KR20190091490A - 인간 다능성 줄기 세포로부터 심방 및 심실 심근세포 계통의 생성 - Google Patents

인간 다능성 줄기 세포로부터 심방 및 심실 심근세포 계통의 생성 Download PDF

Info

Publication number
KR20190091490A
KR20190091490A KR1020197018959A KR20197018959A KR20190091490A KR 20190091490 A KR20190091490 A KR 20190091490A KR 1020197018959 A KR1020197018959 A KR 1020197018959A KR 20197018959 A KR20197018959 A KR 20197018959A KR 20190091490 A KR20190091490 A KR 20190091490A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
cells
cardiomyocytes
population
ventricular
component
Prior art date
Application number
KR1020197018959A
Other languages
English (en)
Other versions
KR102666175B1 (ko
Inventor
고든 켈러
스테파니 프로츠
지 훈 이
Original Assignee
유니버시티 헬스 네트워크
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 유니버시티 헬스 네트워크 filed Critical 유니버시티 헬스 네트워크
Priority to KR1020237040626A priority Critical patent/KR20230167143A/ko
Publication of KR20190091490A publication Critical patent/KR20190091490A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102666175B1 publication Critical patent/KR102666175B1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/34—Muscles; Smooth muscle cells; Heart; Cardiac stem cells; Myoblasts; Myocytes; Cardiomyocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/04—Inotropic agents, i.e. stimulants of cardiac contraction; Drugs for heart failure
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0657—Cardiomyocytes; Heart cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5014—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing toxicity
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G01N33/5061—Muscle cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6887—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids from muscle, cartilage or connective tissue
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/38—Vitamins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/155—Bone morphogenic proteins [BMP]; Osteogenins; Osteogenic factor; Bone inducing factor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/16—Activin; Inhibin; Mullerian inhibiting substance
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70596—Molecules with a "CD"-designation not provided for elsewhere in G01N2333/705
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/902—Oxidoreductases (1.)
    • G01N2333/90203—Oxidoreductases (1.) acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)

Abstract

다능성 줄기 세포로부터 심근세포 개체군을 생산하는 방법이 개시된다. 모집단은 심방 또는 심실 심근세포가 농축되어 있을 수 있고, 생성되는 심실 개체군은 본질적으로 박동원 세포가 없을 수 있다. 상기 방법은, 다능성 줄기 세포를 적절한 배지에서 BMP 성분 및 액티빈 성분으로 인큐베이션하는 단계를 포함하며, 심방 또는 심실 심근세포를 농축하기 위해 액티빈의 양은 가변될 수 있다. 심장 복구를 필요로 하는 환자를 치료하기 위한 농축된 개체군뿐만 아니라 사용하는 방법도 개시된다.

