KR20190085249A

KR20190085249A - 히알루론산-젤라틴 중합체를 포함하는 유착방지용 조성물

Info

Publication number: KR20190085249A
Application number: KR1020180003139A
Authority: KR
Inventors: 박용일; 김성철; 김준일; 김성욱
Original assignee: 가톨릭대학교 산학협력단
Priority date: 2018-01-10
Filing date: 2018-01-10
Publication date: 2019-07-18

Abstract

본 발명은 히알루론산-젤라틴 중합체을 포함하는 유착방지용 조성물에 관한 것이다.

Description

히알루론산-젤라틴 중합체를 포함하는 유착방지용 조성물 {Compositions for the prevention of tissue adhesion comprising a hyaluronic acid-gelatin polymer}

본 발명은 히알루론산-젤라틴 중합체를 포함하는 유착방지용 조성물에 관한 것이다.

최근 급격한 평균수명의 증가와 세계 최저의 출산 등으로 노인 인구가 빠른 속도로 증가하고 있으며, 이에 비례해서 외과적 수술이 수반되는 각종 혈관계 및 소화기계 질환이 실질적으로 크게 증가하고 있다. 특히 수술을 요하는 암, 뇌혈관 및 심장 질환은 현재 한국인 사망원인 중 1-3위를 차지하고 있다. 이로 인하여 수술 후 빈번히 발생되는 조직 유착(tissue adhesion)에 따른 합병증의 방지를 위한 유착방지제의 개발이 급증하고 있다.

유착(adhesion)은 보통 염증의 치유 과정에서 볼 수 있는 것으로, 육아조직이나 반흔(scar)을 형성할 때 서로 엉겨 붙거나, 다량으로 석출(析出)되는 섬유소가 엉겨 이 같은 현상을 일으킴. 일반적으로, 개복수술 후 67~93%정도의 빈도로 유착이 발생하며 이 중 일부는 자발적으로 분해되기도 하지만, 대부분의 경우 상처 치유 후에도 유착이 존재하여 수반되는 증상으로는 환자의 통증과 장기의 기능장애(장폐색, 불임 등)가 있으며 이로 인해 복잡하고 위험한 재수술이 필요한 실정임. 유착방지제는 창상피복제의 한 종류로 심부체강창상피복제를 유착방지제라 부른다. 유착방지제는 이러한 유착현상을 방지하기 위해 수술 후 유착이 우려되는 부위에 삽입하여 조직 간의 유착현상을 막는 ‘차단벽’역할을 하는 의료기기를 말하며 대표적인 유착방지제의 성분으로는 히알루론산(hyaluronic acid), 알긴산, CMC가 있다.

유착과 관련된 약물 제제로는 유착 형성을 방지하는 섬유소용해제(fibrinolytic agent), 항응고제, 항염증제, 감염 방지를 위한 항생제, 기타 호르몬제 등이 사용되며 유착방지막은 고형 (내인성 및 외인성), 액체형, 그리고 겔 형 등이 있다. 수술 후 유착 방지는 합병증을 줄일 수 있는 매우 중요한 요인이므로 이를 위해 세심한 수술적 방법과 유 착방지제가 사용되고 있으나 현재 유착방지의 효과가 아주 뛰 어난 독보적인 제품은 없는 실정이다. 따라서 각각의 환자에게 맞는 적절한 유착방지법의 사용이 중요하며 최신 수술 술기와 더불어 유착 방지제의 정보 습득에 대한 관심이 필요하다.

