BR112019011550A2

BR112019011550A2 - geração de linhagens de cardiomiócitos atriais e ventriculares a partir de células-tronco pluripotentes humanas

Info

Publication number: BR112019011550A2
Application number: BR112019011550A
Authority: BR
Inventors: Keller Gordon; Hoon Lee Jee; Protze Stephanie
Original assignee: Univ Health Network
Priority date: 2016-12-04
Filing date: 2017-12-04
Publication date: 2019-10-15
Also published as: CN110268048A; AU2017369684A1; IL267012A; JP2022191357A; KR20230167143A; EP3548608A1; SG10202105977WA; JP7157742B2; WO2018098597A1; RU2019120696A; JP2020513244A; RU2019120696A3; EP3548608A4; KR20190091490A; MX2023003296A; US20190336537A1; CA3045182A1

Abstract

são divulgados métodos para a produção de populações de cardiomiócitos a partir de células-tronco pluripotentes. as populações podem ser enriquecidas para cardiomiócitos atriais ou ventriculares e a população ventricular resultante pode ser essencialmente livre de células marca-passo. o método inclui a incubação de células-tronco pluripotentes em um meio adequado com um componente bmp, e um componente de activina, em que as quantidades de activina podem ser variadas para enriquecer os cardiomiócitos atriais ou ventriculares. são divulgadas as populações enriquecidas, bem como os métodos de uso das mesmas, para tratar pacientes em necessidade de reparo cardíaco

Description

Relatório descritivo da patente de invenção para “GERAÇÃO DE LINHAGENS DE CARDIOMIÓCITOS ATRIAIS E VENTRICULARES A PARTIR DE CÉLULAS-TRONCO PLURIPOTENTES HUMANAS”

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS [0001] Este pedido reivindica prioridade de acordo com 35 U.S.C. §119 para Pedido Provisório dos Estados Unidos n. de Série 62/429.823, depositado em 4 de dezembro de 2016 e Pedido Provisório dos Estados Unidos n. de Série 62/430.815, depositado em 6 de dezembro de 2016. O conteúdo integral desses pedidos de patente depositados anteríormente está expressamente incorporado a este documento por referência, incluindo, sem limitação, cada relatório descritivo, reivindicações e resumo, bem como quaisquer figuras, tabelas e desenhos.

CAMPO DA INVENÇÃO [0002] A divulgação fornece métodos para produção e composições que compreendem populações enriquecidas de cardiomiócitos atriais, cardiomiócitos ventriculares e o uso das mesmas para tratamento terapêutico, modelagem de doenças, descoberta de drogas, bem como biomarcadores e métodos para identificar essas subpopulações enriquecidas.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO [0003] Os objetivos da pesquisa referente à doença cardíaca são entender, com mais detalhes, o que acontece na doença cardíaca e por qual motivo e encontrar maneiras de prevenir dano ou de reparar ou substituir o tecido cardíaco lesionado. As terapias existentes visam ao retardamento da progressão da insuficiência cardíaca em vez da restauração da função contrátil perdida. Atualmente, a única opção terapêutica disponível para substituir a função contrátil perdida é o transplante total do órgão, porém, em virtude de a demanda exceder bastante à oferta, houve considerável interesse nas terapias à base de célulatronco como uma abordagem alternativa. O uso particular seria a capacidade de utilizar cardiomiócitos diferenciados de células-tronco para transplante. Vários estudos demonstraram que o uso de células-tronco embrionárias humanas (hESC) derivada de cardiomiócitos, uma vez transplantada, pode re-muscularizar

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2/58 corações lesionados e mediar melhorias na função contrátil (vide, por exemplo, Shiba et al. (2012). No entanto, um dos desafios tem sido a natureza mista das populações de cardiomiócitos derivados de células-tronco, o que pode ser responsável por problemas como, por exemplo, taquiarritmias ventriculares relacionadas a enxerto. É necessária a capacidade de diferenciar ainda célulastronco para permitir a formação de populações enriquecidas de subtipos específicos de cardiomiócitos, tais como cardiomiócitos ventriculares e cardiomiócitos atriais e permitir que essas populações enriquecidas de cardiomiócitos sejam usadas para fins de tratamento.

SUMÁRIO [0004] Em um aspecto, é fornecido um método de produção de uma população de cardiomiócitos enriquecida por cardiomiócitos atriais, as etapas compreendendo: i. incubar células-tronco pluripotentes em um meio de indução do mesoderma, o referido meio de indução do mesoderma compreendendo pelo menos um componente BMP, opcionalmente BMP4, e uma quantidade eficaz de um componente de activina, opcionalmente Activina A, para gerar mesoderma atrial. Neste aspecto, o método compreende adicionar, ainda, um componente de ácido retinoico às células, a referida adição do ácido retinoico realizada durante a indução do mesoderma ou do estágio de especificação cardiovascular e cultivar as referidas células para que a população de cardiomiócitos enriquecida por cardiomiócitos atriais seja gerada.

[0005] Em um aspecto, esse mesoderma atrial pode ser caracterizado pelas referidas células sendo um ou mais dentre positivas para RALDH2, negativas para CD235 e negativas para CYP26A1. Em uma modalidade, o componente BMP em relação ao componente da activina é fornecido em uma razão de 3:2. Em outra modalidade, o componente de activina está presente em uma quantidade de cerca de 0,001 ng/ml a 6 ng/ml e o referido componente BMP está presente em uma quantidade de cerca de 3 ng/ml a cerca de 100 ng/ml.

[0006] Em um aspecto, é fornecido um método de produção de uma população de cardiomiócitos enriquecida por cardiomiócitos ventriculares, as etapas compreendendo: i. incubar células-tronco pluripotentes em um meio de

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3/58 indução do mesoderma compreendendo um componente BMP, opcionalmente BMP4, e uma quantidade eficaz de um componente de activina, opcionalmente Activina A, suficiente para gerar mesoderma ventricular e, posteriormente, cultivar as referidas células em meios adequados para gerar uma população de cardiomiócitos enriquecida por cardiomiócitos ventriculares. Em uma modalidade, a quantidade do componente de activina eficaz para gerar mesoderma ventricular é caracterizada pelo referido mesoderma ventricular sendo um ou mais dentre RALDH2 negativo, CD235a positivo e CYP26A1 positivo. Em outra modalidade, a concentração do componente de activina é maior que a concentração do componente BMP. Em uma modalidade, o componente de activina está presente em uma quantidade de cerca de 6 ng/ml a 20 ng/ml e o referido componente BMP está presente em uma quantidade de cerca de 3 ng/ml a cerca de 20 ng/ml.

[0007] Em um aspecto, é fornecida uma população de cardiomiócitos enriquecidos para cardiomiócitos ventriculares, em que a referida população é essencialmente livre de células marca-passo. Em outro aspecto, a população é desprovida de células marca-passo. Em outro aspecto, é fornecida uma população de cardiomiócitos: enriquecidos para cardiomiócitos ventriculares compreendendo pelo menos ou cerca de 50% de cardiomiócitos ventriculares, pelo menos ou cerca de 60% de cardiomiócitos ventriculares, pelo menos ou cerca de 70% de cardiomiócitos ventriculares, pelo menos ou cerca de 80% de cardiomiócitos ventriculares, pelo menos ou cerca de 90% de cardiomiócitos ventriculares, pelo menos ou cerca de 95% de cardiomiócitos ventriculares, pelo menos ou cerca de 99% de cardiomiócitos ventriculares, preferencialmente obtidos de acordo com o método descrito neste documento. Em um aspecto da invenção, a população isolada é essencialmente livre ou células marca-passo (menos de 5% das células totais). Em uma modalidade preferencial, a população inclui menos de 1% de células marca-passo, menos de 0,5% de células marcapasso, menos de 0,1%, menos de 0,01% de células marca-passo, menos de 0,001% de células marca-passo, 0,0001% de células marca-passo ou é completamente desprovida de células marca-passo. Não desejando se vincular a qualquer teoria, é postulado que a presença de células marca-passo pode induzir

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4/58 contração do músculo independente e separada quando introduzidas a um paciente. Em uma modalidade preferencial, as células marca-passo não são detectáveis na população isolada de cardiomiócitos ventriculares usando técnicas atualmente disponíveis.

[0008] Em outro aspecto, é fornecida uma população de cardiomiócitos enriquecidos para cardiomiócitos atriais compreendendo pelo menos ou cerca de 50% de cardiomiócitos atriais, pelo menos ou cerca de 60% de cardiomiócitos atriais, pelo menos ou cerca de 70% de cardiomiócitos atriais, pelo menos ou cerca de 80% de cardiomiócitos atriais ou pelo menos ou cerca de 90% de cardiomiócitos atriais ou pelo menos ou cerca de 95% de cardiomiócitos atriais ou pelo menos ou cerca de 99% de cardiomiócitos atriais, preferencialmente obtidos de acordo com o método descrito neste documento.

[0009] Em um aspecto, é fornecido um método de tratamento de um sujeito em necessidade de reparo cardíaco, tal como, por exemplo, um sujeito com insuficiência cardíaca ou um sujeito com risco de ter insuficiência cardíaca, compreendendo administrar ao sujeito a população de cardiomiócitos ventriculares descritos neste documento.

[0010] Em um aspecto, é fornecida a população de cardiomiócitos ventriculares descritos neste documento, para uso no tratamento de um sujeito em necessidade de reparo cardíaco, tal como, por exemplo, um sujeito com insuficiência cardíaca ou um sujeito com risco de ter insuficiência cardíaca.

[0011] Em um aspecto, é fornecido o uso da população de cardiomiócitos ventriculares descritos neste documento, no preparo de um medicamento para o tratamento de um sujeito em necessidade de reparo cardíaco, tal como, por exemplo, um sujeito com insuficiência cardíaca ou um sujeito com risco de ter insuficiência cardíaca.

[0012] Em um aspecto, é fornecido um processo para detectar mesoderma atrial em uma população de células, compreendendo detectar ALDH, preferencialmente RALDH2, em que a presença de ALDH, preferencialmente RALD2, é indicativa de mesoderma atrial.

[0013] Em um aspecto, é fornecido um processo para detectar mesoderma

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5/58 ventricular em uma população de células, compreendendo a detecção de um ou mais dentre CD235a, CD235b e CYP26A1, em que uma presença de CD235a, CD235b e/ou CYP26A1 é indicativa de mesoderma ventricular.

[0014] Outras características e vantagens da presente divulgação irão se tomar evidentes a partir da descrição detalhada a seguir. No entanto, deve ser entendido que a descrição detalhada e os exemplos específicos, enquanto indicam modalidades preferenciais da divulgação, são apresentados apenas a título de ilustração, uma vez que várias alterações e modificações na essência e âmbito da divulgação irão se tomar evidentes para os versados na técnica a partir desta descrição detalhada.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS [0015] Uma modalidade da presente divulgação será descrita, agora, em relação às figuras.

[0016] Figura 1. Sinalização de RA Promove Desenvolvimento de Cardiomiócito tipo Atrial. (A) Esquema do protocolo de diferenciação de cardiomiócito hPSC indicando estágios de desenvolvimento e períodos de adição de RA. (B e C) análise qRT-PCR da expressão dos níveis de (B) um gene pancardiomiócito e (C) genes ventricular-específicos (MYL2) e atrial-específicos (KCNJ3) em células NKX2-5⁺SIRPa⁺CD90’ isoladas de populações de EB do dia 20 induzidas com 10 ng/mL de BMP4 e 6 ng/mL de Activina A (10B/6A) e tratadas com RA nos pontos do tempo indicados (n = 3) e em controles de tecido fetal (n ~ 6) (teste t, *p < 0,05 e **p < 0,01 versus controle DMSO e ^#p < 0,01 F-V versus F-A). (D) Mapa de calor comparando os perfis de expressão gênica das células NKX2-5⁺SIRPa⁺CD90 isoladas de EBs do dia 20 (10B/6A induzidas) e tratadas com RA ou DMSO (controle) entre dias 3 e 5 (n = 5). Os valores representam log 10 dos níveis de expressão relativos ao gene de manutenção TBP. (E) Análises de citometria de fluxo representativas da proporção de células NKX2-5⁺/CTNT⁺ e MLC2V7CTNT⁺ nas populações de EB no dia 20 induzidas com 10B/6A e tratadas entre os dias 3 e 5 com RA ou DMSO (controle). (F) Gráfico de barras mostrando a proporção média de células MLC2V⁺CTNT⁺ em EBs no dia 20 tratadas como indicado (teste t, **p < 0.01 versus controle DMSO; n = 4). (G e H) Fotomícrografia

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6/58 mostrando a imunocoloração de (G) ML.C2V e (H) COUPTFII em EBs no dia 20 (10B/6A induzidas) tratadas com DMSO (controle) ou RA entre os dias 3 e 5. As células foram comarcadas com CTNT para identificar todos os cardiomiócitos e DAPI para visualizar todas as células. As barras em escala representam 10 mm. Para todas as análises de PCR, os valores de expressão foram normalizados quanto ao gene de manutenção TBP, As barras de erro representam SEM. F-V, tecido ventricular fetal; F-A, tecido atrial fetal. Vide também Figura 8.

[0017] Figura 2. Indução de ALDH⁺ Mesoderma Cardiogênico (A) Análises de citometria de fluxo representativa da atividade de ALDH em PDGFRalfa+mesoderma em EBs induzidas por 10B/6A. Células tratadas com inibidor de ALDH (DEAB) foram usadas como controle. (B e C) Análises de citometria de fluxo representativas da atividade de ALDH no dia 4 e da expressão de PDGRalfa (colunas da esquerda) e expressão de CTNT correspondente no dia 20 após manipulação (dias 1-3) de (B) concentrações de Activina A (0,110 ng/mL na presença de 10 ng/mL de BMP4 ou (C) concentrações de BMP4 (1-10 ng/mL na presença de 2 ng/mL de Activina A). (D) Análises de citometria de fluxo representativas da atividade de ALDH e da expressão de PDGFRalfa em EBs induzidas com 3B/2A. (E) Análises de qRT-PCR dos níveis de expressão de ALDH1A2 e CYP26A1 em populações de EB induzidas por 10B/6A e 3B/2A (teste t, *p < 0,05 e **p < 0,01 versus EBs induzidas por 10B/6A nos dias de diferenciação correspondentes; n ~ 4). Para todas as análises de PCR, os valores de expressão foram normalizados quanto ao gene de manutenção TBP. As barras de erro representam SEM. Vide também Figura 9.

[0018] Figura 3. Retinol especifica AF+mesoderma para um Destino Atrial (A) Esquema da estratégia usada para isolamento e análises do potencial cardiogênico das frações de ALDH⁺PDGFRa⁺ (fração I) e ALDH‘ PDGFRa* (fração II) isoladas de EBs do dia 4 induzidas com 3B/2A. (B) Gráfico de citometria de fluxo representativa mostrando a estratégia de classificação celular usada para isolar as frações de ALDH+ PDGFRa+ (fração I) e ALDH-PDGFRa+ (fração II). (C) Análises de qRT-PCR da expressão de ALDH1 A2 dentro das populações isoladas indicadas acima (teste t, **p < 0,01; n =3). (D e E) Análises de citometria

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7/58 de fluxo da proporção de (D) células CTNT+ e (E) MLC2V+ em populações no dia 20 geradas a partir de frações de ALDH+ PDGFRa+ e ALDH- PDGFRa+ no dia 4 tratadas com ROH-, RA- ou DMSO (controle) (teste t, *p < 0,05 e **p < 0,01 versus controle DMSO; n ~ 6). (F e G) Análise de qRT-PCR dos níveis de expressão de genes (F) ventriculares e (G) atriais em populações no dia 20 de grupos de tratamento indicados (n - 6) (teste t, *p< 0,05 e **p < 0,01 versus controle DMSO). Para todas as análises de PCR, os valores de expressão foram normalizados quanto ao gene de manutenção TBP. As barras de erro representam SEM. Inibição de WNTi, WNT; ROH, retinol. Vide também Figura 10.

[0019] Figura 4. Marcas de Expressão de CD235a Mesoderma com Potencial Ventricular (A) Análises de citometria de fluxo representativa da expressão de CD235a e da atividade de ALDH em EBs induzidas com 10B/6A (parte superior) ou 3B/2A (parte inferior). (B) Gráfico de citometria de fluxo representativa mostrando a estratégia de classificação celular usada para isolar frações de CD235a⁺ (fração Iii, potencial ventricular) e ALDH’ (fração IV, potencial atrial) de EBs induzidas por 5B/4A no dia 4. (C e D) Análises de citometria de fluxo da proporção de células (C) ΟΤΝΊΓ e (D) MLC2V⁺ em populações no dia 20 geradas de frações de ALDH⁴ e CD235a⁺ no dia 4 tratadas por 24 hr com ROH, RA ou DMSO (controle) (teste t, *p < 0,05 e **p < 0,01 versus controle DMSO e **p < 0.01 versus amostra indicada; n ~ 5). (E e F) Análises de qRT-PCR dos níveis de expressão de genes (E) ventriculares e (F) atriais em populações no dia 20 geradas de frações de ALDH⁴ e CD235a⁺ no dia 4 tratadas como indicado (n = 5) (teste t, *p < 0,05 e **p < 0,01 versus controle DMSO, ^#p < 0,05 e < 0,01 versus amostra indicada). Para todas as análises de PCR, os valores de expressão foram normalizados quanto ao gene de manutenção TBP. As barras de erro representam SEM. Vide também Figura 11.

[0020] Figura 5 Otimização da Indução de Mesoderma Cardiogênico de CD235a⁺ (A e B) Análise de citometria de fluxo representativa da atividade de ALDH no dia 4 e da expressão de CD235a (colunas da esquerda) e expressão de MLC2V e CTNT no dia 20 (colunas da direita) após manipulação (dias 1-3) de (A) concentrações de Activina A (2-20 ng/mL) na presença de 10 ng/mL de BMP4 ou

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8/58 (B) concentrações de BMP4 (3-20 ng/mL) na presença de 12 ng/mL de Activina A. (C) Gráficos de citometria de fluxo representativa mostrando a proporção da atividade de ALDH e da expressão de CD235a em EBs induzidas por 5B/12A (parte superior) e 3B/2A (parte inferior) no dia 4. (D e E) Análises de citometria de fluxo da proporção de (D) células CTNT+ e (E) MLC2V* em populações de EB no dia 20 de EBs induzidas por 5B/12A ou 3B/2A tratadas com ROH, RA ou DMSO (controle) por 48 hr (dias 3-5) (teste t, *p < 0,05 e **p < 0,01 versus controle DMSO; n - 4). (F e G) Análises de qRT-PCR dos níveis de expressão de genes (F) ventriculares e (GO atriais em populações de EB no dia 20 geradas com tratamento indicados (η ··· 4) (teste t, *p< 0,05 e **p < 0,01 versus controle DMSO). (H) Análises de citometria de fluxo representativa da proporção de células NKX25-CTNT+ em populações de EB no dia 20 induzidas com 5B/12A ou 3B/2A. (I) Quantificação das taxas de pulsação espontânea de EBs no dia 20 induzidas com 5B/12A ou 3B/2A (n = 17) (teste t, **p <0,01). (J) Gráfico de barras mostrando a proporção média de células NKX2-5-CTNT+ em populações de EB no dia 20 induzidas com 5B/12A, 10B/6A ou 3B/2A (dias 1-3) na presença ou ausência de RA (0,5 mM, dias 3-5) (teste t, *p < 0,05 versus amostra indicada; n = 5). Para todas as análises de PCR, os valores de expressão foram normalizados quanto ao gene de manutenção TBP. As barras de erro representam SEM. Vide também Figura 12.

