KR20190092494A

KR20190092494A - 메티오날로부터의 l-메티오닌의 제조 방법

Info

Publication number: KR20190092494A
Application number: KR1020197019333A
Authority: KR
Inventors: 아르네 스켈라; 루카스 아이졸트
Original assignee: 에보닉 데구사 게엠베하
Priority date: 2016-12-05
Filing date: 2017-11-30
Publication date: 2019-08-07
Also published as: US20190338324A1; CN110036115A; EP3330380A1; WO2018104143A1; BR112019011512A2; EP3548628A1; US10920255B2; EP3548628B1

Abstract

본 발명은 단백질생성 작용성 L-아미노산, 예컨대 L-알라닌, L-발린, L-메티오닌, L-류신, L-이소류신 또는 L-페닐알라닌의 해당 알데히드 및 이산화탄소로부터의, 특히, 3-메틸티오-프로판알 ("메티오날") 및 이산화탄소로부터의 L-메티오닌의 생촉매 합성 방법에 관한 것이다.

Description

메티오날로부터의 L-메티오닌의 제조 방법

본 발명은 단백질생성 작용성 (proteinogenic) L-아미노산, 예컨대 L-알라닌, L-발린, L-메티오닌, L-류신, L-이소류신 또는 L-페닐알라닌의 해당 알데히드 및 이산화탄소, 뿐 아니라 아미노 공여자로부터의, 특히, 3-메틸티오-프로판알 ("메티오날") 및 이산화탄소, 뿐 아니라 아미노 공여자, 예컨대 암모니아로부터의 L-메티오닌의 생촉매 합성 방법에 관한 것이다.

α-아미노산은 통상적으로 스트레커 (Strecker) 아미노산 합성에 의해 합성되고, 이는 중간체로서 α-아미노 니트릴을 유도하는 암모니아 및 포타슘 시아니드와 알데히드의 처리를 수반한다. 니트릴의 산으로의 가수분해는 α-아미노산을 산출한다. 이러한 화학 합성은 D- 및 L-아미노산의 라세미 혼합물을 제공한다. 단백질생성 작용성 α-아미노산은 또한 바람직하게는 L-아미노산을 유도하는 미생물의 발효에 의해 생성될 수 있다.

아미노산 메티오닌은 현재 다량으로 전세계에서 산업적으로 제조되고 있고, 이는 상업적으로 상당히 중요하다. 메티오닌은 다양한 분야, 예컨대 약학, 건강 및 피트니스 제품에서, 특히 다양한 가축용 다수의 사료 중 첨가제로서 이용되고, 여기서 메티오닌의 라세미 및 거울상이성질체적으로 순수한 L-입체이성질체 둘 모두가 사용될 수 있다.

산업적 규모에서, 메티오닌은 부헤러-베르그 (Bucherer-Bergs) 반응을 통해 화학적으로 제조되고, 이는 스트레커 합성의 변형이다. 개시 물질, 3-메틸티오-프로판알 ("메티오날") 은 통상적으로 프로페날 (아크롤레인) 및 메탄티올 (메틸 메르캅탄) 로부터 제조된다. 메티오날, 시안화수소, 암모니아 및 이산화탄소는 반응하여 5-(2-메틸메르캅토에틸) 히단토인을 제공하고, 이는 이후 알칼리에 의해 가수분해되어 알칼리 금속 D,L-메티오네이트를 제공한다. D,L-메티오닌은 이후 산으로의 중화에 의해 유리화된다 (US 5,770,769). 그러나, 시안화수소를 사용하는 것에 대한 요구는 이러한 방법의 단점이다. 시안화수소의 높은 독성으로 인해, 반응의 안전에 대한 경비가 높아야 한다. 또 다른 큰 단점은 황산으로의 시안화수소의 정제에 의해 형성되는 많은 양의 암모늄 술페이트이다 (이의 메티오닌 히단토인 합성에서의 사용 전). 따라서, HCN 이 없는 메티오닌의 제조 방법에 대한 요구가 존재한다.

다양한 다른 방법이 또한 메티오닌을 제조하기 위해 사용될 수 있고, 예를 들어 아미드, 일산화탄소 및 전이 금속 카르보닐 촉매의 존재 하에서 메티오날의 아미도카르보닐화 (WO 2005/121068 A1, WO 2005/121079 A1), 메티오닌을 생성하는 미생물의 발효 또는 단백질의 가수분해가 사용될 수 있다.

상기 언급된 바, 화학적 합성에서, 예컨대 모든 다른 α-아미노산, 메티오닌은 통상적으로 D- 및 L-메티오닌의 라세미 혼합물로서 제조된다. 그러나, 약학 또는 의학 적용은 흔히 키랄 순수 L-아미노산, 특히 L-메티오닌을 요구한다. L-메티오닌은 D,L-라세메이트의 순수 거울상이성질체로의 전환 또는 적합한 미생물의 발효에 의해 생성될 수 있다. 그러나, 미생물에서 L-메티오닌의 완전 발효의 주요한 단점은 특히 메티오닌-생성 미생물에 대한 환원된 황 화합물 (예컨대, 메탄티올) 의 독성 효과로 인해 통상적으로 발효 배지에 술페이트 형태로 첨가되는, 메티오닌 분자로 도입될 황의 환원을 위해 다량의 영양분 및/또는 에너지가 요구된다는 점이다. 반면, 아스파르테이트에서 개시되는 L-메티오닌의 직접 합성은 1 ATP 및 2 NADPH 분자를 요구하고, 무기 술페이트로부터의 황의 도입은 부가적으로 2 ATP, 1 GTP 및 4 NADPH 분자를 소모한다. 따라서, 환원된 황 화합물 (예를 들어, 메탄티올) 이 L-메티오닌 합성을 위해 사용될 수 있는 경우, 에너지 균형이 크게 개선될 수 있다 (Wilke (2014) Appl. Microbiol. Biotechnol. 98, 9893-9914).

이러한 문제를 해결하기 위해, L-메티오닌의 2-단계 생명공학적 제조 방법이 Kim 등 (WO 2008/013432 A1) 에 의해 제안되었다. 제 1 단계에서, L-메티오닌 전구체, O-숙시닐-L-호모세린 또는 O-아세틸-L-호모세린이, 재조합 미생물에 의해 수득되고, 배양 브로쓰에 축적된다. 제 2 단계에서, L-메티오닌 전구체는 O-숙시닐-L-호모세린 술프히드릴라아제 활성 또는 O-아세틸-L-호모세린 술프히드릴라아제 활성을 갖는 단백질의 존재 하에서 메탄티올과 반응하여, L-메티오닌 및 상응하는 카르복실산, 즉 아세테이트 또는 숙시네이트를 제공한다. 그러나, 이러한 효소 반응에서, 등몰량의 아세테이트 또는 숙시네이트가 L-메티오닌에 더불어 형성된다. 예를 들어, L-메티오닌 전구체로서 O-아세틸-L-호모세린을 선택하는 경우, 이는 반응 과정, 특히 산업적 규모의 반응 과정에서 높은 아세테이트 농도를 유도한다. 그러나, 아세테이트는 수용가능한 노력으로 L-메티오닌 생성물로부터 완전히 제거될 수 없다. 따라서, Hong 등 (WO 2012/091479 A2) 은 L-메티오닌 생성물로부터 L-메티오닌 제조 방법의 제 2 단계에서 생성된 비교적 다량의 아세테이트를 재사용하고 제거하기 위한 다수의 방법을 제안하였다.

탄소 사슬 연장을 위한 C1 빌딩 블록으로서 이산화탄소를 사용하는 여러 시도가 착수되어 왔다. Miyazaki 등 (Chem. Commun., 2001, 1800-1801) 은, 피루베이트 데카르복실라아제 및 C1 빌딩 블록으로서 이산화탄소의 존재 하에서 역효소 반응을 사용하여 아세트알데히드로부터 피루브산을 성공적으로 합성하는 것을 보고하였다. 반응은 데카르복실화의 반대 방향으로 평형을 옮기기 위해, 매우 과량의 이산화탄소를 요구한다. 아세트알데히드 및 피루브산을 통한 L-락테이트의 제조를 위해, 이산화탄소 및 에탄올을 사용하는 보조인자 재생 사이클을 비롯한 다중효소 촉매 시스템이 Tong 등 (Biotechnol. Bioeng. (2011) 108, 465-469) 에 의해 제안되었다.

Wichmann 등 (Biotechnol. Bioeng. (1981) 23, 2789-2802) 은 NADH 재생을 위해 포르메이트 및 포르메이트 데히드로게나아제를 사용하는 생촉매 NADH 재생 시스템, L-류신 데히드로게나아제 (LeuDH), NADH-의존성 효소에 의해 촉매화된 L-류신으로의 2-옥소-4-메틸펜탄산 (α-케토이소카프로에이트) 의 환원성 아민화를 제안하였다.

본 발명의 목적은, C1 빌딩 블록으로서 시아니드 대신 이산화탄소를 사용하고, 이에 따라 다량의 암모늄 술페이트의 형성을 회피하고, 거울상이성질체적으로 순수한 L-아미노산을 직접 유도하는, L-아미노산, 예컨대 L-알라닌, L-발린, L-메티오닌, L-류신, L-이소류신 및 L-페닐알라닌의 제조 방법을 제공하는 것이다.

이러한 목적은 알데히드, 이산화탄소, 데카르복실라아제, 이의 상응하는 보조인자를 포함하는 혼합물 및 (a) 하나 이상의 공여자 아미노산 및 아미노트랜스페라아제 및/또는 (b) NADH, 암모니아 및/또는 암모늄 염 및 아미노산 데히드로게나아제를 반응시켜 L-아미노산 또는 이의 염을 형성하는 단계를 포함하는, L-아미노산의 제조 방법에 의해 달성된다.