현재 사용되고 있는 유착방지법은 크게 세 가지로 분류되는데 첫째, 수술 시 섬세한 주의와 불필요한 시술로 인한 조직 손상과 이물질에 의한 유착을 최소화하는 방법이며 둘째, 염증성 반응과 유착 형성에 필요한 병리 생리학적 과정에서 유착기전에 근거하여 약물치료로 억제하는 것, 마지막으로 수술 후 유착방지막(anti-adhesion barrier)을 사용하여 상처 부위를 감싸거나 덮어줌으로써 주변조직과의 접촉을 차단시켜 유착을 방지하는 방법으로 임상에서 널리 사용되고 있으며 그 중요성이 부각되고 있는 실정임. 훌륭한 수술기법은 유착형성을 줄일 수는 있지만 없앨 수는 없는 한계점이 있으므로 따라서 수술 후 유착방지제의 사용을 고려해야한다. 일반적으로 필름 형태의 제품으로 판매되고 있으나 얇은 필름을 펴는 것이 쉽지 않고 한 개의 제품을 다른 부위에 나누어 사용하는 것이 어려운 실정임으로 이에 따라 개발된 것이 젤 형태의 제품이며 수술부위에 주사기를 이용하여 사용하도록 되어있다. 젤 제품의 특성상 흘러내릴 수 있기 때문에 유착방지제로 이용하기 위해서는 어느정도의 점성이 필요하다.

현재 사용되어지는 유착방지제재에서 용액 형태의 유착방지용 제재는 점도가 높다하더라도 체내에서 흘러 내려 상처에 정확히 도포되기 어려우며 유착방지 기능을 하기 전에 다른 부위로 흘러 들어가거나 너무 일찍 분해되는 경우가 있어 유착방지 기능을 제대로 하지 못하는 경우가 많다는 단점이 있다. 필름 및 멤브레인 형태의 유착방지막은 임상적으로 가장 효과가 뛰어나다고 입증되었으며 많이 상용화 되어 있는 실정이지만 이 제품들은 내부 장기 적용 시 장기 표면에 잘 부착되지 않고 부착되더라도 장기의 운동으로 인해 상처부위에 지속적으로 정확하게 위치하지 못한다는 문제점 및 조직 자체에서 이물질로 인식되어 서로 뭉쳐짐으로써 장기 유착 방지 효과가 미흡한 것으로 보고되고 있다. 그러나 이러한 단점에도 불구하고 유착방지 의 원리 중 하나인 물리적 장벽을 확실히 제공할 수 있는 형태라는 점에서 이를 대체할 수 있는 제품이 아직은 확실하게 없는 것이 현실이다. 이에 따라 필름과 멤브레인 형태의 생체재료를 활용한 새로운 특성과 형태의 제품이 개발되어야 할 필요성이 있다.

유착방지막으로서 적합한 재료는 안전하고 효과가 있어야 하고 염증반응이나 면역 반응을 일으키지 않아야 하며 봉합이 필요 없고 혈액 내에서도 활성이 유지되어야 한다. 또한 손상 조직의 치유기간 동안 남아 있으면서 유착을 방지하는 작용을 하다가 일정 기간이 지난 후 분해 또는 흡수되어 별도의 제거가 필요 없고 복강경 수술 및 개복 수술을 통해 상처 부위에 적용이 용이해야 하고 분해 및 대사를 통한 배출물질 역시 인체에 무해하며 생체적합성이 뛰어나야 되는 재료를 필요로 한다.

히알루론산(Hyaluronic Acid)은 생체에 존재하는 고분자로써 D-glucuronic acid와 N-acetylglucosamine의 반복단위로 구성된 음이온계 다당류로 고분자, 친수성, 점탄성을 나타내며, 이러한 특성으로 인해 점막표면을 코팅하여 윤활작용을 타나낼 수 있고 인체의 결합조직, 상피 및 신경조직 등에 고루 분포되어 있는 높은 생체적합성을 가지는 안전한 생체재료로써 산업적으로는 정형외과, 안과, 피부과, 성형외과, 상처치료, 약물전달시스템, 화장품, 건강식품 등 다양한 응용 범위를 가지고 있다. 하지만, 히알루론산 단일물질을 이용하여 만들어지는 멤브레인은 생분해를 조절하기 힘들다. 이를 해결하기 위해서 폴리에텔렌옥사이드, 키토산, 등 기타물질과의 중합체를 형성하여서 빠른 생분해를 방지한다. 본 발명에서는 생체적합성이 우수한 것으로 알려진 젤라틴을 이용하여 이를 해결하고자 하였다.