[0021] Figura 6 Comparação de Cardiomiócitos Derivados de Populações de Mesoderma Diferentes (A e B) Análises de qRT-PCR dos níveis de expressão de genes (A) pan-cardiomiócitos e (B) ventriculares em células NKX25+SIRPa+CD90- Isoladas de EBs no dia 20 induzidas em condições de indução ventricular (VI), indução mista (Ml também referida como MM) e indução atrial (Al) (n = 5) e em controles de tecido fetal (n = 6) (teste t, *p < 0,05 e **p < 0,01 versus amostra indicada, ##p < 0,01 F-V versus F-A). (C) Análises de qRT-PCR dos níveis de expressão de genes atriais em células NKX2-5⁺SIRPa⁺CD90‘ isoladas de EBs não tratados ou tratados com RA no dia 20 (dias 3 -5) induzidas como indicado (n ··· 4) (teste t, *p < 0,05 e **p <0,01 VI versus VI + RA). (D) Fotomicrografia mostrando imunocoloração de COUPTFII em células NKX2

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5⁺SIRPa⁺CD90' isoladas de EBs no dia 20 induzidas com VI + RA ou Al + RA. As células foram comarcadas com CTNT para identificar todos os cardiomiócitos e com DAPI para visualizar todas as células. As barras em escala representam 100 mm. (E-G) Medições de AP em cardiomiócitos de NKX2-5⁺SIRPa*CD90’ isolados de EBs no dia 20 induzidas como indicado. (E) Registros representativos de APs espontâneos em cardiomiócitos individuais isolados dos grupos indicados. (F) Quantificação da duração de AO em repolarização de 30%/90% (APD30/90) em cardiomiócitos isolados de EBs de VI (n = 18), VI + RA (n ~ 18) e Al + RA (n = 20) (teste t, *p < 0,05 e **p < 0,01 versus amostra indicada). (G) Gráfico de barras mostrando a proporção de cardiomiócitos atriais (APD30/90 < 0,3), ventriculares (APD30/90 R 0,3) e imaturos (velocidade ascendente máxima [dv/dt_max] < 10 e duração do ciclo [CL] R 1) em cada grupo com base nas análises dos APs registrados. (H-J) Análise de densidades da corrente de potássio do retificador interno ativado por acetilcolina (Ikack) em cardiomiócitos isolados de EBs induzidas como indicado. (H) Registro representativo mostrando corrente sensível a carbacol (CCh) (Ikach) em um cardiomiócito isolado de EBs induzidas por Al + RA, quantificadas como a diferença entre a corrente medida após (CCh) e antes da aplicação (controle) de 10 mM de CCh (inserir: protocolo de voltagem). (I) Relação de corrente-voltagem para densidades de corrente de Ikack em cardiomiócitos ventriculares (forma de AP tipo ventricular validado) isolado de EBs VI em cardiomiócitos atriais (forma de AP tipo atrial validado) isolados de EBs VI + RA e Al + RA. (J) Quantificação de densidades de corrente de Ikacíi máximas registradas em -120 mV em cada grupo (teste t, *p <0,05 e **p < 0,01 versus amostra indicada). Para todas as análises de PCR, os valores de expressão foram normalizados quanto ao gene de manutenção TBP. As barras de erro representam SEM. F-V, tecido ventricular fetal; F-A, tecido atrial fetal; n.s., não significativo. Vide também Figura 13.

[0022] Figura 7. Geração de Cardiomiócitos Ventriculares e Atriais de outras Linhagens de hPSC (A) Análises de citometria de fluxo representativa da atividade de ALDH e da expressão de CDS235a em EBs derivadas de HES2 no dia 4 induzidas em condições ventriculares (5B/6A, parte superior) ou atriais

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10/58 (5B/2A, parte inferior). (B) Análises de citometria de fluxo representativa da expressão de CTNT e MLC2V em populações de EB no dia 20 correspondentes geradas em condições ventriculares ou atriais e sujeitas ao tratamento com ROH, RA ou DMSO (controle) dos dias 3 a 5. (C e D) Análises de qRT-PCR dos níveis de expressão de genes ventriculares (C) e atriais (D) em células SIRPa⁺CD90 isoladas de EBs no dia 20 induzidas em condições indicadas (teste t, *p < 0,05 versus controle DMSO, *p < 0,05 e **p < 0,01 versus amostra indicada; η = 5). (E) Análises de citometria de fluxo representativa da atividade de ALDH e da expressão de CD235a em EBs derivadas de MSC-IPS1 no dia 4 induzidas em condições ventriculares (4B/4A, parte superior) ou atriais (4B/1A = SB, parte inferior). (F) Análises de citometria de fluxo representativa da expressão de CTNT e MLC2V em populações de EB no dia 20 correspondentes geradas em condições ventriculares ou atriais e sujeitas ao tratamento com ROH, RA ou DMSO (controle) dos dias 3 a 5. (G e H) Análises de qRT-PCR dos níveis de expressão de genes ventriculares (G) e atriais (H) em células SIRPa+CD90- isoladas de EBs no dia 20 induzidas como indicado (teste t, *p < 0,05 e **p < 0,01 versus controle DMSO, ##p < 0,01 versus amostra indicada; η = 5). (I) Modelo de desenvolvimento de cardiomiócito atrial e ventricular humano de hPSCs. Neste modelo, as populações de mesoderma distintas definidas pela expressão de CD235a e CYP26A1 ou expressão de RALDH2 e atividade de ALDH são induzidas por concentrações diferentes de Activina A e BMP4, O mesoderma de RALDH2+ALDH+, mas não de CD235a+CYP26A1 pode responder a ROH para gerar cardiomiócitos do tipo atrial. RA pode especificar tanto as populações de mesoderma quanto o destino atrial. No entanto, a especificação do mesoderma de CD235a+ é menos eficiente do que a do mesoderma de RALDH2+ e o fenótipo atrial resultante é sub-ótimo. Na ausência de sinalização retinoide (ROH, RA), o mesoderma de RALDH2+ pode dar origem a cardiomiócitos ventriculares com baixa eficiência. Para todas as análises de PCR, os valores de expressão foram normalizados quanto ao gene de manutenção TBP. As barras de erro representam SEM. SB, SB-431542 (inibidor de Nodai/Activina A/TGF~b): inibição de WNTi, WNT. Vide também Figura 14.

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11/58 [0023] Figura 8. Relacionada à Figura 1. Geração de cardiomiócitos de tipo atrial de hPSCs. (A) Gráfico de citometria de fluxo representativa mostrando a estratégia de classificação celular usada para o isolamento de cardiomiócitos de SIRPalfa⁺NKX2-5⁺CD90‘ no dia 20 de diferenciação. (B-E) Gráficos da análise de QRT-PCR representados como um mapa de calor na Figura 1 D mostrando os níveis de expressão de: (B) pan-cardiomióclto, (C) cardiomiócito ventricular, (D) cardiomiócito atrial, (E) genes do canal de íon cardíaco e do canal da conexina em cardiomiócitos de SIRPalfa⁺NKX2-5⁺CD9Cr isolados de EBs induzidos com 10B/6A e tratados com RA ou DMSO (controle) entre os dias 3 e 5 de diferenciação (n=5). teste t: *P<0,05, **P<0,01 vs. controle DMSO, ^##P<0,01 F-V vs. F-A. (F) análises de QRT-PCR dos níveis de expressão de isoformas do receptor de ácido retinoico (RARA, RARB e RARG) em todas as populações de EB induzidas com 10B/6A nos dias de diferenciação indicados (n=3). (G) Análises de citometria de fluxo da proporção de células CTNT⁺ em EBs no dia 20 tratadas entre os dias 3-5 com DMSO (Controle), RA ou agonistas receptor-específicos (n=3). (H) Análises de QRT-PCR dos níveis de expressão do gene ventricularespecífico MYL2 em EBs no dia 20 tratadas entre os dias 3 e 5 com os tratamentos indicados (n=3), teste t: **P<0.01 vs. controle DMSO. Para todas as análises de PCR, os valores de expressão foram normalizados quanto ao gene de manutenção TBP. As barras de erro representam SEM. F-V: tecido ventricular fetal, F-A: tecido atrial fatal, RA: ácido retinoico, AM580: agonista de RARalfa, AC55649: agonista de RAR, CD437: agonista de RARy.

[0024] Figura 9. Relacionada à Figura 2. Cinética do desenvolvimento do mesoderma induzido por 10B/6A e 3B/2A. (A) Gráfico em barras mostrando o número médio de células gerado por poço de uma placa de 6 poços de EBs (dia 20) induzidas com 3B/2A e 10B/6A (n=5). (B) Análises de QRT-PCR da cinética da expressão de isoformas da aldeído desidrogenase ALDH1A1 e ALDH1A3 em EBs nos dias de diferenciação indicados após a indução (dias 1-3) com 3B/2A ou 10B/6A (n=3). (C) Análises de QRT-PCR da cinética da expressão do marcador T de risco primitivo (Brachyury) e marcador do mesoderma cardiogênico MESP1 em EBs nos dias de diferenciação indicados após a indução (dias 1-3) com 3B/2A ou

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10B/6A (n=4). Para todas as análises de PCR, os valores de expressão foram normalizados quanto ao gene de manutenção TBP. As barras de erro representam SEM.

[0025] Figura 10. Atividade de ALDH em populações de mesoderma induzidas por 3B/2A. Análises de citometria de fluxo representativa da atividade de ALDH após cultura de 24 horas como agregados de células ALDH⁺PDGFRalfa⁺(fração i) e ALDHPDGFRalfa⁺ (fração II) isolados de EBs no dia 4 induzidas com 3B/2A.

[0026] Figura 11. Análise da expressão de GYPA em populações de mesoderma classificadas e não classificadas. (A) Análises de QRT-PCR dos níveis de expressão de GYPA em EBs induzidas por 3B/2A e 10B/6A nos dias de diferenciação indicados, teste t: **P<0.01 vs. amostra indicada (n=4). (B) Análises de QRT-PCR dos níveis de expressão de ALDH1A2, CYP26A1 e GYPA em frações de ALDH⁺ (fração IV) e CD235a⁺ (fração III) isoladas de EBs no dia 4 induzidas com 5B/4A. Para todas as análises de PCR, os valores de expressão foram normalizados quanto ao gene de manutenção TBP, teste t: **P<0_?01 (n=3). As barras de erro representam SEM.

[0027] Figura 12. Otimização da diferenciação ventricular pela manipulação da indução do mesoderma.

[0028] (A e B) Análises de citometria de fluxo da proporção de células CD235a⁺ em EBs no dia 4 (à esquerda) e células CTNT⁺MLC2V⁺ resultantes em EBs no dia 20 (à direita) após a manipulação (dias 1-3) de: (A) Concentrações de Activina A (2-20 ng/ml) na presença de 10 ng/ml de BMP4 ou (B) concentrações de BMP4 (3-20 ng/ml) na presença de 12 ng/ml de Activina A (n=6). teste t: *P<0,05, **P<0,01 vs. amostra indicada (n=4). (C) Gráfico em barras mostrando o número médio de células gerado por poço de uma placa de 6 poços de EBs (dia 20) induzidas com 5B/12A ou 10B/6A (n=4). teste t: P>0,05 = n.s., não significativo, (D) Análises de citometria de fluxo da proporção de células CTNT⁺MLC2V⁺ no dia 20 e 40 da cultura nas populações de EB induzidas como indicado (n=3). teste t: P>0,05 = n.s., não significativo. As barras de erro representam SEM.

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13/58 [0029] Figura 13. Caracterização de cardiomiócitos atriais e ventriculares derivados de diferentes populações de mesoderma. (A) Análise de citometria de fluxo da proporção de células MLC2V⁺ em EBs no dia 20 induzidas em condições de indução ventricular (VI), indução mista (Ml) e indução atrial (Al), teste t: **p<0,01 vs. amostra indicada. (B) Fotomicrografía mostrando imunocoloração de MLC2V em populações de EB no dia 20 geradas de Al e VI. As células foram comarcadas com CTNT para identificar todos os cardiomiócitos e DAPI para visualizar todas as células. As barras em escala representam 100 pmm. (C e D) Análises de QRT-PCR dos níveis de expressão de genes (C) atriais e (D) marcapasso em células NKX2- 5⁺SIRPalfa⁺CD90' isoladas de populações de EB no dia 20 induzidas como indicado (n=4) e em controles de tecido fetal (n=6). teste t: *P<0,05, **P<0,01 VI vs. VI+RA; Al vs. AI+RA e vs. amostras indicadas,^#P<0.01 F-V vs. F-A. (E) Análises de citometria de fluxo da proporção de células NKX25⁺SIRPalfa⁺ em EBs no dia 20 induzidas em condições VI e Al e tratadas com as concentrações de RA indicadas (0,125-4μΜ) entre dias 3 e 5 (n=3). (F-H) Análises de QRT-PCR dos níveis de expressão de (F) gene atrial KCN5A (G) genes ventriculares MYL2, IRX4 e (H) genes atriais KCNJ3, CACNA1D e NR2F2 em células NKX2-5⁺SIRPalfa⁺CD90’ isoladas de populações do dia 20 diferentes, teste t: *P<0,05, **P<0,01 vs. amostra VI na respectiva concentração de RA (n~4). Para todas as análises de PCR, os valores de expressão foram normalizados quanto ao gene de manutenção TBP. As barras de erro representam SEM. F-V: tecido ventricular fetal; F-A: tecido atrial fetal; n.s.: não significativo.

[0030] Figura 14 Caracterização de cardiomiócitos atriais e ventriculares derivados de hPSCs de HES2 e MSC-IPS1. (A) Análise de citometria de fluxo representativa da atividade de ALDH e da expressão de CD235a em EBs derivadas de MSC-IPS1 induzidas com 4B/1A e, posteriormente, tratadas com ou sem SB-431542 (SB) (dias 3-5). (B-D) Análises de QRT-PCR dos níveis de expressão de (B) pan-cardiomióclto, (C) genes ventriculares e (D) genes atriais nas células SIRPalfa⁺CD90‘ isoladas de populações de EB derivadas de HES2 no dia 20 induzidas em condições ventriculares (5B/6A) ou atriais (5B/2A) (dias 1-3) e tratadas entre dias 3 e 5 com ROH, RA ou DMSO (Controle), teste t: *P<0,05,

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14/58 **P<0,01 vs. controle DMSO,^#P<0,05,^##P<0,01 vs, amostra indicada (n=5). (E-G) Análises de QRT-PCR dos níveis de expressão de (E) pan-cardiomiócito, (F) genes ventriculares e (G) genes atriais em células SIRPalfa⁺CD90‘ isoladas de RBs derivadas de MSC-ÍPS1 no dia 20 em condições ventriculares (4B/4A) ou atriais (4B/1A+SB) (dias 1-3) e tratadas entre dias 3 e 5 com ROH, RA ou DMSO (Controle), teste t: *P<0,05, **P<0,01 vs. controle DMSO,^##P<0,01 vs. amostra indicada (n=5). Para todas as análises de PCR, os valores de expressão foram normalizados quanto ao gene de manutenção TBP. As barras de erro representam SEM. SB: SB-431542 (inibidor de Nodal/Activina A/TGFp) [0031] Figura 15. Um esquema retratando as várias vias de diferenciação para células cardíacas.

DESCRIÇÃO DETALHADA [0032] Definições [0033] O termo cardiomiócitos ventriculares usado neste documento se refere a uma população de células enriquecida para células ventriculares ou enriquecida para células que tenham propriedades de ventriculócito. Estes incluem cardiomiócitos que expressam marcadores ventriculares específicos como MYL2, IRX4 e/ou níveis elevados de NKX2-5 e/ou apresentam propriedades eletrofísicas de uma célula ventricular (por exemplo, potencial de ação).

[0034] O termo cardiomiócitos atriais usado neste documento se refere a uma população de células enriquecida para células atriais ou enriquecida para células que tenham propriedades similares à célula atrial. Estas incluem cardiomiócitos que expressam marcadores atriais específicos como gene do canal de ion atrial KCNJ3, NPPA, GJA5 e/ou MYL7 e/ou apresentam propriedades eletrofísicas de uma célula atrial (por exemplo, potencial de ação).

[0035] Os termos células do mesoderma cardiovasculares e mesoderma cardiovascular usados neste documento se referem a uma população de células do mesoderma enriquecida para células do mesoderma com potencial aumentado para diferenciação em células cardiovasculares relativas a outras células do mesoderma.

[0036] Os termos células do mesoderma ventriculares e mesoderma

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15/58 ventricular usados neste documento se referem a uma população que compreende células do mesoderma enriquecidas para células do mesoderma com potencial aumentado para diferenciação em cardiomiócitos ventriculares relativos a outras células do mesoderma. Estas incluem células do mesoderma que são uma ou mais dentre ALDH-, RALDH2- CD235a*, CD235b+ e CYP26A1 +.

[0037] Os termos células do mesoderma atriais e mesoderma atrial usados neste documento se referem a uma população que compreende células do mesoderma enriquecidas para células do mesoderma com potencial aumentado para diferenciação em cardiomiócitos atriais relativos a outras células do mesoderma. Estas incluem células do mesoderma que são uma ou mais dentre ALDH+, RALDH2+, CD235a-, CD235b- e CYP26A1-.

[0038] O termo cardiomiócito usado neste documento é uma célula de linhagem cardíaca. Normalmente, as células de linhagem cardíaca expressam o marcador pan-cardíaco específico cTNT.

[0039] O termo célula marca-passo usado neste documento se refere a um cardiomiócito, que tem uma atividade de marca-passo e expressa marcadores célula-específicos nodais sinoatriais (SAN). Geralmente, as células marca-passo têm velocidade de batimento maior do que os cardiomiócitos ventriculares. As células marca-passo não expressam NKX2-5.

