JP2022191357A - ヒト多能性幹細胞からの心房および心室心筋細胞系列の生成 - Google Patents

Abstract

【課題】ヒト多能性幹細胞からの心房および心室心筋細胞系列の生成の提供。【解決手段】多能性幹細胞から心筋細胞の集団を製造する方法が開示される。集団は、心房または心室のいずれかの心筋細胞が濃縮されたものであってよく、結果として得られた心室の集団は、ペースメーカー細胞を本質的に含まないものであってよい。方法は、ＢＭＰ成分、およびアクチビン成分を含む好適な培地中で多能性幹細胞をインキュベートすることを含み、アクチビンの量は心房または心室のいずれかの心筋細胞を濃縮するために変化させてよい。濃縮された集団の他に、それを使用して心臓の修復を必要とする患者を治療する方法が開示される。【選択図】図１５

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年１２月４日に出願された米国仮出願シリアル番号第６２／４２９，８２３号および２０１６年１２月６日に出願された米国仮出願シリアル番号第６２／４３０，８１５号への米国特許法第１１９条の優先権を主張する。これらの先行特許出願の内容全体は、以下に限定されないが、明細書、請求の範囲、および要約書のそれぞれの他に、あらゆる図面、表またはその図を含めて、参照することにより本明細書に明示的に組み込まれる。

本開示は、心房心筋細胞、心室心筋細胞の濃縮された集団を製造する方法およびそれを含む組成物、ならびに治療処置、疾患モデリング、創薬のためのその使用の他に、これらの濃縮された亜集団を同定するためのバイオマーカーおよび方法を提供する。

心臓疾患研究の目標は、心臓疾患において何が、そしてそれが何故起こっているのかをより詳細に理解すること、および損傷を予防しまたは損傷した心臓組織を修復もしくは置換するための方法を発見することである。既存の療法は、失った収縮機能を回復させることではなく心不全の進行を緩慢化させることを目的とする。現在、失った収縮機能を置換するための唯一の利用可能な治療オプションは全臓器移植であるが、需要が供給を大きく上回っているため、代替アプローチとして幹細胞ベースの療法に大きな関心が持たれている。移植の目的のために幹細胞から分化した心筋細胞を利用できることは特に有用であろう。ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）由来の心筋細胞の使用は、それが移植されると、損傷した心臓の筋肉を再肥大させ、収縮機能の改善を媒介できることを様々な研究は実証した（例えばＳｈｉｂａら（２０１２年）を参照）。しかしながら、課題の１つは、幹細胞由来の心筋細胞集団の混合した性質であり、これは、例えば、グラフト関連心室頻脈性不整脈などの問題に関与することがある。必要とされるのは、幹細胞をさらに分化させて、心室心筋細胞および心房心筋細胞などの心筋細胞のサブタイプの特定の濃縮された集団の形成を可能とし、かつ心筋細胞のこれらの濃縮された集団を治療の目的のために使用できるようにすることである。

一態様では、心房心筋細胞が濃縮された心筋細胞の集団を製造する方法であって、そのステップが、ｉ．少なくともＢＭＰ成分、任意選択でＢＭＰ４、および有効量のアクチビン成分、任意選択でアクチビンＡを含む中胚葉誘導培地中で多能性幹細胞をインキュベートして心房中胚葉を生成させることを含む、方法が提供される。この態様では、方法は、中胚葉誘導または心臓血管系列決定ステージの間に細胞にレチノイン酸成分をさらに加えること、および心房心筋細胞が濃縮された心筋細胞の集団が生成されるように前記細胞を培養することを含む。

一態様では、その心房中胚葉は、前記細胞が、ＲＡＬＤＨ２陽性、ＣＤ２３５陰性、およびＣＹＰ２６Ａ１陰性の１つまたは複数であることによって特徴付けられてよい。一実施形態では、アクチビン成分に対してＢＭＰ成分は３：２の比で提供される。別の実施形態では、アクチビン成分は約０．００１ｎｇ／ｍｌ～６ｎｇ／ｍｌの量で存在し、かつ、前記ＢＭＰ成分は約３ｎｇ／ｍｌ～約１００ｎｇ／ｍｌの量で存在する。

一態様では、心室心筋細胞が濃縮された心筋細胞の集団を製造する方法であって、そのステップが、心室中胚葉を生成するために充分なＢＭＰ成分、任意選択でＢＭＰ４、および有効量のアクチビン成分、任意選択でアクチビンＡを含む中胚葉誘導培地中で多能性幹細胞をインキュベートすること、およびその後、心室心筋細胞が濃縮された心筋細胞の集団を生成するために好適な培地中で前記細胞を培養することを含む、方法が提供される。一実施形態では、心室中胚葉を生成するために効果的な量のアクチビン成分は、前記心室中胚葉がＲＡＬＤＨ２陰性、ＣＤ２３５ａ陽性、およびＣＹＰ２６Ａ１陽性の１つまたは複数であることにより特徴付けられる。別の実施形態では、アクチビン成分の濃度はＢＭＰ成分の濃度より高い。一実施形態では、アクチビン成分は約６ｎｇ／ｍｌ～２０ｎｇ／ｍｌの量で存在し、かつ、前記ＢＭＰは約３ｎｇ／ｍｌ～約２０ｎｇ／ｍｌの量で存在する。

一態様では、心室心筋細胞が濃縮された心筋細胞の集団であって、ペースメーカー細胞を本質的に含まない、集団が提供される。別の態様では、集団はペースメーカー細胞を欠いている。別の態様では、心室心筋細胞が濃縮された心筋細胞の単離された集団であって、少なくとももしくは約５０％の心室心筋細胞、少なくとももしくは約６０％の心室心筋細胞、少なくとももしくは約７０％の心室心筋細胞、少なくとももしくは約８０％の心室心筋細胞、少なくとももしくは約９０％の心室心筋細胞、少なくとも約９５％の心室心筋細胞、または少なくとも約９９％の心室心筋細胞を含み、好ましくは本明細書に記載される方法にしたがって得られた、集団が提供される。本発明の一態様では、単離された集団はペースメーカー細胞を本質的に含まない（総細胞の５％未満）。好ましい実施形態では、集団は、１％未満のペースメーカー細胞、０．５％未満のペースメーカー細胞、０．１％未満のペースメーカー細胞、０．０１％未満のペースメーカー細胞、０．００１％未満のペースメーカー細胞、０．０００１％のペースメーカー細胞を含み、またはペースメーカー細胞を完全に欠いている。いかなる理論によっても縛られることを望まないが、ペースメーカー細胞の存在は、患者に導入された時に、筋肉の独立した別々の収縮を誘導し得ることが想定される。好ましい実施形態では、ペースメーカー細胞は、現在利用可能な技術を使用して心室心筋細胞の単離された集団中に検出できない。

一態様では、心房心筋細胞が濃縮された心筋細胞の単離された集団であって、少なくとももしくは約５０％の心房心筋細胞、少なくとももしくは約６０％の心房心筋細胞、少なくとももしくは約７０％の心房心筋細胞、少なくとももしくは約８０％の心房心筋細胞、または少なくとももしくは約９０％の心房心筋細胞、または少なくとももしくは約９５％の心房心筋細胞、または少なくとももしくは約９９の心房心筋細胞を含み、好ましくは本明細書に記載される方法にしたがって得られた、集団が提供される。

一態様では、心臓の修復を必要とする対象、例えば、心不全を有する対象、または心不全のリスクがある対象などを治療する方法であって、対象に本明細書に記載される心室心筋細胞の集団を投与することを含む、方法が提供される。

一態様では、心臓の修復を必要とする対象、例えば、心不全を有する対象または心不全のリスクがある対象などの治療において使用するための、本明細書に記載される心室心筋細胞の集団が提供される。

一態様では、心臓の修復を必要とする対象、例えば、心不全を有する対象または心不全のリスクがある対象などの治療のための医薬の調製における、本明細書に記載される心室心筋細胞の集団の使用が提供される。

一態様では、細胞の集団中の心房中胚葉を検出する方法であって、ＡＬＤＨ、好ましくはＲＡＬＤＨ２を検出することを含み、ＡＬＤＨ、好ましくはＲＡＬＤＨ２の存在が心房中胚葉を指し示す、方法が提供される。

一態様では、細胞の集団中の心室中胚葉を検出する方法であって、ＣＤ２３５ａ、ＣＤ２３５ｂ、およびＣＹＰ２６Ａ１の１つまたは複数を検出することを含み、ＣＤ２３５ａ、ＣＤ２３５ｂ、および／またはＣＹＰ２６Ａ１の存在が心室中胚葉を指し示す、方法が提供される。

本開示の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかとなるであろう。しかしながら、詳細な説明および特定の例は、本開示の好ましい実施形態を指し示すとはいえ、説明のためにのみ与えられるものであることが理解されるべきであり、本開示の精神および範囲内での様々な変更および改良がこの詳細な説明から当業者に明らかとなるであろう。
特定の実施形態では、例えば、以下が提供される：
（項目１）
心室心筋細胞が濃縮された心筋細胞の集団であって、ペースメーカー細胞を本質的に含まない、集団。
（項目２）
ペースメーカー細胞を欠いている、項目１に記載の集団。
（項目３）
患者における心不全または心筋梗塞を治療するための医薬組成物であって、項目１または２に記載の心筋細胞の集団および薬学的に許容される担体を含む、組成物。
（項目４）
心室心筋細胞が濃縮された心筋細胞の集団を製造する方法であって、
中胚葉誘導培地中で多能性幹細胞をインキュベートすることであって、前記中胚葉誘導培地が、心室中胚葉を生成するために充分なＢＭＰ成分および有効量のアクチビン成分を含む、前記インキュベートすること、およびその後に、
好適な培地中で前記インキュベートされた細胞を培養して、心室心筋細胞が濃縮された心筋細胞の集団を生成させること
を含む、方法。
（項目５）
前記アクチビン成分の濃度が前記ＢＭＰ成分の濃度より高い、項目４に記載の方法。
（項目６）
前記アクチビン成分に対する前記ＢＭＰ成分の比が、約０．３～１：１、約０．５：１、または約０．８：１である、項目４または５に記載の方法。
（項目７）
前記アクチビン成分の濃度が、ＣＤ２３５ａを発現する中胚葉細胞のレベルを測定すること、およびこれをＲＡＬＤＨ２を発現する中胚葉細胞のレベルに対して比較することにより決定される、項目４～６のいずれか１項に記載の方法。
（項目８）
前記アクチビン成分の濃度が、ＲＡＬＤＨ２を発現する中胚葉細胞と比較してより多くのＣＤ２３５ａを発現する中胚葉細胞を結果として優先的にもたらす濃度を決定することにより選択される、項目４～７のいずれか１項に記載の方法。
（項目９）
前記アクチビン成分が、約４ｎｇ／ｍｌ～約２０ｎｇ／ｍｌの量で加えられる、項目４～８のいずれか１項に記載の方法。
（項目１０）
前記アクチビン成分の濃度が６～２０ｎｇ／ｍｌである、項目４～９のいずれか１項に記載の方法。
（項目１１）
前記ＢＭＰ成分の濃度が約３ｎｇ／ｍｌ～約２０ｎｇ／ｍｌである、項目４～１０のいずれか１項に記載の方法。
（項目１２）
前記ＢＭＰ成分の濃度が５ｎｇ／ｍｌまたは１０ｎｇ／ｍｌである、項目４～１１のいずれか１項に記載の方法。
（項目１３）
前記アクチビン成分の濃度が１２ｎｇ／ｍｌである、項目４～１２のいずれか１項に記載の方法。
（項目１４）
前記ＢＭＰ成分がＢＭＰ４である、項目４～１３のいずれか１項に記載の方法。
（項目１５）
前記アクチビン成分がアクチビンＡである、項目４～１４のいずれか１項に記載の方法。
（項目１６）
生成された心筋細胞の前記集団の少なくとも一部分が、心臓の修復を必要とする対象を治療するために使用される、項目４～１５のいずれか１項に記載の方法。
（項目１７）
心臓の修復を必要とする前記対象が、心不全のリスクがある、心不全を患っているかつ／または心筋梗塞の発症を患っている、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記治療が、心筋梗塞の発症の前、間または後に為される、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
心房心筋細胞が濃縮された心筋細胞の集団を製造する方法であって、
中胚葉誘導培地中で多能性幹細胞をインキュベートすることであって、前記中胚葉誘導培地が、心房中胚葉を生成するために充分なＢＭＰ成分および有効量のアクチビン成分を含む、前記インキュベートすること、およびその後に、
レチノイン酸成分を前記細胞に加えることであって、前記レチノイン酸成分を前記加えることが、中胚葉誘導培地中での前記インキュベーションの間または後に行われる、前記加えること、および、
心房心筋細胞が濃縮された心筋細胞の集団が生成されるように前記インキュベートされた細胞を培養すること
を含む、方法。
（項目２０）
前記レチノイン酸成分が、前記細胞がＲＡＬＤＨ２陽性かつＣＤ２３５ａ陰性である時に加えられる、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記アクチビン成分に対する前記ＢＭＰ成分の比が約１．５対１またはそれより高い、項目１９または２０に記載の方法。
（項目２２）
前記アクチビン成分に対する前記ＢＭＰ成分の比が３：２である、項目１９～２１のいずれか１項に記載の方法。
（項目２３）
前記ＢＭＰ成分が約３ｎｇ／ｍｌ～約１００ｎｇ／ｍｌの濃度で存在する、項目１９～２２のいずれか１項に記載の方法。
（項目２４）
前記ＢＭＰ成分が約３ｎｇ／ｍｌの量で存在する、項目１９～２３のいずれか１項に記載の方法。
（項目２５）
前記アクチビン成分が約０．０１ｎｇ／ｍｌ～約６ｎｇ／ｍｌの量で存在する、項目１９～２４のいずれか１項に記載の方法。
（項目２６）
前記アクチビン成分が約２ｎｇ／ｍｌの量で存在する、項目１９～２５のいずれか１項に記載の方法。
（項目２７）
前記レチノイン酸成分がトランスレチノイン酸またはレチノールである項目１９～２６のいずれか１項に記載の方法。
（項目２８）
前記レチノイン酸成分が５０ｎｍ～５μΜの濃度で加えられる、項目１９～２７のいずれか１項に記載の方法。
（項目２９）
前記レチノイン酸成分が５００ｎＭの濃度で加えられる、項目１９～２８のいずれか１項に記載の方法。
（項目３０）
前記ＢＭＰ成分がＢＭＰ４である、項目１９～２９のいずれか１項に記載の方法。
（項目３１）
前記アクチビン成分がアクチビンＡである、項目１９～３０のいずれか１項に記載の方法。
（項目３２）
前記ＢＭＰ成分が１日後に前記中胚葉誘導培地に加えられる、項目１９～３１のいずれか１項に記載の方法。
（項目３３）
前記アクチビン成分が１日後に前記中胚葉誘導培地に加えられる、項目１９～３１のいずれか１項に記載の方法。
（項目３４）
前記レチノイン酸成分が前記方法の約３～５日目に加えられる、項目１９～３３のいずれか１項に記載の方法。
（項目３５）
追加のＢＭＰ成分が前記方法の３日目に前記中胚葉誘導培地に加えられない、項目１９～３４のいずれか１項に記載の方法。
（項目３６）
ＦＧＦ阻害剤が前記方法の３日目に前記中胚葉誘導培地に入れられない、項目１９～３５のいずれか１項に記載の方法。
（項目３７）
前記中胚葉誘導培地中で前記多能性幹細胞をインキュベートする前に、凝集および／または胚様体形成のために好適な培地中で前記多能性幹細胞をインキュベートすることをさらに含む、項目４～３６のいずれか１項に記載の方法。
（項目３８）
前記方法により製造された細胞が、潜在的な治療用化合物をスクリーニングするためのｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおいて利用される、項目４～３７のいずれか１項に記載の方法。
（項目３９）
心房心筋細胞が濃縮された心筋細胞の単離された集団であって、少なくとももしくは約５０％の心房心筋細胞、少なくとももしくは約６０％の心房心筋細胞、少なくとももしくは約７０％の心房心筋細胞、少なくとももしくは約８０％の心房心筋細胞、または少なくとももしくは約９０％の心房心筋細胞を含む、集団。
（項目４０）
項目１８～３８のいずれか１項に記載の方法にしたがって得られた、項目３９に記載の心筋細胞の集団。
（項目４１）
心室心筋細胞が濃縮された心筋細胞の単離された集団であって、少なくとももしくは約５０％の心室心筋細胞、少なくとももしくは約６０％の心室心筋細胞、少なくとももしくは約７０％の心室心筋細胞、少なくとももしくは約８０％の心室心筋細胞、または少なくとももしくは約９０％の心室心筋細胞を含む、集団。
（項目４２）
ペースメーカー細胞を本質的に含まない、またはペースメーカー細胞を欠いている、項目４１に記載の集団。
（項目４３）
項目４～１７のいずれか１項に記載の方法にしたがって得られた、項目４１または４２に記載の集団。
（項目４４）
心臓の修復を必要とする対象を治療する方法であって、前記対象に項目１、２、または４１～４３のいずれか１項に記載の心筋細胞の集団を投与することを含む、方法。
（項目４５）
前記対象が、心不全のリスクがある、心不全を患っているかつ／または心筋梗塞の発症を経験している、項目４４に記載の方法。
（項目４６）
前記心筋梗塞が前記患者の心室中のものである、項目４５に記載の方法。
（項目４７）
心臓の修復を必要とする対象の治療において使用するための、項目１、２、または４０～４２のいずれか１項に記載の心筋細胞の集団。
（項目４８）
心臓の修復を必要とする対象を治療するための医薬の調整における、項目１、２、または４１～４３のいずれか１項に記載の心筋細胞の集団の使用。
（項目４９）
中胚葉細胞の集団中の心房中胚葉を検出する方法であって、ＲＡＬＤＨ２を検出することを含み、ＲＡＬＤＨ２の存在が心房中胚葉を指し示す、方法。
（項目５０）
中胚葉細胞の集団中の心室中胚葉を検出する方法であって、ＣＤ２３５ａを検出することを含み、ＣＤ２３５ａの存在が心室中胚葉を指し示す、方法。
（項目５１）
洞房結節のペースメーカー細胞または心外膜細胞が濃縮された心筋細胞の集団を製造する方法であって、
中胚葉誘導培地中で多能性幹細胞をインキュベートすることであって、前記中胚葉誘導培地が、ＡＬＤＨ＋／ＣＤ２３５－中胚葉を生成するために充分な量のＢＭＰ成分およびアクチビン成分をさらに含む、前記インキュベートすること、およびその後に、
ＷＮＴ、ＦＧＦｉおよびＢＭＰの１つまたは複数を含む好適な培地中で前記インキュベートされた細胞を培養して、洞房結節のペースメーカー細胞または心外膜細胞が濃縮された心筋細胞の集団を生成させること
を含む、方法。
（項目５２）
項目５１に記載の方法により製造された心筋細胞の集団。
（項目５３）
試験化合物または剤の潜在的な心毒性をスクリーニングまたは評価する方法であって、先行する細胞集団の項目のいずれかに記載の心筋細胞の集団を前記試験化合物に曝露するステップ、ならびに、生存能力、収縮性、電位の変化および／または細胞の他の機能を評価するステップを含む、方法。

