR(例えばdCLTX-CAR)は、細胞内シグナル伝達ドメインを含まない。
本発明は、多価CLTXキメラ抗原受容体(多価CLTX-CAR)および生存因子を発現する遺伝子工学で作り変えられたγδT細胞を含み、ここで該生存因子は、化学療法剤に対する耐性を付与するDNA、RNAまたはポリペプチドであり、該γδT細胞は、多価CLTX-CARおよび生存因子の発現を方向づける単一のベクターを含み、さらに：
a. 該多価CLTX-CARは：
i. 以下のペプチド：CLTXペプチド、CLTX様ポリペプチドおよびCLTXペプチドの機能性バリアント(それらの組合せを含む)の少なくとも2つを含む細胞外抗原結合ドメイン、
ここで該少なくとも2つのCLTXペプチド、CLTX様ポリペプチドおよびCLTXペプチドの機能性バリアントまたはそれらのいずれかの組み合わせは、リンカーペプチドにより取り付けられ；任意に該リンカーペプチドは30アミノ酸長未満または15アミノ酸長である；
ii. 膜貫通ドメイン；
iii. 膜貫通ドメインを細胞外抗原結合ドメインに取り付ける任意の細胞外ヒンジドメイン；
iv. 任意の細胞内シグナル伝達ドメイン；ならびに
v. 任意に共刺激性ドメイン
を含む。ある局面において、多価CLTX-CARは、CLTXペプチド、CLTX様ポリペプチド、CLTXペプチドの機能性バリアントおよびそれらの組み合わせからなる群より選択される2つのペプチドを含む。
特定の態様において、本発明は、多価CLTXキメラ抗原受容体(多価CLTX-CAR)および生存因子を発現する遺伝子工学で作り変えられたγδT細胞に関し、該生存因子は、化学療法剤に対する耐性を付与するポリペプチドであり、γδT細胞は、多価CLTX-CARおよび生存因子の発現を方向づける単一のベクターを含み、さらに：
a. 該多価CLTX-CARは：
i. 少なくとも2つのCLTXペプチドを含む細胞外抗原結合ドメイン、ここで該少なくとも2つのCLTXペプチドはリンカーペプチドにより取り付けられ；任意に該リンカーペプチドは、30アミノ酸長未満または15アミノ酸長である；
ii. 膜貫通ドメイン；
iii. 膜貫通ドメインを細胞外抗原結合ドメインに取り付ける任意の細胞外ヒンジドメイン；
iv. 任意に、細胞内シグナル伝達ドメイン；および
v. 任意に、共刺激性ドメイン
を含む。
本発明はまた、本明細書に記載される遺伝子工学で作り変えられたγδT細胞の集団を包含する。ある局面において、多価CLTX-CARは、細胞外抗原結合ドメイン中に2つのCLTXペプチドを含む。ある局面において、多価CLTX-CAR(例えばdCLTX-CAR)は、細胞内シグナル伝達ドメインを含まない。特定のさらなる局面において、リンカーペプチドは、Flagペプチド、mycペプチドまたはHAペプチドである。
なおさらなる局面において、本発明は、二価CLTXキメラ抗原受容体(または二価CLTX CAR)および生存因子を発現する遺伝子工学で作り変えられたγδT細胞に関し、該生存因子は、化学療法剤に対する耐性を付与するポリペプチドであり、該γδT細胞は、二価CLTX-CARおよび生存因子の発現を方向づける単一のベクターを含み、さらに：
a. 該二価CLTX-CARは：
i. 2つのCLTXペプチドを含む細胞外抗原結合ドメイン、ここで該2つのCLTXペプチドはリンカーペプチドにより取り付けられ；任意に該リンカーペプチドは、30アミノ酸長未満または15アミノ酸長である；
ii. 膜貫通ドメイン；
iii. 膜貫通ドメインを細胞外抗原結合ドメインに取り付ける任意の細胞外ヒンジドメイン；
iv. 任意の細胞内シグナル伝達ドメイン；および
v. 任意の共刺激性ドメイン
を含む。
本発明はまた、本明細書に記載される遺伝子工学で作り変えられたγδT細胞の集団を包含する。ある特定の局面において、二価CLTX CARは、共刺激性ドメインを含み、細胞内シグナル伝達ドメインを含まない。さらなる局面において、二価CLTX CARは、細胞内シグナル伝達ドメインを含まず、共刺激性ドメインを含まない。なおさらなる局面において、リンカーペプチドは、Flagペプチド、mycペプチドまたはHAペプチドである。
本発明はさらに、本明細書に記載される多価CLTX-CARγδT細胞(または多価CLTX-CARγδT細胞の集団)を含む医薬組成物、ならびに癌または腫瘍の治療を必要とする被験体において癌または腫瘍を治療する方法、該方法は、該被験体に、本明細書に記載される多価CLTX-CARγδT細胞を含む組成物を投与する工程、および該被験体に有効量の化学療法剤を共投与する工程を含み；例えば、有効量は、癌または腫瘍細胞上のストレス抗原発現を増加するのに十分な量である。本明細書に記載される二価CLTX-CARγδT細胞(または二価CLTX-CARγδT細胞の集団)を含む医薬組成物、ならびに癌または腫瘍の治療を必要とする被験体において癌または腫瘍を治療する方法も包含され、該方法は、該被験体に、本明細書に記載される二価CLTX-CARγδT細胞を含む組成物を投与する工程、および該被験体に有効量の化学療法剤を共投与する工程を含み；例えば該有効量は、癌または腫瘍細胞上のストレス抗原発現を増加するのに十分な量である。
ある局面において、生存因子は、化学療法剤に対する耐性を付与するポリペプチドである。化学療法剤に対する耐性を付与するポリペプチドは、例えばアルキルグアニントランスフェラーゼ(AGT)、O6メチルグアニンDNAメチルトランスフェラーゼ(MGMT)、P140K MGMT(本明細書においてMGMTp140kとも称される)、L22Y-DHFR、チミジル酸シンターゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、多剤耐性1タンパク質(MDR1)、5'ヌクレオチダーゼII、ジヒドロ葉酸レダクターゼおよびチミジル酸シンターゼからなる群より選択され得る。該ポリペプチドは、例えば任意の化学療法剤、例えばアルキル化剤に対する耐性を付与(refer)し得る。さらなる局面において、ポリペプチドは、トリメトトレキサート、テモゾロミド、ラルチトレキセド、S-(4-ニトロベンジル)-6-チオイノシン、6-ベンジルグアニジン(benzyguanidine)、ニトロソウレア、フォテムスチン、シタラビン(cytabarine)およびカンプトテシンからなる群より選択される化学療法剤に対する耐性を付与する。
多価CLTX-CARまたは二価CLTX-CARはさらに、自殺遺伝子(suicide gene)を発現し得る。自殺遺伝子の非限定的な例は、チミジンキナーゼ、例えば単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(HSV-TK)である。
多価CLTX-CARは、2つのCLTXペプチド、3つのCLTXペプチド、4つのCLTXペプチドまたは4つより多くのCLTXペプチドを含み得る。ある局面において、多価CLTX-CARは、2つのCLTXペプチドを含む。さらなる局面において、多価CLTX-CARは、2つのCLTXペプチド、3つのCLTXペプチドまたは4つのCLTXペプチドを含み、生存因子はMGMTまたはMGMTp140kである。なおさらなる局面において、多価CLTX-CARは、2つのCLTXペプチドを含み、生存因子はMGMTである。ある局面において、CLTX-CARはdCLTX-CARであり、生存因子はMGMTまたはMGMTp140kであり、dCLTX-CARは、細胞内シグナル伝達ドメインを含まない。さらなる局面において、CLTX-CARはdCLTX-CARであり、生存因子はMGMTまたはMGMTp140kであり、dCLTX-CARは、共刺激性ドメイン(例えばCD28共刺激性ドメイン)を含み、細胞内シグナル伝達ドメインを含まない。なおさらなる局面において、CLTX-CARはdCLTX-CARであり、生存因子はMGMTまたはMGMTp140kであり、dCLTX-CARは、細胞内シグナル伝達ドメインを含まず、共刺激性ドメインを含まない。
多価CLTX-CARは、CD28膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメインを含み得；および/または細胞内シグナル伝達ドメインは、CD3ゼータ(本明細書においてCD3zまたはCD3ζとも称される)シグナル伝達ドメインを含み；および/またはヒンジドメインは、CD8、CD28および/またはCD137からなる群より選択されるタンパク質のヒンジ領域を含む。ある局面において、共刺激性ドメインは存在し、CD28共刺激性ドメインおよび/または4-1BB共刺激性ドメインを含む。多価CLTX-CARはさらに、細胞外シグナルペプチドを含み得；例えばシグナルペプチドは、CD8、CD28、GM-CSF、CD4、CD137またはそれらの組み合わせからなる群より選択されるタンパク質のシグナルペプチドである。例示的なリンカーペプチドは、c-myc、FLAGおよび(GSSS)nである。
多価CLTX-CARまたは二価CLTX-CARは、CD28膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメイン；および/またはCD8、CD28および/またはCD137からなる群より選択されるタンパク質のヒンジ領域を含むヒンジドメインを含み得る。多価または二価CLTX-CARはさらに、細胞外シグナルペプチドを含み得；例えばシグナルペプチドは、CD8、CD28、GM-CSF、CD4、CD137またはそれらの組み合わせからなる群より選択されるタンパク質のシグナルペプチドである。多価または二価CLTX CARはリンカーペプチドを含み得；例示的なリンカーペプチドは、c-myc、FLAG、HAおよび(GSSS)nである。
ある態様において、多価CLTX-CARは、細胞内シグナル伝達ドメインを含まないかまたは含まない(not comprise or include)。さらなる局面において、多価CLTX-CARは、CD3ゼータシグナル伝達ドメインを含まないかまたは含まない。さらなる態様において、多価CLTX-CARは、共刺激性ドメイン(例えばCD28共刺激性ドメイン)を含み、CD3ゼータシグナル伝達を含まない。
二価CLTX-CARも具体的に包含され、エンドドメインは、細胞内シグナル伝達ドメインを含まないかまたは含まない。さらなる局面において、二価CLTX-CARのエンドドメインは、CD3ゼータシグナル伝達ドメインを含まないかまたは含まない。さらなる態様において、二価CLTX-CARは、共刺激性ドメイン(例えばCD28共刺激性ドメイン)を含み、CD3ゼータシグナル伝達を含まない。CD3ゼータシグナル伝達を含まず、共刺激性ドメイン(例えばCD28共刺激性ドメイン)を含まない二価CLTX-CARも包含される。
治療方法は、例えば頭蓋内腫瘍の治療のためのものであり得る。例えば腫瘍は、グリア芽腫などの神経膠腫であり得る。ある局面において、多価CLTX-CARγδT細胞またはその組成物は、頭蓋内投与される。化学療法剤に応答して腫瘍細胞により発現されるストレス抗原は、例えばNKG2DL(NKG2Dリガンド)であり得る。NKG2DLの非限定的な例としては、限定されないが、MIC-A、MIC-B、ULBP-1、ULBP-2、ULBP-3およびULBP-4が挙げられる。具体的に二価CLTX-CARγδT細胞を含む多価CLTX-CARγδT細胞は、同等のsCLTX-CARガンマデルタT細胞のものと比較して、腫瘍細胞に対して高められた細胞傷害性を有し得る。さらなる局面において、多価CLTX-CARγδT細胞、具体的に二価CLTX-CARγδT細胞は、同等のsCLTX-CARγδT細胞のものと比較して、高められた持続性を有し得る。「同等のsCLTX-CAR」は、抗原認識ドメイン中に単一のCLTXペプチドを含む以外は、それが比較される多価CLTX-CARγδT細胞と同一である。同等のsCLTX-CARを含む組成物は、それが比較されている多価CLTX-CARγδT細胞のものと同一である(例えば細胞数は同じである；賦形剤は同じである、投与形態は同じである、等)。
ある局面において、多価CLTX-CARγδT細胞またはその組成物は、化学療法剤環境(生存因子が耐性を付与する)において、同等のsCLTX-CARγδT細胞またはその組成物よりも高められた腫瘍細胞に対する細胞傷害性を有する。さらなる局面において、多価CLTX-CARγδT細胞またはその組成物は、同等のsCLTX-CARγδT細胞またはその組成物のものと比較して、高められた(例えばCD69活性化)活性化を有する。例えば、二価CLTX-CARγδT細胞またはその組成物は、化学療法剤環境(生存因子が耐性を付与する)において、同等のsCLTX-CARγδT細胞またはその組成物よりも高められた腫瘍細胞に対する細胞傷害性を有し得る。さらなる局面において、二価CLTX-CARγδT細胞またはその組成物は、細胞内シグナル伝達ドメインを含まず、同等のsCLTX-CARγδT細胞またはその組成物と比較して、高められた細胞傷害性を有する。さらなる局面において、二価CLTX-CARγδT細胞またはその組成物は、共刺激性ドメイン(例えばCD28共刺激性ドメイン)を含み、細胞内シグナル伝達ドメインを含まず、同等のsCLTX-CARγδT細胞またはその組成物と比較して、高められた細胞傷害性を有する。なおさらなる局面において、二価CLTX-CARγδT細胞は、共刺激性ドメイン(例えばCD28共刺激性ドメイン)を含まず、細胞内シグナル伝達ドメインを含まず、同等のsCLTX-CARγδT細胞またはその組成物と比較して、高められた細胞傷害性を有する。
さらなる局面において、多価CLTX-CARγδT細胞またはその組成物は、同等のsCLTX-CARγδT細胞またはその組成物と比較して、高められた持続性を有する。例えば、二価CLTX-CARγδT細胞またはその組成物は、同等のsCLTX-CARγδT細胞またはその組成物と比較して、高められた持続性を有する。さらなる局面において、二価CLTX-CARγδT細胞は、細胞内シグナル伝達ドメインを含まず、同等のsCLTX-CARγδT細胞またはその組成物と比較して、高められた持続性を有する。さらなる局面において、二価CLTX-CARγδT細胞は、細胞内シグナル伝達ドメインを含まず、細胞内シグナル伝達ドメイン、例えばCD3zシグナル伝達ドメインを含む同等の二価CLTX-CARγδT細胞と比較して、高められた持続性を有する。なおさらなる局面において、二価CLTX-CARγδT細胞は、共刺激性ドメイン(例えばCD28共刺激性ドメイン)を含み、細胞内シグナル伝達ドメインを含まず、細胞内シグナル伝達ドメイン、例えばCD3zシグナル伝達ドメインを含む同等の二価CLTX-CARγδT細胞と比較して、高められた持続性を有する。さらなる態様において、二価CLTX-CARγδT細胞は、共刺激性ドメイン(例えばCD28共刺激性ドメイン)を含まず、細胞内シグナル伝達ドメインを含まず、細胞内シグナル伝達ドメイン、例えばCD3zシグナル伝達ドメインを含む同等の二価CLTX-CARγδT細胞と比較して、高められた持続性を有する。
本発明はさらに、化学療法剤を用いた治療を受ける被験体において、腫瘍細胞に対するCLTX-CARγδT細胞の細胞傷害性を高める方法を包含し、該方法は、本明細書に記載される少なくとも2つのCLTXペプチドおよび生存因子を発現するようにγδT細胞を遺伝子工学的に作り変える工程、ここで該多価CLTX-CARγδT細胞(またはその組成物)は、同等のsCLTX-CARγδT細胞(またはその組成物)と比較して高められた細胞傷害性を有する、さらに被験体に、遺伝子工学で作り変えられたγδT細胞を投与する工程を含む。なおさらなる局面において、本発明は、化学療法剤を用いた治療を受ける被験体において、腫瘍細胞に対するCLTX-CARガンマデルタT細胞の活性化(例えばCD69活性化)を増加する方法を包含し、該方法は、少なくとも2つのCLTXペプチドおよび生存因子を発現するようにガンマデルタT細胞を遺伝子工学で作り変える工程、ここで該多価CLTX-CARγδT細胞(またはその組成物)は、同等のsCLTX-CARγδT細胞(またはその組成物)と比較して、高められた活性化を示す、およびさらに、被験体に、遺伝子工学で作り変えられたγδT細胞を投与する工程を含む。ある特定の局面において、該方法は、2つのCLTXペプチド(二価CLTX-CAR)および本明細書に記載される生存因子を発現するように、γδT細胞を遺伝子工学で作り変える工程を含み、ここで二価CLTX-CARγδT細胞(またはその組成物)は、同等のsCLTX-CARγδT細胞(またはその組成物)と比較して、高められた細胞傷害性を有する。ある態様において、二価CLTX-CARは、細胞内シグナル伝達ドメインを含まない。なおさらなる局面において、二価CLTX-CARは、共刺激性ドメイン(例えばCD28共刺激性ドメイン)を含み、細胞内シグナル伝達ドメインを含まない。さらなる局面において、二価CLTX-CARは、共刺激性ドメイン(例えばCD28共刺激性ドメイン)を含まず、細胞内シグナル伝達ドメインを含まない。
本発明はさらに、化学療法剤を用いた治療を受ける被験体において、CLTX-CARγδT細胞の持続性を高める方法を含み、該方法は、少なくとも2つのCLTXペプチドおよび本明細書に記載される生存因子を発現するようにγδT細胞を遺伝子工学で作り変える工程、ここで該多価CLTX-CARγδT細胞(またはその組成物)は、同等のsCLTX-CARγδT細胞(またはその組成物)と比較して、高められた持続性を有する、および被験体に遺伝子工学で作り変えられたγδT細胞を投与する工程をさらに含む。ある局面において、多価CLTX-CARγδT細胞はシグナル伝達ドメインを含む。なおさらなる局面において、多価CLTX-CARはシグナル伝達ドメインを含まない。さらなる局面において、多価CLTX-CARは、CD3zシグナル伝達ドメインを含まない。ある特定の局面において、該方法は、2つのCLTXペプチド(二価CLTX-CAR)および本明細書に記載される生存因子を発現するようにγδT細胞を遺伝子工学で作り変える工程を含み、該二価CLTX-CARγδT細胞(またはその組成物)は、同等のsCLTX-CARγδT細胞(またはその組成物)と比較して、高められた持続性を有する。ある態様において、二価CLTX-CARは細胞内シグナル伝達ドメインを含まない。なおさらなる局面において、二価CLTX-CARは、共刺激性ドメイン(例えばCD28共刺激性ドメイン)を含み、細胞内シグナル伝達ドメインを含まない。さらなる局面において二価CLTX-CARは、共刺激性ドメイン(例えばCD28共刺激性ドメイン)を含まず、細胞内シグナル伝達ドメインを含まない。
本発明はさらに、本明細書に記載される多価CLTX-CARまたは二価CLTX-CARをコードする核酸またはベクターを含む。ある局面において、核酸またはベクターはさらに、生存因子をコードする。
図面の簡単な説明
図1は、MGMTを発現する細胞内の二重CLTX-CAR(dCLTX-CAR)を示す概略図である。dCLTX-CARの2つのCLTXペプチドは、c-myc(「Myc」)ペプチドリンカーにより連結される。ヒンジ領域、膜貫通領域、細胞内共刺激性ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインも示される。 図2は、例示的CLTX-CAR構築物の構築物マップである。左から開始して、CLTX-CAR構築物は、CD8リーダー配列(「CD8L」)、MycまたはFlagペプチドにより連結される1つまたは2つのCLTXペプチド(例えばCLTXおよび「Null」ならびにCLTXおよびCLTXのそれぞれ)、CD8ヒンジ領域(「CD8H」)、CD28膜貫通ドメイン(「CD28tm」)、CD28共刺激性ドメイン(「CD28co」)、CD3ゼータシグナル伝達ドメイン(「CD3ζ」または「Z」)またはシグナル伝達ドメインなし(「noZ」)、P2AペプチドおよびMGMTまたはEGFPを任意に含み得る。示されるCLTX-CAR構築物は、以下のdCLTX(二重CLTXペプチド)構築物：a. CLTX-Myc-CLTX-CD8H-CD28co-Z-EGFP；b. CLTX-Myc-CLTX-CD8H-CD28co-noZ-EGFP；c. CLTX-Myc-CLTX-CD8H-CD28co-Z-MGMT；d. CLTX-Myc-CLTX-CD8H-CD28co-noZ-MGMT；e. CLTX-Flag-CLTX-CD8H-CD28co-Z-EGFP；f. CLTX-Flag-CLTX-CD8H-CD28co-noZ-EGFP；g. CLTX-Flag-CLTX-CD8H-CD28co-Z-MGMT；およびh. CLTX-Flag-CLTX-CD8H-CD28co-noZ-MGMTを含む。示されるCLTX-CAR構築物はまた、以下のsCLTX(単一CTLXペプチド)構築物：a .CLTX-Myc-CD8H-CD28co-Z-EGFP；b. CLTX-Myc-CD8H-CD28co-noZ-EGFP；c. CLTX-Myc-CD8H-CD28co-Z-MGMT；d. CLTX-Myc-CD8H-CD28co-noZ-MGMT；e. CLTX-Flag-CD8H-CD28co-Z-EGFP；f. CLTX-Flag-CD8H-CD28co-noZ-EGFP；g. CLTX-Flag-CD8H-CD28co-Z-MGMT；およびh. CLTX-Flag-CD8H-CD28co-noZ-MGMTを含む。 図3は、抗Mycモノクローナル抗体を使用した細胞表面染色のフローサイトメトリー分析を示し、dCLTX-CARのCLTX細胞表面局在化を示す。細胞は、dCLTX-CARおよびマーカー遺伝子の共発現を示すGFPについても選別される(gated)。 図4は、EGFP(「CMC-EGFP」)およびMGMT(「CMC-MGMT」)を発現するdCLTX-CAR Jurkat T細胞が、EGFP(「CTX-EGFP」)を発現するsCLTX-CAR Jurkat T細胞と比較して、高められたCD69活性化を示したことを示す棒グラフである。dCLTX-CAR細胞は、2つのCTLXペプチドの間にFlagペプチドを含んだ。 図5は、U251 GBM細胞と24時間共培養され、抗CD69抗体で染色されたレンチウイルス形質導入Jurkat T細胞のフローサイトメトリー分析を示す。 図6は、経時的(日)なCLTX-CAR形質導入Jurkat細胞(左：1xCLTX-Mycおよび右：2xCLTX-Myc)のパーセンテージのグラフを示す。 図7は、γδ T細胞と共培養されたGBM細胞の写真を示す。左上のパネルは、U25-GFP細胞のみを示す。1xCLTX-Flag-noZおよび2xCLTX-Flag-noZで処理されたGBM細胞は、左下および右下のそれぞれに示される。 図8は、異なる割合で24～48時間、U251-GFPまたはU87-GFP細胞と共培養され、その後Annexin Vおよび7-AADで染色された形質導入γδT細胞のフローサイトメトリー分析を示す。 図9は、U251 GBM細胞と24時間共培養され、抗CD69抗体で染色されたCLTX-CAR形質導入Jurkat T細胞のフローサイトメトリー分析を示す。対照細胞(NTC)、緑色蛍光タンパク質対照(GFP)、1xCLTX-Z-GFP(単一CLTXペプチド、CD3zシグナル伝達ドメインおよびGFP、タグなし)、1xCLTX-noZ-GFP(単一CLTXペプチド、CD3zシグナル伝達ドメインなしおよびGFP、タグなし)、1xCLTX-Flag-Z(単一CLTXペプチド、FlagペプチドおよびCD3zシグナル伝達ドメイン)、1xCLTX-Flag-NoZ(単一CLTXペプチド、Flagペプチド、CD3zシグナル伝達ドメインなし)、2xCLTX-Flag-Z(2つのCLTXペプチド、FlagペプチドおよびCD3zシグナル伝達ドメイン)および2xCLTX-Flag-noZ(2つのCLTXペプチド、Flagペプチド、CD3zシグナル伝達ドメインなし)についてのデータを示す。図9(上パネル)は、FlagまたはMycペプチドを有する1xCLTX構築物および2つのCLTXペプチドを連結するFlagまたはMycペプチドを有する2xCLTX構築物を示す概略図を示す。該図に示されるように、CD3zシグナル伝達ドメインを有さない(noZ)CLTX-CAR構築物で形質導入されたJurkat T細胞は、U251共培養の際にCD69活性化を示さなかった。タグを有さない1xCLTX-CARで形質導入されたJurkat T細胞は、形質導入されない細胞と比較して、CD69の中位の活性化を示した。1xCLTX-CARまたはFlagタグを有する2xCLTX-CARで形質導入されたJurkat T細胞は、非常に高いCD69活性化を示した。 図10A～10Dは、経時的(日)なCLTX-CAR形質導入Jurkat細胞のパーセンテージのグラフである。図10Aは、経時的(日)な、1xCTX-Myc-Z-MGMT細胞(1つのCLTXペプチド、Mycペプチド、CD3zシグナル伝達ドメインおよびMGMT)および1xCTX-Myc-noZ-MGMT細胞(1つのCLTXペプチド、Mycペプチド、CD3zシグナル伝達ドメインなしおよびMGMT)のパーセンテージを示すグラフである。 図10Bは、経時的(日)な、2xCTX-Myc-Z-MGMT細胞(2つのCLTXペプチド、Mycペプチド、CD3zシグナル伝達ドメインおよびMGMT)および2xCTX-Myc-noZ-MGMT細胞(2つのCLTXペプチド、Mycペプチド、CD3zシグナル伝達ドメインなしおよびMGMT)のパーセンテージを示すグラフである。図10Cは、経時的(日)な、1xCTX-Flag-Z-MGMT細胞(1つのCLTXペプチド、Flagペプチド、CD3zシグナル伝達ドメインおよびMGMT)および1xCTX-Flag-noZ-MGMT細胞(1つのCLTXペプチド、Flagペプチド、CD3zシグナル伝達ドメインなしおよびMGMT)のパーセンテージを示すグラフである。図10Dは、経時的(日)な、2xCTX-Flag-Z-MGMT細胞(2つのCLTXペプチド、Flagペプチド、CD3zシグナル伝達ドメインおよびMGMT)および2xCTX-Flag-noZ-MGMT細胞(2つのCLTXペプチド、Flagペプチド、CD3zシグナル伝達ドメインなしおよびMGMT)のパーセンテージを示すグラフである。