ES2847323T3

ES2847323T3 - Acidos hialurónicos sulfatados funcionalizados con dopamina

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Publication number: ES2847323T3
Application number: ES17805280T
Authority: ES
Inventors: Cristian Guarise; Stefano Pluda; Devis Galesso
Original assignee: Fidia Farmaceutici SpA
Current assignee: Fidia Farmaceutici SpA
Priority date: 2016-11-18
Filing date: 2017-11-13
Publication date: 2021-08-02
Anticipated expiration: 2037-11-13
Also published as: IT201600117042A1; CN110050001A; EP3541851A1; US10898510B2; CN110050001B; CA3040429A1; EA201990977A1; MX2019005826A; KR20190085068A; WO2018092013A1; KR102526735B1; EP3541851B1; JP2019536850A; EA037766B1; JP7065086B2; US20190321390A1; AU2017360800A1; PT3541851T

Abstract

Ácido hialurónico sulfatado de grado 2 que tiene 2 a 60% molar de los grupos carboxílicos funcionalizados con dopamina conjugados directamente por medio de un enlace amida o por medio de un espaciador que tiene un grupo amino para la formación de un enlace amida con grupos carboxílicos del ácido hialurónico y un grupo carboxílico para la formación de un enlace amida con el grupo amino de la dopamina.

Description

DESCRIPCIÓN

Ácidos hialurónicos sulfatados funcionalizados con dopamina

La invención se refiere a ácidos hialurónicos sulfatados funcionalizados con dopamina por medio de enlaces amida, que pueden ser directos o mediante un grupo espaciador adecuado. Los compuestos de la invención forman sales con medicamentos que tienen grupos ionizables con cargas positivas, en particular antibióticos. Otro objeto de la invención es dichas sales y su uso para revestir endoprótesis de titanio implantables en organismos vivos o dispositivos biomédicos en general.

Técnica anterior

El ácido hialurónico (HA) es un heteropolisacárido que consiste en residuos alternados de ácido D-glucurónico y N-acetil-D-glucosamina, con una cadena lineal, que tiene un peso molecular que varía entre 50000 y 13 x 106 Da, de acuerdo con la fuente de la que se obtiene y los procedimientos de preparación usados.

El ácido hialurónico es prácticamente ubicuo en el cuerpo humano, en el que cumple un papel importante, especialmente como soporte mecánico para las células de muchos tejidos, tales como piel, tendones, músculos y cartílagos. También son conocidas las interacciones de HA con su receptor de membrana CD44 y receptores opioides.

Son conocidos los derivados de HA O-sulfatados, en los que los grupos -OH están esterificados con ácido sulfúrico. La O-sulfatación se puede realizar mediante técnicas conocidas (véanse, por ejemplo, los documentos EP702699 y EP940410); "grado de sulfatación" significa los moles de grupos sulfato por mol de dímero HA (DSmol); específicamente:

sulfatación de grado 1 define un DSmol que varía

entre 0,5 y 1,5;

sulfatación de grado 2 define un DSmol que varía

entre 1,5 y 2,5;

sulfatación de grado 3 define un DSmol que varía

entre 2,5 y 3,5.

En general, HAS atraviesa fácilmente la barrera cutánea, de este modo se simplifica el paso de sustancias asociadas a ella y, por tanto, es un excelente vehículo para la absorción cutánea de moléculas farmacológica y biológicamente activas.

También se ha descubierto (documentos WO2010130468; WO2010130466) que HAS posee propiedades farmacológicas: es un potente antiinflamatorio, que realiza su acción por medio de la modulación efectiva de las actividades de numerosas citoquinas proinflamatorias y antiinflamatorias. Por lo tanto, HAS es adecuado para su uso en el tratamiento de trastornos mediados por alteración de los niveles de citoquinas (artritis reumatoide, asma, enfermedades autoinmunes sistémicas y cutáneas, infecciones virales, dermatitis atópica, eccema, vitiligo, linfomas, etc.).

DOPA (1-3,4-dihidroxifenilalanina), un aminoácido intermedio en la síntesis de dopamina, es un neurotransmisor conocido y recientemente también se estudió como sustancia adhesiva. Se ha hallado una concentración significativa de residuos de DOPA en la composición de aminoácidos de las proteínas denominadas "proteínas del pie Mytilus edulis" (Mefp, en particular Mefp-3 y Mefp-5), que constituyen el pedúnculo con el que Mytilus edulis, comúnmente conocido como el mejillón, se adhiere a las superficies. La característica clave de DOPA es el grupo catecol; esto sugiere que una alta concentración de unidades de catecol cumple un papel clave en la promoción de la adhesión a múltiples superficies, que incluyen vidrio, plástico, cerámica y superficies a base de metales y óxidos metálicos. Aunque el mecanismo por el cual se produce dicha adhesión aún no se comprende completamente, se sabe que la adhesión se producen tanto en medio ácido (pH = 5) como en medio alcalino (pH = 8), cuando los grupos catecol adoptan la forma de quinonas. Como el derivado de dopamina también posee características idénticas, DOPA y la dopamina se definen y usan indiscriminadamente en la bibliografía científica en términos de actividad adhesiva.

Se ha usado HA, “como tal" y en su forma sulfatada, combinado con otros polímeros, en el revestimiento de prótesis metálicas (normalmente titanio) y poliméricas (por ejemplo, PU) para promover la biocompatibilida y hemocompatibilidad (EP1060204).

DOPA también se ha usado ya como adhesivo para promover la unión con otras moléculas (usualmente polímeros) que tienen un núcleo metálico (Lee et al., Adv Mat, 2008, 20, 4154-4157).

Finalmente, existen ejemplos en los que una prótesis de metal se reviste con DOPA conjugada con un polímero que, a su vez, se puede unir a un antibiótico, de este modo se reduce la probabilidad de proliferación bacteriana. Por ejemplo, Lee et al. (Bone, 2012, 50, 974-982) describen DOPA conjugada con heparina y funcionalizada adicionalmente con un antibiótico y BMP2, para promover la integración ósea de las prótesis dentales de titanio. La heparina se selecciona porque contiene grupos sulfato que hacen que el conjugado cargue globalmente en forma negativa y, por lo tanto, se pueda unir al antibiótico con carga positiva. Sin embargo, la presencia de heparina es crítica, porque su conocida actividad anticoagulante puede ser problemática y crear un sangrado anormal durante y después de la implantación.