Description

인간 다능성 줄기 세포로부터 심방 및 심실 심근세포 계통의 생성
관련 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 35 U.S.C §119에 의거하여 2016년 12월 4일 출원된 미국 특허 가출원 제62/429,823호 및 2016년 12월 6일에 출원된 미국 특허 가출원 제62/430,815호에 대한 우선권을 주장한다. 이에 의해 이들 선 출원된 특허 출원의 전체 내용은 참조로서 본원에 명시적으로 통합되며, 상기 전체 내용에는 각각의 명세서 및 요약서뿐만 아니라 임의의 도면, 표 또는 이들의 도면이 포함되지만 이들로 한정되지는 않는다.
기술분야
본 개시는 심방 심근세포, 심실 심근세포의 농축된 모집단을 포함하는 조성물, 상기 조성물을 생산하는 방법, 치료, 질환 모델링, 약물의 발견 및 바이오마커를 위한 조성물의 용도, 및 이들 농축된 하위 집단을 식별하는 방법을 제공한다.
심장 질환 연구의 목표는 심장 질환에서 무엇이 왜 발생하는지를 보다 상세하게 이해하는 것 및 손상을 방지하거나 손상된 심장 조직을 복구하거나 교체하는 방법을 찾는 것이다. 기존의 치료법은 상실된 수축 기능을 회복하기보다는 심부전의 진행을 늦추는 것을 목표로 한다. 현재, 상실된 수축 기능을 대체하기 위해 이용할 수 있는 유일한 치료적 선택은 전체 기관을 이식하는 것이지만, 공급이 수요에 크게 미치지 못하기 때문에, 대안적인 접근법으로서 줄기 세포 기반 치요법에 대한 상당한 관심을 가졌었다. 이식을 목적으로 줄기 세포로부터 분화된 심근세포을 활용할 수 있는 능력은 특히 유용할 것이다. 인간 배아 줄기 세포(hESC) 유래의 심근세포가 이식되면, 이를 사용해 손상된 심장의 근육을 움직이게 할 수 있고 수축 기능의 개선을 매개할 수 있다는 것이 다양한 연구를 통해 입증되었다(예를 들어, Shiba 등의 문헌 (2012) 참조). 그러나, 줄기 세포 유래의 심근세포 모집단의 혼합된 성질이라는 하나의 난제가 남았는데, 이는 이식-관련 심실 빈박성 부정맥과 같은 문제의 원인이 될 수 있다. 필요한 것은, 심실 심근세포 및 심방 심근세포와 같은 심근세포의 특정 아형의 농축된 개체군이 형성될 수 있게 하고, 치료를 목적으로 심근 세포의 이러한 농축된 개체군이 사용될 수 있게 하는 줄기 세포를 더 구별할 수 있는 능력이다.
일 양태에서, 심방 심근세포가 농축된 심근세포의 개체군을 생산하는 방법이 제공되며, 상기 방법은: i. 중배엽 유도 배지에서 다능성 줄기 세포를 인큐베이션하여 심방 중배엽을 생성하는 단계를 포함하되, 상기 중배엽 유도 배지는 적어도 BMP 성분(선택적으로는 BMP4), 및 액티빈 성분(선택적으로는 액티빈 A)의 유효량을 포함한다. 이러한 양태에서, 상기 방법은, 레티노산 성분을 세포에 첨가하고, 심방 심근세포가 농축된 심근세포의 개체군이 생성되도록 상기 세포를 배양하는 단계를 추가로 포함하되, 상기 레티노산의 첨가는 중배엽을 유도하는 단계 또는 심혈관을 특정하는 단계 도중에 이루어진다.
일 양태에서, 심방 중배엽은 상기 세포가 RALDH2 양성, CD235 음성, 및 CYP26A1 음성 중 하나 이상인 것을 특징으로 할 수 있다. 일 구현예에서, BMP 성분과 액티빈 성분은 3:2의 비율로 제공된다. 또 다른 구현예에서, 액티빈 성분은 약 0.001 ng/mL 내지 6 ng/mL의 양으로 존재하고, 상기 BMP 성분은 약 3 ng/mL 내지 약 100 ng/mL의 양으로 존재한다.
일 양태에서, 심실 심근세포가 농축된 심근세포의 개체군을 생산하는 방법이 제공되며, 상기 방법은: 심실 중배엽을 생성하기에 충분한 BMP 성분(선택적으로는 BMP4) 및 액티빈 성분(선택적으로는 액티빈 A)의 유효량을 포함하는 중배엽 유도 배지에서 다능성 줄기 세포를 인큐베이션하는 단계; 및 이어서 심실 심근세포가 농축된 심근세포의 개체군을 생성하기에 적합한 배지(들)에서 상기 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 일 구현예에서, 심실 중배엽을 생성하기에 효과적인 액티빈 성분의 양은 상기 심실 중배엽이 RALDH2 음성, CD235a 양성, 및 CYP26A1 양성 중 하나 이상인 것을 특징으로 한다. 또 다른 구현예에서, 액티빈 성분의 농도는 BMP 성분의 농도보다 더 높다. 일 구현예에서, 액티빈 성분은 약 6 ng/mL 내지 20 ng/mL의 양으로 존재하고, 상기 BMP 성분은 약 3 ng/mL 내지 약 20 ng/mL의 양으로 존재한다.
일 양태에서, 심실 심근세포가 농축된 심근세포의 개체군이 제공되며, 상기 개체군은 본질적으로 박동원 세포가 없다. 또 다른 양태에서, 개체군은 박동원 세포가 전혀 없다. 또 다른 양태에서, 심실 심근세포가 농축된 단리된 심근세포의 개체군이 제공되며, 상기 농축된 심실 심근세포는 본원에 기술된 방법에 따라 바람직하게 수득된 적어도 또는 약 50%의 심실 심근세포, 적어도 또는 약 60%의 심실 심근세포, 적어도 또는 약 70%의 심실 심근세포, 적어도 또는 약 80%의 심실 심근세포, 적어도 또는 약 90%의 심실 심근세포, 적어도 또는 약 95%의 심실 심근세포, 또는 적어도 또는 약 99%의 심실 심근세포를 포함한다. 본 발명의 일 양태에서, 단리된 개체군은 근본적으로 박동원 세포가 없다(총 세포 중 5% 미만임). 바람직한 구현에에서, 개체군은 1% 미만의 박동원 세포, 0.5% 미만의 박동원 세포, 0.1% 미만의 박동원 세포, 0.01% 미만의 박동원 세포, 0.001% 미만의 박동원 세포, 0.0001% 미만의 박동원 세포를 포함하거나, 박동원 세포가 전혀 없다. 임의의 이론에 구속되고자 하는 것은 아니지만, 박동원 세포가 환자에게 도입된 경우, 박동원 세포의 존재가 근육의 독립적이고 개별적인 수축을 유도할 수 있다고 가정한다. 바람직한 구현예에서, 박동원 세포는 현재 이용 가능한 기술을 사용해서는 단리된 심실 심근세포의 개체군에서 검출할 수 없다.
일 양태에서, 심방 심근세포가 농축된 심근세포의 단리된 개체군이 제공되며, 상기 농축된 심방 심근세포는 본원에 기술된 방법에 따라 바람직하게 수득된 적어도 또는 약 50%의 심방 심근세포, 적어도 또는 약 60%의 심방 심근세포, 적어도 또는 약 70%의 심방 심근세포, 적어도 또는 약 80%의 심방 심근세포, 적어도 또는 약 90%의 심방 심근세포, 적어도 또는 약 95%의 심방 심근세포, 또는 적어도 또는 약 99%의 심방 심근세포를 포함한다.
일 양태에서, 예를 들어, 심부전을 가진 대상체나 심부전의 위험이 있는 대상체와 같은, 심장 복구를 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 본원에 기술된 심실 심근세포의 개체군을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
일 양태에서, 예를 들어, 심부전을 가진 대상체나 심부전의 위험이 있는 대상체와 같은, 심장 복구를 필요로 하는 대상체의 치료에 사용하기 위한, 본원에 기술된 심실 심근세포의 개체군이 제공된다.
일 양태에서, 예를 들어, 심부전을 가진 대상체나 심부전의 위험이 있는 대상체와 같은, 심장 복구를 필요로 하는 대상체의 치료용 약제의 제조에 있어서, 본원에 기술된 심실 심근세포의 개체군의 용도가 제공된다.
일 양태에서, 세포의 개체군에서 심방 중배엽을 검출하기 위한 프로세스가 제공되며, 상기 프로세스는 ALDH, 바람직하게는 RALDH2를 검출하는 단계를 포함하되, ALDH, 바람직하게는 RALDH2의 존재는 심방 중배엽을 나타낸다.
일 양태에서, 세포의 개체군에서 심실 중배엽을 검출하기 위한 프로세스가 제공되며, 상기 프로세스는 CD235a, CD235b, CYP26A1 중 하나 이상을 검출하는 단계를 포함하되, CD235a, CD235b, 및/또는 CYP26A1의 존재는 심실 중배엽을 나타낸다.
본 개시의 다른 특징 및 장점은 이어지는 상세한 설명을 통해 명백해질 것이다. 그러나, 본 개시의 범주 내의 다양한 변경 및 수정이 본 상세한 설명으로부터 당업자에게 명백해질 것이므로, 본 개시의 바람직한 구현예를 나타내는 상세한 설명 및 구체적인 실시예는 단지 예시로서 주어진 것임을 이해해야 한다.
본 개시의 구현예는 이제 도면과 관련하여 기술될 것이다.
도 1. RA 신호 전달은 심방 유사 심근세포의 발달을 촉진한다. (a) hPSC 심근세포 분화 프로토콜의 개략도로서, 발달 단계 및 RA 첨가 시점을 나타낸다. (b 및 c) 10 ng/mL의 BMP4 및 6 ng/mL의 액티빈 A(10B/6A)로 유도하였고, 표시된 시점에서 RA로 처리하고(n = 3) 태아 조직 대조군에서 처리한(n = 6) EB 개체군으로부터 20일차에 단리한 NKX2-5+SIRPa+CD90- 세포에서, (b) 범-심근세포 유전자, 및 (c) 심실 특이적 유전자(MYL2) 및 심방 특이적 유전자(KCNJ3)의 발현 수준에 대한 qRT-PCR 분석 (t 검정, DMSO 대조군에 대한 *p < 0.05 및 **p < 0.01이고, F-A에 대한 F-V의 ##p < 0.01임). (d) 10B/6A로 유도하고 3~5일차에 RA 또는 DMSO(대조군)로 처리된(n = 5) EB로부터 20일차에 단리한 NKX2- 5+SIRPa+CD90- 세포의 유전자 발현 프로파일을 비교한 열지도. 값은 하우스키핑 유전자 TBP에 대한 발현 수준의 log10 값을 나타낸다. (e) 10B/6A로 유도하였고, 3~5일차에 RA 또는 DMSO(대조군)로 처리한 EB 개체군에서 20일차에 수행한 NKX2-5+/CTNT+ 및 MLC2V+/CTNT+ 세포의 비율에 대한 대표적인 유세포 계측 분석. (f) 표시된 바와 같이 처리한 EB에서 20일차에 MLC2V+CTNT+ 세포의 평균 비율을 나타내는 막대 그래프(t 검정, DMSO 대조군에 대한 **p < 0.01; n = 4). (g 및 h) 10B/6A로 유도하고 3~5일차에 DMSO(대조군) 또는 RA로 처리한 EB에서 20일차에 수행한 MLC2V (g) 및 COUPTFII (h)에 대한 면역 염색을 나타내는 현미경 사진. 모든 심근세포를 식별하기 위해 CTNT로, 및 모든 세포를 시각화하기 위해 DAPI로 세포를 공염색하였다. 스케일 막대는 100 mm을 나타낸다. 모든 PCR 분석을 위해, 발현 값을 하우스키핑 유전자 TBP에 대해 정규화하였다. 에러 막대는 SEM을 나타낸다. F-V: 태아 심실 조직, F-A: 태아 심방 조직. 도 8도 참조함.
도 2. ALDH+ 심장발생 중배엽의 유도. (a) 10B/6A-유도 EB 상의 PDGFRα+ 중배엽에서의 ALDH 활성에 대한 대표적인 유세포 계측 분석. ALDH 억제제(DEAB)로 처리한 세포를 대조군으로서 사용하였다. (b 및 c) 4일차의 ALDH 활성과 PDGFRα의 발현에 대한 대표적인 유세포 계측 분석(왼쪽 컬럼들), 및 1~3일차에 (b) 액티빈 A 농도(10 ng/mL의 BMP4가 존재하는 가운데 0.110 ng/mL)를 조작하거나 (c) BMP4 농도(2 ng/mL의 액티빈 A가 존재하는 가운데 1~10 ng/mL)를 조작한 후 20일차에 수행한 상응하는 CTNT 발현에 대한 대표적인 유세포 계측 분석. (d) 3B/2A로 유도한 EB에서 ALDH 활성 및 PDGFRα의 발현에 대한 대표적인 유세포 계측 분석. (e) 10B/6A로 유도하였거나 3B/2A로 유도한 EB 개체군에서 ALDH1A2 및 CYP26A1의 발현 수준에 대한 qRT-PCR 분석(t 검정, 상응하는 분화 일차에 10B/6A로 유도한 EB에 대한 *p < 0.05 및 **p < 0.01임; n = 4). 모든 PCR 분석을 위해, 발현 값을 하우스키핑 유전자 TBP에 대해 정규화하였다. 에러 막대는 SEM을 나타낸다. 도 9도 참조함.
도 3. 레티놀은 심방 세동에 대해 AF+ 중배엽을 지정한다. (a) 3B/2A로 유도한 EB로부터 4일차에 단리한 ALDH+ PDGFRα+(분획 I) 및 ALDH- PDGFRα+ (분획 II) 분획의 심원성 전위의 단리 및 분석에 사용된 전략의 개략도. (b) ALDH+ PDGFRa+ (분획 I) 및 ALDH- PDGFRa+ (분획 II) 분획의 단리에 사용된 세포 분류 전략을 나타내는 대표적인 유세포 계측 플롯. (c) 위에 표시된 단리된 개체군 내의 ALDH1A2 발현에 대한 qRT-PCR 분석(t 검정, **p < 0.01; n = 3). (d 및 e) 4일차에 ROH, RA, 또는 DMSO (대조군)으로 처리한 ALDH+ PDGFRa+ 및 ALDH- PDGFRα+ 분획으로부터 생성된 개체군에서 20일차에 수행한 (d) CTNT+ 세포 및 (e) MLC2V+ 세포의 비율에 대한 유세포 계측 분석(t 검정, DMSO 대조군에 대한 *p < 0.05 및 **p < 0.01임; n = 6). (f 및 g) 표시된 처리 그룹의 개체군에서 20일차에 수행한 (f) 심실 유전자 및 (g) 심방 유전자의 발현 수준에 대한 qRT-PCR 분석 (n = 6) (t 검정, DMSO 대조군에 대한 *p < 0.05 및 **p < 0.01임). 모든 PCR 분석을 위해, 발현 값을 하우스키핑 유전자 TBP에 대해 정규화하였다. 에러 막대는 SEM을 나타낸다. WNTi: WNT 억제, ROH: 레티놀. 도 10도 참조함.
도 4. CD235a 발현은 심실 전위로 중배엽을 표지한다. (a) 10B/6A(상단) 또는 3B/2A(하단)로 유도한 EB에서 CD235a의 발현 및 ALDH 활성에 대한 대표적인 유세포 계측 분석. (b) 5B/4A로 유도한 EB로부터 4일차에 CD235a+ (분획 III, 심실 전위) 및 ALDH+ (분획 IV, 심방 전위)를 단리하기 위해 사용한 세포 분류 전략을 나타내는 대표적인 유세포 계측 플롯. (c 및 d) ROH, RA, 또는 DMSO(대조군)로 24시간 동안 처리한 ALDH+ 분획 및 CD235a+ 분획으로부터 4일차에 생성된 개체군에서 20일차에 수행한 (c) CTNT+ 세포 및 (d) MLC2V+ 세포의 비율에 대한 유세포 계측 분석 (t 검정, DMSO 대조군에 대한 *p < 0.05 및 **p < 0.01이고, 표시된 샘플에 대한 ##p < 0.01임; n = 5). (e 및 f) 표시된 바와 같이 처리된 ALDH+ 분획 및 CD235a+ 분획으로부터 4일차에 생성된 개체군에서 20일차에 수행한 (e) 심방 유전자 및 (f) 유전자의 발현 수준에 대한 qRT-PCR 분석 (n = 5) (t 검정, 대 DMSO 대조군에 대한 *p < 0.05 및 **p < 0.01이고, 표시된 샘플에 대한 #p < 0.05 및 ##p < 0.01임). 모든 PCR 분석을 위해, 발현 값을 하우스키핑 유전자 TBP에 대해 정규화하였다. 에러 막대는 SEM을 나타낸다. 도 11도 참조함.
도 5. CD235a+ 심장발생 중배엽 유도의 최적화. (a 및 b) (a) 10 ng/mL BMP4가 존재하는 가운데 액티빈 A의 농도(2~20 ng/mL) 및 (b) 12 ng/mL 액티빈 A가 존재하는 가운데 BMP4의 농도(3~20 ng/mL)를 조작한 후(1~3일차) 4일차에 ALDH 활성 및 CD235a 발현(왼쪽 컬럼), 및 20일차에 상응하는 MLC2V 및 CTNT의 발현(오른쪽 컬럼)에 대한 대표적인 유세포 계측 분석. (c) 5B/12A로 유도하였고(상단) 3B/2A로 유도한(하단) EB에서 4일차의 ALDH 활성 및 CD235a 발현을 나타내는 대표적인 유세포 계측 플롯. (d 및 e) ROH, RA, 또는 DMSO(대조군)로 48시간 동안 처리한(3~5일차) 5B/12A-유도되거나 3B/2A-유도된 20일차의 EB에서 (d) CTNT+ 세포 및 (e) MLC2V+ 세포의 비율에 대한 유세포 계측 분석(t 검정, DMSO 대조군에 대한 *p < 0.05 및 **p < 0.01; n = 4). (f 및 g) 표시된 처리로 생성된 개체군에서 20일차에 수행한 (f) 심실 유전자 및 (g) 심방 유전자의 발현 수준에 대한 qRT-PCR 분석 (n = 6) (t 검정, DMSO 대조군에 대한 *p < 0.05 및 **p < 0.01임). (h) 5B/12A 또는 3B/2A로 유도한 EB 개체군에서 20일차에 수행한 NKX2-5-CTNT+ 세포의 비율에 대한 대표적인 유세포 계측 분석. (i) 5B/12A 또는 3B/2A로 유도한 EB에서 20일차의 자발적 심박동수에 대한 정량화(n = 17)(t 검정, **p < 0.01). (j) RA가 있거나 없는(0.5 mM, 3~5일차) 가운데 5B/12A, 10B/6A, 또는 3B/2A(1~3일차)로 유도한 EB 개체군에서 20일차에 NKX2-5-CTNT+ 세포의 평균 비율을 나타내는 막대 그래프(t 검정, 표시된 샘플에 대한 *p < 0.05; n =5). 모든 PCR 분석을 위해, 발현 값을 하우스키핑 유전자 TBP에 대해 정규화하였다. 에러 막대는 SEM을 나타낸다. 도 12도 참조함.
도 6. 상이한 중배엽으로부터 유래된 심근세포의 비교. (a 및 b) 심실 유도(VI), 혼합 유도(MI, MM으로도 지칭됨), 및 심방 유도(AI) 조건하에서 및 태아 조직 대조군(n = 6)에서 유도한 EB로부터 20일차에 단리한 NKX2-5+SIRPa+CD90- 세포에서의 (a) 범-심근세포 유전자 및 (b) 심실 유전자의 발현 수준에 대한 qRT-PCR 분석 (t 검정, 표시된 샘플에 대한 *p < 0.05 및 **p < 0.01이고, F-A에 대한 F-V의 ##p < 0.01임). (c) 표시된 바와 같이 유도하고(n = 4), 미처리하였거나 RA로 처리한(3~5일차) EB로부터 20일차에 단리한 NKX2-5+SIRPa+CD90- 세포에서 심방 유전자의 발현 수준에 대한 qRT-PCR 분석 (t 검정, VI + RA에 대한 VI의 *p < 0.05 및 **p < 0.01임). (d) VI + RA 또는 AI + RA로 유도한 EB로부터 20일차에 단리한 NKX2-5+SIRPa+CD90- 세포에서 COUPTFII의 면역 염색을 나타내는 현미경 사진. 모든 심근세포를 식별하기 위해 CTNT로, 및 모든 세포를 시각화하기 위해 DAPI로 세포를 공염색하였다. 스케일 막대는 100 mm을 나타낸다. (e~g) 표시된 바와 같이 유도된 EB로부터 20일차에 단리한 NKX2-5+SIRPa+CD90- 심근세포에서의 AP 측정치. (e) 표시된 그룹으로부터 단리된 개별 심근세포에서의 자발적 AP에 대한 대표적인 기록. (f) VI (n = 18), VI + RA (n = 18), 및 AI + RA (n = 20)로 처리한 EB로부터 단리한 심근세포에서 30%/90% 재분극화(APD30/90)가 일어나는 동안의 AP의 정량화 (t 검정, 표시된 샘플에 대한 *p < 0.05 및 **p < 0.01임). (g) 기록된 AP의 분석에 기초하여 각각의 그룹에서 심방 심근세포(APD30/90 < 0.3), 심실 심근세포(APD30/90 R 0.3), 및 미성숙 심근세포(최대 업스토크 속도[dV/dtmax] < 10이고, 사이클 길이는 [CL] R 1임)의 비율을 나타내는 막대 그래프. (h 내지 j) 표시된 바와 같이 유도된 EB로부터 단리한 심근세포에서 아세틸콜린 활성 내향 정류기 칼륨 전류 밀도(inward rectifier potassium current densities, IvCh)에 대한 분석. (h) 10 mM의 카르바콜(CCh)을 적용하기 전(대조군) 및 후(CCh)에 측정된 전류 간의 차이로서 정량화된, AI + RA로 유도된 EB로부터 단리된 심근세포에서 CCh 민감성 전류(IKACh)를 나타내는 대표적인 기록(삽입: 전압 프로토콜). (i) VI EB로부터 단리된 심실 심근세포(검증된 심실 유사 AP 모양) 및 VI + RA 및 AI + RA EB로부터 단리된 심방 심근세포(검증된 심방 유사 AP 모양)에서의 IKACh 전류 밀도에 대한 전류-전압 관계. 각 그룹에서 -120 mV에서 기록된 최대 IKACh 전류 밀도의 정량화(t 검정, 표시된 샘플에 대한 *p < 0.05 및 **p < 0.01임). 모든 PCR 분석을 위해, 발현 값을 하우스키핑 유전자 TBP에 대해 정규화하였다. 에러 막대는 SEM을 나타낸다. F-V: 태아 심실 조직, F-A: 태아 심방 조직, n.s.: 무의미함. 도 13도 참조함.
도 7. 다른 hPSC 계통으로부터 심실 및 심방 심근세포의 생성 (a) 심실 조건(5B/6A, 상단) 또는 심방 조건(5B/2A, 하단) 하에 유도된 4일차 HES2-유래 EB에서 ALDH 활성 및 CD235a 발현에 대한 대표적인 유세포 계측 분석. (b) 심실 조건 또는 심방 조건하에 생성되고 ROH, RA 또는 DMSO (대조군) 처리된 상응하는 20일차 EB 개체군에서 CTNT 및 MLC2V 발현에 대한 대표적인 유세포 계측 분석. (c 및 d) 표시된 조건 하에 유도된 20일차 EB로부터 단리된 SIRPa+CD90- 세포에서 (c) 심실 유전자의 발현 수준 및 (d) 심방 유전자의 발현 수준에 대한 qRT-PCR 분석(t 검정, DMSO 대조군에 대한 *p < 0.05이고, 표시된 샘플에 대한 #p < 0.05 및 ##p < 0.01임; n = 5). (e) 심실 조건(4B/4A, 상단) 또는 심방 조건(4b/1A + SB, 하단) 하에 유도된 4일차 MSC-iPS1-유래의 EB에서 ALDH 활성 및 CD235a 발현에 대한 대표적인 유세포 계측 분석. (f) 심실 조건 또는 심방 조건 하에 생성되고 3일차에서 5일차까지 ROH, RA 또는 DMSO (대조군) 처리된 상응하는 20일차 EB 개체군에서 CTNT 및 MLC2V 발현에 대한 대표적인 유세포 계측 분석. (g 및 h) 표시된 바와 같이 유도된 20일차 EB로부터 단리된 SIRPa+CD90- 세포에서 (g) 심실 유전자의 발현 수준 및 (h) 심방 유전자의 발현 수준에 대한 qRT-PCR 분석(t 검정, DMSO 대조군에 대한 *p < 0.05 및 **p < 0.01이고, 표시된 샘플에 대한 ##p < 0.01임; n = 5). (i) hPSC로부터 인간 심방 및 심실 심근세포의 발달 모델. 본 모델에서, CD235a 및 CYP26A1 발현 또는 RALDH2 발현 및 ALDH 활성에 의해 정의된 개별 중배엽 개체군은 상이한 농도의 액티빈 A 및 BMP4에 의해 유도된다. RALDH2+ALDH+ 중배엽은 ROH에 반응하여 심방 유사 심근세포를 생성하지만, CD235a+CYP26A1+ 중배엽은 그렇지 않다. RA는 두 중배엽 개체군 모두를 심방 세동에 대해 지정한다. 그러나, CD235a+ 중배엽으로부터 지정하는 것은 RALDH2 중배엽으로부터 지정하는 것보다 덜 효율적이며, 생성된 심방 표현형은 최적에 미치지 못한다. 레티노이드 신호 전달(ROH, RA)이 없을 때, RALDH2+ 중배엽은 심실 심근세포를 낮은 효율로 생성한다. 모든 PCR 분석을 위해, 발현 값을 하우스키핑 유전자 TBP에 대해 정규화하였다. 에러 막대는 SEM을 나타낸다. SB: SB-431542 (결절성/액티빈 A/TGF-b 억제제), WNTi: WNT 억제. 도 14도 참조함.
도 8. 도 1과 관련됨. hPSC로부터 심방 유사 심근세포의 생성. (a) 분화 20일차에 SIRPα+ NKX2-5+CD90- 심근세포의 단리를 위해 사용된 세포 분류 전략을 나타내는 대표적인 유세포 계측 플롯. (b~e) 도 1d에서 열 지도(heat map)로서 표시된 QRT-PCR 분석의 그래프로서, (b) 범-심근세포의 발현 수준, (c) 심실 심근세포의 발현 수준, (d) 심방 심근세포의 발현 수준, (e) 분화 3일차와 5일차 사이에 10B/6A로 유도되고 RA 또는 DMSO(대조군) 중 하나로 처리된 EB로부터 단리된 SIRPα+NKX2-5+CD90- 심근세포에서 심장 이온 채널 및 코넥신 채널 유전자의 발현 수준(n = 5). t 검정: DMSO-대조군에 대한 *P<0.05 및 **P<0.01이고, F-A에 대한 F-V의 ##P<0.01임. (f) 분화 후 표시된 일차에 10B/6A로 유도된 전체 EB 개체군에서 레티노산 수용체 이소형(RARA, RARB, 및 RARG)의 발현 수준에 대한 QRT-PCR 분석(n=3). (g) 3일차와 5일차 사이에 DMSO(대조군), RA 또는 수용체 특이적 작용제 중 하나로 처리된 20일차 EB에서 CTNT+ 세포의 비율에 대한 유세포 계측 분석(n=3). (h) 3일차와 5일차 사이에 표시된 처리제로 처리된 20일차 EB에서 심실 특이적 유전자 MYL2의 발현 수준에 대한 QRT-PCR 분석(n=3). t 검정: DMSO-대조군에 대한 **P<0.01. 모든 PCR 분석을 위해, 발현 값을 하우스키핑 유전자 TBP에 대해 정규화하였다. 에러 막대는 SEM을 나타낸다. F-V: 태아 심실 조직, F-A: 태아 심방 조직, RA: 레티노산, AM580: RARα-작용제, AC55649: RARβ-작용제, CD437: RARγ-작용제.
도 9. 도 2과 관련됨. 10B/6A-유도 중배엽 및 3B/2A-유도 중배엽의 발달 동역학. (a) 3B/2A 및 10B/6A로 유도된 EB(20일차)의 6-웰 플레이트의 웰 당 생성된 세포의 평균 개수를 나타내는 막대 그래프(n=5). (b) 3B/2A 또는 10B/6A 중 하나로 유도한 후(1~3일차) 분화로부터 표시된 일차의 EB에서 ALDH1A1 및 ALDH1A3 알데히드 탈수소 효소 이소형의 발현 동역할에 대한 QRT-PCR 분석(n=3). (c) 3B/2A 또는 10B/6A 중 하나로 유도한 후(1~3일차) 분화로부터 표시된 일차의 EB에서 원시 스트리크 마커 T(브라큐리) 및 심원성 중배엽 마커 MESP1의 발현 동역학에 대한 QRT-PCR 분석(n=4). 모든 PCR 분석을 위해, 발현 값을 하우스키핑 유전자 TBP에 대해 정규화하였다. 에러 막대는 SEM을 나타낸다.
도 10. 3B/2A-유도 중배엽 개체군에서 ALDH 활성. 3B/2A로 유도된 4일차 EB로부터 단리된 ALDH+ PDGFRα+ (분획 I) 및 ALDH- PDGFRα+ (분획 II) 세포의 응집체로서 24시간 배양한 후 ALDH 활성에 대한 대표적인 유세포 계측 분석.