図10A～10Dに示されるように、シグナル伝達ドメインを有さない細胞は、CD3zシグナル伝達ドメインを有する細胞よりも高い持続性を有し、2つのCLTXペプチド(二重CLTX)を有し、CD3zシグナル伝達ドメインを有する細胞は、1つのみのCLTXペプチドを有する同等の細胞よりも高い持続性を示した。 図11Aおよび11Bは、3、6、9、12、15および18日目の内部レポーターとして高感度(enhanced)緑色蛍光タンパク質(EGFP)を発現するCLTX-CAR形質導入Jurkat細胞のフローサイトメトリー分析を示す。示されるデータは、対照細胞(NTC)、1xCTX-Flag-Z-EGFP(1つのCLTXペプチド、Flagペプチド、CD3zシグナル伝達ドメインおよびEGFP)および1xCTX-Flag-noZ-EGFP(1つのCLTXペプチド、Flagペプチド、シグナル伝達ドメインなしおよびEGFP)についてのものである。1xCTX-Flag-noZ-EGFPは、1xCTX-Flag-Z-EGFP細胞よりも高い持続性を示した。具体的に、1xCLTX-Flag-Z-EGFP形質導入Jurkat T細胞は、経時的に、細胞表面上でCLTX-CARを発現する細胞の低下したパーセンテージを示し、EGFPは依然としてこれらの細胞において細胞内に存在する。 図12Aおよび12Bは、図11Aおよび11Bに示されるフローサイトメトリー分析からの経時的(日)な、1xCLTX-CAR形質導入Jurkat細胞のパーセンテージのグラフである。図12Aは、経時的(日)な、1xCTX-Flag-Z-EGFP細胞およびGFP単独を形質導入された細胞(対照)のパーセンテージを示すグラフである。図12Bは、経時的(日)な、1xCTX-Flag-noZ-EGFPおよびGFPを形質導入された細胞を示すグラフである。 図13は、2:1のエフェクター/標的(E/T)および4:1のE/Tでの共培養におけるGBM細胞に結合する対照γδ T細胞(γδ T細胞NTC)および2xCLTX-CAR-noZ-γδ T細胞の写真を示す。最も左のパネルはU87G-GBM細胞のみを示す。2xCLTX-CAR-FLAG-noZ-γδT細胞は、対照γδT細胞よりも高いGBM細胞の結合を示した。 図14は、2.1のE/TでU87-GFPグリア芽腫細胞と4時間共培養され、その後7-AADで染色された対照(γδT NTC)、2xCLTX-CAR-noZ-γδT (CAR-γδT)細胞のフローサイトメトリー分析を示す。細胞を、GFPおよび7-AADについて分類する。U87GFP GBM細胞はGFP+であり、死細胞は7-AAD+である。最も左のパネルは、U87G-GBM細胞単独を示す。図15は、2xCLTX-CAR-noZ-γδTが、CD3zシグナル伝達ドメインなしであっても、対照γδT細胞(CARなし)と比較して、高められたU87グリア芽腫細胞に対する細胞傷害性を示したことを示す。 図15は、2xCLTX-CAR-noZγδT細胞によるU251MG GBM細胞の連続殺傷を示すタイムラプス動画からの一連の静止画像を示す。画像中の緑色の細胞(またはグレースケールで示される場合、より明るい細胞)は腫瘍細胞である。赤色の矢印は、γδT細胞が、異なる腫瘍細胞(画像中のT1、T2、T3、T4およびT5ならびにKill-1、Kill-2、Kill-3、Kill-4およびKill-5参照)に結合して殺傷する場合の経時的なγδT細胞を示す。画像は経時的に撮影した(左から右へ、および画像間の矢印により示される)。 図16は、細胞中の3xCLTX-CARおよび4xCLTX-CARを示す概略図である。3xCLTX-CAR中の3つのCLTXペプチドは、示されるように、FlagペプチドおよびMycペプチドにより連結される。4xCLTX-CAR中の4つのCLTXペプチドは、示されるように、HA、FlagペプチドおよびMycペプチドにより連結される。ヒンジ領域、膜貫通領域、任意の細胞内共刺激性ドメインおよび任意の細胞内シグナル伝達ドメインも示される。3xCLTX-CAR構築物について、構築物は：a. CTX-Myc-CTX-Flag-CTX-CD8H-CD28co-Z-EGFP；b. CTX-Myc-CTX-Flag-CTX-CD8H-CD28co-noZ-EGFP；c. CTX-Myc-CTX-Flag-CTX-CD8H-CD28co-Z-MGMT；およびd. CTX-Myc-CTX-Flag-CTX-CD8H-CD28co-noZ-MGMTを含む。4xCLTX-CAR構築物について、構築物は：a. CTX-Myc-CTX-Flag-CTX-HA-CTX-CD8H-CD28co-Z-EGFP；b. CTX-Myc-CTX-Flag-CTX-HA-CTX-CD8H-CD28co-noZ-EGFP；c. CTX-Myc-CTX-Flag-CTX-HA-CTX-CD8H-CD28co-Z-MGMT；およびd. CTX-Myc-CTX-Flag-CTX-HA-CTX-CD8H-CD28co-noZ-MGMTを含む。 図17A～17Cは、対照(NTC)細胞、3xCLTX-Z-EGFP Jurkat細胞および4xCLTX-Z-EGFP Jurkat細胞についての抗Mycモノクローナル抗体を使用した細胞表面染色のフローサイトメトリー分析を示し、U251 GBM細胞との24時間の共培養および抗CD69抗体による染色後のCD69活性化も示す。細胞はGFPについても選別する。図17Bおよび17Cは、3xCLTXおよび4xCLTX CARが通常は細胞表面上に存在しない(MycではなくGFP+が測定される)ことを示す。また、腫瘍細胞との共培養後、3xCLTXまたは4xCLTX形質導入Jurkat細胞において、CD69活性化は観察されなかった。
発明の詳細な説明
そうではないと定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術的および科学的な用語は、本発明が属する分野の当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと同様または同等の任意の方法および材料も本発明の実施または試験において使用され得るが、好ましい方法および材料がここでは記載される。
明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「a」、「an」および「the」は、文脈が明確にそうではないことを示さない限りは複数の指示物を含む。したがって、例えば「細胞(a cell)」についての参照は、複数の細胞を含む。本明細書およびそれに続く特許請求の範囲において、反対の意図が明らかでない限り、以下の意味を有するように定義されるいくつかの用語について参照がなされる。
比、濃度、量および他の数的データは、本明細書において範囲の形式で表され得ることに注意するべきである。かかる範囲の形式は、便利さおよび簡潔さのために使用されることが理解され、そのため範囲の限度として明示的に記載される数的値だけでなく、それぞれの数的値およびサブ範囲が明示的に記載されるように、該範囲内に包含される全ての個々の数的値またはサブ範囲も含むような柔軟な様式で解釈されるべきである。説明するために、「約0.1%～約5%」の濃度範囲は、約0.1wt.%～約5wt.%の明示的に記載される濃度だけでなく、示される範囲内の個々の濃度(例えば1%、2%、3%および4%)およびサブ範囲(例えば0.5%、1.1%、2.2%、3.3%および4.4%)も含むと解釈されるべきである。用語「約」は、修飾される数的値(1つまたは複数)の±1%、±2%、±3%、±4%、±5%、±6%、±7%、±8%、±9%もしくは±10%またはそれ以上を含み得る。また、句「約‘x'～‘y'」は、「約‘x'～約‘y'」を含む。数、比、濃度、量、範囲および他の数的データは、文脈と矛盾しない限り、用語「約」により修飾されると解釈されるべきである。
用語「薬物耐性免疫療法」またはDRIは、癌を治療するための戦略であり、ここで抗癌免疫細胞、好ましくはγδT細胞は、化学療法薬の毒性効果に抵抗するように遺伝子的に作り変えられ、これは化学療法と免疫療法の組合せ投与を可能にする。化学療法耐性または化学耐性(chemoresistance)の獲得は、癌治療の分野において周知の現象である。化学療法剤に対するかかる耐性は、薬物耐性遺伝子に影響を及ぼす特定のDNA、RNAまたはポリペプチドの発現、薬物耐性を運搬する遺伝子の発現、化学療法剤に対する耐性を付与するポリペプチドの発現により生じ得る。本明細書に記載されるDRI戦略は、癌免疫慮法に使用され得る免疫細胞に耐性を付与するために化学耐性を使用する。例えばDRIγδT細胞は、限定されないが、化学療法剤に対する耐性を付与するDNA、RNAまたはポリペプチドを含む、本明細書に記載される生存因子を発現するように遺伝子的に作り変えられたγδT細胞を含む。化学療法剤に対する耐性を付与するポリペプチドは、本明細書において「生存ポリペプチド」)と称され得る。多価CLTX-CARを含むDRIγδT細胞は、多価CLTX-CAR DRIγδT細胞と称され得る。
用語「生存因子」は、化学療法剤におよび/または化学療法剤治療養生法に対する耐性を付与し、および/または生存因子を含む細胞が治療環境(例えば化学療法治療環境)において生存することを可能にする当該技術分野で現在知られているかまたは後に発見される任意の薬剤をいう。句「耐性を付与する」等は、化学療法剤に対する耐性の獲得または化学療法剤に対する耐性の向上を包含する。「生存因子」は、γδT細胞により発現される場合に、化学療法剤に対する耐性を付与する薬剤を含む。したがって、「生存因子」は、γδT細胞に発現され(例えば薬剤耐性遺伝子にコードされ)、化学療法剤に対する耐性を付与するDNA、RNAまたはポリペプチドであり得る。本明細書に記載されるように、γδT細胞は、化学療法剤に対する耐性を付与する生存因子をコードする遺伝子、遺伝子断片、DNA、siRNAまたはmRNAを発現するベクターを含むことにより、化学療法薬に対する耐性を付与するDNA、RNAまたはポリペプチドを発現するように遺伝子工学で作り変えられ得る。さらに他の局面において、生存因子は、化学療法剤に対する耐性を付与するDNAである。さらなる局面において、生存因子は、化学療法剤に対する耐性を付与するRNA(例えばRNAi、siRNA、micoRNAまたはmRNA)である。
ある局面において、生存因子は、化学療法剤に対する耐性を付与するポリペプチドであり；例えば該ポリペプチドは、γδT細胞により発現される場合に耐性を付与する。ある態様において、生存因子は、MGMT、多剤耐性タンパク質1(MDR1)または5'ヌクレオチダーゼII(NT5C2)である。他の生存因子としては、例えばジヒドロ葉酸レダクターゼ(L22Y-DHFR)およびチミジル酸シンターゼの薬物耐性バリアントが挙げられる。ある局面において、生存因子はMGMTである。耐性を付与する他のポリペプチドは、治療環境の性質(すなわち他の治療養生法が、本開示の細胞組成物と組み合わせて患者に与えられているもの)に応じて、細胞により使用または発現され得る。MGMTは、グアニンのO6位から突然変異誘発付加物を除去することにより、DNAのアルキル化損傷を修復する。かかる突然変異誘発付加物はアルキル化剤(限定されないがテモゾロミドを含む)により引き起こされ得る。したがって、MGMTは、テモゾロミドなどのアルキル化剤に対する耐性を付与するポリペプチドである。生存因子は、限定されないが本明細書に記載される特定の化学療法剤を含む化学療法剤に対する耐性を付与するポリペプチドであり得る。
「投与」は、化合物、細胞集団を含む生物学的材料もしくはそれらの組み合わせ、または本発明の前述の化合物、生物学的材料(例えば細胞集団)もしくはそれらの組み合わせのいずれかを含む組成物を、ヒトまたは動物被験体に導入することを意味する。化合物の1つの好ましい投与経路は静脈内である。別の好ましい経路は非経口である。「非経口」は、眼窩内、注入、動脈内、包内、心臓内、皮内、筋内、腹腔内、肺内、脊髄内、胸骨内、鞘内、頭蓋内、子宮内、静脈内、クモ膜下、被膜下、皮下、経粘膜または経気管を含む注射に関連する投与経路をいう。化合物の他の例示的な投与経路は、腹腔内もしくは胸膜腔内またはカテーテルを介した脳へのものであり得る。しかしながら、経口、局所、皮下、腹膜、動脈内、吸入、膣、直腸、鼻腔、脳脊髄液への導入、頭蓋内または身体区分への点滴注入などの任意の投与経路が使用され得る。固形腫瘍などの標的組織部位への直接注射も企図される。例えば、神経膠腫または他の頭蓋内腫瘍の治療のためのγδT細胞の頭蓋内投与が使用され得る。
用語「癌」は、本明細書で使用する場合、制御されることなく異常細胞が分裂する疾患についての一般的な用語として、その通常の意味を与えられる。癌細胞は、近くの組織に侵入し得、血流およびリンパ系を通って身体の他の部分に広がり得る。正常細胞が、特異化された、制御され、調整された単位としてふるまう能力を消失する場合に腫瘍が形成される。一般的に、固形腫瘍は、通常は嚢胞または液体領域を含まない組織の異常な塊である(いくつかの脳腫瘍は嚢胞および液体が充填された中心壊死性領域を有する)。単一の腫瘍はさらに、その中にしくじったプロセスが異なる、異なる細胞の集団を有し得る。固形腫瘍は、良性(癌性でない)または悪性(癌性)であり得る。異なる種類の固形腫瘍は、それらを形成する細胞の種類の名をとって命名される。固形腫瘍の例は、肉腫、癌腫およびリンパ腫である。白血病(血液の癌)は一般的に、固形腫瘍を形成しない。癌腫は、内部臓器を裏打ちするかまたはそれを覆う皮膚または組織中で開始する癌である。神経膠腫は、ニューロンをその位置に保持し、十分に機能することを補助するグリアと称される脳の支持(「にかわ状」)組織から生じる腫瘍である。肉腫は、骨、軟骨、脂肪、筋肉、血管または他の結合もしくは支持組織中で開始する癌である。白血病は、骨髄などの血液形成組織において開始して、より多くの異常な血液細胞を生じさせ、それらを血流に進入させる癌である。リンパ腫は、免疫系の細胞において開始する癌である。
代表的な癌としては、限定されないが、特に急性リンパ芽球性白血病、成人；急性リンパ芽球性白血病、小児期；急性骨髄性白血病、成人；副腎皮質癌；副腎皮質癌、小児期；AIDS関連リンパ腫；AIDS関連悪性疾患；肛門癌；星状細胞腫、小児期小脳性；星状細胞腫、小児期大脳；総胆管癌、肝臓外；膀胱癌；膀胱癌、小児期；骨癌、骨肉腫/悪性線維性組織球腫；グリア芽腫、小児期；グリア芽腫、成人；脳幹神経膠腫、小児期；脳腫瘍、成人；脳腫瘍、脳幹神経膠腫、小児期；脳腫瘍、小脳性星状細胞腫、小児期；脳腫瘍、大脳星状細胞腫/悪性神経膠腫、小児期；脳腫瘍、脳室上衣腫、小児期；脳腫瘍、髄芽腫、小児期；脳腫瘍、テント上未分化神経外肺葉腫瘍、小児期；脳腫瘍、視路および視床下部神経膠腫、小児期；脳腫瘍、小児期(その他)；乳癌；乳癌および妊娠；乳癌、小児期；乳癌、男性；気管支腺腫/カルチノイド、小児期：類癌腫、小児期；類癌腫、胃腸；癌腫、副腎皮質；癌腫、島細胞；未知の原発性の癌腫；中枢神経系リンパ腫、原発性；小脳性星状細胞腫、小児期；大脳星状細胞腫/悪性神経膠腫、小児期；子宮頸癌；小児期癌；慢性(chrome)リンパ球性白血病；慢性骨髄性白血病；慢性骨髄増殖性障害；腱鞘の明細胞肉腫；結腸癌；結腸直腸癌、小児期；皮膚T細胞リンパ腫；子宮内膜癌；脳室上衣腫、小児期；上皮癌、卵巣；食道癌；食道癌、小児期；ユーイングファミリー腫瘍；頭蓋外生殖細胞腫瘍、小児期；性腺外生殖細胞腫瘍；肝臓外総胆管癌；眼の癌、眼内黒色腫；眼の癌、網膜芽腫；胆嚢癌；胃(Gastric)(胃(Stomach))癌；胃(胃)癌、小児期；胃腸類癌腫；生殖細胞腫瘍、頭蓋外、小児期；生殖細胞腫瘍、性腺外；生殖細胞腫瘍、卵巣；妊娠性絨毛腫瘍；神経膠腫. 小児期脳幹；神経膠腫. 小児期視路および視床下部；毛様細胞白血病；頭頸部癌；肝細胞(肝臓)癌、成人(原発性)；肝細胞(肝臓)癌、小児期(原発性)；ホジキンリンパ腫、成人；ホジキンリンパ腫、小児期；妊娠中のホジキンリンパ腫；下咽頭癌；視床下部および視路神経膠腫、小児期；眼内黒色腫；島細胞癌腫(内分泌性膵臓)；カポジ肉腫；腎臓癌；咽頭癌；咽頭癌、小児期；白血病、急性リンパ芽球性、成人；白血病、急性リンパ芽球性、小児期；白血病、急性骨髄性、成人；白血病、急性骨髄性、小児期；白血病、慢性リンパ球性；白血病、慢性骨髄性；白血病、毛様細胞；唇部および口腔癌；肝臓癌、成人(原発性)；肝臓癌、小児期(原発性)；肺癌、非小細胞、肺癌、小細胞；リンパ芽球性白血病、成人急性；リンパ芽球性白血病、小児期急性；リンパ性白血病、慢性；リンパ腫、AIDS関連；リンパ腫、中枢神経系(原発性)；リンパ腫、皮膚T細胞；リンパ腫、ホジキン、成人；リンパ腫、ホジキン；小児期；リンパ腫、妊娠中のホジキン；リンパ腫、非ホジキン、成人；リンパ腫、非ホジキン、小児期；リンパ腫、妊娠中の非ホジキン；リンパ腫、原発性中枢神経系；マクログロブリン血症、ヴァルデンストレーム；男性乳癌；悪性中皮腫、成人；悪性中皮腫、小児期；悪性胸腺腫；髄芽腫、小児期；黒色腫；黒色腫、眼内；メルケル細胞癌；中皮腫、悪性；原発潜在性転移性扁平上皮頸部癌(Squamous Neck Cancer)；多発性内分泌腫瘍症候群、小児期；多発性骨髄腫/形質細胞新生物；菌状息肉腫；骨髄異形成症候群(Myelodysplasia Syndromes)；骨髄性白血病、慢性(Chrome)；骨髄性白血病、小児期急性；骨髄腫、多発性；骨髄増殖性障害、慢性；鼻腔および副鼻腔癌；鼻咽腔癌；鼻咽腔癌、小児期；神経芽腫；神経線維腫；非ホジキンリンパ腫、成人；非ホジキンリンパ腫、小児期；妊娠中の非ホジキンリンパ腫；非小細胞肺癌；口癌、小児期；口腔および唇部の癌；口腔咽頭癌；骨の骨肉腫/悪性線維性組織球腫；卵巣癌、小児期；卵巣上皮癌；卵巣生殖細胞腫瘍；卵巣低悪性潜在的腫瘍；膵臓癌；膵臓癌、小児期、膵臓癌、島細胞；副鼻腔および鼻腔の癌；副甲状腺癌；陰茎癌；褐色細胞腫；松果体およびテント上未分化神経外胚葉腫瘍、小児期；下垂体腫瘍；形質細胞新生物/多発性骨髄腫；胸膜肺芽腫；妊娠および乳癌；妊娠およびホジキンリンパ腫；妊娠および非ホジキンリンパ腫；原発性中枢神経系リンパ腫；原発性肝臓癌、成人；原発性肝臓癌、小児期；前立腺癌；直腸癌；腎細胞(腎臓)癌；腎細胞癌、小児期；腎盂および尿管、移行細胞癌；網膜芽腫；横紋筋肉腫、小児期；唾液腺癌；唾液腺の癌、小児期；肉腫、ユーイングファミリー腫瘍；肉腫、カポジ；骨の肉腫(骨肉腫)/悪性線維性組織球腫；肉腫、横紋筋肉腫、小児期；肉腫、軟部組織、成人；肉腫、軟部組織、小児期；セザール症候群；皮膚癌；皮膚癌、小児期；皮膚癌(黒色腫)；皮膚癌腫、メルケル細胞；小細胞肺癌；小腸癌；軟部組織肉腫、成人；軟部組織肉腫、小児期；原発潜在性の扁平上皮頸部癌、転移性；胃(胃)癌；胃(胃)癌、小児期；テント上未分化神経外胚葉腫瘍、小児期；T細胞リンパ腫、皮膚；精巣癌；胸腺腫、小児期；胸腺腫、悪性；甲状腺癌；甲状腺癌、小児期；腎盂および尿管の移行細胞癌；栄養膜腫瘍、妊娠；未知の原発性部位、癌、小児期；小児期の通常ない癌；尿管および腎盂、移行細胞癌；尿道癌；子宮肉腫；膣癌；視路および視床下部神経膠腫、小児期；外陰癌；ヴァルデンストレームマクログロブリン血症；ならびにウィルムス腫瘍が挙げられる。
腫瘍は、悪性または良性に分類され得る。両方の場合に、細胞の異常な凝集および増殖がある。悪性腫瘍の場合、これらの細胞は、より攻撃的にふるまい、増加した侵入性の特性を獲得する。最終的に、腫瘍細胞は、それらが生じて身体の別の領域(通常それらの増殖に助けとならない異なる環境を有する)に広がる、微小環境から離れる能力を獲得しさえし得、この新しい場所でのそれらの迅速な増殖および分裂を継続し得る。これは転移と呼ばれる。一旦悪性細胞が転移すると、治癒または治療の達成はより困難になる。良性腫瘍は侵入する傾向が低く、転移する可能性が低い。
用語「融合タンパク質」は、本明細書で使用する場合、例えば少なくとも2つのCLTXペプチドおよび少なくとも1つの異種タンパク質を含む抗原認識ドメイン、すなわち融合タンパク質が天然には連結していない部分を含むキメラ分子をいう。アミノ酸配列は、通常は融合ポリペプチド内に一緒に持ち込まれる別々のタンパク質内に存在し得るか、または通常は同じタンパク質内に存在し得るが、融合ポリペプチド内で新しい配置に位置する。融合タンパク質は、例えば化学合成により、またはペプチド領域が所望の関係においてコードされるポリヌクレオチドを作製して翻訳することにより作製され得る。本明細書に記載される多価CLTX-CARは、少なくとも2つのCLTXペプチドを含む融合タンパク質であり得る。
多価CLTX-CARγδ T細胞および化学療法剤の投与を含む本明細書に記載される治療方法は、癌または腫瘍を低減するために使用され得る。用語「癌を低減すること」、「癌の阻害」、「癌を阻害すること」、「癌の再発を予防すること」および同様の用語は、本明細書において交換可能に使用され、腫瘍塊のサイズまたは体積の低減、被験体中の転移した腫瘍の数の低下、癌細胞の増殖状態(癌細胞が倍加する程度)の低下、以前の腫瘍の再発または新規の転移の発症の予防等の1つ以上をいう。
多価CLTX-CARγδ T細胞および化学療法剤の投与を含む本明細書に記載される治療方法は、腫瘍を低減するために使用され得る。用語「腫瘍を低減すること」は、本明細書で使用する場合、腫瘍塊のサイズまたは体積の低減、被験体中の転移した腫瘍の数の低下、癌細胞の増殖状態(癌細胞が倍加する程度)の低下等をいう。
用語「化学療法剤」は、本明細書で使用する場合、癌細胞と相互作用して、それにより細胞の増殖状態を低減し得るおよび/または例えば細胞分裂もしくはDNA合成を損なうことにより、またはDNAを損傷することにより、速く分裂する細胞を効果的に標的化することにより細胞を殺傷し得る化合物またはその誘導体をいう。化学療法剤の例としては、限定されないが、アルキル化剤(例えばシクロホスファミド、イホスファミド、テモゾロミド)；代謝拮抗剤(例えばメトトレキサート(MTX)、5-フルオロウラシルまたはそれらの誘導体)；置換ヌクレオチド；置換ヌクレオシド；DNA脱メチル化剤(代謝拮抗剤としても公知；例えばアザシチジン)；抗腫瘍抗生物質(例えばマイトマイシン、アドリアマイシン)；植物由来抗腫瘍剤(例えばビンクリスチン、ビンデシン、TAXOL(登録商標)、パクリタキセル、アブラキサン)；シスプラチン；カルボプラチン；エトポシド等が挙げられる。かかる剤としてはさらに、限定されないが抗癌剤トリメトトレキサート(TMTX)；テモゾロミド(TMZ)；ラルチトレキセド；S-(4-ニトロベンジル)-6-チオイノシン(NBMPR)；6-ベンジルグアニジン(benzyguanidine)(6-BG)；ニトロソウレア(nitrosoureas a nitrosourea) (ラビノピラノシル(rabinopyranosyl)-N-メチル-N-ニトロソウレア(Aranose)、カルムスチン(BCNU、BiCNU)、クロロゾトシン、エチルニトロソウレア(ENU)、フォテムスチン、ロムスチン(CCNU)、ニムスチン、N-ニトロソ-N-メチルウレア(NMU)、ラニムスチン(MCNU)、セムスチンおよびストレプトゾシン(ストレプトゾトシン))；シタラビン；およびカンプトテシン；またはそれらのいずれかの治療誘導体が挙げられ得る。
用語「キメラ抗原受容体(1つまたは複数)(CAR(1つまたは複数))」は、本明細書で使用する場合、人工T細胞受容体、Tボディ、一本鎖イムノレセプター、キメラT細胞受容体またはキメライムノレセプターをいい、例えば人工的な特異性(例えば抗原認識ドメイン)を、特定の免疫エフェクター細胞、例えばγδT細胞に移植する遺伝子工学で作り変えられた受容体を包含する。いくつかの態様において、CARは、細胞内活性化ドメイン、膜貫通ドメインおよび長さが変化し得、抗原認識ドメインを含む細胞外ドメインを含む。本明細書にも記載されるように、CARは細胞内シグナル伝達ドメインを欠き得る。多価CLTX-CARにおいて、抗原認識ドメインは、1つより多くのCLTXペプチド、例えば2、3、4、5またはそれ以上のCLTXペプチドを含み得る。その抗原認識ドメイン内にCLTXペプチドを含むCARは、本明細書においてCLTX-CARと称される。「多価CLTX-CAR」は、抗原認識ドメイン中に1つより多くのCLTXペプチドを含むCTLX-CARであり；例えば1つより多くのCLTXペプチドは、ペプチド(1つまたは複数)により連結され得る。かかる連結ペプチドは本明細書において、「リンカーペプチド」または「連結ペプチド」と称される。一対のCLTXペプチドを連結するリンカーペプチドは、抗原認識ドメイン内の異なるペアのCLTXペプチドを連結するペプチドと同じであり得るかまたは異なり得；例えば3つのCLTXペプチドを含む多価CLTX-CARにおいて、2つのペプチド(例えば第1および第2のペプチド)を連結するリンカーペプチドは、連結する(例えば第2のペプチドおよび第3のペプチド)リンカーペプチドと同じであり得るかまたは異なり得る。用語「二重(double)CLTX-CAR」または「dCLTX-CAR」または「二価CAR」または「2xCLTX-CAR」は、抗原認識ドメイン内に2つのCLTXペプチドを含むCARをいい；2つのCLTXペプチドは、リンカーペプチドにより結合され得る。「単一CLTX-CAR」または「sCLTX-CAR」または「1xCLTX-CAR」は、抗原認識ドメイン内に1つのみのCLTXペプチドを含むCARをいう。
本明細書で使用する場合、用語「クロロトキシン」および「CLTX」または「CTX」は、交換可能に使用され、アミノ酸配列：MCMPCFTTDHQMARKCDDCCGGKGRGKCYGPQCLCR(配列番号：1) (UniProt受託番号P45639)を有する36アミノ酸を含むサソリ毒ペプチドクロロトキシンをいう。理論に拘束されることを望まないが、CLTXペプチド結合ドメインは、γδT細胞の固形腫瘍、例えば限定されないが神経膠腫、肝臓癌、卵巣癌および標的を発現する他のものへの移動を高めるように作用し得る。CLTXペプチドはまた、黒色腫、小細胞肺癌、神経芽腫、乳癌、腎臓癌、肝臓癌、肺癌、卵巣癌および髄芽腫への移動を高め得る。
