KR20190085068A - 도파민으로 관능화된 황산화 히알루론산 - Google Patents

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Abstract

아미드 결합을 통해 직접 콘쥬게이트되거나, 또는 히알루론산의 카르복실기와 아미드 결합의 형성을 위한 아미노기 및 도파민의 아미노기와 아미드 결합의 형성을 위한 카르복실기를 갖는 스페이서에 의해 콘쥬게이트된 도파민으로 관능화된, 2 내지 60 몰%, 바람직하게는 15 내지 35 몰%, 더 바람직하게는 20 내지　25 몰%의 카르복실기를 갖는 2 등급 황산화 히알루론산이 개시되어 있다.

Description

도파민으로 관능화된 황산화 히알루론산
본 발명은 아미드 결합에 의해 도파민으로 관능화된 황산화 히알루론산 (sulphated hyaluronic acids)에 관한 것으로서, 이는 직접 또는 적절한 스페이서 (spacer) 기를 통해 이루어질 수 있다. 본 발명의 화합물은 양전하를 갖는 이온화가능한 기를 갖는 약제, 구체적으로 항생제와 염을 형성한다. 본 발명의 또 다른 목적은 상기 염 및 일반적으로 생물체 또는 생체의학용 장치에 이식가능한 티타늄 관내인공삽입물 (titanium endoprostheses)을 코팅하기 위한 그의 용도에 관한 것이다.
히알루론산 (Hyaluronic acid: HA)은, D-글루쿠론산과 N-아세틸-D-글루코사민의 교대 잔기로 구성되고, 입수되는 공급처 및 사용된 제조 방법에 따라, 50000 내지 13 x 106 Da 범위의 분자량을 갖는 직쇄로 이루어진 헤테로폴리사카리드 (heteropolysaccharide)이다.
히알루론산은 실제로 인체에 편재되어 있고, 이는 구체적으로 피부, 힘줄, 근육 및 연골과 같은 많은 조직의 세포에 대한 기계적 지지체로서 중요한 역할을 한다. HA와 그의 CD44 막 수용체 및 오피오이드 (opioid) 수용체와의 상호작용이 또한 알려져 있다.
-OH 기가 황산으로 에스테르화된, O-황산화 HA 유도체가 알려져 있다. O-황산화는 알려져 있는 기술에 의해 수행될 수 있다 (예를 들어, EP702699 및 EP940410 참조); "황산화도 (degree of sulphation)"는 HA 이량체의 1몰당 술페이트 기의 몰 (DSmol)을 의미하고; 구체적으로
1 등급 황산화는 DSmol이 0.5 내지 1.5 범위인 것으로 정의된다;
2 등급 황산화는 DSmol이 1.5 내지 2.5 범위인 것으로 정의된다;
3 등급 황산화는 DSmol이 2.5 내지 3.5 범위인 것으로 정의된다.
일반적으로, HAS는 피부 장벽을 쉽게 가로지르므로, 이와 관련된 물질의 통과를 단순화하고, 그러므로 약리학적으로 및 생물학적으로 활성인 분자의 피부 흡수를 위한 우수한 담체이다.
또한 HAS가 약리학적 특성을 갖는 것이 밝혀졌고 (WO2010130468; WO2010130466): 이는 수 많은 전-염증성 및 항-염증성 시토킨 활성의 효과적인 조절에 의해 그의 작용을 수행하는 강력한 항-염증제이다. 그러므로 HAS는 시토킨 수준의 변화에 의해 매개된 질환 (류마티스 관절염, 천식, 전신 및 피부 자가면역 질환, 바이러스 감염, 아토피 피부염, 습진, 백반증, 림프종 등)의 치료에서 사용하기에 적합하다.
도파민 합성에서 아미노산 중간체인 DOPA (l-3,4-디히드록시페닐알라닌)는 신경전달물질로 알려져 있고, 또한 최근에 접착제 물질로 연구되었다. "미틸루스 에둘리스 풋 단백질 (Mytilus edulis foot proteins)" (Mefp, 구체적으로 Mefp-3 및 Mefp-5)로 불리는 단백질의 아미노산 조성 중에 유의한 농도의 DOPA 잔기가 발견되었고, 이는 통상 홍합으로 알려져 있는 미틸루스 에둘리스가 표면에 부착되는 육경 (peduncle)을 구성한다. DOPA의 중요 특성은 카테콜 기이고; 이는 높은 농도의 카테콜 유닛이 유리, 플라스틱, 세라믹, 및 금속 및 금속 산화물에 기반한 표면을 포함하는 여러 표면에 대한 부착을 촉진하는 중요한 역할을 한다는 것을 시사한다. 상기 부착이 일어나는 기전이 아직 완전히 이해되지는 않았지만, 상기 카테콜 기가 퀴논의 형태를 취할 때, 산성 매질 (pH=5) 및 알칼리 매질 (pH=8) 모두에서 부착이 일어나는 것으로 알려져 있다. 상기 도파민 유도체는 또한 동일한 특성을 가지고 있기 때문에, DOPA 및 도파민은 접착제 활성 측면의 과학 문헌에서 구별 없이 정의되고, 사용된다.
HA "그대로" 및 그의 황산화 형태 모두는, 금속 (통상적으로 티타늄) 및 폴리머 (예컨대 PU) 보철물 (prostheses)의 코팅에서 다른 폴리머와 조합하여 사용되어, 생체적합성 및 혈액적합성 (haemocompatibility)을 촉진한다 (EP1060204).
DOPA는 또한 금속 코어를 갖는 다른 분자 (통상적으로 폴리머)와의 결합을 촉진하기 위해 접착제로 이미 사용되어 왔다 (Lee et al., Adv Mat, 2008, 20, 4154-4157).
마지막으로, 금속 보철물은 폴리머로 콘쥬게이트된 DOPA로 코팅되고, 항생제에 결합하여, 이로 인해 박테리아 증식의 가능성을 감소시키는 예가 있다. 예를 들어, Lee 등 (Bone, 2012, 50, 974-982)은 DOPA가 헤파린으로 콘쥬게이트되고, 항생제 및 BMP2로 더 관능화되어 티타늄 치과 보철물의 골유착 (osseointegration)을 촉진시키는 것을 개시하였다. 헤파린은 콘쥬게이트를 전체적으로 음전하로 만드는 술페이트 기를 포함하여, 양전하를 갖는 항생제에 결합할 수 있기 때문에, 헤파린이 선택되었다. 그러나, 헤파린이 존재하면, 그의 잘-알려져 있는 항응고 활성이 문제가 되어 이식 중에나 이식 후에 비정상적인 출혈을 일으킬 수 있기 때문에 비판적이다.
