KR20190079636A - 인터류킨 2 및 그로부터 유도된 단백질의 분비 수준을 증가시키는 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 생명공학 분야에 관한 것이며, 특히 인간 IL-2 및 그것의 유도된 뮤테인을 암호화하는 유전자에 단일 돌연변이를 도입하여 이들의 생물학적 기능에는 영향 없이 상이한 숙주에서 증가된 분비 수준을 얻는 것에 기초한 방법에 관한 것이다. 특히, 이들 돌연변이는 인간 IL-2의 주 서열에서 위치 35에 위치된 아미노산의 비-보존적 변화에 기초하며, 바람직하게 치환은 K35E, K35D 및 K35Q이다. 본 발명의 다른 목적은 본 명세서에 개시된 방법을 사용하여 재조합 인간 IL-2 및 그것의 유도된 뮤테인을 둘 다 얻기 위해 사용된 발현 시스템과 관련된 것이다. 상기 언급된 방법은 실험실 및 상업적 규모로 재조합 인간 IL-2 및 그것의 유도된 뮤테인의 생산 효능을 개선하는데 유용하다. 이 방법을 사용하여 얻어진 단백질은 입양 이식 요법에서 T 세포의 시험관내 확장에 사용될 수 있을 뿐만 아니라 치료적 목적을 위해서 사용될 수 있다.

Description

인터류킨 2 및 그로부터 유도된 단백질의 분비 수준을 증가시키는 방법
본 발명은 생명공학 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 인터류킨-2(IL-2)의 유전자에 돌연변이를 도입하여 이들의 생물학적 기능에는 영향 없이 상기 분자 및 그로부터 유도된 면역조정성 뮤테인 패밀리의 분비 수준을 증가시키는 방법에 관한 것이다.
IL-2는 모 T 세포에 대한 성장인자로서 보고되었고(Smith, K.A. Immunol. Rev. 51: 337-357, 1980), 면역 반응 내에서 이중 기능을 가진 조절제로서, 면역시스템의 이펙터 기능을 촉진하거나 억제하는 능력을 나타내는 것으로 알려져있다(Malek, T.R. Annu. Rev. Immunol. 26: 453-479, 2008; Hoyer K.K. et al, Immunol. Rev. 226: 19-28, 2008). IL-2의 주된 역할은 IL-2 수용체의 알파 사슬을 높은 수준으로 발현하는 조절성 T 세포의 자극을 통하여 면역학적 관용성(tolerance)을 유지하는 것과 관련된다고 여겨진다(Malek, T.R. & Bayer, A.L. Nat. Rev. Immunol. 4: 665-674, 2004). 베타 및 감마 서브유닛은 면역시스템의 이펙터 세포에 존재하는 중간 친화성 이량체 수용체를 형성하지만, 높은 수준의 알파 사슬은 조절성 T 세포에 고 친화성 삼량체 수용체를 제공하여, 이 세포 집단에 의한 사이토카인의 우선적 사용을 가능케 한다(Malek, T.R. & Castro, I. Immunity. 33: 153-165, 2010).
면역시스템에 대한 상반된 치료 효과를 야기하고 상이한 시나리오에서 원하는 면역 반응을 조정하도록 IL-2의 양분된 기능을 조사하였다. IL-2의 면역부활(immunopotentiating) 능력은 항-종양 반응을 자극하기 위해 사용되었다(Klapper, J.A. et al, Cancer. 113: 293-301, 2008). 한편, 자가면역 질환(Hartemann, A. et al, Lancet Diabetes Endocrinol.1: 295-305, 2013) 및 염증(Saadoun, D. et al, N. Engl. J. Med. 365: 2067-2077, 2011)의 제어와 이식편 대 숙주병(Koreth, A. et al, N. Engl. J. Med. 365: 2055-2066, 2011)의 제어를 위해, 이펙터 T 세포를 자극하거나 독성 효과를 야기하는데 불충분한 저 용량의 적용을 통해서 T 조절성 세포를 우선적으로 자극하는 IL-2의 능력을 조사하였다.