본 발명에 따른 방법으로 L-아미노산의 개시 알데히드로부터 합성될 수 있는 바람직한 L-아미노산은 에탄알 (아세트알데히드) 로부터의 L-알라닌, 2-메틸 프로판알로부터의 L-발린, 3-(메틸티오) 프로판알 (메티오날) 로부터의 L-메티오닌, 3-메틸 부탄알로부터의 L-류신, 2-메틸 부탄알로부터의 L-이소류신 및 2-페닐 에탄알 (페닐 아세트알데히드) 로부터의 L-페닐알라닌이다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 목적은 3-(메틸티오)-프로판알 (메티오날), 이산화탄소, 데카르복실라아제, 이의 상응하는 보조인자의 혼합물 및 (a) 하나 이상의 공여자 아미노산 및 아미노트랜스페라아제 및/또는 (b) NADH, 암모니아 및/또는 암모늄 염 및 아미노산 데히드로게나아제를 반응시켜 L-메티오닌 또는 이의 염을 형성하는 단계를 포함하는, L-메티오닌 (L-Met) 의 제조 방법에 의해 달성된다.

이론에 의해 구속되지 않으면서, 먼저, 혼합물 중 데카르복실라아제가 이의 역반응, 즉 알데히드, 예를 들어 메티오날의 이산화탄소 (CO₂) 와의 카르복실화 (이는 중간체 α-케토산 (2-옥소산), 예를 들어 4-메틸티오-2-옥소부탄산 (MTOB) 를 유도함) 를 촉매화한다고 인식된다. 이후, α-케토산 (예를 들어, 2-MTOB) 의 α-카르보닐 기는, L-아미노산, 예컨대 L-메티오닌을 산출하기 위해, 아미노트랜스페라아제에 의해 촉매화되는 입체특이성 반응에서 아미노 기에 의해 교환된다 (도 1A). 이러한 반응은 공여자 아미노산 (예를 들어, L-글루타민) 의 존재를 요구하고, 이는 그 자체로 해당 α-케토산으로 전환된다. 대안적으로, 상기 L-아미노산의 α-케토산의 전환 (예를 들어, MTOB 에서 L-메티오닌) 은, 아미노 공여자로서 NH₃ 를 갖는 NADH 의 소모 하에서, α-케토산, 예를 들어 MTOB 의 환원성 아민화를 촉매화하는 아미노산 데히드로게나아제 (예를 들어, LeuDH 또는 페닐알라닌 데히드로게나아제, PheDH) 에 의해 달성될 수 있다 (도 1B).

데카르복실라아제의 보조인자는 티아민 피로포스페이트를 포함한다. CO₂ 와 메티오날의 카르복실화를 촉매화하는 적합한 데카르복실라아제는, 예를 들어 사카로마이세스 세레비시아에 (Saccharomyces cerevisiae) 유래 피루베이트 데카르복실라아제 PDC1, 사카로마이세스 세레비시아에 유래 페닐피루베이트 데카르복실라아제 ARO10, 및 락토코쿠스 락티스 (Lactococcus lactis) 유래 분지쇄 데카르복실라아제 KdcA, 뿐 아니라 데카르복실라아제 활성을 갖는 이러한 데카르복실라아제의 돌연변이 및 변이체이다 (표 1). 이산화탄소는 바람직하게는 10 내지 7400 kPa (0.1 내지 74 bar), 바람직하게는 100 내지 1000 kPa (1 내지 10 bar), 보다 바람직하게는 200 내지 800 kPa (2 내지 8 bar) 의 압력에서 반응 혼합물에 적용된다.

본 발명에 따른 방법, 예를 들어 공여자 아미노산으로부터의 아미노 기의 MTOB 의 α-카르보닐 기로의 이동의 변이체 (a) 로 특히 적합한 아미노트랜스페라아제는 예를 들어 E. 콜라이 (E. coli) 유래 메티오닌 아미노트랜스페라아제 YbdL, 및 사카로마이세스 세레비시아에 유래 방향족 아미노트랜스페라아제 Aro8, 뿐 아니라 아미노트랜스페라아제 활성을 갖는 이러한 아미노트랜스페라아제의 돌연변이 및 변이체이다 (표 1). 바람직하게는, 공여자 아미노산은 형성될 L-아미노산과 상이하다. 본 발명에 따른 방법의 이러한 변이체로 바람직한 공여자 아미노산은 L-글루타민, L-글루타메이트, L-알라닌, L-페닐알라닌, L-티로신, L-류신, L-이소류신, L-히스티딘 및 L-트립토판으로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 L-아미노산이다.

본 발명에 따른 방법, 예를 들어 NADH 및 NH₃ 의 소모 하에서 메티오날로부터 형성된 MTOB 의 환원성 아민화의 변이체 (b) 로 특히 적합한 아미노산 데히드로게나아제는, 예를 들어 바실루스 스파에리쿠스 (Bacillus sphaericus) 유래 류신 데히드로게나아제 LeuDH, 및 테르모액티노마이세스 인테르메디우스 (Thermoactinomyces intermedius) 유래 페닐알라닌 데히드로게나아제 PheDH, 뿐 아니라 아미노산 데히드로게나아제 활성을 갖는 이러한 아미노산 데히드로게나아제의 돌연변이 및 변이체이다 (표 1).

표 1: 메티오날로부터 L-메티오닌의 합성에 적합한 효소.

이론에 구속되지 않으면서, 데카르복실라아제 (예를 들어, ARO10 또는 KdcA) 및 아미노산 데히드로게나아제 (예를 들어, LeuDH 또는 PheDH) 에 의해 촉매화된, 알데히드로부터의 L-아미노산, 예컨대 메티오날로부터의 L-메티오닌의 2-단계 효소 합성 중, 공동기질 NADH 가 α-케토산, 예를 들어, MTOB 의 α-카르보닐 기의 환원을 위해 데히드로게나아제에 의해 소모된다.

제자리에서 NADH 의 산화된 형태 NAD⁺ 로부터 NADH 를 재순환시키기 위해, 포르메이트 데히드로게나아제 (예를 들어, CboFDH(C23A/F285S)) 가 이용될 수 있다 (도 1C). 이러한 효소는 CO₂ 를 산출하기 위해 NAD⁺ 로 포르메이트를 산화시키고, 이는 또한 알데히드, 예를 들어 메티오날의 카르복실화 반응에 대한 기질, 뿐 아니라 공동기질 NADH 로 작용할 수 있다 (Schutte 등. (1976) Eur. J. Biochem. 62, 151-160; Wichmann 등. (1981) Biotechnol. Bioeng. 23, 2789-2802).

따라서, 본 발명에 따른 방법의 특정 구현예에서, 알데히드, 이산화탄소, 데카르복실라아제, 이의 상응하는 보조인자를 포함하는 반응 혼합물 및 NADH, 암모니아 및/또는 암모늄 염 및 아미노산 데히드로게나아제 및, 임의로, 하나 이상의 공여자 아미노산 및 아미노트랜스페라아제는 추가로 포름산 또는 이의 염 및 포르메이트 데히드로게나아제를 포함한다.

NADH 재생은, 포르메이트 소모 및 CO₂ 방출 하에서, 예를 들어 슈도모나스 종 (Pseudomonas sp.) 101 유래 포르메이트 데히드로게나아제, 예컨대 PseFDH (Egorov 등. (1979) Eur. J. Biochem. 99, 569-576) 또는 칸디다 보이디니 (Candida boidinii) 유래 포르메이트 데히드로게나아제 (CboFDH; O13437; Schutte 등. (1976) Eur. J. Biochem. 62, 151-160) 또는 이의 돌연변이 CboFDH (C23A/F285S) 에 의해 달성될 수 있다.

따라서, 본 발명에 따른 방법의 바람직한 구현예에서, 포르메이트 데히드로게나아제는 슈도모나스 종 또는 칸디다 종에서 유래할 뿐 아니라 포르메이트 데히드로게나아제 활성을 갖는 이러한 포르메이트 데히드로게나아제의 돌연변이 및 변이체로부터 유래한다.

도 1a: 데카르복실라아제 및 아미노트랜스페라아제를 수반하는 3-(메틸티오)프로판알 (메티오날) 로부터의 L-메티오닌의 2-단계 생촉매 합성에 대한 반응식.
도 1b: 데카르복실라아제 및 아미노산 데히드로게나아제를 수반하는 3-(메틸티오)프로판알 (메티오날) 로부터의 L-메티오닌의 2-단계 생촉매 합성에 대한 반응식.
도 1c: 생촉매 NADH 재생 시스템의 존재 하에서 3-(메틸티오)프로판알 (메티오날) 로부터의 L-메티오닌의 2-단계 생촉매 합성에 대한 반응식.
도 2a: HPLC 분석학을 사용한 반응 생성물 L-메티오닌의 검출. L-메티오닌의 생성은, 1 % v/v 인산으로 보충된 4 % (v/v) 수성 아세토니트릴 중 등용매 용리 및 C18 컬럼 (Gemini C18, 4.6×15 ㎜, 3 ㎛, 110 Å) 을 사용하여, HPLC 분석학을 통해 실시예 4 로부터의 5 μL 샘플에서 확인되었다. 메티오날 및 L-메티오닌을 210 ㎚ 에서 이의 흡광에 따라 검출하였다. 5 μM KdcA, 5 μM YbdL, 4 mM 메티오날, 50 mM L-글루타민의 존재 하에서, 105 min 동안 2 bar (200 kPa) CO₂ 하에서 L-메티오닌 합성. 점선 기록은 정의된 농도에 의한 L-메티오닌 표준물에 상응한다. 체류 시간의 약간의 변동은 반복된 크로마토그래피 수행 사이의 전형적인 실험 오류에 상응한다.
도 2b: (a) 와 동일하지만, 각각 KdcA, YbdL 또는 메티오날을 생략한 조건 하에서의 대조 반응.
도 2c: 하기의 상승하는 KdcA 농도를 사용하여, 반응 조건의 최적화 후, (a) 에 나타난 바와 같은, 3 % 로부터 12.5 % 까지의 L-메티오닌 수율의 증가: 5 또는 10 또는 20 μM KdcA, 5 μM YbdL, 4 mM 메티오날, 50 mM L-글루타민; 105 min 동안 2 bar (200 kPa) CO₂ 하에서 반응.
도 3a: HPLC 분석학을 사용한 반응 생성물 L-메티오닌의 검출. L-메티오닌의 생성은 1 % v/v 인산으로 보충된 4 % (v/v) 수성 아세토니트릴 중 등용매 용리 및 C18 컬럼 (Gemini C18, 4.6×15 mm, 3 ㎛, 110 Å) 을 사용하여, HPLC 분석학을 통해 실시예 5 로부터의 5 μL 샘플에서 확인되었다. 메티오날 및 L-메티오닌을 210 ㎚ 에서 이의 흡광에 따라 검출하였다. 10 μM KdcA, 5 μM LeuDH, 4 mM 메티오날, 4 mM NADH 의 존재 하에서, 45 min 동안 2 bar (200 kPa) CO₂ 하에서 L-메티오닌 합성.
도 3b: (a) 와 동일하지만, 각각 KdcA, LeuDH, 메티오날 또는 NADH 를 생략한 조건 하에서의 대조 반응.
도 3c: 2 배 LeuDH 농도를 사용하여, (a) 에 나타난 바와 같은, 1.5 % 로부터 3 % 까지의 L-메티오닌 수율의 증가: 45 min 동안 2 bar (200 kPa) CO₂ 하에서 반응.