황산화 히알루론산 (HAS) 및 도파민의 콘쥬게이트는 정전기적 상호작용에 의해 양전하를 갖는 생물학적으로 및/또는 약리학적으로 활성인 항생제 또는 분자를 흡착시키는데 유익하게 사용될 수 있다는 것이 밝혀졌다. 약제 또는 다른 활성의 화합물과 관능화된 HAS 및 도파민의 콘쥬게이트는 일반적으로 생체의학용 물품 (biomedical articles), 구체적으로 티타늄 보철물을 코팅하는데 사용되어, 이를 생체적합하게 하고, 특히 티타늄 보철물의 경우에, 이들이 이식되는 골기질 (bone matrix)과의 유착을 향상시킨다. 본원에 개시된 황산화 히알루론산 (HAS) 및 도파민의 콘쥬게이트는 콤팩트한 구조를 갖는 고전적인 티타늄 보철물 또는 뼈에 완벽하게 유착가능한, 다공성 (지주 (trabecular)) 가교된 구조를 갖는 최신 보철물과 사용될 때 특히 효과적인 것으로 입증되었다. 이식 후에, 본원에 개시된 콘쥬게이트로 처리된 지주 보철물은 생체적합성이고, 또한 그의 특정 구조에 기인하여, 세포에 의해 군집되고 뼈와 완벽하게 유착된다.
본 발명의 대상을 형성하는 황산화 히알루론산 (HAS) 및 도파민의 콘쥬게이트는 또한 임플란트로부터 유래되는 가능한 감염을 감소시키는데 주요 역할을 한다. 상기 후자의 측면은, 박테리아 성장 및 후속하는 생물막 (biofilm) 형성은, 인공 슬관절, 고관절 등의 일차적 이식 단계에서보다 보철물의 첫번째 검토 후에 주요 합병증으로 나타나므로, 이러한 사례의 5-40%는 제거를 필요로 하기 때문에 특히 중요하다. 보철물 제거를 초래하는 감염의 약 80%는 박테리아 생물막의 형성에 기인하는 것으로 추정된다.
상기 생물막은, 폴리사카리드 매트릭스에 캡슐화되고, 고형 생물학적 또는 비-생물학적 표면에 부착되는, 높은 박테리아 밀도로 미생물 (스타필로코쿠스 아우레우스 (Staphylococcus aureus), 에스 . 에피더미디스 (S. epidermidis), 에스 . 헤몰리티쿠스 (S. haemolyticus) 등)이 축적된 것으로, 통상적으로 항생제에 의한 전신 치료에 내성이 있다.
본 발명에 따라 사용된 황산화 히알루론산은 2 등급 (HAS2)로, 즉 HA 이량체 1몰당 술페이트 기의 몰 (DSmol)이 1.5 내지 2.5 범위에 있는 HAS이다.
직접 또는 스페이서를 통해 결합되는 도파민과 HAS2의 카르복실기의 관능화 (functionalisation) 퍼센트는, 직접 결합 및 간접 결합 모두에 대해 2 내지 60 몰% 범위에 있고; 이는 직접 결합하는 경우 바람직하게는 15 내지 40 몰%, 더 바람직하게는 20 내지 32 몰% 범위에 있고, 반면에 간접 결합하는 경우 바람직하게는 2 내지 20 몰% 범위에 있다.
도파민과 HAS2 사이의 결합은 아미드 타입이고, 반응식 A에 개시된 바와 같이 직접 결합 (HA의 COOH - 도파민의 NH2)일 수 있거나, 또는 스페이서가 도파민과 HAS 사이에 삽입될 때 간접 결합일 수 있고, 항상 아미드 결합을 통해 결합되어, 도파민과 관능화될 티타늄 표면의 상호작용을 최대로 하여, 이로 인해 HAS2의 입체 효과를 감소시킬 수 있다. 사용된 스페이서는 메틸렌 유닛 5 내지 10개, 바람직하게는 5 또는 10개 범위의 길이를 갖는 알킬 사슬 (반응식 B), 또는 화학식 HOOC-(CH2)n-O-[(CH2)2-O]m-(CH2)2-NH2의 폴리에틸렌 글리콜 사슬 (반응식 C)일 수 있다.
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
그러므로 스페이서는, 히알루론산의 카르복실기와 아미드 결합의 형성을 위한 아미노기, 및 도파민의 아미노기와 아미드 결합의 형성을 위한 카르복실기를 갖는다.
본 발명의 2 등급 황산화 히알루론산의 제조에 사용하기에 적합한 스페이서 화합물은 하기 화학식을 갖는다:
- HOOC-(CH2)n-NH2, 상기에서 n은 5 내지 10, 바람직하게는 5 또는 10의 정수이다;
- HOOC-CH2-(O-CH2-CH2)m-O-CH2-CH2-NH2, 상기에서 m은 1 또는 2이다.
상기 화합물들은 알려져 있거나 또는 알려져 있는 방법에 의해 제조될 수 있다.
HAS2와 도파민 사이의 반응은 아미드 결합의 형성을 위한 알려져 있는 조건, 예를 들어 카르보닐디이미다졸 (carbonyldiimidazole: CDI) 또는 디이미드와 같은 축합제의 존재하에 수행된다.
도파민이 스페이서를 통해 황산화 히알루론산에 결합하는 유도체의 제조를 위해, 먼저 도파민-스페이서 중간체를 합성하고, 그 다음에 상기 중간체를 HAS2와 콘쥬게이트시키는 것이 바람직하다. 아미노기가 적절하게 보호된 스페이서는 도파민 히드로클로리드와 기존의 축합제 및 염기의 존재하에 반응할 수 있다. 결과의 중간체는, 보호기를 제거한 후에, HAS2와 아미드 결합의 형성을 위해 상기에 개시된 조건하에 반응한다.
개시 (starting) 히알루론산은 임의의 알려져 있는 출처, 예를 들어 수탉 벼슬 (rooster combs)로부터의 추출 (EP138572), 발효 또는 생합성 (바실루스 (Bacillus)로부터, WO2012032154)에 의해 유래될 수 있고; 본 특정 사례에서 중량평균 MW 범위가 100,000 내지 250,000 Da, 구체적으로 180,000 내지 230,000 Da으로, 이후에 "MW 200 kDa"로 불리는 중량평균 MW를 갖는 HA로부터 제조되는 2 등급 HAS가 사용된다. 상기 제조는 알려져 있는 방법 (EP0702699; IT102015000073016)에 의해 수행되고, 실시예에 보고되어 있다.
본원에서 "평균 분자량 (Average molecular weight)" (MW)은 "고유 점도" 방법에 의해 산출되는, 중량-평균 MW를 의미한다 (Terbojevich et al., Carbohydr. Res., 1986, 363-377).
본 발명의 화합물은 약물 담체로서 또한 관내인공삽입물을 코팅하기 위해 사용될 수 있다.