他のCAR設計の特異性は、受容体のリガンド(例えばペプチド)に由来し得る。特定の場合において、抗原認識ドメインの間隔は、活性化誘導細胞死を低減するように改変され得る。特定の場合において、CARの細胞内シグナル伝達ドメインは、限定されないが、CD3ζに加えてFcR、CD27、CD28、CD137、DAP10および/またはOX40などのさらなる共刺激性シグナル伝達のためのドメインを含む。いくつかの場合において、共刺激分子、画像化のため(例えば陽電子放射断層撮影法のため)のレポーター遺伝子、CARを発現するホスト細胞がさらなる治療的処置により生じる治療環境において生存することを可能にする遺伝子産物、プロドラッグの添加の際にCARを発現するホスト細胞を条件的に除去する遺伝子産物、ホーミング受容体、ケモカイン、ケモカイン受容体、サイトカインおよびサイトカイン受容体などの分子が、CARと共発現され得る。
本明細書にも記載されるように、CLTX-CARは、細胞内シグナル伝達ドメインを含まないCLTX-CARであり得る。
本発明はまた、CLTXペプチドの1つより多くの機能性バリアントを含む多価CARを包含し、該機能性バリアントは、同じであり得るかまたは異なり得る。本発明はさらに、1つより多くのCLTX様ペプチドを含む多価CARを含み、該CLTX様ペプチドは、同じであり得るかまたは異なり得る。本発明はさらに、細胞外抗原結合ドメイン内に以下：CLTXペプチド、CLTX様ポリペプチドおよびCLTXペプチドの機能性バリアントの1つより多く(例えば2つ)を含む多価CARを包含する。例えば、二価CARは、2つのCLTXペプチドもしくは2つのCLTX様ポリペプチドもしくはCLTXペプチドの2つの機能性バリアントまたはそれらの組み合わせ(例えば1つのCLTXペプチドおよび1つのCLTX様ポリペプチド)を含み得る。
CLTXペプチドの「機能性バリアント」は、クロロトキシン(CLTX)(例えば配列番号：1)に対して実質的または有意な配列同一性または類似性を有するペプチドであり、該機能性バリアントは、クロロトキシンペプチドの生物学的活性を保持する。例えば、CLTXの機能性バリアントを含むCARは、CLTX-CARの生物学的活性の少なくともいくつかを保持し；例えば親CLTX-CARと同様の程度、同じ程度またはそれより高い程度まで標的細胞を認識する能力を保持する。用語「CLTXの機能性バリアント」および「CLTXペプチドの機能性バリアント」は本明細書において交換可能に使用される。CLTXペプチドの機能性バリアントは、CLTXペプチド(例えば配列番号：1)に対して少なくとも約65%同一、少なくとも約80%同一、約90%同一、約95%同一または約99%同一であるアミノ酸配列であり得るかまたはそれを有し得る。例えば、本明細書に記載される多価CARは、細胞外抗原認識ドメイン内のCLTXの少なくとも1つの機能性バリアントを利用し得(抗原認識部分は、CLTXペプチド、CLTXの別の機能性またはCLTX様ペプチドをさらに含み得)、CLTXのかかる機能性バリアントは、配列番号：1と70%、80%、90%、95%またはそれ以上の相同性を有する配列を含む。
例えば、少なくとも1つのアミノ酸改変(限定されないが欠失、挿入および置換など)を有するCLTXのアミノ酸配列を含み得る機能性バリアントは、所望のCTX-CAR機能性バリアントを生じるために当業者に公知であるように選択され得る。配列番号：1のアミノ酸配列に対する保存的改変(およびコードヌクレオチドに対応する改変)は、天然に存在するCLTXのものと同様の機能的および化学的特性を有する機能性バリアントを作製する。
句「保存的アミノ酸置換」または「保存的変異」は、1つのアミノ酸の、共通の特性を有する別のアミノ酸での置き換えをいう。保存的変異の例としては、同じアミノ酸サブグループ内のアミノ酸のアミノ酸置換、例えば正の電荷が維持され得るようなアルギニンの代わりのリジンおよびその逆；負の電荷が維持され得るようなアスパラギン酸の代わりのグルタミン酸およびその逆；遊離-OHが維持され得るようなトレオニンの代わりのセリン；ならびに遊離-NH2が維持され得るようなアスパラギンの代わりのグルタミンが挙げられる。「保存的アミノ酸置換」は、その位置でのアミノ酸残基の極性または電荷にほとんどまたは全く影響がないような天然のアミノ酸残基の非天然の残基による置換を含み得る。さらに、ポリペプチド中の任意の天然の残基はまた、アラニンで置換され得る。保存的アミノ酸置換はまた、生物学系における合成ではなく典型的に化学的ペプチド合成により組み込まれる天然に存在しないアミノ酸残基を包含する。これらは、ペプチド模倣物、およびアミノ酸部分の他の逆転または反転形態を含む。本明細書に記載される核酸およびポリペプチド分子は、化学的に合成され得、組換え手段により作製され得ることが当業者に理解される。天然に存在する残基は、共通の側鎖の特性：1)疎水性：ノルロイシン、Met、Ala、Val、Leu、lie；2)中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；3)酸性：Asp、Glu；4)塩基性：His、Lys、Arg；5)鎖の配向に影響する残基：Gly、Pro；および6)芳香族：Tip、Tyr、Pheに基づいて分類に分けられ得る。特にかかる非保存的アミノ酸が同様の活性を有する関連するポリペプチドにおいて生じる場合に、非保存的アミノ酸置換も企図される。例えば非保存的置換は、別の部類由来のメンバーへのアミノ酸部類の1つのメンバーの交換を含み得る。かかる置換された残基は、関連のあるCLTXポリペプチドオーソログと相同なCLTXまたはCLTX様ペプチド機能性バリアントの領域、または該分子の非相同領域に導入され得る。かかる変化の作製において、アミノ酸のハイドロパシー指数が考慮され得る。それぞれのアミノ酸は、それらの疎水性および電荷特性に基づいてハイドロパシー指数が割り当てられ、これらは：イソロイシン(+4.5)；バリン(+4.2)；ロイシン(+3.8)；フェニルアラニン(+2.8)；システイン/シスチン(+2.5)；メチオニン(+1.9)；アラニン(+1.8)；グリシン(-0.4)；トレオニン(-0.7)；セリン(-0.8)；トリプトファン(-0.9)；チロシン(-1.3)；プロリン(-1.6)；ヒスチジン(-3.2)；グルタミン酸(-3.5)；グルタミン(-3.5)；アスパラギン酸(-3.5)；アスパラギン(-3.5)；リジン(-3.9)；およびアルギニン(-4.5)である。タンパク質に相互作用性生物学的機能を付与することにおけるハイドロパシーアミノ酸指数の重要性は、当該技術分野において理解される(Kyle et a!., J. Mol. Biol., 157: 105-131, 1982)。特定のアミノ酸は、同様のハイドロパシー指数またはスコアを有する他のアミノ酸の代わりとして置換され得、依然として同様の生物学的活性を保持することが公知である。ハイドロパシー指数に基づく変化の作製において、そのハイドロパシー指数が+/-2以内であるアミノ酸の置換が使用され得；代替的な態様において、ハイドロパシー指数は+/-1以内であり；さらに別の代替的な態様において、ハイドロパシー指数は+/-0.5以内である。同様のアミノ酸の置換が親水性に基づいて有効に作製され得ることも当該技術分野において理解される。その隣接するアミノ酸の親水性により支配されるポリペプチドの最も大きな局所的平均親水性は、タンパク質の生物学的特性に相関する。以下の親水性値がアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン(+3.0)；リジン(+3.0)；アスパラギン酸(+3.0.+-.1)；グルタミン酸(+3.0.+-.1)；セリン(+0.3)；アスパラギン(+0.2)；グルタミン(+0.2)；グリシン(0)；トレオニン(-0.4)；プロリン(-0.5 1)；アラニン(-0.5)；ヒスチジン(-0.5)；システイン(-1.0)；メチオニン(-1.3)；バリン(-1.5)；ロイシン(-1.8)；イソロイシン(-1.8)；チロシン(-2.3)；フェニルアラニン(-2.5)；トリプトファン(-3.4)。同様の親水性値に基づく変化の作製において、その親水性値が+/-2以内であるアミノ酸の置換が使用され得；代替的な態様において、親水性値は+/-1であり；さらに別の代替的な態様において、親水性値は+/-0.5以内である。
所望のアミノ酸置換(保存的または非保存的のいずれにせよ)は、かかる置換が望ましい時間に当業者により決定され得る。例えば、アミノ酸置換は、本開示のCLTX-CARの活性(例えばエフェクター機能および/または免疫エフェクター機能)を増加または減少するために、CLTXの重要な残基を同定するように、または特定の結合標的とのCLTXの親和性を増加もしくは減少するように使用され得る。
一態様において、CLTXの機能性バリアントは、1、3、10、13、14、17、25および36位(配列番号：1に関する位置)に対応する位置で1つ以上の置換を含むものである。かかる態様の一局面において、示される位置でのかかるCLTX機能性バリアントについての好ましい置換としては：1位でのMetの代わりのArg；3位でのMetの代わりのLysまたはSer；10位でのHisの代わりのProまたはGln；13位でのAlaの代わりのSerまたはThr；14位でのArgの代わりのLys；17位でのAspの代わりのAlaまたはTyr；25位でのArgの代わりのLys；および36位でのArgの代わりのAlaが挙げられる。かかる態様のある局面において、CTXの機能性バリアントは、示される位置から6以下の置換、示される位置から4以下の置換または示される位置から2以下の置換を含む。
一態様において、CLTXの機能性バリアントは、23および24位(配列番号：1に関する位置)でアミノ酸の欠失ありまたはなしで、9～11、14～15、17～18、25および29位に対応する位置で1つ以上の置換を含むものである。かかる態様の一局面において、示される位置でのかかるCTX機能性バリアントについての好ましい置換としては：9位でのAspの代わりのArg；10位でのHisの代わりのProまたはGln；11位でのGlnの代わりのAsnまたはAsp；14位でのArgの代わりのLys、GlnまたはAsn；15位でのLysの代わりのArgまたはGln；17位でのAspについてのAsn、Ala、ArgまたはTyr；18位でのAspの代わりのGluまたはAla；25位でのArgの代わりのTyr、Lys、He、GlyまたはAsn；29位でのTyrの代わりのPhe；および36位でのArgの代わりのAsnまたはAlaが挙げられる。かかる態様の別の局面において、示される位置でのかかるCTX機能性バリアントについての好ましい置換としては：9位でのAspの代わりのArg；10位でのHisについてのPro；11位でのGlnの代わりのAsn；14位でのArgの代わりのLysまたはGln；15位でのLysの代わりのGln；17位でのAspの代わりのArg；18位でのAspの代わりのAla；25位でのArgの代わりのAsn；29位でのTyrの代わりのPhe；および36位でのArgの代わりのAsnが挙げられる。かかる態様のある局面において、CTXの機能性バリアントは、示される位置から6以下の置換、示される位置から4以下の置換または示される位置から2以下の置換を含む。
一態様において、CLTXの機能性バリアントは、23および24位(配列番号：1に関する位置)でアミノ酸の欠失を有するかまたは有さずに、1、3、9～15、17～18、21、25～26、29～31および36位に対応する位置で置換を含むものである。かかる態様の一局面において、示される位置でのかかるCTX機能性バリアントについての好ましい置換としては：1位でのMetの代わりのArg；3位でのMetの代わりのLys、SerまたはGly；9位でのAspの代わりのArg；10位でのHisの代わりのProまたはGln；11位でのGlnについてのAsnまたはAsp；12位でのMetの代わりのTyr；13位でのAlaの代わりのSer、ThrまたはGlu；14位でのArgの代わりのLys、GlnまたはAsn；15位でのLysの代わりのArgまたはGln；17位でのAspの代わりのAsn、Ala、ArgまたはTyr；18位でのAspの代わりのGluまたはAla；21位でのGlyの代わりのArgまたはLys；25位でのArgの代わりのTyr、Lys、Ile、GlyまたはAsn；27位でのGlyの代わりのLys；29位でのTyrの代わりのPhe；30位でのGlyの代わりのPhe；31位でのAspの代わりのGlyまたはTyr；および36位でのArgの代わりのAsnまたはAlaが挙げられる。かかる態様のある局面において、CLTXの機能性バリアントは、示される位置から12以下の置換、示される位置から10以下の置換、示される位置から8以下の置換、示される位置から6以下の置換、示される位置から4以下の置換または示される位置から2以下の置換を含む。
別の態様において、CLTXの機能性バリアントは、配列番号：1のアミノ酸2～36の配列を有するポリペプチドである。かかる態様の一局面において、CLTXバリアントは、上述のアミノ酸1、3、10、13、14、17、25および36について記載されるアミノ酸置換、上述のアミノ酸9～11、14～15、17～18、25および29について記載されるアミノ酸置換または上述のアミノ酸1、3、9～15、17～18、21、25～26、29～31および36について記載されるアミノ酸置換を有し得る。
別の態様において、CLTXの機能性バリアントは、配列番号：1のアミノ酸1～35の配列を有するポリペプチドである。かかる態様の一局面において、CLTXバリアントは、アミノ酸1、3、10、13、14、17、25および36について記載されるアミノ酸置換、上述のアミノ酸9～11、14～15、17～18、25および29について記載されるアミノ酸置換または上述のアミノ酸1、3、9～15、17～18、21、25～26、29～31および36について記載されるアミノ酸置換を有し得る。別の態様において、CLTXの機能性バリアントは、配列番号：1のアミノ酸2～35の配列を有するポリペプチドである。かかる態様の一局面において、CLTXバリアントは、アミノ酸1、3、10、13、14、17、25および36について記載されるアミノ酸置換、上述のアミノ酸9～11、14～15、17～18、25および29について記載されるアミノ酸置換または上述のアミノ酸1、3、9～15、17～18、21、25～26、29～31および36について記載されるアミノ酸置換を有し得る。
「クロロトキシン様ペプチド」は、CLTXのものと同様の一次構造を有するペプチドであり、例えばその内容が参照により本明細書に明確に援用されるWO2018107134に記載されるものを含む。かかるペプチドとしては、限定されないが、Bs8 (Uniprot Acc. No. PI 5229)、インセクトトキシン(Insectotoxin)-I4 (UniProt Acc No P60269)、Lqh 8/6 (UniProt Acc No. P55966)、インセクトトキシン-13 (UniProt Acc No P60268)、インセクトトキシン-I5A (UniProt Acc No PI 5222)、MeuCITx (UniProt Acc No P86401)、GaTxl (UniProt Acc No P85066)、インセクトトキシン-I5 (UniProt Acc No P60270)、インセクトトキシン-I1 (UniProt Acc No P15220)；Bml2-b (UniProt Acc No Q9BJW4)；BmK CT (UniProt Acc No Q9UAD0；特にアミノ酸25～59；シグナルペプチドアミノ酸残基1～24の除去により生じる)；AaCtx (UniProt Acc No P86436)、MeuCITx-1 (UniProt Acc No P86402)；Bsl4 (UniProt Acc No P59887)；AmmP2 (UniProt Acc No P01498)；BtlTx3 (UniProt Acc No p81761、特にアミノ酸25～6；シグナルペプチドアミノ酸残基1～24の除去により生じる)およびアミノ酸25～62；シグナルペプチドアミノ酸残基1～24およびプロペプチドアミノ酸残基62の除去により生じる、が挙げられる。
用語「抗原認識ドメイン」、「抗原認識部分」、「抗原結合ドメイン」、「抗原結合部分」等は、本明細書において交換可能に使用される。同様に、用語「膜貫通ドメイン」、「膜貫通部分」、「膜貫通領域」等は交換可能に使用され；用語「ヒンジドメイン」、「ヒンジ部分」および「ヒンジ領域」等は交換可能に使用され：用語「細胞内シグナル伝達ドメイン」、「シグナル伝達ドメイン」、「シグナル伝達部分」、「シグナル伝達領域」等は本明細書において交換可能に使用される。
句「治療有効量」または「有効量」は、被験体への薬剤または組成物投与の文脈において、被験体に投与される場合に、疾患、障害または状態の任意の症状、局面または特徴に対して任意の検出可能な正の効果を有し得る量をいい；該薬剤または組成物は、単独でまたは医薬組成物の一部としてのいずれかで、単回用量でまたは一連の投与の一部のいずれかで投与され得る。治療有効量または有効量は、関連のある生理学的効果を測定することにより確かめられ得、これは、投与養生法および被験体の状態の診断分析等に関して調整され得る。癌または制御されない細胞分裂に関連する病状に関して、治療有効量または有効量は、(1)腫瘍のサイズを低減する(すなわち腫瘍退縮)、(2)異常な細胞分裂、例えば癌細胞分裂を阻害する(すなわちある程度まで遅延する、好ましくは停止する)、(3)癌細胞の転移を予防もしくは低減する、(4)制御されないもしくは異常な細胞分裂に部分的に関連するかもしくはそれにより引き起こされる病状、例えば癌に関連する1つ以上の症状をある程度まで和らげる(または好ましくは排除する)、(5)被験体の生存または余命を増加する、および/または(6)再発のリスクを減少する効果を有する量をいい得る。「有効量」はまた、本発明の治療活性組成物の投与の際に、所望のPDおよびPKプロフィールならびに所望の免疫細胞プロフィールを生じる量である。「有効量」はまた、記載される効果または結果を達成する量であり；例えば有効量の化学療法剤は、単独でまたは別の薬剤と組み合される場合に、腫瘍のサイズを低減するおよび/または腫瘍細胞上でストレス抗原発現を増加するおよび/または細胞傷害性効果を有する量であり得る。
用語、疾患(または状態もしくは障害)を「治療すること」またはその「治療」は、本明細書で使用する場合、疾患を阻害すること(その発症の遅延または阻止)、疾患の症状または副作用からの軽減を提供すること(例えば軽減的処置)、再発を予防または遅延すること、および疾患の後退を引き起こすことをいう。癌に関して、これらの用語はまた、癌に罹患した個体の余命が増加され得ることまたは疾患の症状の1つ以上が低減されることを意味する。癌に関して、「治療すること」はまた、被験体において抗腫瘍応答を高めることまたは延長することを含む。
本明細書で使用する場合、「組合せ」、「組み合された治療」および/または「組み合された治療養生法」の任意の投与形態または「共投与」もしくは「共投与すること」等は、別々または組み合わされた製剤のいずれかにおいて同時もしくは実質的に同時、または分、時間、日、週もしくは月で分離された異なる時間で連続の少なくとも2つの治療活性薬物または組成物の投与(例えばγδT細胞および化学療法剤またはその医薬組成物の投与)をいうが、いくつかの様式において、例えば同じ治療養生法の一部として所望の治療応答を提供するように一緒に作用する。
用語「高める」、「高めること」、「高められた」等は、本明細書で使用する場合、参照される応答または結果の増加をいう。例えば「細胞傷害性を高めること」は細胞傷害性を増加することをいい、「活性化を高めること」は活性化を増加することをいう。同様に、高められた持続性は持続性を高めることを意味する。用語「高めること」等は、被験体または腫瘍細胞が、本明細書に開示される治療に応答するその能力を向上することを可能にすることも包含し得る。高められた応答は、少なくとも約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%もしくは98%またはそれ以上の応答性(細胞傷害性、活性化および/または持続性)の増加を含み得る。高められた応答性は、癌もしくは腫瘍に対する高められた細胞傷害性および/または高められたT細胞活性化および/または高められた持続性を包含し得る。
多価CLTX-CARγδT細胞(またはその組成物)、例えば二価CLTX-CARγδT細胞(またはその組成物)により示されるかまたは発揮される高められた活性化および/または高められた細胞傷害性は、同等のsCLTX-CARまたはその組成物の活性化または細胞傷害性に基づいて予測される相加的な効果と比較して、より高い相加的な効果または相乗的な効果を包含し得る。本明細書で定義される場合、「相乗的な効果」は、相加的な効果よりも高い。相加的な効果は、相乗効果を決定するためのベースラインとみなされ、それは、相乗効果が存在しない場合に組合せに基づいて理論的に予想または予測される効果である(Roell et al. (2017), Front. Pharmacol. 8(158); https://doi.org/10.3389/fphar.2017.00158；その内容は本明細書において参照により明確に援用される)。例えば、多価CLTX-CARγδT細胞(またはその組成物)が細胞外抗原結合ドメイン内に2つのみのCLTXペプチドを含む場合、相乗的な効果または細胞傷害性または活性化に対する相加的な効果よりも高い効果は、同等のsCLTX-CARまたはその組成物の細胞傷害性または活性化の2倍よりも高い。ある態様において、dCLTX-CARまたはその組成物の相加的よりも高い効果または相乗的な効果は、2倍(fold)よりも大きい。特定の態様において、dCLTX-CARまたはその組成物の相加的よりも高い効果または相乗的な効果は、同等のsCLTX-CARまたはその組成物のものよりも、少なくとも約2.5倍(または少なくとも約2.5倍(times))、少なくとも約3倍(または少なくとも約3倍)、少なくとも約3.5倍(または少なくとも約3.5倍)、少なくとも約4倍(または少なくとも約4倍)および少なくとも約4.5倍(または少なくとも約4.5倍)高い。
用語「被験体」および「患者」は、本明細書で使用する場合、ヒト、哺乳動物(例えばネコ、イヌ、ウマ等)、生体細胞および他の生きた生物を含む。生きた生物は哺乳動物であり得る。典型的な患者は哺乳動物、特に霊長類、特にヒトである。獣医学的適用について、広範囲の被験体、例えば畜牛、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ブタ等の家畜；ニワトリ、アヒル、ガン、シチメンチョウ等の家禽；ならびにイヌおよびネコなどの家庭内動物、特にペットが適切である。診断または研究用途について、げっ歯類(例えばマウス、ラット、ハムスター)、ウサギ、霊長類および同系交配のブタなどのブタ等の広範囲の哺乳動物が適切な被験体である。好ましくは、系は、試料および被験体を含む。用語「生体宿主」は、生きており、死んでいない上述の宿主または生物をいう。用語「生体宿主」は、宿主または生物の全体をいい、生体宿主から切除された一部(例えば肝臓または他の臓器)のみではない。好ましい局面において、被験体または患者は、ヒト被験体または患者である。
用語「γδT細胞」または「ガンマデルタT細胞」は、本明細書で使用する場合、それらの表面上で別々のT細胞受容体(TCR)を発現するT細胞のサブセットをいう。T細胞の大部分は、α-およびβ-TCR鎖と称される2つの糖タンパク鎖で構成されるTCRを有する。対照的に、γδT細胞において、TCRは、1つのγ鎖および1つのδ鎖で構成される。T細胞のこの群は通常、αβT細胞よりもかなり一般的ではない。γδT細胞は、抗原プロセッシングおよびペプチドエピトープのMHC提示を必要としない点で、T細胞型の中で特有である。さらに、γδT細胞は、脂質抗原の認識に顕著な役割を有し、MIC-AおよびMIC-BならびにNKG2D受容体の他のリガンドなどのストレス関連抗原に応答すると考えらえる。
ヒトγδT細胞はまた、抗原提示能力を発揮し得る。樹状細胞(DC)と同様に、血液Vγ9Vδ2 T細胞は、微生物および腫瘍からのシグナルに応答し得、CD4+およびCD8+ T細胞を誘導し得る。γδT-APCは、抗原をCD8+ T細胞に直接交差提示すると考えられる。細胞内タンパク質分解およびエンドソーム酸性化は、単球由来DCと比較して、γδT細胞において有意に遅延される。抗原は、IRAP(インスリン制御アミノペプチダーゼ)陽性初期および後期エンドソームを通って輸送され、それらのプロセッシングは、MHC-I負荷区分に導入される前の、プロテアソームによる分解のための細胞質への運び出しからなる。活性化されたγδT細胞は、おそらくC/EBPα(CCAAT/エンハンサー結合タンパク質α)依存性機構におけるスカベンジャー受容体CD36により腫瘍抗原およびアポトーシス細胞または生体癌細胞を貪食し得、腫瘍抗原特異的CD8+ T細胞応答を展開する。γδT細胞はまた、TNF-α産生によりDC成熟を誘導し得る。全体的に、γδT細胞は、提示のために広範囲の抗原を処理し得、他の免疫細胞を刺激し得る。そのため、感染または癌に応答するγδT細胞の関与は、ヒトγδT細胞系免疫療法の臨床的応答を向上するために、新規の戦略を設計するように強化され得る。
例えば化学療法剤またはDDR阻害により生じる増加した腫瘍免疫原性(例えばNKG2D受容体に対するリガンドの増加した上方制御)は、γδT細胞媒介腫瘍免疫サーベイランス、および最終的にγδT細胞による腫瘍細胞殺傷の特有の助けとなる。