실시예

실시예 1: E. 콜라이에서 데카르복실라아제의 생성

사카로마이세스 세레비시아에 유래 피루베이트 데카르복실라아제 (Pdc1; SEQ ID NO: 1; P06169; Killenberg-Jabs 등. (1997) Biochemistry 36, 1900-1905) 및 페닐피루베이트 데카르복실라아제 (Aro10; SEQ ID NO: 3; Q06408; Kneen 등. (2011) FEBS J. 278, 1842-1853) 에 대한 유전자, 뿐 아니라 락토코쿠스 락티스 유래 분지쇄 데카르복실라아제 (KdcA) (SEQ ID NO: 5; Q6QBS4; Yep 등. (2006) Bioorg. Chem. 34, 325-336) 에 대한 유전자를, E. 콜라이에서 발현을 위한 최적의 코돈을 사용하여 합성한 후, 제한 효소 NdeI 및 XhoI 를 사용하여 발현 벡터 pET21 (Novagen, Madison, WI) 상에서 클로닝하였다. 또한, 각 효소에 대한 카르복시-말단 His₆-태그를 인코딩하는, 3 개의 수득된 발현 플라스미드 pET21-Pdc1, pET21-Aro10 및 pET21-KdcA 각각을 클로닝된 구조 유전자의 DNA 시퀀싱에 의해 확인하였다 (Eurofins Genomics, Ebersberg, Germany).

이러한 발현 플라스미드로의, CaCl₂-방법에 따른 (Sambrook 등. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press) E. 콜라이 BL21 세포의 화학적 형질전환 후 (Studier and Moffatt (1986) J. Mol. Biol. 189, 113-130), T7 프로모터의 제어 하에서 효소 Pdc1, Aro10 및 KdcA 를 개별 제조하였다 (Studier and Moffatt, ibid.). 이를 위해, 0.3-0.4 의 OD₅₅₀ 이 달성될 때까지 셰이킹하면서 30℃ 에서, 100 ㎍/㎖ 암피실린으로 보충된 LB 배지 중 2 리터 배양물에서 형질전환된 박테리아를 성장시켰다. 22℃ 로 45-60 min 동안 온도를 낮춘 후, 0.01 mM 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노시드 (IPTG) 의 첨가에 의해 OD₅₅₀ = 0.6-0.8 에서 5 h 동안 22℃ 에서 재조합 유전자 발현을 유도하였다. 마지막으로, 원심분리 (10 min, 6000 rpm, 4℃) 에 의해 박테리아를 채취하고, 세포 페이스트를 -20℃ 에서 동결시켰다.

부동화된 금속 이온 친화성 크로마토그래피 (IMAC, immobilized metal ion affinity chromatography) 이후 크기 배제 크로마토그래피 (SEC) 를 포함하는 2-단계 전략을 사용하여 모든 데카르복실라아제를 정제하였다. 따라서, 3 ㎖ 300 mM NaCl, 1 mM MgSO₄, 0.1 mM 티아민 피로포스페이트 (ThDP), 20 mM PIPES/NaOH pH 7.0/1g 웨트 (wet) 중량에서 세포를 재현탁시킨 후, 프렌치 압력 셀 (French pressure cell) (SLM Aminco, Rochester, NY) 을 사용하여 기계 분쇄하였다. 균질 현탁액을 원심분리 (30 min, 18000 rpm, 4℃) 하고, 러닝 완충액으로서 300 mM NaCl, 1 mM MgSO₄, 0.1 mM ThDP, 20 mM PIPES/NaOH pH 7.0 을 사용하여, Ni(II) 이온이 채워진 5 ㎖ 베드 용적 HisTrap HP 컬럼 (GE Healthcare, Munich, Germany) 에 완전 상청액을 가하였다. 결합된 데카르복실라아제를 러닝 완충액 중 0 내지 500 mM 이미다졸/HCl 의 선형 농도 구배에 의해 용리하였다. 데카르복실라아제 함유 메인 분획을 쿠마시-염색된 SDS-PAGE 로 확인하고, 30 kDa 의 공칭 분자량 한계 (nominal molecular weight limit, NMWL) 를 갖는 원심분리 필터 유닛 (Merck, Darmstadt, Germany) 을 사용하여 2-2.5 ㎖ 의 최종 용적으로 농축시켰다. 500 mM NaCl, 1 mM MgSO₄, 0.5 mM ThDP, 20 mM PIPES/NaOH pH 7.0 의 존재 하에서, 120 ㎖ 베드 용적 HiLoad Superdex 200 16/60 컬럼 (GE Healthcare) 을 사용하여 SEC 를 통해 농축된 샘플을 추가 정제하였다.

그 결과, 모든 3 개의 데카르복실라아제는 쿠마시-염색된 SDS-PAGE 분석에 의해 확인된 바와 같이 >90% 순도로 수득되었다. 수율은 각각 Pdc1, Aro10 및 KdcA 에 대한 배양액 용적 1 리터 당 대략 50 mg, 10 mg 및 30 mg 이었다.

실시예 2: E. 콜라이에서 아미노트랜스페라아제의 생성

E. 콜라이 유래 메티오닌 아미노트랜스페라아제 (YbdL) (SEQ ID NO: 7; P77806; Dolzan 등. (2004) FEBS Lett. 571, 141-146) 에 대한 유전자를 적합한 프라이머를 사용하여 E. 콜라이 K12 MG1655 로부터 증폭시키고, 제한 효소 KasI 및 HindIII 를 사용하여 발현 벡터 pASK-IBA35(+) (IBA, Gottingen, Germany) 상에서 클로닝하였다. 또한, YbdL 에 대한 아미노-말단 His₆-태그를 인코딩하는, 수득된 발현 플라스미드 pASK-IBA35(+)-YbdL 을 클로닝된 구조 유전자의 DNA 시퀀싱에 의해 확인하였다 (Eurofins Genomics).

사카로마이세스 세레비시아에 유래 방향족 아미노트랜스페라아제 (Aro8) (SEQ ID NO: 9; P53090; Bulfer 등. (2013) Protein Sci. 22, 1417-1424) 에 대한 유전자를 E. 콜라이 (Geneart) 에서 발현을 위한 최적의 코돈을 사용하여 합성하고, 제한 효소 KasI 및 HindIII 를 사용하여 발현 벡터 pASK-IBA35(+) 상에서 클로닝하였다. 또한, Aro8 에 대한 아미노-말단 His₆-태그를 인코딩하는, 수득된 발현 플라스미드 pASK-IBA35(+)-Aro8 을 클로닝된 구조 유전자의 DNA 시퀀싱에 의해 확인하였다 (Eurofins Genomics).

tet 프로모터의 제어 하 E. 콜라이 BL21 에서 두 효소, YbdL 및 Aro8 을 생성하였다 (Skerra (1994) Gene 151, 131-135). 따라서, E. 콜라이 BL21 세포를 상응하는 발현 플라스미드로 CaCl₂-방법 (Sambrook 등, ibid.) 에 따라 형질전환시킨 후, OD₅₅₀ = 0.3-0.4 이 도달될 때까지 셰이킹하면서 30℃ 에서 100 ㎍/㎖ 암피실린을 보충한 2 리터 LB 배지에서 성장시켰다. 이후, 온도를 22℃ 로 45-60 min 동안 감소시키고, 재조합 유전자 발현을 0.2 mg/l 안히드로테트라시클린 (aTc; Acros, Geel, Belgium) 으로 유도하였다. 22℃ 에서 5 h 후, 박테리아를 원심분리 (10 min, 6000 rpm, 4℃) 에 의해 채취하고, -20℃ 에서 동결시켰다.