주로 티타늄-기반 금속으로 제조되고, 콤팩트하거나 또는 지주 구조를 갖는 이식가능한 보철물은, 본 발명의 화합물의 용액을 상기 보철물에 분무하고, 선택적으로 그 후에 항생제 또는 생물학적으로 또는 약리학적으로 활성인 물질의 용액을 분무하여 간단하게 코팅하고, 생물막 형성에서 저해 효과에 대해 이미 알려져 있는, 성장 인자 (BMP-2; TGF1β; IGF) 또는 합성 분자 (예컨대 디클로페낙 (diclofenac) 산 형태)와 같이 양전하를 갖도록 적절하게 처리한다.
유용한 항생제로는 양전하를 갖는 것으로, 구체적으로 겐타마이신 (Gentamicin), 답토마이신 (Daptomycin), 반코마이신 (Vancomycin), 시프로플록사신 (Ciprofloxacin), 메로페넴 (Meropenem), 아미카신 (Amikacin), 토브라마이신 (Tobramycin), 폴리믹신 (Polymyxin), 콜리스틴 (Colistin) 및 바시트라신 (Bacitracin), 바람직하게는 겐타마이신, 콜리스틴 및 답토마이신이 있다.
상기 항생제는 도파민으로 관능화된 2 등급 황산화 히알루론산과 염을 형성한다. 상기 염 및 이들이 흡착되는 보철물은 본 발명의 부가의 목적이다.
본 발명의 HAS2-도파민 화합물은 종래 기술보다 하기의 이점을 갖는다:
Figure pct00004
분무가능하다. 종래 기술은 "접착제" 폴리머를 포함하는 용액 중에, 때로 장기간 (시간) 동안 상기 보철물을 침지시킬 것을 필요로 하지만, 본 발명은 수술실에서 조차도 간단히 직접 분무 적용하여 평편하고 균질한 피복, 전체적인 멸균 유지, 및 상기 보철물 이식 전에 부착 및 건조 시간의 유의한 감소, 또는 심지어 배제를 보장한다;
Figure pct00005
금속 보철물에 완벽하게 부착된다;
Figure pct00006
생체적합성이 있다;
Figure pct00007
골기질과의 유착을 촉진하는데 필요로 하는, 보철물의 표면 거칠기 (surface roughness)를 유지한다;
Figure pct00008
가장 잘 알려져 있는 기술 (베타선 또는 감마선 조사)에 의해 멸균가능하고, 멸균 후에, 그의 구조적 특성을 온전하게 유지하며 (도파민의 산화적 분해 없음), 그러므로 항생제와의 콘쥬게이트 후에, 또한 그의 생물학적 효능을 유지한다 (항박테리아 활성이 변화되지 않음). 이는, 필요할 때, 이식될 보철물을 HAS2-DOPA로 코팅하고, 멸균하고, 수술실에서 사용하기 전에 장시간 보관하고, 사용시에 항생제를 분무하며, 이러한 경우에 수술실에서 보철물 부착 및 건조 시간의 종료까지 기다릴 필요가 없다는 것을 의미하며, 이는 특히 장시간 수술의 경우에 중요하다;
Figure pct00009
골모세포 (osteoblast) 재생을 자극한다;
Figure pct00010
양전하를 갖는 항생제 (또는 일반적으로 활성 분자)와 정전기적 상호작용에 적합한 음전하 세트를 형성한다. 이렇게 하여, 박테리아 생물막의 형성이 방지 또는 강하게 제한되기 때문에 감염의 발병은 현저하게 감소된다;
Figure pct00011
술페이트 기를 포함하고 있어서 헤파린과 같은 효과는 거의 없고, 그러므로 비정상적인 출혈을 일으키지 않는다;
Figure pct00012
매우 효과적이고, 신속하고, 영구적인 방식으로 작용한다.
도 1: 미처리된 티타늄 실린더 표면의 ESEM 이미지 및 강조된 영역의 해당하는 XPS 스펙트럼.
도 2: 실시예 3의 유도체로 코팅된 티타늄 실린더 표면의 ESEM 이미지 및 강조된 영역의 해당하는 XPS 스펙트럼.
도 3: 실시예 3의 유도체로 처리되고 그 다음에 세척된 실린더 표면의 ESEM 이미지.
도 4: 겐타마이신으로 코팅된, 실시예 3의 HAS2-DOPA 또는 실시예 12의 HA-DOPA로 관능화된 티타늄 실린더에서 에스 . 아우레우스의 성장 저해를 나타내는 곡선.
도 5: 겐타마이신에 결합된 실시예 11의 헤파린-DOPA (HEPA-DOPA) 콘쥬게이트와 비교되는, 실시예 3의 HAS2-DOPA 콘쥬게이트의 항미생물 활성으로, CFU/mL로 표시됨.
도 6: 실시예 11의 HEPA-DOPA와 비교에 의해 실시예 6의 HAS2-DOPA의 항응고 효과.
도 7: 피브로넥틴과 비교에 의해 실시예 3 및 12의 HAS2-DOPA의 골모세포 증식에서의 효과.
제조예
2 등급 황산화 히알루론산과 도파민의 콘쥬게이트 (이후에 HAS2-DOPA라고 함)는 하기 두 단계로 합성된다: HAS2의 합성 단계 및 HAS2와 도파민 사이의 반응 단계. HAS2는, 차례로, 테트라부틸암모늄 (TBA; EP702699)으로 염화 (salified)되거나 또는 나트륨 (IT102015000073016)으로 염화된 HA로부터 제조될 수 있다.
실시예 1: HA-TBA로부터 HAS2의 제조
2.0 g d.m. (3.22×10-3 mol; 1 eq)의 HA- TBA+ (MW 200 kDa)를 200 mL의 DMSO에 용해시켰다. 용해가 완료되면, 3.59 g의 Pyr·SO3 (8 eq)을 첨가하였다. 밤새 실온에서 정치한 후에, 산물을 EtOH로 침전시켰고, 수득된 침전물을 여과하였고, EtOH로 2회 세척하였고, 150 mL의 탈이온수에 재용해시켰다; 8 mL의 NaCl 포화 용액 및 115 mL의 DMSO를 첨가하였고, pH를 3M NaOH로 3.4 ± 0.1로 수정하였다. 산물을 440 mL의 EtOH로 침전시켰고, 수득된 침전물을 여과하였고, EtOH/H2O 혼합물 (80:20) 및 EtOH로 세척하였고, 마지막으로 진공하에 37℃에서 건조시켰다.