細胞組成物または細胞の集団は、例えばγδT細胞または遺伝子工学で作り変えられたγδT細胞について富化され得る。用語「富化される」は、本明細書で使用する場合、本明細書に開示されるように、試料中に存在する1つ以上の細胞傷害性免疫細胞型(例えばγδT細胞および/またはNK細胞)の総パーセンテージが、富化の前の同じ1つ以上の細胞型の総パーセンテージと比較して、増加することをいう。例えば、細胞傷害性免疫細胞の1つ以上の型について「富化」される試料は、試料中の1つ以上の細胞傷害性免疫細胞の約10%～100%を含み得、富化前の試料中の1つ以上の細胞傷害性免疫細胞型の総パーセンテージは、例えば0%～10%であった。好ましくは、富化された試料は、1つ以上の型の細胞傷害性免疫細胞の少なくとも10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、50%、60%、70%、80%、90%または100%を含む。試料は、標準的な技術、例えばフローサイトメトリー技術を使用して、1つ以上の細胞型について富化され得る。用語「高度に富化される」は、本明細書で使用する場合、1つ以上の細胞傷害性免疫細胞型が試料中の細胞傷害性免疫細胞型の少なくとも約70%～約100%を含み得るように試料中の1つ以上の細胞傷害性免疫細胞型の総パーセンテージを増加することをいい、富化の前の細胞傷害性免疫細胞の同じ型の総パーセンテージは、例えば0%～10%であった。好ましくは、高度に富化された試料は、細胞傷害性免疫細胞の1つ以上の型の少なくとも60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%またはそれ以上を含む。試料は、標準的な技術、例えばフローサイトメトリー技術を使用して、1つ以上の細胞型について高度に富化され得る。
細胞組成物または集団は、γδT細胞または遺伝子工学で作り変えられたγδT細胞または例えばその任意のサブセットの拡大された集団を含み得る。用語「拡大される」および「拡大」は、試料中の1つ以上の細胞傷害性免疫細胞の拡大に関して本明細書で使用する場合、例えば約少なくとも2倍だけ、好ましくは約5倍だけ、好ましくは少なくとも10倍だけ、好ましくは約少なくとも50倍またはそれ以上、試料中の1つ以上の細胞傷害性免疫細胞の数を増加することを意味する。細胞傷害性免疫細胞集団の拡大は、当該技術分野で公知のような任意の数の方法により達成され得る。例えば、T細胞は、フィーダーリンパ球およびインターロイキン-2(IL-2)またはインターロイキン-15(IL-15)のいずれかの存在下、非特異的T細胞受容体刺激を使用して迅速に拡大され得、ここでIL-2が好ましい。非特異的T細胞受容体刺激は、約30ng/mlのOKT3、マウスモノクローナル抗CD3抗体(ORTHO-MCNEIL(登録商標)、Raritan, N.J.から入手可能)を含み得る。代替的に、T細胞は、癌の1つ以上の抗原(例えばエピトープ(1つまたは複数)などのその抗原性部分または細胞)を用いてインビトロで末梢血単球(PBMC)の刺激により迅速に拡大され得、これは、300IU/ml IL-2またはIL-15などのT細胞増殖因子の存在下、ヒト白血球抗原A2 (HLA-A2)結合ペプチド、例えば0.3μM MART-1:26-35(27L)またはgp100:209-217 (210M)などのベクターから任意に発現され得、ここでIL-2が好ましい。γδT細胞を拡大させる方法は、例えばWO2017035375およびWO2011053750に記載され；その内容は本明細書において参照により明確に援用される。
γδT細胞は、ヒト誘導多能性幹細胞(hiPSC)にも由来し得る。例えば多能性幹細胞は、癌を有する患者から単離され得る。他の局面において、多能性幹細胞は、癌を有する患者以外の供給源から単離され得る。任意に富化されるおよび/または任意に拡大されるγδT細胞を含む組成物は、ナチュラルキラー(NK)細胞も含み得、任意にさらに、限定されないが、単球、マクロファージおよび樹状細胞を含む他の免疫コンピテント細胞を含み得る。誘導多能性幹細胞からγδT細胞を作製するための方法は、例えばWatanabe et al. 2017, Stem Cells Transl Med 7(1): 34-44およびZeng et al. (2019), PLoS One 14(5): e0216815に記載されており；それらのそれぞれの内容は、本明細書において参照により明確に援用される。
用語「単離された」および細胞の「単離された集団」は、本明細書で使用する場合、組織または細胞が被験体中に見られる状態から除去される細胞または複数の細胞をいう。該用語は、限定されないが、細胞表面マーカー、色素または標識などのレポーターマーカーなどのパラメーターに従って分離された細胞をさらに含み得る。
用語「発現される」または「発現」は、本明細書で使用する場合、遺伝子の2つの核酸鎖の1つの領域に対して少なくとも部分的に相補的であるRNA核酸分子を与える遺伝子からの転写をいう。用語「発現される」または「発現」は、本明細書で使用する場合、タンパク質、ポリペプチドまたはその一部もしくは断片を与える該RNA核酸分子からの翻訳もいう。
用語「ベクター」は、本明細書で使用する場合、一本鎖、二本鎖、環状またはスーパーコイルのDNAまたはRNAで構成されるポリヌクレオチドをいう。典型的なベクターは、機能的遺伝子発現を可能にするための適切な間隔で操作的に連結される以下の因子：複製起点、プロモーター、エンハンサー、5'mRNAリーダー配列、リボソーム結合部位、核酸カセット、終結およびポリアデニル化部位、ならびに選択可能マーカー配列で構成され得る。これらの因子の1つ以上は、具体的な適用において省略されてもよい。該ベクターは、発現される核酸配列の挿入のための制限部位を含み得る核酸カセットも含み得る。機能的ベクターにおいて、核酸カセットは、翻訳開始および終結部位を含む、発現される核酸配列を含む。特定のコーディング配列(例えば本開示の多価CLTX-CARのためのコーディング配列)が、適切な制御配列を有するベクター内に位置するようにベクターが構築され、制御配列に関するコーディング配列の配置決定および配向は、コーディング配列が、制御配列の「制御下」で操作可能に連結されおよび/または転写されるようなもである。特定の目的のタンパク質をコードする配列の改変は、この目的を達成するために望ましくあり得る。例えば、いくつかの場合において、配列が、適切な配向を有する制御配列に操作可能に連結され得るように配列を改変することまたはリーディングフレームを維持することが必要であり得る。制御配列および/または他の調節配列は、ベクターへの挿入前にコーディング配列にライゲーションされ得る。代替的に、コーディング配列は、制御配列の調節性制御を有しかつその下にあるリーディングフレーム内にある制御配列および適切な制限部位を既に含む発現ベクター内に直接クローニングされ得る。
用語「プロモーター」は、本明細書で使用する場合、RNAポリメラーゼからの転写開始の部位を決定するDNA配列をいう。「プロモーター近位因子」は、転写開始部位の約200塩基対以内にある調節配列であり得る。
用語「組換え細胞」は、自然には互いに共有結合しない核酸断片の新規の組合せを有する細胞をいう。核酸断片の新規の組み合わせは、当業者に利用可能な広範囲の核酸操作技術を使用して生物に導入され得る。組換え細胞は、単一の真核細胞または単一の原核細胞または哺乳動物細胞であり得る。組換え細胞は、ゲノム外(extragenomic)にあるベクターを有し得る。ゲノム外核酸ベクターは、細胞のゲノムに挿入されない。組換え細胞は、ゲノム内(intragenomic)にあるベクターまたはその一部をさらに有し得る。用語「ゲノム内」は、組換え細胞のゲノム内に組み込まれる核酸構築物を画定する。
用語「組換え核酸」および「組換えDNA」は、本明細書で使用する場合、真核または原核細胞内に天然には見られない少なくとも2つの核酸配列の組合せをいう。核酸配列としては、限定されないが、核酸ベクター、遺伝子発現調節因子、複製の起点、発現される場合に抗生物質耐性を付与する適切な遺伝子配列、タンパク質コード配列等が挙げられる。用語「組換えポリペプチド」は、その位置、純度または構造のいずれかにおいて天然に存在するポリペプチドとは別であるような、組換えDNA技術により作製されるポリペプチドを含むことを意味する。一般的に、かかる組換えポリペプチドは、通常自然において観察されるものとは異なる量で細胞内に存在する。
用語「操作可能」または「操作可能に連結される」は、本明細書で使用する場合、所望の機能を実行するようなコーディング配列および制御配列の構成をいう。したがって、コーディング配列に操作可能に連結される制御配列は、コーディング配列の発現を実行し得る。コーディング配列は、DNAポリメラーゼがプロモーター配列に結合して、コーディング配列を、コードされるタンパク質に翻訳され得るmRNAに転写する場合に、細胞内の転写調節領域に操作可能に連結されるかまたはその制御下にある。制御配列は、その発現を方向づけるように機能する限りは、コーディング配列と連続する必要はない。したがって、例えば介在する、翻訳されないが転写される配列は、プロモーター配列とコーディング配列の間に存在し得、プロモーター配列は、依然としてコーディング配列に「操作可能に連結される」とみなされ得る。
用語「異種」および「外因性」は、それらがコーディング配列および制御配列などの核酸配列に関連する場合、通常は組換え構築物の領域もしくは特定の染色体座と関連しない、および/または通常は特定の細胞と関連しない配列を示す。したがって、核酸構築物の「異種」領域は、自然には他の分子との関連において見られない別の核酸分子内にあるかまたはそれに結合する核酸の同定可能な区分である。例えば、構築物の異種領域は、自然にはコーディング配列との関連において見られない配列と隣り合うコーディング配列を含み得る。異種コーディング配列の別の例は、自然にはコーディング配列自体が見られない構築物である(例えば天然の遺伝子とは異なるコドンを有する合成配列)。同様に、通常は宿主細胞内に存在しない構築物で形質転換される宿主細胞は、本発明の目的について異種とみなされる。
好ましくは、プロモーターは、配列の付加または欠失により改変されるか、または天然および合成の配列ならびに合成および天然の配列の組み合わせであり得る配列などの代替的な配列で置き換えられる。多くの真核生物プロモーターは、2種類の認識配列：TATAボックスおよび上流プロモーター因子を含む。転写開始部位の上流に位置する前者は、正確な部位で転写を開始させるようにRNAポリメラーゼを方向づけることに関与し、後者は、転写の速度を決定するように思われ、TATAボックスの上流にある。エンハンサー因子も、連結されたプロモーターからの転写を刺激し得るが、多くは特定の細胞型においては排除的に機能し得る。ウイルス、例えばSV40、ラウス肉腫ウイルス(RSV)およびCMVプロモーター由来の多くのエンハンサー/プロモーター因子は、広範囲の細胞型において活性であり、「構成的」または「遍在的」と称される。クローニング部位に挿入される核酸配列は、目的のポリペプチドをコードする任意のオープンリーディングフレームを有し得、コーディング配列が目的のポリペプチドをコードすると仮定すると、それは、適切なmRNA分子の産生を妨げ得るおよび/または異常にスプライシングされるかもしくは異常なmRNA分子を生じ得る潜在的なスプライス部位を欠くはずである。
終結領域は比較的交換可能であると思われるので、主に使用される終結領域は、便利さの1つである。終結領域は、意図される目的の核酸配列に対して天然であり得るか、または別の供給源に由来し得る。
用語「標的化された治療」は、本明細書で使用する場合、免疫系の任意の局面を標的化する任意の治療分子をいう。
用語「形質転換」、「形質導入」および「形質導入」は全て、レシピエント細胞(1つまたは複数)へのポリヌクレオチドの導入を示す。
本発明は、多価CLTXキメラ抗原受容体(CLTX-CAR)を発現し、生存因子を発現する遺伝子工学で作り変えられたγδT細胞を提供し、生存因子は、化学療法剤に対する耐性を付与するDNA、RNAまたはポリペプチドである。本発明はさらに、多価CLTXキメラ抗原受容体(CLTX-CAR)および化学療法剤に対する耐性を付与するポリペプチドを発現する遺伝子工学で作り変えられたγδT細胞を提供し、該γδT細胞は、CLTX-CARおよび化学療法剤に対する耐性を付与するポリペプチドの発現を方向づける単一のベクターを含む。上述のように、多価CLTX-CARの抗原結合ドメインは、少なくとも2つのCLTXペプチドを含み、少なくとも2つのCLTXペプチドは、リンカーペプチドにより結合され；任意にリンカーペプチドは1～30アミノ酸長であるかまたはリンカーペプチドは15アミノ酸長未満である。ある局面において、多価CLTX-CARは、2つのCLTXペプチド(またはすなわち「2つのみのCLTXペプチド」)、3つのCLTXペプチド(またはすなわち「3つのみのCLTXペプチド」)または4つのCLTXペプチド(またはすなわち「4つのみのCLTXペプチド」)を含む。この文脈において、「2つのみのCLTXペプチド」等は、抗原認識ドメインが2つより多くのCLTXペプチドを含まないが、抗原認識ドメイン内のCLTXペプチドの数が2つである限りはさらなるアミノ酸、ペプチド、リンカーペプチド等を含み得ることを意味する。かかるCLTX-CAR(1つまたは複数)はさらに、細胞外ドメイン内にさらなる部分またはドメインを含み得る。本明細書に記載される多価CLTX-CARはさらに、膜貫通ドメイン、ヒンジドメインおよび任意に少なくとも1つの細胞内シグナル伝達ドメインならびに共刺激性ドメインを含み得る。ある局面において、多価CLTX-CARは、膜貫通ドメイン、ヒンジドメイン、少なくとも1つの細胞内シグナル伝達ドメインならびに少なくとも1つの共刺激性ドメインを含む。さらなる局面において、多価または二価CLTX-CARは、膜貫通ドメイン、ヒンジドメインを含み、細胞内シグナル伝達ドメインを含まない。本発明による多価CLTX-CARは、以下の構造：i)少なくとも2つのCLTXペプチド(または以下：CLTXペプチド、CLTXペプチドの機能性バリアントまたはCLTX様ペプチドの少なくとも2つ)を含む抗原認識ドメイン/部分を含む細胞外ドメイン(本明細書において「エクトドメイン(ectodomain)」とも称される)、ii)ヒンジドメイン；iii)膜貫通ドメインおよびiii)細胞内シグナル伝達ドメイン(細胞内シグナル伝達ドメインは、「エンドドメイン」または受容体の機能性末端の一部である)を有し得る。特定の多価CLTX-CARは、以下：i)少なくとも2つのCLTXペプチド(または以下：CLTXペプチド、CLTXペプチドの機能性バリアントまたはCLTX様ペプチドの少なくとも2つ)を含む抗原認識ドメイン/部分を含む細胞外ドメイン(本明細書において「エクトドメイン」とも称される)、ii)ヒンジドメイン；iii)膜貫通ドメインおよびiv)シグナル伝達ドメインを含まないエンドドメインを含み得る。また、本明細書における特定の二価CLTX-CARは、i)2つのみのCLTXペプチド(または以下：CLTXペプチド、CLTXペプチドの機能性バリアントまたはCLTX様ペプチドの2つ)を含む抗原認識ドメイン/部分を含む細胞外ドメイン(本明細書において「エクトドメイン」とも称される)、ii)ヒンジドメイン；iii)膜貫通ドメインおよびiv)シグナル伝達ドメインを含まないエンドドメインを含み得る。さらなる局面において、本明細書における特定の二価CLTX-CARは、i)2つのみのCLTXペプチド(または以下：CLTXペプチド、CLTXペプチドの機能性バリアントまたはCLTX様ペプチドの2つ)を含む抗原認識ドメイン/部分を含む細胞外ドメイン(本明細書において「エクトドメイン」とも称される)、ii)ヒンジドメイン；iii)膜貫通ドメインおよびiv)共刺激性ドメインを含むがシグナル伝達ドメインを含まないエンドドメインを含み得る。
ある態様において、1～30アミノ酸のペプチドリンカーは、CARの種々のドメインを分離するようにCLTX-CAR内に存在し得る。さらに他の局面において、ペプチドリンカーは15アミノ酸長未満である。例えばペプチドリンカーは、抗原認識ドメイン/部分と、細胞外ドメイン内に存在し得る他のドメインの間、抗原認識ドメイン/細胞外ドメインとヒンジドメインの間、ヒンジドメインと膜貫通ドメインの間または膜貫通ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインの間に存在し得る。ペプチドリンカーは、全てのドメインの間に存在し得るか、またはドメイン/部分の一部の間のみに存在し得る。さらに、細胞内シグナル伝達ドメインが1つより多くの因子を含む場合、リンカーペプチドは、エンドドメイン内の個々の因子のいくつかまたは全ての間に存在し得る。多価CLTX-CAR中のそれぞれのリンカーペプチドは、同じであり得るかまたは異なり得る。2つのCLTXペプチド(または以下：CLTXペプチド、CLTXペプチドの機能性バリアントまたはCLTX様ペプチドの少なくとも2つ)を連結し得る(またはその間に位置され得る)例示的なリンカーペプチドは、30アミノ酸長以下、20アミノ酸長以下または15アミノ酸長以下であり得る。かかるリンカーペプチドの非限定的な例は、FLAG、インフルエンザウイルスヘマグルニチン(HA)、c-myc、ポリHis；Strepタグ、Strep IIタグ、FLAGタグ、グルタチオンSトランスフェラーゼ(GST)タグ、緑色蛍光タンパク質(GFP)タグ、ヘマグルニチンA(HA)タグ、ヒスチジン(His)タグ、ルシフェラーゼタグ、マルトース結合タンパク質(MBP)タグ、c-Mycタグ、プロテインAタグ、プロテインGタグ、ヒト血清アルブミン(HSA)またはインフルエンザウイルスヘマグルニチンである。ある局面において、ペプチドリンカーは、c-myc(例えばEQKLISEEDL(配列番号：2)のアミノ酸配列を有する、またはFLAG(例えばDYKDDDDK(配列番号：3)のアミノ酸配列を有する、である。リンカーペプチドの別の例は(GSSS)nであり、式中nは、1～10の整数である。さらに別の態様において、リンカーペプチドは、例えばGLFGAIAGFIENG(配列番号：14)またはEGMIDGWYG(配列番号：15)のアミノ酸配列を有するHAである。
本発明のCLTX-CARの細胞内シグナル伝達ドメインは、CLTX-CARが配置される宿主細胞の通常のエフェクター機能の少なくとも1つの活性化の原因である。用語「エフェクター機能」は、分化した細胞の特殊化された機能をいう。宿主細胞が免疫エフェクター細胞である場合、本発明のCLTX-CARの細胞内シグナル伝達ドメインは、通常の免疫エフェクター機能の少なくとも1つの活性化の原因である。例えばT細胞の免疫エフェクター機能は、限定されないがサイトカインの分泌を含む細胞溶解活性またはヘルパー活性であり得る。したがって、用語「細胞内シグナル伝達ドメイン」は、エフェクター機能シグナルを形質導入し、細胞(ceil)が特殊化された機能(例えばエフェクター機能および/または免疫エフェクター機能)を実行するように方向づけるCLTX-CARの一部をいう。通常は全細胞内シグナル伝達ドメインが使用されるが、多くの場合、全細胞内シグナル伝達ドメインを使用する必要はない。細胞内シグナル伝達ドメインの切断された部分が使用を見出し得る程度まで、かかる切断された部分がエフェクター機能/免疫エフェクター機能シグナルを依然として形質導入する限りは、かかる任意の切断された部分は、インタクトなシグナル伝達ドメインの代わりに使用され得る。したがって、用語「細胞内シグナル伝達ドメイン」は、エフェクター機能/免疫エフェクター機能シグナルを形質導入するのに十分な細胞内シグナル伝達ドメインの任意の切断された部分を含むことを意味する。細胞内シグナル伝達ドメインの例としては、限定されないが、T細胞受容体のゼータ鎖由来のシグナル伝達ドメイン(CD3ゼータ；CD247)またはそのホモログのいずれか(例えばイータ、デルタ、ガンマまたはエプシロン)、MB1鎖、B29、FcRIII、FcRIおよびシグナル伝達および/または共刺激分子の組み合わせ、例えばCD3ゼータ鎖およびCD28、CD27、4-IBB、DAP-10、OX40およびそれらの組み合わせ、ならびに前述のものの他の同様の分子および断片ならびに変異、例えばイムノレセプターチロシン系活性化モチーフ(1つまたは複数)(ITAM)を改変することが挙げられる。ある態様において、シグナル伝達ドメインは、CD3ゼータ配列を含み、これは配列：RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (配列番号：4)で示され得る。活性化タンパク質のファミリーの他のメンバーの細胞内シグナル伝達部分、例えばFcyRIIIおよびFcRIが使用され得る。当業者は、対応するシグナル伝達ドメインを決定し得る。さらに、シグナル伝達ドメイン配列のいずれかは、1～5個のアミノ酸改変を含み得、これは本明細書において議論されるように選択され得る。
ある局面において、エンドドメインは細胞内シグナル伝達ドメインを含まない。
ある局面において、CLTX-CARの細胞内シグナル伝達ドメインまたはエンドドメインは、共刺激性シグナル伝達ドメインをコードする配列を含む。例えば細胞内シグナル伝達ドメインまたはエンドドメインは、主要なシグナル伝達ドメインをコードする配列および共刺激性シグナル伝達ドメインをコードする配列を含み得る。ある態様において、共刺激性ドメインは、41BB、OX40および/またはCD28由来の機能性シグナル伝達ドメインである。OX40由来の共刺激性ドメインは、配列：
ALYLLRRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI (配列番号：5)を有し得る。CD28由来の共刺激性ドメインは、配列. RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS (配列番号：6)を有し得る。4IBB由来の共刺激性ドメインは、配列. KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL (配列番号：7)を有し得る。好ましくは、コードされる共刺激性シグナル伝達ドメインは、CD27、CD28、4-1BB (CD137)、OX40、C.D30、CD40、PD-1、ICOS、リンパ球機能関連抗原-1 (LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83と特異的に結合するリガンド、CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM (LIGHTR)、SLAMF7、NKp80 (KLRF1)、CD160、CD19、CD4、CD8ct、CD8fi、IL2Rp、IL2Ry、IL7Ra、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CDIId、ITGAE、CD103、ITGAL、CDl8、LFA-1、ITGAM、CD1 lb、ITGAX、CD1 lc、1TGBI、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、TRANCE/RAKL、DNAM1 (CD226)、SLAMF4 (CD244.2B4)、CD84、CD96 (Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9 (CD229)、CD160 (BY55)、PSGL1、CD100 (SEMA4D)、CD69、SLAMF6 (NTB-A、Lyl08)、SLAM (SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME (SLAMF8)、SELPLG (CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46またはNKG2Dの1つ以上から選択されるタンパク質の機能性シグナル伝達ドメインを含む。当業者は、これらのポリペプチドから対応する膜貫通領域を決定し得る。さらに、共刺激性ドメイン配列のいずれかは、1～5個のアミノ酸改変を含み得、これは本明細書において議論されるように選択され得る。ある態様において、シグナル伝達ドメインは、CD3ゼータ-CD28-OX40、CD3ゼータ-4IBBまたはCD28-41BBおよびCD3ゼータ-CD28-41BBを含む。
抗原認識ドメインを含む細胞外ドメインは、細胞外スペーサー(本明細書において細胞外ヒンジドメインとも称される)を介して細胞内シグナル伝達ドメインおよび/または膜貫通ドメインに連結され得る。細胞外抗原結合ドメインおよび膜貫通ドメインは、細胞外ヒンジドメインまたは細胞外スペーサー配列により連結され得る。好ましくは、細胞外スペーサーまたは細胞外ヒンジドメイン配列は、ヒンジ領域の1つ以上および/またはヒト免疫グロブリン、すなわちIgA、IgD、IgE、IgGおよびIgMの免疫グロブリン重鎖定常領域の一部(CH1、リンカー領域、CH2および/またはCH3ドメインを含み得る)またはそれらの任意の組み合わせを含む。ある態様において、細胞外スペーサーまたはヒンジドメインは、ヒトIgDのヒンジ領域の全てまたは一部を含む。ある態様において、細胞外スペーサーまたはヒンジは、ヒトIgG1のヒンジ領域の全てまたは一部を含む。ある態様において、細胞外スペーサーまたはヒンジは、ヒトIgDのヒンジ領域の全てまたは一部およびヒトIgGlのヒンジ領域の全てまたは一部を含む。ある態様において、細胞外スペーサーまたはヒンジは、ヒトIgDのヒンジ領域の全てまたは一部ならびにヒトIgG1の重鎖定常領域のCH2およびCH3ドメインの全てまたは一部を含む。ある態様において、細胞外スペーサーまたはヒンジは、ヒトIgDのヒンジ領域の全てまたは一部、ヒトIgG1のヒンジ領域の全てまたは一部ならびにヒトIgG1の重鎖定常領域のCH2およびCH3ドメインの全てまたは一部を含む。ある態様において、細胞外スペーサーまたはヒンジは、ヒトIgG1のヒンジ領域の全てまたは一部ならびにヒトIgG1の重鎖定常領域のCH2およびCH3ドメインの全てまたは一部を含む。ある態様において、細胞外スペーサーまたはヒンジは、ヒトIgDのヒンジ領域の全て、ヒトIgG1のヒンジ領域の全てまたは一部を含み、重鎖定常領域はヒトIgG1のCH2およびCH3ドメインの全てまたは一部を含む。好ましくは、ヒンジ領域アミノ酸配列は、IgDまたはIgG1などの免疫グロブリン由来のヒンジ領域アミノ酸配列を含み、アミノ酸配列は、1～5個のアミノ酸改変を含み、これは本明細書において議論されるように選択され得る。好ましくは、重鎖定常領域のCH2およびCH3ドメインは、IgG1などの免疫グロブリン由来のCH2およびCH3ドメイン免疫グロブリン重鎖定常領域アミノ酸(add)配列を含み、該アミノ酸配列は1～5個のアミノ酸改変を含み、これは本明細書において議論されるように選択され得る。他の局面において、細胞外スペーサーまたは細胞外ヒンジドメインは、CD8a、CD28、CD137またはそれらの組み合わせからなる群より選択されるタンパク質のヒンジ領域を含む。ある局面において、細胞外スペーサーまたは細胞外ヒンジドメインは、CD8aのヒンジ領域を含む。前述のいずれかにおいて、細胞外スペーサーは、Ser-Gly-Gly-Gly(配列番号：8)またはSer-Gly-Gly-Gly-Gly(配列番号：9)の配列を有するリンカーなどのリンカーをさらに含み得、該配列は1～10コピーを有するように存在し得、細胞外スペーサーを細胞外抗原結合ドメインに連結する。