[0040] O termo NKX2-5 usado neste documento se refere a uma proteína homeobox cardíaca NKX2-5 codificada em humanas pelo gene NKX2-5. O gene é envolvido em diferenciação cardíaca e é expresso em subtipos de cardiomiócito como cardiomiócitos ventriculares. A expressão de NKX2-5 pode ser medida usando, por exemplo, um anticorpo específico para NKX2-5 ou, por exemplo, usando um construto repórter de NKX2-5.

[0041] O termo componente BMP usado neste documento se refere a qualquer molécula, opcionalmente qualquer BMP ou fator de crescimento e diferenciação (GDF) ou molécula pequena, que ativa o receptor para BMP4, incluindo, por exemplo, BMP4 e/ou BMP2.

[0042] O termo BMP4 (por exemplo, ID do Gene: 652) usado neste

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16/58 documento se refere à Proteína Óssea Morfogenética tipo 4, por exemplo, BMP4 humana, bem como conjugados ativos e/ou seus fragmentos, que podem, por exemplo, ativar a sinalização do receptor de BMP4.

[0043] O termo essencialmente livre de células marca-passo usado neste documento se refere a uma população de cardiomiócitos em que as células marca-passo compreendem menos de 5% das células totais, menos de 1% de células marca-passo, menos de 0,5% de células marca-passo, menos de 0,1% de células marca-passo, menos de 0,01% de células marca-passo, menos de 0,001% de células marca-passo, menos de 0,0001 % de células marca-passo, é completamente desprovida de células marca-passo ou em que as células marcapasso não são detectáveis na população de cardiomiócitos por meio de métodos de detecção atualmente disponíveis. Não desejando se vincular a qualquer teoria, é postulado que a presença de células marca-passo em uma população de células ventriculares pode induzir contração do músculo independente e separada quando introduzidas a um paciente.

[0044] O termo componente de activina usado neste documento se refere a um ou mais componentes ou a uma composição que compreende os referidos componentes, que ativa a transdução do sinal nodal, opcionalmente, que tem atividade da Activina A tal como Activina A e/ou nodal.

[0045] O termo activina ou ActA usado neste documento se refere à Activina A (por exemplo, ID do Gene: 3624), por exemplo, Activina A humana, bem como conjugados ativos e seus fragmentos ou moléculas pequenas, que podem ativar a transdução do sinal nodal.

[0046] O termo ácido retinoico ou RA significa ácido retinoico.

[0047] O termo componente do ácido retinoico inclui compostos que mediam a função da vitamina A e inclui, por exemplo, todos os RA trans (por exemplo, Sigma R2625), RA 9-cís (por exemplo, Sigma R4643) e retinol (por exemplo, Sigma R7632), bem como análogos do RA (por exemplo, antagonistas do RAR), tal como AM580, um agonista seletivo de RARalfa (Tocris 0760), AC55649, um agonista seletivo de RAR (Tocris 2436) e CD437, um agonista seletivo de RARv (Tocris 1549).

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17/58 [0048] O termo meio de corpo embrioide usado neste documento é um meio de cultura que suporta formação de agregados (por exemplo, agregados flutuantes de PSCs com potencial para se diferenciar em células de todas as três camadas germinativas) ou corpos embrioides de PSCs e compreende meios mínimos, tais como StemPro 34 (ThermoFisher), MesoFate™ (Stemgent), RPMI(ThermoFisher e outras empresas), meios HES (DMEM/F12 com Substituição Sérica por KnockOut, ThermoFisher e outras empresas) e, por exempio, um componente BMP, opcionalmente BMP4 e, compreendendo ainda, opcionalmente, um inibidor da proteína quinase associada a Rho (ROCK).

[0049] O termo fase de agregação do corpo embrioide usado neste documento se refere ao período de tempo em que hPSCs não-agregadas são cultivadas, por exemplo, com um meio de corpo embrioide descrito neste documento e são tratadas com componente BMP, bem como, opcionalmente, inibidor ROCK e/ou outros componentes que resultam em agregados, tais como corpos embrioides (por exemplo, agregados de PSCs que podem se diferenciar em células de todas as três camadas germinativas). Os tratamentos com o componente podem ser simultâneos, sobrepostos ou distintos. Por exemplo, um primeiro componente pode estar contido no meio e um segundo componente pode ser adicionado ao meio durante a fase de agregação do corpo embrioide.

[0050] O termo meio de indução do mesoderma pode incluir um meio de cultura que suporta a formação de células do mesoderma cardiovasculares e compreende meios mínimos tais como StemPro 34 (ThermoFisher), MesoFate™ (Stemgent), RPMI(ThermoFisher e outras empresas). O meio de indução do mesoderma pode incluir componentes adicionais, tais como componente BMP, opcionalmente BMP4, um componente da activina, opcionalmente Activina A, e pode incluir outros componentes, como bFGF. Dependendo do destino desejado das células cardiomiócitos produzidas do mesoderma, concentrações diferentes de cada componente BMP e componente de activina podem ser ajustadas, conforme ensinado neste documento.

[0051] O termo fase de indução do mesoderma pode descrever o período de tempo em que as PSCs são cultivadas com meio de indução do mesoderma,

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18/58 incluindo tratamento com componente BMP e um componente de activina, bem como, opcionalmente, um componente FGF e/ou outros componentes, tais como PSCs que se diferenciam em células do mesoderma. Os tratamentos com componente de BMP e activina podem ser simultâneos, sobrepostos ou distintos. Por exemplo, um primeiro componente pode ser incluído no meio no início da indução do mesoderma e um segundo componente pode ser adicionado ao meio durante a fase de indução do mesoderma.

[0052] O termo meio de indução cardíaca pode incluir um meio de cultura que suporta a indução de células progenitoras cardíacas de células do mesoderma, tais como, por exemplo, meios mínimos StemPro-34 compreendendo, por exemplo, um inibidor de WNT, opcionalmente, IWP2, VEGF e/ou opcionalmente inibidor de actívina/nodal, opcionalmente SB-431542. Dependendo do tipo de célula desejado, o meio de indução cardíaca também pode compreender um componente BMP, ácido retinoico, inibidor de FGF ou um componente FGF. Uma modalidade do meio de indução cardíaca (também denominado meio de indução cardíaca padrão) são os meios mínimos StemPro34 contendo 0,5 μΜ de IWP2,10 ng/ml de VEGF e, opcionalmente, 5,4 μΜ de SB431542. Outros meios mínimos que podem ser usados Incluem MesoFate™(Stemgent) e RPM! (ThermoFisher e outras empresas).

[0053] O termo fase de indução cardíaca pode ser usado para descrever o período de tempo em que as células do mesoderma são induzidas a se diferenciar em células progenitoras cardíacas quando cultivadas com meio de indução cardíaca e são tratadas, por exemplo, com componente BMP e RA, bem como, opcionalmente, um inibidor de FGF ou componente FGF e/ou outros componentes que resultam em células progenitoras cardiovasculares. Os tratamentos podem ser simultâneos, sobrepostos ou distintos. Por exemplo, um primeiro componente pode estar contido no meio e um segundo componente pode ser adicionado ao meio durante a fase de indução cardíaca.

[0054] O termo meio básico pode incluir um meio de cultura que suporta o crescimento de células progenitoras cardiovasculares e cardiomiócitos compreendendo meios mínimos tais como StemPro 34 (ThermoFisher),

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MesoFate™ (Stemgent), RPMI (ThermoFisher e outras empresas) e, por exemplo, VEGF. Um exemplo de meio básico é fornecido no Exemplo 1.

[0055] O termo fase básica pode ser usado para se referir ao período de tempo em que as células progenitoras cardiovasculares são cultivadas com meio básico e são tratadas com VEGF e/ou outros componentes que resultam em cardiomiócitos. Os tratamentos podem ser simultâneos, sobrepostos ou distintos.

[0056] O termo incubação pode incluir qualquer método in vitro de manutenção e/ou propagação de uma população de células, incluindo monocamada, grânulo, frasco ou culturas 3D, opcionalmente, onde as condições ambientais são controladas como uma incubadora e, opcionalmente, envolvendo passagem de células. Nas etapas que envolvem a incubação de células com um ou mais componentes, os componentes podem ser adicionados simultaneamente, em momentos diferentes, por períodos sobrepostos ou por períodos distintos. O fator pode ser adicionado ao meio depois de as células terem iniciado a incubação em, por exemplo, um meio de indução ou o fator pode ser adicionado ao meio antes do meio ser adicionado às células. Além disso, as células podem ser lavadas entre as incubações, por exemplo, para reduzir o nível de um componente de uma incubação anterior.

[0057] O termo cultivo pode incluir qualquer método in vitro de manutenção e/ou propagação de uma população de células, pelo menos por meio de uma divisão celular, incluindo monocamada, grânulo, frasco ou culturas 3D, opcionalmente, onde as condições ambientais são controladas como uma incubadora.

[0058] O termo enriquecido para usado neste documento significa que compreende pelo menos 50%, pelo menos 60% ou pelo menos 70%, até 100% do tipo de célula que é enriquecida. Em uma modalidade, o enriquecimento é medido em uma cultura no dia 20 usando um método descrito neste documento.

[0059] O termo sujeito usado neste documento inclui todos os membros do reino animal, inclusive mamíferos e, portanto, se refere aos humanos.

[0060] Os termos tratar, tratando”, tratamento, etc., conforme aplicados a uma célula, incluem a sujeição da célula a qualquer tipo de processo ou

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20/58 condição ou realização de qualquer tipo de manipulação ou procedimento na célula.

[0061] O termo tratamento usado neste documento, conforme aplicado a um sujeito, se refere a uma abordagem que visa à obtenção de resultados benéficos ou desejados, inclusive resultados clínicos, e inclui procedimentos médicos e aplicações que incluem intervenções farmacêuticas ou intervenções com outros produtos. Em uma modalidade, tratamento se refere à administração de um produto, para fins de enxerto. Os resultados clínicos benéficos ou desejados podem incluir, sem limitação, alívio ou melhora de um ou mais sintomas ou condições, diminuição da extensão da doença, estabilização do estado da doença (ou seja, sem piora), prevenção da propagação da doença, retardo ou desaceleração da progressão da doença, melhora ou paliação do estado da doença e remissão (parcial ou total), detectável ou não detectável. Tratamento também se refere ao prolongamento da sobrevida em comparação com a sobrevida esperada se não recebesse tratamento.

[0062] O termo insuficiência cardíaca usado neste documento se refere a uma condição em que o coração do sujeito não consegue bombear suficientemente para manter fluxo sanguíneo adequado no corpo do sujeito. Um sujeito com risco de ter insuficiência cardíaca se refere a um sujeito que tem uma ou mais características conhecidas que precedem a insuficiência cardíaca. Por exemplo, um sujeito com risco de ter insuficiência cardíaca pode ter ou ter tido doença arterial coronariana, infarto do miocárdio prévio (ataque cardíaco), pressão sanguínea alta, fibrilação atrial, doença valvar cardíaca, uso excessivo de álcool, tabagismo, obesidade, apneia do sono, infecção (viral e/ou bacteriana), cardiomiopatia, miocardite, defeitos cardíacos congênitos, arritmias e/ou doenças tais como, sem limitação, diabetes, hipertireoidismo, hipotireoídísmo, hemocromatose e/ou amiloidose.

[0063] Os termos infarto do miocárdio e Ml usados neste documento se referem a um evento em que o fluxo sanguíneo diminui ou para de ir para uma parte do coração causando, assim, morte dos cardiomiócitos, em virtude da falta de oxigenação (isquemia) resultando em danos ao músculo cardíaco.

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21/58 [0064] Os termos administrar, introduzir e transplantar usados neste documento são usados de maneira intercambiável no contexto de distribuição de células para um sujeito, por um método ou via que resulte em uma localização pelo menos parcial das células introduzidas em um local desejado.

[0065] O termo célula-tronco pluripotente ou PSC usado neste documento se refere a uma célula com a capacidade, em condições diferentes, de se diferenciar em qualquer um dos tipos de células característicos das três camadas celulares germinativas e inclui células-tronco embrionárias e célulastronco pluripotentes induzidas. As células pluripotentes são caracterizadas pela sua capacidade de se diferenciar em mais de um tipo de célula usando, por exemplo, um ensaio de formação de teratoma de camundongo nude. A pluripotência é demonstrada também pela expressão de marcadores de célulastronco (ES) embrionárias. Neste documento, as células-tronco pluripotentes podem incluir células-tronco pluripotentes induzidas (IPSC) e células-tronco embrionárias (ESC).

[0066] Em uma modalidade, o termo células-tronco embrionárias exclui as células-tronco que envolvem destruição de um embrião, tal como um embrião humano.

[0067] Neste documento, os termos IPSC e célula-tronco pluripotente induzida são usados de maneira intercambiável e se refere a uma célula-tronco pluripotente artificial mente derivada (por exemplo, induzida ou por reversão completa) de uma célula não-pluripotente, normalmente, uma célula somática adulta, por exemplo, pela indução da expressão de um ou mais genes (Incluindo, por exemplo, POU4F1/OCT4 (ID do Gene: 5460) em combinação, mas sem restrição a SOX2 (ID do Gene: 6657), KLF4 (ID do Gene: 9314), cMYC (ID do Gene: 4609), NANOG (ID do Gene: 79923), LIN28/LIN28A (ID do Gene: 79727)).

[0068] Os cardiomiócitos preparados, enriquecidos ou isolados por um método da invenção são derivados de células-tronco pluripotentes. Por exemplo, as células de um paciente podem ser geneticamente modificadas antes do uso pela introdução de genes que podem controlar seu estado de diferenciação antes, durante ou após sua exposição a fatores de diferenciação descritos neste

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22/58 documento. As células-tronco pluripotentes adequadas para uso em métodos descritos neste documento, que são derivadas do tecido do próprio paciente, potencializam a compatibilidade de enxertos de tecido diferenciados derivados de células-tronco com o paciente.

[0069] O termo célula-tronco embrionária é usado para se referir a células-tronco pluripotentes da massa celular interna de blastócitos embrionários (vide, por exemplo, Pat. US n. 5,843,780,6,200,806). Tais células também podem ser obtidas da massa celular interna de blastócitos derivados da transferência nuclear de célula somática (vide, por exemplo, Pat. US n. 5,945,577, 5,994,619, 6,235,970). As características distintas de uma célula-tronco embrionária definem um fenótipo da célula-tronco embrionária. Assim, uma célula tem o fenótipo de uma célula-tronco embrionária se ela possui uma ou mais das características singulares de uma célula-tronco embrionária, tal como aquelas que podem distinguir uma célula de outras células. Características distintas exemplificativas da célula-tronco embrionária incluem, sem limitação, perfil de expressão gênica, capacidade proliferative, capacidade de diferenciação, capacidade de resposta a condições de cultura específicas e similares.

[0070] As células-tronco pluripotentes, conforme usado neste documento, também podem ser geneticamente modificadas pela introdução de vetores que expressam um marcador selecionável sob controle de um promotor específico da célula-tronco, tal como Oct-4, ou de genes que podem ser regulados positivamente para induzir diferenciação do cardiomiócito. As células-tronco podem ser geneticamente modificadas em qualquer estágio com marcadores ou genes de modo que os marcadores ou genes sejam carregados por qualquer estágio da cultura. Os marcadores podem ser usados para purificar ou enriquecer as populações de célula-tronco diferenciada e não diferenciada em qualquer estágio de cultura.

[0071] O termo carteador farmaceuticamente aceitável usado neste documento inclui composições essencialmente e quimicamente inertes e atóxicas que não interferem na eficácia da atividade biológica da composição farmacêutica. Exemplos de carteadores farmacêuticos incluem, sem limitação, água, soluções

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23/58 salinas, soluções de glicerol, etanol, N-(1(2,3-dioleilóxi)propil, cloreto de Ν,Ν,Νtrimetilamônio (DOTMA), diolesifosfotidil-etanolamina (DOPE) e lipossomas. Tais composições devem conter uma quantidade terapeuticamente eficaz de compostos, juntamente com uma quantidade adequada de carreador de modo a fornecer a forma para administração direta para o sujeito.

[0072] No entendimento do âmbito da presente divulgação, o termo concentração usado neste documento se refere a uma concentração final de uma substância, tal como, por exemplo, BMP4, Activina A, ácido retinoico em um meio. Salvo se indicado em contrário, a concentração se baseia em uma razão peso/volume.

[0073] Os termos de grau como substancialmente, cerca de e aproximadamente” usados neste documento se referem a uma quantidade de desvio razoável do termo modificado, de modo que o resultado final não seja significativamente alterado. Os termos de grau devem ser interpretados como a inclusão de um desvio de pelo menos ±5% do termo modificado, se esse desvio não negar o significado da palavra que ele modifica.

[0074] A menção de intervalos numéricos por pontos de extremidade neste documento inclui todos os números e frações incluídos em tal intervalo (por exemplo, 1 a 5 inclui 1,1,5,2, 2,75, 3,3,90,4 e 5). Entende-se também que todos os números e suas frações sejam supostamente modificados pelo termo cerca de. Além disso, entende-se que um, uma e a/o inclui referentes plurais, salvo se o contexto expressar claramente o contrário. O termo cerca de se refere a mais ou menos 0,1 a 50%, 5-50% ou 10-40%, preferencial mente 10-20%, mais preferencial mente 10% ou 15% do número ao qual se faz referência.

[0075] Além disso, as definições e modalidades descritas nas seções particulares se destinam a serem aplicáveis a outras modalidades descritas neste documento em relação às quais elas sejam adequadas, uma vez que seriam entendidas pelos versados na técnica. Por exemplo, nas seguintes passagens, diferentes aspectos da invenção são definidos com mais detalhes. Cada aspecto então definido pode ser combinado com outro aspecto ou aspectos, salvo se claramente indicado o contrário. Em particular, qualquer característica indicada

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24/58 como sendo preferencial ou vantajosa pode ser combinada com qualquer outra característica ou características indicadas como sendo preferenciais ou vantajosas.

[0076] Aspectos e Modalidades [0077] Em um aspecto, é fornecido um método de produção de uma população de cardiomiócitos enriquecidos para cardiomiócitos atriais, as etapas compreendendo: i. incubar células-tronco pluripotentes em um meio adequado para gerar agregados e/ou corpos embrioides, li. incubar ainda as células-tronco em um meio adequado para indução do mesoderma, em que o referido meio inclui pelo menos um componente BMP, opcionalmente BMP4, e um componente de activina, opcionalmente Activina A, em que a razão entre o componente BMP e o componente de activina é fornecida como 3:2, iii. adicionar ainda um componente de ácido retinoico às células, a referida adição de ácido retinoico realizada durante a indução de mesoderma ou estágio de especificação cardiovascular; iv. O crescimento contínuo das referidas células em meios adequados para gerar uma população de cardiomiócitos, em que a referida população de cardiomiócitos é enriquecida para cardiomiócitos atriais. Em algumas modalidades, a razão entre BMP e activina é 1,5:1,0 (ou 3:2).