실시예 2: HA-Na로부터 HAS2의 제조
4.0 g d.m. (9.96×10- 3 mol; 1 eq)의 HA- Na+ (MW 200 kDa)를 220 mL의 DMSO에 분산시켰고; 3.6 mL의 메탄술폰산 (5 eq)을 첨가하였고, 혼합물을 24시간 동안 실온에서 교반하에 두었다. 용해가 완료되면, 12.8 g의 Pyr·SO3 (8 eq)을 첨가하였다. 밤새 실온에서 정치한 후에 산물을 EtOH로 침전시켰고, 수득된 침전물을 Gooch에서 여과하였고, EtOH로 2회 세척하였고, 150 mL의 탈이온수에 재용해시켰고; 8 mL의 NaCl 포화 용액 및 115 mL의 DMSO를 첨가하였고, pH를 3M NaOH로 3.4 ± 0.1로 수정하였다. 산물을 440 mL의 EtOH로 침전시켰고, 수득된 침전물을 여과하였고, EtOH/H2O 혼합물 (80:20) 및 EtOH로 세척하였고, 마지막으로 진공하에 37℃에서 건조시켰다.
실시예 3: 23% 유도체화를 갖는 HAS2-DOPA 콘쥬게이트의 합성 (직접 결합)
실시예 2에서와 같이 제조되는 2.0 g d.m. (3.3×10- 3 mol, 1 eq)의 HAS2 나트륨 염을 100 mL의 탈이온수에 용해시켰고, 3.0 g의 벤잘코늄 클로리드 (BA+Cl-)를 개별적으로 100 mL의 탈이온수에 용해시켰다. 용해가 완료되면 BA+Cl- 용액을 HAS2 용액에 첨가하여, 침전물을 수득하였고, 이를 여과하였고, H2O, EtOH 그 다음에 아세톤에서 세척하였고, 회전 증발기에서 고진공하에 건조시켰다. 분리된 침전물을 160 mL의 DMSO에 용해시켰고; 그 다음에 0.267 g (0.5 eq)의 CDI 및 0.1 mL의 메탄술폰산 (0.5 eq)을 첨가하였다. 30분 후에, 40℃에서 교반하고, 0.5 g (0.8 eq)의 도파민 히드로클로리드를 첨가하였고, 상기 반응을 밤새 40℃에서 천천히 교반하면서 지속시켰다. 16 mL의 포화된 NaCl 용액을 다음 날 첨가하였고, 산물을 EtOH로 침전시켰다. 수득된 침전물을 여과시켰고, EtOH/H2O (85:15)로 구성되는 혼합물의 2 부피, 그 다음에 EtOH, 마지막으로 아세톤으로 세척하였다. 결과의 산물을 50 mL의 탈이온 H2O에 용해시켰고, 0.05 M 아세테이트 완충액 pH 5에서 3일 동안, 및 1 M HCl을 첨가하여 pH 5로 조정된 H2O에서 1일 동안 투석하였다 (Spectra/Por® 투석막, 커트-오프=12,000-14,000 Da).
투석 시간을 조절하여, GPC에 의해 투석막 중에 유리 도파민의 소멸을 확인하였다. 마지막으로, 투석된 산물을 동결 및 동결-건조시켰다.
실시예 4: 55% 유도체화를 갖는 HAS2-DOPA 콘쥬게이트의 합성 (직접 결합)
상기 유도체는 실시예 3에 개시된 바와 같이 합성하고, 특성화하였지만, 2 g의 HAS2 나트륨 염으로 개시하였고, BA로 염화시켰고, 1.34 g (2.5 eq)의 CDI 및 2.5 g (4.0 eq)의 도파민 히드로클로리드와 반응시켰다.
실시예 5: 31% 유도체화를 갖는 HAS2-DOPA 콘쥬게이트의 합성 (직접 결합)
상기 유도체는 실시예 3에 개시된 바와 같이 합성하고, 특성화하였지만, 2 g의 HAS2 나트륨 염으로 개시하였고, BA로 염화시켰고, 0.801 g (1.5 eq)의 CDI 및 1.25 g (2.0 eq)의 도파민 히드로클로리드와 반응시켰다.
실시예 6: 21% 유도체화를 갖는 HAS2-DOPA 콘쥬게이트의 합성 (직접 결합)
상기 유도체는 실시예 3에 개시된 바와 같이 합성하고, 특성화하였지만, 2 g의 HAS2 나트륨 염으로 개시하였고, BA로 염화시켰고, 0.134 g (0.25 eq)의 CDI 및 0.25 g (0.4 eq)의 도파민 히드로클로리드와 반응시켰다.
실시예 7: 6% 유도체화를 갖는 HAS2-DOPA 콘쥬게이트의 합성 (직접 결합)
상기 유도체는 실시예 3에 개시된 바와 같이 합성하고, 특성화하였지만, 2 g의 HAS2 나트륨 염으로 개시하였고, BA로 염화시켰고, 0.067 g (0.125 eq)의 CDI 및 0.25 g (0.4 eq)의 도파민 히드로클로리드와 반응시켰다.
실시예 8: 5% 유도체화를 갖는 HAS2-CONH-(CH2)10-CONH-도파민 콘쥬게이트의 합성 (10개의 탄소 원자를 갖는 알킬 스페이서를 통한 간접 결합)
간접 결합은 두 단계를 포함한다: 도파민-스페이서 종의 합성 그 다음에 도파민-스페이서와 HAS2의 합성:
- 8.1: 도파민-스페이서 합성: NH2-(CH2)10-CONH-도파민
0.55 g의 11-(Boc-아미노)운데카노산을 10 mL의 DMF에 용해시켰고, 카르복실을 0.56 g의 EDC (N-에틸-N′-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 히드로클로리드)로 활성화시켰고, DMAP (0.07 g)를 3차 염기 (TEA, 0.31 mL)의 존재하에 0℃에서 교반하에 첨가하였다. 0.4 g의 도파민 히드로클로리드를 10분 후에 첨가하였고, 혼합물을 교반하에 RT에서 밤새 두었다. 그 다음에 40 mL의 디클로로메탄 및 40 mL의 H2O를 첨가하였고, 유기 상을 추출하였고, 물에서 세척하였고, rotovap에서 건조시켰다. BOC 보호기는, 5 mL의 하기 산 혼합물: TFA 15%/ H2O 5%/ DCM 80%를 첨가하여 방출시켰고, 결과의 혼합물을 교반하에 20분 동안 RT에서 두었다. 그 다음에 용매를 증발시켰고, 산물을 건조시켰다.
- 8.2: HAS2-CONH-(CH2)10-CONH-DOPA의 합성
상기 유도체는 실시예 3에 개시된 바와 같이 합성하고, 특성화하였지만, 1 g의 HAS2 나트륨 염으로 개시하였고, BA로 염화하였고, 0.45 g의 CDI 및 0.5 g의 실시예 8.1에서 수득된 NH2-(CH2)10-CONH-DOPA와 반응시켰다.
실시예 9: 5% 유도체화를 갖는 HAS2-CONH-(CH2)5-CONH-도파민 콘쥬게이트의 합성 (5개의 탄소 원자를 갖는 알킬 스페이서를 통한 간접 결합)
도파민-스페이서를 시약으로서 6-(Boc-아미노)카프로산을 사용하여 수득하였고, 실시예 8.1에 개시된 절차를 따랐다.