ある態様において、抗原認識ドメインはフレキシブルリンカーを介して膜貫通ドメインに連結される。フレキシブルリンカーは、本明細書に記載される細胞外スペーサーに加えてまたは細胞外スペースの代わりに存在し得る。ある態様において、細胞外ドメイン/抗原認識ドメインは、フレキシブルリンカーを介して細胞外スペーサーに連結される。好ましくは、フレキシブルリンカーは、例えばグリシンおよびセリンを含む。好ましくは、フレキシブルリンカーは、配列番号：10 (Ser-Gly-Gly-Gly)nまたは配列番号：8 (Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)の配列を有するポリペプチドで構成され、式中nは1～10の整数である。好ましくは、それぞれのフレキシブルリンカーは、約1～25アミノ酸、好ましくは約1～15アミノ酸、好ましくは約1～10アミノ酸、好ましくは約4～24アミノ酸、好ましくは約5～20アミノ酸、好ましくは約5～15アミノ酸および好ましくは約5～12アミノ酸を含むポリペプチドである。好ましくは、リンカーは、(Ser-Gly-Gly-Gly)nであり、式中nは3である。
本発明のCLTX-CARは、当該技術分野で公知の任意の分子の膜貫通ドメインに対応するまたはそれに由来するまたはそれから得られる膜貫通ドメインを含み得る。例えば、膜貫通ドメインは、CD8分子またはCD28分子のものに対応し得る。CD8は、T細胞受容体(TCR)の共受容体として働く膜貫通糖タンパクであり、主に細胞傷害性T細胞の表面上で発現される。CD8の最も一般的な形態は、CD8およびCD8β鎖で構成されるダイマーとして存在する。CD28は、T細胞上に発現され、T細胞活性化に必要とされる共刺激性シグナルを提供する。CD8ポリペプチド由来の膜貫通ドメインは、配列IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC(配列番号：11)、特に配列番号：13のアミノ酸1～21、1～23または1～24)を有し得る。CD28は、CD80 (B7.1)およびCD86 (B7.2)についての受容体である。CD28ポリペプチド由来の膜貫通ドメインは、配列FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV(配列番号：12)を有し得る。好ましくは、CD8およびCD28はヒトである。本発明のCLTX-CARの好ましい膜貫通ドメインは、限定されないが：T細胞受容体のα、βまたはζ鎖、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、KIRDS2、OX40、CD2、CD27、LFA-1 (CDIIa、CD18)、ICOS (CD278)、4-IBB (CD137)、GITR、CD40、BAFFR、HVEM (LIGHTR)、SLAMF7、NKp80 (KLRFl)、CD160、CDI9、IL2Rβ、1L2Rγ、IL7Rα、ITGA1、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CDIId、ITGAE、CD103、ITGAL、CD1 la、LFA-1、ITGAM、CD1 lb、ITGAX、CD1 lc、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、DNAM1 (CD226)、SLAMF4 (CD244、2B4)、CD84、CD96 (Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9 (CD229)、CD160 (BY55)、PSGLI、CD100 (SEMA4D)、SLAMF6 (NTB-A、Lyl08)、SLAM (SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME (SLAMF8)、SELPLG (CD162)、LTBR、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46、NKG2Dおよび/またはNKG2Cから選択されるポリペプチド由来の膜貫通ドメインの全てまたは一部を含む。当業者は、これらのポリペプチド由来の対応する膜貫通領域を決定し得る。
多価CLTX-CARは、前述の膜貫通ドメインのいずれか1つおよび任意の組み合わせの前述の細胞内T細胞シグナル伝達ドメインのいずれか1つ以上(例えば1、2、3または4)および前述のヒンジドメインのいずれかおよび前述の共刺激性ドメインのいずれかを含み得る。例えば、CLTX-CARは、CD28膜貫通ドメインならびにCD28およびCD3ゼータの細胞内T細胞シグナル伝達ドメインを含み得る。さらに膜貫通ドメイン配列のいずれかは1～5個のアミノ酸改変を含み得、これは本明細書において議論されるように選択され得る。
本発明の例示的なCLTX-CARは、少なくとも2つのCLTXペプチド(または以下：CLTXペプチド、CLTXペプチドの機能性バリアントまたはCLTX様ペプチドの少なくとも2つ)を含む抗原認識ドメインを含み得る。別の例示的なCLTX CARは、2つのCLTXペプチドを有する抗原認識を含む。CLTX-CARはさらに、以下：抗原認識ドメインをヒンジドメインに連結する任意のリンカー；CD8a、CD28またはCD137のヒンジ領域の全てまたは一部を含むヒンジドメイン；好ましくは、CD8aのヒンジ領域；CD28由来の膜貫通領域；および/または少なくとも1つのシグナル伝達ドメインを含む任意の細胞内シグナル伝達領域(またはエンドドメイン)；好ましくは、CD3ゼータおよび本明細書に記載される任意の共刺激性シグナル伝達ドメイン；好ましくは、CD28および/または4-1BB共刺激性ドメインの1つ以上を含み得る。なおさらなる局面において、多価CLTX-CARは、細胞外シグナルペプチドを含み得る。例えばシグナルペプチドは、CD8a、CD28、GM-CSF、CD4、CD137またはそれらの組み合わせからなる群より選択されるタンパク質のシグナルペプチドであり得る。ある局面において、CLTX-CARは、抗原結合ドメイン中に2つのみのCLTXペプチドまたは3つのみのCLTXペプチドを含む。
ある局面において、多価CLTX-CAR(例えば二価CLTX-CAR)は、細胞内シグナル伝達ドメインを含まないかまたは含まない(does not comprise or include)。かかる多価CLTX-CARは、少なくとも2つのCLTXペプチド(または以下：CLTXペプチド、CLTXペプチドの機能性バリアントまたはCLTX様ペプチドの少なくとも2つ)を含む抗原認識ドメイン/部分を含む細胞外ドメイン(本明細書において「エクトドメイン」とも称される)を含み得る。ある局面において、細胞外ドメインは、2つのCLTXペプチドを含む。なおさらなる非限定的な例において、多価CLTX-CARは、ヒンジドメインおよび膜貫通ドメインをさらに含み得る。なおさらなる態様において、多価CLTX-CARは、CD3ゼータ(本明細書においてCD3zまたはCD3ζとも称される)シグナル伝達ドメインを含まない。理論に拘束されることを望まないが、CLTX-CARγδT細胞中のシグナル伝達ドメインの非存在は、活性化誘導細胞死(AICD)を緩和し得、これはCLTX-CARγδ T細胞の持続性を増加し、そのためにそれらの効果を延長する。細胞内シグナル伝達ドメインを含まないかまたは含まない多価CLTX-CARは、共刺激性ドメインを含み得るかまたは含み得ない。理論に拘束されることを望まないが、共刺激性ドメイン(例えばCD28共刺激性ドメイン)は、細胞内アンカーとして働き、細胞膜内の構築物を安定化し得および/または細胞表面発現を増強または延長し得る。
本発明はさらに、本明細書に記載される多価CLTX-CARまたは二価CTLX-CARを含む核酸またはベクターを含む。核酸またはベクターは：
i. 少なくとも2つのCLTXペプチドを含む細胞外抗原結合ドメイン、ここで少なくとも2つのCLTXペプチドは、リンカーペプチドにより結合され；任意にリンカーペプチドは30アミノ酸長以下であるかまたはリンカーペプチドは15アミノ酸長未満である；
ii. 膜貫通ドメイン；
iii. 膜貫通ドメインを細胞外抗原結合ドメインに結合する細胞外ヒンジドメイン；
iv. 任意に細胞内シグナル伝達ドメイン；および
v. 任意に共刺激性ドメイン
を含み得る。ある局面において、核酸またはベクターはさらに、本明細書に記載される化学療法剤に対する耐性を付与するDNA、RNAまたはポリペプチドをコードする。なおさらなる局面において、核酸またはベクターは、化学療法剤に対する耐性を付与するポリペプチドをコードする。さらなる局面において、核酸またはベクターは、多価CLTX-CARとポリペプチドの間に自己切断ペプチドをコードする。自己切断ペプチドの例としては、例えばブタテシオウイルス(teschovirus)-1 2A (P2A)配列、トセアアシグナウイルス(thosea asigna virus)2A (T2A)、ウマ鼻炎Aウイルス2A(E2A)、細胞質多角体病ウイルス(BmCPV 2A)およびB. moriの軟化病ウイルス(flacherie virus) (BmIFV 2A)が挙げられる。特定の局面において、核酸またはベクターは、多価CLTX-CARとMGMTなどの生存ポリペプチドの間にP2A配列をコードする。
特定の多価CLTX-CARは、例えばリンカーペプチドにより分離される2つのCLTXペプチドを含む抗原結合ドメイン、CD8aヒンジドメイン、CD28共刺激性ドメイン、CD3ζシグナル伝達ドメインおよびMGMTを含む。なおさらなる態様において、多価CLTX-CARは、例えばリンカーペプチドにより分離される2つのCLTXペプチドを含む抗原結合ドメイン、CD8aヒンジドメイン、CD28共刺激性ドメインを含み、シグナル伝達ドメインおよびMGMTを含まない。特定の多価CLTX-CARは、例えばc-mycまたはFlagペプチドにより分離される2つのCLTXペプチドを含む抗原結合ドメイン、CD8aヒンジドメイン、CD28共刺激性ドメイン、CD3ζシグナル伝達ドメインおよびMGMTを含む。なおさらなる態様において、多価CLTX-CARは、例えばc-mycまたはFlagペプチドにより分離される2つのCLTXペプチドを含む抗原結合ドメイン、CD8aヒンジドメイン、CD28共刺激性ドメインを含み、シグナル伝達ドメインおよびMGMTを含まない。細胞外c-mycまたはFlagペプチドまたは他のタンパク質タグは、CAR-T検出および/または富化のために含まれ得る。
本発明による多価CLTX-CARは、当該技術分野で公知の任意の手段により作製され得るが、これは好ましくは、組換えDNA技術を使用して作製される。多価CLTX-CARのいくつかの領域をコードする核酸配列は、分子クローニングの標準的な技術(ゲノムライブラリスクリーニング、PCR、プライマー補助ライゲーション、部位誘導突然変異誘発等)により調製され得、完全コーディング配列に集合され得る。得られるコーディング領域は、好ましくは発現ベクターに挿入され、免疫エフェクター細胞、好ましくはTリンパ球細胞株および最も好ましくはガンマデルタT細胞(γδ-T細胞)などの適切な発現宿主細胞株を変換するために使用され、これらの細胞に分化する幹細胞も使用され得る。好ましくは、γδ-T細胞が宿主細胞株として使用される。本明細書で使用する場合、「核酸構築物」または「核酸配列」は、限定されないがT細胞などの発現宿主細胞株を形質転換またはそれに導入され得、生成物(例えばキメラ受容体)を生じるように発現され得るDNA分子などの核酸分子を意味することを意図する。そのため、本発明はさらに、本発明の多価CLTX-CARをコードする、単離または精製された核酸配列を提供する。「核酸配列」は、一本鎖または二本鎖であり得、非天然または改変されたヌクレオチドを含み得るDNAまたはRNAのポリマー、すなわちポリヌクレオチドを包含することが意図される。用語「核酸」および「ポリヌクレオチド」は、本明細書で使用する場合、リボヌクレオチド(RNA)またはデオキシリボヌクレオチド(DNA)のいずれかの任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態をいう。これらの用語は、分子の一次構造をいい、そのために二本鎖および一本鎖DNA、ならびに二本鎖および一本鎖RNAを含む。均等物として、該用語は、ヌクレオチドアナログで作製されるRNAまたはDNAのいずれかのアナログならびに限定されないが、メチル化および/またはキャップポリヌクレオチドなどの改変ポリヌクレオチドを含む。本発明において使用される核酸構築物において、プロモーターは、本発明のCLTX-CARをコードする核酸配列に操作可能に連結され、すなわちそれらは、キメラ受容体をコードするDNAからのメッセンジャーRNAの転写を促進するように配置される。プロモーターはゲノム起源であり得るかまたは合成的に作製され得る。T細胞における使用のための種々のプロモーターが当該技術分野で周知である。プロモーターは、構成的であり得るかまたは誘導的であり得、誘導は、例えば特定の細胞型または特定の成熟レベルに関連する。代替的に、いくつかの周知のウイルスプロモーターも適切である。目的のプロモーターとしては、β-アクチンプロモーター、SV40初期および後期プロモーター、免疫グロブリンプロモーター、ヒトサイトメガロウイルスプロモーター、レトロウイルスプロモーターおよびフレンド脾臓病巣形成ウイルスプロモーターが挙げられる。プロモーターは、エンハンサーと関連付けられても関連付けられなくてもよく、エンハンサーは、異なるプロモーター(promote)と結合する特定のプロモーターと天然に結合され得る。
本発明はまた、単一のCLTXキメラ抗原受容体(またはsCLTX CARまたは1xCLTX CAR)および生存因子を発現する遺伝子工学で作り変えられたγδT細胞に関し、該生存因子は化学療法剤に対する耐性を付与するポリペプチドであり、γδT細胞は、単一のCLTX-CARおよび生存因子の発現を方向づける単一のベクターを含み、さらに：
a. CLTX-CARは：
i. 1つのCLTXペプチドを含む細胞外抗原結合ドメイン、
ii. 細胞外リンカーペプチド、ここで該リンカーペプチドは、30アミノ酸長未満または15アミノ酸長であり、リンカーペプチドは、CTLXペプチドと膜貫通ドメインの間またはCLTXペプチドと細胞外ヒンジドメインの間に配置される；
iii. 膜貫通ドメイン；
iv. 膜貫通ドメインを細胞外抗原結合ドメインに結合する任意の細胞外ヒンジドメイン；
v. 任意に、細胞内シグナル伝達ドメイン；および
vi. 任意に、共刺激性ドメイン
を含む。本発明はまた、本明細書に記載される遺伝子工学で作り変えられたγδT細胞の集団を包含する。ある局面において、細胞内シグナル伝達ドメインが存在する。さらなる局面において、リンカーペプチドは、CTLXペプチドを膜貫通ドメインに直接または間接的に連結するように配置される。さらなる局面において、リンカーペプチドは、CLTXペプチドおよび細胞外ヒンジドメインを直接または間接的に連結する。なおさらなる局面において、リンカーペプチドは15アミノ酸長である。ある局面において、リンカーペプチドは、Flagペプチド、mycペプチドまたはHAペプチドである。ある態様において、単一のCLTX-CARはシグナル伝達ドメインを含み、リンカーペプチドは、リンカーペプチドを有さない他の同一の単一CLTX-CARと比較して高められた活性化を有する。本発明はさらに、単一のCLTX-CARを発現するγδT細胞を含む医薬組成物および本明細書に記載されるように癌または腫瘍を治療する方法を包含する。
本発明はさらに、単一のCLTXキメラ抗原受容体(またはsCLTX CARまたは1xCLTX CAR)および生存因子を発現する遺伝子工学で作り変えられたγδT細胞を含み、該生存因子は、化学療法剤に対する耐性を付与するポリペプチドであり、該γδT細胞は、単一のCLTX-CARおよび生存因子の発現を方向づける単一のベクターを含み、さらに：
a. CLTX-CARは：
i. 1つのCLTXペプチドを含む細胞外抗原結合ドメイン、
ii. 膜貫通ドメイン；
iii. 膜貫通ドメインを細胞外抗原結合ドメインに結合する任意の細胞外ヒンジドメイン；
iv. 任意に、共刺激性ドメイン
を含み；単一のCLTX-CARは細胞内シグナル伝達ドメインを含まない。本発明はまた、本明細書に記載される遺伝子工学で作り変えられたγδT細胞の集団を包含する。本発明はまた、共刺激性ドメイン(例えばCD28共刺激性ドメイン)を含み、細胞内シグナル伝達ドメインを含まない単一のCTLX-CARを含む。本発明はさらに、単一のCLTX-CARを発現するγδT細胞を含む医薬組成物、および本明細書に記載されるように癌または腫瘍を治療する方法を包含する。
本発明のCLTX-CAR(例えば多価CTLX-CAR、二価CLTX-CARまたはsCLTX-CAR)を調製するための種々の操作は、インビトロで実行され得、CLTX-CARキメラ構築物は、標準的な形質転換またはトランスフェクション法を使用して、適切な宿主細胞におけるクローニングおよび発現のためにベクターに導入され得る。したがって、それぞれの操作の後、DNA配列の連結により得られる構築物はクローニングされ、ベクターは単離され、配列はスクリーニングされて、配列が所望のキメラ受容体をコードすることが確実にされる。配列は、制限分析、配列解析等によりスクリーニングされ得る。そのため、本発明は、本明細書に記載される多価CLTX-CARまたはその機能性同等物をコードするベクターを含む。
当業者に周知のように、被験体からこれらの細胞を単離および拡大するために、種々の方法が容易に利用可能である。例えば、細胞表面マーカー発現を使用してまたは市販のキットを使用する。キメラ構築物は、ネイキッドDNAとして被験体自身のT細胞にまたは適切なベクターに導入され得ることが企図される。ネイキッドDNAを使用してエレクトロポレーションによりT細胞を安定にトランスフェクトする方法は当該技術分野で公知である。ネイキッドDNAは一般的に、発現のための適切な方向でプラスミド発現ベクター内に含まれる本発明のキメラ受容体をコードするDNAをいう。有利なことに、ネイキッドDNAの使用により、本発明のキメラ受容体を発現するT細胞を作製するのに必要な時間が低減される。
そのため、本発明は、本発明の多価CTX-CAR(1つまたは複数)、二価CLTX-CARおよびsCLTX-CARならびにそれらの機能的バリアントをコードするベクターを含む(すなわち形質転換または形質導入される)宿主細胞を含む。好ましくは、宿主細胞は、CLTX-CARの発現のための免疫エフェクター細胞、好ましくはT細胞、Tリンパ球細胞株および最も好ましくは自己Tリンパ球細胞株、第三者由来T細胞株/クローン、形質転換された体液性または外因性免疫学的エフェクター細胞株である。ナチュラルキラー(NK)細胞、マクロファージ、好中球、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)、リンホカイン活性化キラー(LAK)細胞、記憶T細胞、制御性｝-T細胞、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)、ガンマデルタT細胞(γδT細胞)およびこれらの細胞に分化する幹細胞も使用され得る。好ましくは、γδT細胞は、宿主細胞株として使用される。トランスフェクトまたは形質導入されたT細胞が所望の制御を有し、所望のレベルで表面膜タンパク質としてキメラ受容体を発現し得ることが一旦確立されると、キメラ受容体が宿主細胞内で機能性であり、所望のシグナル誘導を提供するかどうかが決定され得る。その後、形質導入されたT細胞は、被験体に再導入または投与されて、被験体において抗腫瘍応答を活性化する。
一態様において、本発明は、本開示の多価CLTX-CAR(1つまたは複数)、二価CLTX-CARまたはsCLTX-CARおよび化学療法剤に対する耐性を付与するポリペプチドなどの本明細書に開示される生存因子をコードする(すなわちその発現を方向づける)1つのベクターを含む(すなわち形質転換または形質導入される)、宿主細胞、例えばγδ-T細胞を含む。本開示の任意のCLTX-CARが使用され得る。γδT細胞は、自然にはストレス誘導抗原に対する受容体(限定されないがNKG2Dなど)を発現し；好ましくは、ストレス誘導抗原(ストレス誘導抗原受容体)が結合するの発現は、化学療法剤の投与により増加される。例えば、γδT細胞は、自然にはNKG2Dを発現し得、化学療法剤の投与を含む治療方法においてそのように利用され得、化学療法剤の投与は、腫瘍または癌細胞上のNKG2DLの発現を増加する。さらに他の局面において、γδ-T細胞は、ストレス誘導抗原受容体(限定されないがNKG2Dなど)をコードする(すなわちその発現を方向づける)ベクター(CLTX-CARをコードする同じベクターまたは異なるベクター)を含み得る。
上述のように、γδT細胞は、CLTX CAR、例えば多価CLTX-CARを発現し、さらに生存因子を発現し、および/または生存因子で処理されており、該生存因子は、化学療法剤に対する耐性を付与するDNA、RNAまたはポリペプチドである。ある局面において、該細胞は生存因子を発現し、該生存因子は、化学療法剤に対する耐性を(γδ-T細胞に)付与するポリペプチドであり、γδ-T細胞を、化学療法剤により生じる治療環境において生存させる、および/またはγδ-T細胞を、化学療法剤を含む腫瘍環境において生存させる。好ましい局面において、単一のベクターは、多価CLTX-CARおよび化学療法剤に対する耐性を付与するポリペプチドを発現する。ある特定の態様において、単一のベクターは、多価CLTX-CARならびに、アルキルグアニントランスフェラーゼ(AGT)、P140K MGMT、O6メチルグアニンDNAメチルトランスフェラーゼ(MGMT)、L22Y-DHFR、チミジル酸シンターゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、多剤耐性1タンパク質(MDR1)、5'ヌクレオチダーゼII、ジヒドロ葉酸レダクターゼおよびチミジル酸シンターゼからなる群より選択される生存ポリペプチドをコードする。なおさらなる局面において、単一のベクターは、多価CLTX-CARおよびMGMTをコードする。なおさらなる局面において、単一のベクターは、多価CLTX-CARおよびMGMTをコードし、該多価CLTX-CARは、抗原認識ドメイン中に2つのCLTXペプチドを含む。ある態様において、多価CLTX-CARおよび生存因子(および任意にストレス誘導抗原受容体)の発現を方向づけるベクターを含む宿主細胞は、単離および精製されたγδT細胞である。本明細書において議論されるように、宿主細胞は、宿主細胞、例えばγδT細胞を、化学療法剤により生じる治療環境において生存させる生存ポリペプチドを発現するように、遺伝子工学で作り変えられ得る)。生存ポリペプチドを発現するかかる細胞は、本明細書において薬物耐性(DR)細胞と称され、治療におけるそれらの使用は、本明細書において「薬物耐性免疫療法」(DRI)と称される。DR細胞およびDRIは、WO 2011/053750に記載され、その教示は、本願への参照により本明細書に援用される。生存ポリペプチドは、化学療法剤を含む治療養生法に対する耐性を提供し、および/または生存ポリペプチドおよび本明細書に記載される多価CLTX-CARを含む細胞を、化学療法剤により生じる治療環境において生存させることが当該技術分野で公知である任意のポリペプチドであり得る。
例示的な化学療法剤は、ヌクレオシドアナログ化学療法薬、アルキル化剤、代謝拮抗物質、抗生物質、トポイソメラーゼ阻害剤、有糸分裂阻害剤、分化剤またはホルモン療法剤であり、生存因子は化学療法剤に対する耐性を提供する。さらなる局面において、化学療法剤はアルキル化剤である。ある態様において、生存ポリペプチドはMGMT、多剤耐性タンパク質1(MDRI)または5'ヌクレオチダーゼII(NT5C2)である。なおさらなる局面において、生存ポリペプチドはMGMTであり、化学療法剤は、カルムスチン(BCNU)、ロムスチン(CCNU)およびテモゾロミドなどのアルキル化剤である。ある局面において、化学療法剤はテモゾロミド(TMZ)である。さらなる局面において、生存ポリペプチドはMDR1であり、化学療法剤は、アントラサイクリン、ビンカアルカロイド、エピポドフィロトキシン、カンプトテシン、メトトレキサート(MTX)、サキナビルおよびミトキサントロン(MX)である(Sodani et all. (2011). Multidrug resistance associated proteins in multidrug resistance. Chin J Cancer 31(2): 58-72)。NT5C2は、チオプリン化学療法に対する耐性を提供することが当該技術分野で公知のポリペプチドである(Tzoneva et al. (2013), Activating mutations in the NT5C2 nucleotidase gene drive chemotherapy resistance in relapsed ALL, Nat Med. 19(3): 368-371)。他の生存ポリペプチドとしては、例えばジヒドロ葉酸レダクターゼ(L22Y-DHFR)およびチミジル酸シンターゼの薬物耐性バリアントが挙げられる。ある局面において、生存ポリペプチドはMGMTである。しかしながら他の生存因子が、共投与される化学療法剤、治療環境の性質(すなわち本開示の細胞組成物と組み合わせてどのような他の治療養生法が患者に与えられているのか)に応じて、使用され得る。