本開示の実施形態をこれより図面と関連させて説明する。

ＲＡシグナル伝達は、心房様心筋細胞の発生を促進する。（Ａ）発生ステージおよびＲＡ添加のタイミングを指し示すｈＰＳＣ心筋細胞分化プロトコールの設計図。（ＢおよびＣ）１０ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ４および６ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ（１０Ｂ／６Ａ）で誘導し、指し示した時点においてＲＡで処理した２０日目のＥＢ集団から単離したＮＫＸ２－５^＋ＳＩＲＰａ^＋ＣＤ９０^－細胞中（ｎ＝３）および胎児組織対照中（ｎ＝６）の（Ｂ）全心筋細胞遺伝子ならびに（Ｃ）心室特異的（ＭＹＬ２）および心房特異的（ＫＣＮＪ３）遺伝子の発現レベルのｑＲＴ－ＰＣＲ分析（ｔ検定、＊ｐ＜０．０５および＊＊ｐ＜０．０１、ＤＭＳＯ対照に対して、ならびに＃＃ｐ＜０．０１、Ｆ－Ｖ対Ｆ－Ａ）。（Ｄ）３～５日目にＲＡまたはＤＭＳＯ（対照）で処理した２０日目のＥＢ（１０Ｂ／６Ａで誘導）から単離したＮＫＸ２－５^＋ＳＩＲＰａ^＋ＣＤ９０^－細胞の遺伝子発現プロファイルを比較するヒートマップ（ｎ＝５）。値は、ハウスキーピング遺伝子ＴＢＰに対する発現レベルのｌｏｇ_１０を表す。（Ｅ）１０Ｂ／６Ａで誘導し、３～５日目にＲＡまたはＤＭＳＯ（対照）で処理した２０日目のＥＢ集団中のＮＫＸ２－５^＋／ＣＴＮＴ^＋およびＭＬＣ２Ｖ^＋／ＣＴＮＴ^＋細胞の割合の代表的なフローサイトメトリー解析。（Ｆ）指し示す通りに処理した２０日目のＥＢ中のＭＬＣ２Ｖ^＋ＣＴＮＴ^＋細胞の割合の平均を示す棒グラフ（ｔ検定、＊＊ｐ＜０．０１、ＤＭＳＯ対照に対して；ｎ＝４）。（ＧおよびＨ）３～５日目にＤＭＳＯ（対照）またはＲＡのいずれかで処理した２０日目のＥＢ（１０Ｂ／６Ａで誘導）中の（Ｇ）ＭＬＣ２Ｖおよび（Ｈ）ＣＯＵＰＴＦＩＩの免疫染色を示す顕微鏡写真。全ての心筋細胞を同定するためのＣＴＮＴおよび全ての細胞を可視化するためのＤＡＰＩで細胞を共染色した。スケールバーは１００ｍｍを表す。全てのＰＣＲ分析について、発現の値はハウスキーピング遺伝子ＴＢＰに対して正規化した。エラーバーはＳＥＭを表す。Ｆ－Ｖ、胎児心室組織；Ｆ－Ａ、胎児心房組織。図８も参照。

ＡＬＤＨ^＋心臓中胚葉の誘導。（Ａ）１０Ｂ／６Ａで誘導したＥＢにおけるＰＤＧＦＲアルファ＋中胚葉におけるＡＬＤＨ活性の代表的なフローサイトメトリー解析。ＡＬＤＨ阻害剤（ＤＥＡＢ）で処理した細胞を対照として使用した。（ＢおよびＣ）（Ｂ）１０ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ４の存在下のアクチビンＡ濃度（０．１１０ｎｇ／ｍＬ）または（Ｃ）２ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡの存在下のＢＭＰ４濃度（１～１０ｎｇ／ｍＬ）のマニピュレーション（１～３日目）後の４日目のＡＬＤＨ活性およびＰＤＧＲアルファの発現（左カラム）ならびに対応する２０日目のＣＴＮＴの発現の代表的なフローサイトメトリー解析。（Ｄ）３Ｂ／２Ａで誘導したＥＢにおけるＡＬＤＨ活性およびＰＤＧＦＲアルファの発現の代表的なフローサイトメトリー解析。（Ｅ）１０Ｂ／６Ａおよび３Ｂ／２Ａで誘導したＥＢ集団におけるＡＬＤＨ１Ａ２およびＣＹＰ２６Ａ１の発現レベルのｑＲＴ－ＰＣＲ分析（ｔ検定、＊ｐ＜０．０５および＊＊ｐ＜０．０１、対応する分化日数での１０Ｂ／６Ａで誘導したＥＢに対して；ｎ＝４）。全てのＰＣＲ分析について、発現の値はハウスキーピング遺伝子ＴＢＰに対して正規化した。エラーバーはＳＥＭを表す。図９も参照。

レチノールは、心房運命へとＡＦ＋中胚葉を系列決定させる。（Ａ）３Ｂ／２Ａで誘導した４日目のＥＢから単離したＡＬＤＨ^＋ＰＤＧＦＲａ^＋（画分Ｉ）およびＡＬＤＨ^－ＰＤＧＦＲａ^＋（画分ＩＩ）の画分の単離および心臓分化能力の解析のために使用した戦略の設計図。（Ｂ）ＡＬＤＨ^＋ＰＤＧＦＲａ^＋（画分Ｉ）およびＡＬＤＨ^－ＰＤＧＦＲａ^＋（画分ＩＩ）の画分を単離するために使用した細胞選別戦略を示す代表的なフローサイトメトリープロット。（Ｃ）上記に指し示した単離された集団内のＡＬＤＨ１Ａ２の発現のｑＲＴ－ＰＣＲ分析（ｔ検定、＊＊ｐ＜０．０１；ｎ＝３）。（ＤおよびＥ）ＲＯＨ－、ＲＡ－、またはＤＭＳＯ（対照）で処理した４日目のＡＬＤＨ＋ＰＤＧＦＲａ＋およびＡＬＤＨ－ＰＤＧＦＲａ＋画分から生成された２０日目の集団における（Ｄ）ＣＴＮＴ＋および（Ｅ）ＭＬＣ２Ｖ＋細胞の割合のフローサイトメトリー解析（ｔ検定、＊ｐ＜０．０５および＊＊ｐ＜０．０１、ＤＭＳＯ対照に対して；ｎ＝６）。（ＦおよびＧ）指し示した処理群の２０日目の集団における（Ｆ）心室および（Ｇ）心房の遺伝子の発現レベルのｑＲＴ－ＰＣＲ分析（ｎ＝６）（ｔ検定、＊ｐ＜０．０５および＊＊ｐ＜０．０１、ＤＭＳＯ対照に対して）。全てのＰＣＲ分析について、発現の値はハウスキーピング遺伝子ＴＢＰに対して正規化した。エラーバーはＳＥＭを表す。ＷＮＴｉ、ＷＮＴ阻害；ＲＯＨ、レチノール。図１０も参照。

ＣＤ２３５ａの発現は、心室への分化能力を有する中胚葉の印となる。（Ａ）１０Ｂ／６Ａ（上）または３Ｂ／２Ａ（下）のいずれかで誘導したＥＢにおけるＣＤ２３５ａの発現およびＡＬＤＨ活性の代表的なフローサイトメトリー解析。（Ｂ）４日目の５Ｂ／４Ａで誘導したＥＢからＣＤ２３５ａ^＋（画分ＩＩＩ、心室への分化能力）およびＡＬＤＨ^＋（画分ＩＶ、心房への分化能力）の画分を単離するために使用した細胞選別戦略を示す代表的なフローサイトメトリープロット。（ＣおよびＤ）ＲＯＨ、ＲＡ、またはＤＭＳＯ（対照）で２４時間処理した４日目のＡＬＤＨ^＋およびＣＤ２３５ａ^＋の画分から生成された２０日目の集団における（Ｃ）ＣＴＮＴ^＋および（Ｄ）ＭＬＣ２Ｖ^＋細胞の割合のフローサイトメトリー解析（ｔ検定、＊ｐ＜０．０５および＊＊ｐ＜０．０１、ＤＭＳＯ対照に対して、および＃＃ｐ＜０．０１、指し示した試料に対して；ｎ＝５）。（ＥおよびＦ）指し示した通りに処理した４日目のＡＬＤＨ^＋およびＣＤ２３５ａ^＋の画分から生成された２０日目の集団における（Ｅ）心室および（Ｆ）心房の遺伝子の発現レベルのｑＲＴ－ＰＣＲ分析（ｎ＝５）（ｔ検定、＊ｐ＜０．０５および＊＊ｐ＜０．０１、ＤＭＳＯ対照に対して、＃ｐ＜０．０５および＃＃ｐ＜０．０１、指し示した試料に対して）。全てのＰＣＲ分析について、発現の値はハウスキーピング遺伝子ＴＢＰに対して正規化した。エラーバーはＳＥＭを表す。図１１も参照。

ＣＤ２３５ａ^＋心臓中胚葉の誘導の最適化。（ＡおよびＢ）（Ａ）１０ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ４の存在下のアクチビンＡ濃度（２～２０ｎｇ／ｍＬ）または（Ｂ）１２ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡの存在下のＢＭＰ４濃度（３～２０ｎｇ／ｍＬ）のマニピュレーション（１～３日目）後の４日目のＡＬＤＨ活性およびＣＤ２３５ａの発現（左カラム）ならびに対応する２０日目のＭＬＣ２ＶおよびＣＴＮＴの発現（右カラム）の代表的なフローサイトメトリー解析。（Ｃ）４日目の５Ｂ／１２Ａ（上）および３Ｂ／２Ａで誘導したＥＢ（下）におけるＡＬＤＨ活性およびＣＤ２３５ａの発現の割合を示す代表的なフローサイトメトリープロット。（ＤおよびＥ）ＲＯＨ、ＲＡ、またはＤＭＳＯ（対照）で４８時間（３～５日目）処理した５Ｂ／１２Ａまたは３Ｂ／２Ａで誘導したＥＢからの２０日目のＥＢ集団における（Ｄ）ＣＴＮＴ＋細胞および（Ｅ）ＭＬＣ２Ｖ＋細胞の割合のフローサイトメトリー解析（ｔ検定、＊ｐ＜０．０５および＊＊ｐ＜０．０１、ＤＭＳＯ対照に対して；ｎ＝４）。（ＦおよびＧ）指し示した処理で生成された２０日目のＥＢ集団における（Ｆ）心室および（Ｇ）心房の遺伝子の発現レベルのｑＲＴ－ＰＣＲ分析（ｎ＝４）（ｔ検定、＊ｐ＜０．０５および＊＊ｐ＜０．０１、ＤＭＳＯ対照に対して）。（Ｈ）５Ｂ／１２Ａまたは３Ｂ／２Ａで誘導した２０日目のＥＢ集団におけるＮＫＸ２－５－ＣＴＮＴ＋細胞の割合の代表的な割合のフローサイトメトリー解析。（Ｉ）５Ｂ／１２Ａまたは３Ｂ／２Ａで誘導した２０日目のＥＢの自律鼓動速度の定量化（ｎ＝１７）（ｔ検定、＊＊ｐ＜０．０１）。（Ｊ）ＲＡ（０．５ｍＭ、３～５日目）の存在または非存在下で５Ｂ／１２Ａ、１０Ｂ／６Ａ、または３Ｂ／２Ａ（１～３日目）で誘導した２０日目のＥＢ集団におけるＮＫＸ２－５－ＣＴＮＴ＋細胞の割合の平均を示す棒グラフ（ｔ検定、＊ｐ＜０．０５、指し示した試料に対して；ｎ＝５）。全てのＰＣＲ分析について、発現の値はハウスキーピング遺伝子ＴＢＰに対して正規化した。エラーバーはＳＥＭを表す。図１２も参照。 同上

異なる中胚葉集団に由来する心筋細胞の比較。（ＡおよびＢ）心室誘導（ＶＩ）、混合誘導（Ｍｌ、ＭＭとも称する）、および心房誘導（ＡＩ）条件下で誘導した２０日目のＥＢから単離したＮＫＸ２－５＋ＳＩＲＰａ＋ＣＤ９０－細胞（ｎ＝５）および胎児組織対照（ｎ＝６）における（Ａ）全心筋細胞および（Ｂ）心室遺伝子の発現レベルのｑＲＴ－ＰＣＲ分析（ｔ検定、＊ｐ＜０．０５および＊＊ｐ＜０．０１、指し示した試料に対して、＃＃ｐ＜０．０１、Ｆ－Ｖ対Ｆ－Ａ）。（Ｃ）指し示した通りに誘導した２０日目の非処理またはＲＡで処理したＥＢ（３～５日目）から単離したＮＫＸ２－５＋ＳＩＲＰａ＋ＣＤ９０－細胞における心房の遺伝子の発現レベルのｑＲＴ－ＰＣＲ分析（ｎ＝４）（ｔ検定、＊ｐ＜０．０５および＊＊ｐ＜０．０１、ＶＩ対ＶＩ＋ＲＡ。（Ｄ）ＶＩ＋ＲＡまたはＡＩ＋ＲＡで誘導した２０日目のＥＢから単離したＮＫＸ２－５^＋ＳＩＲＰａ^＋ＣＤ９０^－細胞におけるＣＯＵＰＴＦＩＩの免疫染色を示す顕微鏡写真。全ての心筋細胞を同定するためのＣＴＮＴおよび全ての細胞を可視化するためのＤＡＰＩで細胞を共染色した。スケールバーは１００ｍｍを表す。（Ｅ～Ｇ）指し示した通りに誘導した２０日目のＥＢから単離したＮＫＸ２－５^＋ＳＩＲＰａ^＋ＣＤ９０^－心筋細胞におけるＡＰ測定。（Ｅ）指し示した群から単離した個々の心筋細胞における自律ＡＰの代表的な記録。（Ｆ）ＶＩ（ｎ＝１８）、ＶＩ＋ＲＡ（ｎ＝１８）、およびＡＩ＋ＲＡ（ｎ＝２０）のＥＢから単離した心筋細胞における３０％／９０％の再分極（ＡＰＤ３０／９０）でのＡＰ継続時間の定量化（ｔ検定、＊ｐ＜０．０５および＊＊ｐ＜０．０１、指し示した試料に対して）。（Ｇ）記録されたＡＰの解析に基づく、各群における心房（ＡＰＤ３０／９０＜０．３）、心室（ＡＰＤ３０／９０ Ｒ ０．３）、および未熟な（最大立ち上がり速度［ｄｖ／ｄｔ_ｍａｘ］＜１０および周期長［ＣＬ］Ｒ １）心筋細胞の割合を示す棒グラフ。（Ｈ～Ｊ）指し示した通りに誘導したＥＢから単離した心筋細胞におけるアセチルコリン活性化内向き整流カリウム電流密度（Ｉ_ＫＡＣｈ）の解析。（Ｈ）１０ｍＭのカルバコール（ＣＣｈ）の適用の後（ＣＣｈ）および前（対照）に測定した電流間の差異として定量化した、ＡＩ＋ＲＡで誘導したＥＢから単離した心筋細胞におけるＣＣｈ感受性の電流（Ｉ_ＫＡＣｈ）を示す代表的な記録（挿入図：電圧プロトコール）。（Ｉ）ＶＩのＥＢから単離した心室心筋細胞（心室様のＡＰ形状で検証）ならびにＶＩ＋ＲＡおよびＡＩ＋ＲＡのＥＢから単離した心房心筋細胞（心房様のＡＰ形状で検証）におけるＩ_ＫＡＣｈの電流密度についての電流と電圧の関係性。（Ｊ）各群において－１２０ｍＶで記録した最大Ｉ_ＫＡＣｈの電流密度の定量化（ｔ検定、＊ｐ＜０．０５および＊＊ｐ＜０．０１、指し示した試料に対して）。全てのＰＣＲ分析について、発現の値はハウスキーピング遺伝子ＴＢＰに対して正規化した。エラーバーはＳＥＭを表す。Ｆ－Ｖ、胎児心室組織；Ｆ－Ａ、胎児心房組織；ｎ．ｓ．、有意でない。図１３も参照。

他のｈＰＳＣ株からの心室および心房心筋細胞の生成。（Ａ）心室（５Ｂ／６Ａ、上）または心房（５Ｂ／２Ａ、下）の条件下で誘導した４日目のＨＥＳ２由来ＥＢにおけるＡＬＤＨ活性およびＣＤ２３５ａの発現の代表的なフローサイトメトリー解析。（Ｂ）心室または心房条件下で生成し、３～５日目にＲＯＨ、ＲＡ、またはＤＭＳＯ（対照）処理に供した対応する２０日目のＥＢ集団におけるＣＴＮＴおよびＭＬＣ２Ｖの発現の代表的なフローサイトメトリー解析。（ＣおよびＤ）指し示した条件下で誘導した２０日目のＥＢから単離したＳＩＲＰａ^＋ＣＤ９０^－細胞における（Ｃ）心室および（Ｄ）心房の遺伝子の発現レベルのｑＲＴ－ＰＣＲ分析（ｔ検定、＊ｐ＜０．０５、ＤＭＳＯ対照に対して、＃ｐ＜０．０５および＃＃ｐ＜０．０１、指し示した試料に対して；ｎ＝５）。（Ｅ）心室（４Ｂ／４Ａ、上）または心房（４Ｂ／１Ａ＋ＳＢ、下）条件下で誘導した４日目のＭＳＣ－ｉＰＳ１由来のＥＢにおけるＡＬＤＨ活性およびＣＤ２３５ａの発現の代表的なフローサイトメトリー解析。（Ｆ）心室または心房条件において生成し、３～５日目にＲＯＨ、ＲＡ、またはＤＭＳＯ（対照）処理に供した対応する２０日目のＥＢ集団におけるＣＴＮＴおよびＭＬＣ２Ｖの発現の代表的なフローサイトメトリー解析。（ＧおよびＨ）指し示した通りに誘導した２０日目のＥＢから単離したＳＩＲＰａ＋ＣＤ９０－細胞における（Ｇ）心室および（Ｈ）心房の遺伝子の発現レベルのｑＲＴ－ＰＣＲ分析（ｔ検定、＊ｐ＜０．０５および＊＊ｐ＜０．０１、ＤＭＳＯ対照に対して、＃＃ｐ＜０．０１、指し示した試料に対して；ｎ＝５）。（Ｉ）ｈＰＳＣからのヒト心房および心室心筋細胞の発生のモデル。このモデルでは、ＣＤ２３５ａおよびＣＹＰ２６Ａ１の発現またはＲＡＬＤＨ２の発現ならびにＡＬＤＨ活性により定義される別個の中胚葉集団が異なる濃度のアクチビンＡおよびＢＭＰ４により誘導される。ＲＡＬＤＨ２＋ＡＬＤＨ＋の中胚葉はＲＯＨに応答して心房様心筋細胞を生成することができるが、ＣＤ２３５ａ＋ＣＹＰ２６Ａ１＋はそうではない。ＲＡは、心房運命へと両方の中胚葉集団を系列決定することができる。しかしながら、ＣＤ２３５ａ＋中胚葉からの系列決定はＲＡＬＤＨ２＋中胚葉からのものよりも効率性が低く、結果として生じる心房表現型は最適以下である。レチノイドシグナル伝達（ＲＯＨ、ＲＡ）がない場合、ＲＡＬＤＨ２＋中胚葉は、低い効率で心室心筋細胞を生じさせることができる。全てのＰＣＲ分析について、発現の値はハウスキーピング遺伝子ＴＢＰに対して正規化した。エラーバーはＳＥＭを表す。ＳＢ、ＳＢ－４３１５４２（Ｎｏｄａｌ／アクチビンＡ／ＴＧＦ－ｂ阻害剤）；ＷＮＴｉ、ＷＮＴ阻害。図１４も参照。