산물 HAS2-CONH-(CH2)5-CONH-도파민을 실시예 8.2에 개시된 절차에 따라 수득하였다.
실시예 10: 5% 유도체화를 갖는 HAS2-CONH-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-CONH-DOPA 콘쥬게이트의 합성 (폴리에틸렌 글리콜 스페이서를 통한 간접 결합)
간접 결합은 하기 두 단계를 포함한다: DOPA-스페이서 종의 합성 그 다음에 DOPA-스페이서와 HAS2의 합성
- DOPA-스페이서 합성: NH2-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-CONH-DOPA
0.64 g의 Boc-NH-(PEG)-COOH. DCHA (9 원자)를 10 mL의 DMF에 용해시켰고, 카르복실을 0.56 g의 EDC (N-에틸-N′-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 히드로클로리드)로 활성화시켰고, DMAP (0.07 g)를 3차 염기 (TEA, 0.31 mL)의 존재하에 0℃에서 교반하에 첨가하였다. 10분 후에 DOPA (도파민 히드로클로리드)를 첨가하였고, RT에서 밤새 교반하에 두었다. 그 다음에 40 mL의 디클로로메탄 및 40 mL의 H2O를 첨가하였고, 유기 상을 추출하였고, 물에서 세척하였고, 회전 증발기에서 건조시켰다. BOC 보호기는, 5 mL의 하기 산 혼합물: TFA 15%/ H2O 5%/ DCM 80%를 첨가하여 방출시켰고, 20분 동안 RT에서 교반하에 두었다. 그 다음에 용매를 증발시켰고, 산물을 건조시켰다. 0.5 g의 산물을 수득하였다 (83% 수득율).
- HAS2-CONH-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-CONH-DOPA의 합성
상기 유도체는 HAS2-DOPA 유도체에 대해 상기에 개시된 바와 같이 합성하였지만, 1 g의 HAS2 나트륨 염으로 개시하였고, BA로 염화하였고, 0.45 g의 CDI 및 0.5 g의 NH2-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-CONH-DOPA와 반응시켰다.
실시예 11 (비교): 21% 유도체화를 갖는 헤파린 (HEPA)-DOPA 콘쥬게이트의 합성 (Lee 등, 2012에 따라 제조됨)
1.0 g d.m. (3.3×10- 3 mol, 1 eq)의 헤파린 나트륨 (HEPA)을 50 mL의 탈이온수에 용해시켰고, 1.5 g의 벤잘코늄 클로리드 (BA+Cl-)를 개별적으로 100 mL의 탈이온수에 용해시켰다. 용해가 완료되면 BA+Cl- 용액을 HEPA 용액에 첨가하여, 침전물을 수득하였고, 이를 여과하였고, H2O, EtOH 그 다음에 아세톤에서 세척하였고, 회전 증발기에서 고진공하에 건조시켰다. 분리된 침전물을 80 mL의 DMSO에 용해시켰고; 그 다음에 0.134 g (0.5 eq)의 CDI 및 0.05 mL의 메탄술폰산 (0.5 eq)을 첨가하였다. 40℃에서 30분 교반한 후에, 0.25 g (0.8 eq)의 도파민 히드로클로리드를 첨가하였고, 상기 반응을 40℃에서 천천히 교반하에 밤새 지속하였다. 8 mL의 포화된 NaCl 용액을 다음 날 첨가하였고, 산물을 EtOH로 침전시켰다. 수득된 침전물을 여과하였고, EtOH/H2O (85:15)로 구성된 혼합물의 2 부피, 그 다음에 EtOH, 마지막으로 아세톤으로 세척하였다. 결과의 산물을 50 mL의 탈이온 H2O에 용해시켰고, 0.05 M 아세톤 완충액 pH 5에서 3일 동안 및 1 M HCl을 첨가하여 pH 5로 조정된 H2O에서 1일 동안 투석시켰다 (Spectra/Por® 투석막, 커트-오프=3,000 Da).
상기 투석 시간을 조절하여, GPC에 의해 투석막에서 유리 도파민의 소멸을 확인하였다.
실시예 12 (비교): 23% 유도체화를 갖는 HA-DOPA 콘쥬게이트의 합성
HA-DOPA 유도체는 실시예 3에 개시된 절차에 의해 합성하였지만, 1.32 g (0.0033 moles)의 HA 나트륨 염 200 kDa으로 개시하였고, BA로 염화하였고, 0.267 g (0.5 eq)의 CDI 및 0.5 g (0.8 eq)의 도파민 히드로클로리드와 반응시켰다.
실시예 13: HAS2-DOPA 유도체의 부착 시험
도파민이 다양한 pH 값에서 접착제로 작용할 때, 2개의 가장 대표적인 pH 값, 즉 5 및 8에서 PBS에 용해된, HAS2-DOPA 콘쥬게이트 (실시예 5에 개시된 바와 같이 제조됨)를 코팅하는 그의 역량을 시험하였다:
- 용액 A: 4 mL의 0.1 M MES pH 5 중 20 mg의 HAS2-DOPA (31%).
- 용액 B: 4 mL의 0.1 M PBS pH 8 중 20 mg의 HAS2-DOPA (31%).
임의의 pH에서 양전하를 갖는 형광 프로브 (상귀나린 (Sanguinarine) 히드로클로리드)를 본 시험에 사용하여, 생리학적 pH에서 상기 유도체와 양전하를 갖는 항생제의 상호작용을 자극하였다.
2개의 티타늄 실린더 (d=15 × h=17 mm) 각각에 용액 A 및 용액 B를 균일하게 분무하였고, 탈이온수로 세척하였고, 기류에서 건조시켰고, 0.1 M MES, pH 5 중 0.5 mg/mL의 농도의 상귀나린 용액을 포함하는 상이한 바이알에 침지시켰다. 상기 실린더를 밤새 RT에서 온화한 교반하에 두었다. 다음 날 상기 실린더를 다시 탈이온수로 세척하였고, N2 흐름하에 건조시켰고, 360 nm의 UV 램프로 조사하였고, 육안 검사를 수행하였다.
처리된 실린더에 의해 방출된 형광의 평가로부터, pH 8에서 도파민 유도체 (용액 B)가 상기 표면에 가장 잘 부착됨을 유추하였다. 이러한 발견은 용액 B가 본 발명을 구현하기 위한 이상적인 접근법임을 나타내었다.