전술한 바와 같이 히알루론산이 가지고 있는 유착방지 효능을 바탕으로 본 발명자들은 히알루론산에 젤라틴을 접목한 중합체를 이용하여 신규 유착방지 멤브레인을 제작하였고, Fibroblast에서의 유착방지 효능이 있음을 확인하였다. 이를 토대로 본 중합체를 이용하여, 기존의 유착방지제와는 다른 새로운 형태의 유착방지 멤브레인을 제작하였다.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로, 본 발명자들은 생체내에서 뛰어난 유착방지 효능을 가지는 히알루론산에 젤라틴을 가교하여 지속성이 뛰어나면서 유착방지 효능을 가지는 히알루론산-젤란틴 중합체를 제조하였고, 상기 중합체를 전기방사하여 신규한 유착 방지 멤브레인을 제작하였다. 상기 유착 방지 멤브레인이 섬유아세포에서의 독성이 없으며, 뛰어난 유착방지 효능을 가지는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기와 같은 본 발명의 과제를 달성하기 위해서, 본 발명의 목적은 히알루론산 및 젤라틴에 가교제를 이용하여 제조한 히알루론산-젤라틴 중합체를 포함하는 유착방지용 조성물을 제공하는 것이다.

상기 가교제는 BDDE(1,4-Butanediol diglycidyl ether) 또는 DVS(Divinyl Sulfone)일 수 있고, 바람직하게는 BDDE(1,4-Butanediol diglycidyl ether) 일 수 있다.

상기 중합체는 섬유아세포에서 세포의 부착을 방지하는 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 히알루론산은 분자량이 5,345,095 Da일 수 있다.

상기 유착 방지용 조성물에 HPMC, Dextrin 및 Bromophenol blue로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상를 추가로 포함할 수 있다.

상기 유착 방지용 조성물은 히알루로니다아제(hyaluronidase)에 의해 생분해가 가능할 수 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 전술한 히알루론산-젤라틴 중합체를 전기방사하여 제조한 멤브레인을 제공하는 것이다.

상기 멤브레인은 섬유아세포에 독성이 없으며, 세포의 부착을 저해하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 히알루론산-젤라틴 중합체를 포함하는 유착방지 멤브레인은 섬유아세포에 대한 세포독성을 갖지 않으면서 생분해성 및 유착방지기능을 가지는 효과가 있다. 또한 히알루론산-젤라틴 중합체를 포함하는 유착방지 멤브레인은 조직의 유착을 효율적으로 막음과 동시에 젤라틴과 가교된 형태로 인하여 조직에서의 생분해성이 느려지기 때문에 체내에서의 체류시간이 길어지고 조직의 상처가 회복될 때까지 물리적 장벽을 유지하는 효과가 있다.

도 1은 히알루론산에 대한 섬유아세포의 세포독성 측정을 MTT assay와 LDH assay로 측정한 결과이다.
도 2는 히알루론산을 플루란(pullulan)을 표준물질로 설정하여 하여 분자량(Molecular weight)를 HPLC로 측정한 그래프와 분자량 표의 결과이다.
도 3은 히알루론산 유착 방지막에 대한 섬유아세포의 세포독성을 MTT assay로 측정한 결과이다.
도 4는 히알루론산 유착방지막에 대한 섬유아세포의 부착능을 DAPI 염색을 통해 형광현미경으로 찍은 사진 결과이다.
도 5는 히알루론산의 효소에 의한 분해정도를 DNS 환원당 정량법으로 확인한 결과이다.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

본 발명은 생체 내에서 뛰어난 유착방지 효능을 가지는 히알루론산에 젤라틴을 가교하여 히알루론산-젤라틴 중합체를 제조하였고, 상기 중합체를 이용하여 신규 유착방지 멤브레인을 제작하였으며, 섬유아세포에서 독성을 나타내지 않으며 유착방지 효능을 확인한 것 이다(도 3).