図１に関する。ｈＰＳＣからの心房様心筋細胞の生成。（Ａ）分化の２０日目にＳＩＲＰアルファ^＋ＮＫＸ２－５^＋ＣＤ９０^－心筋細胞の単離のために使用した細胞選別戦略を示す代表的なフローサイトメトリープロット。（Ｂ～Ｅ）１０Ｂ／６Ａで誘導し、分化の３～５日目にＲＡまたはＤＭＳＯ（対照）のいずれかで処理したＥＢから単離したＳＩＲＰアルファ^＋ＮＫＸ２－５^＋ＣＤ９０^－心筋細胞における（Ｂ）全心筋細胞、（Ｃ）心室心筋細胞、（Ｄ）心房心筋細胞、（Ｅ）心臓イオンチャネルおよびコネキシンチャネル遺伝子の発現レベルを示す図１Ｄにおいてヒートマップとして表されるＱＲＴ－ＰＣＲ分析のグラフ（ｎ＝５）。ｔ検定：＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、ＤＭＳＯ対照に対して、＃＃Ｐ＜０．０１、Ｆ－Ｖ対Ｆ－Ａ。（Ｆ）分化の指し示した日数での１０Ｂ／６Ａで誘導した全ＥＢ集団におけるレチノイン酸受容体アイソフォーム（ＲＡＲＡ、ＲＡＲＢ、およびＲＡＲＧ）の発現レベルのｑＲＴ－ＰＣＲ分析（ｎ＝３）。（Ｇ）３～５日目にＤＭＳＯ（対照）、ＲＡまたは受容体特異的アゴニストのいずれかで処理した２０日目のＥＢにおけるＣＴＮＴ^＋細胞の割合のフローサイトメトリー解析（ｎ＝３）。（Ｈ）指し示した処理で３～５日目に処理した２０日目のＥＢにおける心室特異的遺伝子ＭＹＬ２の発現レベルのｑＲＴ－ＰＣＲ分析（ｎ＝３）。ｔ検定：＊＊Ｐ＜０．０１、ＤＭＳＯ対照に対して。全てのＰＣＲ分析について、発現の値はハウスキーピング遺伝子ＴＢＰに対して正規化した。エラーバーはＳＥＭを表す。Ｆ－Ｖ：胎児心室組織、Ｆ－Ａ：胎児心房組織、ＲＡ：レチノイン酸、ＡＭ５８０：ＲＡＲアルファアゴニスト、ＡＣ５５６４９：ＲＡＲアゴニスト、ＣＤ４３７：ＲＡＲγアゴニスト。

図２に関する。１０Ｂ／６Ａおよび３Ｂ／２Ａで誘導した中胚葉の発生動態。（Ａ）３Ｂ／２Ａおよび１０Ｂ／６Ａで誘導したＥＢ（２０日目）の６ウェルプレートのウェル当たりの生成された細胞の平均数を示す棒グラフ（ｎ＝５）。（Ｂ）３Ｂ／２Ａまたは１０Ｂ／６Ａのいずれかでの誘導（１～３日目）後の分化の指し示した日数のＥＢにおけるＡＬＤＨ１Ａ１およびＡＬＤＨ１Ａ３アルデヒドデヒドロゲナーゼアイソフォームの発現動態のＱＲＴ－ＰＣＲ分析（ｎ＝３）。（Ｃ）３Ｂ／２Ａまたは１０Ｂ／６Ａのいずれかでの誘導（１～３日目）後の分化の指し示した日数のＥＢにおける原条マーカーＴ（Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ）および心臓中胚葉マーカーＭＥＳＰ１の発現動態のＱＲＴ－ＰＣＲ分析（ｎ＝４）。全てのＰＣＲ分析について、発現の値はハウスキーピング遺伝子ＴＢＰに対して正規化した。エラーバーはＳＥＭを表す。

３Ｂ／２Ａで誘導した中胚葉集団におけるＡＬＤＨ活性。３Ｂ／２Ａで誘導した４日目のＥＢから単離したＡＬＤＨ^＋ＰＤＧＦＲアルファ^＋（画分Ｉ）およびＡＬＤＨ^－ＰＤＧＦＲアルファ^＋（画分ＩＩ）細胞の凝集体としての２４時間の培養後のＡＬＤＨ活性の代表的なフローサイトメトリー解析。

非選別のおよび選別した中胚葉集団におけるＧＹＰＡの発現の解析。（Ａ）分化の指し示した日数での３Ｂ／２Ａおよび１０Ｂ／６Ａで誘導したＥＢにおけるＧＹＰＡの発現レベルのｑＲＴ－ＰＣＲ分析、ｔ検定：＊＊Ｐ＜０．０１、指し示した試料に対して（ｎ＝４）。（Ｂ）５Ｂ／４Ａで誘導した４日目のＥＢから単離したＡＬＤＨ^＋（画分ＩＶ）およびＣＤ２３５ａ^＋（画分ＩＩＩ）の画分におけるＡＬＤＨ１Ａ２、ＣＹＰ２６Ａ１、およびＧＹＰＡの発現レベルのＱＲＴ－ＰＣＲ分析。全てのＰＣＲ分析について、発現の値はハウスキーピング遺伝子ＴＢＰに対して正規化した。ｔ検定：＊＊Ｐ＜０．０１（ｎ＝３）。エラーバーはＳＥＭを表す。

中胚葉誘導のマニピュレーションを通じた心室分化の最適化。

（ＡおよびＢ）（Ａ）１０ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ４の存在下のアクチビンＡ濃度（２～２０ｎｇ／ｍｌ）または（Ｂ）１２ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡの存在下のＢＭＰ４濃度（３～２０ｎｇ／ｍｌ）のマニピュレーション（１～３日目）後の４日目のＥＢにおけるＣＤ２３５ａ^＋細胞（左）および２０日目のＥＢにおける結果として生じたＣＴＮＴ^＋ＭＬＣ２Ｖ^＋細胞（右）の割合のフローサイトメトリー解析（ｎ＝６）。ｔ検定：＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、指し示した試料に対して。（Ｃ）５Ｂ／１２Ａまたは１０Ｂ／６Ａのいずれかで誘導したＥＢ（２０日目）の６ウェルプレートのウェル当たりの生成された細胞の平均数を示す棒グラフ（ｎ＝４）。ｔ検定：Ｐ＞０．０５＝ｎ．ｓ．、有意でない。（Ｄ）指し示した通りに誘導したＥＢ集団における培養の２０日目および４０日目のＣＴＮＴ^＋ＭＬＣ２Ｖ^＋細胞の割合のフローサイトメトリー解析（ｎ＝３）。ｔ検定：Ｐ＞０．０５＝ｎ．ｓ．、有意でない。エラーバーはＳＥＭを表す。

異なる中胚葉集団に由来する心房および心室心筋細胞の特徴付け。（Ａ）心室誘導（ＶＩ）、混合誘導（ＭＩ）および心房誘導（ＡＩ）条件下で誘導した２０日目のＥＢにおけるＭＬＣ２Ｖ^＋細胞の割合のフローサイトメトリー解析。ｔ検定：＊＊Ｐ＜０．０１、指し示した試料に対して。（Ｂ）ＡＩおよびＶＩから生成された２０日目のＥＢ集団におけるＭＬＣ２Ｖの免疫染色を示す顕微鏡写真。全ての心筋細胞を同定するためのＣＴＮＴおよび全ての細胞を可視化するためのＤＡＰＩで細胞を共染色した。スケールバーは１００μｍを表す。（ＣおよびＤ）指し示した通りに誘導した２０日目のＥＢ集団から単離したＮＫＸ２－５^＋ＳＩＲＰアルファ^＋ＣＤ９０^－細胞（ｎ＝４）および胎児組織対照（ｎ＝６）における（Ｃ）心房および（Ｄ）ペースメーカー遺伝子の発現レベルのＱＲＴ－ＰＣＲ分析。ｔ検定：＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、ＶＩ対ＶＩ＋ＲＡ；ＡＩ対ＡＩ＋ＲＡおよび指し示した試料に対して、＃＃Ｐ＜０．０１、Ｆ－Ｖ対Ｆ－Ａ。（Ｅ）ＶＩまたはＡＩのいずれかの条件下で誘導し、３～５日目に指し示した濃度のＲＡ（０．１２５～４μΜ）で処理した２０日目のＥＢにおけるＮＫＸ２－５^＋ＳＩＲＰアルファ^＋細胞の割合のフローサイトメトリー解析（ｎ＝３）。（Ｆ～Ｈ）異なる２０日目の集団から単離したＮＫＸ２－５^＋ＳＩＲＰアルファ^＋ＣＤ９０^－細胞における（Ｆ）心房の遺伝子ＫＣＮ５Ａ、（Ｇ）心室の遺伝子ＭＹＬ２、ＩＲＸ４、ならびに（Ｈ）心房の遺伝子ＫＣＮＪ３、ＣＡＣＮＡ１ＤおよびＮＲ２Ｆ２の発現レベルのＱＲＴ－ＰＣＲ分析、ｔ検定：＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、各々のＲＡ濃度のＶＩ試料に対して（ｎ＝４）。全てのＰＣＲ分析について、発現の値はハウスキーピング遺伝子ＴＢＰに対して正規化した。エラーバーはＳＥＭを表す。Ｆ－Ｖ：胎児心室組織、Ｆ－Ａ：胎児心房組織、ｎ．ｓ．：有意でない。

ＨＥＳ２およびＭＳＣ－ｉＰＳ１ ｈＰＳＣに由来する心房および心室心筋細胞の特徴付け。（Ａ）４Ｂ／１Ａで誘導し、その後にＳＢ－４３１５４２（ＳＢ）のありまたはなしで誘導した（３～５日目）ＭＳＣ－ｉＰＳ１由来のＥＢにおけるＡＬＤＨ活性およびＣＤ２３５ａの発現の代表的なフローサイトメトリー解析。（Ｂ～Ｄ）心室（５Ｂ／６Ａ）または心房（５Ｂ／２Ａ）条件下で誘導し（１～３日目）、３～５日目にＲＯＨ、ＲＡまたはＤＭＳＯ（対照）のいずれかで処理した２０日目のＨＥＳ２由来のＥＢ集団から単離したＳＩＲＰアルファ^＋ＣＤ９０^－細胞における（Ｂ）全心筋細胞、（Ｃ）心室および（Ｄ）心房の遺伝子の発現レベルのＱＲＴ－ＰＣＲ分析。ｔ検定：＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、ＤＭＳＯ対照に対して、＃Ｐ＜０．０５、＃＃Ｐ＜０．０１、指し示した試料に対して（ｎ＝５）。（Ｅ～Ｇ）心室（４Ｂ／４Ａ）または心房（４Ｂ／１Ａ＋ＳＢ）条件下で誘導し（１～３日目）、３～５日目にＲＯＨ、ＲＡまたはＤＭＳＯ（対照）のいずれかで処理した２０日目のＭＳＣ－ｉＰＳ１由来のＥＢから単離したＳＩＲＰアルファ^＋ＣＤ９０^－細胞における（Ｅ）全心筋細胞、（Ｆ）心室および（Ｇ）心房の遺伝子の発現レベルのＱＲＴ－ＰＣＲ分析。ｔ検定：＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、ＤＭＳＯ対照に対して、＃＃Ｐ＜０．０１、指し示した試料に対して（ｎ＝５）。全てのＰＣＲ分析について、発現の値はハウスキーピング遺伝子ＴＢＰに対して正規化した。エラーバーはＳＥＭを表す。ＳＢ：ＳＢ－４３１５４２（Ｎｏｄａｌ／アクチビンＡ／ＴＧＦβ阻害剤）。

心臓細胞の様々な分化経路を描写する設計図。

定義

本明細書で使用される「心室心筋細胞」という用語は、心室細胞が濃縮された、または心室細胞の特性を有する細胞が濃縮された細胞の集団を指す。これらとしては、ＭＹＬ２、ＩＲＸ４などの心室特異的マーカー、および／または上昇したレベルのＮＫＸ２－５を発現し、かつ／または心室細胞の電気生理学的性質（例えば、活動電位）を示す心筋細胞が挙げられる。

本明細書で使用される「心房心筋細胞」という用語は、心房細胞が濃縮された、または心房細胞様の特性を有する細胞が濃縮された細胞の集団を指す。これらとしては、心房イオンチャネル遺伝子ＫＣＮＪ３、ＮＰＰＡ、ＧＪＡ５および／またはＭＹＬ７などの心房特異的マーカーを発現し、かつ／または心房細胞の電気生理学的性質（例えば、活動電位）を示す心筋細胞が挙げられる。

本明細書で使用される「心臓血管中胚葉細胞」および「心臓血管中胚葉」という用語は、他の中胚葉細胞と比べて心臓血管細胞への分化の能力が増加した中胚葉細胞が濃縮された中胚葉細胞の集団を指す。

本明細書で使用される「心室中胚葉細胞」および「心室中胚葉」という用語は、他の中胚葉細胞と比べて心室心筋細胞への分化の能力が増加した中胚葉細胞が濃縮された中胚葉細胞を含む集団を指す。これらとしては、ＡＬＤＨ－、ＲＡＬＤＨ２－ＣＤ２３５ａ＋、ＣＤ２３５ｂ＋、およびＣＹＰ２６Ａ１＋の１つまたは複数である中胚葉細胞が挙げられる。

本明細書で使用される「心房中胚葉細胞」および「心房中胚葉」という用語は、他の中胚葉細胞と比べて心房心筋細胞への分化の能力が増加した中胚葉細胞が濃縮された中胚葉細胞を含む集団を指す。これらとしては、ＡＬＤＨ＋、ＲＡＬＤＨ２＋、ＣＤ２３５ａ－、ＣＤ２３５ｂ－、およびＣＹＰ２６Ａ１－の１つまたは複数である中胚葉細胞が挙げられる。

本明細書で使用される「心筋細胞」という用語は、心臓系列細胞である。心臓系列細胞は、典型的に、全心臓特異的マーカーｃＴＮＴを発現する。

本明細書で使用される「ペースメーカー細胞」という用語は、ペースメーカー活性を有し、かつ洞房結節（ＳＡＮ）細胞特異的マーカーを発現する心筋細胞を指す。ペースメーカー細胞は、一般に、心室心筋細胞より速い鼓動速度を有する。ペースメーカー細胞はＮＫＸ２－５を発現しない。

本明細書で使用される「ＮＫＸ２－５」という用語は、ヒトにおいてＮＫＸ２－５遺伝子によりコードされる心臓ホメオボックスタンパク質ＮＫＸ２－５を指す。該遺伝子は心臓の分化に関与し、心室心筋細胞などの心筋細胞サブタイプにおいて発現される。ＮＫＸ２－５の発現は、例えばＮＫＸ２－５に特異的な抗体を使用して、または例えばＮＫＸ２－５レポーターコンストラクトを使用することにより、測定することができる。

本明細書で使用される「ＢＭＰ成分」という用語は、ＢＭＰ４の受容体を活性化する、任意の分子、任意選択で任意のＢＭＰもしくは成長分化因子（ＧＤＦ）、または小分子を意味し、例えば、ＢＭＰ４および／またはＢＭＰ２が挙げられる。

本明細書で使用される「ＢＭＰ４」（例えば、遺伝子ＩＤ：６５２）という用語は、骨形成タンパク質４、例えばヒトＢＭＰ４の他に、例えばＢＭＰ４受容体シグナル伝達を活性化できるその活性コンジュゲートおよび／または断片を指す。

本明細書で使用される「ペースメーカー細胞を本質的に含まない」という用語は、心筋細胞の集団であって、ペースメーカー細胞が、総細胞の５％未満、１％未満のペースメーカー細胞、０．５％未満のペースメーカー細胞、０．１％未満のペースメーカー細胞、０．０１％未満のペースメーカー細胞、０．００１％未満のペースメーカー細胞、または０．０００１％未満のペースメーカー細胞を含み、ペースメーカー細胞を完全に欠いており、またはペースメーカー細胞が現在利用可能な検出方法を介して心筋細胞の集団中に検出できないものを指す。いかなる理論によっても縛られることを望まないが、心室細胞の集団におけるペースメーカー細胞の存在は、患者に導入された時に、筋肉の独立した別々の収縮を誘導し得ることが想定される。

本明細書で使用される「アクチビン成分」という用語は、ｎｏｄａｌシグナル伝達を活性化し、任意選択でアクチビンＡおよび／またはｎｏｄａｌなどのアクチビンＡ活性を有する、１つまたは複数の成分、または前記成分を含む組成物を意味する。

本明細書で使用される「アクチビン」または「ＡｃｔＡ」という用語は、ｎｏｄａｌシグナル伝達を活性化できる、「アクチビンＡ」（例えば、遺伝子ＩＤ：３６２４）、例えばヒトアクチビンＡの他に、その活性コンジュゲートおよび断片または小分子を指す。

「レチノイン酸」または「ＲＡ」という用語は、レチノイン酸を表す。

「レチノイン酸成分」という用語は、ビタミンＡの機能を媒介する化合物を含み、例えば、オールトランスＲＡ（例えば、Ｓｉｇｍａ Ｒ２６２５）、９－シスＲＡ（例えば、Ｓｉｇｍａ Ｒ４６４３）、およびレチノール（例えば、Ｓｉｇｍａ Ｒ７６３２）の他に、ＲＡアナログ（例えば、ＲＡＲアゴニスト）、例えば、選択的ＲＡＲアルファアゴニストであるＡＭ５８０（Ｔｏｃｒｉｓ ０７６０）、選択的ＲＡＲβアゴニストであるＡＣ５５６４９（Ｔｏｃｒｉｓ ２４３６）、および選択的ＲＡＲγアゴニストであるＣＤ４３７（Ｔｏｃｒｉｓ １５４９）などが挙げられる。

本明細書で使用される「胚様体培地」という用語は、凝集体（例えば、３つ全ての胚葉の細胞に分化する能力を有するＰＳＣの浮遊凝集体）またはＰＳＣの胚様体の形成を支持する培養培地であり、最小培地、例えば、ＳｔｅｍＰｒｏ ３４（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、ＭｅｓｏＦａｔｅ（商標）（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）、ＲＰＭＩ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒおよび他の企業）、ＨＥＳ培地（ＫｎｏｃｋＯｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒおよび他の企業）など、および例えばＢＭＰ成分、任意選択でＢＭＰ４、およびさらに任意選択でＲｈｏ関連プロテインキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤を含む。

本明細書で使用される「胚様体凝集期」という用語は、非凝集ｈＰＳＣが例えば本明細書に記載される胚様体培地を用いて培養され、かつＢＭＰ成分の他に、任意選択でＲＯＣＫ阻害剤および／または胚様体などの凝集体（例えば、３つ全ての胚葉の細胞に分化できるＰＳＣの凝集体）を結果としてもたらす他の成分で処理される期間を意味する。成分での処理は、同時であってもよいし、重なり合っていてもよいし、または別個であってもよい。例えば、第１の成分は培地中に含まれてもよく、かつ、第２の成分は胚様体凝集期の間に培地に加えられてもよい。

「中胚葉誘導培地」という用語は、心臓血管中胚葉細胞の形成を支持し、最小培地、例えば、ＳｔｅｍＰｒｏ ３４（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、ＭｅｓｏＦａｔｅ（商標）（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）、ＲＰＭＩ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒおよび他の企業）などを含む培養培地を含むことができる。中胚葉誘導培地は、追加の成分、例えば、ＢＭＰ成分、任意選択でＢＭＰ４、アクチビン成分、任意選択でアクチビンＡなどを含むことができ、また、ｂＦＧＦなどの他の成分を含んでもよい。中胚葉から生成される心筋細胞の所望の運命に応じて、ＢＭＰ成分およびアクチビン成分のそれぞれの異なる濃度を本明細書に教示される通りに調整することができる。