13.1: 티타늄 표면 코팅의 전자 현미경 (ESEM) 분석
본 시험은, 상기 실린더 표면에 분무에 의해 부착된 HAS2-DOPA 유도체가 Ti에 균일하게 부착될 뿐만 아니라, 골기질과 보철물의 골유착을 촉진하는데 필요한 표면 거칠기를 유지하는 것을 입증하였다. 0.1 M PBS, pH 8 중 HAS2-DOPA (23%; 실시예 3) 25 mg/mL의 용액을 제조하였고, 1 ml의 상기 용액을 Ti 실린더 상에 분무하였고; 이를 공기-건조시켰고, 표면을 ESEM으로 관찰하였고, 이를 처리되지 않은 실린더의 표면과 비교하였다 (도 1 및 2). 정성적 XPS 분석 (광전자 X-선 분광기, 이는 분석되는 표면에서 유기 물질의 존재를 검출함) 뿐만 아니라 사진 스캐닝 (photographic scanning)을 수행하였다. 그 다음에 처리된 실린더를 세척하여, 인 비보 (in vivo)에서 이식 후에 생리액의 흐름과 접촉하는 상황에서도 상기 유도체가 상기 표면에 부착이 지속되는지를 확인하였다 (도 3).
처리된 표면의 이미지는 물질의 존재를 명확하게 보여주었고, XPS 분석에 의해 확인하였다. 더욱이, 건조된 유도체는 표면에 거친 질감을 주는 표면 불규칙성을 형성하였고, 이는 골기질에 이식물의 유착을 촉진하는데 중요한 파라미터이다.
세척 후에, 유도체 잔류물이 표면에서 여전히 보였고, 상기 유도체는 Ti와 활발하게 상호작용하였고, 세척 후에도 부착이 지속되었음을 확인하였다.
이는 하기를 나타내었다:
Figure pct00013
HAS2-DOPA 콘쥬게이트는, 특히 pH=8의 용액에서 제조될 때, 티타늄 표면에 완벽하게 부착됨;
Figure pct00014
HAS2-DOPA 콘쥬게이트는 또한 세척 후에 표면에 결합이 유지됨; 및
Figure pct00015
HAS2-DOPA 콘쥬게이트는 보철물의 골유착을 촉진하는데 필요한 거친 질감을 금속 표면에 제공함.
실시예 14: 에스 . 아우레우스 박테리아 성장 저해의 인 비트로 (In vitro) 시험 (HAS2-DOPA 또는 HA-DOPA 및 겐타마이신으로 관능화된 티타늄 실린더)
하기를 제조하였다:
0.1 M PBS, pH=8 중 HAS2-DOPA의 용액 (23%, 실시예 3);
0.1 M PBS, pH=8 중 HA-DOPA의 용액 (23%, 실시예 12);
겐타마이신 용액 (0.25 M MES, pH=5.2 중 25 mg/5 ml);
0.1 M PBS, pH=8의 용액 (대조군).
2개의 티타늄 실린더 (d=15 × h=17 mm)에 HAS2-DOPA 용액을 분무하였고, 15분 동안 공기-건조시켰고, 겐타마이신 용액을 분무하였고, 15분 동안 다시 공기-건조시켰다.
동일한 처리를, 동일한 크기의, 2개의 다른 티타늄 실린더에 적용하였고, 이에 먼저 HA-DOPA 유도체 용액 그 다음에 겐타마이신 용액을 상기에 개시된 절차에 의해 분무하였다.
마지막으로, 동일한 크기의, 2개의 다른 티타늄 실린더에, PBS 용액 그 다음에 겐타마이신 용액을, 상기에 개시된 절차에 의해 분무하였다.
그 다음에 각 실린더 (총: 6개)를 MQ 물에 5초 동안 한번 침지시켰고, 15분 동안 공기-건조시켰고, 스타필로코쿠스 아우레우스 600,000,000 CFU/mL이 접종된 배양액 (완충된 펩톤 워터 (Buffered Peptone Water): 펩톤 10.0 g/L, 소듐 클로리드 5.0 g/L, 무수 디소듐 포스페이트 3.6 g/L, 포타슘 포스페이트 1.5 g/L, Biokar Diagnostics)에 삽입하였다. 상기 배양액을 37℃에서 인큐베이트하였고, 사전-설정된 시간 (6 h, 12 h, 24 h, 48 h, 144 h)에서 1 mL의 상등액을 채취하였고, 플레이트 시딩 (PCA -Plate Count Agar: 트립톤 5.0 g/L, 효모 추출물 2.5 g/L, 글루코스 1.0 g/L, 박테리아성 아가 (bacteriological agar) 12.0 g/L. Biokar Diagnostics제)을 위해, 멸균 식염수 용액으로, 1:10 (박테리아 성장에 따름)으로 스칼라적으로 (scalarly) 희석하였다. 그 다음에 CFU/mL 계수를 수행하였다.
600,000,000 CFU/mL의 에스 . 아우레우스의 초기 접종물과 비교하여 경시적으로 박테리아 성장 저해 퍼센트 데이터는 도 4에 개시되었다.
그래프는 하기를 명확하게 나타내었다:
Figure pct00016
HAS2-DOPA는 대조군 (PBS)보다 훨씬 더 효과적으로 작용한다; 이는 HAS2-DOPA가 경시적으로 조절되고, 일정한 방식으로 겐타마이신을 방출하는 것을 의미한다;
Figure pct00017
HAS2-DOPA는 HA-DOPA보다 훨씬 더 유의한 방식으로 작용한다;
Figure pct00018
놀랍게도, 처음 24시간 내에 전체 항미생물 작용 이외에, HAS2-DOPA는 접종 후에 최대 144시간, 즉 7일 동안 장기 항박테리아 커버력을 유지하지만, 반면에 HA-DOPA는 에스. 아우레우스의 증식이 단 48시간 만에 재개되었다.
유사한 실험을 동일한 농도의 답토마이신으로 수행하였고, 동일한 활성 프로파일이 수득되었다.
실시예 15: 비교 시험: 겐타마이신에 결합된 헤파린-DOPA (HEPA-DOPA) 콘쥬게이트와 비교되는 HAS2-DOPA 콘쥬게이트의 항미생물 활성
HAS2-DOPA 콘쥬게이트는 실시예 6에서와 같이 제조되었고, HEPA-DOPA 유도체는 실시예 11에서와 같이 제조되었다 (유도체화도: 21%).
2개의 티타늄 실린더 (d=15 × h=17 mm) 각각에, pH 8에서 PBS 중 20 mg/mL의 농도로, HAS2-DOPA 또는 HEPA-DOPA를 분무하였고, 그 후에 MES, pH 5.2 중 5 mg/mL의 겐타마이신을 분무하였다. 그 다음에 MQ 물에서 3회 연속하는 침지 세척 (5 초)을 수행하였다; 반복된 세척의 목적은 시험된 종에 실제 정전기적으로 결합되지 않은 모든 겐타마이신을 제거하는데 있다. 그 다음에 상기 실린더를 에스 . 아우레우스의 접종물 (600,000,000 CFU/mL)을 갖는 시험 튜브에 삽입하였고; 1 mL의 상등액을 사전-설정된 시간에서 채취하였고, 그 다음에 플레이트 시딩 (PCA -Plate Count Agar: 트립톤 5.0 g/L, 효모 추출물 2.5 g/L, 글루코스 1.0 g/L, 박테리아성 아가 12.0 g/L (Biokar Diagnostics)을 위해, 멸균 식염수 용액으로, 1:10 (박테리아 성장에 따름)으로 스칼라적으로 희석하였다. 그 다음에 CFU/mL 계수를, 도 5에 개시된 바와 같이 수행하였다.