도 11. 미분류 중배엽 개체군 및 분류된 중배엽 개체군에서 GYPA 발현의 분석. (a) 분화로부터 표시된 일차에 3B/2A 및 10B/6A-유도 EB에서 GYPA의 발현 수준에 대한 QRT-PCR 분석. t 검정: 표시된 샘플에 대한 **P<0.01 (n=4). (b) 5B/4A로 유도된 4일차 EB로부터 단리된 ALDH+ (분획 IV) 및 CD235a+(분획 III) 분획에서 ALDH1A2, CYP26A1, 및 GYPA 의 발현 수준에대한 QRT-PCR 분석. 모든 PCR 분석을 위해, 발현 값을 하우스키핑 유전자 TBP에 대해 정규화하였다. t 검정: **P<0.01 (n=3). 에러 막대는 SEM을 나타낸다.
도 12. 중배엽 유도의 조작을 통한 심실 분화의 최적화.
(a 및 b) 다음의 조작(1~3일차) 이후 4일차에 EB에서의 CD235a+ 세포의 비율(좌측) 및 20일차에 EB에서의 생성된 CTNT+MLC2V+ 세포의 비율(우측)에 대한 유세포 계측 분석: (a) 10 ng/mL BMP4가 있을 때 액티빈 A 농도(2~20 ng/mL) 또는 (b) 12 ng/mL 액티빈 A가 있을 때 BMP4 농도(3~20 ng/mL) (n=6). t 검정: 표시된 샘플에 대한 *P<0.05 및 **P<0.01. (c) 5B/12A 또는 10B/6A 중 하나로 유도된 EB(20일차)의 6-웰 플레이트의 웰 당 생성된 세포의 평균 개수를 나타내는 막대 그래프(n=4). t 검정: P>0.05, n.s.: 무의미함. (d) 표시된 바와 같이 유도된 EB 개체군에서 배양으로부터 20일차 및 40일차에 CTNT+MLC2V+ 세포의 비율에 대한 유세포 계측 분석(n=3). t 검정: P>0.05, n.s.: 무의미함. 에러 막대는 SEM을 나타낸다.
도 13. 상이한 중배엽 개체군으로부터 유래된 심방 및 심실 심근세포의 특성화. (a) 심실 유도(VI), 혼합 유도(MI) 및 심방 유도(AI) 조건 하에 유도된 20일차 EB에서 MLC2V+ 세포의 비율에 대한 유세포 계측 분석. t 검정: 표시된 샘플에 대한 **P<0.01. (b) AI 및 VI로부터 생성된 20일차 EB 개체군에서 MLC2V의 면역 염색을 나타내는 현미경 사진. 모든 심근세포를 식별하기 위해 CTNT로, 및 모든 세포를 시각화하기 위해 DAPI로 세포를 공염색하였다. 스케일 막대는 100 pm을 나타낸다. (c 및 d) 표시된 바와 같이 유도되고(n=4) 태아 조직 대조군에서 유도된(n=6) 20일차 EB 개체군으로부터 단리된 NKX2- 5+SIRPα+CD90- 세포에서 (c) 심방 유전자 및 (d) 박동원 유전자의 발현 수준에 대한 QRT-PCR 분석. t 검정: VI+RA에 대한 VI, AI+RA에 대한 AI, 및 표시된 샘플에 대한 *P<0.05 및 **P<0.01이고, F-A에 대한 F-V의 **P<0.01임. (e) VI 또는 AI 조건 하에 유도되고, 3일차와 5일차 사이에 표시된 농도의 RA(0.125~4 μM)로 처리된 20일차 EB에서 NKX2-5+SIRPα+ 세포의 비율에 대한 유세포 계측 분석(n=3). (f~h) 상이한 20일차 개체군으로붙 단리된 NKX2-5+SIRPα+CD90- 세포에서 (f) 심방 유전자인 KCNSA (g) 심실 유전자인 MYL2, IRX4 및 (h) 심방 유전자인 KCNJ3, CACNAID 및 NR2F2의 발현 수준에 대한 QRT-PCR 분석. t 검정: 각 RA 농도에서 VI 샘플에 대한 *P<0.05 및 **P<0.01임 (n=4). 모든 PCR 분석을 위해, 발현 값을 하우스키핑 유전자 TBP에 대해 정규화하였다. 에러 막대는 SEM을 나타낸다. F-V: 태아 심실 조직, F-A: 태아 심방 조직, n.s.: 무의미함.
도 14. HES2 및 MSC-iPS1 hPSC로부터 유래된 심방 및 심실 심근세포의 특성화. (a) 4B/1A로 유도되고 이어서 SB-431542(SB)의 유무와 상관없이 처리된(3~5일차) MSC-iPS1-유도 EB에서 ALDH 활성 및 CD235a 발현에 대한 대표적인 유세포 계측 분석. (b~d) 심실 조건(5B/6A) 또는 심방 조건(5B/2A) 하에서 유도되고(1~3일차) 3일차와 5일차 사이에 ROH, RA 또는 DMSO(대조군)으로 처리된 20일차의 HES2-유도 EB 개체군으로부터 단리된 SIRPα+CD90- 세포에서 (b) 범-심근세포 유전자, (c) 심실 유전자, 및 (d) 심방 유전자의 발현 수준에 대한 QRT-PCR 분석. t 검정: DMSO-대조군에 대한 *P<0.05 및 **P<0.01이고, 표시된 샘플에 대한 *P<0.05 및 **P<0.01임 (n=5). (e~g) 심실 조건(4B/4A) 또는 심방 조건(4B/1A+SB) 하에서 유도되고(1~3일차) 3일차와 5일차 사이에 ROH, RA 또는 DMSO(대조군) 중 하나로 처리된 20일차의 MSC-iPS1-유도 EB로부터 단리된 SIRPα+CD90- 세포에서 (e) 범-심근세포 유전자, (f) 심실 유전자, 및 (g) 심방 유전자의 발현 수준에 대한 QRT-PCR 분석. t 검정: DMSO-대조군에 대한 *P<0.05 및 **P<0.01이고, 표시된 샘플에 대한 **P<0.01임 (n=5). 모든 PCR 분석을 위해, 발현 값을 하우스키핑 유전자 TBP에 대해 정규화하였다. 에러 막대는 SEM을 나타낸다. SB: SB-431542 (결절성/액티빈 A/TGFβ 억제제).
도 15. 심장 세포에 대한 다양한 분화 경로를 예시한 개략도.
정의
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "심실 심근세포(venticular cardiomyocytes)"는 심실 세포가 농축된 세포의 개체군, 또는 심실세포 속성(ventriculocyte properties)을 갖는 세포가 농축된 세포의 개체군을 지칭한다. 이들은 MYL2, IRX4 및/또는 상승된 수준의 NKX2-5와 같은 심실 특이적 마커를 발현하는 심근세포를 포함하고/하거나 심실 세포의 전기물리적 특성(예: 활동 전위)을 나타낸다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "심방 심근세포(atrial cardiomyocytes)"는 심방 세포가 농축된 세포의 개체군, 또는 심방 세포 유사 특성을 갖는 세포가 농축된 세포의 개체군을 지칭한다. 이들은 심방 이온 채널 유전자인 KCNJ3, NPPA, GJA5 및/또는 MYL7과 같은 심방 특이적 마커를 발현하는 심근세포를 포함하고/하거나 심방 세포의 전기물리적 특성(예: 활동 전위)을 나타낸다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "심혈관 중배엽 세포(cardiovascular mesoderm cells)" 및 "심혈관 중배엽(cardiovascular mesoderm)"은 다른 중배엽 세포에 비해 심혈관 세포로 분화하기 위한 전위가 증가한 중배엽 세포가 농축된 중배엽 세포의 개체군을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "심실 중배엽 세포(ventricular mesoderm cells)" 및 "심실 중배엽(ventricular mesoderm)"은 다른 중배엽 세포에 비해 심실 심근세포로 분화하기 위한 전위가 증가한 중배엽 세포가 농축된 중배엽 세포를 포함하는 개체군을 지칭한다. 이들은 ALDH-, RALDH2- CD235a+, CD235b+, 및 CYP26A1+ 중 하나 이상인 중배엽 세포를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "심방 중배엽 세포(atrial mesoderm cells)" 및 "심방 중배엽(atrial mesoderm)"은 다른 중배엽 세포에 비해 심실 심방 심근세포로 분화하기 위한 전위가 증가한 중배엽 세포가 농축된 중배엽 세포를 포함하는 개체군을 지칭한다. 이들은 ALDH+, RALDH2+, CD235a-, CD235b-, 및 CYP26A1- 중 하나 이상인 중배엽 세포를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "심근세포(cardiomyocyte)"는 심장 계통 세포이다. 심장 계통 세포는 일반적으로 범 심장 특이적 마커 cTNT를 발현한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "박동원 세포(pacemaker cell)"는, 박동원 활성을 가지고 동방결절성(SAN) 세포 특이적 마커를 발현하는 심근세포를 지칭한다. 박동원 세포는 일반적으로 심실 심근세포보다 빠른 심박동수를 갖는다. 박동원 세포는 NKX2-5를 발현하지 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "NKX2-5"는 NKX2-5 유전자에 의해 인간에서 암호화된 심장 호메와박스 단백질(cardial homeobox proten) NKX2-5를 지칭한다. 상기 유전자는 심장 분화(cardiac differentiation)에 관여하며, 심실 심근세포와 같은 심근세포 아형에서 발현된다. NKX2-5의 발현은 예를 들어 NKX2-5에 특이적인 항체를 사용하거나 예를 들어 NKX2-5 리포터 작제물을 사용해 측정할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "BMP 성분"은 BMP4에 대한 수용체를 활성화시키는 임의의 분자, 선택적으로는 임의의 BMP 인자 또는 성장 및 분화 인자(GDF), 또는 소분자를 의미하며, 예를 들어 BMP4 및/또는 BMP2를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "BMP4"(예: 유전자 ID 652)는 예를 들어 BMP4 수용체 신호 전달을 활성화시킬 수 있는 뼈형성 단백질(Bone Morphogenetic Protein) 4(예: 인간 BMP4)를 비롯하여 이의 활성 접합체(active conjugates) 및/또는 단편을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "본질적으로 박동원 세포가 없는(essentially free of pacemaker cells)"은 총 세포 중 박동원 세포가 5% 미만, 1% 미만, 0.5% 미만, 0.1% 미만, 0.01% 미만, 0.001% 미만, 0.0001% 미만이거나, 박동자 세포가 전혀 없는 심근세포의 개체군, 또는 현재 이용 가능한 검출 방법을 통해서는 박동원 세포를 검출할 수 없는 심근세포의 개체군을 지칭한다. 임의의 이론에 구속되고자 하는 것은 아니지만, 박동원 세포가 환자에게 도입된 경우, 심실세포의 개체군 내 박동원 세포의 존재가 근육의 독립적이고 개별적인 수축을 유도할 수 있다고 가정한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "액티빈 성분"은, 결절 신호 전달(nodal signal transduction)을 활성화시키고, 선택적으로는 액티빈 A 및/또는 결절 성분과 같은 액티빈 A 활성을 갖는 하나 이상의 성분, 또는 상기 성분(들)을 포함하는 조성물을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "액티빈" 또는 "ActA"는 인간 액티빈 A와 같이 결절 신호 전달을 활성화시킬 수 있는 "액티빈 A(예: 유전자 ID 3624)"를 비롯하여 이의 활성 접합체 및 단편, 또는 소분자를 지칭한다.
용어 "레티노산" 또는 "RA"는 레티노산을 의미한다.
용어 "레티노산 성분"은 비타민 A의 작용을 매개하는 화합물을 포함하며, 예를 들어 전-트랜스(all-trans) RA(예: Sigma R2625), 9-시스 RA(예: Sigma R4643), 및 레티놀(예: Sigma R7632)를 비롯하여 RA 유사체(예: RAR 작용제), 예컨대 선별적 RARα 작용제(Tocris 0760)인 AM580, 선별적 RARA 작용제(Tocris 2436)인 AC55649, 및 선별적 RARy 작용제(Tocris 1549)인 CD437을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "배아체 배지(embryoid body medium)"는 응집체(예: 완전한 3배엽 세포로 분화될 전위를 가진 PSC의 부유 응집체) 형성 또는 PSC의 배아체 형성을 뒷받침하는 배양 배지이며, StemPro 34(ThermoFisher), MesoFateTM(Stemgent), RPMI(ThermoFisher 및 타사), HES-배지(넉아웃 혈청이 치환된 DMEM/F12, ThermoFisher 및 타사)와 같은 최소 배지를 포함하고, 예를 들어 BMP 성분(선택적으로는 BMP4)을 포함하며, 선택적으로는 Rho-관련 단백질 키나제(ROCK) 억제제를 추가적으로 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "배아체 응집 단계(embryoid aggregation phase)"는 응집되지 않은 hPSC가 예를 들어 본원에 기술된 배아체 배지와 함께 배양되고, BMP 성분으로 처리되는 기간뿐만 아니라 배아체와 같은 응집체(예: 완전한 3배엽의 세포로 분화될 수 있는 PSC의 응집체)를 생성하는 ROCK 억제제 및/또는 다른 성분으로 선택적으로 처리되는 기간을 의미한다. 성분으로 처리하는 것은 동시에 이루어지거나, 중첩되거나, 개별적으로 이루어질 수 있다. 예를 들어, 제1 성분이 배지에 포함될 수 있고, 제2 성분은 배아체 응집 단계 동안에 배지에 첨가될 수 있다.
용어 "중배엽 유도 배지(mesoderm induction medium)"는 심혈관 중배엽 세포의 형성을 뒷받침하는 배양 배지를 포함할 수 있으며, StemPro 34(ThermoFisher), MesoFateTM(Stemgent), 및 RPMI(ThermoFisher 및 타사)와 같은 최소 배지를 포함한다. 중배엽 유도 배지는 BMP 성분(선택적으로는 BMP4), 액티빈 성분(선택적으로는 액티빈 A)과 같은 추가 성분을 포함할 수 있고, bFGF와 같은 다른 성분을 포함할 수 있다. 중배엽으로부터 생성된 심근세포의 바람직한 세동에 따라, BMP 성분 및 액티빈 성분 각각의 상이한 농도가 본원에서 교지된 바와 같이 조절될 수 있다.
용어 "중배엽 유도 단계(mesoderm induction phase)"는 PSC가 중배엽 세포로 분화되도록 PSC를 BMP 성분 및 액티빈 성분으로 처리하는 것뿐만 아니라 FGF 성분 및/또는 다른 성분으로 선택적으로 처리하는 것을 포함하여, PSC를 중배엽 유도 배지와 함께 배양하는 기간을 기술하는 것일 수 있다. BMP 및 액티빈 성분으로 처리하는 것은 동시에 이루어지거나, 중첩되거나, 개별적으로 이루어질 수 있다. 예를 들어, 제1 성분이 중배엽 유도의 착수 시점에 배지에 포함될 수 있고, 제2 성분은 중배엽 유도 단계 도중에 배지에 첨가될 수 있다.
용어 "심장 유도 배지(cardiac induction medium)"는 중배엽 세포로부터 심장 간세포(cardiac progenitor cells)의 유도를 뒷받침하는 배양 배지, 예컨대, WNT 억제제, 선택적으로 IWP2, VEGF 및/또는 선택적으로 액티빈 억제제/결절성 억제제, 선택적으로 SB-431542를 포함하는 StemPro-34 최소 배지를 예를 들어 포함할 수 있다. 바람직한 세포 유형에 따라, 심장 유도 배지는 BMP 성분, 레티노산, FGF 억제제 또는 FGF 성분을 포함할 수도 있다. 심장 유도 배지(표준 심장 유도 배지로도 지칭됨)의 일 구현예는 0.5 pM의 IWP2, 10 ng/mL의 VEGF, 및 선택적으로 5.4 pM의 SB-431542를 함유하는 StemPro-34이다. 사용할 수 있는 다른 최소 배지는 MesoFateTM(Stemgent) 및 RPMI(ThermoFisher 및 타사)를 포함한다.
용어 "심장 유도 단계(cardiac induction phase)"는 중배엽 세포가 심장 유도 배지와 함께 배양될 때 심장 간세포로 분화되도록 유도되고, 예를 들어, 심혈관 간세포를 생성하는 BMP 성분과 RA뿐만 아니라 선택적으로 FGF 억제제 또는 FGF 성분 및/또는 다른 성분으로 처리되는 기간을 기술하도록 사용될 수 있다. 처리는 동시에 이루어지거나, 중첩되거나, 개별적으로 이루어질 수 있다. 예를 들어, 제1 성분이 배지에 포함될 수 있고, 제2 성분은 심장 유도 단계 동안에 배지에 첨가될 수 있다.
용어 "기본 배지(basic medium)"는 심혈관 간세포 및 심근세포의 형성을 뒷받침하는 배양 배지를 포함할 수 있으며, StemPro 34(ThermoFisher), MesoFateTM(Stemgent), 및 RPMI(ThermoFisher 및 타사), 및 예를 들어 VEGF와 같은 최소 배지를 포함한다. 기본 배지의 예는 실시예 1에 제공된다.
용어 "기본 단계(basic phase)"는 심혈관 간세포가 기본 배지와 함께 배양되고, 심근세포를 생성하는 VEGF 및/또는 다른 성분으로 처리되는 기간을 지칭하도록 사용될 수 있다. 처리는 동시에 이루어지거나, 중첩되거나, 개별적으로 이루어질 수 있다.
용어 "인큐베이팅(incubating)"은 세포의 개체군을 유지시키고/시키거나 증식시키는 임의의 시험관 내(in vitro) 방법을 포함할 수 있으며, 주변 조건이 인큐베이터에서와 같이 조절되는 단층 배양(monolayer culture), 비드 배양(bead culture), 플라스크 배양(flask culture), 또는 3D 배양(3D culture)을 선택적으로 포함하고, 선택적으로는 세포의 계대 배양(passaging of cells)을 포함한다. 하나 이상의 성분과 함께 세포를 인큐베이팅하는 것을 포함하는 단계에 있어서, 상기 성분은 동시에 첨가되거나, 상이한 시간에 첨가되거나, 중첩되는 기간 동안 첨가되거나, 개별 기간 동안 첨가될 수 있다. 세포의 인큐베이팅이 시작된 후에 하나의 인자(factor)가 예를 들어 유도 배지에 첨가되거나, 상기 인자는 배지가 세포에 첨가되기 전에 배지에 첨가될 수 있다. 또한, 예를 들어 이전 인큐베이션으로부터의 성분의 수준을 감소시키기 위해 인큐베이션 사이에 세포가 세척될 수 있다.
용어 "배양(culturing)"은 적어도 하나의 세포 분열을 통해 세포의 개체군을 유지시키고 증식시키는 임의의 방법을 포함할 수 있으며, 주변 조건이 인큐베이터에서와 같이 조절되는 단층 배양(monolayer culture), 비드 배양(bead culture), 플라스크 배양(flask culture), 또는 3D 배양(3D culture)을 선택적으로 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "농축된(enriched for)"은 농축된 세포 유형의 적어도 50%, 적어도 60%, 또는 적어도 70% 내지 100%를 포함하는 것을 의미한다. 일 구현예에서, 농축은 본원에 기술된 방법을 사용하여 20일차의 배양물에서 측정된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "대상체(subject)"는 포유동물을 포함하는 동물계의 모든 구성원을 포함하며, 적절하게는 인간을 지칭한다.
세포에 적용될 때의 용어 "처리(treat, treating, treatment)" 등은 세포가 임의 종류의 프로세스 또는 조건을 거치도록 하는 것, 또는 세포에 대해 임의 종류의 조작 또는 절차를 수행하는 것을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 대상체에 적용될 때의 용어 "치료(treatment)"는 임상 결과를 포함하여 유익하거나 원하는 결과를 획득하는 것을 목표로 하는 접근법을 지칭하며, 약물적 중재나 비약물적 중재를 포함하는 의료 절차 및 의료 적용을 포함한다. 일 구현예에서, 치료는 접종을 목적으로 제품을 투여하는 것을 지칭한다. 유익하거나 원하는 임상 결과는, 검출 가능한지의 여부와 상관없이, 하나 이상의 증상 또는 병태의 완화 또는 개선, 질환 범위의 축소, 안정화된(또는 악화되지 않는) 질환 상태, 질환 확산의 방지, 질환 진행의 지연 또는 둔화, 질환 상태의 개선 또는 일시적 완화, 및 (부분적 또는 전체적) 차도를 포함할 수 있지만, 이들로 한정되지는 않는다. "치료"는, 치료를 받지 않았을 경우의 예상 생존과 비교해 생존을 연장시키는 것을 의미할 수도 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "심부전(heart failure)"은 대상체의 심장이 대상체의 신체에서 적절한 혈류가 유지하도록 충분하게 펌핑할 수 없는 상태를 지칭한다. "심부전의 위험이 있는" 대상체란 심부전에 선행하는 것으로 알려진 하나 이상의 특징을 가지고 있는 대상체를 지칭한다. 예를 들어, 심부전의 위험이 있는 대상체는 관상 동맥 질환, 심근 경색(심장 마비) 전력, 고혈압, 심방세동, 심장 판막증, 과도한 알코올의 사용, 흡연, 비만, 수면성 무호흡, 감염(바이러스성 및/또는 세균성), 심근증, 심근염, 선천성 심장병, 부정맥, 및/또는 다른 질환, 예컨대, 당뇨병, 갑상선 기능 항진증, 갑상성 기능 저하증, 혈색소 침착증 및/또는 유전분증(이들로 한정되지는 않음)을 가진 적이 있거나 가지고 있을 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "심근 경색(myocardial infarction 및 MI)"은 심장의 일부분에 대한 혈류가 감소하거나 중단됨으로써 산소 공급의 결핍(국소 빈혈)으로 인한 심근세포의 사멸을 초래하여 심장 근육을 손상시키는 이벤트를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "투여(administering)", "도입(introducing)" 및 "이식(transplanting)"은, 도입된 세포를 원하는 부위에 적어도 부분적으로 편재화시키는 방법 또는 경로에 의해 세포를 대상체 내에 전달하는 것의 맥락에서 상호 교환 가능하게 사용된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "다능성 줄기 세포(pluripotent stem cell 또는 PSC"는 상이한 조건 하에서 3배엽 세포를 특징으로 하는 세포 유형 중 임의의 하나로 분화될 수 있는 능력을 가진 세포를 지칭하며, 배아 줄기 세포 및 유도된 다능성 줄기 세포를 포함한다. 다능성 세포는, 예를 들어, 무모 마우스 기형종 형성 분석법(nude mouse teratoma formation assay)을 사용해 둘 이상의 세포로 분화하는 능력을 특징으로 한다. 다능성(pluripotency)은 배아 줄기(ES) 세포 마커의 발현에 의해서도 증명된다. 본원에서 사용된 바와 같이, 다능성 줄기는 유도된 다능성 줄기 세포(iPSC) 및 배아 줄기 세포(ESC)를 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 용어 "배아 줄기 세포"는 인간 배아와 같은 배아의 파괴를 수반하는 줄기 세포는 배제한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "iPSC" 및 "유도된 다능성 줄기 세포"는 상호 교환 가능하게 사용되며, 예를 들어, 하나 이상의 유전자(예를 들어, POU4F1/OCT4 (유전자 ID 5460)를 SOX2 (유전자 ID 6657), KLF4 (유전자 ID 9314), cMYC (유전자 ID 4609), NANOG (유전자 ID 79923), LIN28/ LIN28A (유전자 ID 79727)와 조합으로 포함하되, 이들로 한정되지 않음)의 발현을 유도하는 것에 의해 일반적으로는 성체 체세포인 비-다능성 세포로부터 인공적으로 (예를 들어, 유도되거나, 완전한 역전(complete reversal)에 의해) 유래된 다능성 줄기 세포를 지칭한다.
본 발명의 방법에 의해 제조되거나, 농축되거나, 단리된 심근세포는 다능성 줄기 세포로부터 유래된다. 예를 들어, 환자의 세포는 사용되기 전에, 본원에 기술된 분화 인자에 이들이 노출되기 전, 도중, 또는 후에 이들의 분화 상태를 조절할 수 있는 유전자 도입을 통해 유전적으로 변형될 수 있다. 환자의 자가 조직으로부터 유래되고, 본원에 기술된 방법에 사용하기에 적합한 다능성 줄기 세포는 줄기 세포 유래의 분화된 조직 이식편과 환자와의 호환성을 향상시킨다.
용어 "배아 줄기 세포"는 배아 배반포(embryonic blastocyst)의 속세포덩이(inner cell mass)의 다능성 줄기 세포를 지칭하도록 사용된다(예를 들어, 미국 특허 제5,843,780호, 제6,200,806호 참조). 이러한 세포는 체세포 핵이식으로부터 유래된 배반포의 속세포덩이로부터 수득될 수도 있다(예를 들어, 미국 특허 제5,945,577호, 제5,994,619호, 제6,235,970호 참조). 배아 줄기 세포의 구별되는 특징이 배아 줄기 세포 표현형을 정의한다. 따라서, 세포가 다른 세포와 구별될 수 있도록 배아 줄기 세포의 고유 특징 중 하나 이상을 가지는 경우, 해당 세포는 배아 줄기 세포의 표현형을 갖는다. 예시적인, 구별되는 배아 줄기 세포의 특징은 유전자 발현 프로파일, 증식 능력, 분화 능력, 특정 배양 조건에 대한 반응성 등을 포함하되 이들로 한정되지 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, 다능성 줄기 세포는 줄기 세포 특이적 프로모터(예: Oct-4) 또는 심근세포 분화를 유도하도록 상향 조절될 수 있는 유전자의 조절에 의해 선별 마커를 발현하는 벡터의 도입을 통해서도 유전적으로 변형될 수 있다. 줄기 세포는, 마커 또는 유전자가 임의의 배양 단계로 운반되도록 임의의 단계에서 마커 또는 유전자를 사용해 유전자 변형될 수 있다. 마커는 배양의 임의 단계에서 분화되었거나 미분화된 줄기 세포 개체군을 정제하거나 농축시키는 데 사용될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "약제학적으로 허용 가능한 담체(pharmaceutically acceptable carrier)"는, 약제학적 조성물의 생물학적 활성의 효과를 해치지 않으면서 본질적으로는 화학적으로 비활성이면서 비독성인 조성물을 포함한다. 적절한 약제학적 담체의 예는 물, 식염수, 글리세롤 용액, 에탄올, N-(1(2,3-디올레일옥시)프로필)-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드 (DOTMA), 디올레실포스파티딜-에탄올아민 (DOPE), 및 리포솜을 포함하되, 이들로 한정되지 않는다. 이러한 조성물은 대상체에게 직접 투여하기 위한 형태를 제공하도록 화합물(들)의 치료 유효량을 적당량의 담체와 함께 함유해야 한다.