「中胚葉誘導期」という用語は、ＰＳＣが中胚葉細胞に分化するように、ＰＳＣが中胚葉誘導培地を用いて培養され、例えば、ＢＭＰ成分およびアクチビン成分の他に、任意選択でＦＧＦ成分および／または他の成分で処理される期間を表すことができる。ＢＭＰおよびアクチビン成分での処理は、同時であってもよいし、重なり合っていてもよいし、または別個であってもよい。例えば、第１の成分は中胚葉誘導の最初に培地中に含まれてもよく、かつ、第２の成分は中胚葉誘導期の間に培地に加えられてもよい。

「心臓誘導培地」という用語は、中胚葉細胞からの心臓前駆細胞の誘導を支持する培養培地、例えば、例えばＷＮＴ阻害剤、任意選択でＩＷＰ２、ＶＥＧＦおよび／または任意選択でアクチビン／ｎｏｄａｌ阻害剤、任意選択でＳＢ－４３１５４２を含むＳｔｅｍＰｒｏ－３４最小培地などを含むことができる。所望の細胞種に応じて、心臓誘導培地はまた、ＢＭＰ成分、レチノイン酸、ＦＧＦ阻害剤またはＦＧＦ成分を含んでもよい。心臓誘導培地の一実施形態（標準心臓誘導培地とも称する）は、０．５μΜのＩＷＰ２、１０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ、および任意選択で５．４μΜのＳＢ－４３１５４２を含有するＳｔｅｍＰｒｏ－３４最小培地である。使用できる他の最小培地としては、ＭｅｓｏＦａｔｅ（商標）（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）およびＲＰＭＩ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒおよび他の企業）が挙げられる。

「心臓誘導期」という用語は、中胚葉細胞が、心臓誘導培地と培養された時に心臓前駆細胞に分化するように誘導され、かつ例えばＢＭＰ成分およびＲＡの他に、任意選択でＦＧＦ阻害剤またはＦＧＦ成分および／または心臓血管前駆細胞を結果としてもたらす他の成分で処理される期間を表すために使用することができる。処理は、同時であってもよいし、重なり合っていてもよいし、または別個であってもよい。例えば、第１の成分は培地中に含まれてもよく、かつ、第２の成分は心臓誘導期の間に培地に加えられてもよい。

「基本培地」という用語は、心臓血管前駆細胞および心筋細胞の成長を支持する培養培地であって、最小培地、例えば、ＳｔｅｍＰｒｏ ３４（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、ＭｅｓｏＦａｔｅ（商標）（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）、ＲＰＭＩ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒおよび他の企業）など、および例えばＶＥＧＦを含むものを含むことができる。基本培地の一例は、実施例１に提供される。

「基本期」という用語は、心臓血管前駆細胞が基本培地を用いて培養され、かつＶＥＧＦおよび／または心筋細胞を結果としてもたらす他の成分で処理される期間を指すために使用することができる。処理は、同時であってもよいし、重なり合っていてもよいし、または別個であってもよい。

「インキュベートする」という用語は、細胞の集団を維持および／または増殖させる任意のｉｎ ｖｉｔｒｏの方法を含むことができ、単層、ビーズ、フラスコ、または３Ｄ培養を挙げることができ、これは任意選択で、インキュベーター中など、周囲条件が制御され、任意選択で細胞の継代を伴う。１つまたは複数の成分と細胞をインキュベートすることを伴うステップにおいて、成分は、同時に加えらえてもよいし、または重なり合う期間もしくは別個の期間のために異なる時点に加えられてもよい。因子は、例えば誘導培地中での細胞のインキュベートを開始した後に培地に加えられてもよいし、または因子は培地が細胞に加えられる前に培地に加えられてもよい。さらに、細胞をインキュベーションの間に洗浄して、例えば、以前のインキュベーションからの成分のレベルを低減させてもよい。

「培養する」という用語は、少なくとも１回の細胞分裂を通じて細胞の集団を維持および増殖させる任意のｉｎ ｖｉｔｒｏの方法を含むことができ、単層、ビーズ、フラスコ、または３Ｄ培養を挙げることができ、これは任意選択で、インキュベーター中など、周囲条件が制御される。

本明細書で使用される「濃縮された」という用語は、少なくとも５０％、少なくとも６０％、または少なくとも７０％から最大１００％の濃縮された細胞種を含むことを意味する。一実施形態では、濃縮は、本明細書に記載される方法を使用して２０日目の培養物中で測定される。

本明細書で使用される「対象」という用語は、哺乳動物などの動物界の全てのメンバーを包含し、好適にはヒトを指す。

細胞に適用される「処理する」、「処理すること」、「処理」などの用語は、細胞を任意の種類の加工もしくは条件に供することまたは細胞に任意の種類のマニピュレーションもしくは手順を行うことを含む。

対象に適用される場合、本明細書で使用される「治療」という用語は、有益なまたは所望の結果、例えば臨床結果を得ることを目的とするアプローチを指し、医療処置および薬剤または他の製造物による介入などの適用を含む。一実施形態では、治療は、生着の目的のための製造物の投与を指す。有益なまたは所望の臨床結果としては、１つまたは複数の症状または状態の軽減または改善、疾患の程度の減少、疾患の状態の安定化（すなわち、悪化させない）、疾患の拡大の予防、疾患進行の遅延または緩慢化、病態の改善または一時的緩和、および寛解（部分的または完全寛解）が挙げられるがこれらに限定されず、これらは検出可能または検出不可能なものであってよい。「治療」はまた、治療を受けていない場合の予想される生存と比較して生存を長期化させることも意味することができる。

本明細書で使用される場合、「心不全」という用語は、対象の心臓が、対象の身体中に好適な血液の流れを維持するために充分にポンプできない状態を指す。「心不全のリスクがある」対象は、心不全に先立つことが公知の１つまたは複数の特徴を有する対象を指す。例えば、心不全のリスクがある対象は、冠動脈疾患、以前の心筋梗塞（心臓発作）、高血圧、心房細動、心臓弁膜症、過剰アルコール摂取、タバコ摂取、肥満症、睡眠時無呼吸、感染症（ウイルス性および／または細菌性）、心筋症、心筋炎、先天性心臓欠陥、不整脈、および／または他の疾患、例えば、以下に限定されないが、糖尿病、甲状腺機能亢進症、甲状腺機能低下症、ヘモクロマトーシスおよび／またはアミロイドーシスなどを有するまたは有していた対象であり得る。

本明細書で使用される場合、「心筋梗塞」および「ＭＩ」という用語は、心臓の一部分への血液の流れが減少または停止し、それにより、酸素供給の欠如（虚血）のため心筋細胞の死を引き起こし、心筋の損傷を結果としてもたらす事象を指す。

本明細書で使用される場合、「投与する」、「導入する」および「移植する」という用語は、所望の部位において導入された細胞の少なくとも部分的な局在を結果としてもたらす方法または経路による対象への細胞の送達の文脈において交換可能に使用される。

本明細書で使用される「多能性幹細胞」または「ＰＳＣ」という用語は、異なる条件下で、３胚葉の細胞に特徴的な細胞種のいずれか１つに分化する能力を有する細胞を指し、胚性幹細胞および人工多能性幹細胞が挙げられる。多能性細胞は、例えばヌードマウス奇形腫形成アッセイを使用して、１つより多くの細胞種に分化する能力により特徴付けられる。多能性はまた、胚性幹（ＥＳ）細胞マーカーの発現によっても立証される。本明細書で使用される場合、多能性幹としては、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）および胚性幹細胞（ＥＳＣ）を挙げることができる。

一実施形態では、「胚性幹細胞」という用語は、ヒト胚などの胚の破壊を伴う幹細胞を除外する。

本明細書で使用される場合、「ｉＰＳＣ」および「人工多能性幹細胞」という用語は交換可能に使用され、例えば、１つまたは複数の遺伝子（例えば、以下に制限されないが、ＳＯＸ２（遺伝子ＩＤ；６６５７）、ＫＬＦ４（遺伝子ＩＤ；９３１４）、ｃＭＹＣ（遺伝子ＩＤ；４６０９）、ＮＡＮＯＧ（遺伝子ＩＤ；７９９２３）、ＬＩＮ２８／ＬＩＮ２８Ａ（遺伝子ＩＤ；７９７２７）と組み合わせたＰＯＵ４Ｆ１／ＯＣＴ４（遺伝子ＩＤ；５４６０）など）の発現を誘導することにより、非多能性細胞、典型的に成体体細胞から、人工的に誘導された（例えば、誘導された、または完全な反転による）多能性幹細胞を指す。

本発明の方法により調製され、濃縮され、または単離された心筋細胞は、多能性幹細胞に由来する。例えば、本明細書に記載される分化因子への曝露の前、間または後に、分化の状態を制御し得る遺伝子の導入を通じて、使用前に患者の細胞を遺伝子改変してもよい。本明細書に記載される方法において使用するために好適な多能性幹細胞は、患者自身の組織に由来し、幹細胞に由来する分化した組織グラフトの患者との適合性を増進させる。

「胚性幹細胞」という用語は、胚性胚盤胞の内部細胞塊の多能性幹細胞を指すために使用される（例えば、米国特許第５，８４３，７８０号、同第６，２００，８０６号を参照）。そのような細胞はまた、体細胞核移植に由来する胚盤胞の内部細胞塊から得ることもできる（例えば、米国特許第５，９４５，５７７号、同第５，９９４，６１９号、同第６，２３５，９７０号を参照）。胚性幹細胞を区別する特徴は、胚性幹細胞の表現型を定義する。したがって、細胞は、その細胞を他の細胞から区別できるような胚性幹細胞の独特の特徴の１つまたは複数を持つ場合、胚性幹細胞の表現型を有する。例示的な区別する胚性幹細胞の特徴としては、遺伝子発現プロファイル、増殖能力、分化能力、特定の培養条件への応答性などが挙げられるがこれらに限定されない。

本明細書で使用される場合、多能性幹細胞は、幹細胞特異的プロモーターの制御下でＯｃｔ－４などの選択マーカーを発現するベクター、または上方調節されて心筋細胞分化を誘導し得る遺伝子の導入を通じて遺伝子改変されてもよい。幹細胞は、マーカーまたは遺伝子が培養の任意のステージを通じて保有されるように、任意のステージにおいてマーカーまたは遺伝子を用いて遺伝子改変されてよい。マーカーは、培養の任意のステージにおいて分化したまたは未分化の幹細胞の集団を精製または濃縮するために使用され得る。

本明細書で使用される「薬学的に許容される担体」という用語は、医薬組成物の生物学的活性の効果に干渉しない、本質的に化学的に不活性のおよび非毒性の組成物を含む。好適な薬学的担体の例としては、水、食塩水溶液、グリセロール溶液、エタノール、Ｎ－（１（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル）Ν，Ν，Ν－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、ジオレシルホスホチジル－エタノールアミン（ＤＯＰＥ）、およびリポソームが挙げられるがこれらに限定されない。そのような組成物は、対象への直接投与のための形態を提供するように、好適な量の担体と共に治療有効量の化合物を含有するべきである。

本開示の範囲の理解において、本明細書で使用される「濃度」という用語は、培地中の物質、例えば、ＢＭＰ４、アクチビンＡ、レチノイン酸などの最終濃度を意味する。別に指し示さない限り、濃度は質量／体積比に基づく。

本明細書で使用される「実質的に」、「約」および「おおよそ」などの程度の用語は、最終結果が大きく変化しないような、修飾される用語の逸脱の合理的な合理的な量を意味する。程度のこれらの用語は、この逸脱がそれが修飾する語の意味を打ち消さない限り、修飾される用語の少なくとも±５％の逸脱を含むものとして解釈されるべきである。

本明細書における終点による数値範囲の記載は、その範囲内に包含される全ての数および小数を包含する（例えば、１～５は、１、１．５、２、２．７５、３、３．９０、４、および５を包含する）。全ての数およびその小数は、「約」という用語により修飾されると考えられることも理解されるべきである。さらに、「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、内容が明らかにそうでないことを規定しない限り、複数の指示対象を包含することが理解されるべきである。「約」という用語は、参照される数の、プラスまたはマイナス０．１～５０％、５～５０％、または１０～４０％、好ましくは１０～２０％、より好ましくは１０％または１５％を意味する。

さらに、特定のセクションに記載される定義および実施形態は、当業者によって好適であると理解されるであろう本明細書に記載される他の実施形態に適用可能であることが意図される。例えば、以下において、発明の異なる態様がより詳細に定義される。そのように定義される各態様は、明らかにそうでないことを指し示さない限り、任意の他の１つまたは複数の態様と組み合わせることができる。特に、好ましいまたは有利であると指し示す任意の特徴を、好ましいまたは有利と指し示す任意の他の１つまたは複数の特徴と組み合わせることができる。

態様および実施形態

一態様では、心房心筋細胞が濃縮された心筋細胞の集団を製造する方法であって、そのステップが、ｉ．凝集体および／または胚様体を生成するために好適な培地中で多能性幹細胞をインキュベートすること、ｉｉ．中胚葉誘導のために好適な培地中で幹細胞をさらにインキュベートすることであって、前記培地が、少なくともＢＭＰ成分、任意選択でＢＭＰ４、およびアクチビン成分、任意選択でアクチビンＡを含み、アクチビン成分に対してＢＭＰ成分が３：２の比で提供される、前記さらにインキュベートすること、ｉｉｉ．細胞にレチノイン酸成分をさらに加えることであって、レチノイン酸を前記加えることが、中胚葉誘導または心臓血管への系列決定ステージの間に加えられる、前記加えること、ｉｖ．好適な培地中で前記細胞の生育を続けて、心筋細胞の集団を生成させることであって、心筋細胞の前記集団は心房心筋細胞が濃縮されている、前記生成させることを含む、方法が提供される。一部の実施形態では、アクチビンに対するＢＭＰの比は１．５：１．０（または３：２）である。

一部の実施形態では、前記ＢＭＰ成分はＢＭＰ４であり、アクチビン成分はアクチビンＡであり、ＢＭＰ４の濃度は３ｎｇ／ｍｌであり、かつ、アクチビンＡの濃度は２ｎｇ／ｍｌである。一部の実施形態では、前記レチノイン酸成分はトランスレチノイン酸であり、かつ５０ｎｍ～５μΜの濃度で加えられる。一部の実施形態では、前記レチノイン酸成分は５００ｎＭの濃度で加えられる。

一部の実施形態では、ＢＭＰ成分およびアクチビン成分は方法の１日目に加えられる。一部の実施形態では、レチノイン酸成分は方法の３日目に加えられる。一部の実施形態では、追加のＢＭＰ成分は方法の３日目に培地に加えられない。

一部の実施形態では、ＦＧＦ阻害剤は方法の３日目に培地に入れられない。一部の実施形態では、方法により製造される細胞は、潜在的な治療用化合物によって引き起こされ得る心毒性（cardiac texicity）についてスクリーニングするためのｉｎ ｖｉｔｒｏア
ッセイにおいて利用される。

一態様では、心房心筋細胞が濃縮された心筋細胞の単離された集団であって、少なくとももしくは約５０％の心房心筋細胞、少なくとももしくは約６０％の心房心筋細胞、少なくとももしくは約７０％の心房心筋細胞、少なくとももしくは約８０％の心房心筋細胞、または少なくともまたは約９０％の心房心筋細胞を含み、好ましくは本明細書に記載される方法にしたがって得られた、集団が提供される。一態様では、心室心筋細胞が濃縮された心筋細胞の集団を製造する方法であって、そのステップが、ｉ．凝集体（胚様体）を生成するために好適な培地中で多能性幹細胞をインキュベートすること、ｉｉ．中胚葉誘導のために好適な培地中で凝集した幹細胞をインキュベートすることであって、前記培地が、少なくともＢＭＰ成分、任意選択でＢＭＰ４、およびアクチビン成分、任意選択でアクチビンＡを含み、アクチビン成分の濃度がＢＭＰ成分の濃度より高い、前記インキュベートすること、ｉｉｉ．好適な培地中で前記細胞の生育を続けて、心筋細胞の集団を生成させることであって、心筋細胞の前記集団は心室心筋細胞が濃縮されている、前記生成させることを含む、方法が提供される。一部の実施形態では、アクチビンに対するＢＭＰの比は、約０．３：１．０、約０．５：１．０（または１：２）または約０．８：１．０である。

一部の実施形態では、ＢＭＰ成分および／またはアクチビン成分の濃度は、ＣＤ２３５ａのレベルを測定し、かつこれをＲＡＬＤＨ２のレベルと比較することにより決定される。

一部の実施形態では、アクチビン成分の濃度は、ＲＡＬＤＨ２を発現する中胚葉細胞と比較してより多くのＣＤ２３５ａを発現する中胚葉細胞を結果として優先的にもたらす濃度に基づいて選択され、かつ、ＢＭＰ成分は、アクチビン成分の濃度より低い濃度を達成するように加えられる。一部の実施形態では、ＢＭＰ成分は、誘導された中胚葉からの最適な心臓発生を達成するように加えられる。

一部の実施形態では、前記ＢＭＰ成分はＢＭＰ４であり、アクチビン成分はアクチビンＡであり、ＢＭＰ４の濃度は３～２０ｎｇ／ｍｌであり、アクチビンＡの濃度は４～２０ｎｇ／ｍｌであり、かつ、アクチビンＡの濃度はＢＭＰ４の濃度より高い。一部の実施形態では、ＢＭＰ４の濃度は１０ｎｇ／ｍｌであり、かつ、アクチビンＡの濃度は１２ｎｇ／ｍｌである。

一態様では、心室心筋細胞が濃縮された心筋細胞の単離された集団であって、少なくとももしくは約３０％の心室心筋細胞、少なくとももしくは約４０％の心室心筋細胞、少なくとももしくは約５０％の心室心筋細胞、少なくとももしくは約６０％の心室心筋細胞、少なくとももしくは約７０％の心室心筋細胞、少なくとももしくは約８０％の心室心筋細胞、または少なくとももしくは約９０％の心室心筋細胞を含み、好ましくは本明細書に記載される方法にしたがって得られた、集団が提供される。一実施形態では、心室心筋細胞が濃縮された心筋細胞の単離された集団はペースメーカー細胞を本質的に含まない。好ましい実施形態では、心室心筋細胞が濃縮された心筋細胞の単離された集団はペースメーカー細胞を欠いている。

本発明による心筋細胞の単離された集団は、心臓血管および任意の他の障害の治療において使用するための潜在的な治療活性剤の潜在的な心毒性についてスクリーニングする方法において使用され得る。例えば、それらは、心臓血管への応用のための薬物スクリーニングにおいて使用できる細胞の供給源を提供し；心臓機能を回復させるため、虚血性心臓を修復するためおよび／または冠血管系を再生するためといった、治療目的のために使用できる細胞の供給源を提供し；心臓または冠血管系の構成成分が必要とされる組織工学目的のために使用することができ；および、心臓血管の発生および疾患の研究のための研究ツールとして役立ち得る。本発明の方法にしたがって、活性剤のスクリーニングのために使用される心筋細胞の単離された集団は、例えば、心室心筋細胞が濃縮された心筋細胞の集団を含み得る。そのような心室心筋細胞の集団は、任意選択で、ペースメーカー細胞を本質的に含まない、またはペースメーカー細胞を欠いている集団を含む。本発明の方法にしたがって活性剤をスクリーニングする（scree）ために使用される心筋細胞の単離され
た集団はまた、心房心筋細胞が農集された集団を含み得る。試験化合物または剤の潜在的な心毒性をスクリーニングまたは評価するそのような方法は、本発明による心筋細胞の集団を、心毒性について試験すべき化合物に曝露することを伴う。評価される効果としては、生存能力、収縮性、膜電位および／または細胞の他の機能の変化が挙げられる。