さらなる局面において化学療法剤は、アルキル化剤；代謝拮抗物質；DNA脱メチル化剤；置換ヌクレオチド；置換ヌクレオシド；抗腫瘍抗生物質；植物由来抗腫瘍剤またはニトロソウレアである。好ましくは、化学療法剤は、シスプラチン；カルボプラチン；エトポシド；メトトレキサート(MTX)；トリメトトレキサート(TMTX)；テモゾロミド；ダカルバジン(DTIC)、ラルチトレキセド；S-(4-ニトロベンジル)-6-チオイノシン(NBMPR)；6-ベンジル(benzy)グアニジン(6-BG)；ニトロソウレア(ラビノピラノシル-N-メチル-N-ニトロソウレア(Aranose)、カルムスチン(BCNU、BiCNU)、クロロゾトシン、エチルニトロソウレア(ENU)、フォテムスチン、ロムスチン(CCNU)、ニムスチン、N-ニトロソ-N-メチルウレア(NMU)、ラニムスチン(MCNU)、セムスチン、ストレプトゾシン(ストレプトゾトシン))；シタラビン；カンプトテシン；およびそれらのいずれかの治療誘導体から選択される。好ましくは、γδT細胞は、アルキルグアニントランスフェラーゼ(AGT)、P140KMGMT、O6メチルグアニンDNAメチルトランスフェラーゼ(MGMT)、L22Y-DHFR、チミジル酸シンターゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼまたは多剤耐性1タンパク質(MDR1)をコードするように遺伝子的に改変されている。好ましくは、γδT細胞は、アルキル化剤；代謝拮抗物質；DNA脱メチル化剤；置換ヌクレオチド；置換ヌクレオシド、；抗腫瘍抗生物質；植物由来抗腫瘍剤およびニトロソウレア(nitrosurea)から選択される少なくとも2つの化学療法剤に対して耐性であるように遺伝子的に改変されている。好ましくは、γδT細胞は、シスプラチン；カルボプラチン；エトポシド；メトトレキサート(MTX)；トリメトトレキサート(TMTX)；テモゾロミド；ダカルバジン(DTIC)、ラルチトレキセド；S-(4-ニトロベンジル)-6-チオイノシン(NBMPR)；6-ベンジルグアニジン(6-BG)；ニトロソウレア(ラビノピラノシル-N-メチル-N-ニトロソウレア(Aranose)、カルムスチン(BCNU、BiCNU)、クロロゾトシン、エチルニトロソウレア(ENU)、フォテムスチン、ロムスチン(CCNU)、ニムスチン、N-ニトロソ-N-メチルウレア(NMU)、ラニムスチン(MCNU)、セムスチン、ストレプトゾシン(ストレプトゾトシン))；シタラビン；カンプトテシン；およびそれらの任意の治療誘導体から選択される少なくとも2つの化学療法剤に対して耐性であるように遺伝子的に改変されている。好ましくは、化学療法剤はTMZ、メトトレキサート、DTIC、BCNU、CCNU、MCNU、NMUまたはENUである。
例えば化学療法剤(例えば被験体に投与されている化学療法剤)に対する耐性を付与するポリペプチドなどの生存因子は、化学療法剤により生じる治療環境におけるそれを発現する宿主細胞の生存、または宿主細胞が、治療の一部としての化学療法剤の投与から生じる環境または腫瘍微小環境における毒性の存在下で生存する場合の、化学療法剤の存在下の生存を促進し得る。DRI(および化学療法剤に対する耐性を付与するポリペプチドを発現するγδT細胞)を用いた使用についての化学療法剤としては、限定されないが、アルキル化剤(例えばシクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン)；代謝拮抗物質(例えばメトトレキサート(MTX)、5-フルオロウラシルまたはそれらの誘導体)；DNA脱メチル化剤(代謝拮抗剤としても公知；例えばアザシチジン)；置換ヌクレオチド；置換ヌクレオシド；抗腫瘍抗生物質(例えばマイトマイシン、アドリアマイシン)；植物由来抗腫瘍剤(例えばビンクリスチン、ビンデシン、TAXOL(登録商標)、パクリタキセル、アブラキサン)；シスプラチン；カルボプラチン；エトポシド等が挙げられる。かかる剤としてはさらに、限定されないが抗癌剤トリメトトレキサート(TMTX)；テモゾロミド(TMZ)；ラルチトレキセド；S-(4-ニトロベンジル)-6-チオイノシン(NBMPR)；6-ベンジルグアニジン(benzyguanidine)(6-BG)；ニトロソウレア(例えば、BCNUとしても公知のビス-クロロエチルニトロソウレアおよびカルムスチン、CCNUとしても公知のロムスチン、+/-プロカルバジンおよびビンクリスチン(PCV養生法)およびフォテムスチン)；ドキソルビシン；シタラビン；カンプトテシン；およびそれらのいずれかの治療誘導体が挙げられ得る。
本明細書に記載される遺伝子工学で作り変えられたγδ-T細胞はさらに、自殺遺伝子を発現し得る。「自殺遺伝子」は、本明細書で使用される場合、本明細書に記載されるCLTX-CAR発現細胞が、例えば段階的に生じる炎症性応答または標的でない細胞傷害性から保護するために、細胞またはその組成物を投与された被験体から根絶され得る機構をいう。自殺遺伝子系は、例えば単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(HSVTK)/ガンシクロビル(GCV)自殺遺伝子系、誘導性カスパーゼ自殺遺伝子系(Budde et al., PLoS One 2013 8(12):82742)、コドン最適化CD20 (Marin et al., Hum. Gene Ther. Meth. 2012 23(6)376-86)、CD34、切断EGFR (Wang X, Chang W-C, Wong C W, et al. A transgene-encoded cell surface polypeptide for selection, in vivo tracking, and ablation of engineered cells. Blood. 2011; 118(5):1255-1263. doi:10.1182/blood-2011-02-337360)、切断CD19またはポリペプチドRQR8 (Philip et al、および参照により本明細書において援用されるWO2013153391A)であり得る。自殺遺伝子のさらなる例は、2A様配列を介して、選択可能マーカーとして働く切断ヒトCD 19に連結されたiC9からなるτ-レトロウイルスSFG.iCaspase9.2A.DeltaCD19である。カスパーゼ9自殺遺伝子のAP1903誘導性活性化は、ヒトFK506結合タンパク質(FKBP)由来の薬物結合ドメインに融合されるキメラタンパク質(iC9)を発現することにより達成される。iC9は、FKBPドメインを架橋するAPI 903への曝露がiCasp9シグナル伝達を開始して、遺伝子改変細胞のアポトーシスを誘導するまで、細胞内で休止している。該遺伝子およびAPI 903は、Bellicum Pharmaceuticals (Houston, TX)から利用可能である。
本発明のCLTX-CARまたは多価CLTX-CARを発現するDRγδ-T細胞は、本明細書に記載されるCLTX-CARをコードして発現し得る核酸構築物を組み込むことにより作製され得、任意に、ポリペプチドに対する耐性を付与するDNA、RNAまたはポリペプチド、および任意に他の因子(例えば自殺遺伝子および/またはストレス誘導抗原に対する受容体)をさらに発現し得る。ある態様において、単一の核酸構築物は、多価CLTX-CARおよび化学療法剤に対する耐性を付与するポリペプチドならびにさらなる任意の因子(例えば自殺遺伝子および/またはストレス誘導抗原に対する受容体)をコードする。ある態様において、別々の核酸構築物は、多価CLTX-CARおよび化学療法剤に対する耐性を付与するポリペプチドならびに任意の他の因子(例えば自殺遺伝子および/またはストレス誘導抗原に対する受容体)のそれぞれをコードする。ある態様において、単一の核酸構築物は、多価CLTX-CARおよび化学療法剤に対する耐性を付与するポリペプチドをコードし、1つ以上の核酸構築物は、さらなる任意の因子(例えば自殺遺伝子および/またはストレス誘導抗原に対する受容体)をコードする。
CLTX-CAR、例えば多価CLTX-CARを発現するγδT細胞は、ストレス誘導抗原に対する受容体をさらに発現し得る。ある局面において、γδT細胞は天然に、ストレス誘導抗原、例えばNKGD2を発現する。他の局面において、γδT細胞は、ストレス誘導抗原を発現するように遺伝子工学で作り変えられる。ある態様において、本開示のCLTX-CARまたは多価CTX-CARを発現する宿主細胞は、ストレス誘導抗原受容体、例えばNKGD2をコードする遺伝子をさらに含む。ある態様において、限定されないがNKGD2受容体などのストレス誘導抗原受容体は、γδT細胞上で増加したレベルまで誘導される。
CTLX-CARまたは多価CLTX-CARを発現するγδ-T細胞、例えば多価CLTX-CARおよび化学療法剤に対する耐性を付与するDNA、RNAまたはポリペプチドを発現するγδ-T細胞などの宿主細胞は、組成物の一部として投与される。該組成物は、遺伝子工学で作り変えられたγδ-T細胞およびさらなる免疫系細胞を含み得る。例えば、該組成物は、本明細書に記載される多価CLTX-CARを発現するγδT細胞を含み得、さらにNK細胞および/またはαβT細胞を含み得る。ある局面において、該組成物は、本明細書に記載される多価CLTX-CARを発現する遺伝子工学で作り変えられたγδT細胞およびさらなる免疫系細胞を含み、該γδT細胞は、例えばフローサイトメトリーにより決定される場合に、総細胞集団の50%、60%または70%以上で存在する。なおさらなる局面において、γδT細胞は、例えばフローサイトメトリーにより決定される場合に、全ての生存可能細胞集団の50%、60%または70%以上で存在する。ある態様において、該組成物は、遺伝子工学で作り変えられたγδT細胞およびNK細胞を含み、該γδT細胞は、総細胞集団または全ての生存可能細胞集団の50%、60%または70%以上で存在し、NK細胞は、(例えばフローサイトメトリーで決定した場合に)25%以下で存在する。ある態様において、該組成物は、遺伝子工学で作り変えられたγδT細胞およびαβT細胞を含み、該γδT細胞は、例えばフローサイトメトリーで決定した場合、総細胞集団または全ての生存可能細胞集団の50%、60%または70%以上で存在する。さらなる局面において、該組成物は、例えばフローサイトメトリーで決定した場合、総細胞集団または全ての生存可能細胞集団の5%以下のαβT細胞を含む。ある態様において、該組成物は、遺伝子工学で作り変えられたγδT細胞、αβT細胞およびNK細胞を含み、該γδT細胞は、例えばフローサイトメトリーで決定した場合、総細胞集団または全ての生存可能細胞集団の50%、60%または70%以上で存在する。ある態様において、αβT細胞は、フローサイトメトリーで決定した場合、総細胞集団または全ての生存可能細胞集団の5%以下で存在し、NK細胞は、総細胞集団または全ての生存可能細胞集団の25%以下で存在する。
好ましくは、任意に富化されるおよび/または任意に拡大されるγδT細胞の集団を含む、患者への投与のための治療組成物は、約5x108γδT細胞/患者体重kg以下を含む。好ましくは、任意に富化されるおよび/または任意に拡大されるγδT細胞の集団を含む、患者への投与のための治療組成物は、約5x107γδT細胞/患者体重kg以下を含む。好ましくは、任意に富化されるおよび/または任意に拡大されるγδT細胞の集団を含む、患者への投与のための治療組成物は、約5x106γδT細胞/患者体重kg以下を含む。
治療される患者または別の供給源のいずれかからγδT細胞を単離するための方法は、例えばその全体において参照により本明細書に援用される米国特許第7,078,034号においてLamb L. S.により記載されるようなものである。
上述のように、例えば化学療法剤に対する耐性を付与するポリペプチド(MGMTポリペプチドなど)を含む生存因子の使用により、本開示の遺伝子工学で作り変えられたγδT細胞(DRγδT細胞など)を含む組成物が、腫瘍がストレスを受ける際に化学療法剤により生じる治療環境内で生存することが可能になる。特定の態様において、腫瘍に対するストレス効果(例えば化学療法剤による)は、γδT細胞上のNKG2D受容体などの受容体により認識されるストレス抗原の発現を増加する。化学療法によりストレス抗原を誘導することおよび制御T細胞を減少することの二重の効果は、個々の養生法のいずれかにわたり腫瘍低減を有意に向上させる。本明細書に記載される(生存ポリペプチドを発現する)遺伝子改変および/または生存因子による治療は、本開示の組成物を、化学療法養生法、例えばTMZのリンパ球枯渇効果から保護し、本開示の細胞組成物が、悪性細胞が化学療法により最大にストレスを受ける際に損なわれないT細胞細胞傷害性と組み合わされるTAAを介して、腫瘍に特異的にアクセスすることを可能にする。本発明によるCLTX-CARまたは多価CLTX-CARと組み合わせたDRIの使用は、本明細書において「DRI CLTX-CAR」療法と称され、化学療法(例えばTMZ)治療単独またはγδT細胞注入、例えば単独のいずれかと比較した場合に、生存を有意に延長し、腫瘍負荷および再発までの時間を有意に低減し、有意な有害全身性または神経学的な結果を伴うことなくそれを行うと考えられる。
本明細書に記載される組成物は、医薬組成物として送達され得るか、またはさらに薬学的に許容され得る適切な担体または希釈剤と共にインビボ投与に適切な埋没物に作製され得る。かかる組成物または埋没物を作製する手段は当該技術分野に記載される。適切な場合、本明細書に記載される遺伝子工学で作り変えられたγδT細胞は、それらのそれぞれの投与経路について通常の様式で、カプセル剤、溶液、注射、吸入剤またはエーロゾルなどの半固体または液体の形態の製剤に調製され得る。組成物が標的組織または臓器に到達するまで組成物の放出および吸収を防ぐかもしくは最小化する、または組成物の徐放性放出を確実にするために、当該技術分野で公知の手段が使用され得る。しかしながら望ましくは、CLTX-CARを発現する細胞を無効にしない(ineffectuate)薬学的に許容され得る形態が使用される。したがって、望ましくは本明細書に記載される多価CLTX-CARを発現する細胞は、均衡がとれた塩溶液、例えばハンクスバランス塩溶液または通常の食塩水を含む医薬組成物に作製され得る。そのため、本発明は、本開示の多価CLTX-CARを発現するγδT細胞を含む医薬組成物を含み、具体的には多価CLTX-CARを発現し、ポリペプチドに対する耐性を付与するポリペプチドを発現するγδT細胞を含む。
医薬組成物は、単独でまたは癌の治療に有用な他の十分に確立された薬物、例えば本明細書に記載される化学療法剤と組み合わせて使用され得る。単独で送達されるかまたは他の薬剤と組み合わせて送達されるかのいずれにせよ、本発明の医薬組成物は、種々の経路で、哺乳動物、特にヒトの身体の種々の部位に送達されて、特定の効果を達成し得る。当業者は、投与のために1つより多くの経路が使用され得るが、特定の経路は、別の経路よりも即時的でより効果的な反応を提供し得ることを理解する。例えば、黒色腫の治療について、皮内送達は吸入よりも有利に使用され得る。局所または全身の送達は、製剤の体腔への適用もしくは滴下、エーロゾルの吸引もしくは吹き込みを含む投与により、または筋内、静脈内、門脈内、肝臓内、腹腔、皮下もしくは皮内の投与を含む非経口的導入により達成され得る。
組成物は、単位剤型で提供され得、それぞれの投与単位、例えば注射は、単独またはより油性の活性剤との適切な組合せで所定量の組成物を含む。用語単位剤型は、本明細書で使用する場合、ヒトおよび動物被験体に対して単位用量として適切な物理的に別々の単位をいい、それぞれの単位は、適切な場合は薬学的に許容され得る希釈剤、担体またはビヒクルと合わせて所望の効果を生じるのに十分な量で計算される、単独または他の活性剤との組合せで本発明の組成物の所定量を含む。本発明の新規の単位剤型のための仕様は、特定の被験体における医薬組成物と関連する特定の薬力学に依存する。好ましくは、単独または治療剤と組み合わせて投与される遺伝子工学で作り変えられたγδT細胞の治療有効量または十分な数は、長期間の特異的な応答が確立されるように被験体に導入される。一態様において、応答は、癌の阻害を含む。一態様において、応答は、そうでなければ遺伝子工学で作り変えられたγδT細胞またはその組成物を用いた治療の非存在を生じるものよりも大きな程度までの腫瘍のサイズの低減または腫瘍成長もしくは再生の排除または転移の低下である。ある局面において、治療有効量は、遺伝子工学で作り変えられたCLTX-CARの非存在下のものと比較する場合、腫瘍サイズの少なくとも約5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%または100%の減少を生じる。したがって、治療有効量は、投与経路を考慮し、遺伝子工学で作り変えられた細胞の数は、所望の治療応答を達成するような十分な数となるようなものであるべきである。さらに、本開示のCLTX-CARを発現するそれぞれのγδT細胞または本明細書に記載される組成物に含まれる他の細胞の量(例えば接触されるそれぞれの細胞当たりの量または特定の体重当たりの量)は、異なる用途において変化し得る。特定の非限定的な例において、細胞の濃度は、治療されている被験体において少なくとも約1xl05～約1xl010の宿主細胞、さらにより望ましくは約1xl07～約5x108の宿主細胞を提供するのに十分であり得るが、上述のいずれか、例えば5x10s細胞超またはそれ以下、例えば1xl07細胞未満の任意の適切な量が利用され得る。投与スケジュールは、十分に確立された細胞系治療に基づき得るか、または代替的な連続注入戦略が使用され得る。
これらの量は、本発明の実施のための本発明の方法を最適化する際に、実務者により利用される一般的な手引きを提供する。かかる範囲の本明細書における記載は、特定の適用において保証され得るように、構成成分のより高いまたはより低い量の使用を決して排除するものではない。例えば、実際の用量およびスケジュールは、組成物が他の医薬組成物と組み合わせて投与されるかどうかに応じて、または薬物動態学、薬物の性質および代謝における個々の間の違いに応じて変化し得る。当業者は、特定の状況の緊急性に応じて、任意の必要な調整を容易になし得る。治療効果についての適切な用量は、1投与当たり、好ましくは一連の投与サイクルにおいて約105～約1010の宿主細胞である。好ましい投与養生法は、段階的に増加用量の4回の1週間投与サイクルからなり、0日目に約1(P細胞(ceil)で開始し、5日目までに約1010細胞の標的用量まで漸増的に増加する。適切な投与形態としては、静脈内、皮下、腔内(例えばレザバーアクセスデバイスによる)、腹腔内および腫瘍塊への直接注射が挙げられる。
治療される癌は、神経外胚葉起源のものであり得る。ある局面において、癌は、悪性の神経膠腫、黒色腫、神経芽腫、髄芽腫または小細胞肺癌である。注入される細胞は、レシピエントにおいて腫瘍細胞を殺傷し得る。抗体療法とは異なり、CLTX-CARを発現する宿主細胞は、インビボで複製し得、持続的な腫瘍制御をもたらし得る長時間の持続性を生じる。本発明はまた、γδ-T細胞が本発明のCLTX-CARおよび生存ポリペプチドを一過的に発現するように改変される細胞療法を含み、該細胞は、該細胞を必要とするレシピエントに注入される。注入された細胞は、レシピエントにおいて腫瘍細胞を殺傷し得る。したがって、種々の局面において、患者に投与されるγδ-T細胞は、患者への投与後、1か月未満、例えば3週間、2週間、1週間存在する。ある局面において、患者に投与される細胞またはそれらの子孫は、宿主細胞の患者への投与後少なくとも4か月、5か月、6か月、7か月、8か月、9か月、10か月、11か月、12か月、13か月、14か月、15か月、16か月、17か月、18か月、19か月、20か月、21か月、22か月、23か月、2年、3年、4年または5年の間患者内で持続する。
さらなる局面において、γδ-T細胞は、哺乳動物におけるエクソビボ免疫および/またはインビボ療法のためのある型のワクチンであり得る。一局面において、哺乳動物はヒトである。エクソビボ免疫に関して、以下：i)宿主細胞の拡大、ii)多価CLTX-CARおよび生存ポリペプチドをコードする核酸の宿主細胞への導入および/またはiii)CLTX-CARを発現するかもしくはそれを発現し得る細胞の凍結保存の少なくとも1つは、宿主細胞を含む医薬組成物などの宿主細胞または組成物を哺乳動物に投与する前にインビトロで起こる。エクソビボ手順は当該技術分野で周知である。簡潔に、患者(例えばヒト)から細胞を単離して、本開示のCLTX-CARを発現するように遺伝子的に改変する(すなわち本明細書に開示されるCLTX-CARを発現するベクターをインビトロで形質導入またはトランスフェクトする)。CLTX-CAR改変宿主細胞を患者に投与して、治療的利益を提供し得る。好ましくは患者はヒトであり、CLTX-CAR改変宿主細胞は、患者に関して自己であり得る。代替的に、宿主細胞は、患者に関して同種異系、同系または異種であり得る。
遺伝子工学で作り変えられたγδT細胞および化学療法剤(例えば生存因子が耐性を付与する化学療法剤)は共投与され得る。かかる共投与は、例えば同じまたは別々の細胞中の「同時(simultaneous)」または「同時(concurrent)送達」を包含し得る。他の局面において、共投与は、別々の投与であるが同じ治療養生法の一部としての投与を包含する。ある局面において、化学療法剤は、遺伝子工学で作り変えられたγδT細胞の前またはそれと同時に投与される。さらなる局面において、遺伝子工学で作り変えられたγδT細胞は、化学療法剤と共投与され、化学療法剤は、腫瘍または癌細胞上のストレスリガンド(例えばNKG2DL)の増加した発現を引き起こし；例えば化学療法剤は、ストレスリガンドの増加した発現を生じる量および様式/養生法で投与される。ある局面において、共投与は、いずれかの治療単独のものよりも効果的であり得る。2つの治療の効果は、部分的に相加的、全体的に相加的または相加的より大きくあり得る。例えば、共投与は、化学療法剤の投与の約8時間～約72時間後のγδT細胞の投与を包含し得る。ある局面において、遺伝子工学で作り変えられたγδT細胞は、化学療法剤の投与の約12時間～約36時間後に投与され；例えば遺伝子工学で作り変えられたγδT細胞は、化学療法剤の投与の約24時間後に投与される。なおさらなる局面において、共投与は、化学療法剤と同時(same time)または実質的に同時に、遺伝子工学で作り変えられたγδT細胞を投与することを包含する。本明細書で使用する場合、「実質的に同時」は、同じ治療期間内の投与を包含し得る。
遺伝子工学で作り変えられたγδT細胞および化学療法剤は、活性な障害の期間、または寛解もしくはより活性でない疾患の期間に投与され得る。
さらなる局面において、γδT細胞および化学療法剤に加えて、さらなる治療剤が投与される。γδT細胞および化学療法剤および任意にさらなる治療剤が組み合わせて投与される場合、前述の1つまたは全ての量または用量は、個々に、例えば単一療法として使用されるそれぞれの薬剤の量または用量よりも高い、それよりも低いまたはそれと同じ量または用量で投与され得る。ある態様において、前述の1つまたは全ての量または用量は、個々に、例えば単一療法として使用されるそれぞれの薬剤の量または用量よりも(例えば少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%または少なくとも50%)低い。他の態様において、所望の効果(例えば癌の阻害)を生じる前述の1つまたは全ての量または用量は、同じ治療効果を達成するために必要とされる、個々に、例えば単一療法として使用されるそれぞれの薬剤の量または用量よりも低い(例えば少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%または少なくとも50%低い)。
遺伝子工学で作り変えられたγδT細胞および化学療法剤は、限定されないが手術、化学療法(例えばDR細胞が耐性である化学療法剤とは異なるさらなる化学療法剤)、チェックポイント阻害剤、PARP阻害剤、放射線、免疫抑制剤、例えばシクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノレート、およびFK506、抗体、または他の免疫除去(immunoablative)剤、例えばCAMPATH、抗CD3抗体もしくは他の抗体療法、サイトキシン(cytoxin)、フルダラビン、FK506、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、およびサイトカインなどのさらなる治療的処置と組み合わせて投与され得る。なおさらなる局面において、さらなる治療剤は、例えばその内容が参照により本明細書に明確に援用されるWO2018/035413に記載されるチェックポイント阻害剤である。さらなる局面において、さらなる治療剤は、限定されないが、例えばその内容が参照により本明細書に明確に援用されるWO 2020/097306に記載されるPARP阻害剤などのDDR阻害剤である。