수용체의 서브유닛과의 상이한 결합 계면에서 돌연변이의 도입을 통한 IL-2의 상호작용의 격리가 상이한 면역조정 특성을 가진 뮤테인을 얻기 위한 방식으로서 제안되었다. 지정 돌연변이 유발에 의한 알파 사슬과의 계면의 선택적인 교란은 조절성 T 세포를 자극하는 능력은 감소되지만 베타/감마 이량체 수용체를 지닌 이펙터 세포에 대한 효현제 작용은 보유하는 소위 말하는 노-알파(no-alpha) 분자를 얻는 것을 가능케 했다(Carmenate, T. et al, J. Immunol. 190: 6230-6238, 2013; US 9,206,243 B2). 이 분자는 마우스에서 강한 항-종양 효과를 가진다. 한편, 베타 및/또는 감마 서브유닛과 IL-2 계면의 돌연변이 유발에 의한 파괴는 상이한 세포 집단의 자극을 선택적으로 조정하는 IL-수용체 길항제를 생성할 수 있다(Shanafelt, A.B. et al, Nat. Biotechnol. 18: 1197-1202, 2000; WO 2011/063770). 이러한 종류의 분자의 예들은 US 8,759,486 B2에 기재된 뮤테인 M1 및 M2이다.
상호작용 능력을 상실한 뮤테인에 더하여, 수용체의 하나 또는 다른 서브유닛과의 결합 능력 증가로 인한 초효현제(superagonist) 특성을 가진 IL-2의 돌연변이된 변이체가 또한 보고되었다. 베타 서브유닛에 대한 친화성의 증가는 이펙터 세포를 강하게 자극하며 강한 항-종양 효과를 가진 분자의 생성을 야기한다(Levin, A.M. et al, Nature. 484: 529-533, 2012). 한편, 수용체의 알파 서브유닛에 대한 IL-2의 증가된 친화성은 T 세포의 증식 반응을 시험관내 자극하는 뛰어난 능력을 가진 다른 초효현제 변이체를 발생시켰다(WO 2005/007121).
상기 설명된 IL-2-유도 뮤테인들은 합리적 설계, 인 실리코(in silico) 스크리닝 및 효모 세포 표면에 전시된 IL-2의 유도 진화(directed evolution)를 통해서 얻어졌다. 생물학적으로 활성인 IL-2의 사상 파지 전시가 달성되었지만(Buchli, P.J. et al, Arch. Biochem. Biophys. 339: 79-84, 1997; Vispo, N.S. et al, Immunotechnology 3: 185-193, 1997), 변형된 특성을 가진 사이토카인의 새로운 변이체에 대해서는 아직 조사되지 않았다.
IL-2 및 그것의 유도 뮤테인들의 면역조정 특성 외에, 이들의 치료적 이용을 위한 필수 요소는, 특히 실험실 규모나 산업 규모로, 또는 정상 및/또는 종양 세포 또는 조직의 트랜스펙션이나 형질도입에 의해, 이것을 충분한 양으로 얻을 수 있는 시스템의 개발이다.
IL-2 및 다른 관련된 분자들의 재조합 생성을 위한 주요 경로는 봉입체를 형성하는 이콜리(E. coli)의 세포질에서의 발현과 이후 시험관내 재-귀화 과정이었다(Devos, R. et al, Nucl. Acids Res. 11: 4307-4323, 1983; Weir, M.P. & Sparks, J., Biochem. J. 245: 85-91, 1987). 이 전략에 대한 유용성이 증명되었음에도 불구하고, 시작 단계부터 천연 IL-2와 매우 유사한 폴딩된 분자를 얻는데 까지 이르는 다른 발현 시스템에 대한 연구가 계속되어 왔다. 이들 발현 시스템의 일부에서 IL-2의 분비는 IL-2의 응집 경향에 의해 제한되었다(Halfmann, G. et al, J. Gen. Microbiol. 139: 2465-2473, 1993; Cha, H.J. et al, Biochem. Eng. J. 24: 225-233, 2005).
놀랍게도 본 발명의 발명자들은 이미 보고된 것이 아니며 인간 IL-2의 결정 구조의 분석으로부터 예측할 수 없는 몇몇 돌연변이를 발견했으며, 이들의 도입은 상이한 세포 타입에서 특이적 면역조정 특성을 가진 재조합 인간 IL-2 및 그로부터 유도된 다수의 뮤테인들을 분비하는 능력을 증가시킨다. 이 발견은 상업적 규모로 이들 돌연변이의 사용을 위한 근거를 제공한다.
한 구체예에서, 본 발명은 생물학적 기능에는 영향 없이 상이한 숙주들에서 재조합 인간 IL-2의 증가된 분비 수준을 가져오는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 제한은 아니지만 길항제, 초효현제 또는 선택적 효현제로서 작용하도록 설계된 인간 IL-2로부터 유도된 뮤테인을 포함하는 인간 IL-2를 암호화하는 유전자 및 그로부터 유도된 다른 폴리펩타이드에 독특한 돌연변이를 도입하는 것에 기초한다. 본 발명의 방법이 사용되는 경우 상기 단백질의 분비 수준의 증가는 돌연변이되지 않은 대응물에 비하여 적어도 3배 더 높다. 본 발명에서, 유도된 뮤테인은 인간 IL-2와 90%를 초과하는 동일성을 가진 것들을 말한다.