本発明の方法を使用して製造される心筋細胞および心筋細胞前駆細胞の集団は、移植、細胞療法または遺伝子療法のために使用することができる。例えば、本発明は、治療目的のため、例えば、心臓の修復を必要とする対象を治療する方法などにおいて使用され得る本発明の方法を使用して製造される分化した細胞を提供する。例えば、治療的修復は、心臓の修復を必要とする対象、例えば、心臓疾患または状態を患う対象などにおいて、心臓機能を完全または部分的に回復させることを伴い得る。

本発明の別の態様は、心臓疾患または状態を治療または予防する方法である。心臓疾患は、典型的に、心臓機能の減少に関連し、以下に限定されないが、心筋梗塞、心臓肥大および心臓不整脈などの状態が含まれる。本発明のこの態様において、方法は、心臓の修復を必要とする対象に、本発明の単離された分化した心室心筋細胞および／または心室心筋細胞に分化できる細胞を導入することを含む。単離された心筋細胞は、対象の損傷した心臓組織に移植することができる。理想的に、方法は、患者において一部または全ての心臓機能の回復を結果としてもたらす。

一態様では、心不全を有する対象を治療する方法であって、対象に本明細書に記載される心室心筋細胞の集団を投与することを含む、方法が提供される。一部の実施形態では、前記対象は心筋梗塞を患っている。一部の実施形態では、心筋梗塞は患者の心室にあり、かつ、集団は本明細書に記載されるものである。

一態様では、心不全を有するまたは心不全のリスクがある対象の治療において使用するための、本明細書に記載される心室心筋細胞の集団が提供される。一態様では、心不全を有するまたは心不全のリスクがある対象の治療のための医薬の調製における、本明細書に記載される心室心筋細胞の集団の使用が提供される。

本発明のさらに別の態様では、心臓組織を修復する方法であって、本発明の単離された心室心筋細胞もしくは心臓前駆細胞および／または本発明の方法を使用して処理された時に心室心筋細胞に分化できる細胞を患者の損傷した心臓組織に導入することを含む、方法が提供される。

患者は、心臓疾患または状態を患う患者であり得る。本発明の心臓組織を修復する方法において、単離された心筋細胞は、患者の損傷した心臓組織に移植することができる。理想的に、方法は、患者において少なくとも一部の心臓機能の回復を結果としてもたらす。

一実施形態では、本明細書に開示される心室心筋細胞は、心筋梗塞後の急性期の間または心不全の慢性期の間に対象に投与される。細胞は、直接的な注射またはカテーテルベースの送達のいずれかにより心室中の損傷の部位に投与される。細胞は、例えば、組織中での細胞の配置、生存および／または生着を補助するために、薬学的に許容される担体、ハイドロゲルまたはスキャフォールドと共に配合されてもよい。細胞の投与量範囲としては、例えば、１用量当たり約５億～２０億個の細胞を挙げることができる。細胞は、対象を治療するために１つまたは複数の時点において、単回または複数回投与で対象に投与することができる。

本発明は、好ましくは、本発明の方法を使用して心筋細胞または心臓前駆細胞に分化した幹細胞の、心臓機能を回復させる能力を試験するための心筋モデルを提供する。心筋細胞移植の有効性をｉｎ ｖｉｖｏで試験するために、心臓機能の測定可能なパラメーターを有する再現性のある動物モデルが重要である。使用されるパラメーターは、移植の効果を充分に決定できるように、対照および実験動物を明確に区別するべきである［例えば、Ｐａｌｍｅｎら（２００１年）、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．５０巻、５１６～５２４頁を参照］。ＰＶの関係性は、心臓のポンプ能力の指標であり、移植後の変化した心臓機能の読取りとして使用することができる。

一態様では、細胞の集団中の心房中胚葉を検出する方法であって、ＲＡＬＤＨ２を検出することを含み、ＲＡＬＤＨ２の存在が心房中胚葉を指し示す、方法が提供される。一態様では、細胞の集団中の心室中胚葉を検出する方法であって、ＣＤ２３５ａおよび／またはＣＹＰ２６Ａ１を検出することを含み、ＣＤ２３５ａおよび／またはＣＹＰ２６Ａ１の存在が心室中胚葉を指し示す、方法が提供される。

それぞれ、ＡＬＤＨ、好ましくはＲＡＬＤＨ２、ならびに／またはＣＤ２３５ａおよび／もしくはＣＤ２３５ｂ、および／もしくはＣＹＰ２６Ａ１の発現に基づいて心房または心室中胚葉を同定する本発明の方法が提供される。より具体的には、それらは、心筋細胞の増殖、心房または心室細胞集団の生存、機能および分化に影響する中胚葉細胞により産生される分泌因子の同定のために使用することができる。例えば、心房または心室心筋細胞集団を同定する本発明の方法は、分子レベルで心房および心室中胚葉の分化を理解するためおよび分化をモジュレ―トする新たな薬物標的（例えば、シグナル伝達経路）を同定するための両方の系を提供する。

本明細書に開示される実施形態の１つまたは複数によれば、レチノイン酸（ＲＡ）は、特定の発生時間ウインドウ内で心房心筋細胞へと系列決定させ、３～５日目の中胚葉へのＲＡの適用は、心房心筋細胞へと系列決定させる。ＲＡ濃度範囲：５０ｎＭ～５ｕＭ。ＲＡの供給源：オールトランスＲＡ、レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）アゴニスト（アルファについてＡＭ５８０、βについてＡＣ５５６４９、γについてＣＤ４３７）、アゴニスト濃度：ＡＭ５８０について３～３００ｎＭ；０．０２５～２．５ｕＭのＡＣ５５６４９；０．０５～５ｕＭのＣＤ４３７。

ＲＡＬＤＨ２（レチナールデヒドロゲナーゼ、またはＡｌｄｅｆｌｕｏｒ）は心房中胚葉のマーカーである。ＲＡＬＤＨ２^＋細胞の割合は、心房分化を最適化するためのａｌｄｅｆｌｕｏｒアッセイを使用することによりモニターされる。解析日：２～６日目。

１日目のアクチビンＡおよびＢＭＰ４を使用する初期中胚葉誘導は、４日目のＲＡＬＤＨ２^＋中胚葉細胞の割合を決定する。誘導条件は、低ＢＭＰ（１～５ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ）および低アクチビンＡ（０．１～４ｎｇ／ｍｌ）であり、最も一般的には、３ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ／２ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ（３Ｂ／２Ａ）が使用される。

ＲＡＬＤＨ２の機能性は、３～５日目のレチノール（ＲＯＨ）での処理により示され、これは心房表現型を誘導するために充分である（レチノールはＲＡＬＤＨ２によりＲＡに変換され、ＲＡは心房表現型へと系列決定させる）。グリコホリンＡ（ＣＤ２３５ａ）は心室中胚葉のマーカーである。ＣＤ２３５ａは心室中胚葉で排他的に発現され、ＲＡＬＤＨ２^＋心房中胚葉には存在しない。ＣＤ２３５ａ^＋細胞はＲＡＬＤＨ２を発現しない。ＣＤ２３５ａ^＋細胞は、ＲＡを分解する酵素であるＣＹＰ２６Ａ１を発現して、ＲＡシグナル伝達に拮抗し、心室表現型の確立を確実にする。解析日：２～６日目。

１日目のアクチビンＡおよびＢＭＰ４を使用する初期中胚葉誘導は、４日目のＣＤ２３５ａ^＋中胚葉細胞の割合を決定する。誘導条件は高ＢＭＰ（５～２０ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ）、および高アクチビン（６～２０ｎｇ／ｍｌ）であり、最も一般的には、１０ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ／１２ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ（１０Ｂ／１２Ａ）が使用される。３～５日目のレチノール（ＲＯＨ）でのＣＤ２３５ａ^＋細胞の処理は、心房表現型を誘導するために充分でない（これらの細胞はレチノールをＲＡに変換することができず、したがって細胞は心室表現型へと発生する）。ＣＤ２３５ａ^＋細胞は、ＭＬＣ２Ｖ^＋心室心筋細胞において高度に濃縮された集団を生じさせる。

心室および心房心筋細胞は、２つの別個の中胚葉亜集団に由来する。心室分化は、４日目のＣＤ２３５ａ＋細胞および２０日目のＭＬＣ２Ｖ^＋／ＣＴＮＴ^＋細胞の出現によりモニターされる。心房分化は、４日目のＡＦ＋細胞および２０日目のＭＬＣ２ｖ^－／ＣＴＮＴ^＋細胞の出現によりモニターされる。心室中胚葉に由来する２０日目の集団（１０Ｂ／１２Ａ）は、心房中胚葉に由来するもの（３Ｂ／２Ａ）より高い割合のＭＬＣ２ｖ^＋心室心筋細胞を含有する。

遺伝子発現解析および単一細胞パッチクランプ解析は、心房中胚葉からＲＡ処理により生成される２０日目の集団（３Ｂ／２Ａ＋ＲＡ）は、心室中胚葉からＲＡ処理により生成される２０日目の集団（１０Ｂ／１２Ａ＋ＲＡ）より高い割合の心房心筋細胞を含有することを示した。

所望の心筋細胞サブタイプを濃縮するために適切な中胚葉亜集団が系列決定される必要がある。心筋梗塞後の細胞置換療法のための心室心筋細胞の系列決定のための改良されたプロトコール。ＣＤ２３５ａ^＋心室中胚葉（１０Ｂ／１２Ａ）は、ペースメーカー細胞を欠いたＭＬＣ２ｖ^＋心室心筋細胞が高度に濃縮された集団を生じさせる。これは、他の異種混合心筋細胞集団と比較してより低い自律鼓動速度を結果としてもたらす。

汚染性ペースメーカー細胞を含有し、かつ速い自律鼓動速度を有する混合細胞集団は生命を脅かす不整脈を引き起こすことがあるので、これらは心筋梗塞後の細胞置換療法にとって望ましい特徴である。心室心筋細胞の系列決定のための我々の新たなプロトコールは、心室およびペースメーカー細胞の混合集団を生成した先行するプロトコールより優れていることを我々は提案する。

方法論および結果

ヒト多能性幹細胞株は、以前に記載された通りに培養することができる（例えば、Ｋｅｎｎｅｄｙら、２００７年）。心臓系列への分化のために、Ｋａｔｔｍａｎら、２０１１年に記載されるものなどの確立されたプロトコールを使用することができる。ＷＯ２０１６１３１１３７に記載されるものなど、手順への様々な改良が可能である。一実施形態では、８０％コンフルエントのｈＰＳＣ培養物を単一細胞に解離させ、１ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ４および１０μΜのＲＯＣＫ阻害剤を含有するＳｔｅｍＰｒｏ－３４培地中に懸濁し、オービタルシェーカーで１８時間インキュベートして胚様体（ＥＢ）を生成させることができる。翌日（分化の１日目）、中胚葉誘導培地、すなわち、本明細書にさらに記載される通り、設定された濃度のＢＭＰ４、および設定された濃度のアクチビンＡの他に５ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦを含有するＳｔｅｍＰｒｏ－３４にＥＢを移してよい。分化の３日目に、ＩＭＤＭを使用してＥＢを１回洗浄してよく、心臓誘導培地に懸濁してよく、一実施形態では、心臓誘導培地は、０．５μΜのＩＷＰ２、１０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ、および任意選択で５．４μΜのＳＢ－４３１５４２（ＳＢ、アクチビン／Ｎｏｄａｌ／ＴＧＦβ阻害剤）を含有するＳｔｅｍＰｒｏ－３４を含んでよい。心臓誘導培地はまた、任意選択で、レチノイン酸（ＲＡ）、または本明細書にさらに記載されるＲＡ成分を含んでもよい。

レチノイン酸シグナル伝達は、ｈＥＳＣから心房様心筋細胞に系列決定させる

レチノイン酸シグナル伝達が我々の胚葉体（ＥＢ）ベースのプロトコールを用いて生成されたｈＰＳＣ由来の心臓性集団において心房運命に決定させることができることを判定するために、以下の発生ステージを表す４つの異なる時点において分化培養物にオールトランスレチノイン酸（ＲＡ）を加えた：中胚葉誘導（３日目）、心臓血管への系列決定（５日目）、心臓前駆細胞の発生（７日目）および収縮性心筋細胞の出現（９日目）（Ｋａｔｔｍａｎら、２０１１年）（図１Ａ）。ＨＥＳ３ ＮＫＸ２－５：ＧＦＰレポーターｈＥＳＣ株をこれらの実験のために使用することにより、心臓血管の発生をモニターおよび定量化し、かつＧＦＰ＋心筋細胞を単離することが可能となった。培養の２０日目に、ＧＦＰ＋ＳＩＲＰＡ＋ＣＤ９０－心筋細胞を分化した集団から単離し、心房および心室の発生を指し示す遺伝子の発現についてＲＴ－ｑＰＣＲにより解析した（図１Ｂ～Ｄおよび８Ｂ～Ｅ）。

いずれのＲＡ処理も全心筋細胞マーカーＣＴＮＴの発現のレベルを有意に変化させず、異なる集団における同等の心筋細胞含有量を指し示した（図１Ｂ）。３日目および５日目におけるＲＡの添加は、心室特異的遺伝子ＭＹＬ２の発現の有意な低減および心房イオンチャネル遺伝子ＫＣＮＪ３の上方調節を結果としてもたらし（図１Ｃ）、２０日目の集団における心筋細胞運命の変化を示唆した。興味深いことに、より後の段階（７日目および１２日目）でのＲＡの添加はこれらの遺伝子の発現に効果を有しなかった。追加の室特異的マーカーの解析は、３日目にＲＡ処理した中胚葉から生成された心筋細胞はまた、非処理群より低いレベルの心室マーカーＩＲＸ４およびＭＹＨ７を発現した一方、心房マーカーＮＲ２Ｆ２、ＴＢＸ５、ＮＰＰＡ、およびＭＹＬ７ならびに心房特異的イオンチャネルＣＡＣＮＡ１Ｄ、ＫＣＮＡ５、およびＧＪＡ５について反転したパターンが観察されたことを示した（図１Ｄおよび８Ｃ～Ｅ）。対照胎児組織の解析により、これらの異なる遺伝子の心房および心室での発現パターンが検証された。３日目にＲＡ処理した中胚葉から生成された心筋細胞集団のフローサイトメトリーおよび免疫染色解析により、ｑＲＴ－ＰＣＲの発現パターンが確認され、またそれらは、非処理の対照中胚葉から生成されたものと比較して３日目にＲＡ処理した中胚葉から生成された集団におけるＭＬＣ２Ｖ^＋細胞の割合の劇的な低減およびＣＯＵＰＴＦＩＩ^＋細胞のはるかに高い頻度を示した（図１Ｅ～Ｈ）。

以上を合わせると、これらの発見は、ＲＡシグナル伝達がｈＰＳＣの心臓発生における運命の変化を誘導し、心室系列と引き換えに心房心筋細胞の発生を促進することを強く示唆する。さらに、それらは、ＲＡのこの効果は、初期発生ウインドウ、すなわち、分化の中胚葉状態に対応する分化の３～５日目に制限されることを示す。

ＲＡ応答をさらに特徴付けるために、３つのＲＡ受容体（ＲＡＲ）アイソフォーム：ＲＡＲ－アルファ、－β、－γ（図８ＦにおいてそれぞれＲＡＲＡ、ＲＡＲＢ、およびＲＡＲＧ）の発現について分化の２～６日目の集団を次に解析した。応答ステージの間に３つ全てが発現され、ＲＡ応答はこれらの全てを通じて媒介され得ることを示唆する（図８Ｆ）。これを試験するために、３日目の培養物にＲＡの代わりにアルファについて受容体特異的アゴニストＡＭ５８０、βについてＡＣ５５６４９、またはγについてＣＤ４３７を加えた。それぞれのアゴニストの添加は、２０日目のＣＴＮＴ^＋集団におけるＭＹＬ２発現の低減に繋がり、全ての受容体アイソフォームを通じたシグナル伝達が運命の変化を媒介できることを示唆した（図８Ｇおよび図８Ｈ）。

一部の実施形態では、ＲＡを約０．０５μΜの濃度から約５μΜの濃度で加えてもよい。一実施形態では、ＲＡの濃度は５００ｎＭ（０．５μΜ）である。一実施形態では、加えられるＲＡの濃度は０．０５μΜ～０．０１μΜである。一実施形態では、加えられるＲＡの濃度は０．０１μΜ～０．１μΜである。一部の実施形態では、ＲＡ成分が加えられる。一部の実施形態では、ＲＡ成分はレチノイン酸受容体（ＲＡＲ）アゴニストである。一部の実施形態では、ＲＡＲアゴニストはアルファ受容体に対するアゴニストである。一部の実施形態では、ＲＡＲアゴニストはＡＭ５８０である。一部の実施形態では、ＡＭ５８０ ＲＡＲアゴニストは約３ｎＭ～約３００ｎＭの濃度で加えられる。一部の実施形態では、ＲＡＲアゴニストはベータ受容体に対するアゴニストである。一部の実施形態では、ＲＡＲアゴニストはＡＣ５５６４９である。一部の実施形態では、ＡＣ５５６４９は約０．０２５μΜ～２．５μΜの濃度で加えられる。一部の実施形態では、ＲＡＲアゴニストはガンマ受容体に対するアゴニストである。一部の実施形態では、ＲＡＲアゴニストはＣＤ４３７である。一部の実施形態では、ＣＤ４３７ ＲＡＲアゴニストは約０．０５μΜ～約５μΜの濃度で加えられる。

ＲＡＬＤＨ２およびＣＹＰ２６Ａ１の発現は中胚葉亜集団を同定する

心房運命の系列決定がオートクラインＲＡシグナル伝達を介して媒介される場合、これらの心筋細胞を生じさせる中胚葉集団はＲＡＬＤＨ活性を示すはずである。これを試験するために、３つのレチナールデヒドデヒドロゲナーゼ、ＲＡＬＤＨ１、－２、および－３を含む全てのアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＬＤＨ）の活性を検出するａｄｅｆｌｕｏｒアッセイを使用して異なる日に我々の標準条件（１０ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ４および６ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ（１０Ｂ／６Ａ）で誘導したＰＤＧＦＲアルファ中胚葉を解析した（Ｊｏｎｅｓら、１９９５年）。これらの解析は、分化の４日目および５日目の小さいＡＬＤＨ＋ＰＤＧＦＲアルファ＋集団の存在を明らかにし（図２Ａ）、これらのステージの中胚葉の亜集団はＲＡを合成する能力を有し得ることを示唆した。ＡＬＤＨ^＋ＰＤＧＦＲアルファ^＋集団の大きさの増加を試みて、中胚葉誘導ステップの間のアクチビンＡおよびＢＭＰ４の濃度を変化させる効果を試験した。一定の濃度のＢＭＰ４（１０ｎｇ／ｍＬ）の存在下でのアクチビンＡの量の低減は、分化の４日目のＡＬＤＨ^＋ＰＤＧＦＲアルファ^＋集団の大きさの大幅な増加に繋がった（図２Ｂ）。しかしながら、この増加は、生成されるＣＴＮＴ^＋心筋細胞の割合の減少に関連し、これらの変化は非心臓性運命を促進することを示唆した。アクチビンＡおよびＢＭＰ４シグナル伝達の比が最適な心臓分化能力の維持に重要であることを我々は以前に示したので（Ｋａｔｔｍａｎら、２０１１年）、次に、最大のＡＬＤＨ^＋ＰＤＧＦＲアルファ^＋集団を誘導するアクチビンＡの量（２ｎｇ／ｍＬ）の存在下でＢＭＰ４の濃度を変化させた。１０ｎｇ／ｍＬから３ｎｇ／ｍＬ（３Ｂ／２Ａ）へのＢＭＰ４濃度の低減は、ＡＬＤＨ^＋ＰＤＧＦＲアルファ^＋集団の大きさに影響を及ぼさなかったが、２０日目に生成されるＣＴＮＴ^＋細胞の頻度を増加させた（図２Ｃ）。同等の細胞数が３Ｂ／２Ａおよび１０Ｂ／６Ａの培養物から得られ、このマニピュレーションは総心筋細胞産生量に有意に影響しないことを指し示した（図９Ａ）。