결과로부터 상기 HAS2-DOPA 산물은, 유도체화도 및 농도가 동일할 때 에스 . 아우레우스 증식을 저해하는데 훨씬 더 활성이 있었고, 상기 활성은 적어도 36시간 동안 지속되는 것을 보여주었다. 상기 결과는, HEPA-DOPA 유도체가 36시간 후에 "대조군" (항박테리아 활성이 없음)과 같이, 그의 항박테리아 활성이 점차적으로 빠르게 소실된다는 사실을 고려하여 특히 중요하다.
실시예 16: HAS2-DOPA와 HEPA-DOPA 사이에 항응고 효과의 비교
실시예 6의 HAS2-DOPA 콘쥬게이트 및 실시예 11의 HEPA-DOPA 유도체를 제조하였다.
항응고 효과는 표준으로 순수한 헤파린을 사용하여 평가하였다. 색측계 방법 (colorimetric method)을 이용하는 키트 (Hyphen BioMed, Biophen Heparin AT+ Ref 221007)를 사용하였다; 헤파린 또는 시험 폴리머로 복합체화 및 저해되지 않은 응고 인자 Xa를 측정하였다. 405 nm에서의 흡광도는 유리 Xa 인자에 직접적으로 비례하였고, 그러므로 시험된 종의 헤파린-유사 활성에 반비례하였다 (도 6).
HAS2-DOPA의 항응고 효과는 농도가 동일할 때 HEPA-DOPA의 항응고 효과보다 훨씬 떨어지고; HAS2-DOPA 시스템으로 동일한 효과를 수득하기 위해 (Abs에서 50% 감소), 약 50배 더 높은 농도가 필요하다. 이는 HAS2-DOPA 콘쥬게이트가 헤파린과 똑같이 황산화 폴리머를 포함하고 있지만, 알려져 있는 산물보다 더 낮은 항응고 효과를 나타내는 것을 의미한다.
겐타마이신 또는 유사한 항박테리아제에 결합된 HAS2-DOPA 콘쥬게이트는, 분무에 의해 적용가능할 뿐만 아니라, 단시간내에 사용할 수 있고, 실질적으로 헤파린-유사 효과를 갖지 않으므로 비정상적인 출혈을 일으키지 않으며, 또한 알려져 있는 동등물보다 훨씬 더 효과적이고, 빠르며, 지속되는 방식으로 작용하기 때문에 유익하다.
실시예 17: 인 비트로 골모세포 증식에서 HAS2-DOPA 및 HA-DOPA의 효과 평가
하기를 제조하였다:
- HAS2-DOPA의 수성 용액 (23%, 실시예 3) 10 mg/mL
- HA-DOPA의 수성 용액 (23%, 실시예 12) 10 mg/mL
- 피브로넥틴의 수성 용액 (포지티브 대조군) 20 μg/ml.
2개의 티타늄 실린더 (d=15 × h=17 mm)의 원형 상부 표면에 HAS2-DOPA 용액을 분무하였고, 15분 동안 공기-건조시켰고; 동일한 처리를 동일한 크기의 다른 2개의 티타늄 실린더에 적용하였고, 상기에 개시된 절차에 따라 HA-DOPA 용액을 이에 분무하였다. 마지막으로, 동일한 크기의, 2개의 다른 티타늄 실린더에, 상기에 개시된 절차에 따라, 수중 피브로넥틴 용액을 분무하였다. 피브로넥틴은 세포 부착, 증식 및 이동을 자극하기 때문에, 이는 인 비트로 세포 증식 실험에서 참조 표준으로 널리 사용되었다.
그 다음에 각 실린더 (총: 6개)를 5초 동안 MilliQ 물 중에 한번 침지시켰고, 15분 동안 공기-건조시켰고, 플레이트 웰에 삽입하였고; 그 다음에 티타늄 1 cm2당 세포 약 50000개의 양으로, 배양 배지 (McCOY'S 5A + 10% FBS) 중 0.10 mL의 골모세포 (골육종으로부터 유래, Saos-2 세포주)를 각 실린더의 표면에 부착시켰다. 상기 세포를 티타늄에서 4시간 동안 37℃ (5% CO2)에서 인큐베이트하여 부착시켰다; 그 다음에 배지를 실린더가 침지될 때까지 첨가하였고, 동일한 조건하에 밤새 인큐베이트하였다.
배지를 다음날 제거하였고, 상기 실린더를 PBS로 세척하여 부착되지 않은 세포를 제거하였고; 그 다음에 동일한 부피의 동일한 배지를, 10% Alamar Blue를 갖는 각 실린더에 첨가하였고, 상기 실린더를 24시간 동안 37℃ (5% CO2)에서 인큐베이트하였다. 인큐베이트 후에, 형광 판독을 수행하였다 (λ 여기: 530 nm 및 방출: 590 nm); 형광 세기는 세포 대사작용에 비례하므로, 살아있는 골모세포의 수에 비례한다.
결과로부터 (도 7), 유도체화도 및 농도가 동일할 때, HAS2-DOPA는, 피브로넥틴의 골유착 활성과 거의 동일한, 매우 높은 골유착 활성을 가지며, 놀랍게도 HA-DOPA의 골유착 활성에 거의 2배이다. 상기 값은 통계적으로 유의했다.
C-는 네가티브 대조군, 즉 골모세포의 시딩 없이 티타늄 실린더 "그대로"를 나타낸다.
실시예 18: 실시예 3에서와 같이 제조된 23% HAS2-DOPA 분말의 베타선 및 감마선 멸균에 대한 안정성 평가
실시예 3에 개시된 바와 같이, 1 g의 23% HAS2-DOPA 분말 시료 3개를 제조하였다. 상기 시료들 각각을 하기와 같이 처리하였다:
Figure pct00019
베타선으로 멸균처리;
Figure pct00020
감마선으로 멸균처리;
Figure pct00021
멸균 처리 없음 (대조군).
그 다음에 상기 시료를, 상이한 알려져 있는 방법, 즉 중수 (D2O) 중에 상기 분말을 용해시킨 후에 1H-NMR (양전자 핵자기 공명 분광법), IR 분석 (KBr 펠렛에서), 마지막으로 물에 용해시킨 후에 가시광 UV 분석 (UV-Vis)의 구조 분석에 의해 분석하였다.