본 발명의 방법은 주 단백질 서열의 위치 35(모 서열에서 Lys)를 점유하는 아미노산의 비-보존적 변화를 초래하는 돌연변이, 바람직하게 K35E, K35D 및 K35Q 치환에 관한 것이다.
특히, 본 발명은 서열목록 제1서열 내지 서열목록 제18서열을 포함하는 군으로부터 선택되는 본 명세서에 기재된 방법에 따라서 얻어진 단백질에 관한 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 IL-2 또는 그로부터 유도된 다른 면역조정성 폴리펩타이드에 의해 형성된 융합 단백질의 합성을 암호화하는 다른 뉴클레오타이드 서열에 융합된 상기 기재된 돌연변이된 유전자 및 추가의 단백질 서열을 포함하는 유전자 구성물이다. 추가의 단백질 서열은 제한은 아니지만 사상 파지의 캡시드 단백질, 알부민, 항체의 Fc 영역, 전체 항체 또는 그것의 가변 도메인을 포함하는 항체 단편을 포함한다.
특정 구체예에서, 상기 기재된 분자를 얻기 위해 사용되는 숙주는 제한은 아니지만 이콜리, 효모 및 포유류 세포, 예컨대 특히 HEK-293, CHO, NSO를 포함한다. 본 발명의 방법은 실험실 규모와 상업적 규모 모두에서 IL-2 및 그로부터 유도된 다른 폴리펩타이드의 생산 효능을 개선하는데 유용하다.
다른 구체예에서, 본 발명의 목적은 시험관내 및 생체내에서 모두, 인간 IL-2 및/또는 그로부터 유도된 면역조정성 뮤테인 패밀리(단독의 또는 다른 단백질과 융합된)의 발현을 통해서 정상 및 종양 세포 및/또는 조직의 생리학을 변형하는 것이다. 구체적인 예는 입양 이식 요법(adoptive transfer therapy) 요법을 위한 T 림프구, B 림프구 또는 NK 세포의 형질도입; 또는 종양 조직의 직접 형질도입/트랜스펙션이다. 본 발명의 방법은 이와 관련하여 관심 분자의 분비를 증가시키는데 유용하다.
발명의 상세한 설명:
본 발명은 생물학적 기능에는 영향 없이 상이한 숙주들에서 재조합 인간 IL-2의 증가된 분비 수준을 가져오는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 제한은 아니지만 길항제, 초효현제 또는 선택적 효현제로서 작용하도록 설계된 인간 IL-2로부터 유도된 뮤테인을 포함하는 인간 IL-2를 암호화하는 유전자 및 그로부터 유도된 다른 폴리펩타이드에 독특한 돌연변이를 도입하는 것에 기초한다.
인간 IL-2로부터 유도된 단백질이 사상 파지 상에 전시되는 능력을 증가시 키는 돌연변이의 확인
사상 파지 상에 전시 수준을 증가시키는 독특한 돌연변이를 가진, 인간 IL-2로부터 유도된 폴리펩타이드는 사상 파지 상에 나타나는 108을 초과하는 분자의 라이브러리로부터 선택될 수 있다. 상기 폴리펩타이드에 상응하는 유전자가 파지미드 타입 발현 벡터(사상 파지 캡시드 단백질을 암호화하는 유전자 중 하나에 융합된)에 삽입되고 단백질 변이체를 표면에 전시하는 바이러스 입자를 생성하는데 사용될 수 있다. 출발 라이브러리는 전체 서열을 통틀어서 또는 일련의 미리 정해진 위치에서 상이한 다양성 정도를 포함할 수 있다. 이들 위치에서 모 잔기는 각각 20개 아미노산의 혼합물이나 또는 선택된 잔기의 하위군에 의해 치환될 수 있다. 다양성은 무작위 또는 부위-지정 돌연변이유발을 통해서 달성될 수 있다.
인간 IL-2의 증가된 전시 수준을 가진 파지의 선택은 고체 표면에 고정된 셀렉터 분자와 접촉하여 라이브러리로부터의 파지 혼합물의 인큐베이션, 세척에 의한 미결합 파지의 제거, 및 단백질 상호작용을 방해하는 조건하에 결합된 파지의 용출에 기초할 수 있다. 셀렉터 분자로서, 재조합 IL-2 수용체 서브유닛 중 하나 또는 IL-2나 그것에 유전자 융합된 펩타이드에 대해 지정된 단클론성 항체가 사용될 수 있다. 몇 번의 연속적인 선택 사이클이 유사한 조건하에 이루어질 수 있다. 선택된 파지 미드에 삽입된 DNA 서열의 분석은 더욱 풍부한 치환의 동정을 유도하고 파지 상에 전시되는 능력의 증가와 잠재적으로 관련되는 규칙성을 나타낼 수 있다.