本発明はさらに、化学療法剤環境において腫瘍細胞に対するクロロトキシン(CLTX)-CARγδT細胞の細胞傷害性を高める方法を包含し、該方法は、少なくとも2つのCLTXペプチドを発現し、および任意に生存因子、例えば本明細書に記載される化学療法剤に対する耐性を付与するポリペプチドを発現するように、γδT細胞を遺伝子工学で作り変える工程を含む。多価CLTX-CARγδT細胞またはその組成物は、(生存ポリペプチドが耐性を付与する)化学療法剤環境において、同等のsCLTX-CARγδT細胞またはその組成物よりも高められた腫瘍細胞に対する細胞傷害性を有する。本発明はさらに、化学療法剤環境において腫瘍細胞に対するクロロトキシン(CLTX)-CARγδT細胞の活性化(例えばCD69活性化)を高める方法を包含し、該方法は、少なくとも2つのCLTXペプチドおよび本明細書に記載される生存ポリペプチドを発現するようにγδT細胞を遺伝子工学的に作り変える工程を含む。多価CLTX-CARγδT細胞またはその組成物は、同等のsCLTX-CARγδT細胞またはその組成物よりも高められた活性化を有する。
本明細書に開示される組合せ療法は、例えば経口または非経口などの種々の経路により患者に投与され得、限定されないが、静脈内、筋内、皮下、眼窩内、包内、腹腔内、直腸内、槽内、腫瘍内、脈管内、皮内、膣内(例えば膣坐剤)、または局所(例えば散剤、軟膏経皮パッチ)または例えば皮膚パッチもしくは経皮イオン導入法を使用した皮膚を介する受動的もしくは促進された吸収のそれぞれを含み得る。
好ましくは、本発明の方法の実施において投与される薬剤の総量は、ボーラスとしてもしくは比較的短い時間にわたる注入によるのいずれかで単回用量として被験体に投与され得るか、または延長された時間にわたり複数の用量が投与される分割された治療プロトコルを使用して投与され得る。当業者は、被験体において病理学的状態を治療するための組成物の量は、被験体の年齢および一般的な健康状態ならびに投与される治療の投与経路および回数などの多くの要因に依存することを知っている。これらの要因を考慮して、当業者は、必要な場合は特定の用量を調整する。
本発明の医薬組成物は、意図される方法または投与経路に適合性であるように製剤化され得；例示的な投与経路は本明細書に記載される。さらに、医薬組成物は、本開示により企図される疾患、障害および状態を治療または予防するために、本明細書に記載される他の治療活性剤または化合物と組み合わせて使用され得る。
医薬組成物は典型的に、本発明の併用療法ならびに1つ以上の薬学的および生理学的に許容され得る製剤において使用される1つ以上の薬剤の治療有効量を含む。適切な薬学的に許容され得るまたは生理学的に許容され得る希釈剤、担体または賦形剤としては、限定されないが、酸化防止剤(例えばアスコルビン酸および重硫酸ナトリウム)、保存剤(例えばベンジルアルコール、メチルパラベン、エチルまたはn-プロピル、p-ヒドロキシベンゾエート)、乳化剤、懸濁剤、分散剤、溶媒、充填剤、嵩増し剤、洗剤、緩衝剤、ビヒクル、希釈剤および/またはアジュバントが挙げられる。例えば、適切なビヒクルは、生理学的食塩水溶液、またはクエン酸緩衝化食塩水であり得、非経口投与のための医薬組成物において一般的な他の材料が補充される可能性があり得る。中性の緩衝化食塩水または血清アルブミンと混合された食塩水は、さらなる例示的なビヒクルである。当業者は、本明細書において企図される医薬組成物および剤型において使用され得る種々の緩衝剤を容易に理解する。典型的な緩衝剤としては、限定されないが、薬学的に許容され得る弱酸、弱塩基またはそれらの混合物が挙げられる。例として、緩衝剤構成成分は、リン酸、酒石酸、乳酸、コハク酸、クエン酸、酢酸、アスコルビン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸およびそれらの塩などの水溶性材料であり得る。許容され得る緩衝化剤としては、例えばTris緩衝剤、N-(2-ヒドロキシエチル)ピペラジン-N'-(2-エタンスルホン酸)(HEPES)、2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸(MES)、2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸ナトリウム塩(MES)、3-(N-モルホリノ)プロパンスルホン酸(MOPS)およびN-トリス[ヒドロキシメチル]メチル-3-アミノプロパンスルホン酸(TAPS)が挙げられる。
医薬組成物を製剤化した後、これは、溶液、懸濁液、ゲル、エマルジョン、固体、または脱水もしくは凍結乾燥粉末として滅菌バイアル内に保存され得る。かかる製剤は、使用の準備ができた形態、使用前の再構成を必要とする凍結乾燥形態、使用前の希釈を必要とする液体形態、または他の許容され得る形態のいずれかで保存され得る。好ましくは、医薬組成物は、単回使用容器(例えば単回使用バイアル、アンプル、シリンジまたは自動注射器(例えばEpiPen(登録商標)と同様)内に提供され、他の態様において複数回使用容器(例えば複数回使用バイアル)が提供される。埋没物(例えば埋め込み可能ポンプ)およびカテーテル系、遅延注射ポンプおよびデバイスなどの任意の薬物送達装置は、IL-10を送達するために使用され得、それらの全ては当業者に公知である。一般的に皮下または筋内投与されるデポー注射も、規定された時間にわたり本明細書に開示されるポリペプチドを放出するために使用され得る。デポー注射は通常、固体または油系のいずれかであり、一般的に本明細書に記載される製剤構成成分の少なくとも1つを含む。当業者は、あり得る製剤化をよく知っており、デポー注射を使用する。
医薬組成物は、滅菌注射可能水性または油性の懸濁物の形態であり得る。この懸濁物は、適切な分散または湿潤化剤および本明細書に記載される懸濁剤を使用して公知技術に従って製剤化され得る。滅菌注射可能製剤はまた、非毒性非経口性の許容され得る希釈物または溶媒中、例えば1,3-ブタンジオール中の溶液としての滅菌注射可能溶液または懸濁液であり得る。使用され得る許容され得る希釈物、溶媒および分散媒体としては、水、リンガー溶液、等張塩化ナトリウム溶液、CremophorELTM (BASF, Parsippany, N.J.)またはリン酸緩衝化食塩水(PBS)、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール)、ならびにそれらの適切な混合物が挙げられる。また、滅菌性固定油は、溶媒または懸濁媒体として従来から使用される。この目的で、合成モノまたはジグリセリドなどの任意の低刺激性固定油が使用され得る。さらに、オレイン酸などの脂肪酸は、注射可能物の調製における使用を見出す。特定の注射可能製剤の延長吸収は、吸収を遅延する剤(例えばモノステアリン酸アルミニウムまたはゼラチン)を含むことにより達成され得る。
医薬組成物は、例えば錠剤、カプセル剤、トローチ剤、ロゼンジ、水性もしくは油性の懸濁物、分散可能散剤もしくは顆粒剤、エマルジョン、硬質もしくは軟質カプセル剤、またはシロップ剤、溶液、マイクロビーズまたはエリキシル剤などの経口用途に適した形態であり得る。経口用途に意図される医薬組成物は、医薬組成物の製造のための当該技術に公知の任意の方法により従って調製され得、かかる組成物は、薬学的に上質で好ましい製剤を提供するために、例えば甘味剤、香料剤、着色剤および保存剤などの1つ以上の剤を含み得る。錠剤、カプセル剤等は、錠剤の製造に適した非毒性の薬学的に許容され得る賦形剤と混合された有効成分を含む。これらの賦形剤は、例えば炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウムまたはリン酸ナトリウムなどの希釈剤；顆粒化および崩壊剤、例えばトウモロコシデンプンまたはアルギン酸；結合剤、例えばデンプン、ゼラチンまたはアラビアゴム、ならびに滑沢剤、例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸またはタルクであり得る。
経口投与に適した錠剤、カプセル剤等は、被覆され得ないかまたは胃腸管内の崩壊および吸収を遅延するための公知の技術により被覆され得、それにより徐放作用を提供し得る。例えば、モノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリルなどの時間遅延材料が使用され得る。それらはまた、制御放出のための浸透性治療用錠剤を形成するための技術分野において公知の技術を使用して被覆され得る。さらなる剤は、投与される組成物の送達を制御するために、生分解性または生体適合性の粒子またはポリマー性物質、例えばポリエステル、ポリアミン酸、ヒドロゲル、ポリビニルピロリドン、ポリ無水物、ポリグリコール酸、エチレンビニルアセテート、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、硫酸プロタミン、またはラクチド/グリコリドコポリマー、ポリラクチド/グリコリドコポリマー、またはエチレンビニルアセテートコポリマーを含む。例えば、経口剤は、コアセルベーション技術によりまたは界面重合により、ヒドロキシメチルセルロースもしくはゼラチンマイクロカプセルもしくはポリ(メチルメタクロレート)マイクロカプセルのそれぞれの使用によりまたはコロイド薬物送達系において調製されるマイクロカプセル中にトラップされ得る。コロイド状分散系としては、マクロカプセル複合体、ナノカプセル、マイクロスフィア、マイクロビーズおよび脂質系システム、例えば水中油エマルジョン、ミセル、混合ミセルおよびリポソームが挙げられる。上述の製剤の調製のための方法は当業者に明らかである。
経口用途の製剤は、硬質ゼラチンカプセルとしても存在し得、有効成分は、不活性固形希釈剤、例えば炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、カオリンもしくは微結晶セルロースと混合され、または軟質ゼラチンカプセル剤としても存在し得、有効成分は、水もしくは油性媒体、例えばラッカセイ油、流動パラフィンもしくはオリーブ油と混合される。
水性懸濁物は、その製造に適した賦形剤との混合物中に活性材料を含む。かかる賦形剤は、懸濁剤、例えばナトリウムカルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントガムおよびアラビアゴム；分散もしくは湿潤剤、例えば天然に存在するホスファチド(例えばレシチン)、またはアルキレンオキシドと脂肪酸の凝縮生成物(例えばポリオキシエチレンステアレート)、またはエチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールの凝縮生成物(例えばヘプタデカエチレンオキシセタノールのためのもの)、またはエチレンオキシドと脂肪酸由来部分エステルおよびヘキシトールの凝縮生成物(例えばポリオキシエチレンソルビトールモノオレイン酸)、またはエチレンオキシドと脂肪酸由来部分エステルおよびヘキシトール無水物の凝縮生成物(例えばポリエチレンソルビタンモノオレイン酸)であり得る。水性懸濁物はまた、1つ以上の保存剤を含み得る。
油性懸濁物は、有効成分を、植物油、例えばラッカセイ油、オリーブ油、ゴマ油もしくはココナッツ油中、または鉱物油、例えば流動パラフィン中に懸濁することにより製剤化され得る。油性懸濁物は、濃化剤、例えばミツロウ、硬質パラフィンまたはセチルアルコールを含み得る。上述のものなどの甘味剤および香料剤は、好ましい経口製剤を提供するために添加され得る。
水の添加による水性懸濁物の調製に適した分散性散剤および顆粒は、分散または湿潤化剤、懸濁剤および1つ以上の保存剤と混合された有効成分を提供する。適切な分散または湿潤剤および懸濁剤が、本明細書に例示される。
医薬組成物はまた、水中油エマルジョンの形態であり得る。油性相は、植物油、例えばオリーブ油もしくはラッカセイ油または鉱物油、例えば流動パラフィンまたはこれらの混合物であり得る。適切な乳化剤は、天然に存在するゴム、例えばアラビアゴムまたはトラガカントゴム；天然に存在するホスファチド、例えばダイズ、レシチンおよびエステルもしくは脂肪酸由来の部分エステル；ヘキシトール無水物、例えばモノオレイン酸ソルビタン；および部分エステルとエチレンオキシドの凝縮生成物、例えばポリオキシエチレンモノステアリン酸ソルビタンであり得る。
包埋物、リポソーム、ヒドロゲル、プロドラッグおよびマイクロカプセル化送達系を含む制御放出製剤などの製剤はまた、組成物を迅速な分解または身体からの排除から保護するために担体を含み得る。例えばモノステアリン酸グリセリルもしくはステアリン酸グリセリル単独またはワックスとの組合せなどの時間遅延材料が使用され得る。
常温で固体であるが直腸温度で液体であり、そのため直腸内で溶解して薬物を放出する坐剤は、薬物と、適切な非刺激性賦形剤を混合することにより調製され得る。かかる材料としては限定されないが、カカオバターおよびポリエチレングリコールが挙げられる。
本発明による使用に適した医薬組成物は、現在公知であるか将来開発される任意の形式(例えば鼻孔または吸入用途のためのスプレー)であり得る。
本明細書に記載される治療方法は、癌の治療に特に適切である。癌細胞は、近くの組織に侵入し得、血流およびリンパ系を通って身体の他の部分に広がり得る。いくつかの主要な型の癌があり、例えば癌腫は、皮膚または内部臓器を裏打ちするかもしくはそれを被覆する組織において開始する癌である。肉腫は、骨、軟骨、脂肪、筋肉、血管または他の結合性もしくは支持組織において開始する癌である。白血病は、骨髄などの血液形成組織で開始して、多くの異常な血液細胞を産生して血流に進入させる癌である。リンパ腫は、免疫系の細胞において開始する癌である。
治療されている腫瘍に対する癌は、頭蓋内腫瘍であり得る。頭蓋内腫瘍としては、限定されないが、神経膠腫、髄膜腫、聴神経腫、下垂体腺腫、髄芽腫、生殖細胞腫瘍および頭蓋咽頭腫が挙げられる。
いくつかの局面において、本発明により治療されている癌は、CNS腫瘍であり、限定されないが、頭蓋内および脊髄上衣腫(上衣下腫を除く)；低級浸潤性テント上方星状細胞腫/希突起神経膠腫、髄芽腫、退形成型神経膠腫、グリア芽腫、CNSおよび原発性CNSリンパ腫の転移性病変が挙げられる。
いくつかの局面において、治療されている癌は黒色腫である。好ましくは治療されている癌はブドウ膜黒色腫である。
いくつかの局面において、治療されている癌は、神経内分泌または副腎の腫瘍である。例としては限定されないが、気管支肺疾患、GI管、肺または胸腺、膵臓、パラガングリオーマまたは褐色細胞腫が挙げられる。
いくつかの局面において、治療されている癌は非ホジキンリンパ腫であり、限定されないが、菌状息肉腫およびセザール症候群が挙げられる。
いくつかの局面において、治療されている癌は、軟部組織肉腫である。例としては、血管肉腫、切除可能でないまたは進行性の腹膜後/腹内軟部組織肉腫、横紋筋肉腫、端/表在体幹および/または頭頸部癌または単発性線維性腫瘍/血管周囲細胞腫が挙げられる。
いくつかの局面において、治療されている癌は骨癌である。例としては、ユーイング肉腫および間葉軟骨肉腫が挙げられる。
いくつかの局面において、治療されている癌は、子宮肉腫、小細胞肺癌(SCLC)またはゾリンジャー-エリソン症候群である。
いくつかの局面において、本発明により治療されている癌は、限定されないが、卵巣癌、ファローピウス管の癌、腹膜癌および乳癌などの婦人科学の癌(例えば女性の生殖系の癌)である。好ましくは、本発明により治療されている癌は卵巣癌である。
いくつかの局面において、本発明により治療されている癌はグリア芽腫である。
脳腫瘍は、通常は脳の外側に転移しないが脳内に広く拡散する。神経膠腫は、半球を越えても脳の内側に非常に侵入性である。しかしながらそれらは制御されない様式で分裂する。それらの位置に応じて、それらは、悪性病変と同様に生命を脅かし得る。この例は、脳内の良性腫瘍であり、これは増殖して頭蓋内の空間を占有し得、脳に対する圧力の増加をもたらす。
典型的に本明細書に記載される発明の併用療法において使用される治療有効量の1つ以上の薬剤を含む医薬組成物を含むキットも提供される。キットは典型的に、キットの内容物の意図される使用を示す標識および使用のための指示書を含む。
本明細書に記載される組成物または組成物の組み合わせのいずれかは、キットに含まれ得る。非限定的な例において、キメラ受容体発現構築物、キメラ受容体発現構築物を作製するための1つ以上の試薬、発現構築物のトランスフェクションのための細胞および/または発現構築物のトランスフェクションのための自己細胞を得るための1つ以上の器具(かかる器具は、シリンジ、ピペット、鉗子および/または任意のかかる医学的に認可される装置であり得る)。キットは、1つ以上の適切に分けられた本発明の組成物または本発明の組成物を作製するための試薬を含み得る。キットの構成成分は、水性媒体中または凍結乾燥形態のいずれかでパッケージングされ得る。キットの容器手段は、構成成分が配置され得る、好ましくは適切に分けられ得る少なくとも1つのバイアル、試験管、フラスコ、ボトル、シリンジまたは他の容器手段を含み得る。キット内に1つより多くの構成成分がある場合、キットは、さらなる構成成分が別々に配置され得る第2、第3または他のさらなる容器も一般的に含む。しかしながら、構成成分の種々の組み合わせは、バイアルに含まれ得る。本発明のキットはまた典型的に、キメラ受容体構築物を含むための手段および商業的販売のために密に封入する任意の他の試薬容器を含む。かかる容器としては、例えば所望のバイアルが保持される注入またはブロー成形プラスチック容器が挙げられる。
該キットは一般的に、以下に記載される種々の構成成分を収容する物理的構造の形態であり、例えば上述の方法を実施することに使用され得る。キットは、例えば1つ以上の滅菌容器内に提供される本発明の併用療法に使用される治療剤の1つ以上を含む組成物(例えば遺伝子工学で作り変えられたγδ細胞)を含み得、これは被験体への投与に適した医薬組成物の形態であり得る。医薬組成物は、使用が容易である形態または例えば投与前に再構成もしくは希釈を必要とする形態で提供され得る。組成物がユーザーにより再構成される必要のある形態である場合、キットはまた、治療剤と一緒にまたは別々にパッケージングされる緩衝剤、薬学的に許容され得る賦形剤等を含み得る。併用療法が企図される場合、キットは、いくつかの薬剤を別々に含み得るか、またはそれらはキット内ですでに合わされ得る。
本発明のキットは、その中に収容される構成成分を適切に保持する必要がある条件(例えば冷蔵または冷凍)について設計され得る。キットは、その中の構成成分についての情報を識別することを含む標識またはパッケージング挿入物ならびにそれらの使用のための指示書(例えば投与パラメーター、作用機構(1つまたは複数)、薬物動力学および薬力学、有害効果、禁忌等を含む有効成分(1つまたは複数)の臨床的薬理学)を含み得る。
キットのそれぞれの構成成分は、個々の容器に囲まれ得、種々の容器の全ては、単一のパッケージ内にあり得る。標識または挿入物は、ロット番号および使用期限などの製造者情報を含み得る。標識またはパッケージング挿入物は、例えば構成成分を収容する物理的構造に一体化され得るか、物理的構造内に別々に含まれ得るか、またはキットの構成成分(例えばアンプル、シリンジまたはバイアル)に固定され得る。
標識または挿入物はさらに、ディスク(例えばハードディスク、カード、メモリディスク)、CD-もしくはDVD-ROM/RAM、DVD、MP3、磁気テープなどの光学ディスク、またはRAMおよびROMなどの電子記憶媒体、または磁気/光学記憶媒体、FLASHメディアもしくはメモリタイプカードなどのこれらのハイブリッドなどのコンピューター読み取り可能媒体を含み得るかまたはそれらに一体化され得る。いくつかの態様において、実際の指示書はキット内に存在しないが、遠隔供給源から例えばインターネットサイトを介して指示書を得るための手段が提供される。
実施例
以下の実施例は、例示の目的で提供され、任意の方法で特許請求される場合に発明の限定であると解釈されない。
実施例1：γδT細胞薬物耐性免疫療法のためのdCLTX-CAR-MGMTベクターの開発
本発明者らは、遺伝子改変γδT細胞と標準的なテモゾロミド(TMZ)保持化学療法の同時の頭蓋内投与を組み合わせることにより、原発性GBMの治療のための新規のアプローチを開発した。これらのγδT細胞は、アルキル化化学療法に対する耐性を運ぶO-6-メチルグアニン-DNAメチルトランスフェラーゼ(MGMT)で形質導入され、それにより腫瘍NKG2DL発現が有意に上昇される場合に、TMZの治療濃度でエフェクター機能を可能にする。本発明者らは、クロロトキシン結合ドメインを有するキメラ抗原受容体(CAR) (CLTX-CAR)を発現するレンチベクター構築物でγδT細胞を改変して、GBM標的化を向上させた。MGMTp140kは、同じCLTX-CARベクター内で共発現されて、CAR-T細胞にTMZ耐性を付与した。CLTX-CARベクターは、CD8αシグナルペプチド、モノまたは二重CLTX結合ドメイン、Myc-タグペプチド、CD8αヒンジドメイン、CD28膜貫通ドメインおよび共刺激性ドメイン、その後にCD3ζ活性化ドメインを含む。本発明者らは、P2Aペプチドを使用して、CARと一緒にMGMTp140kを共発現した。最初に、本発明者らは、Jurkat T細胞内の、結合ドメインとして二重CLTX構築物を用いたCLTX-CARの効率的な形質導入を示した(dCLTX-CAR)。dCLTX-CARの細胞表面局在は、フローサイトメトリーにより検証した。モノCLTX-CAR (sCLTX-CAR)形質導入Jurkat細胞と比較した場合、dCLTX-CARは、CD69活性化の増加を示した(MFI=4873対1078)。dCLTX-CAR形質導入γδT細胞は、sCLTX-CAR形質導入γδT細胞と比較して、TMZ曝露下などで、インビトロで腫瘍細胞に対するより大きな細胞傷害性を示すことが予想される。γδT細胞は、NKG2DLストレス抗原認識を通じて腫瘍を認識および殺傷するので、本発明者らは、活性化シグナルなしのCLTX-CARは、腫瘍細胞に対するγδT細胞の認識および細胞傷害性を高め、CAR-T活性化誘導細胞死を減ずるのに十分であり得ると仮説を立てた。次いで本発明者らは、CD3ζドメインなしdCLTX-CAR構築物を開発した(dCLTX-noZ-CAR)。予想されるように、dCLTX-noZ-CARレンチウイルス形質導入Jurkat細胞は、完全dCLTX-CARと比較して、高められた細胞-細胞結合を示したが、GBM細胞と共培養した場合にはCD69発現は示さなかった。全体的に、本発明者らは、TMZに対する耐性を有するdCLTX-CAR T細胞を作製することができ、TMZ曝露下でGBM細胞に対して向上された活性化を示した。dCLTX-CARおよびTMZ耐性を合わせる本発明者らのアプローチは、動物モデル実験においてさらに検証し、GBMについての臨床的開発のための潜在的な候補であり得た。
dCLTX-CAR構築物を構築するために、ヒトコドン最適化CLTX、c-Mycタグ、P2A-EGFP、P2A-MGMTp140kおよび他のCARドメインをコードするgblocks二本鎖DNAを、IDT DNAにより合成し、Gibsonアセンブリクローニングキット(New England Biolabs)によりトランスファープラスミドpDL171にクローニングした。
図3は、Jurkat細胞中のレンチウイルスベクターによるdCLTX-CARおよびマーカー遺伝子の共発現についてのフローサイトメトリー分析を示す。c-MycタグをCLTXの代理マーカーとして使用し、dCLTX-CARの発現および細胞表面局在を示す。EGFPは、P2A自己切断ペプチドによりCLTX-CARと共発現されるマーカー遺伝子である。
図4は、U251MG細胞との共培養後のレンチウイルスdCLTX-CAR形質導入Jurkat細胞中のCD69の活性化を示す。EGFP、CLTX-EGFP、dCLTX-EGFPおよびdCLTX-MGMTをコードするレンチウイルスベクターを形質導入したJurkat細胞を、U251MG細胞と、24時間共培養し、CD69の活性化をフローサイトメトリーにより測定した。図4は、細胞外抗原結合ドメイン内に2つのCLTXペプチドを含むCARを形質導入したT細胞(dCLTX-CAR細胞)が、細胞外抗原結合ドメイン内に単一のCLTXペプチドを含む細胞(sCLTX-CARγδT細胞)と比較して、約4.5倍高いCD69活性化を示したことを示した。2つのCLTXペプチドの存在は、相加的であり、単一CLTXペプチドよりも高い、例えば2倍高いCD69活性化を生じることが予想され得たが、CAR中の2つのみのCLTXペプチドの存在は、単一のCLTXペプチドを有する同等のCARよりも4倍より高い活性化を生じたことは驚くべきことであった。このデータは、細胞外抗原結合ドメイン内の複数のCLTXペプチドが、T細胞活性化に対して相乗的な効果を有し、予期せずにより高い持続性を示し、グリア芽腫細胞に対してより高い細胞傷害性を示すことを示唆した。dCLTX-CAR中の2つのCLTXペプチドは、短いペプチド、具体的にFlagペプチドにより分離された。以下の図9に示されるように、Flagまたはmycペプチドを含む1xCLTX構築物を調製した場合に、1xCLTX-CARは、ペプチド/タグを有さないCLTX-CARよりも高いCD69活性化を示した。このデータ(図9；以下により詳細に議論される)は、増加したCD69活性化は、少なくとも部分的にペプチドリンカー(例えばFLAG/mycタグ)の付加のためであり得ることを示唆する。
実施例2：多形グリア芽腫(GBM)の薬物耐性免疫療法のための二重クロロトキシンCAR (dCLTX-CAR/2xCLTX-CAR)およびMGMTγδ-T細胞
フローサイトメトリーアッセイは以下の通りに実行した。
・活性化
-レンチウイルス形質導入Jurkat T細胞を、U251 GBM細胞と24時間共培養して、抗CD69抗体で染色した
・持続性
-CLTX-CAR形質導入Jurkat細胞を活性化して、約3週間培養し、% CAR+ T細胞を測定した
・細胞傷害性アッセイ