상기 분석 결과로부터 멸균된 시료들의 신호는 동일하였고, 상기 신호와 멸균되지 않은 대조군의 신호 사이에 차이가 없다는 것을 확인하였다. 구체적으로, 부산물의 형성에 의한 신호 (NMR 및 IR 분석) 또는 예를 들어 도파민 산화에 의한 UV-Vis 흡수 신호 이동은 관찰되지 않았다.
그러므로 HAS2-DOPA 폴리머는 베타선 또는 감마선 멸균에 안정하고 적합했다.
실시예 19: HAS2-DOPA로 관능화되고, 베타선으로 멸균되고, 그 후에 반코마이신으로 처리된 티타늄 실린더에서 에스 . 아우레우스 박테리아 성장 저해의 인 비트로 시험
하기를 제조하였다:
수 중 HAS2-DOPA의 용액 (23%, 실시예 3), 10 mg/mL;
수 중 반코마이신 용액, 5 mg/ml.
1개의 티타늄 실린더 (d=15 × h=17 mm) (시료 A, 대조군)는 어떠한 처리도 수행하지 않았고, 동일한 치수의 두 번째 티타늄 실린더 (시료 B)에 HAS2-DOPA 용액을 분무하고, 15분 동안 공기-건조시켰다.
상기 실린더 모두를 베타선을 조사하여 멸균하였고, 후속하여 제조된 반코마이신 용액을 분무하였고, 마지막으로 15분 동안 공기-건조시켰다.
그 다음에 실린더 모두를 5초 동안 MQ 물의 상이한 용액 중에 10회 침지시켜서, 존재하는 과량의 항생제를 제거하였고, 15분 동안 공기-건조시켰다. 스타필로 코쿠스 아우레우스의 현탁액 (650 nm에서 O.D. > 0.5의 200 μL)을 플레이트에서 Mueller-Hinton 아가 (BD Biosciences) 표면에 균일하게 분포시켰고, 2개의 티타늄 실린더 각각을 접종된 아가 표면의 중심에 배치시켰다. 상기 플레이트를 35℃에서 18시간 동안 인큐베이트하였고, 그 다음에 박테리아 성장이 항생제에 의해 저해되는 표면의 직경을 측정하였다.
HAS2-DOPA로 처리되고, 멸균된 시료 B는, 멸균 처리만 수행된 대조군 시료보다 박테리아 성장이 훨씬 더 효과적으로 저해되는 것으로 입증되었다.
이는 멸균처리로 HAS2-DOPA의 구조 또는 특성이 변화되지 않는 것을 의미하고, 이는 상기 Ti에 고착되어 남아 있고, 결과적으로 반코마이신에 결합하는 그의 역량을 유지하고, 후속하여 이를 방출한다.
유사한 실험을, 동일한 농도의 겐타마이신 및 동일한 조건 및 동일한 농도에서, 가교된 티타늄 시료에서 반코마이신으로 수행하여, 상기에 토의된 것과 동일한 박테리아 성장 저해 프로파일을 수득하였다.
그러므로 베타선 멸균처리로:
티타늄에 대한 HAS2-DOPA의 부착이 변화되지 않았고
HAS2-DOPA의 구조적 특성이 변화되지 않았으며
그러므로, 항생제에 결합하는 HAS2-DOPA의 역량이 변화되지 않아서, 원하는 항박테리아 효과를 수행하였다.

Claims (14)

  1. 아미드 결합을 통해 직접 콘쥬게이트되거나, 또는 히알루론산 카르복실기와 아미드 결합의 형성을 위한 아미노기 및 도파민 아미노기와 아미드 결합의 형성을 위한 카르복실기를 갖는 스페이서 (spacer)를 통해 콘쥬게이트된 도파민으로 관능화된, 2 내지 60 몰% (mole %)의 카르복실기를 갖는 2 등급 황산화 히알루론산 (Grade 2 sulphated hyaluronic acid).
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 도파민은, 상기 황산화 히알루론산 카르복실기의 15-40%, 바람직하게는 20-32%에 아미드 결합을 통해 직접 콘쥬게이트되는 것인 황산화 히알루론산.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 도파민은, 상기 황산화 히알루론산 카르복실기의 2-20%와 아미드 결합의 형성을 위한 아미노기 및 도파민 아미노기와 아미드 결합의 형성을 위한 카르복실기를 갖는 스페이서를 통해 황산화 히알루론산과 콘쥬게이트되는 것인 황산화 히알루론산.
  4. 청구항 3에 있어서, 상기 스페이서는 화학식 HOOC-(CH2)n-NH2의 화합물이고, 상기 n은 5 내지 10, 바람직하게는 5 또는 10의 정수인 것인 황산화 히알루론산.
  5. 청구항 3에 있어서, 상기 스페이서는 화학식 HOOC-(CH2)n-O-[(CH2)2-O]m-(CH2)2-NH2의 화합물이고, 상기 n은 1 또는 2이고, m은 1 또는 2인 것인 황산화 히알루론산.
  6. 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항에 있어서, 100,000 내지 250,000 Da, 구체적으로 180,000 내지 230,000 Da의 중량 평균 분자량을 갖는 히알루론산으로부터 제조된 2 등급 황산화 히알루론산의 관능화 (functionalisation)에 의해 수득되는 것인 황산화 히알루론산.
  7. 청구항 1 내지 6의 황산화 히알루론산과 양전하를 갖는 약제의 염 (Salt).
  8. 청구항 7에 있어서, 상기 양전하를 갖는 약제는 항생제, 성장 인자, 및 산 형태의 디클로페낙 (diclofenac)으로부터 선택되는 것인 염.
  9. 청구항 8에 있어서, 상기 양전하를 갖는 약제는 아미노글리코시드 항생제, 답토마이신 (Daptomycin), 시프로플록사신 (Ciprofloxacin), 메로페넴 (Meropenem), 반코마이신 (Vancomycin), 폴리믹신 (Polymyxin), 콜리스틴 (Colistin) 및 바시트라신 (Bacitracin)으로부터 선택되는 것인 염.
  10. 청구항 9에 있어서, 상기 아미노글리코시드 항생제는 아미카신 (Amikacin), 겐타마이신 (Gentamicin) 및 토브라마이신 (Tobramycin)으로부터 선택되는 것인 염.
  11. 청구항 7에 있어서, 상기 양전하를 갖는 약제는 겐타마이신, 답토마이신, 폴리믹신 또는 콜리스틴인 것인 염.
  12. 약제용 담체로서 사용하기 위한 청구항 1 내지 6의 황산화 히알루론산.
  13. 생체의학용 물품 (biomedical articles)을 코팅하는데 사용하기 위한 청구항 1 내지 6의 황산화 히알루론산.
  14. 청구항 7 내지 11의 염으로 코팅된 티타늄 관내인공삽입물 (Titanium endoprostheses).
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