아미노트랜스페라아제를 정제하기 위해, 3 ㎖ 500 mM NaCl, 40 mM Tris/HCl pH 7.4/1 g 웨트 중량에서 각각의 재조합 단백질을 함유하는 세포를 재현탁시켰다. 이후, 박테리아를 프렌치 압력 셀에서 기계 분쇄하였다. 균질 현탁액을 원심분리 (30 min, 18000 rpm, 4℃) 하고, 러닝 완충액으로서 500 mM NaCl, 40 mM Tris/HCl pH 7.4 을 사용하여, Ni(II) 이온이 채워진 5 ㎖ 베드 용적 HisTrap HP 컬럼 (GE Healthcare) 에 전체 상청액을 가하였다. 결합된 아미노트랜스페라아제를 러닝 완충액 중 0 내지 500 mM 이미다졸/HCl 의 선형 농도 구배에 의해 용리하였다. 아미노트랜스페라아제 함유 메인 분획을 쿠마시-염색된 SDS-PAGE 로 확인하고, 30 kDa 의 NMWL 을 갖는 원심분리 필터 유닛을 사용하여 4-5 ㎖ 의 최종 용적으로 농축시켰다. 제 2 단계에서, 500 mM NaCl, 20 mM Tris/HCl pH 7.4 의 존재 하에서, 320 ㎖ 베드 용적 HiLoad Superdex 200 26/60 컬럼을 사용하여 SEC 를 통해 농축된 샘플을 정제하였다.

두 아미노트랜스페라아제는 YbdL 에 대해 18 mg/l 및 Aro8 에 대해 47 mg/l 의 수율로, SDS-PAGE 분석에 의해 확인된 바와 같이 >90% 순도로 수득되었다.

실시예 3: E. 콜라이에서 아미노산 데히드로게나아제의 생성

바실루스 스파에리쿠스 유래 류신 데히드로게나아제 (LeuDH; SEQ ID NO: 11; Li 등. (2009) Appl. Biochem. Biotechnol. 158, 343-351) 에 대한 유전자 및 테르모액티노마이세스 인테르메디우스 유래 페닐알라닌 데히드로게나아제 (PheDH; SEQ ID NO: 13; P22823; Takada 등. (1991) J. Biochem. 109, 371-376) 에 대한 유전자를, E. 콜라이 (Geneart) 에서 발현을 위한 최적의 코돈을 사용하여 합성하고, 제한 효소 KasI 및 HindIII 를 사용하여 발현 벡터 pASK-IBA35(+) 상에서 클로닝하였다. 또한, 아미노-말단 His₆-태그를 인코딩하는, 수득된 발현 플라스미드 pASK-IBA35(+)-LeuDH 및 pASK-IBA35(+)-PheDH 각각을 클로닝된 구조 유전자의 DNA 시퀀싱에 의해 확인하였다 (Eurofins Genomics).

aTc 로의 유도 후, 5 h 동안 30℃ 에서 (22℃ 대신) 배양물을 인큐베이팅한 것을 제외하고, 본원에서 실시예 2 에 전술된 아미노트랜스페라아제와 동일한 조건 하에서, LeuDH 뿐 아니라 PheDH 를 E. 콜라이 BL21 에서 생성하였다.

두 아미노산 데히드로게나아제의 정제를 위해, 3 ㎖ 100 mM NaCl, 50 mM Tris/HCl pH 8.0/1 g 웨트 세포 매스에서 박테리아 페이스트를 재현탁시키고, 프렌치 압력 셀을 사용하여 기계 분쇄하였다. 원심분리 (30 min, 18000 rpm, 4℃) 후, 러닝 완충액으로서 100 mM NaCl, 50 mM Tris/HCl pH 8.0 을 사용하는, Ni(II) 이온이 채워진 5 ㎖ 베드 용적 HisTrap HP 컬럼 (GE Healthcare) 에 상청액을 가하였다. 결합된 아미노산 데히드로게나아제를 러닝 완충액 중 0 내지 500 mM 이미다졸/HCl 의 선형 농도 구배에 의해 용리하였다. 아미노산 데히드로게나아제 함유 메인 분획을 쿠마시-염색된 SDS-PAGE 로 확인하고, 30 kDa 의 NMWL 을 갖는 원심분리 필터 유닛 (Merck) 을 사용하여 4-5 ㎖ 의 최종 용적으로 농축시켰다. 제 2 단계에서, 300 mM NaCl, 20 mM Tris/HCl pH 8.0 의 존재 하에서, 320 ㎖ 베드 용적 HiLoad Superdex 200 26/60 컬럼을 사용하여 SEC 를 통해 농축된 샘플을 정제하였다.

LeuDH 및 PheDH 는 각각 7.5 mg/l 및 19 mg/l 의 수율로 수득되었다. >95 % 의 높은 순도가 쿠마시-염색된 SDS-PAGE 분석에 의해 확인되었다.

실시예 4: 데카르복실라아제 및 아미노트랜스페라아제를 수반하는 2-단계 생촉매 반응에 의한 3-(메틸티오)프로판알 (메티오날) 로부터의 L-메티오닌의 합성.

2-단계 생촉매 반응에서 L-메티오닌을 합성하기 위해 (도. 1A), 정제된 데카르복실라아제 KdcA 및 아미노트랜스페라아제 YbdL 을 최종 용적 1 ㎖ 로 10 ㎖ 압력 반응기 (타이니클레이브 스틸 (Tinyclave steel); Buchi, Uster, Switzerland) 에서 하기 시약과 혼합하였다:

기질 메티오날의 첨가 및 2 bar (200 kPa) CO₂ 의 적용에 의해 반응을 개시하였다. 혼합물의 초기 pH 는 8 이었고, CO₂ 적용시 이는 약 6.5 로 변경되었다 (불변색 pH 지시 스틱; Carl Roth, Karlsruhe, Germany 로 측정됨). 인큐베이션 1 h 후, 혼합물을 반응기로부터 수집하고, 벤치 탑 원심분리기에서 5 min 동안 13400 rpm 에서 원심분리하여 침전된 단백질을 제거하였다. 투명 상청액을 사용하여, 1% (v/v) 인산으로 보충된 4 % (v/v) 수성 아세토니트릴 중 등용매 용리와, C18 컬럼 (Gemini C18, 4.6×15 ㎜, 3 ㎛, 110 Å; Phenomenex, Aschaffenburg, Germany) 을 사용하는 HPLC 에 의해 생성물 형성을 분석하였다.

KdcA, YbdL 또는 메티오날 각각을 생략한 대조 반응에 비해 (도. 2B), 데카르복실라아제 (예를 들어, KdcA) 및 아미노트랜스페라아제 (예를 들어, YbdL) 뿐 아니라 공여자 아미노산 (예를 들어, L-글루타민) 의 존재 하의 2-단계 생촉매 합성의 크로마토그램은, L-메티오닌이 메티오날로부터 생성되었다는 것을 명백히 입증하였다 (도. 2A). 데카르복실라아제의 농도를 20 μM 로 증가시킴으로써, L-메티오닌 수율은 3 % 에서 12.5 % 로 개선되었다 (도. 2C).

실시예 5: 데카르복실라아제 및 아미노산 데히드로게나아제를 수반하는 2-단계 생촉매 반응에 의한 메티오날로부터의 L-메티오닌의 합성.

아미노 공여자 공동기질에 대한 필요 없이 2-단계 생촉매 반응에서 L-메티오닌을 합성하기 위해 (도. 1B), 정제된 데카르복실라아제 KdcA 및 아미노산 데히드로게나아제 LeuDH 를 최종 용적 1 ㎖ 로 10 ㎖ 압력 반응기 (타이니클레이브 스틸) 에서 하기 시약과 혼합하였다:

실시예 4 에서와 같이, 메티오날의 첨가 및 2 bar (200 kPa) CO₂ 의 적용에 의해 반응을 개시하였다. 혼합물의 초기 pH 는 8 이었고, CO₂ 적용시 이는 약 7 로 변경되었다 (불변색 pH 지시 스틱으로 측정됨). 인큐베이션 45 min 후, 혼합물을 반응기로부터 회수하고, 실시예 4 에 기재된 바와 같이 HPLC 를 사용하여 분석하였다.

데카르복실라아제 (예를 들어, KdcA), 아미노산 데히드로게나아제 (예를 들어, LeuDH) 또는 NADH 각각을 생략한 대조 반응에 비해 (도. 3B), 데카르복실라아제 (예를 들어, KdcA) 및 아미노산 데히드로게나아제 (예를 들어, LeuDH) 뿐 아니라 NADH 및 암모늄 염의 존재 하의 2-단계 생촉매 합성의 크로마토그램은, L-메티오닌이 메티오날로부터 생성되었다는 것을 명백히 입증하였다 (도. 3A). 아미노산 데히드로게나아제의 농도를 10 μM 로 2 배함으로써, L-메티오닌 수율이 1.5 % 에서 3 % 로 개선되었다 (도. 3C).