Descripción de la invención

En la actualidad se hallado que los conjugados de ácido hialurónico sulfatado (HAS) y dopamina se pueden usar ventajosamente para adsorber un antibiótico o molécula biológica y/o farmacológicamente activos con carga positiva por medio de interacción electrostática. Los conjugados de HAS y dopamina funcionalizados con medicamentos u otros compuestos activos son útiles para revestir artículos biomédicos en general y prótesis de titanio en particular, para hacerlas biocompatibles y, especialmente en el caso de las prótesis de titanio, para mejorar su integración con la matriz ósea sobre la que están injertadas. Los conjugados de ácido hialurónico sulfatado (HAS) y dopamina descritos en la presente memoria han demostrado ser particularmente eficaces cuando se usan tanto con prótesis clásicas de titanio, que tienen una estructura compacta, como con las prótesis de última generación, que tienen una estructura reticulada porosa (trabecular), perfectamente integrable con el hueso. Después de la implantación, la prótesis trabecular tratada con los conjugados descritos en la presente no solo es biocompatible sino que, por su estructura específica, también está colonizada por las células y se integra perfectamente con el hueso.

Los conjugados de ácido hialurónico sulfatado (HAS) y dopamina que forman el objeto de la invención también cumplen un papel principal en la reducción de las posibles infecciones derivadas del implante. Este último aspecto es particularmente importante porque el crecimiento bacteriano y la posterior formación de biopelículas representan una complicación mayor, no tanto en la etapa de implantación primaria de una rodilla, cadera, etc., sino después de la primera revisión de la prótesis, lo que lleva a la necesidad de extracción en el 5-40% de los casos. Se estima que aproximadamente 80% de las infecciones que llevan a la extracción de la prótesis se deben a la formación de una biopelícula bacteriana.

La biopelícula es una acumulación de microorganismos (Staphylococcus aureus, S. epidermidis, S. haemolyticus, etc.) con alta densidad bacteriana, encapsulados en una matriz de polisacárido y adheridos a una superficie sólida biológica o no biológica, generalmente resistente al tratamiento sistémico con antibióticos.

El ácido hialurónico sulfatado usado de acuerdo con la invención es de grado 2 (HAS2), a saber, un HAS en el que los moles de los grupos sulfato por mol de dímero HA (DSmol) varían entre 1,5 y 2,5.

El porcentaje de funcionalización de los grupos carboxilo de HAS2 con dopamina, unidos directamente o mediante un espaciador, oscila entre 2 y 60% molar tanto para el enlace directo como indirecto; preferentemente varía entre 15 y 40%, e incluso más preferentemente entre 20 y 32%, para el enlace directo, mientras que para el enlace indirecto oscila preferentemente entre 2 y 20%.

El enlace entre la dopamina y HAS2 es del tipo amida, y puede ser directo (COOH de HA-NH2 de dopamina) como se muestra en el Esquema A, o indirecto, cuando se inserta un espaciador entre la dopamina y HAS, siempre unido mediante un enlace amida, para maximizar la interacción de la dopamina con la superficie de titanio para funcionalizar, de este modo se reduce el efecto estérico de HAS2. El espaciador usado puede ser una cadena de alquilo con una longitud que varía entre 5 y 10 unidades de metileno, preferentemente 5 o 10 (Esquema B), o una cadena de polietilenglicol de fórmula HOOC-(CH2)nO-[(CH2)2-O]m-(CH2)2-NH2

Esquema A

Esquema B

El espaciador en consecuencia tiene un grupo amino para la formación de un enlace amida con los grupos carboxilo del ácido hialurónico, y un grupo carboxilo para la formación de un enlace amida con el grupo amino de la dopamina. Los compuestos espaciadores adecuados para su uso en la preparación de los ácidos hialurónicos sulfatados de grado 2 de la invención tienen las siguientes fórmulas:

- HOOC-(CH2)n-NH2 en el que n es un número entero de 5 a 10, y es preferentemente 5 o 10;

- HOOC-CH2-(O-CH2-CH2)m-O-CH2-CH2-NH2 en el que m es 1 o 2.

Dichos compuestos son conocidos o se pueden preparar mediante procedimientos conocidos.

La reacción entre HAS2 y dopamina tiene lugar usando condiciones conocidas para la formación de enlaces amida, por ejemplo en presencia de agentes de condensación tales como carbonildiimidazol (CDI) o diimidas.

Para la preparación de derivados en los que la dopamina se une por medio de un espaciador al ácido hialurónico sulfatado, es preferible sintetizar primero el intermedio espaciador de dopamina y después conjugar el intermedio con HAS2. El espaciador, adecuadamente protegido en el grupo amino, se puede hacer reaccionar con clorhidrato de dopamina en presencia de bases y agentes de condensación convencionales. El intermedio resultante, después de la eliminación del grupo protector, después se hace reaccionar con HAS2 en las condiciones descritas anteriormente para la formación de enlaces amida.

El ácido hialurónico de partida puede derivar de cualquier fuente conocida, por ejemplo, por extracción de crestas de gallo (EP138572), fermentación o biosíntesis (de Bacillus, WO2012032154); en este caso específico se usa HAS de grado 2, preparado a partir de HA con un MW promedio en peso que varía entre 100.000 y 250.000 Da, en particular entre 180.000 y 230.000 Da, de aquí en adelante denominado "Mw 200 kDa". La preparación se realiza mediante procedimientos conocidos (EP0702699; IT102015000073016) y se informa en los ejemplos.

Peso molecular promedio (MW) significa aquí el MW promedio en peso, calculado mediante el procedimiento de la "viscosidad intrínseca" (Terbojevich et al., Carbohydr. Res., 1986, 363-377).

Los compuestos de la invención se pueden usar como vehículos de fármacos y para revestir endoprótesis.