[0078] Em algumas modalidades, o referido componente BMP é BMP4, o componente de activina é a Activina A, a concentração de BMP4 é 3ng/ml e a concentração de Activina A é 2 ng/ml. Em algumas modalidades, o referido componente de ácido retinoico é ácido trans-retinoico e é adicionado em uma concentração entre 50 nm e 5 μΜ. Em algumas modalidades, o referido componente de ácido retinoico é adicionado em uma concentração de 500 nM.

[0079] Em algumas modalidades, o componente BMP e o componente de Activina são adicionados no dia 1 do processo. Em algumas modalidades, o componente de ácido retinoico é adicionado no dia 3 do processo. Em algumas modalidades, o componente BMP adicional não é adicionado ao meio no dia 3 do processo.

[0080] Em algumas modalidades, o inibidor de FGF é excluído do meio no dia 3 do processo. Em algumas modalidades, as células produzidas pelo processo

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25/58 são utilizadas em um ensaio in vitro para triar quanto à toxicidade cardíaca que pode ser causada por compostos terapêuticos potenciais.

[0081] Em outro aspecto, é fornecida uma população de cardiomiócitos enriquecidos para cardiomiócitos atriais compreendendo pelo menos ou cerca de 50% de cardiomiócitos atriais, pelo menos ou cerca de 60% de cardiomiócitos atriais, pelo menos ou cerca de 70% de cardiomiócitos atriais, pelo menos ou cerca de 80% de cardiomiócitos atriais ou pelo menos ou cerca de 90% de cardiomiócitos atriais, preferencialmente obtidos de acordo com o método descrito neste documento. Em um aspecto, é fornecido um método de produção de uma população de cardiomiócitos enriquecida para cardiomiócitos ventriculares, as etapas compreendendo: i. incubar células-tronco pluripotentes em um meio adequado para gerar agregados (corpos embrioides), II. incubar as células-tronco agregadas em um meio adequado para indução do mesoderma, em que o referido meio inclui pelo menos um componente BMP, opcionalmente BMP4, e um componente de activina, opcionalmente Activina A, em que a concentração do componente de activina é maior do que a concentração do componente BMP; ill. obter crescimento contínuo das referidas células em meios adequados para gerar uma população de cardiomiócitos, em que a referida população de cardiomiócitos é enriquecida para cardiomiócitos ventriculares. Em algumas modalidades, essa razão entre BMP e activina é cerca de 0,3:1,0, cerca de 0,5:1,0 (ou 1:2) ou cerca de 0,8: 1,0.

[0082] Em algumas modalidades, a concentração do componente BMP e/ou do componente de Activina é determinada pela medição para o nível de CD235a e comparação deste com o nível de RALDH2.

[0083] Em algumas modalidades, a concentração do componente de Activina é escolhida com base na concentração que resulta preferencialmente em mais células de mesoderma expressoras de CD235a, em comparação a células expressoras de RALDH2, e o componente BMP é adicionado para obter uma concentração inferior à concentração do componente de Activina. Em algumas modalidades, o componente BMP é adicionado para obter cardiogênese ideal do mesoderma induzido.

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26/58 [0084] Em algumas modalidades, o referido componente BMP é BMP4, o componente de activina é a Activina A, a concentração de BMP4 é entre 3-20 ng/ml, a concentração de Activina A é entre 4-20 ng/ml e a concentração de Activina A é maior do que a concentração de BMP4. Em algumas modalidades, a concentração de BMP4 é 10ng/ml e a concentração de Activina A é 12ng/ml.

[0085] Em outro aspecto, é fornecida uma população de cardiomiócitos isolada: enriquecida para cardiomiócitos ventrículares compreendendo pelo menos ou cerca de 30% de cardiomiócitos ventrículares, pelo menos ou cerca de 40% de cardiomiócitos ventrículares, pelo menos ou cerca de 50% de cardiomiócitos ventrículares, pelo menos ou cerca de 60% de cardiomiócitos ventrículares, pelo menos ou cerca de 70% de cardiomiócitos ventrículares, pelo menos ou cerca de 80% de cardiomiócitos ventrículares ou pelo menos ou cerca de 90% de cardiomiócitos ventrículares, preferencialmente obtidos de acordo com o método descrito neste documento. Em uma modalidade, a população isolada de cardiomiócitos enriquecidos para cardiomiócitos ventrículares é essencialmente livre de células marca-passo. Em uma modalidade preferencial, a população isolada de cardiomiócitos enriquecidos para cardiomiócitos ventrículares é desprovida de células marca-passo.

[0086] Uma população de cardiomiócitos isolada, de acordo com a invenção, pode ser usada em um método para triagem quanto à toxicidade cardíaca potencial de agentes ativos terapêuticos potenciais para uso no tratamento de distúrbios cardiovasculares e outros distúrbios. Por exemplo, eles fornecem uma fonte de células que pode ser usada em triagens de drogas quanto a aplicações cardiovasculares; eles fornecem uma fonte de células que pode ser usada para fins terapêuticos - para restaurar a função cardíaca; para reparar o coração isquêmico e/ou para regenerar a vasculatura coronária; eles podem ser usados para manipulação de tecido onde são necessários componentes do coração ou da vasculatura coronária; e eles podem servir como uma ferramenta de pesquisa para o estudo do desenvolvimento e de doenças cardiovasculares. Uma população de cardiomiócitos isolada usada para a triagem de agentes ativos, de acordo com os métodos da invenção, pode, por exemplo, incluir populações

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27/58 de cardiomiócitos enriquecidos para cardiomiócitos ventriculares. Tais populações de cardiomiócito ventricular incluem, opcionalmente, populações que são essencialmente livres de células marca-passo ou desprovidas de células marcapasso. Uma população de cardiomiócitos isolada usada para triar agentes ativos, de acordo com os métodos da invenção, pode incluir também uma população enriquecida para cardiomiócitos atriais. Tais métodos para triagem ou avaliação da toxicidade cardíaca potencial de um composto ou agente de teste envolvem a exposição de uma população de cardiomiócitos, de acordo com a presente invenção, a um composto a ser testado quanto à cardiotoxicidade. Os efeitos para avaliar incluem mudanças na viabilidade, contratilidade, potenciais elétricos de membrana e/ou outras funcionalidades das células.

[0087] [0088] As populações de cardiomiócito e de célula progenitora de cardiomiócito produzidas usando métodos da invenção que podem ser usados para transplante, terapia celular e terapia gênica. Por exemplo, a invenção fornece células diferenciadas produzidas usando métodos da invenção que podem ser usados para fins terapêuticos, tal como em métodos de tratamento de um sujeito em necessidade de reparo cardíaco. Por exemplo, o reparo terapêutico pode envolver restauração, total ou parcial, da função cardíaca em um sujeito em necessidade de reparo cardíaco, tal como um sujeito que sofre de uma doença ou condição do coração.

[0089] Outro aspecto da invenção é um método de tratamento ou prevenção de uma doença ou condição cardíaca. Normalmente, a doença cardíaca está associada à diminuição da função cardíaca e inclui condições como, sem limitação, infarto do miocárdio, hipertrofia cardíaca e arritmia cardíaca. Neste aspecto da invenção, o método inclui introduzir, em um sujeito em necessidade de reparo cardíaco, células de cardiomiócito ventricular diferenciado isolado da invenção e/ou células capazes de se diferenciar em células de cardiomiócito ventricular. As células de cardiomiócito isoladas podem ser transplantadas em um tecido cardíaco danificado de um sujeito. Idealmente, o método resulta na restauração de alguma ou de toda a função cardíaca em um paciente.

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28/58 [0090] Em um aspecto, é fornecido um método de tratamento de um sujeito com insuficiência cardíaca, compreendendo administrarao sujeito a população de cardiomiócitos ventriculares descritos neste documento. Em algumas modalidades, o referido sujeito está sofrendo de um infarto do miocárdio. Em algumas modalidades, o infarto do miocárdio ocorre no ventrículo do paciente e a população é conforme descrita neste documento.

[0091] Em um aspecto, é fornecida a população de cardiomiócitos ventriculares descritos neste documento, para uso no tratamento de um sujeito com insuficiência cardíaca ou com risco de ter insuficiência cardíaca. Em um aspecto, é fornecido o uso da população de cardiomiócitos ventriculares descritos neste documento, no preparo de um medicamento para o tratamento de um sujeito com insuficiência cardíaca ou com risco de ter insuficiência cardíaca.

[0092] Ainda em outro aspecto da invenção, é fornecido um método de reparo do tecido cardíaco, o método incluindo introduzir um cardiomiócito ventricular isolado ou célula progenitora cardíaca da invenção e/ou célula capaz de se diferenciar em uma célula de cardiomiócito ventricular quando tratada usando um método da invenção no tecido cardíaco danificado de um paciente.

[0093] O paciente pode sofrer de uma doença ou condição cardíaca. No método de reparo do tecido cardíaco da presente invenção, a célula do cardiomiócito isolado pode ser transplantada no tecido cardíaco danificado de um paciente. Idealmente, o método resulta na restauração de pelo menos alguma função cardíaca em um paciente.

[0094] Em uma modalidade, os cardiomiócitos ventriculares divulgados neste documento são administrados a um sujeito durante a fase aguda após infarto do miocárdio ou durante estágio crônico de insuficiência cardíaca. As células são administradas no local do dano no ventrículo por injeção direta ou distribuição à base de cateter. As células podem ser formuladas juntamente com carreadores farmaceuticamente aceitáveis, hidrogéis ou estruturas em andaime (scaffolds), por exemplo, para auxiliar na colocação, sobrevida e/ou enxerto das células no tecido. Os intervalos de dosagem de células podem incluir, por exemplo, de cerca de 0,5 bilhão a 2 bilhões de células por dose. As células podem

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29/58 ser administradas ao sujeito em doses únicas ou múltiplas, em um ou mais pontos de tempo a fim de tratar o sujeito.

[0095] A presente invenção fornece preferencialmente um modelo de miocárdio para testar a capacidade de células-tronco que se diferenciaram em cardiomiócitos ou progenitores cardíacos usando os métodos da invenção para restaurar a função cardíaca. A fim de testar a eficácia do transplante de cardiomiócitos In vivo, é importante ter um modelo animal reprodutível com um parâmetro mensurável de função cardíaca. Os parâmetros usados devem distinguir claramente os animais de controle e experimentais [vide, por exemplo, em Palmen et. al. (2001), Cardiovasc. Res. 50, 516-524] de modo que os efeitos do transplante possam ser determinados adequadamente. As relações de PV são uma medida da capacidade de bombeamento do coração e podem ser usadas como leituras de função cardíaca alterada após o transplante.

[0096] Em um aspecto, é fornecido um processo para detectar mesoderma atria! em uma população de células, compreendendo a detecção de RALDH2, em que uma presença de RALDH2 é indicativa de mesoderma atrial. Em um aspecto, é fornecido um processo para detectar mesoderma ventricular em uma população de células, compreendendo a detecção de CD235a e/ou CYP26A1, em que uma presença de CD235a e/ou CYP26A1 é indicativa de mesoderma ventricular.

[0097] São fornecidos os métodos da invenção para a identificação de mesoderma atrial ou ventricular com base na expressão de ALDH, preferencial mente RALDH2, e/ou CD235a e/ou CD235b, e/ou CYP26A1, respectivamente. Mais particularmente, eles podem ser usados para a identificação de fatores secretados produzidos pela célula do mesoderma que influencia a proliferação, sobrevida, função e diferenciação de cardiomiócitos de populações celulares atrial ou ventriculares. Por exemplo, os métodos da invenção para a identificação de populações de cardiomiócitos atriais ou ventriculares fornecem sistemas para entender a diferenciação do mesoderma atrial e ventricular em nível molecular e para identificar novos alvos de drogas (por exemplo, vias de sinalização) que modulem a diferenciação.

[0098] De acordo com uma ou mais modalidades divulgadas neste

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30/58 documento, o ácido retinoico (RA) especifica cardiomiócitos atriais dentro de uma janela de tempo de desenvolvimento específica e a aplicação de RA ao mesoderma a partir dos dias 3-5 especifica cardiomiócitos atriais. Intervalo de concentração de RA: 50nM - 5uM, Fontes de RA: RA all-trans, agonistas do receptor retinoico (RAR) (AM580 para - alfa, AC55649 para -β, CD437 para -γ). Concentrações do agonista: 3~300nM para AM580; 0,025-2,5uM AC55649; 0,055uM CD437.

[0099] RALDH2 (Retinaldesidrogenase, ou Aldefluor) é um marcador para mesoderma atrial. A proporção de células RALDH2⁺ é monitorada pelo uso do ensaio aldefluor para otimização da diferenciação atrial. Dias de análise: dias 2-6.

[0100] As induções de mesoderma precoces usando Activina A e BMP4 no dia 1 determinam a proporção de células de mesoderma RALDH2⁺ no dia 4. Condições de indução são baixo teor de BMP (1-5 ng/ml BMP) e baixo teor de Activina A (0,1-4 ng/ml), mais comumente usado 3ng/ml de BMP/2ng/ml de Activina A (3B/2A).

[0101] Afuncionalidade de RALDH2 é mostrada pelo tratamento com retinol (ROH) nos dias 3-5, que é suficiente para induzir um fenótipo atrial. (O retinol é convertido por RALDH2 em RA, o RA especifica, então, o fenótipo atrial). A glicoforina A (CD235a) é um marcador para mesoderma ventricular. CD235a é expresso exclusivamente no mesoderma ventricular e ausente no mesoderma atrial RALDH2L As células CD235a⁺ não expressam RALDH2. As células CD235a⁺ expressam CYP26A1, uma enzima que degrada RA, para antagonizar a sinalização de RA e garantir o estabelecimento de um fenótipo ventricular. Dias de análise: dias 2-6.

[0102] As induções de mesoderma precoces usando Activina A e BMP4 no dia 1 determinam a proporção de células de mesoderma CD235a⁺ no dia 4. Condições de indução são alto teor de BMP (5-20 ng/ml BMP) e alto teor de Activina A (6-20 ng/ml), mais comumente usado 10ng/ml de BMP/12ng/ml de Activina A (10B/12A). O tratamento das células CD235a⁺ com retinol (ROH) nos dias 3-5 NÃO é suficiente para induzir um fenótipo atrial. (Essas células não são capazes de converter retinol em RA, portanto, as células se desenvolvem em um

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31/58 fenótipo ventricular). As células CD235a⁺ dão origem a populações altamente enriquecidas em cardiomiócitos ventriculares MLC2V⁺.

[0103] Os cardiomiócitos ventriculares e atriais são derivados de duas subpopulações mesodérmicas distintas. A diferenciação ventricular é monitorada pela emergência de células CD235a+ no dia 4 e células MLC2V7 CTNT⁺ no dia 20. A diferenciação atrial é monitorada pela emergência de células AF+ no dia 4 e células MLC2V7CTNT⁺ no dia 20. A população no dia 20 derivada do mesoderma ventricular (10B/12A) contém uma proporção mais alta de cardiomiócitos ventriculares MLC2v⁺ do que aquela derivada do mesoderma atrial (3B/2A).

[0104] As análises de expressão gênica e uma análise de patch clamp de célula única mostraram que a população no dia 20 gerada pelo tratamento com RA a partir do mesoderma atrial (3B/2A+RA) contém uma proporção mais alta de cardiomiócitos atriais do que a população no dia 20 gerada pelo tratamento com RA a partir do mesoderma ventricular (10B/12A+RA).

[0105] As subpopulações de mesoderma adequadas necessitaram ser especificadas para enriquecer para os subtipos de cardiomiócitos desejados. Protocolo melhorado para a especificação de cardiomiócitos ventriculares para a terapia de reposição celular após infarto do miocárdio. O mesoderma ventricular CD235a⁺ (10B/12A) dá origem a populações altamente enriquecidas para cardiomiócitos ventriculares MLC2v⁺ desprovidos de células marca-passo. Isto resulta em taxas de batimento espontâneo mais baixas em comparação a outras populações de cardiomiócitos heterogêneos.

[0106] Essas são as características desejáveis para as terapias de reposição celular após infarto do miocárdio porque populações celulares mistas que contêm células marca-passo contaminantes e têm taxas de batimento espontâneo rápidas podem provocar arritmias com risco de morte. Propomos que nosso novo protocolo para especificação de cardiomiócitos ventriculares seja superior aos protocolos prévios que geraram populações mistas de células ventriculares e tipo marca-passo.

EXEMPLOS

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32/58 [0107] Metodologias e Resultados [0108] Linhagens de céluias-tronco pluripotentes humanas podem ser cultivadas conforme descrito anteriormente (por exemplo, Kennedy et ai., 2007). Para diferenciação na linhagem cardíaca, um protocolo estabelecido, tal como aquele descrito em Kattman et al., 2011) pode ser usado. Várias modificações aos procedimentos são possíveis, incluindo aquelas conforme descrito em WO2016131137. Em uma modalidade, 80% de culturas de hPSCs confluentes podem ser dissociadas em células únicas, suspensas em meios StemPro-34 contendo 1 ng/mi de BMP4 e 10 pM de inibidor de ROCK e incubadas por 18 horas em um agitador orbital para gerar corpos embrioides (EBs). No dia seguinte (dia 1 de diferenciação), os EBs podem ser transferidos para os meios de indução do mesoderma: StemPro-34 contendo uma concentração definida de BMP4 e uma concentração definida de Activina A, conforme descrito neste documento, bem como 5 ng/ml de bFGF. No dia 3 de diferenciação, os EBs podem ser lavados uma vez usando IMDM e suspensos em meios de indução cardíaca: em uma modalidade, os meios de indução cardíaca podem incluir StemPro-34 contendo 0,5 pM de IWP2,10 ng/ml de VEGF, e opcionalmente 5,4 μΜ de SB-431542 (SB, inibidor de Activina/TGFp Nodal). Os meios de indução cardíaca também podem incluir, opcionalmente, ácido retinoico (RA), ou um componente de RA, conforme descrito neste documento.

[0109] A sinalização de ácido retinoico especifica cardiomiócitos de tipo atrial a partir de hESCs.