３Ｂ／２Ａで誘導した培養物の解析は、分化の３日目に大きいＰＤＧＦＲアルファ^＋中胚葉集団の出現、その後４日目にＡＬＤＨ^＋ＰＤＧＦＲアルファ^＋集団の発生を明らかにした（図２Ｄ）。ＡＬＤＨ^＋ＰＤＧＦＲアルファ^＋集団の大きさは５日目まで増加した後、６日目に減少し始めた。分子解析は、ＲＡＬＤＨ２（ＡＬＤＨ１Ａ２）の発現が分化の２～３日目に激しく増加した後、３Ｂ／２Ａで誘導された群において次の７日にわたって減少したことを示した（図２Ｅ）。１０Ｂ／６Ａで誘導した細胞は、３日目および４日目に有意に低いレベルのＡＬＤＨ１Ａ２を発現し、この群におけるより小さい割合のＡＬＤＨ^＋細胞に合致していた。他のＲＡＬＤＨアイソフォーム（ＡＬＤＨ１Ａ１およびＡＬＤＨ１Ａ３）の発現レベルはＡＬＤＨ１Ａ２より顕著に低く、２つの集団間で異ならなかった（図９Ｂ）。Ｔ（ＢＲＡＣＨＹＵＲＹ）およびＭＥＳＰ１は、１０Ｂ／６Ａおよび３Ｂ／２Ａで誘導した両方の集団において類似の時間的発現パターンを示し、中胚葉誘導の動態は２つの群間で劇的には異ならなかったことを指し示した（図９Ｃ）。発生中の胚において、ＲＡ活性の境界およびシグナル伝達の継続時間は、局在化したアゴニストの合成と分解との均衡により確立される（ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍおよびＤｕｅｓｔｅｒ、２０１５年；ＲｙｄｅｅｎおよびＷａｘｍａｎ、２０１４年）。この均衡がｈＰＳＣ分化培養において果たされているかどうかを決定するために、次に、ＲＡ分解に関与するシトクロムＰ４５０ファミリー酵素のメンバーＣＹＰ２６Ａ１の発現について２つの集団を解析した。これらの解析は、２つの群間の著しい差異を明らかにし、３日目に１０Ｂ／６Ａで誘導した細胞は、あらゆる他の１０Ｂ／６Ａまたは３Ｂ／２Ａで誘導した集団より劇的に高い発現レベルを示した（図２Ｅ）。合わせると、これらの発見は、３Ｂ／２Ａと１０Ｂ／６Ａとの組合せがＡＬＤＨ１Ａ２およびＣＹＰ２６Ａ１の発現により区別される異なる中胚葉集団を誘導するという解釈を支持する。

レチノールは心房運命にＡＬＤＨ＋中胚葉を系列決定させる

ＡＬＤＨ^＋細胞がＲＡを合成できるかどうかを決定するために、ＡＬＤＨ^＋ＰＤＧ－ＦＲアルファ^＋およびＡＬＤＨ^－ＰＤＧＦＲアルファ^＋画分を４日目の３Ｂ／２Ａで誘導した集団から単離し、細胞を凝集体としてレチノール（ＲＯＨ）、ＲＡ、またはＤＭＳＯ（対照）中で２４時間培養した（図３Ａおよび図３Ｂ）。ＡＬＤＨ１Ａ２の発現はＡＬＤＨ^＋画分に集まり、ＲＡＬＤＨ２発現細胞を単離するためのａｌｄｅｆｌｕｏｒベースの選別戦略の妥当性が確認された（図３Ｃ）。追加の１５日の培養後、全ての群は高い割合のＣＴＮＴ^＋細胞を含有し、効率的な心筋細胞分化が実証された（図３Ｄ）。非処理対照は、ＭＬＣ２Ｖ^＋細胞を含有し、ＩＲＸ４を発現する心筋細胞集団を生成し、ＲＡシグナル伝達なしで、３Ｂ／２Ａで誘導した中胚葉はある程度の心室性心臓分化能力を有することが実証された（図３Ｅおよび図３Ｆ）。ＲＯＨでの処理後、ＡＬＤＨ^＋中胚葉は、非処理対照と比較してより低い頻度のＭＬＣ２Ｖ^＋細胞、より低いレベルのＩＲＸ４発現、および上昇したレベルのＫＣＮＪ３発現を有する心房様心筋細胞集団を生成した（図３Ｅ～３Ｇ）。ＲＯＨおよびＲＡで処理したＡＬＤＨ^＋ＰＤＧＦＲアルファ^＋由来集団における発現パターンは類似しており、ＡＬＤＨ^＋細胞はＲＯＨからＲＡを合成できることを強く示唆した。

驚くべきことに、単離の時点でＡＬＤＨ１Ａ２発現を欠くにもかかわらず（図３Ｂおよび図３Ｃ）、ＡＬＤＨ－細胞においてＲＯＨへの類似の応答が観察された（図３Ｅ～３Ｆ）。この応答は、ＡＬＤＨ－由来の集団の大部分は２４時間の凝集培養の間にＡＬＤＨ＋になり（図１０Ａ）、細胞がＲＯＨに応答できるようになるという事実によるようであった。興味深いことに、同じ２４時間の期間にわたってＡＬＤＨ＋由来の集団においてａｌｄｅｆｌｕｏｒ染色の減少が観察され、中胚葉集団内のＡＬＤＨ活性（ＲＡＬＤＨ２発現）の動的性質を強調した。

合わせると、これらの発見は、ＲＯＨに応答でき、心房様心筋細胞を生成できるＡＬＤＨ＋ＰＤＧ－ＦＲアルファ＋（ＲＡＬＤＨ２＋）中胚葉を３Ｂ／２Ａが誘導することを実証し、この運命の系列決定はオートクラインＲＡシグナル伝達を介して媒介されるという考えを支持する。

ＣＤ２３５ａの発現は、心室心筋細胞を生じさせる中胚葉の印となる。ＣＤ２３５ｂは、少なくともグリコホリンＢおよびグリコホリンＡのＮ末端領域のアミノ酸配列の類似性および／または同一性により、心室中胚葉を生じさせる中胚葉のマーカーとしてＣＤ２３５ａを置換し得ることが本明細書において想定される。

心室心筋細胞を生じさせるＡＹＰ２６Ａ１発現中胚葉（ＶＭ）の発生のモニターを可能とするために、この集団をＡＬＤＨ＋中胚葉から区別することを可能とする該集団における表面マーカーについての探索を開始した。抗ＣＤ抗体アレイに対する先行するスクリーニングを通じて（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｏｃｉｇｃ．ｃａ／ａｎｔｉｂｏｄｙ／）、グリコホリンＡ（ＣＤ２３５ａ）は、１０Ｂ／６Ａで誘導した５日目の心臓性ＰＤＧＦＲアルファ＋細胞のサブセットで発現されることを我々は発見した（データ示さず）。１０Ｂ／６Ａおよび３Ｂ／２Ａで誘導した集団の解析は、ＣＤ２３５ａ＋集団は次の２４時間以内に増加（＞６０％）した後、続く４８時間にわたって減少することを明らかにした。５日目に検出された小さい割合のＡＬＤＨ^＋細胞はＣＤ２３５ａ^－であり、ＡＬＤＨ^＋およびＣＤ２３５ａ^＋の集団は互いに排他的であることを指し示した。３Ｂ／２Ａで誘導した集団において、わずかなＣＤ２３５ａ^＋細胞のみが４日目に検出された。ｑＲＴ－ＰＣＲ分析は、１０Ｂ／６Ａで誘導した群における分化の３日目のＧＹＰＡ（グリコホリンＡ）発現の上方調節を明らかにした図１１Ａ）。発現レベルは次の２４時間にわたって激しく減少し、解析の期間にわたって低いままであった。３Ｂ／２Ａで誘導した集団において、低いレベルの発現のみが検出された。これらの発見に基づいて、我々は、心室心筋細胞系列に寄与する中胚葉においてグリコホリンＡが発現されるという仮説を立てる。

心室前駆細胞の単離のためのＣＤ２３５ａの有用性を試験するために、中等度の濃度のＢＭＰ４およびアクチビンＡ（５ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ４および４ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ［５Ｂ／４Ａ］）を用いる誘導戦略を使用してＣＤ２３５ａ^＋およびＡＬＤＨ^＋の両方の亜集団を含有する４日目の集団を生成した（図４Ｂ）。ＣＤ２３５ａ^＋ＡＬＤＨ^－およびＣＤ２３５ａ^－ＡＬＤＨ^＋の両方の画分を単離し、細胞を凝集体として培養した。選別した画分のｑＲＴ－ＰＣＲ分析は、ＡＬＤＨ１Ａ２がＣＤ２３５ａ^－ＡＬＤＨ^＋細胞においてＣＤ２３５ａ^＋ＡＬＤＨ^－細胞におけるよりも高いレベルで発現されることを示した（図１１Ｂ）。ＧＹＰＡおよびＣＹＰ２６Ａ１の発現レベルは、恐らくこれらの遺伝子のピーク発現を過ぎた４日目に画分を単離したという事実により、２つの間で有意に異ならなかった。ＲＯＨおよびＲＡの非存在下で、両方の画分は心室様細胞を生成した（図４Ｃ～４Ｅ）。しかしながら、ＭＬＣ２Ｖ^＋細胞の割合およびＩＲＸ４の発現は、ＣＤ２３５ａ^－ＡＬＤＨ^＋派生物におけるよりもＣＤ２３５ａ^＋ＡＬＤＨ^－中胚葉から生成した集団において高かった。心房の遺伝子ＫＣＮＪ３およびＮＲ２Ｆ２について反対のパターンが観察された（図４Ｆ）。ＲＯＨの存在下で培養した場合、ＣＤ２３５ａ^－ＡＬＤＨ^＋は、低い頻度のＭＬＣ２Ｖ^＋細胞、低いレベルのＩＲＸ４発現、および上昇したレベルのＮＰＰＡ、ＫＣＮＪ３、およびＮＲ２Ｆ２発現により特徴付けられる心房様の心筋細胞集団を生じさせた（図４Ｄ～４Ｆ）。対照的にＣＤ２３５ａ^＋ＡＬＤＨ^－細胞はＲＯＨへの応答を示さず、ＡＬＤＨ^＋細胞の非存在下でＲＡを合成できないことを実証した。予想の通り、両方の中胚葉集団はＲＡに応答し、ＭＬＣ２Ｖ^－細胞を生成した。以上を合わせると、これらの発見は、ＣＤ２３５ａの発現が、ＣＤ２３５ａ^－ＡＬＤＨ^＋中胚葉からそれを区別する特徴である、ＲＯＨに応答して心房細胞を生成できない、心室心筋細胞への分化能力を有する中胚葉集団の印となることを実証する。これらの発見はまた、ＲＡシグナル伝達の非存在下で生成された心筋細胞の集団における心室および心房の遺伝子の差次的発現が指し示す通り、ＣＤ２３５ａ^＋およびＡＬＤＨ^＋中胚葉集団は各々の運命に既にパターン決定されていることも示唆する。

心室心筋細胞分化の最適化

１０Ｂ／６Ａでの誘導は心室心筋細胞の発生に有利に働くが、これらの条件下で生成される中胚葉は、多くの場合、小さい割合のＡＬＤＨ＋細胞を含有し、ばらついた割合（４０％～６０％のＭＬＣ２Ｖ＋細胞を含有するＣＴＮＴ＋集団を生じさせる。心室心筋細胞の発生をさらに最適化するために、異なる濃度のアクチビンＡおよびＢＭＰ４で誘導した４日目のＥＢ集団におけるＣＤ２３５ａ＋画分の大きさをモニターし、これを２０日目にＭＬＣ２Ｖ＋ＣＴＮＴ＋細胞の頻度と比較した（図５Ａおよび図５Ｂ）。アクチビンＡの濃度を一定量のＢＭＰ４（１０ｎｇ／ｍＬ）の存在下で２ｎｇ／ｍｌから１２ｎｇ／ｍｌに増加させたところ、４日目のＣＤ２３５ａ＋集団の大きさの増加、ＡＬＤＨ＋＋集団の除去、およびＭＬＣ２Ｖ＋ＣＴＮＴ＋細胞の割合の増加に繋がった（図５Ａ）。

次に、最も高い頻度のＭＬＣ２Ｖ^＋ＣＴＮＴ^＋細胞を生成するアクチビンＡの量（１２ｎｇ／ｍＬ）に対してＢＭＰ４の濃度（３～２０ｎｇ／ｍＬ）を変化させた。ＢＭＰ４濃度の変化は、ＣＤ２３５ａ^＋集団の大きさにほとんど影響力がなかったが、心室の系列決定に影響を及ぼした。最も高い濃度（２０ｎｇ／ｍＬ）のＢＭＰ４で誘導したＥＢから生成された２０日目の集団は最も低い頻度のＭＬＣ２Ｖ^＋ＣＴＮＴ^＋細胞を有した一方、低い濃度のＢＭＰ４（５ｎｇ／ｍＬ［５Ｂ／１２Ａ］）で誘導したＥＢは最も高い頻度のこれらの心筋細胞（８０％±５％）を生成した（図５Ｂおよび図１３Ｂ）。５Ｂ／１２Ａおよび１０Ｂ／６Ａで誘導した培養物は同等の細胞数をもたらし、総細胞産生量を落とすことなくＭＬＣ２Ｖ^＋ＣＴＮＴ^＋細胞の濃縮が得られたことを指し示す（図１２Ｃ）。

アクチビンＡおよびＢＭＰ４の最適な濃度は特定のロットのサイトカインの活性に依存することに留意する価値がある。これを考慮すると、これらの滴定は、最適な濃度を決定するために各新たなロットのサイトカインを用いて繰り返す必要がある。報告されている通りに（Ｂｕｒｒｉｄｇｅら、２０１４年）培養における時間がｈＰＳＣ由来の心筋細胞集団のＭＬＣ２Ｖ＋含有量に影響を及ぼし得るかどうかを決定するために、３Ｂ／２Ａ、１０Ｂ／６Ａ、および５Ｂ／１２Ａで誘導したＥＢから生成された２０日目および４０日目の集団を比較した。図１３Ｂに示すように、各集団において両方の時点で類似の割合のＭＬＣ２Ｖ＋ＣＴＮＴ＋心筋細胞が検出され、培養時間の延長はこれらの条件下で心室含有量に影響を及ぼさなかったことを実証した。以上を合わせると、これらの発見は、４日目のＣＤ２３５ａ＋集団の誘導は、ＭＬＣ２Ｖ＋ＣＴＮＴ＋心筋細胞における高度に濃縮された集団の生成のための必要条件であることを指し示す。しかしながら、それらはまた、この集団の大きさは、培養の２０日目のＭＬＣ２Ｖ＋細胞のパーセンテージを必ずしも予測しないことも示す。５Ｂ／１２Ａで誘導したＥＢ集団は、高い割合のＣＤ２３５ａ＋細胞を含有し、ＡＬＤＨ＋細胞を含有しなかった一方（図５Ｃ）、３Ｂ／２Ａで誘導したものは高い頻度のＡＬＤＨ＋細胞を有し、ＣＤ２３５ａ^＋細胞をほとんど有しなかった。ＲＯＨまたはＲＡの非存在下または存在下で系列決定され（３～５日目）、かつ追加の１５日間培養された場合、両方の集団は、生成されたＣＴＮＴ^＋細胞の頻度による測定で類似の心臓分化能力を示した（図５Ｄ）。

３Ｂ／２Ａで誘導したＥＢはＲＯＨに応答し、ＭＬＣ２Ｖ^＋細胞の欠失、ＩＲＸ４発現の低減、ならびにＫＣＮＪ３およびＮＲ２Ｆ２の発現の上方調節により特徴付けられる心房様心筋細胞集団を生成した（図５Ｅ～５Ｇ）。対照的に、５Ｂ／１２Ａで誘導したＥＢはＲＯＨに応答せず、ＡＬＤＨ^＋細胞の完全な非存在に合致した。予想の通り、ＲＡ処理はこの中胚葉から心房様心筋細胞の表現型を誘導することができた。

心室分化を最適化するために使用した条件が、これらの培養物中に通常検出されるＮＫＸ２．５^－洞房結節ペースメーカー様細胞（Ｂｉｒｋｅｔら、２０１５年；Ｐｒｏｔｚｅら、２０１７年）の割合に影響したかどうかを決定するために、ＮＫＸ２－５－ＧＦＰ^－細胞の存在について集団を解析した。図５Ｈに示すように、最適化した５Ｂ／１２Ａで誘導したＥＢから生成された集団は、１０Ｂ／６Ａで誘導した（図１Ｅ）および３Ｂ／２Ａで誘導したＥＢに由来するものより有意に少ないＮＫＸ２－５－ＧＦＰ^-ＣＴＮＴ^＋細胞
を含有し、洞房結節様ペースメーカー細胞（ＳＡＮＰＬＣ）の含有量の低減を指し示した。ペースメーカー含有量のこの減少は、３Ｂ／２Ａで誘導したＥＢと比較した５Ｂ／１２Ａで誘導したＥＢの自律鼓動速度の有意な減少に関連した（図５Ｉ）。我々の先行する発見（Ｐｒｏｔｚｅら、２０１７年）に合致して、ＲＡ処理は誘導集団中のＮＫＸ２－５－ＧＦＰ^－細胞の割合に影響を及ぼさなかった（図５Ｊ）。

以上を合わせると、５Ｂ／１２Ａは、高い割合のＣＤ２３５ａ^＋細胞を含有し、心室心筋細胞が高度に濃縮された集団を生じさせ、かつ心房心筋細胞およびＳＡＮＰＬＣを欠いた中胚葉の亜集団に系列決定させることをこれらの発見は示す。この亜集団はまた、心室中胚葉と称してもよい。

一部の実施形態では、心室分化の最適化は、本明細書に記載される方法を使用して２０日目の培養物において測定した時に、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の心室心筋細胞の濃縮を結果としてもたらす。一部の実施形態では、集団はペースメーカー細胞を本質的に含まない。一部の実施形態では、集団はペースメーカー細胞を欠いている。