Las prótesis implantables, principalmente compuestas por metal a base de titanio, con una estructura compacta o trabecular, se revisten simplemente mediante la pulverización de una solución de los compuestos de la invención sobre la prótesis, seguido opcionalmente mediante la pulverización de una solución de antibióticos o sustancias biológica o farmacológicamente activas, adecuadamente tratadas para que tengan carga positiva, tal como factores de crecimiento (BMP-2; TGF1P; IGF) o moléculas sintéticas, ya conocidas por su efecto inhibidor sobre la formación de biopelículas (tal como diclofenac en forma ácida).

Los antibióticos usables son aquellos con carga positiva, en particular gentamicina, daptomicina, vancomicina, ciprofloxacina, meropenem, amikacina, tobramicina, polimixina, colistina y bacitracina, preferentemente gentamicina, colistina y daptomicina.

Dichos antibióticos forman sales con ácidos hialurónicos sulfatados de grado 2 funcionalizados con dopamina. Dichas sales y las prótesis sobre las que se adsorben son un objeto adicional de la invención.

El compuesto HAS2-dopamina de la invención tiene las siguientes ventajas respecto de la técnica anterior:

• es pulverizable. Mientras que la técnica anterior requiere que la prótesis se sumerja, a veces durante largos períodos (horas), en la solución que contiene el polímero "adhesivo", la presente invención se aplica mediante simple pulverización, incluso directamente en el quirófano, lo que asegura una cobertura uniforme y homogénea, mantenimiento total de la esterilidad, y sobre todo una reducción significativa, o incluso eliminación de los tiempos de adhesión y secado previos a la implantación de la prótesis;

• se adhiere perfectamente a la prótesis metálica;

• es biocompatible;

• conserva la rugosidad de superficie de la prótesis, necesaria para promover la integración con la matriz ósea;

• es esterilizable mediante las técnicas más conocidas (irradiación con rayos beta o gamma) y, después de la esterilización, mantiene intactas sus características estructurales (degradación no oxidativa de la dopamina) y por tanto, después de la conjugación con un antibiótico, también mantiene su eficacia biológica (actividad antibacteriana inalterada). Esto significa que, cuando sea necesario, la prótesis para implantar se puede revestir con HAS2-DOPA, esterilizar, almacenar mucho antes de su uso en el quirófano y pulverizar con antibiótico en el momento de uso, en cuyo caso no es necesario esperar. hasta el final de los tiempos de adhesión y secado de la prótesis en el quirófano, lo que es particularmente importante en el caso de operaciones prolongadas;

• estimula la regeneración de osteoblastos;

• genera un conjunto de cargas negativas adecuadas para la interacción electrostática con antibióticos cargados positivamente (o moléculas activas en general). De esta forma se reduce considerablemente la aparición de infecciones, porque se previene o limita fuertemente la formación de una biopelícula bacteriana;

• no tiene prácticamente efecto similar a la heparina, aunque contiene grupos sulfato y, por tanto, no origina sangrado anormal,

• actúa de forma excepcionalmente eficaz, rápida y duradera.

Descripción de figuras

Figura 1: Imagen ESEM de la superficie de un cilindro de titanio sin tratar y los correspondientes espectros XPS de las zonas destacadas.

Figura 2: Imagen ESEM de la superficie de un cilindro de titanio revestido con el derivado del ejemplo 3 y los correspondientes espectros XPS de las zonas destacadas.

Figura 3: Imagen ESEM de la superficie del cilindro tratado con el derivado del ejemplo 3 y después lavado. Figura 4: Curvas que muestran la inhibición del crecimiento de S. aureus en cilindros de titanio funcionalizados con el HAS2-DOPA del ejemplo 3 o el HA-DOPA del ejemplo 12 revestidos con gentamicina.

Figura 5: Actividad antimicrobiana expresada en CFU/ml del conjugado HAS2-DOPA del ejemplo 3 en comparación con el conjugado heparina-DOPA (HEPA-DOPA) del ejemplo 11 unido a gentamicina.

Figura 6: Efecto anticoagulante de HAS2-DOPA del ejemplo 6 en comparación con HEPA-DOPA del ejemplo 11.

Figura 7: Efecto sobre la proliferación de osteoblastos de HAS2-DOPA de los ejemplos 3 y 12 en comparación con fibronectina.

Ejemplos de preparación

Los conjugados de ácido hialurónico sulfatado de grado 2 con dopamina (de aquí en adelante llamado, HAS2-DOPA) se sintetizan en dos etapas: síntesis de HAS2 y reacción entre hAS2 y dopamina. HAS2, a su vez, se puede preparar a partir de HA salificado con tetrabutilamonio (TbA; EP702699) o salificado con sodio (IT102015000073016).

Ejemplo 1: preparación de HAS2 de HA-TBA

2.0 g de masa seca (3,22 x10-3 mol; 1 equivalente) de HA-TBA (PM 200 kDa) se disolvieron en 200 ml de DMSO. Cuando se completó la disolución, se añadieron 3,59 g de Pyr^SO3 (8 equivalentes). Después de dejarlo durante la noche a temperatura ambiente, el producto se precipitó con EtOH, y el precipitado obtenido se filtró, se lavó dos veces con EtOH y se redisolvió en 150 ml de agua desionizada; se añadieron 8 ml de solución saturada de NaCl y 115 ml de DMSO, y se corrigió el pH a 3,4 ± 0,1 con NaOH 3M. El producto se precipitó con 440 ml de EtOH y el precipitado obtenido se filtró, se lavó con mezcla EtOH/H2O (80:20) y con EtOH, y finalmente se secó al vacío a 37 °C.