SEQUENCE LISTING <110> Evonik Degussa GmbH <120> Method for producing L-amino acids <130> 201600130 <160> 14 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1719 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <220> <221> misc_feature <222> (1)..(6) <223> NdeI restriction site <220> <221> CDS <222> (4)..(1719) <223> sequence of PDC1 of Sacharomyces cerevisiae optimized for the codon usage of Escherichia coli with a carboxy-terminal His6-tag <220> <221> misc_feature <222> (1693)..(1698) <223> XhoI restriction site <400> 1 cat atg agc gaa att acc ctg ggc aaa tac ctg ttt gaa cgc ctg aaa 48 Met Ser Glu Ile Thr Leu Gly Lys Tyr Leu Phe Glu Arg Leu Lys 1 5 10 15 cag gtt aat gtg aat acc gtt ttt ggt ctg cct ggc gat ttt aat ctg 96 Gln Val Asn Val Asn Thr Val Phe Gly Leu Pro Gly Asp Phe Asn Leu 20 25 30 agc ctg ctg gat aaa atc tat gaa gtt gaa ggt atg cgt tgg gca ggt 144 Ser Leu Leu Asp Lys Ile Tyr Glu Val Glu Gly Met Arg Trp Ala Gly 35 40 45 aat gca aat gaa ctg aat gca gcc tat gca gca gat ggt tat gca cgt 192 Asn Ala Asn Glu Leu Asn Ala Ala Tyr Ala Ala Asp Gly Tyr Ala Arg 50 55 60 att aaa ggt atg agc tgc att att acc acc ttt ggt gtt ggt gaa ctg 240 Ile Lys Gly Met Ser Cys Ile Ile Thr Thr Phe Gly Val Gly Glu Leu 65 70 75 agc gca ctg aat ggt att gca ggt agc tat gca gaa cat gtt ggt gtg 288 Ser Ala Leu Asn Gly Ile Ala Gly Ser Tyr Ala Glu His Val Gly Val 80 85 90 95 ctg cat gtt gtt ggt gtt ccg agc att agc gca cag gca aaa cag ctg 336 Leu His Val Val Gly Val Pro Ser Ile Ser Ala Gln Ala Lys Gln Leu 100 105 110 ctg ctg cat cat acc ctg ggt aat ggt gat ttt acc gtg ttt cat cgt 384 Leu Leu His His Thr Leu Gly Asn Gly Asp Phe Thr Val Phe His Arg 115 120 125 atg agc gca aat att agc gaa acc acc gca atg att acc gat att gca 432 Met Ser Ala Asn Ile Ser Glu Thr Thr Ala Met Ile Thr Asp Ile Ala 130 135 140 acc gca ccg gca gaa att gat cgt tgt att cgt acc acc tat gtt acc 480 Thr Ala Pro Ala Glu Ile Asp Arg Cys Ile Arg Thr Thr Tyr Val Thr 145 150 155 cag cgt ccg gtt tat ctg ggt ctg cca gca aat ctg gtt gat ctg aat 528 Gln Arg Pro Val Tyr Leu Gly Leu Pro Ala Asn Leu Val Asp Leu Asn 160 165 170 175 gtt ccg gct aaa ctg ctg caa acc ccg att gat atg agc ctg aaa ccg 576 Val Pro Ala Lys Leu Leu Gln Thr Pro Ile Asp Met Ser Leu Lys Pro 180 185 190 aat gat gca gaa agc gaa aaa gaa gtg att gat acc att ctg gcc ctg 624 Asn Asp Ala Glu Ser Glu Lys Glu Val Ile Asp Thr Ile Leu Ala Leu 195 200 205 gtt aaa gat gca aaa aat ccg gtt att ctg gca gat gcc tgt tgt agc 672 Val Lys Asp Ala Lys Asn Pro Val Ile Leu Ala Asp Ala Cys Cys Ser 210 215 220 cgt cat gat gtt aaa gca gaa acc aaa aaa ctg atc gac ctg acc cag 720 Arg His Asp Val Lys Ala Glu Thr Lys Lys Leu Ile Asp Leu Thr Gln 225 230 235 ttt ccg gca ttt gtt acc ccg atg ggt aaa ggt agc att gat gaa cag 768 Phe Pro Ala Phe Val Thr Pro Met Gly Lys Gly Ser Ile Asp Glu Gln 240 245 250 255 cat ccg cgt tat ggt ggt gtt tat gtt ggc acc ctg agc aaa ccg gaa 816 His Pro Arg Tyr Gly Gly Val Tyr Val Gly Thr Leu Ser Lys Pro Glu 260 265 270 gtt aaa gaa gca gtt gaa agc gca gat ctg att ctg agc gtt ggt gca 864 Val Lys Glu Ala Val Glu Ser Ala Asp Leu Ile Leu Ser Val Gly Ala 275 280 285 ctg ctg agt gat ttt aac acc ggt agc ttt tcg tat agc tac aaa acg 912 Leu Leu Ser Asp Phe Asn Thr Gly Ser Phe Ser Tyr Ser Tyr Lys Thr 290 295 300 aaa aac atc gtc gag ttt cat agc gat cac atg aaa att cgt aat gca 960 Lys Asn Ile Val Glu Phe His Ser Asp His Met Lys Ile Arg Asn Ala 305 310 315 acc ttt ccg ggt gtg cag atg aaa ttt gtt ctg caa aaa ctg ctg acc 1008 Thr Phe Pro Gly Val Gln Met Lys Phe Val Leu Gln Lys Leu Leu Thr 320 325 330 335 acc att gca gat gca gca aaa ggt tat aaa ccg gtt gca gtt ccg gca 1056 Thr Ile Ala Asp Ala Ala Lys Gly Tyr Lys Pro Val Ala Val Pro Ala 340 345 350 cgt aca ccg gca aat gca gcc gtt ccg gca tca aca ccg ctg aaa caa 1104 Arg Thr Pro Ala Asn Ala Ala Val Pro Ala Ser Thr Pro Leu Lys Gln 355 360 365 gaa tgg atg tgg aat cag ctg ggt aat ttt ctg caa gag ggt gat gtt 1152 Glu Trp Met Trp Asn Gln Leu Gly Asn Phe Leu Gln Glu Gly Asp Val 370 375 380 gtt att gca gaa acc ggc acc agc 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ctg ctg ccg acc ttt ggc gca aaa gat tat gaa aca cat cgt 1536 Leu Ser Leu Leu Pro Thr Phe Gly Ala Lys Asp Tyr Glu Thr His Arg 500 505 510 gtt gca acc aca ggt gaa tgg gat aaa ctg acc cag gat aaa tcc ttt 1584 Val Ala Thr Thr Gly Glu Trp Asp Lys Leu Thr Gln Asp Lys Ser Phe 515 520 525 aat gat aac agc aaa atc cgc atg atc gaa att atg ctg ccg gtt ttt 1632 Asn Asp Asn Ser Lys Ile Arg Met Ile Glu Ile Met Leu Pro Val Phe 530 535 540 gat gca ccg cag aat ctg gtg gaa cag gcc aaa ctg acc gca gca acc 1680 Asp Ala Pro Gln Asn Leu Val Glu Gln Ala Lys Leu Thr Ala Ala Thr 545 550 555 aat gca aaa cag ctc gag cac cac cac cac cac cac tga 1719 Asn Ala Lys Gln Leu Glu His His His His His His 560 565 570 <210> 2 <211> 571 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 2 Met Ser Glu Ile Thr Leu Gly Lys Tyr Leu Phe Glu Arg Leu Lys Gln 1 5 10 15 Val Asn Val Asn Thr Val Phe Gly Leu Pro Gly Asp Phe Asn Leu Ser 20 25 30 Leu Leu Asp Lys Ile Tyr Glu Val Glu Gly Met Arg Trp Ala Gly Asn 35 40 45 Ala Asn Glu Leu Asn Ala Ala Tyr Ala Ala Asp Gly Tyr Ala Arg Ile 50 55 60 Lys Gly Met Ser Cys Ile Ile Thr Thr Phe Gly Val Gly Glu Leu Ser 65 70 75 80 Ala Leu Asn Gly Ile Ala Gly Ser Tyr Ala Glu His Val Gly Val Leu 85 90 95 His Val Val Gly Val Pro Ser Ile Ser Ala Gln Ala Lys Gln Leu Leu 100 105 110 Leu His His Thr Leu Gly Asn Gly Asp Phe Thr Val Phe His Arg Met 115 120 125 Ser Ala Asn Ile Ser Glu Thr Thr Ala Met Ile Thr Asp Ile Ala Thr 130 135 140 Ala Pro Ala Glu Ile Asp Arg Cys Ile Arg Thr Thr Tyr Val Thr Gln 145 150 155 160 Arg Pro Val Tyr Leu Gly Leu Pro Ala Asn Leu Val Asp Leu Asn Val 165 170 175 Pro Ala Lys Leu Leu Gln Thr Pro Ile Asp Met Ser Leu Lys Pro Asn 180 185 190 Asp Ala Glu Ser Glu Lys Glu Val Ile Asp Thr Ile Leu Ala Leu Val 195 200 205 Lys Asp Ala Lys Asn Pro Val Ile Leu Ala Asp Ala Cys Cys Ser Arg 210 215 220 His Asp Val Lys Ala Glu Thr Lys Lys Leu Ile Asp Leu Thr Gln Phe 225 230 235 240 Pro Ala Phe Val Thr Pro Met Gly Lys Gly Ser Ile Asp Glu Gln His 245 250 255 Pro Arg Tyr Gly Gly Val Tyr Val Gly Thr Leu Ser Lys Pro Glu Val 260 265 270 Lys Glu Ala Val Glu Ser Ala Asp Leu Ile Leu Ser Val Gly Ala Leu 275 280 285 Leu Ser Asp Phe Asn Thr Gly Ser Phe Ser Tyr Ser Tyr Lys Thr Lys 290 295 300 Asn Ile Val Glu Phe His Ser Asp His Met Lys Ile Arg Asn Ala Thr 305 310 315 320 Phe Pro Gly Val Gln Met Lys Phe Val Leu Gln Lys Leu Leu Thr Thr 325 330 335 Ile Ala Asp Ala Ala Lys Gly Tyr Lys Pro Val Ala Val Pro Ala Arg 340 345 350 Thr Pro Ala Asn Ala Ala Val Pro Ala Ser Thr Pro Leu Lys Gln Glu 355 360 365 Trp Met Trp Asn Gln Leu Gly Asn Phe Leu Gln Glu Gly Asp Val Val 370 375 380 Ile Ala Glu Thr Gly Thr Ser Ala Phe Gly Ile Asn Gln Thr Thr Phe 385 390 395 400 Pro Asn Asn Thr Tyr Gly Ile Ser Gln Val Leu Trp Gly Ser Ile Gly 405 410 415 Phe Thr Thr Gly Ala Thr Leu Gly Ala Ala Phe Ala Ala Glu Glu Ile 420 425 430 Asp Pro Lys Lys Arg Val Ile Leu Phe Ile Gly Asp Gly Ser Leu Gln 435 440 445 Leu Thr Val Gln Glu Ile Ser Thr Met Ile Arg Trp Gly Leu Lys Pro 450 455 460 Tyr Leu Phe Val Leu Asn Asn Asp Gly Tyr Thr Ile Glu Lys Leu Ile 465 470 475 480 His Gly Pro Lys Ala Gln Tyr Asn Glu Ile Gln Gly Trp Asp His Leu 485 490 495 Ser Leu Leu Pro Thr Phe Gly Ala Lys Asp Tyr Glu Thr His Arg Val 500 505 510 Ala Thr Thr Gly Glu Trp Asp Lys Leu Thr Gln Asp Lys Ser Phe Asn 515 520 525 Asp Asn Ser Lys Ile Arg Met Ile Glu Ile Met Leu Pro Val Phe Asp 530 535 540 Ala Pro Gln Asn Leu Val Glu Gln Ala Lys Leu Thr Ala Ala Thr Asn 545 550 555 560 Ala Lys Gln Leu Glu His His His His His His 565 570 <210> 3 <211> 1932 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <220> <221> misc_feature <222> (1)..(6) <223> NdeI restriction site <220> <221> CDS <222> (4)..(1932) <223> sequence of ARO10 of Sacharomyces cerevisiae optimized for the codon usage of Escherichia coli with a carboxy-terminal His6-tag <220> <221> misc_feature <222> (1906)..