[0110] Para determinar se a sinalização de ácido retinoico pode especificar um destino atrial em populações cardiogênicas derivadas de hPSC geradas com nosso protocolo baseado em corpos embrioides, todo o ácido trans-retinoico (RA) foi adicionado às culturas de diferenciação em 4 pontos de tempo diferentes que representam os seguintes estágios de desenvolvimento: indução do mesoderma (dia 3), especificação cardiovascular (dia 5), desenvolvimento de progenitor cardíaco (dia 7) e emergência de cardiomiócitos de contração (dia 9) (Kattman et al., 2011) (Figura 1A). A linhagem de hESC repórter de HES3 NKX2-5: GFP foi usada para esses experimentos para nos permitir monitorar e quantificar o

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33/58 desenvolvimento cardiovascular e isolar cardlomiócitos GFP+. No dia 20 da cultura, os cardiomiócitos GFP+SIRPA+CD90- foram isolados das populações diferenciadas e analisados por RT-qPCR para expressão de genes indicativos de desenvolvimento atrial e ventricular. (Figuras 1 ΒΌ e 8B-E).

[0111] Nenhum dos tratamentos com RA alterou significativamente os níveis de expressão do CTNT marcador de pan-cardiomiócito, indicando conteúdo de cardiomiócitos comparável nas diferentes populações (Figura 1 B). A adição de RA nos dias 3 e 5 resultou em uma redução significativa na expressão do gene específico ventricular MYL2 e numa regulação positiva do gene do canal de íons atrial KCNJ3 (Figura 1 C), sugerindo uma mudança no destino dos cardiomiócitos nas populações no dia 20. Curiosamente, a adição de RA em estágios tardios (dias 7 e 12) não tiveram efeito sobre a expressão desses genes. As análises de marcadores específicos de câmara adicionais mostrou que os cardiomiócitos gerados a partir do mesoderma tratado com RA no dia 3 também expressaram níveis mais baixos dos marcadores ventriculares IRX4 e MYH7 do que o grupo não tratado, enquanto que o padrão reverso foi observado para os marcadores atriais NR2F2, TBX5, NPPA e MYL7 e canais de íons específicos atriais CACNA1 D, KCNA5 e GJA5 (Figuras 1 D e 8C-E). As análises de tecidos fetais de controle verificaram os padrões de expressão atrial e ventricular desses genes diferentes. As análises por citometria de fluxo e imunocoloração de populações de cardiomiócitos geradas a partir do mesoderma tratado com RA no dia 3 confirmaram os padrões de expressão por qRT-PCR, e mostraram uma redução dramática na proporção de células MLC2V⁺ e uma frequência muito mais alta de células COUPTFII* na população gerada a partir do mesoderma tratado com RA no dia 3, em comparação àquele gerado a partir do mesoderma controle não tratado (Figuras 1 E-H).

[0112] Em conjunto, essas descobertas sugerem fortemente que a sinalização de RA induz uma alteração de destino na cardiogênese de hPSC, promovendo o desenvolvimento de cardiomiócitos atriais às custas da linhagem ventricular. Adicionalmente, elas mostram que este efeito de RA é restrito a uma janela de desenvolvimento precoce, entre os dias 3 e 5 de diferenciação,

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34/58 correspondendo ao estado de diferenciação de mesoderma.

[0113] Para caracterizar ainda mais a resposta de RA, analisamos, em seguida, populações entre os dias 2 e 6 de diferenciação para expressão das 3 isoformas do receptor de RA (RAR); RAR-alfa, -β, -γ (RARA, RARE e RARG na Fig. 8F, respectivamente). Todos os três foram expressos durante o estágio responsive, sugerindo que a resposta de RA pode ser mediada através de todos eles (Figura 8F). Para testar isto, adicionamos os agonistas receptor-específicos AM580 para alfa, AC55649 para β ou CD437 para γ no lugar de RA às culturas no dia 3. A adição de cada um dos agonistas levou a uma redução da expressão de MYL2 nas populações de CTNT* no dia 20, sugerindo que a sinalização através de todas as isoformas do receptor podem mediar a alteração no destino (Figuras 8G e 8H).

[0114] Em algumas modalidades, RA pode ser adicionado em uma concentração de cerca de 0,05 μΜ a uma concentração de cerca de 5 μΜ. Em uma modalidade, a concentração de RA é de 500nM (0,5μΜ). Em uma modalidade, a concentração de RA adicionado é de entre 0,05μΜ e 0,01 μΜ. Em uma modalidade, a concentração de RA adicionado é de entre 0,01 μΜ e 0,1 μΜ. Em algumas modalidades, um componente de RA é adicionado. Em algumas modalidades, o componente de RA é um agonista do receptor de ácido retinoico (RAR). Em algumas modalidades, o agonista de RAR é um agonista contra o receptor alfa. Em algumas modalidades, o agonista de RAR é AM580. Em algumas modalidades, o agonista de RAR AM580 é adicionado em uma concentração de cerca de 3nM a cerca de 300nM. Em algumas modalidades, o agonista de RAR é um agonista contra o receptor beta. Em algumas modalidades, o agonista de RAR é AC55649. Em algumas modalidades, o AC55649 é adicionado em uma concentração de cerca de 0,025μΜ a 2,5 μΜ. Em algumas modalidades, o agonista de RAR é um agonista contra o receptor gama. Em algumas modalidades, o agonista de RAR é CD437. Em algumas modalidades, o agonista de RAR CD437 é adicionado em uma concentração de cerca de Ο,ΟδμΜ a cerca de 5μΜ.

[0115] A expressão de RALDH2 e CYP26A1 identifica subpopulações de

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35/58 mesoderma.

[0116] Se a especificação de destino atrial for mediada através de sinalização de RA autócrina, a população de mesoderma que dá origem a esses cardiomiócitos deverá apresentar atividade de RALDH. Para testar isto, analisamos o mesoderma de PDGFRalfa induzido com nossas condições padrão (10 ng/mL de BMP4 e 6 ng/mL de Activina A (10B/6A) em dias diferentes, usando o ensaio de aldefluor que detecta a atividade de todas as aldeído desidrogenases, (ALDHs), incluindo as três retinaldeído desidrogenases, RALDH1, -2 e -3 (Jones et. al.., 1995). Esses análises revelaram a presença de uma pequena população de ALDH+ PDGFRalfa+ nos dias 4 e 5 de diferenciação (Figura 2A), sugerindo que uma subpopulação de mesoderma nesses estágios pode ter a capacidade de sintetizar RA. Numa tentativa de aumentar o tamanho da população ALDH⁺PDGFRalfa⁴, testamos o efeito da variação das concentrações de Activina A e BMP4 durante a etapa de indução do mesoderma. A redução da quantidade de Activina A na presença de uma concentração constante de BMP4 (10 ng/mL) levou a um aumento substancial no tamanho da população ALDH⁴ PDGFRalfa⁴no dia 4 de diferenciação (Figura 2B). No entanto, este aumento foi associado a uma diminuição na proporção de cardiomiócitos CTNT⁴ gerados, sugerindo que essas alterações promoveram um destino não cardiogênico. Como mostramos anteriormente que a razão entre a sinalização de Activina A e de BMP4 é importante para a manutenção do potencial cardiogênico ótimo (Kattman et al., 2011), em seguida, variamos a concentração de BMP4 na presença da quantidade de Activina A (2 ng/mL) que induziu a maior população ALDH⁴PDGFRalfa⁴. A redução da concentração de BMP4 de 10 para 3 ng/mL (3B/2A) não influenciou o tamanho da população ALDH⁴ PDGFRalfa⁴, mas aumentou a frequência de células CTNT⁴ geradas no dia 20 (Figura 2C). Números celulares comparáveis foram obtidos a partir das culturas de 3B/2A e 10B/6A, indicando que as manipulações não impactaram significativamente a produção de cardiomiócitos total (Figura 9A).

[0117] As análises de culturas induzidas com 3B/2A revelaram a emergência de uma grande população de mesoderma PDGFRalfa⁴ no dia 3 de

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36/58 diferenciação, seguido pelo desenvolvimento de uma população ALDH⁺PDGFRalfa* no dia 4 (Figura 2D). A tamanho da população ALDH⁺ PDGFRalfa* aumentou até o dia 5 e, em seguida, começou a diminuir no dia 6. As análises moleculares mostraram que a expressão de RALDH2 (ALDH1A2) aumentou acentuadamente entre os dias 2 e 3 de diferenciação e, em seguida, diminuiu ao longo dos 7 dias seguintes no grupo induzido com 3B/2A (Figura 2E). As células induzidas por 10B/6A expressaram níveis significativamente mais baixos de ALDH1A2 nos dias 3 e 4, consistente com a proporção menor de células ALDH⁺neste grupo. Os níveis de expressão de outras isoformas de RALDH (ALDH1A1 e ALDH1A3) foram marcadamente menores do que aqueles de ALDH1A2, e não diferiram entre as duas populações (Figura 9B). T (BRACHYURY) e MESP1 mostraram padrões de expressão temporal semelhantes nas populações induzidas por 10B/6A e 3B/2A, indicando que as cinéticas de indução do mesoderma não foram dramaticamente diferentes entre os dois grupos (Figura 9C). No embrião em desenvolvimento, os limites da atividade de RA e a duração da sinalização são estabelecidos por um equilíbrio entre a síntese agonista localizada e a degradação (Cunningham e Duester, 2015; Rydeen e Waxman, 2014). Para determinar se este equilíbrio contribui para as culturas de diferenciação de hPSC, analisamos em seguida as duas populações para a expressão de CYP26A1, um membro da família do citocromo P450, enzima responsável pela degradação de RA. Essas análises revelaram uma diferença convincente entre os dois grupos, com as células induzidas por 10B/6A no dia 3 mostrando níveis de expressão dramaticamente mais altos do que qualquer outra população induzida por 10B/6A ou 3B/2A (Fig. 2E). Coletivamente, essas descobertas apoiam a interpretação de que combinações de 3B/2A e 10B/6A induzem diferentes populações de mesoderma distinguidas pela expressão de ALDH1A2 e CYP26A1.

[0118] O retinol especifica o mesoderma ALDH* para um destino atrial.

[0119] Para determinar se as células ALDH⁺ podem sintetizar RA, as frações ALDH⁺ PDG-FRalfa⁺ e ALDH PDGFRalfa* foram isoladas da população induzida por 3B/2A no dia 4, e as células foram cultivadas como agregados em

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37/58 retinol (ROH), RA, ou DMSO (controle) por 24 hr (Figuras 3A e 3B). A expressão de ALDH1A2 segregou para a fração ALDH⁺, confirmando a validade da estratégia de separação baseada em aldefluor para o isolamento de células expressoras de RALDH2 (Figura 3C). Após um adicional de 15 dias de cultura, todos os grupos continham uma alta proporção de células CTNT, demonstrando eficiente diferenciação de cardiomiócitos (Figura 3D). Os controles não tratados geraram populações de cardiomiócitos que continham células MLC2V⁺ e expressaram IRX4, demonstrando que, na ausência de sinalização de RA, o mesoderma induzido por 3B/2A tem algum potencial cardiogênico ventricular (Figuras 3E e 3F). Após o tratamento com ROH, o mesoderma ALDH⁺ gerou uma população de cardiomiócitos de tipo atrial que tinha uma frequência mais baixa de células MLC2V⁺, níveis mais baixos de expressão de IRX4, e níveis elevados de expressão de KCNJ3, em comparação ao controle não tratado (Figuras 3E-3G). Os padrões de expressão nas populações tratadas com ALDH⁺ derivadas de PDGFRalfa⁺ foram semelhantes, sugerindo fortemente que as células ALDH⁺eram capazes de sintetizar RA a partir de ROH.

[0120] Surpreendentemente, observamos uma resposta semelhante a ROH nas células ALDH (Fig. 3E-3F), apesar de sua falta de expressão de ALDH1A2 no momento do isolamento (Fig. 3B e 3C). Esta resposta foi provavelmente devido ao fato de que a maior parte da população derivada de ALDH- se tornou ALDH+ durante a cultura de agregação de 24 horas (Figura 10A), permitindo que as células respondessem a ROH. Curiosamente, observamos uma diminuição na coloração de aldefluor na população derivada de ALDH+ ao longo do mesmo período de 24 horas, destacando nas naturezas dinâmicas da atividades de ALDH (expressão de RALDH2) dentro da população de mesoderma.

[0121] Juntamente, essas descobertas demonstram que 3B/2A induz o mesoderma ALDH+ PDG-FRalfa+ (RALDH2+) que pode responder a ROH e gerar cardiomiócitos de tipo atrial, apoiando a noção de que a especificação deste destino é mediada através de sinalização de RA autócrina.

[0122] A expressão de CD235a marca o mesoderma que pode originar cardiomiócitos ventriculares. Considera-se neste documento que CD235b pode

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38/58 substituir CD235a como um marcador de mesoderma que origina o mesoderma ventricular, pelo menos devido à similaridade de sequência de aminoácidos e/ou à identidade da região N-terminal de Glicoforina B e Glicoforina A.

[0123] Para ser capaz de monitorar o desenvolvimento do mesoderma expressor de AYP26A1 (VM) que origina cardiomiócitos ventriculares, iniciamos uma busca por marcadores de superfície neste população que nos permitiría distingui-los do mesoderma ALDH+. Através de uma triagem prévia em um arranjo de anticorpo anti-CD (http://www.ocigc.ca/antibody/), descobrimos que a glicoforina A (CD235a) foi expressa em um subconjunto de células PDGFRalfa+ cardiogênicas no dia 5 induzidas com 10B/6A (dados não mostrados). Análises de populações induzidas por 10B/6A e 3B/2A revelaram que a população CD235a+ aumentou dentro das 24 hr (> 60%) seguintes e, então, diminuiu ao longo das 48hr seguintes. A pequena proporção de células ALDH⁺ detectadas no dia 5 foram CD235a⁺, indicando que as populações ALDH⁺ e CD235a⁺ eram mutuamente exclusivas. Apenas algumas células CD235a⁺ foram detectadas no dia 4 nas populações induzidas por 3B/2A. As análises de qRT-PCR revelaram uma regulação positiva da expressão de GYPA (glicoforina A) no dia 3 de diferenciação no grupo induzido com 10B/6A. Figura 11A). Os níveis de expressão diminuíram acentuadamente ao longo das 24 horas seguintes e permaneceram baixos por toda a duração das análises. Apenas baixos níveis de expressão foram detectados nas populações induzidas por 3B/2A. Com base nessas descobertas, criamos a hipótese de que a glicoforina A é expressa no mesoderma que contribui para a linhagem de cardiomiócitos ventriculares.

[0124] Para testar a utilidade de CD235a para o isolamento de progenitores ventriculares, geramos uma população no dia 4 que continha as subpopulações CD235a* e ALDH⁺ usando uma estratégia de indução com concentrações intermediárias de BMP4 e Activina A (5 ng/mL BMP4 e 4 ng/mL de Activina A [5B/4A]) (Figura 4B). As frações CD235a⁺ALDH- e CD235a-ALDH⁺ foram isoladas e as células cultivadas como agregados. As análises de qRT-PCR das frações separadas mostraram que ALDH1A2 foi expresso em níveis mais altos nas células CD235a~ALDH⁺ do que nas células CD235a⁺ALDH~ (Figura 11 B). Os níveis de

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39/58 expressão de GYPA e CYP26A1 não foram significativamente diferentes entre as duas, provavelmente devido ao fato de que as frações foram isoladas no dia 4, um dia além da expressão máxima desses genes. Na ausência de ROH e RA, ambas as frações geraram células de tipo ventricular (Figuras 4C- 4E). No entanto, a proporção de células MLC2V⁺ e a expressão de IRX4 foram mais altas na população gerada a partir do mesoderma CD235a⁺ALDH- do que nos derivados de CD235a-ALDH’. O padrão reverso foi observado para os genes atriais KCNJ3 e NR2F2 (Figura 4F). Quando cultivado na presença de ROH, o CD235a-ALDH⁺ deu origem a uma população de cardiomiócitos de tipo atrial caracterizada por uma baixa frequência de células MLC2V⁺; baixos níveis de expressão de IRX4; e elevados níveis de expressão de NPPA, KCNJ3 e NR2F2 (Figuras 4D-4F). As células CD235aALDH'\ em contraste, não mostraram nenhuma resposta a ROH, demonstrando uma incapacidade de sintetizar RA na ausência de células ALDH⁺ . Como esperado, ambas as populações de mesoderma responderam a RA e geraram células MLC2V’. Em conjunto, essas descobertas demonstram que a expressão de CD235a marca uma população de mesoderma com potencial de cardiomiócitos ventriculares que é incapaz de responder a ROH para gerar células atriais, uma característica que o distingue do mesoderma CD235a-ALDH⁺. Essas descobertas também sugerem que as populações de mesoderma CD235a⁺ e ALDH⁺ já são padronizadas para seus respectivos destinos, conforme indicado pela expressão diferencial dos genes ventriculares e atriais nas populações de cardiomiócitos geradas na ausência de sinalização de RA.

[0125] Otimização de diferenciação de cardiomiócitos ventriculares [0126] Embora a indução com 10B/6A favoreça o desenvolvimento de cardiomiócitos ventriculares, o mesoderma gerado nessas condições geralmente contém uma pequena proporção de células ALDH+ e dá origem a populações de CTNT+ que contêm proporções variáveis (40% a 60% de células MLC2V+. Para otimizar ainda mais o desenvolvimento de cardiomiócitos ventriculares, monitoramos o tamanho da fração CD235a+ nas populações de EB no dia 4 induzidas com diferentes concentrações de Activina A e BMP4 e comparamos isto

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40/58 à frequência de células MLC2V+CTNT+ no dia 20 (Figuras 5A e 5B). O aumento da concentração de Activina A de 2ng/ml para 12ng/ml na presença de uma quantidade constante de BMP4 (10 ng/mL) levou a um aumento no tamanho da população de CD235a+ no dia 4, à eliminação da população de ALDH++, e a um aumento na proporção de células MLC2V* CTNT+ (Figura 5A).

[0127] Em seguida, a concentração de BMP4 (3-20 ng/mL) foi variada contra a quantidade de Activina A (12 ng/mL) que gerou a frequência mais alta de células MLC2V⁺CTNT⁺. Alterações na concentração de BMP4 tiveram pouco impacto sobre o tamanho da população de CD235a⁺, mas influenciaram a especificação ventricular. As populações no dia 20 geradas a partir de EBs induzidos com a maior concentração (20 ng/mL) de BMP4 tiveram a menor frequência de células MLC2V⁺CTNT⁺, enquanto que os EBs induzidos com uma baixa concentração de BMP4 (5 ng/mL [5B/12A]) geraram a maior frequência desses cardiomiócitos (80% ± 5%) (Figuras 5B e 13B). As culturas induzidas por 5B/12A e 10B/6A produziram números celulares comparáveis, indicando que o enriquecimento de células MLC2V⁺CTNT⁺ foi obtido sem o comprometimento da produção celular total (Figura 12C).