Ejemplo 2: preparación de HAS2 de HA-Na

4.0 g de masa seca (9,96 x 10'3 mol; 1 equivalente) de HA-Na+ (PM 200 kDa) se dispersaron en 220 ml de DMSO; se añadieron 3,6 ml de ácido metansulfónico (5 equivalentes) y la mezcla se dejó en agitación durante 24 h a temperatura ambiente. Cuando se completó la disolución, se añadieron 12,8 g de Pyr^SO3 (8 equivalentes). Después de dejarlo durante la noche a temperatura ambiente se precipitó el producto con EtOH, y el precipitado obtenido se filtró en un Gooch, se lavó dos veces con EtOH y se redisolvió en 150 ml de agua desionizada; se añadieron 8 ml de solución saturada de NaCl y 115 ml de DMSO, y se corrigió el pH a 3,4 ± 0,1 con NaOH 3M. El producto se precipitó con 440 ml de EtOH y el precipitado obtenido se filtró, se lavó con mezcla EtOH/H2O (80:20) y con EtOH, y finalmente se secó al vacío a 37 °C.

Ejemplo 3: síntesis del conjugado de HAS2-DOPA con 23% de derivatización (enlace directo)

2.0 g de masa seca (3,3 x 10'3 mol, 1 equivalente) de sal sódica de HAS2 preparada como en el Ejemplo 2 se disolvió en 100 ml de agua desionizada y se disolvieron 3,0 g de cloruro de benzalconio (BA+Cl‘) por separado en 100 ml de agua desionizada. Cuando se completó la solubilización, se añadió la solución BA+Cl' a la solución HAS2, así se obtiene un precipitado, el cual se filtró, se lavó en H2O, en EtOH y después en acetona, y se secó en un evaporador giratorio a alto vacío. El precipitado aislado se solubilizó en 160 ml de DMSO; después se añadieron 0,267 g (0,5 equivalentes) de CDI y 0,1 ml de ácido metansulfónico (0,5 equivalentes). Después de 30 minutos, se agitó a 40 °C, se añadieron 0,5 g (0,8 equivalentes) de clorhidrato de dopamina y la reacción continuó durante la noche con agitación lenta a 40 °C. Se añadieron 16 ml de solución saturada de NaCl al día siguiente y el producto se precipitó con EtOH. El precipitado obtenido se filtró y se lavó con 2 volúmenes de una mezcla que consiste en EtOH/H2O (85:15), después con EtOH y finalmente con acetona. El producto resultante se disolvió en 50 ml de H2O desionizada y se dializó (membrana de diálisis Spectra/Por® con corte = 12.000-14.000 Da) durante 3 días en tampón acetato 0,05 M pH 5, y durante 1 día en H2O ajustado a pH 5 mediante la adición de HCl 1 M.

Se reguló el tiempo de diálisis, se verificó la desaparición de dopamina libre en la membrana de diálisis por GPC. Finalmente, el producto dializado se congeló y se liofilizó.

Ejemplo 4: síntesis del conjugado de HAS2-DOPA con 55% de derivatización (enlace directo)

El derivado se sintetizó y se caracterizó como se describe en el Ejemplo 3, a partir de 2 g de sal sódica de HAS2, se salificó con BA y se hizo reaccionar con 1,34 g (2,5 equivalentes) de CDI y 2,5 g (4,0 equivalentes) de clorhidrato de dopamina.

Ejemplo 5: síntesis del conjugado de HAS2-DOPA con 31% de derivatización (enlace directo)

El derivado se sintetizó y se caracterizó como se describe en el Ejemplo 3, a partir de 2 g de sal sódica de HAS2, se salificó con BA y se hizo reaccionar con 0,801 g (1,5 equivalentes) de CDI y 1,25 g (2,0 equivalentes) de clorhidrato de dopamina.

Ejemplo 6: síntesis del conjugado de HAS2-DOPA con 21% de derivatización (enlace directo)

El derivado se sintetizó y se caracterizó como se describe en el Ejemplo 3, a partir de 2 g de sal sódica de HAS2, se salificó con BA y se hizo reaccionar con 0,134 g (0,25 equivalentes) de CDI y 0,25 g (0,4 equivalentes) de clorhidrato de dopamina.

Ejemplo 7: síntesis del conjugado de HAS2-DOPA con 6% de derivatización (enlace directo)

El derivado se sintetizó y se caracterizó como se describe en el Ejemplo 3, a partir de 2 g de sal sódica de HAS2, se salificó con BA y se hizo reaccionar con 0,067 g (0,125 equivalentes) de CDI y 0,25 g (0,4 equivalentes) de clorhidrato de dopamina.

Ejemplo 8: síntesis de conjugado de HAS2-CONH-(CH2)10-CONH-dopamina con 5% de derivatización (enlace indirecto a través de un espaciador de alquilo con 10 átomos de carbono)

El enlace indirecto implica dos etapas: síntesis de la especie espaciadora de dopamina seguida de síntesis de espaciador de dopamina con HAS2:

- 8.1: Síntesis de dopamina-espaciador: NH2-(CH2)10-CONH-dopamina

Se disolvieron 0,55 g de ácido 11-(Boc-amino) undecanoico en 10 ml de DMF y se activó el carboxilo con 0,56 g de EDC (clorhidrato de N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida), se añadieron DMAP (0,07 g) en presencia de una base terciaria (TEA, 0,31 ml) a 0 °C con agitación. Se añadieron 0,4 g de clorhidrato de dopamina después de 10 min y se dejó la mezcla bajo agitación durante la noche RT. Después se añadieron 40 ml de diclorometano y 40 ml de H2O y la fase orgánica se extrajo, se lavó con agua y se secó en un evaporador giratorio. El grupo protector BOC se liberó mediante la adición de 5 ml de la siguiente mezcla ácida: TFA 15%/H2O 5%/DCM 80% y dejó la mezcla resultante con agitación durante 20 min a temperatura ambiente. A continuación, se evaporó el disolvente y se secó el producto.

- 8.2: Síntesis de HAS2-CONH-(CH2)10-CONH-DOPA

El derivado se sintetizó y se caracterizó como se describe en el Ejemplo 3, a partir de 1 g de sal sódica de HAS2, se salificó con BA y se hizo reaccionar con 0,45 g de CDI y 0,5 g de NH2-(CH2)10-CONH-DOPA obtenido como en el Ejemplo 8,1.