(1911) <223> XhoI restriction site <400> 3 cat atg gca ccg gtt acc att gaa aaa ttc gtg aat caa gaa gaa cgc 48 Met Ala Pro Val Thr Ile Glu Lys Phe Val Asn Gln Glu Glu Arg 1 5 10 15 cac 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agt att gat agc cgt agc agc aat ttt agc gat cgt aat ctg 432 Ala Lys Ser Ile Asp Ser Arg Ser Ser Asn Phe Ser Asp Arg Asn Leu 130 135 140 cat cat ctg gtt ccg cag ctg cat gat agc aac ttt aaa ggt ccg aac 480 His His Leu Val Pro Gln Leu His Asp Ser Asn Phe Lys Gly Pro Asn 145 150 155 cat aaa gtg tat cac gac atg gtt aaa gat cgt gtt gca tgt agc gtt 528 His Lys Val Tyr His Asp Met Val Lys Asp Arg Val Ala Cys Ser Val 160 165 170 175 gca tat ctg gaa gat att gaa acc gca tgt gat cag gtg gat aat gtg 576 Ala Tyr Leu Glu Asp Ile Glu Thr Ala Cys Asp Gln Val Asp Asn Val 180 185 190 att cgc gat atc tat aaa tac agc aaa ccg ggt tat atc ttt gtg cct 624 Ile Arg Asp Ile Tyr Lys Tyr Ser Lys Pro Gly Tyr Ile Phe Val Pro 195 200 205 gcc gat ttt gca gat atg agc gtt acc tgt gat aat ctg gtt aat gtt 672 Ala Asp Phe Ala Asp Met Ser Val Thr Cys Asp Asn Leu Val Asn Val 210 215 220 ccg cgt att agc cag cag gat tgt att gtt tat ccg agc gaa aat cag 720 Pro Arg Ile Ser Gln Gln Asp Cys Ile Val Tyr Pro Ser Glu Asn Gln 225 230 235 ctg agc gac att att aac aaa atc acc agc tgg atc tat agc agc aaa 768 Leu Ser Asp Ile Ile Asn Lys Ile Thr Ser Trp Ile Tyr Ser Ser Lys 240 245 250 255 aca ccg gca att ctg ggt gat gtt ctg acc gat cgt tat ggt gtt agc 816 Thr Pro Ala Ile Leu Gly Asp Val Leu Thr Asp Arg Tyr Gly Val Ser 260 265 270 aat ttt ctg aac aaa ctg att tgc aaa acc ggc atc tgg aat ttt tct 864 Asn Phe Leu Asn Lys Leu Ile Cys Lys Thr Gly Ile Trp Asn Phe Ser 275 280 285 acc gtt atg ggt aaa agc gtg atc gat gaa agc aat ccg acc tat atg 912 Thr Val Met Gly Lys Ser Val Ile Asp Glu Ser Asn Pro Thr Tyr Met 290 295 300 ggt cag tat aat ggt aaa gaa ggc ctg aaa cag gtc tat gaa cat ttt 960 Gly Gln Tyr Asn Gly Lys Glu Gly Leu Lys Gln Val Tyr Glu His Phe 305 310 315 gaa ctg tgt gat ctg gtg ctg cat ttt ggc gtt gac att aac gaa att 1008 Glu Leu Cys Asp Leu Val Leu His Phe Gly Val Asp Ile Asn Glu Ile 320 325 330 335 aac aac ggc cat tac acc ttc acc tat aaa ccg aat gca aaa atc atc 1056 Asn Asn Gly His Tyr Thr Phe Thr Tyr Lys Pro Asn Ala Lys Ile Ile 340 345 350 cag ttc cac ccg aac tat att cgt ctg gtt gat acc cgt cag ggt aat 1104 Gln Phe His Pro Asn Tyr Ile Arg Leu Val Asp Thr Arg Gln Gly Asn 355 360 365 gag cag atg ttt aaa ggt att aac ttt gca ccg atc ctg aaa gag ctg 1152 Glu Gln Met Phe Lys Gly Ile Asn Phe Ala Pro Ile Leu Lys Glu Leu 370 375 380 tat aaa cgt att gat gtg agc aaa ctg tcc ctg caa tat gat agt aat 1200 Tyr Lys Arg Ile Asp Val Ser Lys Leu Ser Leu Gln Tyr Asp Ser Asn 385 390 395 gtt acc cag tat acc aac gaa acc atg cgc ctg gaa gat ccg acc aat 1248 Val Thr Gln Tyr Thr Asn Glu Thr Met Arg Leu Glu Asp Pro Thr Asn 400 405 410 415 ggt cag agc agc att att acc cag gtt cat ctg caa aaa acg atg ccg 1296 Gly Gln Ser Ser Ile Ile Thr Gln Val His Leu Gln Lys Thr Met Pro 420 425 430 aaa ttt ctg aat cca ggt gat gtt gtt gtt tgt gaa acc ggt agc ttt 1344 Lys Phe Leu Asn Pro Gly Asp Val Val Val Cys Glu Thr Gly Ser Phe 435 440 445 cag ttt agc gtt cgt gat ttt gca ttt ccg agc cag ctg aaa tat atc 1392 Gln Phe Ser Val Arg Asp Phe Ala Phe Pro Ser Gln Leu Lys Tyr Ile 450 455 460 agc cag ggt ttt ttt ctg agt att ggt atg gca ctg cct gcc gca ctg 1440 Ser Gln Gly Phe Phe Leu Ser Ile Gly Met Ala Leu Pro Ala Ala Leu 465 470 475 ggt gtt ggt atc gca atg cag gat cat agc aat gca cat att aat ggt 1488 Gly Val Gly Ile Ala Met Gln Asp His Ser Asn Ala His Ile Asn Gly 480 485 490 495 ggc aac gtg aaa gag gat tat aaa ccg cgt ctg att ctg ttt gaa ggt 1536 Gly Asn Val Lys Glu Asp Tyr Lys Pro Arg Leu Ile Leu Phe Glu Gly 500 505 510 gat ggt gca gca cag atg acc att caa gaa ctg agc acc att ctg aaa 1584 Asp Gly Ala Ala Gln Met Thr Ile Gln Glu Leu Ser Thr Ile Leu Lys 515 520 525 tgt aat att ccg ctg gaa gtg atc atc tgg aac aat aat ggt tat acg 1632 Cys Asn Ile Pro Leu Glu Val Ile Ile Trp Asn Asn Asn Gly Tyr Thr 530 535 540 att gag cgt gca att atg ggt ccg acc cgt agc tat aat gat gtt atg 1680 Ile Glu Arg Ala Ile Met Gly Pro Thr Arg Ser Tyr Asn Asp Val Met 545 550 555 agc tgg aaa tgg acc aaa ctg ttt gag gca ttt ggc gat ttt gat ggc 1728 Ser Trp Lys Trp Thr Lys Leu Phe Glu Ala Phe Gly Asp Phe Asp Gly 560 565 570 575 aaa tat acc aat agc acc ctg att cag tgt ccg agt aaa ctg gca ctg 1776 Lys Tyr Thr Asn Ser Thr Leu Ile Gln Cys Pro Ser Lys Leu Ala Leu 580 585 590 aaa ctg gaa gaa ctg aaa aac agc aat aaa cgc agc ggt att gaa ctg 1824 Lys Leu Glu Glu Leu Lys Asn Ser Asn Lys Arg Ser Gly Ile Glu Leu 595 600 605 ctg gaa gtt aaa ctg ggc gaa ctg gat ttt ccg gaa caa ctg aaa tgc 1872 Leu Glu Val Lys Leu Gly Glu Leu Asp Phe Pro Glu Gln Leu Lys Cys 610 615 620 atg gtt gaa gca gca gcc ctg aaa cgt aat aaa ctc gag cac cac cac 1920 Met Val Glu Ala Ala Ala Leu Lys Arg Asn Lys Leu Glu His His His 625 630 635 cac cac cac tga 1932 His His His 640 <210> 4 <211> 642 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 4 Met Ala Pro Val Thr Ile Glu Lys Phe Val Asn Gln Glu Glu Arg His 1 5 10 15 Leu Val Ser Asn Arg Ser Ala Thr Ile Pro Phe Gly Glu Tyr Ile Phe 20 25 30 Lys Arg Leu Leu Ser Ile Asp Thr Lys Ser Val Phe Gly Val Pro Gly 35 40 45 Asp Phe Asn Leu Ser Leu Leu 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Asp Arg Tyr Gly Val Ser Asn 260 265 270 Phe Leu Asn Lys Leu Ile Cys Lys Thr Gly Ile Trp Asn Phe Ser Thr 275 280 285 Val Met Gly Lys Ser Val Ile Asp Glu Ser Asn Pro Thr Tyr Met Gly 290 295 300 Gln Tyr Asn Gly Lys Glu Gly Leu Lys Gln Val Tyr Glu His Phe Glu 305 310 315 320 Leu Cys Asp Leu Val Leu His Phe Gly Val Asp Ile Asn Glu Ile Asn 325 330 335 Asn Gly His Tyr Thr Phe Thr Tyr Lys Pro Asn Ala Lys Ile Ile Gln 340 345 350 Phe His Pro Asn Tyr Ile Arg Leu Val Asp Thr Arg Gln Gly Asn Glu 355 360 365 Gln Met Phe Lys Gly Ile Asn Phe Ala Pro Ile Leu Lys Glu Leu Tyr 370 375 380 Lys Arg Ile Asp Val Ser Lys Leu Ser Leu Gln Tyr Asp Ser Asn Val 385 390 395 400 Thr Gln Tyr Thr Asn Glu Thr Met Arg Leu Glu Asp Pro Thr Asn Gly 405 410 415 Gln Ser Ser Ile Ile Thr Gln Val His Leu Gln Lys Thr Met Pro Lys 420 425 430 Phe Leu Asn Pro Gly Asp Val Val Val Cys Glu Thr Gly Ser Phe Gln 435 440 445 Phe Ser Val Arg Asp Phe Ala Phe Pro Ser Gln Leu Lys Tyr Ile Ser 450 455 460 Gln Gly Phe Phe Leu Ser Ile Gly Met Ala 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Lactococcus lactis optimized for the codon usage of Escherichia coli with a carboxy-terminal His6-tag <220> <221> misc_feature <222> (1645)..(1650) <223> XhoI restriction site <400> 5 cat atg tat acc gtt ggt gat tat ctg ctg gat cgt ctg cat gaa ctg 48 Met Tyr Thr Val Gly Asp Tyr Leu Leu Asp Arg Leu His Glu Leu 1 5 10 15 ggt att gaa gaa att ttt ggt gtt ccg ggt gat tac aac ctg caa ttt 96 Gly Ile Glu Glu Ile Phe Gly Val Pro Gly Asp Tyr Asn Leu Gln Phe 20 25 30 ctg gat cag att atc agc cgt gaa gat atg aaa tgg att ggc aat gcg 144 Leu Asp Gln Ile Ile Ser Arg Glu Asp Met Lys Trp Ile Gly Asn Ala 35 40 45 aat gaa ctg aat gca agc tat atg gca gat ggt tat gca cgt acc aaa 192 Asn Glu Leu Asn Ala Ser Tyr Met Ala Asp Gly Tyr Ala Arg Thr Lys 50 55 60 aaa gca gca gca ttt ctg acc acc ttt ggt gtt ggt gaa ctg agc gca 240 Lys Ala Ala Ala Phe Leu Thr Thr Phe Gly Val Gly Glu Leu Ser Ala 65 70 75 att aat ggt ctg gca ggt agc tat gca gaa aat ctg ccg gtt gtt gaa 288 Ile Asn Gly Leu Ala Gly Ser Tyr Ala Glu Asn Leu Pro Val Val Glu 80 85 90 95 att gtt ggt agc ccg acc agc aaa gtt cag aat gat ggt aaa ttt gtg 336 Ile Val Gly Ser Pro Thr Ser Lys Val Gln Asn Asp Gly Lys Phe Val 100 105 110 cat cat acc ctg gcc gat ggt gat ttt aaa cac ttt atg aaa atg cac 384 His His Thr Leu Ala Asp Gly Asp Phe Lys His Phe Met Lys Met His 115 120 125 gaa ccg gtt acc gca gca cgt acc ctg ctg acc gca gaa aat gca acc 432 Glu Pro Val Thr Ala Ala Arg Thr Leu Leu Thr Ala Glu Asn