[0128] Deve-se notar que a concentração ideal de Activina A e BMP4 é dependente da atividade do lote específico de citocina. Dado isto, essas titulações precisam ser repetidas com cada novo lote de citocina para determinar a concentração ideal. Para determinar se o tempo em cultura influenciaria o conteúdo de MLC2V+ das populações de cardiomiócitos derivadas de hPSC como foi relatado (Burridge et al., 2014), comparamos as populações dos dias 20 e 40 geradas a partir de EBs induzidos com 3B/2A, 10B/6A e 5Β/Ί2Α. Como mostrado na Figura 13B, proporções similares de cardiomiócitos MLC2V+CTNT+ foram detectadas em ambos os pontos de tempo em cada uma das populações, demonstrando que o tempo prolongado em cultura não influencia seu conteúdo ventricular nessas condições. Em conjunto, essas descobertas indicam que a indução de uma população de CD235a+ no dia 4 é um pré-requisito para a geração de populações altamente enriquecidas em cardiomiócitos MLC2V+CTNT-F No entanto, elas também mostraram que o tamanho desta

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41/58 população não é necessariamente predltivo da porcentagem de células MLC2V+ no dia 20 da cultura. A população de EB induzida com 5B/12A continha uma alta proporção de células CD235a+ e nenhuma célula ALDH+ (Figura 5C), enquanto aquele induzida com 3B/2A teve uma alta frequência de células ALDH+ e poucas células CD235a⁺. Quando especificadas na ausência ou presença de ROH ou RA (dias 3-5) e cultivadas por mais 15 dias, ambas as populações apresentaram potencial cardiogênico semelhante como medido pela frequência de células CTNT⁺ geradas (Figura 5D).

[0129] Os EBs induzidos por 3B/2A responderam a ROH e geraram uma população de cardiomiócitos de tipo atrial, caracterizada por uma perda de células MLC2V⁺, uma redução na expressão de IRX4, e uma regulação positiva de KCNJ3 e NR2F2 (Figuras 5E-5G). Em contraste, os EBs induzidos por 5B/12A não responderam a ROH, consistente com uma ausência completa de células ALDH⁺. Conforme esperado, o tratamento com RA foi capaz de induzir um fenótipo de cardiomiócito de tipo atrial a partir deste mesoderma.

[0130] Para determinar se as condições usadas para otimizar a diferenciação ventricular impactaram a proporção de células tipo marca-passo do nó sinoatrial NKX2.5 (Birket et al., 2015; Protze et al., 2017) normalmente detectadas nessas culturas, analisamos a população para a presença de células NKX2-5-GFP. Conforme mostrado na Figura 5H, a população gerada a partir dos EBs induzidos por5B/12A otimizados continha significativamente menos células NKX2-5-GFPCTNT⁺ do que aqueles derivados de EBs induzidos por 10B/6A (Figura 1 E) e induzidos por 3B/2A, indicando um conteúdo reduzido de células tipo marca-passo do nó sinoatrial (SAN PLC). Esta diminuição no conteúdo de marca-passo estava associado a uma diminuição significativa nas taxas de batimento espontâneo dos EBs induzidos por 5B/12A, em comparação aos EBs induzidos por 3B/2A (Figura 5I). Consistente com nossas descobertas anteriores (Protze et al., 2017), o tratamento com RA não influenciou a proporção de células NKX2-5-GFP nas populações derivadas (Figura 5J).

[0131] Em conjunto, essas descobertas mostram que 5B/12A especifica uma subpopulação de mesoderma que contém uma alta proporção de células

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CD235a⁺ e dá origem a populações altamente enriquecidas em cardiomiócitos ventriculares e desprovidos de cardiomiócitos atriais e SANPLCs. Esta subpopulação também pode ser referida como mesoderma ventricular.

[0132] Em algumas modalidades, a otimização da diferenciação ventricular resulta no enriquecimento de pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% de cardiomiócitos ventriculares, quando medida em uma cultura no dia 20 usando um método, conforme descrito neste documento. Em algumas modalidades, a população é essencialmente livre de células marca-passo. Em algumas modalidades, a população é essencialmente desprovida de células marca-passo.

[0133] Em algumas modalidades, métodos de diferenciação ventricular otimizam a geração do mesoderma ventricular pela adição de concentrações otimizadas de um componente de BMP e um componente de activina. Em algumas modalidades, o componente de BMP é BMP4 e o componente de activina é a Activina A. Em algumas modalidades, ο BMP4 é adicionado em uma concentração de 3ng/mi a 20 ng/ml. Em algumas modalidades, a Activina A é adicionada em uma concentração de 4ng/mi a 20ng/mi. Em algumas modalidades, a Activina A é adicionada em uma concentração mais alta que o BMP4. Em algumas modalidades, ο BMP4 é adicionado em uma concentração de 10ng/mi e a Activina A é adicionada em uma concentração de 12ng/ml. Em algumas modalidades, o componente de BMP e o componente de Activina são adicionados no dia 1 do processo. Em algumas modalidades, a concentração do componente de BMP e/ou do componente de Activina são determinadas pela medição para a presença ou quantidade de CD235a. Em algumas modalidades, a concentração do componente de BMP e/ou do componente de Activina são determinadas pela medição para a presença ou quantidade de RALDH2. Em algumas modalidades, a concentração do componente de BMP e/ou do componente de Activina são determinadas pela medição para o nível de CD235a e comparação deste com o nível de RALDH2. Em algumas modalidades, a concentração do componente de Activina é escolhida com base na concentração que resulta preferencialmente em mais células de mesoderma expressoras de

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CD235a, em comparação a células expressoras de RALDH2, e o componente de BMP é adicionado em uma concentração inferior à concentração do componente de Activina. Em algumas modalidades, a concentração do componente de BMP é escolhida com base na concentração que resulta preferencialmente em mais CD235a, em comparação com RALDH2, e o componente de Activina é adicionado em uma concentração superiora concentração do componente de BMP.

Caracterização de cardiomiócitos gerados a partir de diferentes mesodermas.

[0134] Para pesquisar ainda mais o potencial cardlogênico das populações de mesoderma diferentes, isolamos cardiomiócitos NKX2-5+SIRPalpha+CD90no dia 20 gerados a partir de EBs induzidos com nossa combinação de citocina original (10B/6A; Ml induzido misto) ou com combinações otimizadas para destino ventricular (5B/12A; VI induzido ventricular) ou atrial (3B/2A; Al induzido atrial). Como esperado, os níveis de expressão de CTNT foram semelhantes nas populações separadas (Figura 6A). Cardiomiócitos gerados a partir de VI EBs expressaram níveis significativamente mais altos de genes associados com miócitos ventriculares, incluindo MYL2, IRX4 e MYH7, do que os cardiomiócitos derivados de Ml ou Al EBs (Figura 6B). Populações derivadas de VI Ebs tiveram a maior frequência de cardiomiócitos MCL2V+. (80% ± 2% de VI EBs, 56% ± 4% de Ml EBs, e 25% ± 5% de Al EBs), sugerindo que o perfil de expressão ventricular melhorado é devido, em parte, à frequência enriquecida de cardiomiócitos de tipo ventricular (Figura 13A). Análises de imunocoloração confirmaram as diferenças no conteúdo de MLC2V das populações de cardiomiócitos (Figura 13B).

[0135] Cardiomiócitos gerados a partir de VI e Al EBs tratados com RA (VI + RA e Al + RA, respectivamente) mostraram níveis elevados de expressão de todos os genes atriais em comparação com aqueles isolados dos EBs não tratados (Figuras 6C e 13C). Os níveis de expressão de KCNA5, KCNJ3, NR2F2 e CACNA1D nas células a partir de Al + RA foram tão altos quanto ou maiores do que aqueles no tecido atrial fetal (Figura 6C). Notavelmente, seus níveis de expressão também foram significativamente mais altos do que aqueles detectados nos miócitos gerados a partir de VI + RA EBs. Em contraste, outros

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44/58 genes atriais, tais como GJA5, NPPA e MYL7, foram expressos em níveis comparáveis nas duas populações de cardiomiócitos tratadas com RA, mas em níveis significativamente menores do que aqueles detectados no tecido atrial fetal (Figura 14C). Os níveis do gene de marca-passo TBX3 foram comparáveis nos dois grupos tratados com RA, indicando que as diferenças observadas na expressão de KCNA5, KCNJ3, CACNA1D e NR2F2 não foram devidas à contaminação de células marca-passo na população atrial (Figura 13D).

[0136] Dado que o mesoderma CD235a* expressa CYP26A1 que pode degradar RA, é possível que as diferenças na expressão dos genes atriais sejam devidas às diferenças na concentração final de ligante ativo que atinge os receptores nucleares. Para testar isto, variamos a concentração de RA usada para a especificação atrial e analisamos as células NKX2-5+SIRPa+ isoladas (dia 20) geradas a partir de cada condição de indução de EB (Figura 13E). O aumento da concentração de RA de 0,5 para 1-2 mM aumentou o nível de expressão de KCNA5 nos cardiomiócitos a partir dos VI EBs para níveis comparáveis às células a partir dos Al EBs (Figura 13F). Essas concentrações de RA também foram suficientes para suprimir completamente a expressão dos genes ventriculares MYL2 e IRX4 na população VI (Figura 13G). Em contraste, a adição de RA em concentrações acima de 2 mM falhou em aumentar a expressão de KCNJ3, CACNA1D e NR2F2 em cardiomiócitos VI para os níveis observados nas células Al (Figura 14H). Níveis de expressão comparáveis desses genes foram apenas detectados em cardiomiócitos gerados a partir de EBs tratados com 4 mM de RA, uma concentração que resultou em uma redução dramática na frequência de células NKX2-5+ SIRPa+ nas populações no dia 20 (Figura 14E). Esses dados demonstram ainda que as populações de mesoderma VI e Al não têm o mesmo potencial. Adicionalmente, eles ressaltam a importância do uso de estratégias adequadas de indução de estágio inicial para a especificação eficiente de cardiomiócitos ventriculares e atriais. Para avaliar se as populações acima diferiram funcionalmente, testamos as características eletrofisiológicas dos cardiomiócitos NKX2-5+SIRPa+CD90-derivados de VI e Al ± RA EBs usando experimentos de patch-clamp.

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45/58 [0137] Tabela 1 (relacionada à Figura 6) Características eletrofisiológicas dos cardiomiócitos derivados dos VI e Al EBs

VI+RA AI+RA

	espontâneo(n = 15)	estimulado (n = 3)	n - 18)	ill - 20)
Características de AP
DMP hiV'i	-57.0 + 2.3	-7Ü.0 + 4.2*	-54 3+1.9	-54.0 ±17
APA (mV)	91.5 + 4.1	81.7 ±4.1	80.0 + 5.2	84.5 ±5.2
(VA)	55 8 1-6.4	48.9 + 3.5	67.1 ±7.6	67.7 + 12.2
APD30 (ms)	172*13	133 ±23	55 ± 20**	f 3.0 + 4.8’®
APD90 (n»)	320 1- 3?	227 > 30	253 ±. 25	1 eg i nv’·’
CL (Si	3.7 1 0.7	n a.	11 +0.1''	0.750.1”*
Classificação em tipos de AP
vertricuíar (b)	'100 1 0 í 18^células ,1	± 5 fG^c®'^u'^asΓ¹	£ ± *3 [^células
otrinl bú	2 + C		<1.2 Σ *J ΐ 12_células )	* Ο Γ.· j. h ; ί 7 '' m Uri + tf i /células .>
marca-passo (%)	+ 0		0 ·<· C·	0 + 0
imaturas (%)	Q ± Q		C ± ü	8 ± 8 (Icélulai)

[0138] [0139] APA, amplitude do potencial de ação; APD30/90, duração do potencial de ação a 30%/90% de repolarização; CL, duração do ciclo; DMP, potencial de membrana diastólico; dv/dtmax, velocidade de fase ascendente do potencial de ação máximo; teste t: *P<0,05, **P<0,01 vs VI espontâneo e #P<0,05, ##P<0,01 vs VI+RA. % de tipo de AP ± SEM foi quantificado a partir de lotes celulares repartidos de n = 5 (VI, VI+RA) e n = 6 (AI+RA) de diferenciação independente. Os detalhes dos parâmetros usados para a classificação nos tipos de AP estão especificados na seção de métodos.

[0140] Uma vez que as análises de citometria de fluxo para MLC2V já tinham demonstrado uma baixa eficiência de especificação de cardiomiócitos ventriculares a partir de Al EBs na ausência de RA, esses cardiomiócitos não foram mais analisados nos experimentos de patch-clamp. Cardiomiócitos derivados de VI EB (na ausência de RA) mostraram potenciais de ação ventriculares típicos (APs) com rápidas velocidades de fase ascendente (>10 V/s) e longas durações de AP (APD30 > 50 ms) (Figuras 6E e 6F). Consideravelmente, 100% das células analisadas mostraram este fenótipo ventricular (Figura 6G). Os cardiomiócitos que foram especificados a partir de VI ou Al EBs na presença de RA apresentaram taxas de batimento significativamente mais rápidas e APD30s mais curtos em comparação aos cardiomiócitos derivados de VI EB, indicativo de

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46/58 um fenótipo de AP atrial (Figuras 6E e 6F). No entanto, o APD30 e APD90 de cardiomiócitos derivados de VI + RA EB foram significativamente mais longos do que os encontrados em cardiomiócitos derivados de Al + RA EB (APD30, 55 ± 20 ms versus 13,0 ± 4,8 ms; APD90, 258 ± 25 ms versus 189 ± 18 ms). A classificação dos tipos de AP observados revelou diferenças notáveis na proporção de APs do tipo atrial e ventricular registrados nas células dos dois grupos (Figura 6G). Apenas 62% ± 5% das células analisadas a partir de VI + RA EBs mostraram um padrão atrial, com os 38% ± 5% restantes apresentando um fenótipo ventricular (APD30/90 > 0,3). Em contraste, a maior parte (86% ± 9%) das células nos Al + RA EBs mostrou um padrão atrial com apenas 6% ± 6% apresentando um AP ventricular. Uma célula das 20 registradas a partir de Al + RA EBs teve uma baixa velocidade de fase ascendente (<10 V/s) e baixa taxa de batimento (50 bpm), indicativo de um cardiomiócito imaturo. Para caracterizar ainda mais as células atriais geradas a partir das duas populações de EB, medimos, a seguir, as densidades de corrente de potássio ativada por acetilcolina (IKACh), focando apenas nas células que apresentaram um fenótipo de AP atrial (velocidade de fase ascendente > 10 V/s, APD30/90 < 0,3). Conforme esperado, as células ventriculares derivadas de VI EB de controle (-RA) apresentaram uma densidade de IKACh significativamente menor do que as células atriais geradas a partir de ambas as populações (Figuras 6H-6J). A comparação das duas populações de cardiomiócitos atriais revelou diferenças interessantes, assim como aquelas derivadas de Al + RA EBs mostraram densidades de corrente de IKACh significativamente maiores do que aquelas derivadas de VI + RA EBs (2,8 ± 0,4 pA/pF versus 1,6 ±0,4 pA/pF). Em conjunto com as observações acima, essas descobertas indicam que a eficiência de geração de células atriais e a qualidade dessas células são dependentes da geração da população de mesoderma adequada.

[0141] Geração de cardiomiócitos atriais e ventriculares a partir de outras linhagens de hPSC.

[0142] Para determinar se a abordagem para otimização da diferenciação atrial e ventricular com base na atividade de ALDH e expressão de CD235a é

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47/58 amplamente aplicável, usamos isto para gerar essas populações de cardiomiócitos a partir de linhagens de células-tronco embrionárias humanas HES2 e células-tronco pluripotentes induzidas por MSC-ÍPS1. Estudos de titulação identificaram 5B/2A e 5B/6A como ideais para induções atrial e ventricular, respectivamente, para células HES2, e 4B/4A como ideais para indução ventricular para células MSC-IPSC1 (Figuras 7A, 7B, 7E, e 7F; Mendeley http://dx.doi.Org/10.17632/7z7d5v2c3w.1). A otimização da indução atrial a partir das células MSC-ÍPSC1 foi mais desafiadora, uma vez que todas as combinações de citocina promoveram o desenvolvimento de uma população de CD235a+ substancial. Uma interpretação desses padrões é que as células MSC-ÍPS1 têm um alto nível de sinalização de Nodal/de Activina A endógena, resultando no desenvolvimento de algumas células CD235a+ em todas as condições. Para testar isto, adicionamos o inibidor Nodal/de Activina A/do fator de transformação do crescimento beta (TGF-beta) SB-431542 (SB) a partir dos dias 3 a 5 às células induzidas com 4B/1 A. A adição de SB levou a uma redução nas células CD235a+ e a um aumento no tamanho da população de ALDH+ sem afetar o potencial cardiogênico de CTNT+MLC2V- do mesoderma no dia 4 (Figuras 7E, 7F e 14A), apoiando a interpretação de que as células MSC-ÍPS1 têm níveis mais altos de sinalização Nodal/de Activina A do que outras linhagens.

[0143] EBs otimizados para o desenvolvimento do mesoderma CD235a+ a partir de ambas as linhagens geraram populações no dia 20 que continham altas proporções de cardiomiócitos MLC2V+CTNT+ que expressavam IRX4 (Figuras 7B, 70, 7F e 7G). Nenhuma população de mesoderma CD235a+ respondeu a ROH. Como esperado, ambos responderam a RA, e geraram populações de cardiomiócitos que mostraram teor reduzido de MLC2V, uma regulação negativa da expressão de MYL2 e IRX4, e uma regulação positiva de KCNJ3 e NR2F2, em comparação aos controles não tratados (Figuras 7B-7D, 7F-7H e 14B-14G). Os EBs otimizados para o desenvolvimento do mesoderma ALDH+ responderam a ROH e RA, e eles geraram populações de cardiomiócitos que apresentaram perfis de expressão indicativos da linhagem atrial (Figuras 7B-7D, 7F-7H e 14B-14G). Em conjunto, essas descobertas demonstram que as populações de mesoderma

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ALDH+ e CD235a+ geradas a partir de diferentes linhagens de hPSC apresentaram potencial atrial e ventricular, respectivamente, semelhante às populações geradas a partir da linhagem de HES3-NKX2-5eGFP/w. Usamos o sistema de diferenciação de hPSC para modelar os estágios mais iniciais do desenvolvimento cardíaco humano, com o objetivo de mapear a emergência e segregação das linhagens de cardiomiócitos atriais e ventriculares. As descobertas deste trabalho apoiam um esquema de desenvolvimento cardíaco humano, no qual cardiomiócitos atriais e ventriculares derivam de populações de mesoderma distintas que são especificadas por diferentes níveis de sinalização de Activina A e BMP4 e podem ser identificadas com base na atividade de ALDH (RALDH2) ou expressão de CD235a/CYP26A1, respectivamente (Figura 7I). Propomos que a cardiogênese atrial é induzida através de sinalização de RA autócrina dentro de uma subpopulação de mesoderma RALDH2⁺, enquanto que a inibição da via no mesoderma CD235a⁺ através da expressão de CYP26A1 é necessária para o desenvolvimento de cardiomiócitos ventriculares. Embora as populações de RALDH2⁺ e CD235a⁺ possam dar origem a ambos os tipos de cardiomiócitos, a geração eficiente de células atriais e ventriculares é dependente da Indução do mesoderma adequado. Coletivamente, essas novas percepções fornecem um quadro para o acesso dos estágios mais iniciais do desenvolvimento cardíaco humano e uma plataforma para a criação de protocolos ideais para a geração eficiente de subtipos de cardiomiócitos específicos.