Ejemplo 9: síntesis del conjugado de HAS2-CONH-(CH2)5-CONH-dopamina con 5% de derivatización (enlace indirecto por medio del espaciador alquilo con 5 átomos de carbono)

El espaciador de dopamina se obtuvo usando ácido 6-(Boc-amino) caproico como reactivo y siguiendo el procedimiento descrito en el ejemplo 8.1.

El producto HAS2-CONH-(CH2)5-CONH-dopamina se obtuvo de acuerdo con el procedimiento descrito en el ejemplo 8.2.

Ejemplo 10: Síntesis del conjugado HAS2-CONH-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-CONH-DOPA con 5% de derivatización (enlace indirecto mediante espaciador de polietilenglicol).

El enlace indirecto implica dos etapas: síntesis de la especie espaciador-DOPA seguida de síntesis del espaciador-DOPA con HAS2.

Síntesis de DOPA-espaciador: NH2-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-CONH-DOPA

Se disolvieron 0,64 g de Boc-NH-(PEG)-COOH. DCHA (9 átomos) en 10 ml de DMF y se activó el carboxilo con 0,56 g de EDC (clorhidrato de N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida), se añadió DMAP (0,07 g) en presencia de un base terciaria (TEA, 0,31 ml) a 0 °C con agitación. Después de 10 min, se añadió DOPA (clorhidrato de dopamina) y se dejó bajo agitación a temperatura ambiente durante la noche. Después se añadieron 40 ml de diclorometano y 40 ml de H2O y la fase orgánica se extrajo, se lavó con agua y se secó en el evaporador giratorio. El grupo protector BOC se liberó mediante la adición de 5 ml de la siguiente mezcla ácida: TFA 15%/H2O 5%/DCM 80%, y se dejó en agitación durante 20 min a temperatura ambiente. A continuación, se evaporó el disolvente y se secó el producto. Se obtuvieron 0,5 g de producto (rendimiento 83%).

- Síntesis de HAS2-CONH-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-CONH-DOPA

El derivado se sintetizó como se describió previamente para el derivado HAS2-DOPA, a partir de 1 g de sal sódica de HAS2, se salificó con BA y se hizo reaccionar con 0,45 g de CDI y 0,5 g de NH2-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-CONH-DOPA.

Ejemplo 11 (comparativa): síntesis del conjugado de heparina (HEPA) -DOPA con 21% de derivatización (preparado de acuerdo con Lee et al., 2012)

1,0 g de masa seca (3,3 x 10'3 mol, 1 equivalente) de heparina sódica (HEPA) se disolvió en 50 ml de agua desionizada y se disolvieron 1,5 g de cloruro de benzalconio (BA+Cl‘) por separado en 100 ml de agua desionizada. Cuando se completó la solubilización, se añadió la solución de BA+Cta la solución de HEPA, de este nodo se obtiene un precipitado que se filtró, se lavó en H2O, en EtOH y después en acetona, y se secó en un evaporador rotatorio a alto vacío. El precipitado aislado se solubilizó en 80 ml de d Ms O; después se añadieron 0,134 g (0,5 equivalentes) de CDI y 0,05 ml de ácido metansulfónico (0,5 equivalentes). Después de 30 min con agitación a 40 °C, se añadieron 0,25 g (0,8 equivalentes) de clorhidrato de dopamina y la reacción continuó durante la noche con agitación lenta a 40 °C. Se añadieron 8 ml de solución saturada de NaCl al día siguiente y el producto se precipitó con EtOH. El precipitado obtenido se filtró y se lavó con 2 volúmenes de una mezcla constituida por EtOH/H2O (85:15), después con EtOH y finalmente con acetona. El producto resultante se disolvió en 50 ml de H2O desionizada y se dializó (membrana de diálisis Spectra/Por® con valor de corte = 3000 Da) durante 3 días en tampón acetato 0,05 M pH 5 y 1 día en H2O ajustado a pH 5 mediante la adición de HCl 1 M.

Se reguló el tiempo de diálisis, se verifica la desaparición de la dopamina libre en la membrana de diálisis por GPC.

Ejemplo 12 (comparativo): síntesis del conjugado de HA-DOPA con 23% de derivatización.

El derivado de HA-DOPA se sintetizó por el procedimiento descrito en el Ejemplo 3, a partir de 1,32 g (0,0033 moles) de sal sódica de HA 200 kDa, se salificó con BA y se hizo reaccionar con 0,267 g (0,5 equivalentes) de CDI y 0,5 g (0,8 equivalentes) de clorhidrato de dopamina.

Ejemplo 13: Prueba de adhesión del derivado de HAS2-DOPA

Como la dopamina actúa como un adhesivo a varios valores de pH, se probó su capacidad para revestir el conjugado HAS2-DOPA (preparado como se describe en el Ejemplo 5), se disolvió en p Bs a los dos valores de pH más representativos, a saber, 5 y 8:

- Solución A: 20 mg de HAS2-DOPA (31%) en 4 ml de MES 0,1 M pH 5.

- Solución B: 20 mg de HAS2-DOPA (31%) en 4 ml de PBS 0,1 M pH 8.

Se usó una sonda fluorescente cargada positivamente a cualquier pH (clorhidrato de Sanguinarine) para esta prueba, para simular la interacción del derivado con un antibiótico con carga positiva a pH fisiológico.

Se pulverizaron uniformemente dos cilindros de titanio (d = 15 x h = 17 mm) con la solución A y la solución B respectivamente, se lavaron con agua desionizada, se secaron en un flujo de aire y se sumergieron en diferentes viales que contienen una solución de Sanguinarine a la concentración de 0,5 mg/ml en MES 0,1 M, pH 5. Los cilindros se dejaron bajo agitación suave durante la noche a temperatura ambiente. Al día siguiente los cilindros se lavaron nuevamente con agua desionizada, se secaron bajo flujo de N2 y se irradiaron con lámpara UV a 360 nm, y se realizó una inspección visual.

De la evaluación de la fluorescencia emitida por los cilindros tratados se dedujo que el derivado de dopamina a pH 8 (Solución B) se adhirió mejor a la superficie. Este hallazgo demuestra que la solución B representa el enfoque ideal con el fin de realizar la presente invención.