Ala Thr 130 135 140 tat gaa att gat cgt gtt ctg agc cag ctg ctg aaa gaa cgt aaa ccg 480 Tyr Glu Ile Asp Arg Val Leu Ser Gln Leu Leu Lys Glu Arg Lys Pro 145 150 155 gtg tat att aac ctg ccg gtg gat gtt gca gca gca aaa gca gaa aaa 528 Val Tyr Ile Asn Leu Pro Val Asp Val Ala Ala Ala Lys Ala Glu Lys 160 165 170 175 ccg gca ctg agc ctg gaa aaa gaa agc agc acc acc aat acc acc gaa 576 Pro Ala Leu Ser Leu Glu Lys Glu Ser Ser Thr Thr Asn Thr Thr Glu 180 185 190 cag gtt att ctg agc aaa atc gaa gaa agc ctg aaa aat gcc cag aaa 624 Gln Val Ile Leu Ser Lys Ile Glu Glu 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Ile Phe Asn Lys Val Val Glu Asp Phe Asp 305 310 315 ttt cgt gca gtt gtt agc agc ctg agc gaa ctg aaa ggt att gaa tat 1008 Phe Arg Ala Val Val Ser Ser Leu Ser Glu Leu Lys Gly Ile Glu Tyr 320 325 330 335 gaa ggc cag tac atc gac aaa cag tat gaa gaa ttt att ccg agc agc 1056 Glu Gly Gln Tyr Ile Asp Lys Gln Tyr Glu Glu Phe Ile Pro Ser Ser 340 345 350 gca ccg ctg agc cag gat cgc ctg tgg cag gca gtt gaa agt ctg acc 1104 Ala Pro Leu Ser Gln Asp Arg Leu Trp Gln Ala Val Glu Ser Leu Thr 355 360 365 cag agc aat gaa acc att gtt gca gaa cag ggc acc agt ttt ttt ggt 1152 Gln Ser Asn Glu Thr Ile Val Ala Glu Gln Gly Thr Ser Phe Phe Gly 370 375 380 gca agc acc att ttt ctg aaa agc aac agc cgt ttt att ggt cag ccg 1200 Ala Ser Thr Ile Phe Leu Lys Ser Asn Ser Arg Phe Ile Gly Gln Pro 385 390 395 ctg tgg ggt agc att ggt tat acc ttt ccg gca gca ctg ggt agc cag 1248 Leu Trp Gly Ser Ile Gly Tyr Thr Phe Pro Ala Ala Leu Gly Ser Gln 400 405 410 415 att gca gat aaa gaa agc cgt cat ctg ctg ttt att ggt gat ggt agc 1296 Ile Ala Asp Lys Glu Ser Arg His Leu Leu Phe Ile Gly Asp Gly Ser 420 425 430 ctg caa ctg acc gtt caa gaa ctg ggt ctg agc att cgt gaa aaa ctg 1344 Leu Gln Leu Thr Val Gln Glu Leu Gly Leu Ser Ile Arg Glu Lys Leu 435 440 445 aat ccg att tgc ttc atc att aac aac gat ggc tat acc gtg gaa cgt 1392 Asn Pro Ile Cys Phe Ile Ile Asn Asn Asp Gly Tyr Thr Val Glu Arg 450 455 460 gaa att cat ggt ccg acc cag agt tat aat gat att ccg atg tgg aac 1440 Glu Ile His Gly Pro Thr Gln Ser Tyr Asn Asp Ile Pro Met Trp Asn 465 470 475 tac tcg aaa ctg cct gaa acc ttt ggc gca acc gaa gat cgt gtg gtt 1488 Tyr Ser Lys Leu Pro Glu Thr Phe Gly Ala Thr Glu Asp Arg Val Val 480 485 490 495 agc aaa att gtt cgt acc gaa aat gaa ttt gtg agc gtg atg aaa gaa 1536 Ser Lys Ile Val Arg Thr Glu Asn Glu Phe Val Ser Val Met Lys Glu 500 505 510 gca cag gca gac gtt aat cgt atg tat tgg att gaa ctg gtg ctg gaa 1584 Ala Gln Ala Asp Val Asn Arg Met Tyr Trp Ile Glu Leu Val Leu Glu 515 520 525 aaa gag gat gca ccg aaa ctg ctg aaa aaa atg ggt aaa ctg ttt gcc 1632 Lys Glu Asp Ala Pro Lys Leu Leu Lys Lys Met Gly Lys Leu Phe Ala 530 535 540 gag cag aat aaa ctc gag cac cac cac cac cac cac tga 1671 Glu Gln Asn Lys Leu Glu His His His His His His 545 550 555 <210> 6 <211> 555 <212> PRT <213> Lactococcus lactis <400> 6 Met Tyr Thr Val Gly Asp Tyr Leu Leu Asp Arg Leu His Glu Leu Gly 1 5 10 15 Ile Glu Glu Ile Phe Gly Val Pro Gly Asp Tyr Asn Leu Gln Phe Leu 20 25 30 Asp Gln Ile Ile Ser Arg Glu Asp Met Lys Trp Ile Gly Asn Ala Asn 35 40 45 Glu Leu Asn Ala Ser Tyr Met Ala Asp Gly Tyr Ala Arg Thr Lys Lys 50 55 60 Ala Ala Ala Phe Leu Thr Thr Phe Gly Val Gly Glu Leu Ser Ala Ile 65 70 75 80 Asn Gly Leu Ala Gly Ser Tyr Ala Glu Asn Leu Pro Val Val Glu Ile 85 90 95 Val Gly Ser Pro Thr Ser Lys Val Gln Asn Asp Gly Lys Phe Val His 100 105 110 His Thr Leu Ala Asp Gly Asp Phe Lys His Phe Met Lys Met His Glu 115 120 125 Pro Val Thr Ala Ala Arg Thr Leu Leu Thr Ala Glu Asn Ala Thr Tyr 130 135 140 Glu Ile Asp Arg Val Leu Ser Gln Leu Leu Lys Glu Arg Lys 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(1)..(1203) <223> sequence of ybdL of Escherichia coli with an amino-terminal His6-tag <220> <221> misc_feature <222> (37)..(42) <223> KasI restriction site <220> <221> misc_feature <222> (1202)..(1207) <223> HindIII restriction site <400> 7 atg gct agc aga gga tcg cat cac cat cac cat cac ggc gcc atg aca 48 Met Ala Ser Arg Gly Ser His His His His His His Gly Ala Met Thr 1 5 10 15 aat aac cct ctg att cca caa agc aaa ctt cca caa ctt ggc acc act 96 Asn Asn Pro Leu Ile Pro Gln Ser Lys Leu Pro Gln Leu Gly Thr Thr 20 25 30 att ttc acc cag atg agc gcg ctg gcg cag caa cac cag gcg att aac 144 Ile Phe Thr Gln Met Ser Ala Leu Ala Gln Gln His Gln Ala Ile Asn 35 40 45 ctg tcg caa ggc ttt cct gat ttt gat ggt ccg cgc tat tta cag gag 192 Leu Ser Gln Gly Phe Pro Asp Phe Asp Gly Pro Arg Tyr Leu Gln Glu 50 55 60 cgg ctg gcg cac cac gtt gca cag ggg gca aac caa tac gcg ccc atg 240 Arg Leu Ala His His Val Ala Gln Gly Ala Asn Gln Tyr Ala Pro Met 65 70 75 80 acc ggc gtg cag gcc ttg cgc gag gcg att gct cag aaa acg gaa cgt 288 Thr Gly Val Gln Ala Leu Arg Glu Ala Ile Ala Gln Lys Thr Glu Arg 85 90 95 ttg tat ggc tat caa cca gat gcc gat agc gat atc acc gta acg gca 336 Leu Tyr Gly Tyr Gln Pro Asp Ala Asp Ser Asp Ile Thr Val Thr Ala 100 105 110 ggg gcg acg gaa gcg tta tac gcg gcg att acc gca ctg gtg cgc aat 384 Gly Ala Thr Glu Ala Leu Tyr Ala Ala Ile Thr Ala Leu Val Arg Asn 115 120 125 ggc gat gaa gtg att tgt ttt gat ccc agc tat gac agt tac gcc ccc 432 Gly Asp Glu Val Ile Cys Phe Asp Pro Ser Tyr Asp Ser Tyr Ala Pro 130 135 140 gcc atc gcg ctt tct ggg gga ata gtg aag cgt atg gca ctg caa cca 480 Ala Ile Ala Leu Ser Gly Gly Ile Val Lys Arg Met Ala Leu Gln Pro 145 150 155 160 ccg cat ttt cgc gtt gac tgg cag gaa ttt gcc gca tta tta agc gag 528 Pro His Phe Arg Val Asp Trp Gln Glu Phe Ala Ala Leu Leu Ser Glu 165 170 175 cgc acc aga ctg gtg atc ctc aac act ccg cat aac ccc agt gca act 576 Arg Thr Arg Leu Val Ile Leu Asn Thr Pro His Asn Pro Ser Ala Thr 180 185 190 gtc tgg cag cag gct gat ttc gcc gct ttg tgg 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cgc gat att ctg gtg aat gct tta 960 Leu Pro Asp Phe Tyr Arg Gln Lys Arg Asp Ile Leu Val Asn Ala Leu 305 310 315 320 aat gaa agc cgg ctg gag att tta ccg tgt gaa ggt aca tac ttt ttg 1008 Asn Glu Ser Arg Leu Glu Ile Leu Pro Cys Glu Gly Thr Tyr Phe Leu 325 330 335 ctg gtg gat tac agc gcg gtt tct acc ctg gat gat gtt gag ttt tgc 1056 Leu Val Asp Tyr Ser Ala Val Ser Thr Leu Asp Asp Val Glu Phe Cys 340 345 350 cag tgg ctg acg cag gag cac ggc gta gcg gcg att ccg ctg tcg gtg 1104 Gln Trp Leu Thr Gln Glu His Gly Val Ala Ala Ile Pro Leu Ser Val 355 360 365 ttt tgc gcc gat ccc ttc cca cat aaa ctg att cgt ctc tgt ttt gcc 1152 Phe Cys Ala Asp Pro Phe Pro His Lys Leu Ile Arg Leu Cys Phe Ala 370 375 380 aag aag gaa tcg acg ttg ctg gca gca gct gaa cgc ctg cgc cag ctt 1200 Lys Lys Glu Ser Thr Leu Leu Ala Ala Ala Glu Arg Leu Arg Gln Leu 385 390 395 400 taa gctt 1207 <210> 8 <211> 400 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 8 Met Ala Ser Arg Gly Ser His His His His His His Gly Ala Met Thr 1 5 10 15 Asn Asn 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Asp Val Phe Glu Met Met Asp Arg Tyr Gly His Glu Gln Val Ile Phe 20 25 30 Cys Arg His Pro Gln Thr Gly Leu Lys Ala Ile Ile Ala Leu His Asn 35 40 45 Thr Thr Ala Gly Pro Ala Leu Gly Gly Cys Arg Met Ile Pro Tyr Ala 50 55 60 Ser Thr Asp Glu Ala Leu Glu Asp Val Leu Arg Leu Ser Lys Gly Met 65 70 75 80 Thr Tyr Lys Cys Ser Leu Ala Asp Val Asp Phe Gly Gly Gly Lys Met 85 90 95 Val Ile Ile Gly Asp Pro Lys Lys Asp Lys Ser Pro Glu Leu Phe Arg 100 105 110 Val Ile Gly Arg Phe Val Gly Gly Leu Asn Gly Arg Phe Tyr Thr Gly 115 120 125 Thr Asp Met Gly Thr Asn Pro Glu Asp Phe Val His Ala Ala Arg Glu 130 135 140 Ser Lys Ser Phe Ala Gly Leu Pro Lys Ser Tyr Gly Gly Lys Gly Asp 145 150 155 160 Thr Ser Ile Pro Thr Ala Leu Gly Val Phe His Gly Met Arg Ala Thr 165 170 175 Ala Arg Phe Leu Trp Gly Thr Asp Gln Leu Lys Gly Arg Val Val Ala 180 185 190 Ile Gln Gly Val Gly Lys Val Gly Glu Arg Leu Leu Gln Leu Leu Val 195 200 205 Glu Val Gly Ala Tyr Cys Lys Ile Ala Asp Ile Asp Ser Val Arg Cys 210 215 220 Glu Gln Leu Lys Glu 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Claims