본 개시의 범주를 이해함에 있어서, 본원에 사용된 바와 같은 용어 "농도(concentration)"는 예를 들어 BMP4, 액티빈 A, 레티노산과 같은 물질의 배지에서의 최종 농도를 의미한다. 달리 표시되지 않는 한, 농도는 중량/부피의 비를 기준으로 한다.
본원에 사용된 바와 같이, "실질적으로(substantially)", "약(about)" 및 "대략(approximately)"과 같이 정도를 나타내는 용어는 최종 결과가 유의하게 변화되지 않도록, 수정된 조건(modified term)에 대한 적당량의 편차를 의미한다. 이러한 편차로 인해 수정되는 단어의 의미가 무효화되지 않는 경우, 정도를 나타내는 이들 용어는 수정된 조건에 대해 적어도 +5%의 편차를 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
본원에서의 종단점에 의한 수치 범위는 그 범위 내에 포함된 모든 수 및 분수를 포함한다(예를 들어, 1 내지 5는 1, 1.5, 2, 2.75, 3, 3.90, 4, 및 5를 포함함). 또한, 모든 수 및 이의 분수는 용어 "약"에 의해 수정되는 것으로 추정된다는 것을 이해해야 한다. 또한, 내용이 명확히 달리 지시되지 않는 한, "단수 표현(a, an 및 the)"은 복수 지시 대상을 포함한다는 것을 이해해야 한다. 용어 "약"은 기준이 만들어지는 숫자의 +/-0.1 내지 +/-50%, +/-5~50%, 또는 +/-10~40%, 바람직하게는 +/-10~20%, 더 바람직하게는 +/-10% 또는 +/-15%를 의미한다.
또한, 특정 섹션에 기술된 정의 및 구현예는, 당업자가 이해할 수 있는 바와 같이, 이들이 적합한 것으로 기술된 본원의 다른 구현예에 적용될 수 있도록 의도된다. 예를 들어, 다음 단락에서, 본 발명의 상이한 양태들이 보다 상세하게 정의된다. 그렇게 정의된 각각의 양태는 명확히 반대로 표시되지 않는 한, 임의의 다른 양태 또는 양태들과 조합될 수 있다. 특히, 바람직하거나 유리한 것으로 표시된 임의의 특징이 바람직하거나 유리한 것으로 표시된 임의의 다른 특징 또는 특징들과 조합될 수 있다.
양태 및 구현예
일 양태에서, 심방 심근세포가 농축된 심근세포의 개체군을 생산하는 방법이 제공되며, 상기 방법은: i. 응집체 및/또는 배아체를 생성하기에 적합한 배지에서 다능성 줄기 세포를 인큐베이팅하는 단계; ii. 중배엽 유도에 적합한 배지에서 줄기 세포를 추가로 인큐베이팅하는 단계로서, 상기 배지는 적어도 BMP 성분(선택적으로는 BMP4), 및 액티빈 성분(선택적으로는 액티빈 A)를 포함하고, BMP 성분과 액티빈 성분은 3:2의 비율로 제공되는 것인 단계; iii. 레티노산을 세포에 추가로 첨가하는 단계로서, 레티노산의 상기 첨가는 중배엽 유도 단계 또는 심혈관 지정 단계 도중에 첨가되는 것인 단계; 및 iv. 상기 세포를 적합한 배지(들)에서 지속적으로 성장시켜 심근세포의 개체군을 생성하는 단계로서, 상기 심근세포의 개체군은 심방 심근세포에 대해 농축되는 것인 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, BMP와 액티빈의 비율은 1.5:1.0 (또는 3:2)이다.
일부 구현예에서, 상기 BMP 성분은 BMP4이고, 액티빈 성분은 액티빈 A이고, BMP4의 농도는 3 ng/mL이며, 액티빈 A의 농도는 2 ng/mL이다. 일부 구현예에서, 상기 레티노산 성분은 트랜스 레티노산이며, 약 50 nm 내지 5 μM의 농도로 첨가된다. 일부 구현예에서, 상기 레티노산 성분은 약 500 nm의 농도로 첨가된다.
일부 구현예에서, BMP 성분 및 액티빈 성분은 프로세스의 1일차에 첨가된다. 일부 구현예에서, 레티노산 성분은 프로세스의 3일차에 첨가된다. 일부 구현예에서, 추가 BMP 성분은 프로세스의 3일차에 배지에 첨가되지 않는다.
일부 구현예에서, FGF 억제제는 프로세스의 3일차에 배지로부터 배제된다. 일부 구현예에서, 상기 프로세스에 의해 생산된 세포는 시험관 내 분석에 사용되어 잠재적 치료 화합물이 야기할 수 있는 심장 독성에 대해 스크리닝된다.
일 양태에서, 심방 심근세포가 농축된 심근세포의 단리된 개체군이 제공되며, 상기 농축된 심방 심근세포는 본원에 기술된 방법에 따라 바람직하게 수득된 적어도 또는 약 50%의 심방 심근세포, 적어도 또는 약 60%의 심방 심근세포, 적어도 또는 약 70%의 심방 심근세포, 적어도 또는 약 80%의 심방 심근세포, 또는 적어도 또는 약 90%의 심방 심근세포를 포함한다. 일 양태에서, 심실 심근세포가 농축된 심근세포의 개체군을 생산하는 방법이 제공되며, 상기 방법은: i. 응집체(배아체)를 생성하기에 적합한 배지에서 다능성 줄기 세포를 인큐베이팅하는 단계; ii. 중배엽 유도에 적합한 배지에서 응집된 줄기 세포를 인큐베이팅하는 단계로서, 상기 배지는 적어도 BMP 성분(선택적으로는 BMP4), 및 액티빈 성분(선택적으로는 액티빈 A)을 포함하고, 액티빈 성분의 농도는 BMP 성분의 농도보다 더 높은 것이 단계; 및 iii. 상기 세포를 적합한 배지(들)에서 지속적으로 성장시켜 심근세포의 개체군을 생성하는 단계로서, 상기 심근세포의 개체군은 심실 심근세포에 대해 농축되는 것인 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, BMP와 액티빈의 상기 비율은 약 0.3:1.0, 약 0.5:1.0(또는 1:2), 또는 약 0.8:1.0이다.
일부 구현예에서, BMP 성분의 농도 및/또는 액티빈 성분의 농도는 CD235a의 수준을 측정하고 이를 RALDH2의 수준과 비교함으로써 결정된다.
일부 구현예에서, 액티빈 성분의 농도는 RALDH2 발현 중배엽 세포와 비교해 더 많은 CD235a 발현 세포를 우선적으로 생성하는 농도에 기초하여 선택되며, BMP 성분은 액티빈 성분의 농도보다 더 낮은 농도를 달성하도록 첨가된다. 일부 구현예에서, BMP 성분은 유도된 중배엽으로부터 최적의 심형성(cardiogenesis)을 달성하도록 첨가된다.
일부 구현예에서, 상기 BMP 성분은 BMP4이고, 액티빈 성분은 액티빈 A이고, BMP4의 농도는 3~20 ng/mL이고, 액티빈 A의 농도는 4~20 ng/mL이며, 액티빈 A의 농도는 BMP4의 농도보다 더 높다. 일부 구현예에서, BMP4의 농도는 10 ng/mL이며 액티빈 A의 농도는 12 ng/mL이다.
일 양태에서, 심실 심근세포가 농축된 단리된 심근세포 개체군이 제공되며, 상기 농축된 심실 심근세포는 본원에 기술된 방법에 따라 바람직하게 수득된 적어도 또는 약 30%의 심실 심근세포, 적어도 또는 약 40%의 심실 심근세포, 적어도 또는 약 50%의 심실 심근세포, 적어도 또는 약 60%의 심실 심근세포, 적어도 또는 약 70%의 심실 심근세포, 적어도 또는 약 80%의 심실 심근세포, 또는 적어도 또는 약 90%의 심실 심근세포를 포함한다. 일 양태에서, 심실 심근세포가 농축된 단리된 심근세포 개체군은 본질적으로 박동원 세포가 없다. 일 양태에서, 심실 심근세포가 농축된 단리된 심근세포 개체군은 박동원 세포가 전혀 없다.
본 발명에 따른 단리된 심근세포 개체군은 심혈관계 및 임의의 다른 질병의 치료에 사용하기 위한 잠재적 치료 활성제의 잠재적 심장 독성에 대한 스크리닝을 위한 방법에 사용될 수 있다. 예를 들어, 이들은 심혈관계 적용하기 위한 약물의 스크리닝에 사용될 수 있는 세포의 공급원을 제공하고; 이들은 심장 기능을 회복하고, 허혈성 심장을 복구하고/하거나 관상 맥관구조(coronary vasculature)를 재생성하기 위한 치료 목적으로 사용될 수 있는 세포의 공급원을 제공하고; 심장 또는 관상 맥관구조의 구성 요소가 필요할 때, 이들은 조직 공학의 목적으로 사용될 수 있으며; 이들은 심혈관의 발달 및 심혈관계 질환의 연구를 위한 조사 도구로서 사용될 수 있다. 본 발명의 방법에 따라, 활성제의 스크리닝에 사용되는 단리된 심근세포 개체군은, 예를 들어, 심실 심근세포가 농축된 심근세포 개체군을 포함할 수 있다. 이러한 심실 심근세포 개체군은, 선택적으로, 박동원 세포가 본질적으로 없거나, 박동원 세포가 전혀 없는 개체군을 포함한다. 본 발명의 방법에 따라, 활성제의 스크리닝에 사용되는 단리된 심근세포 개체군은, 심방 심근세포가 농축된 심근세포 개체군도 포함할 수 있다. 시험 화합물 또는 제제의 잠재적 심장 독성을 스크리닝하거나 평가하기 위한 이러한 방법은 본 발명에 따른 심근세포 개체군을 세포 독성의 시험 대상인 화합물에 노출시키는 단계를 포함한다. 평가할 효과는 세포의 생존력, 수축력, 막 전위 및/또는 다른 기능성의 변화를 포함한다.
본 발명의 방법을 사용해 생산된 심근세포 및 심근세포 간세포 개체군은 이식, 세포 요법 또는 유전자 요법에 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명은 분화된 세포를 제공하는데, 상기 세포는 본 발명의 방법을 사용해 생산되며, 치료 목적으로, 예컨대, 심장 복구를 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법에 사용될 수 있다. 예를 들어, 치료적 복구는 심장 복구를 필요로 하는 대상체, 예컨대 심장 질환이나 병태를 앓고 있는 대상체에서 심장 기능을 전체적으로 또는 부분적으로 회복하는 것을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 심장 질환 또는 병태를 치료하거나 예방하는 방법이다. 심장 질환은 일반적으로 심장 기능 저하와 연관되어 있으며, 심근 경색, 심장 비대 및 심장 부정맥과 같은 병태를 포함하되, 이들로 한정되지는 않는다. 본 발명의 본 양태에서, 상기 방법은 심장 복구를 필요로 하는 대상체 내에 본 발명의 단리된 분화된 심실 심근세포 및/또는 심실 심근세포로 분화될 수 있는 세포를 도입하는 단계를 포함한다. 단리된 심근세포는 대상체의 손상된 심장 조직 내에 이식될 수 있다. 이상적으로는, 상기 방법은 환자에서 일부 또는 모든 심장 기능을 회복시킨다.
일 양태에서, 심부전을 가진 대상체를 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 본원에 기술된 심실 심근세포의 개체군을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 대상체는 심근 경색을 앓고 있다. 일부 구현예에서, 심근 경색은 환자의 심실에 있는 것이고, 개체군은 본원에 기술된 바와 같다.
일 양태에서, 심부전을 가진 대상체나 심부전의 위험이 있는 대상체의 치료에 사용하기 위한, 본원에 기술된 심실 심근세포의 개체군이 제공된다. 일 양태에서, 심부전을 가진 대상체나 심부전의 위험이 있는 대상체의 치료에 사용하기 위한, 본원에 기술된 심실 심근세포의 개체군의 용도가 제공된다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 심장 조직을 복구하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 본 발명의 단리된 심실 심근세포 또는 심장 간세포 및/또는 본 발명의 방법을 사용해 치료할 때 심실 심근세포로 분화될 수 있는 세포를 환자의 손상된 심장 조직 내에 도입하는 단계를 포함한다.
환자는 심장 질환 또는 병태를 앓고 있을 수 있다. 심장 조직을 복구하는 본 발명의 방법에서, 단리된 심근세포는 환자의 손상된 심장 조직 내로 이식될 수 있다. 이상적으로는, 상기 방법은 환자에서 적어도 일부 심장 기능을 회복시킨다.
일 구현예에서, 본원에 개시된 심실 심근세포는 심근 경색 후 급성기 동안 또는 심부전의 만성 단계 동안 환자에게 투여된다. 세포는 직접 투입이나 카테터 기반 전달법에 의해 심실의 손상 부위에 투여된다. 예를 들어, 세포는 조직 내에서 세포의 안착, 생존 및/또는 이식을 돕는 약제학적으로 허용 가능한 담체, 히드로겔(hydrogels) 또는 스캐폴드(scaffolds)와 함께 제형될 수 있다. 세포 투여량은, 예를 들어, 투여 당 약 5억 내지 20억개의 세포를 포함할 수 있다. 세포는 대상체를 치료하기 위해 하나 이상의 시점에 단일 투여량 또는 다중 투여량으로 대상체에게 투여될 수 있다.
본 발병은 바람직하게는 본 발명의 방법을 사용해 심근세포 또는 심장 간세포로 분화된 줄기 세포의 심장 기능 회복 능력을 시험하기 위한 심근염 모델을 제공한다. 생체 내에서 심근세포 이식의 효과를 시험하기 위해서는, 심장 기능에 대한 측정 가능한 파라미터를 가진 재현 가능한 동물 모델을 갖는 것이 중요하다. 사용되는 파라미터는 이식의 효과가 적절히 결정될 수 있도록 대조군과 실험 동물을 명확하게 구분해야 한다[예를 들어, Palmen 등, (2001), Cardiovasc. Res. 50, 516-524 참조]. PV 관계는 심장의 펌핑 능력에 대한 척도이며, 이식 후 변경된 심장 기능의 판독 값으로서 사용될 수 있다.
일 양태에서, 세포의 개체군에서 심방 중배엽을 검출하기 위한 프로세스가 제공되며, 상기 프로세스는 RALDH2를 검출하는 단계를 포함하며, RALDH2의 존재는 심방 중배엽을 나타낸다. 일 양태에서, 세포의 개체군에서 심실 중배엽을 검출하기 위한 프로세스가 제공되며, 상기 프로세스는 CD235a 및/또는 CYP26A1을 검출하는 단계를 포함하며, CD235a 및/또는 CYP26A1의 존재는 심실 중배엽을 나타낸다.
ALDH, 바람직하게는 RALDH2, 및/또는 CD235a 및/또는 CD235b, 및/또는 CYP26A1 발현에 각각 기초하여 심방 또는 심실 중배엽을 식별하기 위한 본 발명의 방법이 제공된다. 보다 구체적으로는, 이들은 심방 또는 심실 세포 개체군의 심근세포 증식, 생존, 기능 및 분화에 영향을 미치는 중배엽 세포에 의해 생성된 분비 인자의 식별에 사용될 수 있다. 예를 들어, 심방 또는 심실 심근세포 개체군의 식별을 위한 본 발명의 방법은, 심방 및 심실 중배엽 분화 둘 다를 분자 수준에서 이해하고, 분화를 조절하는 신약 표적(예: 신호 전달 경로)을 식별하기 위한 시스템을 제공한다.
본원에 개시된 구현예 중 하나 이상에 따르면, 레티노산(RA)은 특정 발달 시간 윈도우 내에서 심방 심근세포를 지정하는데, 3~5일차부터 중배엽에 RA를 적용하면 심방 심근세포가 지정된다. RA 농도 범위: 50 nM ― 5 μM. RA 공급원: 전-트랜스 RA, 레티노 수용체(RAR) 작용제(-α의 경우 AM580, -β의 경우 AC55649, -γ의 경우 CD437), 작용제 농도: AM580의 경우 3~300 nM; AC55649의 경우 0.025~2.5 μM; CD437의 경우 0.05~5 μM.
RALDH2(레티날디하이드로게나아제, 또는 Aldefluor)는 심방 중배엽에 대한 마커이다. RALDH2+ 세포의 비율은 심방 분화를 최적화하기 위한 aldefluor 분석법을 사용하는 것에 의해 모니터링된다. 분석 일수: 2~6일차
1일차에 액티빈 A 및 BMP4를 사용해 중배엽을 조기 유도하면 RALDH2+ 중배엽의 비율은 4일차에 결정된다. 유도 조건은 저 BMP (1~5 ng/mL BMP) 및 저 액티빈 A(0.1~4 ng/mL)이며, 3 ng/mL BMP/2ng/mL 액티빈 A(3B/2A)가 가장 흔하게 사용된다.
RALDH2의 기능성은 심방 3~5일차에 표현형을 유도하기에 충분한 레티놀(ROH) 처리에 의해 나타난다. (레티놀은 RALDH2에 의해 RA로 변환되고, RA는 심방 표현형을 나타냄). 글리코포린 A(CD235a)는 심실 중배엽에 대한 마커이다. CD235a는 심실 중배엽 상에서 전적으로 발현되며 RALDH2 심방 중배엽에는 존재하지 않는다. CD235a+ 세포는 RALDH2를 발현하지 않는다. CD235a+ 세포는 RA를 분해하는 효소인 CYP26A1을 발현하여 RA 신호 전달을 길항시키고 심실 표현형이 정립되도록 한다. 분석 일수: 2~6일차
1일차에 액티빈 A 및 BMP4를 사용해 중배엽을 조기 유도하면 CD235a+ 중배엽의 비율은 4일차에 결정된다. 유도 조건은 고 BMP(5~20 ng/mL BMP), 및 고 Activin(6~20 ng/mL)이며, 10 ng/mL BMP/12 ng/mL 액티빈 A(10B/12A)가 가장 흔하게 사용된다. 3~5일차에 레티놀(ROH)로 CD235a+ 세포를 처리하는 것은 심방 표현형을 유도하기에 충분하지 않다. (이들 세포는 레티놀을 RA로 변환할 수 없으므로, 세포는 심실 표현형으로 발달됨). CD235a+ 세포는 MLC2V+ 심실 심근세포가 고도로 농축된 개체군을 생성시킨다.
심방 및 심실 심근세포는 2개의 구별되는 중배엽 하위 개체군으로부터 유래된다. 심실 분화는 4일차의 CD235a+ 세포 및 20일차의 MLC2V+/ CTNT+ 세포의 병합에 의해 모니터링된다. 심방 분화는 4일차의 AF+ 세포 및 20일차의 MLC2v+/ CTNT+ 세포의 병합에 의해 모니터링된다. 심실 심근세포(10B/12A)로부터 유래된 20일차의 개체군은 심방 중배엽(3B/2A)로부터 유래된 것들에 비해 더 높은 비율의 MLC2v+ 심실 심근세포를 함유한다.
유전자 발현 분석 및 단일 세포 패치 클램프 분석(patch clamp analysis)은 RA 처리에 의해 심방 중배엽(3B/2A+RA)으로부터 생성된 20일차의 RA 처리에 의해 개체군은 심실 중배엽(10B/12A+RA)으로부터 생성된 20일차의 개체군에 비해 더 높은 비율의 심방 심근세포를 함유한다는 것을 보여주었다.
원하는 심근세포 하위 유형에 대해 농축시킬 적절한 중배엽 하위 개체가 지정되어야 한다. 심근 경색 후 세포 대체 요법을 위한 심실 심근세포 지정을 위한 개선된 프로토콜. CD235a+ 심실 중배엽(10B/12A)은 박동원 세포가 전혀 없는 MLC2v+ 심실 심근세포가 고도로 농축된 개체군을 발생시킨다. 그 결과 자발적인 박동 속도는 다른 이종성 심근세포 개체군과 비교해 더 낮아진다.
이들은 심근 경색 이후의 세포 대체 요법을 위한 바람직한 특성인데, 오염성 박동원 세포를 함유하고 자발 박동 속도가 빠른 혼합 세포 개체군은 생명에 위협이 되는 부정맥을 초래할 수 있기 때문이다. 심실 심근세포의 지정을 위한 본 발명의 새로운 프로토콜이 심실 및 박동원 세포의 혼합 개체군을 생성하는 이전의 프로토콜에 비해 우수하다는 점이 제안된다.
실시예
방법론 및 결과
인간 다능성 줄기 세포주가 전술한 바와 같이 배양될 수 있다(예: Kennedy 등, 2007 문헌 참조). 심장 계통으로의 분화를 위해, Kattman 등의 2011 문헌에 기술된 것과 같은 확립된 프로토콜이 사용될 수 있다. 　 WO2016131137에 기술된 것들을 포함하여, 절차에 대한 다양한 변경이 가능하다. 일 구현예에서, 80% 융합성 hPSC 배양물을 단일 세포로 해리키시고, 1 ng/mL의 BMP4 및 10 μM의 ROCK 억제제가 함유된 StemPro-34 배지에서 현탁시키고, 오비탈 쉐이커(orbital shaker) 상에서 18시간 동안 인큐베이션하여 배아체(EB)를 생성할 수 있다. 익일에(분화 1일차) 설정 농도의 BMP4 및 설정 농도의 액티빈 A(본원에서 추가적으로 기술됨)뿐만 아니라 5 ng/mL bFGF가 함유된 StemPro-34 중배엽 유도 배지에 EB를 옮길 수 있다. 　 분화 3일차에, IMDM을 사용해 EB를 1회 세척하고, 심장 유도 배지에 현탁시킬 수 있으며, 일 구현예에서, 심장 유도 배지는 0.5 μM IWP2, 10 ng/mL VEGF, 및 선택적으로 5.4 μM SB-431542 (SB, 액티빈/결절성/TGFβ 억제제)가 함유된 StemPro-34를 포함할 수 있다. 심장 유도 배지는 본원에서 추가로 설명되는 바와 같이, 선택적으로 레티노산(RA) 또는 RA 성분을 포함할 수도 있다.
레티노산 신호 전달은 hESC로부터 심방 유사 심근세포를 지정한다.
레티노산 신호 전달이 본 발명의 유도체(EB) 기반 프로토콜로 생성된 hPSC-유도 심원성 개체군에서 심방 세동을 지정할 수 있는지 여부를 결정하기 위해, 다음의 발단 단계를 나타내는 4가지 상이한 시점에 전 트랜스 레티노산(RA)을 분화 배양물에 첨가하였다: 중배엽 유도(3일차), 심혈관 지정(5일차), 심장 간세포 발달(7일차), 및 수축 심근세포의 출현(9일차) (Kattman 등, 2011 문헌 참조)(도 1a). HES3 NKX2-5:GFP 리포터 hESC 주를 이를 실험에 사용하여, 심혈관 발달의 모니터링과 정량화를 할 수 있었고 GFP+ 심근세포를 단리할 수 있었다. 배양 20일차에, GFP+SIRPA+CD90- 심근세포를 분화된 개체군으로부터 단리하여, 심방 및 심실 발달을 나타내는 유전자의 발현에 대해 RT- qPCR로 분석하였다. (도 1b~d 및 8b~e).
RA 처리는 범-심근세포 마커 CTNT의 발현 수준을 유의하게 변경시키지 않았는데, 이는 상이한 개체군 간에 심근세포 함량이 유사하다는 것을 나타낸다(도 1b). 3일차 및 5일차에 RA를 첨가한 결과 심실 특이적 유전자 MYL2의 발현이 유의하게 감소하였고 심방 이온 채널 유전자 KCNJ3가 상향 조절되었는데(도 1c), 이는 20일차 개체군에서 심근세포 세동 변화를 시사한다. 흥미롭게도, 나중 단계(7일차 및 12일차)에 RA를 첨가한 경우 이들 유전자의 발현에 영향을 미치지 않았다. 추가적인 챔버-특이적 마커의 분석에 따르면, 3일차 RA-처리 중배엽으로부터 생성된 심근세포도 비처리 그룹에 비해 심실 마커인 IRX4 및 MYH7를 더 낮은 수준으로 발현한 것으로 나타났지만, 심방 마커인 NR2F2, TBX5, NPPA, 및 MYL7 및 심방 특이적 이온 채널인 CACNA1D, KCNAS, 및 GJA5에 대해서는 역전 패턴이 관찰되었다(도 1d 및 8c~8e). 대조군 태아 조직에 대한 분석을 통해 이들 상이한 유전자의 심방 및 심실 발현 패턴을 확인하였다. 3일차 RA-처리된 중배엽으로부터 생성된 심근세포 개체군의 유세포 계측 및 면역 염색 분석을 통해 qRT-PCR 발현 패턴을 확인하였으며, 이들에 따르면 3일차에 RA-처리된 중배엽으로부터 생성된 개체군에서는 비-처리 대조군 중배엽으로부터 생성된 것과 비교해 MLC2V+ 세포의 비율이 극적으로 감소하였고 COUPTFII 세포가 훨씬 더 높은 빈도로 나타났다(도 1e~h).
종합적으로, 이들 연구 결과는 RA 신호 전달이 hPSC 심장 간세포에서 세동 변화를 유도하여, 심실 계통을 희생시키면서 심방 심근세포의 발달을 촉진한다는 것을 강하게 시사한다. 또한, 이들은 이러한 RA의 효과가 분화의 중배엽 상태에 상응하는, 분화의 3일차와 5일차 사이의 조기 발달 윈도우로 한정된다는 것을 보여준다.
그 다음으로, RA 반응을 더 특성화하기 위해, 분화의 2일차와 6일차 사이의 개체군을 3 RA 수용체(RAR) 이소형인, RAR-α, -β, -γ(도 8f에서는 각각 RARA, RARB, 및 RARG)의 발현에 대해 분석하였다. 3가지 모두는 반응 단계 동안에 발현되었는데, 이는 RA 반응이 이들 모두를 통해 매개될 수 있음을 시사한다(도 8f). 이를 시험하기 위해, 3일차 배양물에 대한 RA 대신에 수용체 특이적 작용제인 AM580을 α에, AC55649를 β에, 또는 CD437을 γ에 첨가하였다. 작용제 각각의 첨가는 20일차 CTNT+에서 MYL2의 발현 감소로 이어졌는데, 이는 모든 수용체 아형을 통한 신호 전달이 세동 변화를 매개할 수 있음을 시사한다(도 8g 및 8h).
일부 구현예에서, RA는 약 0.05 μM의 농도 내지 약 5 μM의 농도로 첨가될 수 있다. 일 구현예에서, RA의 농도는 500 nM(0.5 μM)이다. 일 구현예에서, 첨가된 RA의 농도는 0.05 μM 내지 0.01 μM이다. 일 구현예에서, 첨가된 RA의 농도는 0.01 μM 내지 0.1 μM이다. 일부 구현예에서, RA 성분이 첨가된다. 일부 구현예에서, RA 성분은 레티노산 수용체(RAR) 작용제이다. 일부 구현예에서, RAR 작용제는 알파 수용체에 대한 작용제이다. 일부 구현예에서, RAR 작용제는 AM580이다. 일부 구현예에서, AM580 RAR 작용제는 약 3 nM 내지 약 300 nM의 농도로 첨가된다. 일부 구현예에서, RAR 작용제는 베타 수용체에 대한 작용제이다. 일부 구현예에서, RAR 작용제는 AC55649이다. 일부 구현예에서, AC55649는 약 0.025 μM 내지 2.5 μM의 농도로 첨가된다. 일부 구현예에서, RAR 작용제는 감마 수용체에 대한 작용제이다. 일부 구현예에서, RAR 작용제는 CD437이다. 일부 구현예에서, CD437 RAR 작용제는 약 0.05 μM 내지 5 μM의 농도로 첨가된다.
RALDH2 및 CYP26A1 발현을 통해 중배엽 하위 개체군을 식별한다
심방 세동의 지정이 오토크라인(autocrine) RA 신호 전달을 통해 매개되는 경우, 이들 심근세포를 발생시키는 중배엽 개체군은 RALDH 활성을 나타내야 한다. 이를 시험하기 위해, 상이한 일차에 본 발명의 표준 조건(10 ng/mL BMP4 및 6 ng/mL 액티빈 A(10B/6A))으로 유도된 PDGFR α 중배엽을, 3가지 레틴알데히드 탈수소효소(RALDH1, -2, 및 -3)를 포함하여 모든 알데히드 탈수소효소(ALDH)를 검출하는 ADEFLUOR 분석을 사용해 분석하였다(Jones 등, 1995 문헌 참조). 이들 분석을 통해, 분화의 4일차 및 5일차에 작은 ALDH+PDGFRα+ 개체군의 존재가 밝혀졌는데(도 2a), 이는 이들 시기의 중배엽 하위 개체군이 RA를 합성하는 능력을 가질 수 있음을 시사한다. ALDH+PDGFRα+ 개체군을 크기를 증가시키기 위한 시도 중에, 중배엽 유도 단계 도중에 액티빈 A와 BMP4의 농도 변화의 영향을 시험하였다. BMP4가 일정한 농도로 존재하는 가운데 액티빈 A의 양을 감소시키는 것은, 분화 4일차에 ALDH+ PDGFRα+ 개체군 크기의 실질적 증가로 이어진다. 그러나, 이러한 증가가 생성된 CTNT+ 심근세포 비율의 감소와 연관되어 있었고, 이는 이들 변화가 비-심원성 세동을 촉진하였음을 시사한다. 액티빈 A와 BMP4 신호 전달의 비율이 최적의 심원성 전위를 유지하는 데 중요하다는 점을 앞에서 보여준 바와 같이, 그 다음으로, 가장 큰 ALDH+PDGFRα+ 개체군을 유도한 양의 액티빈 A(2 ng/mL)가 존재하는 가운데 BMP4의 농도를 가변시켰다. BMP4 농도를 10에서 3 ng/mL(3B/2A)로 감소시키는 것은 ALDH+ PDGFRα+ 개체군의 크기에 영향을 미치지 않았지만, 20일차에 생성된 CTNT+ 세포의 빈도를 증가시켰다(도 2c). 3B/2A 및 10B/6A 배양물로부터 비슷한 세포 수를 수득하였는데, 이는 조작이 전체 심근세포 출력에 유의한 영향을 미치지 않았음을 나타낸다(도 9a).