13.1: Análisis por microscopio electrónico (ESEM) del revestimiento de la superficie de titanio

Esta prueba estableció que el derivado de HAS2-DOPA depositado por pulverización sobre la superficie del cilindro no solo se adhiere uniformemente al Ti, sino que mantiene la rugosidad superficial necesaria para promover la osteointegración de la prótesis con la matriz ósea. Se preparó una solución de HAS2-DOPA (23%; Ejemplo 3) 25 mg/ml en PBS 0,1 M, pH 8, y se pulverizó 1 ml de dicha solución sobre un cilindro de Ti; se dejó secar al aire y se observó la superficie bajo un ESEM, y se comparó con la de un cilindro sin tratar (Figs. 1 y 2). Se realizó el análisis XPS cualitativo (espectroscopia de rayos X de fotoelectrones, que detecta la presencia de material orgánico en la superficie analizada) además del barrido fotográfico. A continuación, se lavó el cilindro tratado para establecer si el derivado continuaba adhiriéndose a la superficie incluso en una situación en la que, como después de la implantación in vivo, estaba en contacto con un flujo de fluidos fisiológicos (Fig. 3).

La imagen de la superficie tratada muestra claramente la presencia de material, confirmada por el análisis XPS. Además, el derivado seco crea irregularidades en la superficie que le dan a la superficie una textura rugosa, lo cual es un parámetro importante para promover la integración del implante con la matriz ósea.

Después del lavado, los residuos del derivado todavía eran visibles en la superficie, lo que confirma que el derivado interactúa activamente con el Ti y continúa adhiriéndose incluso después del lavado.

Esto demuestra que el conjugado HAS2-DOPA:

• se adhiere perfectamente a la superficie del titanio, especialmente cuando se prepara en solución a pH = 8;

• también permanece adherido a la superficie después del lavado;

• y proporciona a la superficie metálica la textura rugosa necesaria para favorecer la osteointegración de la prótesis.

Ejemplo 14: Prueba de inhibición in vitro del crecimiento bacteriano de S. aureus (cilindro de titanio funcionalizado con HAS2-DOPA o HA-DOPA y Gentamicina)

Se prepararon los siguientes:

una solución de HAS2-DOPA (23%, Ejemplo 3) en PBS 0,1 M, pH=8;

una solución de HA-DOPA (23%, Ejemplo 12) en PBS 0,1 M, pH=8;

una solución de Gentamicina (25 mg/5 ml de 0,25 M MES, pH=5,2);

una solución de PBS 0,1 M, pH=8 (control).

Se pulverizaron 2 cilindros de titanio (d = 15 x h = 17 mm) con la solución de HAS2-DOPA, se dejaron secar al aire durante 15 minutos, se pulverizaron con la solución de gentamicina y se dejaron secar al aire nuevamente durante 15 minutos.

Se aplicó un tratamiento idéntico a los otros dos cilindros de titanio, de igual tamaño, que se pulverizaron primero con la solución del derivado HA-DOPA y después con la solución de Gentamicina, mediante los procedimientos descritos anteriormente.

Finalmente, se pulverizaron otros dos cilindros de titanio, de idéntico tamaño, con la solución de PBS y después con la solución de gentamicina, mediante los procedimientos descritos anteriormente.

Cada cilindro (total: 6) se sumergió una vez en agua MQ durante 5 segundos, se dejó secar al aire durante 15 minutos y se insertó en un caldo de cultivo (agua de peptona tamponada: peptona 10,0 g/L, cloruro de sodio 5,0 g/L, fosfato disódico anhidro 3,6 g/L, fosfato de potasio 1,5 g/L, Biokar Diagnostics) inoculado con 600.000.000 CFU/ml de Staphylococcus aureus. El caldo se incubó a 37 °C, y en tiempos preestablecidos (6 h, 12 h, 24 h, 48 h, 144 h) se recogió 1 ml de sobrenadante y se diluyó en escala 1:10 (según el crecimiento bacteriano), con solución salina estéril, para siembra en placa (Agar de PCA-Plate Count: triptona 5,0 g/L, extracto de levadura 2,5 g/L, glucosa 1,0 g/L, agar bacteriológico 12,0 g/L fabricado por Biokar Diagnostics) . Después se llevó a cabo el recuento de CFU/ml.

Los datos de porcentaje de inhibición del crecimiento bacteriano a lo largo del tiempo en comparación con el inóculo inicial de 600 millones de CFU/ml de S. aureus se muestran en la Fig. 4.

Los gráficos muestran claramente que:

• HAS2-DOPA actúa de manera mucho más efectiva que el control (PBS); esto significa que HAS2-DOPA libera gentamicina de forma controlada y constante en el tiempo;

• HAS2-DOPA actúa de una manera mucho más significativa que HA-DOPA;

• Sorprendentemente, además de la acción antimicrobiana total en las primeras 24 horas, HAS2-DOPA mantiene una cobertura antibacteriana a largo plazo hasta 144 horas, es decir, 7 días después de la inoculación, mientras que HA-DOPA permite que se reanude la proliferación de S. aureus después de solo 48 horas.

Se realizó un experimento similar con daptomicina a las mismas concentraciones y se obtuvo un perfil de actividad idéntico.

Ejemplo 15: Prueba comparativa: actividad antimicrobiana del conjugado HAS2-DOPA en comparación con el conjugado de heparina-DOPA (HEPA- DOPA) unido a gentamicina.

El conjugado HAS2-DOPA se preparó como en el Ejemplo 6, y el derivado de HEPA-DOPA como en el Ejemplo 11 (grado de derivatización: 21%).