-高効率(>60%)で形質導入したγδT細胞を、異なる比で24～48時間、U251-GFPまたはU87-GFP細胞と共培養し、次いでAnnexin Vおよび7-AADで染色した
CLTX-CAR構築物は、潜在的な高められた腫瘍標的化のために、単一CLTX(1xCLTX)または複数のCLTX結合ドメイン(例えば2xCLTX-CAR/dCLTX-CAR)のいずれかを含んだ。CAR-T検出/富化のためにMyc-タグまたはFlag-タグ(示されるように)を含む特定の構築物を調製した。CD3ζ シグナル伝達ドメインを含むCLTX-CAR構築物を調製した。また、活性化誘導細胞死(AICD)および強壮シグナル伝達の緩和のために、CD3ζ シグナル伝達ドメインを有さない(「noZ」または「CD3zなし」)CLTX-CAR構築物も調製した。テモゾロミド(TMZ)耐性を付与するためのO6-メチルグアニン-DNAメチル-トランスフェラーゼ(p140K-MGMT)の共発現(DeltEx薬物耐性免疫療法(DRI))。図5～8に示されるデータは単一の実験を示し、その後の実験は同様の結果を示した。
CLTX-CARはJurkat T細胞を効率的に活性化する：Jurkat T細胞に、細胞外mycまたはflagタグを有する1xおよび2xCLTX-CARのレンチウイルスベクターを形質導入した。GFP対照およびタグなしの1xCLTX-CARも含めた。図5は、CLTX-CAR構築物を最適化し、Jurkat T細胞中で試験し、2xCLTX-CARがJurkat T細胞を効率的に活性化したことを示す。具体的に、CD69は、形質導入CAR-T細胞において活性化されたが、GFP対照形質導入T細胞または形質導入なしT細胞では活性化されなかった。さらに、細胞外タグ(mycまたはflag)を有するCLTX-CARは、タグを有さないCLTX-CARよりも高いレベルのT細胞活性化を示したことが観察された。図9は、U251グリア芽腫細胞との共培養は、1xCLTX-CARおよび2xCLTX Jurkat T細胞を活性化したこと、およびさらにCD3zシグナル伝達ドメインなし(noZ)の1xCLTX-CARまたは2xCLTX-CAR構築物を形質導入したJurkat T細胞は、U251共培養の際にCD69活性化を示さないことを示す。タグを有さない1xCLTX-CARを形質導入したJurkat T細胞は、形質導入なし細胞と比較して、中位のCD69の活性化を示す。Flagタグを有する1xCLTX-CARまたは2xCLTX-CARを形質導入したJurkat T細胞は、腫瘍細胞との共培養の際により大きく増加したCD69活性化を示す。
より長いCAR-T細胞持続性を有するCLTX-CAR構築物：Jurkat T細胞に、CD3zありまたはなしの1xおよび2xCLTX-CARを形質導入して、活性化し、CAR-Tパーセンテージについて約3週間モニタリングした。図6は、Jurkat T細胞持続性に対する2つのCLTX-CAR構築物の効果を示す。CD3zを有さないCLTX-CAR-T細胞は、CD3zを有するCLTX-CAR-T細胞よりも優れた持続性を有する。また、T細胞持続性は、1xCLTX-CARと比較して、2xCLTX-CARにおいて向上された。図10は、Jurkat T細胞持続性に対する2xCLTXおよびシグナル伝達ドメインの非存在の効果を示す。シグナル伝達ドメインを有さない細胞は、CD3zシグナル伝達ドメインを有する同等の細胞よりも高い持続性を有し、2つのCLTXペプチド(二重CLTX)を有する細胞は、1つのみのCLTXペプチドを有する同等の細胞よりも高い持続性を示した。また、図11および12は、シグナル伝達ドメインを欠く1xCLTX細胞は、CD3zシグナル伝達ドメインを有する同等の細胞よりも高い持続性を有し；具体的に、1xCTX-Flag-noZ-EGFPは、1xCTX-Flag-Z-EGFP細胞よりも高い持続性を示したことを示す。
CLTX-CARはGBM細胞のγδT細胞殺傷を高める：CLTX-CAR-γδT細胞との48時間の共培養後、U251-GFP GBM細胞を、細胞傷害性のフローサイトメトリー分析のためにAnnexin Vおよび7-AADで染色した。図8に示されるように、CLTX-CAR-γδT細胞と共培養した場合、形質導入なしγδTと共培養した場合の42.6%のアポトーシスGBM細胞と比較して、80%より高いGBM細胞が、アポトーシスを経験していたかまたは殺傷されたかのいずれかであった。要約すると、これらの結果は、γδ T細胞におけるCLTX-CARの有効な形質導入および発現を示し、さらにCLTX-CARが、CD3z共刺激性ドメインの非存在下においてもGBM細胞に対するγδ Tの細胞傷害性を高めたことを示す。
実施例3：γδ細胞のレンチウイルス形質導入およびCLTX-CAR-γδT細胞の細胞傷害性
50%より高いγδTを有するγδT細胞を、健常ドナーアフェレーシス生成物(Hemacare)から拡大し、FBS (Cytiva HyClone)、HEPES (Thermo Scientific)、MEM NEAA (Cytiva HyClone)、ピルビン酸ナトリウム(Gibco)およびヒトrIL-12を補充したRPMI培地(Cytiva HyClone)中で培養した。拡大されたγδT細胞に、レンチウイルスベクターを発現するCLTX-CARを形質導入し、少なくとも2日間維持し、その後形質導入効率分析および細胞傷害性アッセイを行った。CLTX-γδT細胞の形質導入効率は、γδTCR陽性およびFlag陽性集団について選別したフローサイトメトリーにより測定した。細胞傷害性アッセイについて、対照(γδT細胞NTC)および2xCLTX-CAR-noZ-γδT細胞を、エフェクター対標的(E/T)比、2:1または4:1で4時間、懸濁液中U251またはU87 GBM細胞と共培養し、その後、7-AADでの染色およびフローサイトメトリー分析を行った。
図13は、2:1のエフェクター/標的(E/T)および4:1のE/Tでの共培養中、GBM細胞に結合するレンチウイルスベクターで形質導入した対照γδT細胞(γδT細胞NTC)および2xCLTX-CAR-noZ-γδT細胞の顕微鏡写真を示す。CTLX-CARγδT細胞はGBM細胞に結合し得、具体的に、2xCLTX-CAR-FLAG-noZ-γδT細胞は、対照γδT細胞よりも高いGBM細胞の結合を示した。図14は、2xCLTX-CAR-noZ-γδTが、CD3zシグナル伝達ドメインを有さなくても、対照γδT細胞(CARなし)よりも高められたU87グリア芽腫細胞に対する細胞傷害性を示したことを示す。
実施例4：2xCLTX-CAR-noZγδT細胞によるU251-GFP GBM細胞の連続殺傷
U251-GFP細胞は、GFP発現レンチウイルスベクターで形質導入したU251MG GBM細胞株から確立した。レンチウイルス形質導入2xCLTX-CAR-noZ-γδT細胞を、24ウェルプレート中でU251-GFP GBM細胞と共培養し、EVOSオンステージインキュベーター(Thermo Scientific)を備えたEVOS M5000画像化システムを使用して、15時間、1分ごとにタイムラプス写真を撮った。
図15は、タイムラプス動画からの一連の静止画像を示し、2xCLTX-CAR-noZγδT細胞によるU251MG GBM細胞の連続殺傷を示す。画像中の緑色の細胞(またはグレースケールにおいて示されるより明るい細胞)は腫瘍細胞である。赤色の矢印は、γδT細胞が異なる腫瘍細胞に結合して殺傷する場合の経時的なγδT細胞を示す(画像中のT1、T2、T3、T4およびT5ならびにKill-1、Kill-2、Kill-3、Kill-4およびKill-5参照)。(左から右に、および画像間の矢印で示されるように)経時的に画像を撮った。これは、単一の2xCLTX-CAR-noZ改変γδT細胞は、数時間以内に5より多くの標的GBM細胞に結合し得、それと解離し得、最終的に殺傷し得たことを示す。
実施例5：3または4個のCLTXペプチドを有するCARは細胞表面上に正常に提示されない
3つのタンデムCLTXペプチド(3xCLTX-Z-EGFP)または4つのタンデムCLTXペプチド(4xCLTX-Z-EGFP)を有するCLTX-CAR-EGFP構築物を、レンチウイルスベクターにパッケージングし、Jurkat T細胞に形質導入した(例えば図16参照)。3xCLTX-Z-EGFPまたは4xCLTX-Z-EGFP Jurkat T細胞をU251 GBM細胞と24時間共培養し、フローサイトメトリーにより分析した。
図17A～17Cは、対照(NTC)細胞、3xCLTX-Z-EGFP Jurkat細胞および4xCLTX-Z-EGFP Jurkat細胞についての抗Mycモノクローナル抗体を使用した細胞表面染色のフローサイトメトリー分析を示し、U251 GBM細胞との共培養後の任意のCD69活性化も示す。細胞はGFPについても選別する。図17Bおよび17Cは、3xCLTXおよび4xCLTXのCARは、高いGFP+集団を有する3xおよび4x CLTX-CARレンチベクターを用いて効率的に形質導入されるが、CLTX-CARは細胞表面上に正常に提示されない(GFP+であるがMyc+ではない)ことを示す。さらに、これらの形質導入されたJurkat細胞(GFP+)からのCD69活性化状態において変化はなく、これは細胞表面上に機能的なCAR発現がないことを示す。
本発明は、その好ましい態様に関して具体的に示され、記載されているが、添付の特許請求の範囲に包含される発明の範囲を逸脱することなく、形態および詳細における種々の変更が本発明においてなされ得ることが当業者に理解される。

Claims (83)

  1. 多価CLTXキメラ抗原受容体(CLTX-CAR)を発現する遺伝子工学で作り変えられたγδT細胞であって、該γδT細胞は生存因子を発現し、該生存因子は、化学療法剤に対する耐性を付与するDNA、RNAまたはポリペプチドであり、さらに：
    a. 多価CLTX-CARが：
    i. 少なくとも2つのCLTXペプチドを含む細胞外抗原結合ドメイン、ここで該少なくとも2つのCLTXペプチドは、リンカーペプチドで取り付けられる；
    ii. 膜貫通ドメイン；および
    iii. 膜貫通ドメインを細胞外抗原結合ドメインに取り付ける細胞外ヒンジドメイン；および
    iv. 任意に、細胞内シグナル伝達ドメイン；および
    v. 任意に、共刺激性ドメイン
    を含む、γδT細胞。
  2. 生存因子が化学療法剤に対する耐性を付与するポリペプチドである、請求項１記載のγδT細胞。
  3. 化学療法剤に対する耐性を付与するポリペプチドが、アルキルグアニントランスフェラーゼ(AGT)、O6メチルグアニンDNAメチルトランスフェラーゼ(MGMT)、P140K MGMT、L22Y-DHFR、チミジル酸シンターゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、多剤耐性1タンパク質(MDR1)、5'ヌクレオチダーゼII、ジヒドロ葉酸レダクターゼおよびチミジル酸シンターゼからなる群より選択される、請求項２記載のγδT細胞。
  4. 化学療法剤に対する耐性を付与するポリペプチドがMGMTまたはP140K MGMTである、請求項３記載のγδT細胞。
  5. 生存因子が、化学療法剤に対する耐性を付与するDNAである、請求項１記載のγδT細胞。
  6. 生存因子が化学療法剤に対する耐性を付与するRNAである、請求項１記載のγδT細胞。
  7. 膜貫通ドメインがCD28膜貫通ドメインを含む、請求項１～６いずれか記載のγδT細胞。
  8. ペプチドリンカーが30アミノ酸長以下である、請求項１～７いずれか記載のγδT細胞。
  9. ペプチドリンカーが15アミノ酸長未満である、請求項８記載のγδT細胞。
  10. 細胞内シグナル伝達ドメインが存在する、請求項１～９いずれか記載のγδT細胞。
  11. 細胞内シグナル伝達ドメインがCD3ゼータシグナル伝達ドメインを含む、請求項１０記載のγδT細胞。
  12. ヒンジドメインが、CD8a、CD28、CD137またはそれらの組み合わせからなる群より選択されるタンパク質のヒンジ領域である、請求項１～１１いずれか記載のγδT細胞。
  13. ヒンジドメインがCD8のヒンジ領域を含む、請求項１２記載のγδT細胞。
  14. 共刺激性ドメインが存在し、CD28および4-1BB共刺激性ドメインまたはそれらの組み合わせから選択される、請求項１～１３いずれか記載のγδT細胞。
  15. 細胞外ドメインが細胞外シグナルペプチドをさらに含む、請求項１～１４いずれか記載のγδT細胞。
  16. シグナルペプチドが、CD8a、CD28、GM-CSF、CD4、CD137またはそれらの組み合わせからなる群より選択されるタンパク質のシグナルペプチドである、請求項１５記載のγδT細胞。
  17. シグナルペプチドがCD8aシグナルペプチドである、請求項１６記載のγδT細胞。
  18. リンカーペプチドがc-mycである、請求項１～１７いずれか記載のγδT細胞。
  19. リンカーペプチドがFLAGである、請求項１～１７いずれか記載のγδT細胞。
  20. 細胞外抗原結合ドメインが2つのみのCLTXペプチドを含む、請求項１～１９いずれか記載のγδT細胞。
  21. 細胞外抗原結合ドメインが3つのみのCLTXペプチドを含む、請求項１～１９いずれか記載のγδT細胞。
  22. 細胞外抗原結合ドメインが4つのみのCLTXペプチドを含む、請求項１～１９いずれか記載のγδT細胞。
  23. 細胞外抗原結合ドメインが2つのみのCLTXペプチドを含み、生存ペプチドがMGMTまたはP140K MGMTである、請求項１記載のγδT細胞。
  24. 化学療法剤がアルキル化剤である、前記請求項いずれか記載のγδT細胞。
  25. 化学療法剤が、トリメトトレキサート、テモゾロミド、ラルチトレキセド、S-(4-ニトロベンジル)-6-チオイノシン、6-ベンジルグアニジン(benzyguanidine)、ニトロソウレア、フォテムスチン、シタラビン(cytabarine)およびカンプトテシンからなる群より選択される、前記請求項いずれか記載のγδT細胞。
  26. 細胞外抗原結合ドメインが2つのみのCLTXペプチドを含む、請求項１記載のγδT細胞。
  27. CLTX-CARが細胞内シグナル伝達ドメインを含まない、請求項２６記載のγδT細胞。
  28. 生存因子が化学療法剤に対する耐性を付与するポリペプチドである、請求項２６および２７のいずれか記載のγδT細胞。
  29. 化学療法剤に対する耐性を付与するポリペプチドが、アルキルグアニントランスフェラーゼ(AGT)、O6メチルグアニンDNAメチルトランスフェラーゼ(MGMT)、P140K MGMT、L22Y-DHFR、チミジル酸シンターゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、多剤耐性1タンパク質(MDR1)、5'ヌクレオチダーゼII、ジヒドロ葉酸レダクターゼおよびチミジル酸シンターゼからなる群より選択される、請求項２８記載のγδT細胞。
  30. 化学療法剤に対する耐性を付与するポリペプチドがMGMTまたはP140K MGMTである、請求項２９記載のγδT細胞。
  31. 薬学的に許容され得る賦形剤および前記請求項いずれか記載の遺伝子工学で作り変えられたγδT細胞の有効量を含む、医薬組成物。
  32. γδT細胞が、フローサイトメトリーにより測定される場合、組成物のうちの総生存可能細胞集団の少なくとも約60%である、請求項３１記載の医薬組成物。
  33. αβT細胞が、フローサイトメトリーにより測定される場合、組成物のうちの総生存可能細胞集団の約5%未満である、請求項３１記載の医薬組成物。
  34. 癌または腫瘍の治療を必要とする被験体において癌または腫瘍を治療する方法であって、該被験体に、請求項１～３０いずれか記載の遺伝子工学で作り変えられたγδT細胞の有効量を含む組成物または請求項３１～３３記載の組成物を投与する工程を含み、該被験体に、癌または腫瘍細胞上のストレス抗原発現を増加するのに十分な量の化学療法剤を共投与する工程をさらに含む、方法。
  35. 腫瘍が、頭蓋内/頭蓋外腫瘍である、請求項３４記載の方法。
  36. 腫瘍が神経膠腫である、請求項３４記載の方法。
  37. 神経膠腫がグリア芽腫である、請求項３４記載の方法。
  38. 遺伝子工学で作り変えられたγδT細胞が頭蓋内投与される、請求項３４～３７いずれか記載の方法。
  39. ストレス抗原がNKG2DLである、請求項３４～３８いずれか記載の方法。
  40. 化学療法剤がアルキル化剤である、請求項３４～３９記載の方法。
  41. 化学療法剤が、トリメトトレキサート、テモゾロミド、ラルチトレキセド、S-(4-ニトロベンジル)-6-チオイノシン、6-ベンジルグアニジン、ニトロソウレア、フォテムスチン、シタラビン、カンプトテシン、ドキソルビシンおよびメルファランからなる群より選択される、請求項３４～３９記載の方法。
  42. 化学療法剤がテモゾロミド(TMZ)である、請求項４１記載の方法。
  43. 遺伝子工学で作り変えられたγδT細胞が、同等のsCLTX-CARγδT細胞のものと比較して、腫瘍細胞に対して高められた細胞傷害性を有する、請求項３４記載の方法。
  44. 遺伝子工学で作り変えられたγδT細胞が、同等のsCLTX-CARγδT細胞のものと比較して、高められた活性化を示す、請求項３４記載の方法。
  45. 高められた細胞傷害性が、同等のsCLTX-CARγδT細胞の細胞傷害性から予測されるものと比較して、相加的よりも大きい、請求項４３記載の方法。
  46. 高められた活性化が、同等のsCLTX-CARガンマデルタT細胞の細胞傷害性から予測されるものと比較して、相加的よりも大きい、請求項４４記載の方法。
  47. 細胞外抗原結合ドメインが、2つのみのCLTXペプチドを含み、高められた活性化が、同等のsCLTX-CARガンマデルタT細胞の細胞傷害性から予測されるものよりも少なくとも3倍高い、請求項４１記載の方法。
  48. 遺伝子工学で作り変えられたγδT細胞が、同等のsCLTX-CARγδT細胞のものと比較して、高められた持続性を有する、請求項３４記載の方法。
  49. 遺伝子工学で作り変えられたγδT細胞が細胞内シグナル伝達ドメインを含まない、請求項４８記載の方法。
  50. 遺伝子工学で作り変えられたγδT細胞が、同等のsCLTX-CARγδT細胞のものと比較して、高められた持続性を有する、請求項４３記載の方法。
  51. 遺伝子工学で作り変えられたγδT細胞が、細胞内シグナル伝達ドメインを含まない、請求項４３記載の方法。
  52. 化学療法剤による治療を受けている被験体において、腫瘍細胞に対するCTX-CARγδT細胞の細胞傷害性を高める方法であって、該方法が、少なくとも2つのCLTXペプチドおよび生存因子を発現するようにγδT細胞を遺伝子工学で作り変える工程を含み、該生存因子が化学療法剤に対する耐性を付与するDNA、RNAまたはポリペプチドであり、該γδT細胞が、CLTX-CARおよび生存因子の発現を方向づける単一のベクターを含み、さらに：
    a. CLTX-CARが：
    i. 少なくとも2つのCLTXペプチドを含む細胞外抗原結合ドメイン、ここで少なくとも2つのCLTXペプチドはリンカーペプチドにより取り付けられ、リンカー；
    ii. 膜貫通ドメイン；および
    iii. 膜貫通ドメインを細胞外抗原結合ドメインに取り付ける細胞外ヒンジドメイン；
    iv. 任意に、細胞内シグナル伝達ドメイン；および
    v. 任意に、共刺激性ドメイン
    を含む、方法。
  53. 生存因子が化学療法剤に対する耐性を付与するポリペプチドである、請求項５２記載の方法。
  54. CLTX-CARが2つのみのCLTXペプチドを含む、請求項５２記載の方法。
  55. CLTX-CARが細胞内シグナル伝達ドメインを含まない、請求項５２～５４いずれか記載の方法。
  56. 化学療法剤による治療を受けている被験体において腫瘍細胞に対するCTX-CARγδT細胞の活性化を高める方法であって、該方法は、少なくとも2つのCLTXペプチドおよび生存因子を発現するようにγδT細胞を遺伝子工学で作り変える工程を含み、該生存因子は、ポリペプチドに対する耐性を付与するDNA、RNAまたはポリペプチドであり、該γδT細胞は、CLTX-CARおよび生存因子の発現を方向づける単一のベクターを含み、さらに：
    a. CLTX-CARが：
    i. 少なくとも2つのCLTXペプチドを含む細胞外抗原結合ドメイン、ここで少なくとも2つのCLTXペプチドはリンカーペプチドにより取り付けられる；
    ii. 膜貫通ドメイン；および
    iii. 膜貫通ドメインを細胞外抗原結合ドメインに取り付ける細胞外ヒンジドメイン；
    iv. 任意に、細胞内シグナル伝達ドメイン；および
    v. 任意に、共刺激性ドメイン
    を含む、方法。
  57. 生存因子が化学療法剤に対する耐性を付与するポリペプチドである、請求項４５記載の方法。
  58. 活性化がCD69活性化である、請求項４５および４６のいずれか記載の方法。
  59. CLTX-CARが2つのみのCLTXペプチドを含む、請求項５６記載の方法。
  60. 化学療法剤による治療を受けている被験体においてCLTX-CARγδT細胞の持続性を高める方法であって、該方法は、少なくとも2つのCLTXペプチドおよび生存因子を発現するようにγδT細胞を遺伝子工学で作り変える工程を含み、該生存因子はポリペプチドに対する耐性を付与するDNA、RNAまたはポリペプチドであり、該γδT細胞は、CLTX-CARおよび生存因子の発現を方向づける単一のベクターを含み、さらに：
    a. CLTX-CARが：
    i. 少なくとも2つのCLTXペプチドを含む細胞外抗原結合ドメイン、ここで少なくとも2つのCLTXペプチドはリンカーペプチドにより取り付けられる；
    ii. 膜貫通ドメイン；および
    iii. 膜貫通ドメインを細胞外抗原結合ドメインに取り付ける細胞外ヒンジドメイン；
    iv. 任意に、細胞内シグナル伝達ドメイン；および
    v. 任意に、共刺激性ドメイン
    を含む、方法。
  61. 生存因子が化学療法剤に対する耐性を付与するポリペプチドである、請求項６０記載の方法。
  62. CLTX-CARが2つのみのCLTXペプチドを含む、請求項６０記載の方法。
  63. CLTX-CARが細胞内シグナル伝達ドメインを含まない、請求項６０～６２いずれか記載の方法。
  64. 多価CLTX-CARをコードする核酸であって、該多価CLTX-CARが：
    i. 少なくとも2つのCLTXペプチドを含む細胞外抗原結合ドメイン、ここで少なくとも2つのCLTXペプチドがリンカーペプチドにより取り付けられる；
    ii. 膜貫通ドメイン；および
    iii. 膜貫通ドメインを細胞外抗原結合ドメインに取り付ける細胞外ヒンジドメイン；および
    iv. 任意に、細胞内シグナル伝達ドメイン；および
    v. 任意に、共刺激性ドメイン
    を含む、核酸。
  65. 核酸が生存因子をさらにコードし、生存因子が、化学療法薬に対する耐性を付与するDNA、RNAまたはポリペプチドである、請求項６４記載の核酸。
  66. 生存因子が、化学療法薬に対する耐性を付与するポリペプチドである、請求項６５記載の核酸。
  67. ポリペプチドが、アルキルグアニントランスフェラーゼ(AGT)、O6メチルグアニンDNAメチルトランスフェラーゼ(MGMT)、P140K MGMT、L22Y-DHFR、チミジル酸シンターゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、多剤耐性1タンパク質(MDR1)、5'ヌクレオチダーゼII、ジヒドロ葉酸レダクターゼおよびチミジル酸シンターゼからなる群より選択される、請求項６６記載の核酸。
  68. ポリペプチドがMGMTまたはP140K MGMTである、請求項６４記載の核酸。
  69. 膜貫通ドメインがCD28膜貫通ドメインを含む、請求項６４～６８いずれか記載の核酸。
  70. 細胞内シグナル伝達ドメインがCD3ゼータシグナル伝達ドメインを含む、請求項６４～６９いずれか記載の核酸。
  71. ヒンジドメインが、CD8、CD28、CD137またはそれらの組み合わせからなる群より選択されるタンパク質のヒンジ領域である、請求項６４～７０いずれか記載の核酸。
  72. ヒンジドメインがCD8のヒンジ領域を含む、請求項７１記載の核酸。
  73. 共刺激性ドメインが、CD28および4-1BB共刺激性ドメインの1つ以上である、請求項６４～７２いずれか記載の核酸。
  74. 細胞外ドメインが、細胞外シグナルペプチドをさらに含む、請求項６４～７３いずれか記載の核酸。
  75. シグナルペプチドが、CD8、CD28、GM-CSF、CD4、CD137またはそれらの組み合わせからなる群より選択されるタンパク質のシグナルペプチドである、請求項７４記載の核酸。
  76. シグナルペプチドがCD8aシグナルペプチドである、請求項７４記載の核酸。
  77. リンカーペプチドがc-mycである、請求項６４～７６いずれか記載の核酸。
  78. リンカーペプチドがFLAGである、請求項６４～７６いずれか記載の核酸。
  79. 細胞外が2つのみのCLTXペプチドを含む、請求項６４～７１いずれか記載の核酸。
  80. 細胞外が3つのみのCLTXペプチドを含む、請求項６４～７１いずれか記載の核酸。
  81. 細胞外が4つのみのCLTXペプチドを含む、請求項６４～７１いずれか記載の核酸。
  82. 細胞外ドメインが2つのCLTXペプチドを含み、化学療法剤に対する耐性を付与するポリペプチドがMGMTである、請求項６４記載の核酸。
  83. CTLX-CARが細胞内シグナル伝達ドメインを含まない、請求項６４および７９のいずれか記載の核酸。
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