一部の実施形態では、心室分化を最適化する方法は、最適化された濃度のＢＭＰ成分およびアクチビン成分を加えることにより、心室中胚葉の生成を最適化する。一部の実施形態では、ＢＭＰ成分はＢＭＰ４であり、かつ、アクチビン成分はアクチビンＡである。一部の実施形態では、ＢＭＰ４は３ｎｇ／ｍｌ～２０ｎｇ／ｍｌの濃度で加えられる。一部の実施形態では、アクチビンＡは４ｎｇ／ｍｌ～２０ｎｇ／ｍｌの濃度で加えられる。好ましい実施形態では、アクチビンＡはＢＭＰ４より高い濃度で加えられる。一部の実施形態では、ＢＭＰ４は１０ｎｇ／ｍｌの濃度で加えられ、かつ、アクチビンＡは１２ｎｇ／ｍｌの濃度で加えられる。一部の実施形態では、ＢＭＰ成分およびアクチビン成分は方法の１日目に加えられる。一部の実施形態では、ＢＭＰ成分および／またはアクチビン成分の濃度はＣＤ２３５ａの存在または量を測定することにより決定される。一部の実施形態では、ＢＭＰ成分および／またはアクチビン成分の濃度はＲＡＬＤＨ２の存在または量を測定することにより決定される。一部の実施形態では、ＢＭＰ成分および／またはアクチビン成分の濃度は、ＣＤ２３５ａのレベルを測定し、かつこれをＲＡＬＤＨ２のレベルと比較することにより決定される。一部の実施形態では、アクチビン成分の濃度は、ＲＡＬＤＨ２を発現する中胚葉細胞と比較してより多くのＣＤ２３５ａを発現する中胚葉細胞を結果として優先的にもたらす濃度に基づいて選択され、かつ、ＢＭＰ成分はアクチビン成分の濃度より低い濃度で加えられる。一部の実施形態では、ＢＭＰ成分の濃度は、ＲＡＬＤＨ２と比較してより多くのＣＤ２３５ａを結果として優先的にもたらす濃度に基づいて選択され、かつ、アクチビン成分はＢＭＰ成分の濃度より高い濃度で加えられる。

異なる中胚葉から生成される心筋細胞の特徴付け
異なる中胚葉集団の心臓分化能力をさらに研究するために、我々の元々のサイトカインの組合せ（１０Ｂ／６Ａ；混合誘導ＭＩ）または心室（５Ｂ／１２Ａ；心室誘導ＶＩ）もしくは心房（３Ｂ／２Ａ；心房誘導ＡＩ）運命に最適化された組合せで誘導したＥＢから生成された２０日目のＮＫＸ２－５＋ＳＩＲＰアルファ＋ＣＤ９０－心筋細胞を単離した。予想の通り、ＣＴＮＴの発現レベルは、選別された集団中で類似していた（図６Ａ）。ＶＩのＥＢから生成された心筋細胞は、ＭＩまたはＡＩのＥＢに由来する心筋細胞よりも、ＭＹＬ２、ＩＲＸ４およびＭＹＨ７などの心室筋細胞に関連する遺伝子を有意に高いレベルで発現した（図６Ｂ）。ＶＩのＥＢに由来する集団は、最も高い頻度のＭＣＬ２Ｖ＋心筋細胞を有し（ＶＩのＥＢから８０％±２％、ＭＩのＥＢから５６％±４％、およびＡＩのＥＢから２５％±５％）、向上した心室発現プロファイルは、部分的に、濃縮された頻度の心室様心筋細胞によることを示唆した（図１３Ａ）。心筋細胞の集団のＭＬＣ２Ｖ含有量の差異が免疫染色分析により確認された（図１３Ｂ）。

ＲＡで処理したＶＩおよびＡＩのＥＢ（それぞれＶＩ＋ＲＡおよびＡＩ＋ＲＡ）から生成された心筋細胞は、非処理ＥＢから単離されたものと比較して、解析された全ての心房の遺伝子の発現について上昇したレベルを示した（図６Ｃおよび図１３Ｃ）。ＡＩ＋ＲＡからの細胞におけるＫＣＮＡ５、ＫＣＮＪ３、ＮＲ２Ｆ２およびＣＡＣＮＡ１Ｄの発現レベルは、胎児心房組織におけるものと同じくらい高いか、またはそれより高かった（図６Ｃ）。顕著なことに、それらの発現レベルは、ＶＩ＋ＲＡのＥＢから生成された筋細胞で検出されたものよりも有意に高かった。対照的に、ＧＪＡ５、ＮＰＰＡ、およびＭＹＬ７などの他の心房の遺伝子は、２つのＲＡで処理した心筋細胞の集団において同等のレベルで発現されたが、胎児心房組織において検出されたものより有意に低いレベルであった（図１４Ｃ）。ペースメーカー遺伝子ＴＢＸ３のレベルは２つのＲＡ処理群において同等であり、ＫＣＮＡ５、ＫＣＮＪ３、ＣＡＣＮＡ１Ｄ、およびＮＲ２Ｆ２の発現の観察された差異は心房集団における汚染性ペースメーカー細胞によるものではなかったことを示唆した（図１３Ｄ）。

ＣＤ２３５ａ＋中胚葉は、ＲＡを分解できるＣＹＰ２６Ａ１を発現することを考慮すると、心房の遺伝子の発現の差異は、核内受容体に到達する活性リガンドの最終濃度の差異によるものである可能性がある。これを試験するために、心房系列決定のために使用されるＲＡの濃度を変化させ、各ＥＢ誘導条件から生成された単離されたＮＫＸ２－５＋ＳＩＲＰａ＋細胞（２０日目）を解析した（図１３Ｅ）。０．５ｍＭから１～２ｍＭへのＲＡの濃度の増加は、ＶＩのＥＢからの心筋細胞におけるＫＣＮＡ５の発現レベルをＡＩのＥＢからの細胞と同等のレベルに増加させた（図１３Ｆ）。ＲＡのこれらの濃度はまた、ＶＩ集団において心室遺伝子ＭＹＬ２およびＩＲＸ４の発現を完全に抑制するために充分であった（図１３Ｇ）。対照的に、２ｍＭまでの濃度でのＲＡの添加は、ＶＩの心筋細胞におけるＫＣＮＪ３、ＣＡＣＮＡ１Ｄ、およびＮＲ２Ｆ２の発現をＡＩの細胞で観察されるレベルまで増加させなかった（図１４Ｈ）。これらの遺伝子の同等の発現レベルは、２０日目の集団においてＮＫＸ２－５＋ＳＩＲＰａ＋細胞の頻度の劇的な低減を結果としてもたらす濃度であった４ｍＭのＲＡで処理したＥＢから生成された心筋細胞においてのみ検出された（図１４Ｅ）。ＶＩおよびＡＩの中胚葉集団は同じ分化能力を有しないことをこれらのデータはさらに実証する。さらに、心室および心房心筋細胞の効率的な系列決定のために適切な初期誘導戦略を使用する重要性をそれらは強調する。上記集団が機能的に異なるかどうかを評価するために、パッチクランプ実験を使用してＶＩおよびＡＩ±ＲＡのＥＢに由来するＮＫＸ２－５＋ＳＩＲＰａ＋ＣＤ９０－心筋細胞の電気生理学的特徴を試験した。

表１（図６に関する） ＶＩおよびＡＩのＥＢに由来する心筋細胞の電気生理学的（Elerophysiological）特徴

ＡＰＡ、活動電位の振幅；ＡＰＤ３０／９０、再分極の３０％／９０％での活動電位の継続時間；ＣＬ、周期長；ＤＭＰ、拡張期膜電位；ｄｖ／ｄｔｍａｘ、最大活動電位立ち上がり速度；ｔ検定：＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、ＶＩ自律に対して、および＃Ｐ＜０．０５、＃＃Ｐ＜０．０１、ＶＩ＋ＲＡに対して。ｎ＝５（ＶＩ、ＶＩ＋ＲＡ）およびｎ＝６（ＡＩ＋ＲＡ）の独立した分化のパッチ解析した細胞バッチからＡＰの種類の％±ＳＥＭを定量化した。ＡＰの種類への分類のために使用したパラメーターの詳細は方法セクションに特定される。

ＭＬＣ２Ｖのフローサイトメトリー解析は、ＲＡの非存在下でＡＩのＥＢからの心室心筋細胞の系列決定の低い効率を既に実証しているので、これらの心筋細胞はパッチクランプ実験においてさらに解析しなかった。ＶＩのＥＢ由来の心筋細胞（ＲＡの非存在下）は、迅速な立ち上がり速度（＞１０Ｖ／ｓ）および長いＡＰ継続時間（ＡＰＤ３０＞５０ｍｓ）を有する典型的な心室の活動電位（ＡＰ）を示した（図６Ｅおよび図６Ｆ）。重要なことに、解析した細胞の１００％がこの心室の表現型を示した（図６Ｇ）。ＲＡの存在下でＶＩまたはＡＩのＥＢから系列決定された心筋細胞は、心房のＡＰ表現型を指し示す、ＶＩのＥＢ由来の心筋細胞と比較した有意に速い鼓動速度およびより短いＡＰＤ３０を示した（図６Ｅおよび図６Ｆ）。しかしながら、ＶＩ＋ＲＡのＥＢ由来の心筋細胞のＡＰＤ３０およびＡＰＤ９０は、ＡＩ＋ＲＡのＥＢ由来の心筋細胞で見られたよりも有意に長かった（ＡＰＤ３０、５５±２０ｍｓ対１３．０±４．８ｍｓ；ＡＰＤ９０、２５８±２５ｍｓ対１８９±１８ｍｓ）。観察されたＡＰの種類の分類は、２つの群からの細胞において記録された心房および心室様のＡＰの割合の顕著な差異を明らかにした（図６Ｇ）。ＶＩ＋ＲＡのＥＢからの解析した細胞の６２％±５％のみが心房のパターンを示し、残りの３８％±５％は心室表現型（ＡＰＤ３０／９０＞０．３）を示した。対照的に、ＡＩ＋ＲＡのＥＢにおける細胞の大部分（８６％±９％）は心房のパターンを示し、６％±６％のみが心室のＡＰを示した。ＡＩ＋ＲＡのＥＢからの記録された２０細胞のうち１つは、未熟な心筋細胞を指し示す、遅い立ち上がり速度（＜１０Ｖ／ｓ）および遅い鼓動速度（５０ｂｐｍ）を有した。２つのＥＢ集団から生成された心房細胞をさらに特徴付けるために、心房のＡＰ表現型（立ち上がり速度＞１０Ｖ／ｓ、ＡＰＤ３０／９０＜０．３）を示した細胞のみに焦点を当てて、アセチルコリン活性化カリウム電流密度（ＩＫＡＣｈ）を次に測定した。予想の通り、対照ＶＩのＥＢ由来の心室細胞（－ＲＡ）は、両方の集団から生成された心房細胞より有意に小さいＩＫＡＣｈ電流密度を示した（図６Ｈ－６Ｊ）。２つの心房心筋細胞集団の比較は、興味深い差異を明らかにし、ＡＩ＋ＲＡのＥＢに由来するものは、ＶＩ＋ＲＡのＥＢに由来するものより有意に高いＩＫＡＣｈ電流密度を示した（２．８±０．４ｐＡ／ｐＦ対１．６±０．４ｐＡ／ｐＦ）。上記の観察と合わせると、これらの発見は、心房細胞の生成効率およびこれらの細胞の質は、適切な中胚葉集団を生成させることに依存することを指し示す。

他のｈＰＳＣ株からの心房および心室心筋細胞の生成

ＡＬＤＨ活性およびＣＤ２３５ａの発現に基づく心房および心室分化を最適化するアプローチが広範に適用可能かどうかを決定するために、我々は次に、それを使用して、ＨＥＳ２ヒト胚性幹細胞およびＭＳＣ－ｉＰＳ１人工多能性幹細胞株からこれらの心筋細胞集団を生成した。滴定研究により、ＨＥＳ２細胞について５Ｂ／２Ａおよび５Ｂ／６Ａがそれぞれ心房および心室の誘導のために最適なものとして、およびＭＳＣ－ｉＰＳＣ１細胞について４Ｂ／４Ａが心室誘導のために最適なものとして同定された（図７Ａ、図７Ｂ、図７Ｅ、および図７Ｆ；Ｍｅｎｄｅｌｅｙ ｈｔｔｐ：／／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１７６３２／７ｚ７ｄ５ｖ２ｃ３ｗ．１）。ＭＳＣ－ｉＰＳＣ１細胞からの心房誘導の最適化はより困難であり、全てのサイトカインの組合せが実体的なＣＤ２３５ａ＋集団の発生を促進した。これらのパターンの１つの解釈は、ＭＳＣ－ｉＰＳ１細胞は高いレベルの内因性Ｎｏｄａｌ／アクチビンＡシグナル伝達を有し、全ての条件下である程度のＣＤ２３５ａ＋細胞の発生を結果としてもたらすというものである。これを試験するために、４Ｂ／１Ａで誘導した細胞に３～５日目にＮｏｄａｌ／アクチビンＡ／トランスフォーミング成長因子ベータ（ＴＧＦ－ベータ）阻害剤ＳＢ－４３１５４２（ＳＢ）を加えた。ＳＢの添加は、４日目の中胚葉のＣＴＮＴ＋ＭＬＣ２Ｖ－心臓分化能力に影響することなく、ＣＤ２３５ａ＋細胞の低減およびＡＬＤＨ＋集団の大きさの増加に繋がり（図７Ｅ、図７Ｆ、および図１４Ａ）、ＭＳＣ－ｉＰＳ１細胞は他の株より高いレベルの内因性Ｎｏｄａｌ／アクチビンＡシグナル伝達を有するという解釈を支持した。

両方の株からのＣＤ２３５ａ＋中胚葉の発生に最適化されたＥＢは、ＩＲＸ４を発現する高い割合のＭＬＣ２Ｖ＋ＣＴＮＴ＋心筋細胞を含有する２０日目の集団を生成した（図７Ｂ、図７Ｃ、図７Ｆ、および図７Ｇ）。いずれのＣＤ２３５ａ＋中胚葉集団もＲＯＨに応答しなかった。予想の通り、両方はＲＡに応答し、非処理対照と比較して低減されたＭＬＣ２Ｖ含有量、ＭＹＬ２およびＩＲＸ４発現の下方調節、およびＫＣＮＪ３およびＮＲ２Ｆ２の上方調節を示す心筋細胞の集団を生成した（図７Ｂ～７Ｄ、図７Ｆ～７Ｈ、および図１４Ｂ～１４Ｇ）。ＡＬＤＨ＋中胚葉の発生に最適化したＥＢはＲＯＨおよびＲＡの両方に応答し、心房系列を指し示す発現プロファイルを示す心筋細胞集団を生成した（図７Ｂ～７Ｄ、図７Ｆ～７Ｈ、および図１４Ｂ～１４Ｇ）。以上を合わせると、これらの発見は、異なるｈＰＳＣ株から生成されたＡＬＤＨ＋およびＣＤ２３５ａ＋中胚葉集団は、ＨＥＳ３－ＮＫＸ２－５ｅＧＦＰ／ｗ株から生成された集団と類似して、それぞれ心房および心室への分化能力を示すことを実証する。心房および心室の心筋細胞系列の出現および分離をマッピングすることを目的にして、ｈＰＳＣ分化システムを使用して、ヒト心臓発生の最初期ステージをモデル化した。この研究からの発見は、心房および心室心筋細胞が、異なるレベルのアクチビンＡおよびＢＭＰ４シグナル伝達により系列決定され、またそれぞれＡＬＤＨ活性（ＲＡＬＤＨ２）またはＣＤ２３５ａ／ＣＹＰ２６Ａ１の発現に基づいて同定できる別個の中胚葉集団に由来するというヒト心臓発生のスキームを支持する（図７Ｉ）。心房の心臓発生は、ＲＡＬＤＨ２^＋中胚葉の亜集団内でオートクラインＲＡシグナル伝達を介して誘導される一方、ＣＹＰ２６Ａ１の発現を通じたＣＤ２３５ａ^＋中胚葉における経路の阻害は心室心筋細胞の発生のために必要とされることを我々は提案する。ＲＡＬＤＨ２^＋およびＣＤ２３５ａ^＋集団は両方の種類の心筋細胞を生じさせることができるが、心房および心室細胞の効率的な生成は適切な中胚葉の誘導に依存する。合わせると、これらの新たな洞察は、ヒト心臓発生の最初期ステージにアクセスするための枠組みおよび特定の心筋細胞サブタイプの効率的な生成のための最適なプロトコールを設計するためのプラットフォームを提供する。

心房系列決定は発生の中胚葉ステージの間のＲＡシグナル伝達により媒介されるという我々の観察は、ｈＰＳＣからの心房分化に関する先行する報告（Ｄｅｖａｌｌａら、２０１５年；Ｚｈａｎｇら、２０１１年）の他に、初期胚において記載された心臓発生に対するＲＡの時間制約的な効果（Ｍｏｓｓら、１９９８年；Ｘａｖｉｅｒ－Ｎｅｔｏら、２０００年）に合致する。胚において、このステージは、心臓管の後部領域に寄与し、最終的に心房心筋細胞を生じさせると考えられている側板中胚葉におけるＲＡ応答性およびＲＡＬＤＨ２発現性の細胞の集団の出現と関係付けられる（Ｈｏｃｈｇｒｅｂら、２００３年；Ｍｏｓｓら、１９９８年）。ＲＡ応答性およびＲＡＬＤＨ２発現の高度に重なり合うパターンは、この中胚葉がＲＡの合成およびＲＡへの応答の両方を行うことができることを示唆する。ｉｎ ｖｉｖｏにおいて心臓中胚葉の亜集団がＲＡを合成できるという考えは、心房発生に寄与する遊走性Ｍｅｓｐ１^＋中胚葉（Ｅ７．２５）は初期遊走性心室前駆細胞（Ｅ６．２５～６．７５）より有意に高いレベルのＡＬＤＨ１Ａ２（ＲＡＬＤＨ２）を発現することを示したＬｅｓｃｒｏａｒｔら（２０１４）の研究により支持される。我々の細胞選別実験からの発見は、心房への分化能力を有する３Ｂ／２Ａで誘導した中胚葉はＲＡＬＤＨ２を発現し、ＲＯＨに応答できることを明確に実証し、ヒトの心房系列決定がオートクラインＲＡシグナル伝達を通じて媒介されることの説得力のある証拠を提供する。

ＣＤ２３５ａ^＋ＣＹＰ２６Ａ１^＋ＡＬＤＨ^－中胚葉は心室心筋細胞を効率的に生成するが、ＲＯＨに応答して心房細胞を生成することはできないという発見は、これらの心筋細胞サブタイプが異なる中胚葉集団に由来することの強い証拠を提供する。ＣＤ２３５ａ^＋およびＡＬＤＨ^＋中胚葉におけるＣＹＰ２６Ａ１およびＲＡＬＤＨ２の差次的発現は、これらのｈＰＳＣ由来の前駆細胞が、発生胚における心臓血管前駆領域の前後軸に沿って見られるＲＡシグナル伝達の境界に類似したＲＡの合成と分解との均衡を確立したことを指し示す（ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍおよびＤｕｅｓｔｅｒ、２０１５年；ＲｙｄｅｅｎおよびＷａｘｍａｎ、２０１４年）。現在、ＣＤ２３５ａ中胚葉が左もしくは右の心室心筋細胞または両方の混合を生成するのかどうかは知られていない。ｉｎ ｖｉｔｒｏでこれらの集団のより良好な解明を達成できるまで、異なる前駆細胞が左心室および右心室の流出路に寄与することを提案する第１および第２の心臓領域モデルに我々の発見を組み込むことは難しい（Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍら、２００５年；Ｍｅｉｌｈａｃら年、２００４年；Ｓｐａｅｔｅｒら、２０１３年）。しかしながら、我々の発見は、系列追跡戦略を使用して、マウスにおけるＦＯＸＡ２の発現が、心房ではなく左心室および右心室の心筋細胞を生じさせる前駆細胞の印となることを示したＢａｒｄｏｔら（２０１７年）の発見に合致する。