본 발명은 히알루론산 및 젤라틴를 가교제를 이용하여 제조한 히알루론산-젤라틴 중합체를 포함하는 유착방지용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 히알루론산은 동물 등의 피부에 많이 존재하는 생체 합성 천연 물질로서, 수산화기가 많기 때문에 친수성 물질이며, 동물 등의 피부에서 보습 작용을 한다. 다양한 상피세포에서 발현되어 있는 CD44단백질과 반응하여 다양한 생리적 작용을 조절한다. 본 발명의 히알루론산은 동물조직으로부터 추출하거나, 발효법으로 제조한 것 등 그 기원에 상관없이 사용할 수 있으며, 히알루론산 분해효소(Hyaluronidase)에 의해 분해된 후 흡수되어 대사경로를 통해 제거된다. 본 발명의 히알루론산은 본 발명의 조성물 총 중량을 기준으로 약 0.1 ~ 약 3.0 중량%, 바람직하게는 약 1.0 ~ 약 2.2 중량%로 포함된다.

본 발명의 젤라틴은 동물의 가죽, 연골, 힘줄 등에 구성된 천연 단백질을 분해하고 정제함으로써 얻어지는 단백질의 일종이다. 이러한 생체유래 고분자는 상처부위의 유착방지 효과를 증대시킬 수 있도록 고분자 조성물의 부착성능을 향상시켜 상처부위에 고정됨으로써 다른 부위로 이동하지 않도록 해 준다. 본 발명의 젤라틴은 본 발명의 조성물 총 중량을 기준으로 약 0.1 ~ 약 10.0 중량%, 바람직하게는 약 1.0 ~ 약 2.0 중량%로 포함된다.

본 발명에서 용어, "유착 방지"란 염증, 창상, 마찰, 수술 등에 의한 창상 등 으로 조직 손상이 발생하여 생긴 상처의 치유과정에서 섬유조직이 과도하게 생성되거나, 혈액이 유출되어 응고하여 서로 분리되어 있어야 할 주변 장기 또는 조직이 서로 달라붙는 현상인 유착을 방지하는 것을 의미한다. 즉, 조직 주변의 혈관조직이 손상을 입어 혈액에 포함되어 있는 여러가지 호르몬과 사이토카인들에 의해 혈관내피세포, 섬유아세포, 근육섬유세포들이 성장하여 콜라겐을 중심으로 조직의 수복을 위해 엉키면서 발생하는 것을 저해하는 것을 말한다.

본 발명의 가교된 히알루론산-젤라틴은은 당업계의 어떠한 히알루론산 가교 방법에 의하여도 가교가 가능하며,바람직하게는 BDDE(1,4-Butanediol diglycidyl ether) 또는 DVS(Divinyl Sulfone)일 수있으며, 더욱 바람직하게는 BDDE(1,4-Butanediol diglycidyl)일 수 있다.

상기 히알루론산의 분자량은 5,345,095 Da일 수 있다.

본 발명은 또한 전술한 히알루론산-젤라틴 중합체를 전기방사하여 제조한 멤브레인을 제공할 수 있다.

실시예 1. Hyaluronic acid-gelatin 중합체를 이용한 멤브레인 제작

히알루론산 2 중량%과 젤라틴(Fish gelatin, Sigma, USA) 1 중량%을 0.1 mM의 BDDE(1,4-Butanediol diglycidyl) ether를 가교제로서 이용하여 전기방사하여 멤브레인을 제작하였다.

실시예 2. Hyaluronic acid에 대한 섬유아세포의 세포독성 측정

마우스 섬유아세포(L-929)에서 Hyaluronic acid의 세포독성 능력을 평가하기 위해 MTT (methylthiazolyldiphenyl tetrazolium bromide) assay와 LDH assay(Lactose dehydrogenase)를 하였다.