[0144] Nossa observação de que a especificação atrial é mediada pela sinalização de RA durante o estágio de desenvolvimento do mesoderma é consistente com relatos anteriores sobre diferenciação atrial a partir de hPSCs (Devalla et al., 2015; Zhang et al., 2011), bem como com o efeito limitado por tempo de RA sobre a cardiogênese descrito no embrião inicial (Moss et al., 1998; Xavier-Neto et al., 2000). No embrião, este estágio correlaciona-se com a emergência de uma população de células responsivas a RA e expressoras de RALDH2 no mesoderma de placa lateral que pensa-se contribuir para a região posterior do tubo cardíaco e, finalmente, dá origem aos cardiomiócitos atriais (Hochgreb et al., 2003; Moss et al., 1998). Os padrões altamente sobrepostos de

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49/58 responsividade a RA e de expressão de RALDH2 sugerem que este mesoderma pode sintetizar e responder a RA. O conceito de que uma subpopulação de mesoderma cardíaco in vivo pode sintetizar RA é apoiado pelo estudo de Lescroart et al. (2014), que mostrou que a migração do mesoderma Mesp1 ⁺(E7.25), que contribui para o desenvolvimento atrial, expressa níveis significativamente mais altos de ALDH1A2 (RALDH2) do que a migração precoce de progenitoras ventrícularas (E6.25-6.75). Essas descobertas a partir de nossos experimentos de seleção celular demonstram claramente que o mesoderma induzido por3B/2A com potencial atrial expressa RALDH2 e é capaz de responder a ROH, fornecendo evidências convincentes de que a especificação atrial humana é mediada através da sinalização de RA autócrina.

[0145] A descoberta de que o mesoderma CD235a⁺CYP26A1 ⁺ALDH gera eficientemente cardiomiócitos ventrícularas, mas que é incapaz de responder a ROH para gerar células atriais, fornece forte evidência de que esses subtipos de cardiomiócitos derivam de populações diferentes de mesoderma. A expressão diferencial de CYP26A1 e RALDH2 no mesoderma CD235a⁺ e ALDH⁺ indica que esses progenitores derivados de hPSC estabeleceram o equilíbrio entre a síntese de RA e a degradação semelhante aos limites da sinalização de RA- encontrados ao longo do eixo anterior-posterior do campo progenitor cardiovascular em embriões em desenvolvimento (Cunningham e Duester, 2015; Rydeen e Waxman, 2014). Atualmente, não é sabido se o mesoderma CD235a gera cardiomiócitos ventriculares esquerdos ou direitos, ou uma mistura dos dois. Até que sejamos capazes de alcançar uma melhor resolução dessas populações in vitro, é difícil incorporar nossas descobertas no primeiro e segundo modelos de campo cardíaco que propõem que diferentes progenitores contribuem para o trato de saída do ventrículo esquerdo e ventrículo direito (Buckingham et al., 2005; Meilhac et al., 2004; Spaeter et al., 2013). Nossas descobertas estão, entretanto, em conformidade com aquelas de Bardot et al. (2017), que usaram uma estratégia de rastreio de linhagem para mostrar que a expressão de FOXA2 no camundongo marca progenitores que são origem a cardiomiócitos ventriculares esquerdos e direitos, mas não atriais.

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50/58 [0146] A capacidade de monitorar o desenvolvimento do progenitor ventricular e atrial quantitativamente através da expressão de CD235a e atividade de ALDH nos permite pesquisar as vias que regulam a especificação dessas duas populações e a demonstrar que os gradientes da sinalização de BMP4 e Activina A desempenham um papel fundamental nessas primeiras decisões. Nossas análises de diferentes linhagens de hPSC revelaram que a especificação da linhagem ventricular é dependente de uma razão mais alta entre sinalização de Activina A e BMP4 do que o necessário para a geração da linhagem atrial. Essas diferenças podem refletir os diferentes ambientes de sinalização a que esses progenitores são expostos no embrião inicial. É fornecida evidência de suporte a isto pelo estudo de Lescroart et al. (2014), que mostrou que transcritos para Nodal e seus genes alvo a jusante PITX2, LEFT1, FGF8, GSC e ΜIXI (Lee et al., 2011) são enriquecidos na migração precoce de progenitores ventriculares esquerdos, em comparação aos progenitores atriais de desenvolvimento tardio.

[0147] A observação de que o desenvolvimento ventricular e atrial é dependente da especificação eficiente do mesoderma adequado ressalta a importância da compreensão dos estágios primários do desenvolvimento nas culturas de diferenciação de hPSC. Nossas descobertas mostram que a eficiência de desenvolvimento da linhagem e, no caso de cardiomiócitos atriais, a qualidade das células geradas são influenciadas pelas etapas iniciais de indução. O controle preciso do desenvolvimento da linhagem nas culturas de diferenciação tem implicações importantes para a tradução do potencial de hPSCs em aplicações terapêuticas para doença cardiovascular. Por exemplo, os cardiomiócitos ventriculares altamente enriquecidos, desprovidos de contaminação por células marca-passo e atriais, seriam uma população candidata ideal para o desenvolvimento de terapias à base de células com o objetivo de remuscularização da parede ventricular em pacientes que sofrem de infarto do miocárdio. A eliminação das células não ventriculares pode reduzir as arritmias observadas nos modelos animais após transplante de populações mistas de cardiomiócitos derivados de hPSC (Chong et al., 2014; Shiba et al., 2016). O acesso a populações enriquecidas de subtipos de cardiomiócitos também é

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51/58 importante para modelar doenças que afetam regiões específicas do coração, tais como a fibriiação atrial, cardiomiopatia hipertrófica e outros defeitos cardíacos congênitos de câmara específica. A capacidade de gerar diferentes populações cardíacas não fornecerá apenas as células alvo adequadas para esses estudos, mas também permitirá análises dos potenciais efeitos inespecíficos de estratégias terapêuticas nos outros subtipos de cardiomiócitos. Essas análises abrangentes fornecerão percepções sobre a doença cardiovascular humana que são possíveis com o uso de populações mistas, precariamente caracterizadas.

[0148] DETALHES DO MÉTODO [0149] Diferenciação Direcionada de Linhagens de ESC/iPSC Humanas [0150] Para a diferenciação cardíaca, usamos uma versão modificada de nosso protocolo baseado no corpo embrioide (EB) (Kattman et al., 2011). Populações de hPSC em confluência de 80%~90% foram dissociadas em células únicas (TrypLE, ThermoFisher) e re-agregadas para formar EBs em meios StemPro-34 (ThermoFisher) contendo penicilina/estreptomicina (1 %, ThermoFisher), L-glutamina (2mM, ThermoFisher), transferrina (150 pg/ml, ROCHE), ácido ascórbico (50 pg/ml, Sigma), e monotioglicerol (50 pg/ml, Sigma), inibidor de ROCK Y-27632 (10 pM, TOCRIS) e rhBMP4 (1 ng/ml, R&D) por 18h em um agitador orbital. No dia 1, os EBs foram transferidos para meios de Indução do mesoderma consistindo em StemPro-34 com os complementos acima (inibidor de ROCK Y-27632) e rhBMP4, rhActivinA (R&D) e rhbFGF (5ng/ml, R&D) nas concentrações indicadas. No dia 3, os EBs foram coletados, lavados com IMDM e transferidos para os meios de especificação do mesoderma cardíaco consistindo em StemPro-34, o inibidor de IWP2 Wnt (1 μΜ, TOCRIS) e rhVEGF (lOng/mL, R&D). No dia 5, os EBs foram transferidos para StemPro-34 com rhVEGF (5ng/ml) por mais 7 dias e, então, para meios StemPro-34 sem citocinas adicionais por mais 8 dias. No dia 20, cardiomiócitos derivados de HES3-NKX25gfp/w foram analisados e isolados com base na expressão de NKX2-5:GFP e SIRPa e uma ausência de CD90. Os cardiomiócitos gerados a partir das linhagens de hPSC não transgênicas foram analisados e isolados como populações SIRPa+CD90-. Os meios foram trocados a cada 3 dias. As culturas foram

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52/58 incubadas em um ambiente com baixo teor de oxigênio (5% CO2, 5% O2,90% N2) pelos primeiros 12 dias e um ambiente normóxico (5% CO2) pelos 8 dias seguintes num total de 20 dias. Os EBs foram cultivados em placas de 6 poços de fixação ultrabaixa (Coming) por toda a diferenciação para manutenção das culturas de suspensão.

[0151] Otimização das Condições Indutivas Atriais e Ventriculares [0152] Para determinar as condições indutivas atriais ideais, a seleção das concentrações de Activina A e BMP4 foi baseada na identificação de uma população de mesoderma com a maior proporção de células ALDH+CD235a- no dia 4 que mostraram 0 maior potencial para gerar cardiomiócitos CTNT+MLC2Vno dia 20. Após a otimização, tanto ATRA (0,5 μΜ, Sigma) quanto 0 retinol (2 μΜ, Sigma) foram incluídos nos meios de especificação do mesoderma cardíaco a partir dos dias 3-5 para a geração de cardiomiócitos atriais.

[0153] Para determinar as condições indutivas ventriculares ideais, a seleção das concentrações de Activina A e BMP4 foi baseada na identificação de uma população de mesoderma que continha uma alta proporção de células CD235a+, nenhuma célula ALDH+ e que geraram uma alta proporção de CTNT+MLC2V+ no dia 20.

[0154] Citometria de Fluxo e Seleção Celular [0155] Os EBs dos dias 2-6 foram dissociados com TrypLE por 2-4 min em temperatura ambiente (RT). Os EBs no dia 20 foram dissociados por incubação em Colagenase tipo 2 (0,5mg/ml, Worthington) em tampão HANKs durante a noite em RT seguido por tratamento com TrypLE, conforme descrito acima. Os seguintes anticorpos foram usados para coloração: anti-PDG-FRa-PE (R&D Systems, 3:50), anti-CD235a-APC (BD PharMingen, 1 : 100), anti-SIRPa-PeCy7 (Biolegend, 1:1000), anti-CD90-APC (BD PharMingen, 1:1000), anti-isoforma cardíaca de CTNT (ThermoFisher Scientific, 1:2000), ou anti-cadeia leve de miosina 2 (Abeam, 1:1000). Para anticorpos primários não conjugados, os seguintes anticorpos secundários foram usados para detecção: anti-lgG-APC de camundongo de cabra (BD Pharmigen, 1:250), ou anti-lgG~PE de coelho de burro (Jackson ImmunoResearch, 1:250). As informações sobre anticorpo detalhadas

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53/58 estão descritas na Tabela 2.

[0156] Tabela 2 Recursos Experimentais.

REAGENTE OU RECURSO	RECURSO	IDENTIFICADOR
Anticorpos
Monoclonal decamundongo para PDGFR_x(clone_xRl), conjugado a PE	CD PharYingen	Cai.# 555002; RRID; A0 .39(280
Monoclonal de camundongo para CD235a (clone HIR2), conjugado a APC	Bl? PharMingen	Gat# SS1336; RRKh A8.398499
Monoclonal de camundongo para SIRP_x(clone SE5A5), conjugado a Pecy7	Biolegsnd	Cat.# 323807; RRID: ASJ236443
Monoclonal de camundongo para CD90 (clone 5E10), conjugado a APC	BD PtíerMinjên	Gat# S5Ü8S9; RRÍD: AB_393877
Monoclonal de camundongo para CTNT (clone 13-11)	ThermctFisher	Cat.# MA5-12S60; RRID: ABJ100Ü742
Polidonal de coelho para MLC2V	AbCâlT!	Cai.# 79235; RRID; ABJ 952220
Anti-lgG de camundongo de cabra (H+L), conjugado a APC	Bt? PharMingen	Gat.# 550826; RRID; AB,398465
Anti-lgG de coelho de burro (H+L), conjugado a PE	JaCkSOri tmmuhóRéSearCh	Cat.# 711-116-152; RfflD; ΛΒ..2340599
Monoclonal de camundongo para COUP-TFII (clone H7147)	R&C·	GflL# PP-H7147-O3; RHIQ: ABJ3155827
Monoclonal de coelho para CTNT	Genway ewrtsch	Gat.# GWB-25ESE5
Anti-lgG de coelho de burro (H+L), conjugado a AlexaFluor555	IhiermoFisher	Cat.# A31572; RRID: AB J S2543
Anti-lgG de camundongo de burro (H+L), conjugado a AlexaFluorS47	fhérmoFi&her	Cat.# .431571; BRIO; AB 1 62542

Amostras Biológicas

Tecidos de coração fetal humano	Fornecidos por R. Hamilton (SickKiOs Hosoitai. Caradaj	NrA
Composto químicos, Peptídeos e Proteínas Recombinantes
Penicilina/estreptomicina	ThermoFishôr	Cai.# 15070068
L-glutamina	TTiernioFishef	Cal.# 25830081
aminoácidos não essenciais	ThêrmoFisher	Cat.# 11140-050
Transferrina	RÜGHt	Gat.# 1Ü852202
Ácido ascórbico	Signa	Cat.# .4-46440
Monotioglicerol	Sigma	Csl.#M-tM45
β-Mercaptoetanol	ThermoFisher	Gst.#2:38S-023
Inibidor de ROCKY-27632	TóCn&	Câl.# 1254
BMP4 humano recombinante	R&C*	Gat.#3'4-BP
Activina A humana recombinante	R&D	Gat.#338-AG
bFGF humano recombinante	H&L·	Cât.#223-FB
IWP2 (inibidor de Wnt)	Tocris	Gat.# 3533
VEGF humano recombinante	R&D	CâL#293-VE
RA all-trans	Sigma	Gat,# R2625
RMSrtOl	Signa	Cat.#R7f<32
SB-431542 (inibidor TGΡβ)	Sigma	Cat.#S4317-SMG
Colagenasetipo2	Wort-ihutun	Cai,# 4178
AM580 (agonista de RAR_X)	Tocris	Cai.# 0760
AC55849 (agonista de RARB)	Touris	CaLtí ?458
CD437 (agonista de RARy)	Tòfiris	Caí,# 1549
Soro de bezerro fetal (FCS)	Witórtt	Gat.#O9TMSí3
Albumina de soro bovino (BSA)	Signa	CaL#.A2153
Matrigel, fator de crescimento reduzido	Oom-ng	Cai,# 35:6230
Glicina	Signa	Cat.# Gz289
SlowFade gold antifade com DAPI	ThermoFisher	Cai.# S36939

[0157]

Ensaios Comerciais Críticos

Kit de ensaio Aldefluor	STEMCELL I ethnologies	Cat.# 1700
Kit RNAqueous-micro com tratamento com DNase livre de RNase	Amhicin	Gat.#AM193i

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Continuação
REAGENTEou RECURSO	FONTE	IDENTIFICADOR
TRfeOt	TrfíüTDOFiSh^r·	Oat.# 15898028
Kit Superscript III Reverse Transcriptase	Therm bFiSrt'Sr
Kit QuantiFast SYBR Green PCR	QiAGEN	ΌίΛ. £ 2G*! 45
Dados depositados
Dados de otimização de linhagens HES2 hESC e MSC-iPSl hiPSC	Este artigo; Dados de Mendeley
Modelos experimentais: linhagens celulares
Linhagem ESC:HES3 humana	Presente de Drs. E. Stanley e A. Elefanty, Monash University, AU (Elliott et ai., 2011)	WA
Linhagem ESC:HES2 humana		Cert.# ESdS
Linhagem iPSC: MSC-iPSCl humana	Presente de Dr. G. Daley, Harvard Medical School, US (Park et al., 2008)	NZA

Oligonucleotídeos

Ver Tabela S2 para sequências de primer de PCR	Este artigo	Tabela S2
Software e Algoritmos
pCtAMP	Motecutar Devices	hi’py λ·'· .Gom··’
		syskTri5A'^{;nv«xnion;.J natch clan p/
		nniunrp 10 sxrtwuR
FI-ów-Jo	Tret- Star	h jwj^.L'urr:
FVIõ-ASW	Olympic··;
MuitiEjipsrimerrt Vswíír	MèV	httpv/rresv I»:'’· W
	SrapnRari	ηίίρ·./.Α*.’Λ··Α·.>.ί:·φΗρ<·κ: cwcfeGiwitrt c

Outros
Meios StemPro-34	Therm óTifi-êr	Cat.# 10540019
DMEM/F12		Gat.# 1ÍF032-GV
Reposição de soro KnockOut	Therm oFish&r	ixrt.y 10828028
TrypLE		Cat.# Ifí-ilW0

[0158] [0159] Para análises de marcador de superfície celular, as células foram coradas por 30 min a 4 graus C em tampão FACS consistindo em PBS com 5% de soro de bezerro fetal (FCS) (Wisent) e 0,02% de azida sódica. Para coloração intracelular, as células foram fixadas por 15 min a 4 graus C com 4% PFAem PBS seguido de permeabilização usando metanol a 90% por 20 min a 4 graus C. As células foram lavadas com PBS contendo 0,5% BSA (Sigma) e coradas com anticorpos primários não conjugados em tampão FACS durante a noite a 4 graus

C. As células coradas foram lavadas com PBS com 0,5% BSA e coradas com anticorpos secundários em tampão FACS por 1 h a 4 graus C.

[0160] As células coradas foram analisadas usando o citômetro de fluxo LSR II (BD). Para a seleção celular, as células coradas foram mantidas em IMDM com 0,5% FCS e separadas usando Influx (BD), FACSAriall (BD), MoFIo-XDP (BD) e FACSAria Fusion (BD) na instalação de citometria de fluxo Síckids/UHN. Os dados foram analisados usando o software FlowJo (Tree Star).