3B/2A로 유도된 배양물을 분석한 결과, 분화 3일차에 큰 PDGFRα+ 중배엽 개체군이 출현하고, 이어서 4일차에 ALDH+ PDGFRα+ 개체군이 발달한다는 것이 밝혀졌다(도 2D). ALDH+ PDGFRα+ 개체군의 크기는 5일차까지 증가하였고, 그런 다음 6일차에 감소하기 시작했다. 분자 분석에 의하면, RALDH2(ALDH1A2)는 분화 2일차와 3일차 사이에 급격하게 증가한 다음, 3B/2A로 유도된 그룹에서는 그 다음 7일 동안 감소한 것으로 나타났다(도 2e). 10B/6A로 유도된 세포는 3일차와 4일차에 상당히 낮은 수준의 ALDH1A2를 발현하였는데, 이는 본 그룹에서 ALDH+ 세포의 비율이 더 작은 것과 일관된다. 다른 RALDH 이소형(ALDH1A1 및 ALDH1A3)의 발현 수준은 ALDH1A2의 발현 수준보다는 현저하게 낮았으며, 두 개체군 사이에서는 차이가 없었다. T (BRACHYURY) 및 MESP1은 10B/6A 유도 개체군과 3B/2A 유도 개체군 모두에서 유사한 일시적인 발현 패턴을 보였으며, 이는 중배엽 유도의 역동학이 두 개의 그룹 사이에서 극적으로 상이하지 않았음을 나타낸다.(도 9c). 배아를 발달시킴에 있어서, RA 활성과 신호 전달 기간의 경계는 국소화된 작용제의 합성과 분해 사이의 균형에 의해 확립된다(Cunningham 및 Duester, 2015 문헌; Rydeen 및 Waxman, 2014 문헌 참조). 이러한 균형이 hPSC 분화 배양물에서 역할을 하고 있는지 결정하기 위해, 다음으로, RA 분해를 담당하는 집단 효소인 시토크롬 P450의 구성원인 CYP26A1의 발현에 대해 두 개체군을 분석하였다. 이들 분석에 의해, 두 그룹 간에 현저한 차이가 밝혀졌는데, 3일차 10B/6A 유도 세포는 임의의 다른 10B/6A 유도 개체군이나 3B/2A 유도 개체군보다 극적으로 높은 발현 수준을 나타냈다. 종합적으로, 이러한 결과는 3B/2A 및 10B/6A의 조합이 ALDH1A2 및 CYP26A1의 발현에 의해 구별되는 상이한 중배엽 개체군을 유도한다는 해석을 뒷받침한다.
레티놀은 심방 세동에 대한 ALDH+ 중배엽을 지정한다.
ALDH+ 세포가 RA를 합성할 수 있는지 결정하기 위해, ALDH+ PDGFRα+ 및 ALDH- PDGFRα+ 분획을 4일차 3B/2A 유도 개체군으로부터 단리하였고, 세포를 레티놀(ROH), RA, 또는 DMSO(대조군)에서 24시간 동안 응집체로서 배양하였다(도 3a 및 3b). ALDH1A2 발현은 ALDH+ 분획으로 분리되어, RALDH2 발현 세포를 분리하기 위한 aldefluor 기반 분류 전략의 타당성을 확인했다(도 3c). 15일 동안의 추가 배양에 이어서, 모든 그룹이 높은 비율의 CTNT+ 세포를 함유하여, 효율적인 심근세포 분화가 입증되었다(도 3d). 미처리 대조군은 MLC2V+ 세포를 함유한 심근세포 개체군을 생성하고 IRX4를 발현하여, 3B/2A 유도 중배엽이 RA 신호 전달의 부재 하에 약간의 심실 심원성 전위를 가진다는 것을 입증하였다. ROH로 처리한 후, ALDH+ 중배엽은 미처리 대조군과 비교해 MLC2V+ 세포의 빈도가 더 낮고, IRX4 발현 수준이 더 낮으며, KCNJ3 발현 수준이 증가한 심방 유사 심근세포 개체군을 생성하였다. RA 처리 ALDH+ PDGFRα+ 유도 개체군에서의 발현 패턴은 유사하였는데, 이는 ALDH+ 세포가 ROH로부터 RA를 합성할 수 있음을 강하게 시사한다.
놀랍게도, 분리 시점에 ALDH1A2의 발현이 없었음에도 불구하고(도 3b 및 3c) ALDH-세포에서 ROH에 대한 유사한 반응이 관찰되었다(도 3e~3f). 이러한 반응은 ALDH-- 유래 개체군의 대부분이 24시간의 응집체 배양 도중에 ALDH+가 되어(도 10a), 세포가 ROH에 대해 반응할 수 있도록 하기 때문인 것으로 보인다. 흥미롭게도, 동일한 24시간 동안 ALDH+ 유래 개체군에서 aldefluor 염색이 감소하는 것이 관찰되어, 중배엽 개체군 내에서 ALDH 활성의 동적인 성질(RALDH2 발현)이 강조되었다.
종합하면, 이들 결과는 3B/2A가 ROH에 반응할 수 있고 심방 유사 심근세포를 생성할 수 있는 ALDH+ PDGFRα+ (RALDH2+) 중배엽을 유도한다는 것을 증명하여, 이러한 세동의 지정이 오토크라인 RA 신호 전달을 통해 매개된다는 개념을 뒷받침한다.
CD235a 발현은 심실 심근세포를 생성하는 중배엽을 표시한다. 본원에서는, CD235b가 적어도 아미노산 서열의 유사성 및/또는 글리코포린 B 및 글리코포린 A의 N-말단 영역의 동일성으로 인해, 심실 중배엽을 생성하는 중배엽의 마커로서 CD235a를 대체할 수 있는 것으로 예상한다.
심실 심근세포를 생성하는 AYP26A1-발현 중배엽(VM)의 발달의 모니터링을 가능하게 하기 위해, 이러한 개체군에 대해 ALDH+ 중배엽으로부터 VM을 구별을 가능하게 하는 표면 마커에 대한 검색을 시작하였다. 항CD 항체 어레이(http://www.ocigc.ca/antibody/)에 대한 이전의 스크리닝을 통해, 글리코포린 A(CD235a)가 10B/6A를 사용해 유도된 5일차의 심원성 PDGFRα+ 세포의 하위 집합 상에서 발현된다는 것을 발견하였다(데이터 미도시). 10B/6A 유도 개체군 및 3B/2A 유도 개체군의 분석을 통해, CD235a+ 개체군이 다음 24시간 이내에 증가하고(> 60%), 이어지는 48시간 동안 감소한다는 것이 밝혀졌다. 5일차에 검출된 ALDH+ 세포의 작은 부분은 CD235a-이었는데, 이는 ALDH+ 및 CD235a+ 개체군이 상호 배타적임을 나타낸다. 4일차의 3B/2A 유도 개체군에서는 몇 개의 CD235a+ 세포만이 검출되었다. qRT-PCR 분석을 통해, 10B/6A로 유도된 그룹에서 분화 3일차에 GYPA (글리코포린 A) 발현이 상향 조절됨을 밝혀졌다(도 11a). 　 발현 수준은 다음 24시간 동안 급격히 감소하였고, 분석이 진행되는 동안 낮은 상태로 유지되었다. 3B/2A 유도 개체군에서는 낮은 수준의 발현만이 검출되었다. 이들 결과에 기초하여, 글리코포린 A가 심실 심근세포 계통에 기여하는 중배엽 사에서 발현된다고 가정한다.
심실 간세포의 단리를 위한 CD235a의 유용성을 시험하기 위해, 중간 농도의 BMP4 및 액티빈 A(5 ng/mL BMP4 및 4 ng/mL 액티빈 A [5B/4A])를 사용하는 유도 전략을 사용해 CD235a+ 및 ALDH+ 하위 개체군 모두를 함유한 개체군을 생성하였다. CD235a+ALDH- 및 CD235a-ALDH+ 분획 모두를 단리하고, 응집체로서 세포를 배양하였다. 분류된 분획에 대한 qRT-PCR 분석은 ALDH1A2가 CD235a+ALDH- 세포에서보다 CD235a-ALDH+ 세포에서 더 높은 수준으로 발현함을 나타냈다(도 11b). GYPA 및 CYP26A1의 발현 수준은 둘 사이에서 유의하게 상이하지 않았는데, 이는 이들 유전자의 피크 발현으로부터 하루가 지난 4일차에 분획이 단리되었다는 사실에 기인한 것으로 보인다. ROH와 RA의 부재 중에, 두 가지 분획 모두가 심실 유사 세포를 생성하였다(도 4c~4e). 그러나, MLC2V+ 세포의 비율과 IRX4의 발현은 CD235a-ALDH+ 유도체에서 보다는 CD235a+ALDH- 중배엽으로부터 생성된 개체군에서 더 높았다. 심방 유전자인 KCNJ3 및 NR2F2에 대한 역 패턴이 관찰되었다(도 4f). ROH가 존재하는 가운데 배양한 경우, CD235a-ALDH+는 낮은 빈도의 MLC2V+ 세포; 낮은 수준의 IRX4 발현; 및 높은 수준의 NPPA, KCNJ3, 및 NR2F2 발현을 특징으로 하는 심방 유사 심근세포 개체군을 생성하였다(도 4d~4f). 이와 반대로 CD235a+ALDH- 세포는 ROH에 대한 반응을 나타내지 않았는데, 이는 ALDH+ 세포의 부재 중에는 RA를 합성할 수 없음을 입증하는 것이다. 예상한대로, 중배엽 개체군 모두는 RA에 대해 반응하였고 MLC2V- 세포를 생성하였다. 종합하자면, 이들 결과는 CD235a 발현이 ROH에 반응하여 심방 세포를 형성할 수 없는 심실 심근세포 전위로 중배엽 개체군을 표시한다는 것을 입증하며, 이는 CD235a-ALDH+ 중배엽과 구별되는 특성이다. 이들 결과는 또한, RA 신호 전달이 없는 가운데 생성된 심근세포 개체군에서 심실 및 심방 유전자의 차등 발현에 의해 표시된 바와 같이, CD235a+ 및 ALDH+ 중배엽 개체군이 이들 각각의 세동에 맞게 이미 패턴화되어 있음을 시사한다.
심실 심근세포 분화의 최적화.
10B/6A를 사용하는 유도가 심실 심근세포의 발달에 유리하지만, 이들 조건 하에 생성된 중배엽은 종종 ALDH+ 세포의 작은 부분을 함유하며, 가변 비율(40% 내지 60%)의 MLC2V+ 세포를 함유하는 CTNT+ 개체군을 생성한다. 심실 심근세포의 발달을 더 최적화하기 위해, 상이한 농도의 액티빈 A 및 BMP4로 유도된 4일차의 EB 개체군에서 CD235a+ 분획의 크기를 모니터링하였고, 이를 20일차의 MLC2V+CTNT+ 세포의 빈도와 비교하였다. 일정량의 BMP4(10 ng/mL)가 존재하는 가운데 액티빈 A의 농도를 2 ng/mL에서 12 ng/mL로의 증가시킨 결과 4일차 CD235a+ 개체군의 크기가 증가하였고, ALDH++ 개체군이 제거되었으며, MLC2V+ CTNT+ 세포의 비율이 증가하였다(도 5a).
다음으로, 가장 높은 빈도의 MLC2V+CTNT+ 세포를 생성한 액티빈 A의 양(12 ng/mL)에 대해 BMP4의 농도를 가변시켰다(3~20 ng/mL). BMP4 농도의 변화는 CD235a+ 개체군의 크기에는 거의 영향이 없었지만, 심실 지정에 영향을 미쳤다. 가장 높은 농도의 BMP4(20 ng/mL)로 유도된 20일차 개체군은 MLC2V+CTNT+ 세포의 빈도가 가장 낮았던 반면, 낮은 농도의 BMP4(5 ng/mL [5B/12A])로 유도된 EB는 가장 높은 빈도의 이들 심근세포를 생성하였다(도 5b 및 13b). 5B/12A 유도 배양물 및 10B/6A 유도 배양물은 비슷한 세포 수를 산출하였는데, 이는 MLC2V+CTNT+ 세포의 농축이 총 세포의 산출량을 훼손하지 않고도 얻어진다는 것을 나타낸다.
액티빈 A 및 BMP4의 최적 농도가 특정 로트의 사이토카인의 활성에 의존한다는 것은 주목할 가치가 있다. 이러한 점을 감안하면, 최적의 농도를 결정하기 위해 각각 새로운 로트의 사이토카인을 사용해 이러한 적정을 반복해야 한다. 보고된 바와 같이(Burridge 등, 2014 문헌 참조), 배양에서의 시간이 hPSC 유래 심근세포 개체군의 MLC2V+ 함량에 영향을 미칠 수 있는지 여부를 결정하기 위해, 3B/2A, 10B/6A, 및 5B/12A로 유도된 EB로부터 생성된 20일차와 40일차 개체군을 비교하였다. 도 13b에 도시된 바와 같이, 개체군 각각에서 두 시점 모두에서 유사한 비율의 MLC2V+ CTNT+ 심근세포가 검출되었는데, 이는 배양 시간의 연장이 이러한 조건하에서 이들 심실 함량에 영향을 미치지 않았음을 입증한 것이다. 종합하자면, 이들 결과는, 4일차의 CD235a+ 개체군의 유도가 MLC2V+ CTNT+ 심근세포가 고도로 농축된 개체군의 생성을 위한 전제 조건임을 나타낸다. 그러나, 이들은 또한 이러한 개체군의 크기가 20일차 배양물에서 MLC2V+ 세포의 백분율을 반드시 예측하는 것은 아니라는 점을 보여준다. 5B/12A로 유도된 EB 개체군은 높은 비율의 CD235a+ 세포를 함유하고 ALDH+ 세포를 함유하지 않은 반면(도 5c), 3B/2A로 유도된 것은 ALDH+ 세포의 빈도가 높았고 CD235a+ 세포는 거의 없었다. ROH 또는 RA의 존재 유무와 상관없이 지정되고(3 내지 5일차) 추가로 15일 동안 배양된 경우, 두 개체군 모두는 생성된 CTNT+ 세포의 빈도에 의해 측정했을 때 유사한 심원성 전위를 나타냈다.
3B/2A 유도 EB는 ROH에 대해 반응하여 MLC2V+ 세포의 상실, IRX4 발현의 감소, 및 KCNJ3 및 NR2F2 발현의 상향 조절을 특징으로 하는 심방 유사 심근세포 개체군을 생성하였다(도 5e~5g). 대조적으로, 5B/12A 유도 EB는 ROH에 반응하지 않았으며, 이는 ALDH+ 세포가 전혀 없는 경우와 일관되었다. 예상한대로, RA 처리를 통해 이러한 중배엽으로부터 심방 유사 심근세포 표현형을 유도할 수 있었다.
심실 분화를 최적화하는 데 사용된 조건들이 조건이 이러한 배양물에서 정상적으로 검출되는 NKX2.5- 동방결절 박동원-유사 세포(Birket 등, 2015; Protze 등, 2017 문헌 참조)의 비율에 영향을 주었는지 여부를 결정하기 위해 NKX2-5-GFP- 세포의 존재에 대한 개체군을 분석했다. 도 5h에 도시된 바와 같이, 최적화된 5B/12A 유도 EB로부터 생성된 개체군은 10B/6A 유도(도 1e) 및 3B/2A 유도 EB 유래의 것들보다 유의하게 더 적은 NKX2-5-GFP-CTNT+ 세포를 함유하였는데, 이는 동방결절 유사 박동원 세포(SANPLC) 함량이 감소하였음을 나타낸다. 박동원 함량의 이러한 감소는 3B/2A 유도 EB와 비교해 5B/12A 유도 EB의 자발적 박동 속도의 유의한 감소와 연관되어 있었다. 이전 결과(Protze 등, 2018 문헌 참조)와 일관되게, RA 처리는 유도체 개체군에서의 NKX2-5-GFP- 세포의 비율에 영향을 미치지 않았다(도 5j).
종합적으로, 이들 결과는 5B/12A가, 높은 비율의 CD235a+ 세포를 함유하면서 심실 심근세포가 고도로 농축되고 심방 심근세포와 SANPLC가 전혀 없는 개체군을 생성하는 중배엽의 하위 개체군을 지정한다는 것을 보여준다. 하위 개체군은 심실 중배엽으로서 지칭될 수도 있다.
일부 구현예에서, 심실 분화의 최적화는 본원에 기술된 방법을 사용해 20일차 배양물에서 측정했을 때, 심실 심근세포의 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%를 농축시킨다. 일부 구현예에서, 개체군은 본질적으로 박동원 세포가 없다. 일부 구현예에서, 개체군은 박동원 세포가 전혀 없다.
일부 구현예에서, 심실 분화를 최적화하는 방법은 최적화된 농도의 BMP 성분 및 액티빈 성분을 첨가하는 것에 의해 심실 중배엽의 생성을 최적화한다. 일부 구현예에서, BMP 성분은 BMP4이며, 액티빈 성분은 액티빈 A이다. 일부 구현예에서, BMP4는 3 ng/mL 내지 20 ng/mL의 농도로 첨가된다. 일부 구현예에서, 액티빈 A는 4 ng/mL 내지 20 ng/mL의 농도로 첨가된다. 바람직한 구현예에서, 액티빈 A는 BMP4보다 더 높은 농도로 첨가된다. 일부 구현예에서, BMP4는 10 ng/mL의 농도로 첨가되고 액티빈 A는 12 ng/mL의 농도로 첨가된다. 일부 구현예에서, BMP 성분 및 액티빈 성분은 프로세스의 1일차에 첨가된다. 일부 구현예에서, BMP 성분 및/또는 액티빈 성분의 농도는 CD235a의 존재 또는 그 양에 대한 측정에 의해 결정된다. 일부 구현예에서, BMP 성분 및/또는 액티빈 성분의 농도는 RALDH2의 존재 또는 그 양에 대한 측정에 의해 결정된다. 일부 구현예에서, BMP 성분 및/또는 액티빈 성분의 농도는 CD235a의 수준을 측정하고 이를 RALDH2의 수준과 비교함으로써 결정된다. 일부 구현예에서, 액티빈 성분의 농도는 RALDH2 발현 세포와 비교해 더 많은 CD235a 발현 중배엽을 우선적으로 생성하는 농도에 기초하여 선택되며, BMP 성분은 액티빈 성분의 농도보다 더 낮은 농도로 첨가된다. 일부 구현예에서, BMP성분의 농도는 RALDH2와 비교해 더 많은 CD235a를 우선적으로 생성하는 농도에 기초하여 선택되며, 액티빈 성분은 BMP 성분의 농도보다 더 높은 농도로 첨가된다.
상이한 중배엽으로부터 생성된 심근세포의 특성화
상이한 중배엽 개체군의 심원성 전위를 추가로 조사하기 위해, 원래 사이토카인 조합(10B/6A; 혼합된 유도 MI)를 사용해 유도되거나 심실(5B/12A; 심실 유도 VI) 또는 심방(3B/2A; 심방 유도 AI) 세동에 대해 최적화된 조합을 사용해 유도된 EB로부터 생성된 20일차 NKX2-5+SIRPα+CD90- 심근세포를 단리하였다. 예상한대로, CTNT의 발현 수준은 분류된 개체군에서는 유사하였다(도 6a). VI EB로부터 생성된 심근세포는 myl2, IRX4 및 MYH7을 포함하는 심실 근세포와 연관된 유전자를 심근 MI 또는 AI EB로부터 유도된 심근세포보다 유의하게 더 높은 수준으로 발현하였다. VI Eb 유래의 개체군에서는 MCL2V+ 심근세포의 빈도가 가장 높았는데 (VI EB로부터 80% + 2%, MI EB로부터 56% + 4%, 및 AI EB로부터 25% + 5%), 이는 심실 발현 프로파일의 개선이 심실 유사 심근세포의 농축 빈도에 부분적으로 기인한다는 것을 시사한다(도 13a). 면역 염색 분석을 통해 심근세포 개체군의 MLC2V 함량 차이를 확인하였다.
RA 처리 VI 및 AI EB(각각, VI + RA 및 AI + RA)로부터 생성된 심근세포는 비처리 EB로부터 단리된 것들과 비교해 분석된 모든 심방 유전자의 발현 수준이 상승하였음을 보여주었다. AI + RA 유래 세포에서 KCNAS, KCNJ3, NR2F2 및 CACNA1D의 발현 수준은 태아의 심방 조직에서의 발현 수준만큼 높거나 그보다 더 높았다. 특히, 이들의 발현 수준도 VI + RA EB로부터 생성된 근세포에서 검출된 수준보다 유의하게 더 높았다. 대조적으로, GJA5, NPPA, 및 MYL7과 같은 다른 심방 유전자는 2개의 RA 처리 심근세포 개체군에서 유사한 수준으로 발현되었지만, 태아의 심방 조직에서 검출된 것들보다는 유의하게 더 낮은 수준으로 발현되었다(도 14c). 박동원 유전자 TBX3의 수준은 2개의 RA 처리 그룹에서는 비슷하였으며, 이는 KCNAS, KCNJ3, CACNA1D, 및 NR2F2 발현에서 관찰된 차이가 오염성 박동원 세포에 기인하는 것이 아님을 나타낸다.
CD235a+ 중배엽이 RA를 분해할 수 있는 CYP26A1을 발현하는 경우, 심방 유전자의 발현 차이는 핵 수용체에 도달하는 활성 리간드의 최종 농도 차이 때문일 수 있다. 이를 시험하기 위해, 심상 지정에 사용된 RA의 농도를 가변시켰고 각각의 EB 유도 조건으로부터 생성된 단리된 NKX2-5+SIRPa+ 세포(20일차)를 분석하였다(도 13e). 0.5 mW에서 2 mW까지 RA의 농도를 증가시킨 결과 VI EB 유래 심근세포에서의 KCNAS 발현 수준이 AI EB 유래 세포와 비슷한 수준까지 증가하였다(도 13f). RA의 이러한 농도는 VI 개체군에서의 심실 유전자 MYL2 및 IRX4의 발현을 완전히 억제하기에도 충분하였다(도 13g). 대조적으로, 2 mW의 농도까지 RA를 첨가한 결과 KCNJ3, CACNA1D, 및 NR2F2의 발현을 AI 세포에서 관찰된 수준까지 증가시키지는 못했다(도 14h). 이들 유전자의 비슷한 발현 수준은 20일차 개체군에서 NKX2-5+ SIRPa+ 세포의 빈도를 극적으로 감소시킨 농도인 4 mW RA로 처리된 EB로부터 생성된 심근세포에서만 검출되었다(도 14e). 이들 데이터는 VI 및 AI 중배엽 개체군이 동일한 전위를 가지지 않는다는 것을 추가적으로 입증한다. 추가적으로, 이들은 효율적인 심실 및 심방 심근세포의 지정을 위해 적절한 조기 단계 유도 전략을 사용하는 것의 중요성을 강조한다. 상기 개체군들이 기능적으로 상이한지 여부를 평가하기 위해, 패치 클램프 실험을 사용해 VI 및 AI + RA EB로부터 유래된 NKX2- 5+SIRPa+CD90-심근세포의 전기생리학적 특성을 시험하였다.
Figure pct00001
APA, 활동 전위의 크기; APD30/90, 재분극의 30%/90% 부분에서의 활동 전위 지속시간; CL, 사이클 길이; DMP, 확장기 막전위; dv/dtmax, 최대 활동 전위 업스트로크 속도; t-검정: 자발성인 경우 *P<0.05, **p<0.01이고 VI+RA인 경우 #P<0.05, ##P<0.01. AP 유형 + SEM의 %는 분화와 독립적으로 n = 5 (VI, VI+RA) 및 n = 6 (AI+RA)의 패치된 세포 배치(batch)로부터 정량화하였다. AP 유형으로의 분류에 사용된 파라미터에 대한 상세한 내용은 방법 섹션에 명시되어 있다.
MLC2V에 대한 유세포 계측을 통해 RA가 없는 가운데 AI EB로부터 심실 심근세포의 지정하는 것의 낮은 효율이 입증되었으므로, 패치 클램프 실험에서는 이들 심근세포를 더 이상 분석하지 않았다. VI EB 유래의 심근세포(RA 없음)는 빠른 업스트로크 속도(>10 V/s) 및 긴 AP 지속 시간(APD30 > 50 ms)을 갖는 전형적인 심실 활동 전위(AP)를 나타냈다(도 6e 및 6f). 중요한 것은, 분석된 세포의 100%가 이러한 심실 표현형을 보였다는 것이다(도 6g). RA가 없는 가운데 VI 또는 AI EB로부터 지정된 심근세포는 VI EB 유래의 심근세포와 비교해 유의하게 더 빠른 박동 속도와 더 짧은 APD30을 나타냈으며, 이는 심방 AP 표현형을 나타낸다(도 6e 및 6f). 그러나, VI + RA EB 유래의 심근세포는 AI + RA EB 유래의 심근세포에서 발견된 것보다 유의하게 더 길었다(APD30, 55 ± 20 ms 대 13.0 ± 4.8 ms; APD90, 258 ± 25 ms 대 189 ± 18 ms). 관찰된 AP 유형에 대한 분류를 통해 두 그룹 유래의 세포에서 기록된 심방 및 심실 유사 AP의 비율에서 현저한 차이가 밝혀졌다. VI + RA EB로부터 분석된 세포의 62% ± 5%만이 심방 패턴을 보였고, 나머지인 38% ± 5%는 심실 표현형을 나타냈다(APD30/90 > 0.3). 대조적으로, AI + RA EB에서의 세포 대부분(86% ± 9%)은 심방 패턴을 보였고, 6% ± 6%만이 심실 AP를 나타냈다. AI + RA EB로부터 기록된 20개의 세포중 하나는 느린 업스트로크 속도(< 10 V/s) 및 느린 박동 속도(50 bpm)를 가졌는데, 이는 미성숙 심근세포를 나타낸다. 두 개의 EB 개체군으로부터 생성된 심방 세포를 더 특성화하기 위해, 다음으로 심방 AP 표현형(업스트로크 속도 > 10 V/s, APD30/90 < 0.3)을 나타낸 세포에만 집중하여 아세틸콜린 활성 칼륨 전류 밀도(IKACh)를 측정하였다. 예상한대로, 대조군 VI EB 유래의 심실 세포(-RA)는 두 개체군 모두로부터 생성된 심방 세포보다 유의하게 작은 IKACh 전류 밀도를 나타냈다(도 6h~6j). AI + RA EB에서 유래된 것들이 VI + RA EB에서 유래된 것들보다 유의하게 높은 IKACh 전류 밀도를 보였으므로(2.8 ± 0.4 pA/pF 대 1.6 ± 0.4 pA/pF), 두 심방 심근 세포 집단의 비교는 흥미로운 차이를 나타냈다. 상기 관찰 결과를 종합하면, 이들 결과는 심방 세포의 생성 효율 및 이들 세포의 품질은 적절한 중배엽 개체군을 생성하는 것에 종속된다는 것을 나타낸다.
다른 hPSC 계통으로부터 심방 및 심실 심근세포의 생성.
ALDH 활성 및 CD235a 발현에 기초하여 심방 및 심실 분화를 최적화하기 위한 접근법이 광범위하게 적용 가능한지 여부를 결정하기 위해, 다음으로, 이 접근법을 사용해 HES2 인간 배아 줄기 세포 및 MSC-iPS1 유도 다능성 줄기 세포주로부터 이들 심근세포 개체군을 생성하였다. 적정 연구를 통해 5B/2A와 5B/6A는 각각 심방 및 심실 유도에 적합하고, HES2 세포 및 4B/4A는 MSC-iPSC1 세포에 대한 심실 유도에 적합한 것으로 식별되었다(도 7a, 7b, 7e 및 7f; Mendeley http://dx.doi.org/10.17632/7z7d5v2c3w.1). 모든 사이토카인 조합이 실질적인 CD235a+ 개체군의 발달을 촉진하였으므로, MSC- iPSC1 세포로부터 심방 유도를 최적화하는 것은 더 어려웠다. 이러한 패턴에 대한 한 가지 해석은 MSC-iPS1 세포가 높은 수준의 내인성 결정성/액티빈 A 신호 전달을 가지므로, 모든 조건에서 일부 CD235a + 세포가 발생한다는 것이다. 이를 시험하기 위해, 결절성/액티빈 A/형질변환 성장 인자 베타(TGF-베타) 억제제 SB-431542(SB)를 4B/1A로 유도된 3 내지 5일차 세포에 첨가하였다. SB의 첨가는 4일차 중배엽의 CTNT+MLC2V- 심원성 전위에 영향을 미치지 않으면서 CD235a + 세포의 감소 및 ALDH+ 개체군의 크기 증가를 유도하여 MSC-iPS1 세포가 다른 계통보다 더 높은 수준의 내인성 결절성/액티빈 A 신호 전달을 갖는다는 해석을 뒷받침하였다.
두 계통 모두의 CD235a+ 중배엽 발달에 최적화된 EB는 IRX4를 발현하는 높은 비율의 MLC2V+ CTNT+ 심근세포를 함유하는 20일차 개체군을 생성하였다. CD235a+ 중배엽 개체군도 ROH에 반응하지 않았다. 예상한대로, 둘 다는 RA에 반응하였고, 비처리된 대조군과 비교해 MLC2V 함량의 감소, MYL2 및 IRX4 발현의 하향 조절, 및 KCNJ3 및 NR2F2의 상향 조절을 나타내는 심근세포 개체군을 생성하였다(도 7b~7d, 7f~7h, 및 14b~14g). ALDH+ 중배엽 발달에 최적화된 EB는 ROH와 RA 둘 다에 대해 반응하였고, 심방 계통을 나타내는 발현 프로파일을 나타내는 심근세포 개체군을 생성하였다(도 7b~7d, 7f~7h, 및 14b~14g). 종합하면, 이들 결과는 상이한 hPSC 계통으로부터 생성된 ALDH+ 및 CD235a+ 중배엽 개체군이 HES3-NKX2- 5eGFP/w 계통으로부터 생성된 개체군과 유사하게 심방 및 심실 전위를 각각 나타낸다는 것을 입증한다. 심방 및 심실 심근 세포 계통의 출현 및 분리를 매핑하는 것을 목표로 hPSC 분화 시스템을 사용해 인간 심장 발달의 초기 단계를 모델링하였다. 이러한 연구의 결과는, 상이한 수준의 액티빈 A 및 BMP4 신호 전달에 의해 지정되고 ALDH 활성(RALDH2) 또는 CD235a/CYP26A1 발현에 기초하여 각각 식별될 수 있는 별개의 중배엽 개체군으로부터 심방 및 심실 심근세포가 유래하는, 인간 심장 발달의 계획을 뒷받침한다(도 71). 심방 심형성(atrial cardiogenesis)은 RALDH2+ 중배엽의 하위 개체군 내에서 오토크라인 RA 신호 전달을 통해 유도되지만, CYP26A1의 발현을 통한 CD235a+ 중배엽의 경로 억제가 심실 심근세포의 발달에 필요하다는 점을 제안한다. RALDH2+ 및 CD235a+ 개체군은 두 가지 유형의 심근세포 모두를 생성할 수 있지만, 심방 및 심실 세포의 효율적 생성은 적절한 중배엽의 유도에 의존한다. 종합적으로, 이들 새로운 통찰은 인간 심장 발달의 가장 이른 단계를 평가하기 위한 프레임워크와 특정 심근세포 아형의 효율적 생성을 위한 최적의 프로토콜을 설계하기 위한 플랫폼을 제공한다.