실시예 2-1 : Hyaluronic acid에 대한 섬유아세포의 세포독성 측정 (MTT assay)

10% 소태아혈청 (FBS; fetal bovine serum, Gibco, USA)과 1% Penicillin-Streptomycin (10,000 Units /μg Penicillin, 10,000 μg/μg Streptomycin, Hyclone, USA)이 포함된 DMEM with High Glucose 배양액 (Hyclone, USA)으로 세포를 배양하여 96-well plate에 2×104 cells/ml의 밀도로 36oC, 5% CO2의 조건에서 24시간 동안 배양하고 나서 Hyaluronic acid를 각 농도별 (Hyaluronic acid 0, 100, 200, 500, 1000 μg/ml)로 처리하고 다시 위와 같은 조건으로 24시간 동안 배양하였다. 24시간 뒤 배양액을 모두 LDH sample을 위해 따로 보관한 뒤 인산완충식염수 (PBS; phosphate buffer saline, Hyclone, USA)에 MTT시약 (3-[4,5-dimethyl-thiazol]-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide, Roch, Germany)을 0.5% 농도로 용해시켜 배양액과 1:5로 섞은 다음 각 well에 120 μl씩 첨가하여 4시간 동안 배양하였다. MTT용액을 모두 제거한 후 세포가 형성한 자색 비수용성 포마잔을 디메틸설폭사이드 (DMSO; dimethyl sulfoxide, Daejung, Korea) 100 μl를 첨가하여 녹여내고 microplate reader (Molecular devices, UK)로 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. (도1)

실시예 2-2 : Hyaluronic acid에 대한 섬유아세포의 세포독성 측정 (LDH assay)

LDH asssay를 위해 24시간 동안 배양한 이후 배양액을 따로 모아 LDH assay를 실시하였다. LDH Cytotoxicity Detection Kit(Takara, japan)을 이용하여 실험을 진행하였는데 배양액을 따로 EP tube에 옮긴 후 Centrifuge(13,000rpm, 4℃, 5min)하여 Cell debris를 침전시킨 후 supernatant를 100μl씩 96-well plate에 loading 한 후 Solution A(Catalyst)와 Solution B(Dye Solution)을 1:45로 섞은 Reaction mixture를 well당 100μl씩 첨가하여 빛을 차단한 상태로 30min동안 상온에서 반응시킨다. 이후 microplate reader (Molecular devices, UK)로 490 nm에서 흡광도를 측정하였다.

실시예 3. HPLC를 이용한 Hyaluronic acid 의 Molecular weight 측정

HPLC(Waters, USA)를 이용한 히알루론산의 분자량 측정은 Shodex OHpak SB-806 HQ (MW: 1x~2 x Da, 8.0 x 300mm, Showa, Japan)과 RID (refractive index detecto)(Waters, USA)를 사용하여 확인하였다. Standard로는 1% Pullulan (Sigam, USA, M.W. : 48,800, 113,000, 200,000, 366,000, 805,000)을 사용하였으며. 0.1% Hyaluronic acid를 0.1M NaCl에 녹여서 측정하였다. 용출용매는 0.1M NaCl를 사용하였으며 flow rate는 1.0 mL/min으로 하여 분석하였다. 측정결과 분자량은 약 5,345,095 Da의 고분자 히알루론산인 것을 확인하였다.

실시예 4. Hyaluronic acid-gelatin membrane에 대한 섬유세포의 부착능 측정

실시예 4-1 : membrane에 대한 섬유아세포의 부착능 확인 (MTT assay)

마우스 섬유아세포(L-929)의 Hyaluronic acid-gelatin membrane에 대한 부착능을 평가하기 위해 MTT(methylthiazolyldiphenyl tetrazolium bromide) assay와 DAPI(4‘,6’-diami

dine-2'-phenylindole dihydrochloride) 염색을 실시 하였다. MTT assay의 경우 세포독성 측정 실험과 같이 진행하였다. 다만 세포를 96-well plate에 1×10₄cells/ml, 2×10₄cells/ml의 밀도로 36℃, 5% CO₂의 조건에서 24시간 동안 배양하였는데 plate의 바닥에 membrane을 부착하여 섬유아세포가 membrane에서만 증식이 되도록 유도하였다. 24h 동안 증식시킨 후 양액을 모두 제거하고 인산완충식염수 (PBS; phosphate buffer saline, Hyclone, USA)에 MTT시약 (3-[4,5-dimethyl-thiazol]-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide, Roch, Germany)을 0.5% 농도로 용해시켜 배양액과 1:5로 섞은 다음 각 well에 120 μl씩 첨가하여 4시간 동안 배양하였다. MTT용액을 모두 제거한 후 세포가 형성한 자색 비수용성 포마잔을 디메틸설폭사이드 (DMSO; dimethyl sulfoxide, Daejung, Korea) 100 μl를 첨가하여 녹여내고 microplate reader (Molecular devices, UK)로 570 nm에서 흡광도를 측정함으로써 세포의 농도를 저농도와 고농도로 배양하였을 때 그 차이를 비교하였다.