Se pulverizaron 2 cilindros de titanio (d = 15 x h = 17 mm) con la solución de HAS2-DOPA o HEPA-DOPA respectivamente, a la concentración de 20 mg/ml en PBS a pH 8, y posteriormente con gentamicina a 5 mg/ml en MES, pH 5,2. Después se realizaron 3 lavados de inmersión sucesivos (5 segundos) en agua MQ; el propósito de los lavados repetidos es eliminar toda la gentamicina que no esté realmente unida electrostáticamente a las especies analizadas. Después se insertaron los cilindros en los tubos de ensayo con un inóculo de S. aureus (600.000.000 CFU/ml); se tomó 1 ml de sobrenadante en tiempos preestablecidos y después se diluyó en escala 1:10 (según el crecimiento bacteriano) con solución salina estéril para la siembra en placa (agar PCA-Plate Count: triptona 5,0 g/L, extracto de levadura 2,5 g/L, glucosa 1,0 g/L, agar bacteriológico 12,0 g/L (Diagnóstico Biokar), después se realizó el recuento de CFU/ml, como se muestra en la Figura 5.

Los resultados demuestran que el producto de HAS2-DOPA es mucho más activo para inhibir la proliferación de S. aureus, que el grado de derivatización y la concentración son iguales, y que dicha actividad continúa durante al menos 36 horas. Este resultado es particularmente significativo en vista del hecho de que el derivado HEPA-DOPA pierde progresiva y rápidamente su actividad antibacteriana, igualando el "Control" (que no tiene actividad antibacteriana) después de 36 horas.

Ejemplo 16: Comparación del efecto anticoagulante entre HAS2-DOPA y HEPA-DOPA

Se prepararon el conjugado HAS2-DOPA del Ejemplo 6 y el derivado de HEPA-DOPA del Ejemplo 11

El efecto anticoagulante se evaluó usando heparina pura como estándar. Se usó un kit (Hyphen BioMed, Biophen Heparin AT+Ref 221007) que emplea un procedimiento colorimétrico; Se mide el factor de coagulación Xa no complejado e inhibido por la heparina o el polímero de prueba. La absorbancia a 405 nm es directamente proporcional al factor Xa libre y, por tanto, inversamente proporcional a la actividad similar a la heparina de las especies analizadas (Figura 6).

Es evidente que el efecto anticoagulante de HAS2-DOPA es mucho menor que el de HEPA-DOPA, siendo la concentración igual; para obtener el mismo efecto (50% de reducción de Abs) con el sistema HAS2-DOPA, se necesita una concentración aproximadamente 50 veces mayor. Esto significa que el conjugado HAS2-DOPA tiene un efecto anticoagulante menor que los productos conocidos, aunque contiene un polímero sulfatado, exactamente como la heparina.

El conjugado HAS2-DOPA unido a gentamicina o a un antibacteriano similar es ventajoso porque además de ser aplicable por pulverización, se puede usar en tiempos muy cortos, prácticamente no tiene efecto similar a la heparina y por lo tanto no produce sangrado anormal, y actúa de una manera mucho más eficaz, rápida y duradera que los equivalentes conocidos.

Ejemplo 17: Evaluación del efecto de HAS2-DOPA y HA-DOPA sobre la proliferación de osteoclastos in vitro

Se prepararon los siguientes:

- una solución acuosa de HAS2-DOPA (23%, Ejemplo 3) 10 mg/ml

- una solución acuosa de HA-DOPA (23%, Ejemplo 12) 10 mg/ml

- una solución acuosa de fibronectina 20 mg/ml (control positivo).

La superficie circular superior de dos 2 cilindros de titanio (d = 153 x = 17 mm) se pulverizó con la solución de HAS2-DOPA y se dejó secar al aire durante 15 minutos; se aplicó un tratamiento idéntico a los otros dos cilindros de titanio, de igual tamaño, que se pulverizaron con la solución HA-DOPA según los procedimientos descritos anteriormente. Finalmente, se pulverizaron otros dos cilindros de titanio, de idéntico tamaño, con una solución de fibronectina en agua, según los procedimientos descritos anteriormente. La fibronectina se usa ampliamente como estándar de referencia en experimentos de proliferación celular in vitro porque estimula la adhesión, proliferación y migración celular.

Después, cada cilindro (total: 6) se sumergió una vez en agua MilliQ durante 5 segundos, se dejó secar al aire durante 15 minutos y se insertó en pocillo de placa; 0,10 ml de osteoblastos (línea celular Saos-2, de osteosarcoma) en el medio de cultivo (McCOY'S 5A+FBS 10%), que asciende a aproximadamente 50.000 células/cm2 de titanio, después se depositaron después sobre la superficie de cada cilindro. Las células se incubaron en titanio durante 4 ha 37 °C (CO25%) para permitir la adhesión; después se añadió medio hasta que se sumergieron los cilindros, y la incubación continuó durante la noche en las mismas condiciones.

El medio se eliminó al día siguiente y los cilindros se lavaron con PBS para eliminar las células no adherentes; después se añadió un volumen igual del mismo medio a cada cilindro con Azul Alamar 10%, y los cilindros se dejaron incubar durante 24 h a 37 °C (CO25%). Después de la incubación se realizó la lectura de fluorescencia (A excitación: 530 nm y emisión: 590 nm); la intensidad de la fluorescencia es proporcional al metabolismo celular y, por tanto, al número de osteoblastos viables.

Los resultados (Figura 7) demuestran que, con grado de derivatización y concentración iguales, HAS2-DOPA tiene una actividad de osteointegración muy alta, casi igual a la de la fibronectina y, sorprendentemente, casi el doble que la HA-DOPA. Los valores son estadísticamente significativos.

C- representa el control negativo, a saber, el cilindro de titanio "como tal", sin siembra de osteoblastos.

Ejemplo 18: Evaluación de la estabilidad a la esterilización con rayos beta y gamma de polvo de HAS2-DOPA 23% preparado como en el Ejemplo 3.

Como se describe en el Ejemplo 3, se prepararon tres muestras de 1 g de polvo de HAS2-DOPA 23%. Las muestras se sometieron, respectivamente, a:

• esterilización con rayos beta;

• esterilización con rayos gamma;

• sin esterilización (control).

A continuación, las muestras se analizaron mediante diferentes procedimientos conocidos, a saber, análisis estructural en 1H-RMN (espectroscopia de resonancia magnética nuclear de protones) después de la disolución del polvo en agua pesada (D2O), con análisis IR (en pellet de KBr) y finalmente, con análisis de UV visible (UV-Vis) después de disolución en agua.