심방의 지정이 발달의 중배엽 단계 동안의 RA 신호 전달에 의해 매개된다는 관찰은 hPSC로부터의 심방 분화에 대한 이전 보고서(Devalla 등, 2015; Zhang 등, 2011 문헌 참조)와 일치할 뿐만 아니라, 초기 배아에서 기술된 심형성에 대한 RA의 한시적 효과와도 일치한다(Moss 등, 1998; Xavier-Neto 등, 2000 문헌 참조). 배아에서, 이러한 단계는 외측판 중배엽에서 RA 반응성 세포 및 RALDH2 발현 세포의 출현과 관련이 있으며, 이는 심장 관의 후방 영역을 형성하는데 도움을 주고 궁극적으로는 심방 심근세포를 생성시키는 것으로 여겨진다(Hochgreb 등, 2003; Moss 등, 1998 문헌 참조). RA 반응과 RALDH2 발현의 고도로 중첩된 패턴은, 이러한 중배엽이 RA를 합성하고 RA에 반응하는 것 둘 다를 할 수 있음을 시사한다. 심장 중배엽이 생체 내에서 RA를 합성할 수 있다는 개념은, 심실 발달에 기여하는 이동 Mesp1+ 중배엽(E7.25)이 조기 이동 심방 간세포보다 유의하게 더 높은 수준의 ALDH1A2(RALDH2)를 발현한다는 것을 보여준 Lescroart 등의 연구(2014)에 의해 뒷받침된다. 본 발명의 세포 분류 실험의 결과는 심방 전위를 갖는 3B/2A 유도 중배엽이 RALDH2를 발현하고 ROH에 대해 반응할 수 있음을 쉽게 입증하여, 인간 심방의 지정이 자가분비 RA 신호 전달을 통해 매개된다는 유력한 증거를 제공한다.
CD235a+CYP26A1+ALDH- 중배엽이 심실 심근세포를 효율적으로 생성하지만 ROH에 반응하여 심방 세포를 생성할 수 없다는 결과는 이러한 심근세포 아형이 상이한 중배엽 개체군으로부터 유래된다는 강력한 증거를 제공한다. CD235a+ 및 ALDH+ 중배엽에서 CYP26A1 및 RALDH2의 차등 발현은 이러한 hPSC 유래의 간세포가 발달중인 배아의 심장 혈관 심혈관 간세포 필드의 전후방 축을 따라 발견되는 RA- 신호 전달 경계와 유사한 RA 합성과 분해 사이에서 균형을 확립했다는 것을 나타낸다(Cunningham 및 Duester, 2015; Rydeen 및 Waxman, 2014 문헌 참조). 현재, CD235a 중배엽이 좌심실 또는 우심실 심근세포 또는 이 둘의 혼합체를 생성하는지 여부는 알려져 있지 않다. 이러한 개체군에 대한 보다 나은 분석을 시험관 내에서 달성할 수 있을 때까지는 다른 간세포가 좌심실과 우심실 유출로에 기여한다는 제1 및 제2 심장 필드 모델(Buckingham 등, 2005; Meilhac 등, 2004; Spaeter 등, 2013 문헌 참조)에 본 발명의 결과를 통합하는 것은 어렵다. 그러나, 본 발명의 결과는 마우스에서의 FOXA2의 발현은 좌 및 우심실 심근세포를 생성하지만 심방 심근세포는 생성하지 않는 간세포를 표시한다는 것을 보여주는 혈통 추적 전략을 사용한 Bardot 등의 결과(2017)와 일치한다.
CD235a 발현 및 ALDH 활성을 통해 심실 및 심방 간세포의 발달을 정량적으로 모니터링하는 능력을 통해 이들 두 개체군의 지정을 조절하는 경로를 조사하고 BMP4의 구배 및 액티빈 A의 신호 전달이 이러한 조기 결정에 중추적인 역할을 한다는 것을 입증할 수 있었다. 상이한 hPSC 계통에 대한 본 발명의 분석에 따르면, 심실 혈통의 지정은 심방 혈통 생성에 필요한 것보다 더 높은 BMP4 신호 전달 대 액티빈 A의 비율에 의존한다는 것이 밝혀졌다. 이러한 차이는 이들 간세포가 초기 배아에 노출되는 상이한 신호 전달 환경을 반영하는 것일 수 있다. 이를 뒷받침하는 증거는, 결절성 유전자 및 그 하류에 있는 표적 유전자인 PITX2, LEFT1, FGF8, GSC 및 MIXI에 대한 전사물이 나중에 발달하는 심방 간세포와 비교해 조기 이동하는 좌심실 간세포에서 농축됨을 보여준 Lescroart 등의 (2014) 연구에 의해 제공된다.
최적의 심실 및 심방 발달이 적절한 중배엽의 효율적인 지정에 의존한다는 관찰에 따르면, hPSC 분화 배양물에서 발달 초기 단계에 대한 이해의 중요성이 강조된다. 본 발명의 결과에 따르면 혈통 발달의 효율성과 생성된 세포의 품질(심방 심근세포의 경우) 둘 다가 초기 유도 단계에 영향을 받는것으로 나타난다. hPSC의 전위를 심혈관 질환에 대한 치료 용도로 전환시키기 위해서는 분화 배양물에서 혈통 발달의 정교한 조절이 중요하게 관련된다. 예를 들어, 오염성 박동원 세포 및 심방 세포가 전혀 없이 고도로 농축된 심실 심근세포는 심근 경색을 앓고 있는 환자에서 심실 벽의 근육 재건(remuscularization)을 목표로 하는 세포 기반 치료제를 개발하는 데 이상적인 후보 개체군일 것이다. 비-심실 세포를 제거하면, hPSC 유래의 심근세포 혼합 개체군을 이식한 후 동물 모델에서 관찰된 부정맥을 감소시킬 수 있다(Chong 등, 2014; Shiba 등, 2016 문헌 참조). 심근세포 아형의 농축된 개체군에 대한 접근은 심장의 특정 영역에 영향을 주는 질환, 예컨대 심방 세동, 비대심근병, 및 기타 심실 특이적 선천성 심장병 등의 모델링에 있어서도 중요하다. 상이한 심장 개체군을 생성하는 능력은 이러한 연구를 위한 적절한 표적 세포를 제공할 뿐만 아니라 다른 심근세포 아형에 대한 치료 전략의 잠재적인 표적 외 효과의 분석도 가능하게 할 것이다. 이들 포괄적인 분석은 특성화가 부족한 혼합 개체군의 사용으로는 불가능한 인간의 심혈관 질환에 대한 통찰력을 제공할 것이다.
방법의 상세한 내용
인간 ESC/iPSC 계통의 분화 유도
심장 분화를 위해서, 배아체(EB) 기반 프로토콜(Kattman 등의 2011 문헌 참조)의 변형 버전을 사용했다. 80% ~ 90% 가 합류된 hPSC 개체군을 단일 세포로 해리시키고(TrypLE, ThermoFisher), 오비탈 쉐이커 상에서 페니실린/스트렙토마이신(1%, ThermoFisher), L-글루타민(2 mM, ThermoFisher), 트랜스페린(150 μg/mL, ROCHE), 아스코르브산(50 μg/mL, Sigma), 및 모노티오글리세롤(50 μg/mL, Sigma), ROCK 억제제 Y-27632 (10 μM, TOCRIS) 및 rhBMP4(1 ng/mL, R&D)가 함유된 StemPro-34 배지(ThermoFisher) 중에서 18시간 동안 재응집시켜 EB를 형성하였다. 1일차에, EB를 위의 보충제가 함유된 StemPro-34(-ROCK 억제제 Y-27632) 및 지시된 농도의 rhBMP4, rh액티빈 A(R&D) 및 rhbFGF (5 ng/mL, R&D)로 이루어진 중배엽 유도 배지에 EB를 옮겼다. 3일차에, EB를 수확하고, IMDM으로 세척한 뒤, StemPro-34, Wnt 억제제 IWP2(1 μM, TOCRIS) 및 rhVEGF(10 ng/mL, R&D)로 이루어진 심장 중배엽 지정 배지에 옮겼다. 5일차에, EB를 rhVEGF(5 ng/mL)이 함유된 StemPro-34에 7일 동안 옮기고, 그런 다음 추가 사이토카인이 없는 StemPro-34 배지에 추가로 8일 동안 옮겼다. 20일차에, NKX2-5:GFP 및 SIRPa의 발현 및 CD90의 결핍에 기초하여 HES3-NKX2-5gfp/w 유래의 심근세포를 분석하고 분리하였다. 비유전자이식 hPSC 계통으로부터 생성된 심근세포를 분석하여 SIRPa+CD90- 개체군으로 단리하였다. 배지는 매 3일마다 교체하였다. 배양물을 첫 12일 동안은 저산소 환경(5% CO2, 5% O2, 90% N2)에서, 이어지는 8일 동안은 정상 산소 환경(5% CO2)에서 인큐베이션하여 총 20일 동안 인큐베이션하였다. 분화 전반에 걸쳐 현탁 배양물을 유지하기 위해 초저부착 6-웰 접시(Corning)에서 EB를 배양하였다.
심방 및 심실 유도 조건의 최적화
최적의 심방 유도 조건을 결정하기 위해 액티빈 A 및 BMP4 농도는 4일차에 ALDH+CD235a- 세포의 비율이 가장 높은 중배엽 개체군의 식별에 기초하여 선택하였는데, 20일차에는 CTNT+MLC2V- 심근세포를 생성하는 가장 큰 전위가 나타났다. 최적화에 이어서, 심방 심근세포의 생성을 위해 3일차에서 5일차까지 ATRA(0.5 μM, Sigma) 또는 레티놀(2 μM, Sigma) 중 하나를 심장 중배엽 지정 배지에 포함시켰다.
최적의 심실 유도 조건을 결정하기 위해, 액티빈 A와 BMP4의 농도는 높은 비율의 CD235a+ 세포를 함유하고 ALDH+ 세포는 함유하지 않은 중배엽 개체군의 식별에 기초하여 선택하였고, 20일차에 높은 비율의 CTNT+MLC2V+를 생성하였다.
유세포 계측 및 세포 분류
2일차 내지 6일차에, EB를 실온(RT)에서 2~4분동안 TrypLE로 해리시켰다. 20일차에, EB를 실온에서 밤새 HANK 완충액 중의 2형 콜라겐분해효소(0.5mg/mL, Worthington)에서 인큐베이션한 후 전술한 바와 같이 TrypLE 처리에 의해 해리시켰다. 다음의 항체가 염색에 사용되었다: 항PDGFRa-PE (R&D Systems, 3:50), 항CD235a-APC (BD PharMingen, 1:100), 항SlRPa-PeCy7 (Biolegend, 1:1000), 항CD90-APC (BD PharMingen, 1:1000), CTNT의 항심장 이소형(ThermoFisher Scientific, 1:2000), 또는 항미오신 경쇄(Abcam,1:1000). 미접합 1차 항체의 경우, 다음의 2차 항체가 검출에 사용되었다: 염소 항마우스 IgG-APC (BD Pharmigen, 1:250), 또는 당나귀 항토끼 IgG-PE (Jackson ImmunoResearch, 1:250). 상세한 항체 정보는 표 2에 기술된다.
시약 및 또는 리소스 공급원 식별자
항체
PDGFRα+에 대해 단클론성인 마우스 (클론 α+R1), PE 접합됨 BD PharMingen 카탈로그# 556002; RRID: AB_396286
GD255a(클론 HIR2)에 대해 단클론성이고, APG 접합된 마우스 BD PharMingen 카탈로그# 551336; RRID: AB_398499
SIRPα+(클론 SE5A5)에 대해 단클론성이고, PeCy7 접합된 마우스 Biolegend 카탈로그# 323807; RRID: AB_126443
GD90(클론 5E10)에 대해 단클론성이고, APG 접합된 마우스 BD PharMingen 카탈로그# 559869; RRID: AB_398677
CTNT (clone 13-11) ThermoFisher 카탈로그# MA5-12960; RRID: AB_11000742
MLC2V에 대해 단클론성인 래빗 Abcam 카탈로그# 79935; RRID: AB_1952220
APC 접합된 염소 항마우스 IgG (H+L) BD PharMingen 카탈로그# 550826; RRID: AB_398465
PE 접합된 당나귀 항토끼 IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 카탈로그# 711-116-152; RRID: AB_2340599
COUP-TFII (클론 H7147)에 대해 단클론성인 마우스 R&D 카탈로그# PP-H7147-00; RRID: AB_2155627
CTNT에 대해 단클론성이 토끼 Genway Biotech 카탈로그# GWB-25E5E5
PE 접합된 당나귀 항토끼 IgG (H+L) ThermoFisher 카탈로그# A31572; RRID: AB_162543
당나귀 항마우스 IgG (H+L), AlexaFIuor647 접합됨 ThermoFisher 카탈로그# A31571; RRID: AB_162542
생물학적 샘플
인간 태아 심장 조직 R. Hamilton
(SickKids Hospital, 캐나다)에 의해 제공됨		 N/A
화학물질, 펩티드, 및 재조합 단백질
페니실린/스트렙토마이신 ThermoFisher 카탈로그# 15070063
L-글루탐산염 ThermoFisher 카탈로그# 25030081
비필수 아미노산 ThermoFisher 카탈로그# 11140-050
트란페린 ROCHE 카탈로그# 10652202
아스코르브산 Sigma 카탈로그# A-45440
모노티오글리세롤 Sigma 카탈로그# M-6145
β-메르캅토에탄올 ThermoFisher 카탈로그# 21985-023
RICK 억제제 Y-27632 Tocris 카탈로그# 11254
재조합 인간 BMP4 R&D 카탈로그# 314-BP
재조합 인간 액티빈 A R&D 카탈로그# 338-AC
재조합 인간 bFGF R&D 카탈로그# 223-FB
IWP2 (Wnt 억제제) Tocris 카탈로그# 3533
재조합 인간 VFGF R&D 카탈로그# 293-VE
전-트랜스 RA Sigma 카탈로그# R2625
레티놀 Sigma 카탈로그# R7632
SB-431542 (TFGβ 억제제) Sigma 카탈로그# S4317-5MG
2형 콜라겐분해효소 Worthington 카탈로그# 4176
AM580 (RARα+ 작용제) Tocris 카탈로그# 0760
AC55649 (RARβ 작용제) Tocris 카탈로그# 2436
CD437 (RARγ 작용제) Tocris 카탈로그# 1549
우태혈청 (FCS) Wisent 카탈로그# 088-150
소혈청 알부민 (BSA) Sigma 카탈로그# A2153
성장 인자가 감소된 매트리겔(Matrigel) Coming 카탈로그# 356230
글리신 Sigma 카탈로그# G2289
SlowFade gold antifade + DAPI ThermoFisher 카탈로그# S36939
중요한 상업적 분석
Aldefluor 분석 키트 STEMCELL Technologies 카탈로그# 1700
무-Rnase Dnase로 처리된 RNAqueous-마이크로 키트 Ambion 카탈로그# AM1931
TRIzol ThermoFisher 카탈로그# 15596026
Superscript III 역전사효소 키트 ThermoFisher 카탈로그# 18080044
QuantiFast SYBR Green PCR 키트 QIAGEN 카탈로그# 204145
기탁된 데이터
HES2 hESC 및 MSC-iPS1 hiPSC 계통에 대한 최적화 데이터 본 문서; Mendeley Data http//cx.coi.org/10.17632/7z7c5v2c3W.1
실험 모델: 세포주
인간 ESC: HES3 주 호주 Monash University의 E. Stanley 박사와 A. Elefanty 박사로부터 기증 받음 (Elliot 등. 2011 문헌) N/A
인간 ESC: HES2 주 WiCell 카탈로그# ES02
인간 iPSC: MSC-iPSC1 주 미국 Harvard Medical School의 G. Daley 박사로 부터 기증 받음(Park 등, 2008 문헌) N/A
올리고뉴클레오티드
PCR 프라이머 서열에 대해서는 표 S2 참조 본 문서 표 S2
소프트웨어 및 알로리즘
pCLAMP Molecular Devices https://www.moleculardevices.com/systems/conventional-patch-clamp/pclamp-10-software
FlowJo Tree Star https://www.flowjo.com
FV10-ASW Olympus https://www.olympus-lifescience.com
MultiExperiment Viewer MeV http://mev.tm4.org/
GraphPad Prism 6 GraphPad Software http://www.graphpad.com/scientific-software/prism/
기타
StemPro-34 media ThermoFisher 카탈로그# 10640019
DMEM/F12 Cellgro 카탈로그# 10-092-CV
넉아웃 혈청 교체 ThermoFisher 카탈로그# 10828028
TrypLE ThermoFisher 카탈로그# 12605010
세포 표면 마커 분석을 위해, 5% 우태혈청(FCS)(Wisent) 및 0.02% 아지드화 나트륨이 함유된 PBS로 이루어진 4℃의 FACS 완충액에서 30분 동안 세포를 염색하였다. 세포내 염색을 위해, 4℃의 PBS에서 4% PFA로 15분 동안 세포를 고정시킨 다음, 4℃에서 20분 동안 90% 메탄올로 투과성을 부여하였다. 0.5% BSA(Sigma)가 함유된 PBS로 세포를 세척하고, 4℃의 FACS 완충액에서 미접합 1차 항체로 밤새 염색하였다. 0.5% BSA가 함유된 PBS로 염색된 세포를 세척하고, 4℃의 FACS 완충액에서 1시간 동안 2차 항체로 염색하였다.
LSR II 유세포 계측기(BD)를 사용해 염색된 세포를 분석하였다. 세포 분류를 위해, 0.5% FCS가 함유된 IMDM에 염색된 세포를 보관하고 Sickids/UHN 유세포 분석기에서 Influx (BD), FACSAriaII (BD), MoFlo-XDP (BD) 및 FACSAria Fusion (BD)을 사용하여 분류하였다. FlowJo 소프트웨어(Tree Star)를 사용해 데이터를 분석하였다.
Aldefluor 분석
제조제가 제공한 지침에 따라 AldefluorTM 분석(STEMCELL Technologies)을 수행하였다. 요약하면, 2~6일차에 전술한 바와 같이 EB를 해리시켰다. 0.1% BSA 및 BAAA 기질(0.12 mg/mL)이 함유된 37℃의 aldefluor 분석 완충액에서 60분 동안 2x106 세포/mL의 농도로 세포를 염색하였다. 알데히드 탈수소 효소 억제제 DEAB(0.75 nM)를 음성 대조 샘플에 첨가하였다. 5%의 FCS 및 10%의 aldefluor 분석 완충액이 함유된 IMDM으로 이루어진 저온 배지로 세포를 세척하였다. 그런 다음, 4℃의 저온 세척 배지에서 세포 표면 마커에 대한 상기 표시된 농도의 항체로 20분 동안 세포를 염색하였다. 염색된 세포를 전술한 바와 같이 분석하였다. 분석 도중에는 세포를 저온 세척 배지에 보관하였다. 세포 분류를 위해, FCS를 KnockOutTM 혈청 대체물(ThermoFisher)로 대체하여 세포 분화에 미치는 혈청 함유 사이토카인의 임의의 영향을 방지하였다. 분류 절차 전반에 걸쳐 10% aldefluor 분석 완충액이 함유된 StemPro-34에 세포를 유지시켰다. 분류된 세포를 수집하여 ROCK 억제제(10 μM), IWP2(0.5 μM) 및 rhVEGF(5 ng/mL)가 함유된 StemPro-34에서 재응집시켰다.
면역 조직 화학
20일차에, EB를 전술한 바와 같이 해리시키고, 매트리젤(25%, v/v, BD)로 사전 코팅된 12 mm 커버 글라스(VWR) 상에 세포를 플레이팅하였다. 세포를 3~5일 동안 배양하여 접착성 세포 단일층이 형성되도록 하였다. 실온의 PBS에서 4% PFA로 10분 동안 세포를 고정시키고, 0.3% TritonX, 200 mM 글리신(Sigma)가 함유된 PBS로 실온에서 20분 동안 투과성을 부여하였다. 10% FCS, 0.1% TritonX, 및 2% BSA로 세포를 차단하였다. 염색에 사용된 항체는 다음과 같다: CTNTDML 마우스 항심장 이소형(ThermoFisher Scientific, 1:200), 토끼 항인간/설치류 미오신 경쇄 2(Abcam, 1:200), 마우스 항인간 COUPTF-II(R&d, 1:1000), 또는 토끼 항인간 CTNT(Genway Biotech Inc, 1:1000). 미접합 1차 항체를 검출하기 위해, 다음의 2차 항체가 사용되었다: 당나귀 항마우스 IgG-A647(ThermoFisher, 1:1000), 또는 당나귀 항토끼 IgG-A555(ThermoFisher, 1:1000). 상세한 항체 정보는 주요 리소스표에 기술된다. 세포를 0.1% TritonX, 및 0.1% BSA가 함유된 PBS로 이루어진 염색 완충액에서 1차 항체로 밤새 4℃에서 염색하였다. 염색된 세포를 오비탈 쉐이커 상에서 염색 완충액으로 15분 동안 실온에서 세척하였다. 그런 다음, 세포를 염색 완충액에서 2차 항체로 1시간 동안 실온에서 염색하고, 이어서 전술한 세척 단계를 수행하였다. DAPI가 함유된 SlowFade Gold Antifade 시약(ThermoFisher)를 사용해 샘플을 장착하였다. 올림푸스 FluoView 1000 레이저 스캐닝 공초점 현미경을 사용해 염색된 세포를 분석하여다. 이미지 획득을 위해 FV10-ASW 소프트웨어를 사용하였다.
정량 실시간 PCR
무-RNase DNase 처리제(Ambion)가 포함된 RNAqueous-마이크로 키트를 사용해 hPSC 유래 개체군의 총 RNA를 단리하였다. 절개한 인간 태아 심장의 심실 및 심방 조직 유래의 RNA를 TRIzol 방법(ThermoFisher)를 사용해 단리하고, DNase(Ambion)으로 처리하였다. 단리된 RNA 중 100 ng 내지 1 mg을 올리고(dT) 프라이머와 랜덤 헥사머 및 Superscript III 역전사 효소(ThermoFisher)를 사용해 역전사하였다. QRT-PCR은 QuantiFast SYBR Green PCR 키트(QIAGEN)를 사용해 EP Real-Plex MasterCycler(Eppendorf)에서 수행하였다. 모든 실험은 2회로 준비하였고, PCR 반응의 효율을 평가하기 위한 25 ng/mL 내지 2.5 pg/mL 범위의 초음파처리된 인간 게놈 DNA 표준의 10배 희석 시리즈, 및 하우스키핑 유전자 TBP에 대한 각 유전자의 카피 수를 포함시켰다. 오픈 소스 소프트웨어인 MultiExperiment Viewer(MeV)를 사용해 유전자 발현 데이터의 열 지도를 생성하였다.
패치 클램프
패치 클램프를 사용한 전기 생리학적 특성화를 위해, 전술한 바와 같이 FACS에 의해 EB를 해리시키고 NKX2-5+SIRPa+CD90- 심근세포를 단리하였다. 단리된 세포를 ROCK 억제제(100 mM)가 보충된 StemPro-34 배지에서 1.25~5x105 세포/mL로 현탁하고 70 mm 필터를 통해 여과하였다. 이 세포 현탁액 중 40 μl를 30 mm 접시에서 매트리젤(10% v/v)로 미리 코팅된 글라스 커버 슬립(3x5 mm)에 적가하였다. 세포를 16~18시간 동안 40 mL 부피로 배양하여 세포 부착을 용이하게 하였다. 그런 다음, 2 mL의 StemPro-34 배지로 접시를 가득 채웠다. 배지는 매 4일마다 교체하였다. 플레이팅 후 7일과 14일 사이에 패치 클램프 기록을 위해 배양물을 사용하였다. 표준 패치 클램프 기술을 사용해 전류 모드와 전압 모드 각각에서 AP와 막 전류를 측정하였다(Axopatch 200B, Molecular Devices).
전압과 전류는 5KHz 샘플링 레이트로 기록하고(DigiData, Molecular Devices) pCLAMP 소프트웨어(Molecular Devices)로 분석하였다. 붕규산 유리 마이크로전극을 사용하였으며, 피펫 용액이 채워질 때의 팁 저항은 2~5 MU였다. 직렬 저항은 rf70%로 보상하였다. 전세포 파열 패치 방법을 사용하여 다음의 조 용액(bath solution)으로 AP와 막 전류를 실온에서 기록 하였다(mM 단위): NaCl 140, KCl 5.4, CaCl2 1.2, MgCl2 1, 글루코오스 10, 및 HEPES 10 (pH 7.4, NaOH로 조절됨). 피펫 용액의 구성은 다음과 같다(mW 단위): 아스파르트산 칼륨 120, KCl 20, NaCl 5, MgATP 5 및 HEPES 10 (pH 7.2, KOH로 조절됨).
무활동 심근세포에서, 1 Hz 주파수에서 5~15 pA의 1~3 ms 길이의 탈분극 전류 펄스에 의해 AP를 유도하였다. 자발적 AP 및 자극에 의한 AP는 다음 파라미터에 기초하여 분류하였다: 박동원 유사: dv/dtmax <10 V/s, 심방 유사: dv/dtmax R10 V/s 및 APD30/90 < 0.3, 심실 유사: dv/dtmax R 10 V/s 및 APD30/90 R 0.3. 아세틸콜린 활성 칼륨 전류(IKACh)는 CCh-민감성 전류(CCh에 의해 활성화됨)로서 특성화하였다. 전류는 -40 mV의 유지 전위로부터 20 mV ~ -120 mV 범위의 350 ms 전압 램프 프로토콜에 대응하여 따라 카르바콜(CCH, 10 mM)을 첨가하기 전후에 측정하였다(각각의 원 전류 추적트레이스에서 전압 프로토콜 삽입 참조). IKACh는 CCh가 있을 때 기록된 전류에서 CCh 없이 기록된 전류를 차감하여 정량화하였다.
정량화 및 통계적 분석
모든 데이터는 평균 ± 평균의 표준 오차(SEM)로서 표시된다. 표시된 샘플 크기(n)는 독립적인 세포 배양 복제물 및 개별 조직 샘플을 포함하는 생물학적 복제물을 나타낸다. 단일 세포 데이터(박동 속도 정량화 및 패치-클램프 데이터)의 경우, 샘플 크기(n)는 R 3회의 독립 실험에서 분석된 세포의 수를 나타낸다. 통계적 방법을 사용해 샘플 크기를 미리 결정하지 않았다. 실험의 특성상, 무작위 배정은 수행하지 않았고 맹검 조사를 수행하지 않았다. 통계적 유의성은 GraphPad Prism 6 소프트웨어에서 스튜던트의 t 검정(언페어드, 양측 분포)을 사용해 결정하였다. 결과는 p < 0.05 (*/#)인 경우 유의한 것으로, p < 0.01 (**/##)인 경우 매우 유의한 것으로 간주하였다. 모든 통계적 파라미터를 각각의 도면과 도면의 범례에 보고되어 있다.
본 발명의 바람직한 구현예가 본원에 기술되었지만, 본 발명의 사상이나 첨부된 청구범위의 범주를 벗어나지 않고도 이에 대한 변경이 이루어질 수 있다는 것을 당업자는 이해할 것이다. 다음의 참조 문헌 목록을 포함하여 본원에 기술된 모든 문서는 참조로서 본원에 통합된다.