[0161] Ensaio Aldefluor [0162] O ensaio aldefluor™ (STEMCELL Technologies) foi realizado de

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55/58 acordo com a instrução fornecida pelo fabricante. Resumidamente, os EBs dos dias 2-6 foram dissociados conforme descrito acima. As células foram coradas numa concentração de 2x106 células/m! no tampão do ensaio aldefluor contendo 0,1 % BSA e substrato BAAA (0,12 mg/ml) por 60 min a 37 graus C. O inibidor da aldeído desidrogenase DEAB (0,75nM) foi adicionado à amostra de controle negativo. As células foram lavadas com meios frios consistindo em IMDM com 5% FCS e 10% tampão do ensaio aldefluor. As células foram então coradas com anticorpos para marcadores de superfície celular nas concentrações indicadas acima em meios de lavagem frios por mais 20 min a 4 graus C. As células coradas foram analisadas conforme descrito acima. Durante as análises, as células foram mantidas em meios de lavagem frios. Para a seleção celular, FCS foi substituído por reposição de soro KnockOutTM (ThermoFisher) para evitar qualquer Impacto das citocinas contidas no soro sobre as diferenciações celulares. As células foram mantidas em StemPro-34 contendo 10% de tampão do ensaio aldefluor por todo o procedimento de seleção. As células separadas foram coletadas e re-agregadas em StemPro-34 contendo inibidor de ROCK (10 μΜ), IWP2 (0,5 μΜ) e rhVEGF (5ng/ml).

[0163] Imunohistoquímica [0164] Os EBs no dia 20 foram dissociados, conforme descrito acima, e as células foram plaqueadas em lâminas de 12mm (VWR) pré-revestidas com matrigel (25% v/v, BD). As células foram cultivadas por 3-5 dias para permitir a formação de monocamadas de células aderentes. As células foram fixadas com [0165] 4% PFA em PBS por 10 min em temperatura ambiente e permeabilizadas com PBS contendo 0,3% TritonX, 200mM Glicina (Sigma) por 20 min em RT. As células foram bloqueadas com PBS contendo 10% FCS, 0,1 % TritonX, e 2% BSA. Os seguintes anticorpos foram usadas para coloração:antiisoforma cardíaca de CTNT de camundongo (ThermoFisher Scientific, 1:200), anti-cadeia leve de miosina 2 humana/de roedor de coelho (Abeam, 1 :200), antiCOUPTF-II humano de camundongo (R&D, 1:1000), ou anti-CTNT humano de coelho (Genway Biotech Inc., 1:1000). Para detecção de anticorpos primários não conjugados, os seguintes anticorpos secundários foram usados: anti-lgG-A647 de

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56/58 camundongo de burro (ThermoFisher, 1: 1000), ou anti-lgG-A555 de coelho de burro (ThermoFisher, 1:1000). As informações detalhadas sobre anticorpo estão descritas na Tabela de Recursos Principais. As células foram coradas com anticorpos primários em tampão de coloração consistindo em PBS com 0,1% TritonX, e 0,1% BSA durante a noite em 4 graus C. As células coradas foram lavadas com tampão de coloração por 15 min em RT em um agitador orbital. As células foram, em seguida, coradas com anticorpos secundários em tampão de coloração por 1 h em RT seguido por uma etapa de lavagem, conforme descrito acima. As amostras foram montadas usando o reagente SlowFade Gold Antifade com DAPI (ThermoFisher). As células coradas foram analisadas usando um microscópio confocal de varredura a laser Olympus FluoView 1000. O software FV10-ASW foi usado para aquisição das imagens.

[0166] PCR Quantitativa em Tempo Real [0167] O RNA total de populações derivadas de hPSC foi isolado usando o kit RNAqueous-micro, incluindo tratamento com DNase livre de RNase (Ambion). O RNA do tecido ventricular e atrial dissecado de corações fetais humanos foi isolado usando o método TRIzol (ThermoFisher) e tratado com DNase (Ambion). Entre 100ng e 1 mg do RNA isolado foi transcrito reversamente em cDNA usando primers oligo (dT) e hexâmeros aleatórios e Superscript III Reverse Transcriptase (ThermoFisher). QRT-PCR foi realizado em um EP Real- Plex MasterCycler (Eppendorf) usando o kit QuantiFast SYBR Green PCR (QIAGEN), Todos os experimentos foram preparados em duplicatas e incluíam uma série de diluição de 10 vezes de padrões de DNA genômico humano sonicados variando de 25ng/ml a 2,5pg/ml para avaliação da eficiência da reação de PCR e do número de cópias de cada gene em relação ao gene de manutenção (house keeping) TBP. Mapas de calor (heatmaps) dos dados de expressão gênica foram gerados usando o software de código aberto MultiExperiment Viewer (MeV).

[0168] Patch Clamp [0169] Para a caracterização eletrofisiológica usando patch clamp, EBs foram dissociados e cardiomiócitos NKX2-5+SIRPa+CD90- foram isolados por FACS, conforme descrito acima. As células isoladas foram suspensas em meios

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StemPro-34 complementados com inibidor de ROCK (10mM) a 1,25-5x105 células/ml e filtradas através de um filtro de 70mm. Gotas de 40ul desta suspensão celular foram aplicadas a lamínulas de vidro (3x5mm) que foram prérevestidas com Matrigel (10% v/v) em placas de 30mm. As células foram incubadas no volume de 40 mL por 16-18h para facilitar a fixação celular. As placas foram então submersas com 2ml de meios StemPro-34. Os meios foram trocados a cada 4 dias. As culturas foram usadas para registros de patch clamp entre 7 a 14 dias após o plaqueamento. Os APs e as correntes de membrana foram medidos usando técnicas de patch-clamp padrão em modos de fixação de corrente e de voltagem (current- and voltage-clamp), respectivamente (Axopatch 200B, Molecular Devices). As voltagens e correntes foram registradas com taxa de amostragem de 5KHz (DigiData, Molecular Devices) e analisadas com software pCLAMP (Molecular Devices). Microeletrodos de vidro borossilicato foram usados com resistências de ponta de 2-5MU, quando preenchidos com solução da pipeta. As resistências em série foram compensadas por rv70%. Os APs e as correntes de membrana foram registradas em RT usando o método de patch rompido de célula inteira com a seguinte solução de banho (mM): NaC1140, KCI 5,4, CaCI2 1,2, MgCI2 1, glicose 10, e HEPES 10 (pH 7,4, ajustado com NaOH). A solução da pipeta consistia em (mM): aspartato de potássio 120, KCI 20, NaCI 5, MgATP 5 e HEPES 10 (pH 7,2, ajustado com KOH).

[0170] Em cardiomiócitos quiescentes, os APs foram provocados por pulsos de corrente despolarizante de 1-3 ms de duração de 5-15 pA numa frequência de 1 Hz. APs espontâneos e estimulados foram classificados com base nos seguintes parâmetros; tipo marca-passo: dv/dtmax < 10 V/s, tipo atrial: dv/dtmax R 10 V/s e APD30/90 < 0,3, tipo ventricular: dv/dtmax R 10 V/s e APD30/90 R 0,3. A corrente de potássio ativada por acetilcolina (IKACh) foi caracterizada como uma corrente sensível à CCh (ativada por CCh). As correntes foram medidas antes e após a adição de carbacol (CCH, 10mM) em resposta a um protocolo de declínio de voltagem de 350ms variando de 20mV a -120mV a partir de um potencial mantido de ~40mV (ver material interno do protocolo de voltagem no sinal de corrente original respectivo). IKACh foi quantificada por

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58/58 subtração da corrente registrada sem CCh a partir da corrente registrada na presença de CCh.

[0171] QUANTIFICAÇÃO E ANÁLISE ESTATÍSTICA [0172] Todos os dados estão representados como média ± erro padrão da média (SEM). Os tamanhos de amostra indicados (n) representam replicatas biológicas, incluindo replicatas de cultura celular independentes e amostra de tecido individuais. Para dados de célula única (dados de quantificação de taxa de batimento e patch-clamp), o tamanho das amostras (n) representa o número de células analisadas a partir de três experimentos independentes R. Nenhum método estatístico foi usado para predeterminar o tamanho da amostra. Devido à natureza dos experimentos, a randomização não foi realizada e os pesquisadores não foram cegos A significância estatística foi determinada usando o teste t de Student (não pareado, com duas caudas) no software GraphPad Prism 6. Os resultados foram considerados como significativos em p < 0,05 (7#) e muito significativos em p < 0,01 (*7##). Todos os parâmetros estatísticos foram relatados nas respectivas figuras e legendas das figuras.

[0173] Embora as modalidades preferenciais da invenção tenham sido descritas neste documento, será entendido pelos versados na técnica que variações podem ser feitas à mesma, sem se desviar do espírito da invenção ou do escopo das reivindicações anexas. Todos os documentos divulgados neste documento, incluindo aqueles na seguinte lista de referência, estão incorporados por referência.

Claims

1. População de cardiomiócitos enriquecidos para cardiomiócitos ventriculares, sendo a referida população caracterizada pelo fato de que é essencialmente livre de células marca-passo.

2. População, de acordo com a reivindicação 1, sendo a referida população caracterizada pelo fato de que é desprovida de células marca-passo.

3. Composição farmacêutica para tratamento da insuficiência cardíaca ou infarto do miocárdio em um paciente, sendo a composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende a população de cardiomiócitos, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, e um carreadorfarmaceuticamente aceitável.

4. Método de produção de uma população de cardiomiócitos enriquecidos para cardiomiócitos ventriculares, sendo o método caracterizado pelo fato de que compreende:

incubação de células-tronco pluripotentes em meio de indução do mesoderma, com o referido meio de indução do mesoderma compreendendo um componente BMP e uma quantidade eficaz de um componente de activina suficiente para gerar o mesoderma ventricular; e, após isso, cultura das referidas células incubadas em meio(s) adequado(s) para gerar uma população de cardiomiócitos enriquecidos para cardiomiócitos ventriculares.

5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a concentração do componente de activina é maior que a concentração do componente BMP.

6. Método, de acordo com a reivindicação 4 ou 5, caracterizado pelo fato de que a razão entre o componente BMP e o componente de activina é de cerca de 0,3-1:1, cerca de 0,5:1, ou cerca de 0,8:1.

7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 6, caracterizado pelo fato de que a concentração do componente de activina é determinada pela medição do nível de células do mesoderma que expressam CD235a e pela comparação deste ao nível de células do mesoderma que expressam RALDH2.

8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 7,

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1/7 caracterizado pelo fato de que a concentração do componente de activina é escolhida pela determinação de uma concentração que resulta, preferencial mente, em mais células do mesoderma que expressam CD235a em comparação às células do mesoderma que expressam RALDH2.

9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 8, caracterizado pelo fato de que o componente de activina é adicionado em uma quantidade de cerca de 4 ng/ml a cerca de 20 ng/ml.

10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 9, caracterizado peto fato de que a concentração do componente de activina está entre 6 - 20ng/ml.

11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 10, caracterizado peto fato de que a concentração do componente BMP está entre cerca de 3ng/ml a cerca de 20ng/ml.

12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 11, caracterizado pelo fato de que a concentração do componente BMP é de 5ng/ml ou 10ng/ml.

13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 12, caracterizado pelo fato de que a concentração do componente de activina é de 12 ng/ml.

14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 13, caracterizado pelo fato de que o referido componente BMP é BMP4,

15. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 14, caracterizado pelo fato de que o referido componente de activina é activina A.

16. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 15, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma porção da referida população de cardiomiócitos gerada é usada para tratar um sujeito em necessidade de reparo cardíaco.

17. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o sujeito em necessidade de reparo cardíaco tem risco de insuficiência cardíaca, sofre de insuficiência cardíaca e/ou sofre de um evento de infarto do miocárdio.

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18. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado peto fato de que o referido tratamento é antes, durante ou após um evento de infarto do miocárdio.

19. Método de produção de uma população de cardiomiócitos enriquecidos para cardiomiócitos atriais, sendo o método caracterizado pelo fato de que compreende:

incubação de células-íronco pluripotentes em meio de indução do mesoderma, com o referido meio de indução do mesoderma compreendendo um componente BMP e uma quantidade eficaz de um componente de activina suficiente para gerar o mesoderma atrial; e, após isso, adição de um componente de ácido retinoico às células, em que a referida adição do componente de ácido retinoico ocorre durante ou após a incubação no meio de indução do mesoderma; e cultura das células incubadas para que uma população de cardiomiócitos enriquecidos para cardiomiócitos atriais seja gerada.

20. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o referido componente de ácido retinoico é adicionado quando as referidas células são positivas para RALDH2 e negativas para CD235a.

21. Método, de acordo com a reivindicação 19 ou 20, caracterizado peto fato de que a razão entre o componente BMP e o componente de activina é de cerca de 1,5 a 1 ou superior.

22. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 21, caracterizado pelo fato de que a razão entre o componente BMP e o componente de activina é de 3:2.

23. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 22, caracterizado pelo fato de que o componente BMP está presente numa concentração de cerca de 3 ng/ml a cerca de 100 ng/ml.

24. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 23, caracterizado pelo fato de que o componente BMP está presente em uma quantidade de cerca de 3ng/ml.

25. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 24,

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1/7 caracterizado pelo fato de que o componente de activina está presente em uma quantidade de cerca de 0,01 ng/ml a cerca de 6 ng/ml.

26. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 25, caracterizado pelo fato de que o componente de activina está presente em uma quantidade de cerca de 2ng/ml.

27. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 26, caracterizado pelo fato de que o componente de ácido retinoico é ácido transretinoico ou retinol.

28. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 27, caracterizado pelo fato de que o componente de ácido retinoico é adicionado em uma concentração de entre 50nm e 5μΜ.

29. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 28, caracterizado pelo fato de que o componente de ácido retinoico é adicionado em uma concentração de 500nM.

30. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 29, caracterizado pelo fato de que o componente BMP é BMP4.

31. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 30, caracterizado pelo fato de que o componente de activina é Activina A.

32. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 31, caracterizado pelo fato de que o componente BMP é adicionado ao meio de indução do mesoderma após um dia.

33. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 31, caracterizado pelo fato de que o componente de activina é adicionado ao meio de indução do mesoderma após um dia.

34. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 33, caracterizado pelo fato de que o componente de ácido retinoico é adicionado aproximadamente do dia 3 ao dia 5 do método.

35. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 34, caracterizado pelo fato de que o componente BMP adicional não é adicionado ao meio de Indução do mesoderma no dia 3 do método.

36. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 35,

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1/7 caracterizado pelo fato de que um inibidor de FGF é excluído do meio de indução do mesoderma no dia 3 do método.

37. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 36, caracterizado pelo fato de que compreende ainda:

incubação das células-tronco pluripotentes em um meio adequado para a formação do agregado e/ou do corpo embrioide, antes da incubação das célulastronco pluripotentes no meio de indução do mesoderma.

38. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 37, caracterizado pelo fato de que as células produzidas pelo método são utilizadas em um ensaio in vitro para triar potenciais compostos terapêuticos.

39. População isolada de cardiomiócitos enriquecidos para cardiomiócitos atriais, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos ou cerca de 50% de cardiomiócitos atriais, pelo menos ou cerca de 60% de cardiomiócitos atriais, pelo menos ou cerca de 70% de cardiomiócitos atriais, pelo menos ou cerca de 80% de cardiomiócitos atriais, ou pelo menos ou cerca de 90% de cardiomiócitos atriais.

40. População de cardiomiócitos, de acordo com a reivindicação 39, sendo a referida população caracterizada pelo fato de que é obtida de acordo com o método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 38.

41. População isolada de cardiomiócitos enriquecidos para cardiomiócitos ventriculares, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos ou cerca de 50% de cardiomiócitos ventriculares, pelo menos ou cerca de 60% de cardiomiócitos ventriculares, pelo menos ou cerca de 70% de cardiomiócitos ventriculares, pelo menos ou cerca de 80% de cardiomiócitos ventriculares, ou pelo menos ou cerca de 90% de cardiomiócitos ventriculares.

42. População, de acordo com a reivindicação 41, sendo a referida população caracterizada pelo fato de que é essencial mente livre de células marca-passo ou desprovida de células marca-passo.

43. População, de acordo com a reivindicação 41 ou 42, sendo a referida população caracterizada pelo fato de que é obtida de acordo com o método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 17.

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44. Método de tratamento de um sujeito em necessidade de reparo cardíaco, caracterizado pelo fato de que compreende a administração, ao sujeito, da população de cardiomiócitos, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1,2, ou 41-43.

45. Método, de acordo com a reivindicação 44, caracterizado pelo fato de que o referido sujeito tem risco de insuficiência cardíaca, sofre de insuficiência cardíaca e/ou sofreu um evento de infarto do miocárdio.

46. Método, de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo fato de que o infarto do miocárdio se dá no ventrículo do paciente.

47. População de cardiomiócitos, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, ou 40 a 42, caracterizada pelo fato de que é para uso no tratamento de um sujeito em necessidade de reparo cardíaco.

48. Uso da população de cardiomiócitos, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, ou 41 a 43, caracterizado pelo fato de que se aplica na preparação de um medicamento para o tratamento de um sujeito em necessidade de reparo cardíaco.

49. Processo para detecção de mesoderma atrial em uma população de células do mesoderma, caracterizado pelo fato de que compreende a detecção de RALDH2, em que uma presença de RALDH2 é indicativa de mesoderma atrial.

50. Processo para detecção de mesoderma ventricular em uma população de células do mesoderma, caracterizado pelo fato de que compreende a detecção de CD235a, em que uma presença de CD235a é indicativa de mesoderma ventricular.

51. Método para produção de uma população de cardiomiócitos enriquecidos para células marca-passo do nó sinoatrial ou células epicárdicas, sendo o método caracterizado pelo fato de que compreende:

incubação de células-tronco pluripotentes no meio de indução do mesoderma, com o referido meio de indução do mesoderma compreendendo ainda um componente BMP e um componente de activina em quantidades suficientes para gerar um mesoderma ALDH+/CD235-; e, após isso, cultura das referidas células incubadas no(s) meio(s) adequado(s) com um

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1/7 ou mais dentre WNT, FGFi e BMP para gerar uma população de cardiomiócitos enriquecidos para células marca-passo do nó sinoatrial ou células epicárdicas.

52. População de cardiomiócitos caracterizada pelo fato de que é produzida pelo método, de acordo com a reivindicação 51.

53. Método de triagem ou avaliação de potencial toxicidade cardíaca de um composto ou agente de teste, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de exposição de uma população de cardiomiócitos, de acordo com qualquer uma das reivindicações de população celular anterior, ao composto de teste e avaliação da viabilidade, contratílidade, alterações de potenciais elétricos e/ou outras funcionalidades das células.