알데히드, 이산화탄소, 데카르복실라아제, 이의 상응하는 보조인자를 포함하는 혼합물, 및
(a) 하나 이상의 공여자 아미노산 및 아미노트랜스페라아제 및/또는
(b) NADH, 암모니아 및/또는 암모늄 염 및 아미노산 데히드로게나아제
를 반응시켜, L-아미노산 또는 이의 염을 형성하는 단계를 포함하는, L-아미노산의 제조 방법.
제 1 항에 있어서, 형성될 L-아미노산이 L-알라닌, L-발린, L-메티오닌, L-류신, L-이소류신 및 L-페닐알라닌으로 이루어지는 군으로부터 선택되는, L-아미노산의 제조 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 형성될 L-아미노산이 L-메티오닌이고, 알데히드가 3-(메틸티오)-프로판알 (메티오날) 인, L-아미노산의 제조 방법.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 보조인자가 티아민 피로포스페이트를 포함하는, L-아미노산의 제조 방법.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 데카르복실라아제가 사카로마이세스 세레비시아에 (Saccharomyces cerevisiae) 유래 피루베이트 데카르복실라아제 PDC1, 사카로마이세스 세레비시아에 유래 페닐피루베이트 데카르복실라아제 ARO10, 및 락토코쿠스 락티스 (Lactococcus lactis) 유래 분지쇄 데카르복실라아제 KdcA, 뿐 아니라 데카르복실라아제 활성을 갖는 이러한 데카르복실라아제의 돌연변이 및 변이체로 이루어지는 군으로부터 선택되는, L-아미노산의 제조 방법.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 아미노트랜스페라아제가 E. 콜라이 (E. coli) 유래 메티오닌 아미노트랜스페라아제 YbdL, 및 사카로마이세스 세레비시아에 유래 방향족 아미노트랜스페라아제 Aro8, 뿐 아니라 아미노트랜스페라아제 활성을 갖는 이러한 아미노트랜스페라아제의 돌연변이 및 변이체로 이루어지는 군으로부터 선택되는, L-아미노산의 제조 방법.
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산 데히드로게나아제가 바실루스 스파에리쿠스 (Bacillus sphaericus) 유래 류신 데히드로게나아제 LeuDH, 및 테르모액티노마이세스 인테르메디우스 (Thermoactinomyces intermedius) 유래 페닐알라닌 데히드로게나아제 PheDH, 뿐 아니라 아미노산 데히드로게나아제 활성을 갖는 이러한 아미노산 데히드로게나아제의 돌연변이 및 변이체로 이루어지는 군으로부터 선택되는, L-아미노산의 제조 방법.
제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 공여자 아미노산이 형성될 L-아미노산과 상이하고, 하나 이상의 L-아미노산이 L-글루타민, L-글루타메이트, L-알라닌, L-페닐알라닌, L-티로신, L-류신, L-이소류신, L-히스티딘 및 L-트립토판으로 이루어지는 군으로부터 선택되는, L-아미노산의 제조 방법.
제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 이산화탄소가 10 내지 7400 kPa 의 압력에서 혼합물에 적용되는, L-아미노산의 제조 방법.
제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 혼합물이 추가로 포름산 또는 이의 염 및 포르메이트 데히드로게나아제를 포함하는, L-아미노산의 제조 방법.
제 9 항에 있어서, 포르메이트 데히드로게나아제가 슈도모나스 종 (Pseudomonas sp.) 유래 포르메이트 데히드로게나아제 및 칸디다 종 (Candida sp.) 유래 포르메이트 데히드로게나아제, 뿐 아니라 포르메이트 데히드로게나아제 활성을 갖는 이러한 포르메이트 데히드로게나아제의 돌연변이 및 변이체로 이루어지는 군으로부터 선택되는, L-아미노산의 제조 방법.