Claims (53)

  1. 심실 심근세포가 농축된 심근세포의 개체군으로서, 상기 개체군은 본질적으로 박동원 세포가 없는, 개체군.
  2. 제1항에 있어서, 상기 개체군은 박동원 세포가 전혀 없는, 개체군.
  3. 환자에서 심부전 또는 심근 경색을 치료하기 위한 의약 조성물로서, 상기 의약 조성물은 제1항 또는 제2항의 상기 심근세포의 개체군 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는, 의약 조성물.
  4. 심실 심근세포가 농축된 심근세포의 개체군을 생산하는 방법으로서, 상기 방법은:
    중배엽 유도 배지에서 다능성 줄기 세포를 인큐베이션하는 단계로서, 상기 중배엽 유도 배지는 BMP 성분 및 심실 중배엽을 생성하기에 충분한 액티빈의 유효량을 포함하는, 단계; 및 이어서
    상기 인큐베이션된 세포를 적절한 배지(들)에서 배양하여 심실 심근세포가 농축된 심근세포의 개체군을 생성하는 단계를 포함하는, 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 액티빈 성분의 농도는 상기 BMP 성분의 농도보다 더 높은, 방법.
  6. 제4항 또는 제5항에 있어서, 상기 액티빈 성분에 대한 상기 BMP 성분의 비율은 약 0.3~1:1, 약 0.5:1, 또는 약 0.8:1인, 방법.
  7. 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 액티빈 성분의 농도는 CD235a 발현 중배엽 세포의 수준을 측정하고 이를 RALDH2 발현 중배엽세포의 수준과 비교하는 것에 의해 결정되는, 방법.
  8. 제4항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 액티빈 성분의 농도는 RALDH2 발현 중배엽 세포와 비교하여 더 많은 CD235a 발현 중배엽 세포를 우선적으로 생성하는 농도를 결정하는 것에 의해 선택되는, 방법.
  9. 제4항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 액티빈 성분은 약 4 ng/mL에서 약 20 ng/mL까지의 양으로 첨가되는, 방법.
  10. 제4항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 액티빈 성분의 농도는 6~20 ng/mL인, 방법.
  11. 제4항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 BMP 성분의 농도는 약 3 ng/mL 내지 약 20 ng/mL인, 방법.
  12. 제4항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 BMP 성분의 농도는 5 ng/mL 또는 10 ng/mL인, 방법.
  13. 제4항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 액티빈 성분의 농도는 12 ng/mL인, 방법.
  14. 제4항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 BMP 성분은 BMP4인, 방법.
  15. 제4항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 액티빈 성분은 액티빈 A인, 방법.
  16. 제4항 내지 제15항 중 어느 한 항에 이어서, 생성된 상기 심근세포 개체군의 적어도 일부는 심장 복구를 필요로 하는 대상체를 치료하는 데 사용되는, 방법.
  17. 제16항에 있어서, 심장 복구를 필요로 하는 상기 대상체는 심부전의 위험이 있거나, 심부전을 앓고 있고/있거나 심근 경색증을 앓고 있는, 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 치료는 심근 경색의 발병 전, 도중 또는 후에 이루어지는, 방법.
  19. 심실 심방 심근세포가 농축된 심근세포의 개체군을 생산하는 방법으로서, 상기 방법은:
    중배엽 유도 배지에서 다능성 줄기 세포를 인큐베이션하는 단계로서, 상기 중배엽 유도 배지는 BMP 성분 및 심방 중배엽을 생성하기에 충분한 액티빈의 유효량을 포함하는, 단계; 이어서
    상기 세포에 레티노산 성분을 첨가하는 단계로서, 상기 레티노산 성분을 첨가하는 상기 단계는 중배엽 배양 배지에서 인큐베이션하는 상기 단계 도중에 또는 후에 발생하는 것인 단계; 및
    심방 심근세포가 농축된 심근세포의 개체군이 생성되도록 상기 인큐베이션한 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 레티노산 성분은 상기 세포가 RALDH2 양성이면서 CD235a 음성일 때 첨가되는, 방법.
  21. 제19항 또는 제20항에 있어서, 상기 액티빈 성분에 대한 상기 BMP 성분의 비율은 약 1.5 내지 1 이상인, 방법.
  22. 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 액티빈 성분에 대한 상기 BMP 성분의 비율은 3:2인, 방법.
  23. 제19항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 BMP 성분은 약 3 ng/mL 내지 약 100 ng/mL의 농도로 존재하는, 방법.
  24. 제19항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 BMP 성분은 약 3 ng/mL의 농도로 존재하는, 방법.
  25. 제19항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 액티빈 성분은 약 0.01 ng/mL에서 약 6 ng/mL까지의 양으로 존재하는, 방법.
  26. 제19항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 액티빈 성분은 약 2 ng/mL의 농도로 존재하는, 방법.
  27. 제19항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 레티노산 성분은 트랜스 레티노산이거나 레티놀인, 방법.
  28. 제19항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 레티노산 성분은 50 nm 내지 5 gM의 농도로 첨가되는, 방법.
  29. 제19항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 레티노산 성분은 500 nM의 농도로 첨가되는, 방법.
  30. 제19항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 BMP 성분은 BMP4인, 방법.
  31. 제19항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 액티빈 성분은 액티빈 A인, 방법.
  32. 제19항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 BMP 성분은 1일 후에 상기 중배엽 유도 배지에 첨가되는, 방법.
  33. 제19항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 액티빈 성분은 1일 후에 상기 중배엽 유도 배지에 첨가되는, 방법.
  34. 제19항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 레티노산 성분은 상기 방법의 약 3일차 내지 5일차에 첨가되는, 방법.
  35. 제19항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 BMP 성분은 상기 방법의 3일차에는 상기 중배엽 유도 배지에 첨가되지 않는, 방법.
  36. 제19항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, FGF 억제제가 상기 방법의 3일차에 상기 중배엽 유도 배지로부터 배제되는, 방법.
  37. 제4항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 다능성 줄기 세포를 상기 중배엽 유도 배지에서 인큐베이션하기 전에, 배아체의 형성 및/또는 응집에 적절한 배지에서 상기 다능성 줄기 세포를 인큐베이션하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  38. 제4항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법에 의해 생산된 상기 세포는 잠재적인 치료 조성물에 대해 스크리닝하기 위한 시험관 내 분석에 사용되는, 방법.
  39. 심방 심근세포가 농축된 단리된 심근세포의 개체군으로서, 상기 심방 심근세포는 적어도 또는 약 50%의 심방 심근세포, 적어도 또는 약 60%의 심방 심근세포, 적어도 또는 약 70%의 심방 심근세포, 적어도 또는 약 80%의 심방 심근세포, 또는 적어도 또는 약 90%의 심방 심근세포를 포함하는, 단리된 심근세포의 개체군.
  40. 제39항에 있어서, 상기 개체군은 제18항 내지 제38항 중 어느 한 항의 방법에 따라 수득되는, 심근세포의 개체군.
  41. 심실 심근세포가 농축된 단리된 심근세포의 개체군으로서, 상기 심실 심근세포는 적어도 또는 약 50%의 심실 심근세포, 적어도 또는 약 60%의 심실 심근세포, 적어도 또는 약 70%의 심실 심근세포, 적어도 또는 약 80%의 심실 심근세포, 적어도 또는 약 90%의 심실 심근세포를 포함하는, 단리된 심근세포의 개체군.
  42. 제41항에 있어서, 상기 개체군은 박동원 세포가 본질적으로 없거나 전혀 없는, 개체군.
  43. 제41항 또는 제42항에 있어서, 상기 개체군은 제4항 내지 제17항 중 어느 한 항의 방법에 따라 수득되는, 개체군.
  44. 심장 복구를 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법으로서, 상기 대상체에게 제1항, 제2항, 또는 제41항 내지 제43항 중 어느 한 항에 따른 심근세포의 상기 개체군을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  45. 제44항에 있어서, 상기 대상체는 심부전의 위험이 있고, 심부전을 앓고 있고/있거나 심근 경색증을 경험한 적이 있는, 방법.
  46. 제45항에 있어서, 상기 심근 경색은 상기 환자의 심실에 있는, 방법.
  47. 제1항, 제2항, 또는 제40항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 심장 복구를 필요로 하는 대상체의 치료에 사용하기 위한 심근세포의 상기 개체군.
  48. 제1항, 제2항, 또는 제41항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 심장 복구를 필요로 하는 대상체의 치료용 약제의 조제에 있어서 상기 심근세포의 개체군의 용도.
  49. 중배엽 세포의 개체군에서 심방 중배엽을 검출하는 프로세스로서, RALDH2를 검출하는 단계를 포함하되, RALDH2의 존재는 심방 중배엽을 나타내는 것인, 프로세스.
  50. 중배엽 세포의 개체군에서 심실 중배엽을 검출하는 프로세스로서, CD235a를 검출하는 단계를 포함하되, CD235a의 존재는 심실 중배엽을 나타내는 것인, 프로세스.
  51. 동방결절성 박동원 세포 또는 심외막 세포가 농축된 심근세포의 개체군을 생산하기 위한 방법으로서, 상기 방법은: 중배엽 유도 배지에서 다능성 줄기 세포를 인큐베이션하는 단계로서, 상기 중배엽 유도 배지는 ALDH+/CD235- 중배엽을 생성하기에 충분한 양으로 BMP 성분 및 액티빈 성분을 추가로 포함하는, 단계; 이어서,
    상기 인큐베이션된 세포를 적절한 배지에서 WNT, FGFi 및 BMP 중 하나 이상으로 배양하여 동방결절성 박동원 세포 또는 심외막 세포가 농축된 심근세포의 개체군을 생성하는 단계를 포함하는, 방법.
  52. 제51항의 방법에 의해 생산된 심근세포의 개체군.
  53. 시험 화합물 또는 제제의 잠재적 심장 독성을 스크리닝 또는 평가하는 방법으로서, 상기 방법은 전술한 세포 개체군의 청구항 중 어느 하나에 따를 심근세포 개체군을 상기 시험 화합물에 노출시키는 단계, 및 상기 세포의 생존력, 수축력, 전위 변화 및/또는 기타 기능성을 평가하는 단계를 포함하는, 방법.
KR1020197018959A 2016-12-04 2017-12-04 인간 다능성 줄기 세포로부터 심방 및 심실 심근세포 계통의 생성 KR102666175B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020237040626A KR20230167143A (ko) 2016-12-04 2017-12-04 인간 다능성 줄기 세포로부터 심방 및 심실 심근세포 계통의 생성