실시예 4-2 : membrane에 대한 섬유아세포의 부착능 확인 (DAPI staining)

membrane에 붙어있는 cell을 육안으로 확인하기 위해 DAPI(4‘,6’-diamidine-2'-phenylin

dole dihydrochloride) 염색을 실시하였다. 8well slide 에 1×104 cells/ml, 2×104 cells/ml의 밀도로 36℃, 5% CO₂의 조건에서 24시간 동안 배양한 후 배양액을 모두 제거하고 인산완충식염수 (PBS; phosphate buffer saline, Hyclone, USA)로 washing작업을 거친 뒤 4% Paraformaldehyde (Intron, Korea) 100 μl를 첨가하여 30min 동안 세포 고정을 시킨다. 이후 인산완충식염수 (PBS; phosphate buffer saline, Hyclone, USA)로 washing한 뒤 인산완충식염수 (PBS; phosphate buffer saline, Hyclone, USA)에DAPI(4‘,6’-diamidine-2'-phenylindole dihydrochloride, sigma, USA)시약을 300nM로 용해시켜 각 well에 100 μl씩 첨가하여 1?5 min 동안 빛을 차단한 상태로 배양하였다. 이후 DAPI시약을 모두 제거한 뒤 남아있는 DAPI시약을 제거하기 위해 PBS로 2~3번정도 wash한 뒤 형광현미경(ZEISS, Axio imager 2, USA)으로 membrane에 부착되어있는 cell을 관찰하였다.

실시예 5. Hyaluronic acid의 효소에 대한 분해정도 측정

membrane의 주 원료인 Hyaluronic acid에 대한 효소의 분해능을 측정하기 위해 효소처리 후 시간별로 히알루론산의 분해정도를 DNS 환원당 정량을 통하여 확인하였다. 효소반응은 1% Hyaluronic acid를 3% NaCl이 포함된 100mM Tris-Hcl(pH 7.0) 완충액에 용해시킨 후에 40unit/mL의 hyaluronidase (Hyaluronidase from bovine testes, simga, USA) 효소액을 첨가하여 30℃에서 반응시켰다. 이후 5분간격으로 sample중 일정량을 aliquot하여 80℃에 30분간 heating 작업을 하여 효소반응을 중지시킨 후 Cooling한 sample 200μl을 1% DNS(Dinitrosalicylic acid reagent solution) 2ml에 혼합한 뒤 100℃에서 10분간 반응시킨 뒤 환원당 값을 microplate reader (Molecular devices, UK)로 570 nm에서 흡광도를 측정하였다.

Claims

히알루론산 및 젤라틴를 가교제를 이용하여 제조한 히알루론산-젤라틴 중합체를 포함하는 유착방지용 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 가교제는 BDDE(1,4-Butanediol diglycidyl ether) 또는 DVS(Divinyl Sulfone)인, 유착 방지용 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 중합체는 섬유아세포에서 세포의 부착을 방지하는 것을 특징으로 하는, 유착 방지용 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 히알루론산은 분자량이 5,345,095 Da인, 유착 방지용 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 유착 방지용 조성물에 HPMC, Dextrin 및 Bromophenol blue로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상를 추가로 포함하는, 유착 방지용 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 유착 방지용 조성물은 히알루로니다아제(hyaluronidase)에 의해 생분해가 가능한, 유착 방지용 조성물.
히알루론산-젤라틴 중합체를 전기방사하여 제조한 멤브레인.
제 7항에 있어서, 상기 멤브레인은 섬유아세포에 독성이 없으며, 세포의 부착을 저해하는 것을 특징으로 하는, 멤브레인.