Los resultados del análisis confirmaron que las señales de las muestras esterilizadas son idénticas y, sobre todo, que no hay diferencia entre ellas y las señales del control sin esterilizar. En particular, no se observaron señales debidas a la formación de subproductos (análisis de RMN e IR) o cambios de señal de absorción de UV-Vis debidos, por ejemplo, a la oxidación de la dopamina.

El polímero HAS2-DOPA es por tanto estable y compatible con la esterilización por rayos beta o gamma.

Ejemplo 19: Prueba de inhibición in vitro del crecimiento bacteriano de S. aureus sobre el cilindro de titanio funcionalizado con HAS2-DOPA y esterilizado con rayos beta y posterior tratamiento con vancomicina.

Se prepararon los siguientes:

una solución de HAS2-DOPA (23%, Ejemplo 3), 10 mg/ml en agua;

una solución de vancomicina, 5 mg/ml en agua.

Un cilindro de titanio (d = 15 x h = 17 mm) (muestra A, control) no se sometió a ningún tratamiento, mientras que un segundo cilindro de titanio de las mismas dimensiones (muestra B) se pulverizó con la solución HAS2-DOPA y se dejó secar al aire durante 15 minutos.

Ambos cilindros se esterilizaron mediante irradiación con rayos beta, posteriormente se pulverizaron con la solución de vancomicina preparada y finalmente se dejaron secar al aire durante 15 minutos.

A continuación, se sumergieron ambos cilindros 10 veces en diferentes soluciones de agua MQ durante 5 segundos, para eliminar el exceso de antibiótico presente, y se dejaron secar al aire durante 15 minutos. Se distribuyó uniformemente una suspensión de Staphylococcus aureus (200 ml de O. D. a 650 nm> 0,5) sobre la superficie del agar Mueller-Hinton (BD Biosciences) en una placa, y cada uno de los dos cilindros de titanio se colocó en el centro de la superficie de agar inoculada. La placa se incubó a 35 °C durante 18 h, y después se midió el diámetro de la superficie en el que el antibiótico inhibió el crecimiento bacteriano.

La muestra B, tratada con HAS2-DOPA y esterilizada, demostró inhibir el crecimiento bacteriano mucho más eficazmente que la muestra de control, que solo se esterilizó.

Esto significa que la esterilización no alteró la estructura ni las propiedades de HAS2-DOPA, que continúa anclado al Ti y, en consecuencia, conserva su capacidad para unirse a la vancomicina y posteriormente liberarla.

Se realizó un experimento similar con gentamicina a las mismas concentraciones y con vancomicina sobre muestras de titanio reticuladas, en las mismas condiciones y a las mismas concentraciones, y se obtuvo un perfil de inhibición del crecimiento bacteriano idéntico al comentado anteriormente.

Por tanto, la esterilización por rayos beta:

no altera la adhesión de HAS2-DOPA al titanio

no altera las propiedades estructurales de HAS2-DOPA

y por lo tanto no modifica la capacidad de HAS2-DOPA de unirse a un antibiótico y obtener el efecto antibacteriano deseado.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Ácido hialurónico sulfatado de grado 2 que tiene 2 a 60% molar de los grupos carboxílicos funcionalizados con dopamina conjugados directamente por medio de un enlace amida o por medio de un espaciador que tiene un grupo amino para la formación de un enlace amida con grupos carboxílicos del ácido hialurónico y un grupo carboxílico para la formación de un enlace amida con el grupo amino de la dopamina.

2. Ácido hialurónico sulfatado de acuerdo con la reivindicación 1 en el que la dopamina está conjugada directamente por medio de un enlace amida a 15-40%, preferentemente 20-32%, de los grupos carboxílicos del ácido hialurónico sulfatado.

3. Ácido hialurónico sulfatado de acuerdo con la reivindicación 1 en el que la dopamina está conjugada con el ácido hialurónico sulfatado por medio de un espaciador que tiene un grupo amino para la formación de un enlace amida con 2-20% de los grupos carboxílicos del ácido hialurónico sulfatado y un grupo carboxilo para la formación de un enlace amida con el grupo amino de la dopamina.

4. Ácido hialurónico sulfatado de acuerdo con la reivindicación 3 en el que el espaciador es un compuesto de fórmula HOOC-(CH2)n-NH2 en la que n es un número entero de 5 a 10, preferentemente 5 o 10.

5. Ácido hialurónico sulfatado de acuerdo con la reivindicación 3 en el que el espaciador es un compuesto de fórmula HOOC-(CH2)n-O-[(CH2)2-O]m-(CH2)2-NH2 en la que n es 1 o 2 y m es 1 o 2.

6. Ácido hialurónico sulfatado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 obtenido por funcionalización de un ácido hialurónico sulfatado de grado 2 preparado a partir de ácido hialurónico que tiene un peso molecular promedio en peso de 100.000 a 250.000 Da, en particular 180.000 a 230.000 Da.

7. Sales del los ácidos hialurónicos sulfatados de las reivindicaciones 1-6 con medicamentos con carga positiva.

8. Sales de acuerdo con la reivindicación 7, en las que los medicamentos con carga positiva se seleccionan de antibióticos, factores de crecimiento, y diclofenac en forma ácida.

9. Sales de acuerdo con la reivindicación 8, en las que los medicamentos con carga positiva se seleccionan de antibióticos aminoglucósidos, daptomicina, ciprofloxacina, meropenem, vancomicina, polimixina, colistina y bacitracina.

10. Sales de acuerdo con la reivindicación 9, en las que los antibióticos aminoglucósidos se seleccionan de amicacina, gentamicina y tobramicina.

11. Sales de acuerdo con la reivindicación 7, en las que los medicamentos con carga positiva son gentamicina, daptomicina, polimixina o colistina.

12. Los ácidos hialurónicos sulfatados de las reivindicaciones 1-6 para su uso como vehículos para medicamentos.

13. Los ácidos hialurónicos sulfatados de las reivindicaciones 1-6 para su uso en el revestimiento de artículos biomédicos.

14. Endoprótesis de titanio revestidas con las sales de las reivindicaciones 7-11.