IL-2 돌연변이된 변이체의 전시 수준은 상이한 IL-2 돌연변이된 변이체들과 자생 기준을 구별 없이 인식하는 고정된 캡처 분자 상에서, ELISA와 같은 결합 분석을 통해서 평가될 수 있다. 이러한 종류의 분석을 위한 캡처 분자로서, 파지미드 벡터 pCSM에 기초한 발현 시스템에서 모든 외래 단백질에 융합된, c-myc 펩타이드와 같은, IL-2 변이체에 유전자 융합된 마커 펩타이드 서열에 대한 항체가 바람직하다. IL-2 유도된 뮤테인 패밀리에 대한 상기 스크리닝에서 확인된 돌연변이의 효과는, 면역조정 기능의 변형을 동반하면서 IL-2 수용체의 상이한 서브유닛과의 상호작용에 선택적으로 영향을 미치는 서열 전체적으로 다양한 성질의 다수의 치환을 포함하는, 인간 IL-2에 대해 설명된 상이한 돌연변이된 변이체들의 서열에 상기 변화를 도입하는 것을 통해서 증명될 수 있다. 이러한 변형된 뮤테인은 모두 이들의 코딩 유전자를 파지미드 벡터에 삽입함으로써 사상 파지 상에 전시된다. 사상 파지 상의 각 뮤테인 전시 수준의 평가는 IL-2에 대해 설명된 대로 ELISA에 의해 수행될 수 있다. 본 발명의 일부로서 확인된 변화의 도입과 관련된 파지 전시 증가의 정도를 계산하기 위한 기준으로서, 어떤 추가의 변화 및 파지 상의 전시가 없는 모 뮤테인이 사용된다. 또는, 본 발명의 방법은, 세포막 상에 나타나는 수준이 증가된 IL-2 및/또는 그것의 유도된 뮤테인의 변이체를 선택하기 위한, 효모 또는 포유류 세포 상의 전시와 같은, 조합 생물학의 다른 플랫폼을 활용하여 수행될 수 있다.
상기 설명된 선택 과정으로부터, 반복되는 비-보존적 돌연변이는 위치 35에 출현할 수 있다(특히 K35E, K35D 및 K35Q).
가용성 단백질로서 및 봉입체로부터 그것의 재-귀화 과정에서의, 인간 IL-2 및 그것의 유도된 뮤테인의 분비 수준을 증가시킬 수 있는 확인된 돌연변이의 사용
인간 IL-2 및 그것의 유도된 뮤테인의 사상 파지 상의 전시를 증가시키는 일군의 돌연변이가 확인되면, 이들을 효모 또는 포유류 세포를 위한 가용성 발현 벡터에서 클로닝된 상응하는 코딩 유전자에 도입함으로써 가용성 단백질의 분비에 대한 동일한 변화의 효과가 증명될 수 있다. 상기 발현 벡터를 함유하는 숙주 세포에 의해 상청액에 분비된 단백질의 농도를 평가함으로써, 상기 변화를 포함하지 않는 모 대응물과 비교해서, 본 발명의 방법이 사용한 돌연변이의 도입과 관련된 IL-2 및 그것의 유도된 뮤테인의 분비 증가를 증명할 수 있다.
또는, 인간 IL-2 및 그것의 유도된 뮤테인의 증가된 생성은 정상 및/또는 종양 세포 및/또는 조직의 생체내 또는 시험관내 트랜스펙션 및/또는 형질도입으로부터 검증되어야 한다.
본 발명의 방법을 사용한 상기 설명된 연구는 IL-2 및 그것의 유도된 뮤테인 단독으로 또는 알부민, 인간 면역글로불린의 Fc 영역, 전체 항체 또는 그것의 가변 영역에 기초한 항체 단편과 같은 추가의 폴리펩타이드 서열에 융합된 IL-2 및 그것의 유도된 뮤테인으로 수행될 수 있다.
본 발명에서 설명된 돌연변이는 또한 이콜리의 세포질에서 봉입체로서 얻어진, 인간 IL-2 및 그것의 유도된 뮤테인의 시험관내 재-귀화의 과정을 개선하기 위해 사용될 수 있다. 재-귀화의 효능 증가는 돌연변이되지 않은 변이체와 비교하여 단백질 질량당 특이적 생물학적 활성을 측정함으로써 평가될 수 있다.