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662429823P 2016-12-04 2016-12-04
US62/429,823 2016-12-04
US201662430815P 2016-12-06 2016-12-06
US62/430,815 2016-12-06
PCT/CA2017/051460 WO2018098597A1 (en) 2016-12-04 2017-12-04 Generating atrial and ventricular cardiomyocyte lineages from human pluripotent stem cells

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020237040626A Division KR20230167143A (ko) 2016-12-04 2017-12-04 인간 다능성 줄기 세포로부터 심방 및 심실 심근세포 계통의 생성

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20190091490A true KR20190091490A (ko) 2019-08-06
KR102666175B1 KR102666175B1 (ko) 2024-05-20

Family

ID=62241216

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020237040626A KR20230167143A (ko) 2016-12-04 2017-12-04 인간 다능성 줄기 세포로부터 심방 및 심실 심근세포 계통의 생성
KR1020197018959A KR102666175B1 (ko) 2016-12-04 2017-12-04 인간 다능성 줄기 세포로부터 심방 및 심실 심근세포 계통의 생성

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020237040626A KR20230167143A (ko) 2016-12-04 2017-12-04 인간 다능성 줄기 세포로부터 심방 및 심실 심근세포 계통의 생성

Country Status (13)

Country Link
US (1) US20190336537A1 (ko)
EP (1) EP3548608A4 (ko)
JP (2) JP7157742B2 (ko)
KR (2) KR20230167143A (ko)
CN (1) CN110268048B (ko)
AU (1) AU2017369684A1 (ko)
BR (1) BR112019011550A2 (ko)
CA (1) CA3045182A1 (ko)
IL (1) IL267012A (ko)
MX (1) MX2023003296A (ko)
RU (1) RU2019120696A (ko)
SG (1) SG10202105977WA (ko)
WO (1) WO2018098597A1 (ko)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2018510649A (ja) 2015-02-17 2018-04-19 ユニバーシティー ヘルス ネットワーク 洞房結節様ペースメーカー心筋細胞および心室様心筋細胞を作製および使用するための方法
DE102018212005B4 (de) * 2018-07-18 2020-08-06 Universität Rostock Herzschrittmacherzellen auf Chip zur Etablierung eines autonom regulierbaren elektrischen Schrittmachers
CA3139072A1 (en) 2019-05-03 2020-11-12 University Health Network Cardiomyocyte compositions and use thereof
CA3156678A1 (en) 2019-10-09 2021-04-15 Bluerock Therapeutics Lp CELLS WITH SUSTAINED TRANSGENIC EXPRESSION
CN111647640A (zh) * 2020-05-22 2020-09-11 中国药科大学 一种快速精准实现慢性心力衰竭心功能病程分级的方法
CN112359012B (zh) * 2020-10-22 2022-11-25 中国科学院水生生物研究所 诱导多能干细胞分化制备心脏瓣膜内皮细胞的方法及其应用
IL306134A (en) 2021-03-25 2023-11-01 Bluerock Therapeutics Lp Methods for obtaining induced pluripotent stem cells
CN113462642A (zh) * 2021-08-12 2021-10-01 呈诺再生医学科技(珠海横琴新区)有限公司 间充质干细胞的快速诱导分化方法、试剂盒及其应用
WO2024011320A1 (en) * 2022-07-12 2024-01-18 University Health Network Atrioventricular node-like pacemaker cells

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016131137A1 (en) * 2015-02-17 2016-08-25 University Health Network Methods for making and using sinoatrial node-like pacemaker cardiomyocytes and ventricular-like cardiomyocytes

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103189502A (zh) * 2010-08-27 2013-07-03 大学健康网络 基于sirpa表达富集源自多能干细胞的心肌祖细胞和心肌细胞的方法
GB201121101D0 (en) * 2011-12-08 2012-01-18 Nhs Blood & Transplant A method of preparing isolated cells and uses
SG10201910753RA (en) * 2013-09-20 2020-01-30 Repairon Gmbh A method to direct differentiation of pluripotent stem cells into functional heart muscle
ES2689804T3 (es) * 2013-11-20 2018-11-15 Miltenyi Biotec Gmbh Composiciones de subpoblaciones de cardiomiocitos

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016131137A1 (en) * 2015-02-17 2016-08-25 University Health Network Methods for making and using sinoatrial node-like pacemaker cardiomyocytes and ventricular-like cardiomyocytes

Also Published As

Publication number Publication date
KR20230167143A (ko) 2023-12-07
CN110268048A (zh) 2019-09-20
CN110268048B (zh) 2024-07-09
WO2018098597A1 (en) 2018-06-07
BR112019011550A2 (pt) 2019-10-15
CA3045182A1 (en) 2018-06-07
MX2023003296A (es) 2023-04-13
SG10202105977WA (en) 2021-07-29
JP2022191357A (ja) 2022-12-27
RU2019120696A3 (ko) 2021-06-29
RU2019120696A (ru) 2021-01-11
JP2020513244A (ja) 2020-05-14
IL267012A (en) 2019-07-31
KR102666175B1 (ko) 2024-05-20
AU2017369684A1 (en) 2019-06-20
US20190336537A1 (en) 2019-11-07
EP3548608A1 (en) 2019-10-09
JP7157742B2 (ja) 2022-10-20
EP3548608A4 (en) 2020-05-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102666175B1 (ko) 인간 다능성 줄기 세포로부터 심방 및 심실 심근세포 계통의 생성
US11730770B2 (en) Methods for making and using sinoatrial node-like pacemaker cardiomyocytes and ventricular-like cardiomyocytes
Lee et al. Human pluripotent stem cell-derived atrial and ventricular cardiomyocytes develop from distinct mesoderm populations
EP2273996B1 (en) Human cardiovascular progenitor cells
Kolossov et al. Identification and characterization of embryonic stem cell‐derived pacemaker and atrial cardiomyocytes
JP5677698B2 (ja) ヒト胚性幹細胞の侵害受容器分化のための方法およびその使用
Tsoi et al. Temporal Control of the WNT Signaling Pathway During Cardiac Differentiation Impacts Upon the Maturation State of Human Pluripotent Stem Cell Derived Cardiomyocytes
JP6989591B2 (ja) 多能性細胞の誘導及び自己再生並びにその使用
NZ795019A (en) Generating atrial and ventricular cardiomyocyte lineages from human pluripotent stem cells
NZ795027A (en) Generating atrial and ventricular cardiomyocyte lineages from human pluripotent stem cells
US20240067932A1 (en) Methods and compositions for generating hemogenic endothelial cells from pluripotent stem cells
Tsoi et al. Chow LM-c and Poon EN (2022) Temporal Control of the WNT Signaling Pathway During Cardiac Differentiation Impacts Upon the Maturation State of Human Pluripotent Stem Cell Derived Cardiomyocytes
Shumei et al. Retinoic acid promotes metabolic maturation of human Embryonic Stem Cell-derived Cardiomyocytes
WO2024079149A1 (en) Methods for producing sinoatrial node subpopulations
JP2022528737A (ja) Ａｂｃｇ２陽性角膜輪部幹細胞を得る又は維持する方法
Baio Microgravity Exerts an Age-Dependent Effect on Cardiovascular Progenitor Cell Development
WO2024020180A1 (en) Methods and compositions for generating endothelial cells from pluripotent stem cells
Dunn et al. Xiaojun Lian, Xiaoping Bao, Abraham Al-Ahmad, Jialu Liu, Yue Wu, Wentao Dong
Guddati Derivation of cardiomyocytes from embryonic stem cells and development of techniques to study cardiac lineage

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right