ＣＤ２３５ａの発現およびＡＬＤＨ活性を通じて心室および心房の前駆細胞の発生を定量的にモニターする能力により、これらの２つの集団の系列決定を調節する経路を研究し、かつＢＭＰ４およびアクチビンＡシグナル伝達の勾配がこれらの初期決定において極めて重要な役割を果たすことを実証することが可能となった。異なるｈＰＳＣ株の我々の解析は、心室系列の系列決定は、心房系列の生成のために必要とされるよりも高いアクチビンＡ対ＢＭＰ４シグナル伝達の比に依存することを明らかにした。これらの差異は、これらの前駆細胞が初期胚においてさらされる異なるシグナル伝達環境を反映する可能性がある。これを支持する証拠がＬｅｓｃｒｏａｒｔらの研究（２０１４年）により提供され、彼らは、Ｎｏｄａｌならびにその下流の標的遺伝子ＰＩＴＸ２、ＬＥＦＴ１、ＦＧＦ８、ＧＳＣ、およびＭＩＸＩの転写物（Ｌｅｅら、２０１１年）が、後期発生の心房前駆細胞と比較して初期遊走性左心室前駆細胞において濃縮されることを示した。

最適な心室および心房の発生は適切な中胚葉の効率的な系列決定に依存するという観察は、ｈＰＳＣ分化培養における発生の初期ステージを理解する重要性を強調する。系列発生の効率、および心房心筋細胞の場合は生成される細胞の質の両方が初期誘導ステップにより影響されることを我々の発見は示す。分化培養における系列発生の精密な制御は、ｈＰＳＣの分化能力を心臓血管疾患への治療的応用に翻訳するための重要な意味を有する。例えば、汚染性ペースメーカー細胞および心房細胞を欠いた高度に濃縮された心室心筋細胞は、心筋梗塞を患う患者における心室壁の筋肉の再肥大を目的とする細胞ベースの療法を開発するための理想的な候補集団であろう。非心室細胞の除去は、ｈＰＳＣ由来の心筋細胞の混合集団の移植後の動物モデルにおいて観察される不整脈を低減させ得る（Ｃｈｏｎｇら、２０１４年；Ｓｈｉｂａら、２０１６年）。心筋細胞サブタイプの濃縮された集団へのアクセスもまた、心房細動、肥大性心筋症、および他の室特異的先天性心臓欠陥などの心臓の特定の領域に影響する疾患をモデル化するために重要である。異なる心臓集団を生成させる能力は、そのような研究のために適切な標的細胞を提供するだけでなく、他の心筋細胞サブタイプに対する治療戦略の潜在的なオフターゲット効果の解析も可能とする。これらの包括的な解析は、特徴付けに乏しい混合集団の使用では不可能なヒト心臓血管疾患への洞察を提供するであろう。

方法の詳細

ヒトＥＳＣ／ｉＰＳＣ株の方向付けられた分化

心臓分化のために、我々の胚様体（ＥＢ）ベースのプロトコールの改良版を使用した（Ｋａｔｔｍａｎら、２０１１年）。８０％～９０％コンフルエンスのｈＰＳＣ集団を単一細胞に解離させ（ＴｒｙｐＬＥ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、オービタルシェーカー上で１８時間、ペニシリン／ストレプトマイシン（１％、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、Ｌ－グルタミン（２ｍＭ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、トランスフェリン（１５０μｇ／ｍｌ、ＲＯＣＨＥ）、アスコルビン酸（５０μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ）、およびモノチオグリセロール（５０μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ）、ＲＯＣＫ阻害剤Ｙ－２７６３２（１０μΜ、ＴＯＣＲＩＳ）およびｒｈＢＭＰ４（１ｎｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ）を含有するＳｔｅｍＰｒｏ－３４培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）中で再凝集させてＥＢを形成させた。１日目に、指し示した濃度の上記添加物（－ＲＯＣＫ阻害剤Ｙ－２７６３２）ならびにｒｈＢＭＰ４、ｒｈアクチビンＡ（Ｒ＆Ｄ）およびｒｈｂＦＧＦ（５ｎｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ）を含むＳｔｅｍＰｒｏ－３４からなる中胚葉誘導培地にＥＢを移した。３日目に、ＥＢを回収し、ＩＭＤＭで洗浄し、ＳｔｅｍＰｒｏ－３４、ＷＮＴ阻害剤ＩＷＰ２（１μΜ、ＴＯＣＲＩＳ）およびｒｈＶＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍＬ、Ｒ＆Ｄ）からなる心臓中胚葉系列決定培地に移した。５日目に、さらに７日間ｒｈＶＥＧＦ（５ｎｇ／ｍｌ）を含むＳｔｅｍＰｒｏ－３４に、その後さらなる８日間、追加のサイトカインを含まないＳｔｅｍＰｒｏ－３４培地にＥＢを移した。２０日目に、ＨＥＳ３－ＮＫＸ２－５ｇｆｐ／ｗ由来の心筋細胞を解析し、ＮＫＸ２－５：ＧＦＰおよびＳＩＲＰａの発現ならびにＣＤ９０の欠如に基づいて単離した。非トランスジェニックｈＰＳＣ株から生成された心筋細胞を解析し、ＳＩＲＰａ＋ＣＤ９０－集団として単離した。培地を３日毎に交換した。培養物を最初の１２日間は低酸素環境中（５％のＣＯ_２、５％のＯ_２、９０％のＮ_２）、その後の８日間は正常酸素環境中で（５％のＣＯ_２）インキュベートした（計２０日）。懸濁培養を維持するために分化の全体を通じて超低接着６ウェルディッシュ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中でＥＢを培養した。

心房および心室誘導条件の最適化

最適な心房誘導条件を決定するために、アクチビンＡおよびＢＭＰ４濃度の選択は、２０日目にＣＴＮＴ＋ＭＬＣ２Ｖ－心筋細胞を生成する最も高い能力を示した４日目に最も高い割合のＡＬＤＨ＋ＣＤ２３５ａ－細胞を有する中胚葉集団の同定に基づいた。最適化後、心房心筋細胞の生成のための３～５日目の心臓中胚葉系列決定培地にＡＴＲＡ（０．５μΜ、Ｓｉｇｍａ）またはレチノール（２μΜ、Ｓｉｇｍａ）のいずれかを含めた。

最適な心室誘導条件を決定するために、アクチビンＡおよびＢＭＰ４濃度の選択は、高い割合のＣＤ２３５ａ＋細胞を含有し、ＡＬＤＨ＋細胞を含有せず、かつ高い割合のＣＴＮＴ＋ＭＬＣ２Ｖ＋を２０日目に生成した中胚葉集団の同定に基づいた。

フローサイトメトリーおよび細胞選別

２～６日目のＥＢを室温（ＲＴ）で２～４分間ＴｒｙｐＬＥを用いて解離させた。ハンクス緩衝液中の２型コラゲナーゼ（０．５ｍｇ／ｍｌ、Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）中、ＲＴで終夜インキュベーションした後、上記の通りにＴｒｙｐＬＥ処理することにより、２０日目のＥＢを解離させた。以下の抗体を染色のために使用した：抗ＰＤＧ－ＦＲａ－ＰＥ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、３：５０）、抗ＣＤ２３５ａ－ＡＰＣ（ＢＤ ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ、１：１００）、抗ＳＩＲＰａ－ＰｅＣｙ７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、１：１０００）、抗ＣＤ９０－ＡＰＣ（ＢＤ ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ、１：１０００）、抗ＣＴＮＴ心臓アイソフォーム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１：２０００）、または抗ミオシン軽鎖２（Ａｂｅａｍ、１：１０００）。非共役一次抗体について、以下の二次抗体を検出のために使用した：ヤギ抗マウスＩｇＧ－ＡＰＣ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ、１：２５０）、またはロバ抗ウサギＩｇＧ－ＰＥ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、１：２５０）。詳細な抗体情報を表２に記載する。

表２ 実験リソース

細胞表面マーカーの解析のために、５％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ）（Ｗｉｓｅｎｔ）および０．０２％のナトリウムアジドを含むＰＢＳからなるＦＡＣＳ緩衝液中４℃で３０分間細胞を染色した。細胞内染色のために、細胞を４℃で１５分間、ＰＢＳ中の４％のＰＦＡで固定した後、９０％のメタノールを使用して４℃で２０分間透過処理を行った。０．５％のＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）を含有するＰＢＳで細胞を洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液中の非共役一次抗体で終夜４℃で染色した。染色した細胞を０．５％のＢＳＡを含むＰＢＳで洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液中の二次抗体で１時間４℃で染色した。

染色した細胞をＬＳＲ ＩＩ Ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（ＢＤ）を使用して解析した。細胞選別のために、０．５％のＦＣＳを含むＩＭＤＭ中に染色した細胞を保ち、Ｓｉｃｋｉｄｓ／ＵＨＮフローサイトメトリー施設でＩｎｆｌｕｘ（ＢＤ）、ＦＡＣＳＡｒｉａｌｌ（ＢＤ）、ＭｏＦｌｏ－ＸＤＰ（ＢＤ）およびＦＡＣＳＡｒｉａ Ｆｕｓｉｏｎ（ＢＤ）を使用して選別した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ）を使用してデータを解析した。

ａｌｄｅｆｌｕｏｒアッセイ

製造者により提供された使用説明書にしたがってａｌｄｅｆｌｕｏｒ（商標）アッセイ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を行った。簡潔に述べれば、２～６日目のＥＢを上記の通りに解離させた。０．１％のＢＳＡおよびＢＡＡＡ基質（０．１２ｍｇ／ｍｌ）を含有するａｌｄｅｆｌｕｏｒアッセイ緩衝液中、３７℃で６０分間、２×１０６細胞／ｍｌの濃度で細胞を染色した。アルデヒドデヒドロゲナーゼ阻害剤ＤＥＡＢ（０．７５ｎＭ）を陰性対照試料に加えた。５％のＦＣＳを含むＩＭＤＭおよび１０％のａｌｄｅｆｌｕｏｒアッセイ緩衝液からなる冷培地で細胞を洗浄した。次に、冷却した洗浄培地中の上記に指し示す濃度の細胞表面マーカーへの抗体で追加の２０分間４℃で細胞を染色した。染色した細胞を上記の通りに解析した。解析の間、冷却した洗浄培地中に細胞を保った。細胞選別のために、ＦＣＳをＫｎｏｃｋＯｕｔＴＭ ｓｅｒｕｍ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）と置き換えて、細胞分化に対する血清含有サイトカインのあらゆる影響力を回避した。選別手順の全体を通じて、１０％のａｌｄｅｆｌｕｏｒアッセイ緩衝液を含有するＳｔｅｍＰｒｏ－３４中に細胞を維持した。選別した細胞を回収し、ＲＯＣＫ阻害剤（１０μΜ）、ＩＷＰ２（０．５μΜ）およびｒｈＶＥＧＦ（５ｎｇ／ｍｌ）を含有するＳｔｅｍＰｒｏ－３４中で再凝集させた。

免疫組織化学

２０日目のＥＢを上記の通りに解離させ、マトリゲル（２５％ｖ／ｖ、ＢＤ）を予めコーティングした１２ｍｍのカバーガラス（ＶＷＲ）に細胞をプレートした。細胞を３～５日間培養して、接着細胞の単層の形成を可能とした。

ＰＢＳ中の４％のＰＦＡで１０分間室温で細胞を固定し、０．３％のＴｒｉｔｏｎＸ、２００ｍＭのグリシン（Ｓｉｇｍａ）を含有するＰＢＳで２０分間ＲＴで透過処理した。１０％のＦＣＳ、０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ、および２％のＢＳＡを含有するＰＢＳで細胞をブロッキングした。以下の抗体を染色のために使用した：マウス抗ＣＴＮＴ心臓アイソフォーム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１：２００）、ウサギ抗ヒト／齧歯動物ミオシン軽鎖２（Ａｂｃａｍ、１：２００）、マウス抗ヒトＣＯＵＰＴＦ－ＩＩ（Ｒ＆Ｄ、１：１０００）、またはウサギ抗ヒトＣＴＮＴ（Ｇｅｎｗａｙ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．、１：１０００）。非共役一次抗体を検出するために、以下の二次抗体を使用した：ロバ抗マウスＩｇＧ－Ａ６４７（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、１：１０００）、またはロバ抗ウサギＩｇＧ－Ａ５５５（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、１：１０００）。詳細な抗体情報はＫｅｙ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ Ｔａｂｌｅに記載される。０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ、および０．１％のＢＳＡを含むＰＢＳからなる染色緩衝液中の一次抗体で４℃で終夜、細胞を染色した。染色した細胞をオービタルシェーカー上ＲＴで１５分間染色緩衝液で洗浄した。次に、細胞を染色緩衝液中の二次抗体で１時間ＲＴで染色した後、上記の通りに洗浄ステップを行った。ＳｌｏｗＦａｄｅ Ｇｏｌｄ Ａｎｔｉｆａｄｅ ｒｅａｇｅｎｔ ｗｉｔｈ ＤＡＰＩ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して試料をマウントした。染色した細胞をＯｌｙｍｐｕｓ ＦｌｕｏＶｉｅｗ １０００ Ｌａｓｅｒ Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｃｏｎｆｏｃａｌ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅを使用して解析した。画像取得のためにＦＶ１０－ＡＳＷソフトウェアを使用した。

定量的リアルタイムＰＣＲ

リボヌクレアーゼフリーのデオキシリボヌクレアーゼ処理を含むＲＮＡｑｕｅｏｕｓ－ｍｉｃｒｏ Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を使用してｈＰＳＣ由来の集団からトータルＲＮＡを単離した。ヒト胎児心臓の解剖した心室および心房組織からのＲＮＡをＴＲＩｚｏｌ法（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して単離し、デオキシリボヌクレアーゼ（Ａｍｂｉｏｎ）で処理した。オリゴ（ｄＴ）プライマーおよびランダム六量体およびＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ逆転写酵素（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して、１００ｎｇ～１ｍｇの単離したＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した。ＱｕａｎｔｉＦａｓｔ ＳＹＢＲ ＧＲＥＥＮ ＰＣＲキット（ＱＩＡＧＥＮ）を使用してＥＰ Ｒｅａｌ－ Ｐｌｅｘ ＭａｓｔｅｒＣｙｃｌｅｒ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）でＱＲＴ－ＰＣＲを行った。全ての実験は二連で調製し、ＰＣＲ反応の効率およびハウスキーピング遺伝子ＴＢＰに対する各遺伝子のコピー数を評価するために２５ｎｇ／ｍｌ～２．５ｐｇ／ｍｌに及ぶ超音波処理したヒトゲノムＤＮＡ標準物質の１０倍段階希釈を含んだ。ＭｕｌｔｉＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔ Ｖｉｅｗｅｒ（ＭｅＶ）オープンソースソフトウェアを使用して遺伝子発現データのヒートマップを生成した。

パッチクランプ

パッチクランプを使用する電気生理学的特徴付けのために、ＥＢを解離させ、上記の通りにＦＡＣＳによりＮＫＸ２－５＋ＳＩＲＰａ＋ＣＤ９０－心筋細胞を単離した。ＲＯＣＫ阻害剤（１０ｍＭ）を添加したＳｔｅｍＰｒｏ－３４培地中に単離した細胞を１．２５～５×１０５細胞／ｍｌで懸濁し、７０ｍｍのフィルターで濾過した。３０ｍｍディッシュ中のマトリゲル（１０％ｖ／ｖ）を予めコーティングしたガラスカバースリップ（３×５ｍｍ）にこの細胞懸濁液の４０ｕｌの滴を塗布した。細胞を４０ｍＬの体積で１６～１８時間インキュベートして細胞接着を促進させた。次に、ディッシュを２ｍｌのＳｔｅｍＰｒｏ－３４培地で満たした。培地は４日毎に交換した。プレーティングの７～１４日後に培養物をパッチクランプ記録のために使用した。それぞれ電流および電圧クランプモードで標準的なパッチクランプ技術を使用してＡＰおよび膜電流を測定した（Ａｘｏｐａｔｃｈ ２００Ｂ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）。電圧および電流を５ＫＨｚのサンプリング率で記録し（ＤｉｇｉＤａｔａ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）、ｐＣＬＡＭＰソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて解析した。ピペット溶液を満たした時に２～５ＭＵの先端抵抗を有するホウ珪酸ガラスの微小電極を使用した。直列抵抗はｒｖ７０％で補正した。以下の浴液（ｍＭ）を用いて全細胞破裂パッチ法を使用してＲＴでＡＰおよび膜電流を記録した：ＮａＣｌ １４０、ＫＣｌ ５．４、ＣａＣｌ２ １．２、ＭｇＣｌ２ １、グルコース １０、およびＨＥＰＥＳ １０（ｐＨ７．４、ＮａＯＨで調整）。ピペット溶液は以下からなるものであった（ｍＭ）：アスパラギン酸カリウム １２０、ＫＣｌ ２０、ＮａＣｌ ５、ＭｇＡＴＰ ５およびＨＥＰＥＳ １０（ｐＨ ７．２、ＫＯＨで調整）。

静止状態の心筋細胞において、ＡＰは、１Ｈｚの周波数で５～１５ｐＡの１～３ｍｓの長さの脱分極電流パルスにより誘発した。自律性および刺激性ＡＰは以下のパラメーターに基づいて分類した：ペースメーカー様：ｄｖ／ｄｔｍａｘ＜１０Ｖ／ｓ、心房様：ｄｖ／ｄｔｍａｘ Ｒ １０Ｖ／ｓおよびＡＰＤ３０／９０＜０．３、心室様：ｄｖ／ｄｔｍａｘ Ｒ １０Ｖ／ｓおよびＡＰＤ３０／９０ Ｒ ０．３。アセチルコリン活性化カリウム電流（ＩＫＡＣｈ）は、ＣＣｈ感受性電流（ＣＣｈにより活性化される）として特徴付けた。－４０ｍＶの保持電位から２０ｍＶ～－１２０ｍＶに及ぶ３５０ｍｓの電圧ランププロトコールに応答してカルバコール（ＣＣＨ、１０ｍＭ）の添加の前および後に電流を測定した（各々の元々の電流トレース中の電圧プロトコールの挿入を参照）。ＩＫＡＣｈは、ＣＣｈの存在下で記録した電流からＣＣｈなしで記録した電流を引くことにより定量化した。

定量化および統計解析

全てのデータは平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）として表す。指し示した試料サイズ（ｎ）は、独立した細胞培養複製物および個々の組織試料を含む生物学的複製物を表す。単一細胞データ（鼓動速度の定量化およびパッチクランプデータ）について、試料サイズ（ｎ）は、Ｒの３つの独立した実験から解析した細胞の数を表す。試料サイズを予め決定するために統計的方法を使用しなかった。実験の性質により、無作為化は行わず、研究者は盲検ではなかった。統計的有意性は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６ソフトウェアのＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定（対応のない両側）を使用することにより決定した。結果はｐ＜０．０５（＊／＃）で有意、ｐ＜０．０１（＊＊／＃＃）で非常に有意と考えた。全ての統計パラメーターを各々の図中および図のレジェンド中に報告する。

本発明の好ましい実施形態を本明細書に記載してきたが、本発明の精神または添付の特許請求の範囲から離れることなくそれに対して変形が為され得ることが当業者に理解されるであろう。以下の参照文献リスト中のものを含めて、本明細書に開示される全ての文献は、参照することにより組み込まれる。

Claims (1)

1. 明細書に記載の発明。

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