사용된 돌연변이와 IL-2의 생물학적 기능의 양립성 및 수용체 서브유닛과의 상호작용에 대한 선택적 조정의 양립성의 증명
본 발명의 방법에 의해 변형된 IL-2 변이체들의 생물학적 활성의 평가는, 성장을 위해 IL-2에 의존하는 T 림프구 부차 집단, NK 세포 및 림프양 기원의 셀라인과 같은, 상이한 세포 타입의 증식, 분화 및 활성화를 유도하는 능력의 보존을 증명하기 위한 시험관내 및 생체내 기술을 아우를 수 있다. 삼량체 수용체를 발현하는 T 림프구의 증식에 대한 자생 IL-2의 효과는 알라마르 블루 환원 비색 기술을 사용하거나 유세포분석법에 의해 CTLL-2 셀라인 증식을 시험관내 분석함으로써 확인될 수 있다. T CD4+ 림프구의 T 조절성 림프구로의 분화에 대한 자생 IL-2의 시험관내 효과 및 시험관내 NK 세포를 확장시키고 활성화할 수 있는 이 분자의 능력은 유세포분석법에 의해 확인된다.
본 발명의 방법에서 사용된 돌연변이와 그것의 수용체와의 IL-2 상호작용에 대한 선택적 조정의 양립성은 IL-2 수용체의 서브유닛 중 어느 것에 대한 결합 능력을 증가시키거나 감소시키도록 미리 설계 및/또는 선택된 뮤테인의 프레임워크에 상기 변화를 도입함으로써 증명될 수 있다. 결합 특성의 원하는 변화가 발생했는지 여부는 각각의 수용체 서브유닛으로 코팅된 마이크로타이터 플레이트에서 ELISA 실험을 통해 직접 확인함으로써 증명될 수 있다. 상이한 뮤테인들의 면역조정 및/또는 항종양 활성을 시험관내 및 생체내 특성화하기 위해 사용되는 분석들이 추가의 검증 도구로서 사용될 수 있다. 노-알파 뮤테인의 경우(Carmenate, T. et al. J. Immunol. 190: 6230-6238, 2013), 시험관내 T CD8+ 림프구 증식을 자극하는 능력을 자생 IL-2와 동일하게 유지한다는 것이 검증될 수 있다. 수용체의 베타 서브유닛에 대한 결합 능력이 증가되고 초효현제 활성을 가진 뮤테인의 경우(수퍼-베타 뮤테인), 시험관내 NK 세포 증식을 자극하는 능력을 자생 IL-2보다 더 높게 유지한다는 것이 검증될 수 있다. 두 경우 모두 증식은 유세포계수법에 의해 결정될 수 있다. 생체내 모집단 증식에 대한 차별적 효과는 브로모데옥시유리딘 통합 실험에 의해 확인될 수 있다. MB16F0 흑색종 계통을 사용한 실험적 전이 모델에서, 양쪽 뮤테인이 모두 자생 IL-2보다 큰 생체내 항종양 효과를 유도한다는 것이 증명될 수 있다.
도 1. 돌연변이된 IL-2의 파지 전시 수준의 ELISA 평가. 모든 파지 제조물은 1013 바이러스 입자/ml의 등가 농도로 조정되었다.
도 2. IL-2 또는 그것의 유도된 뮤테인과 인간 IgG1 Fc 도메인에 의해 형성된 융합 단백질 분비 수준의 ELISA 평가. 세포는
a. 돌연변이 K35E가 있는 IL-2 및 없는 IL-2
b. 추가 돌연변이 K35E가 있는 노-알파 IL-2(NA) 및 없는 노-알파 IL-2(NA)
c. K35E가 있는 수퍼-베타 IL-2(SB) 및 없는 수퍼-베타 IL-2(SB)
d. K35E가 있는 노-감마(no-gamma) M1 IL-2(NG M1) 및 없는 노-감마 M1 IL-2(NG M1)
e. K35E가 있는 노-감마 M2 IL-2(NG M2) 및 없는 노-감마 M2 IL-2(NG M2)
를 함유하는 융합 단백질을 코딩하는 유전자 구성물 및 폴리에틸렌이민으로 트랜스펙션되었다.
도 3. K35E 변이체에서 자생 IL-2의 분자 상호작용의 보존(ELISA)
도 4. CTLL-2 증식 분석을 사용한 K35E 치환하에서 IL-2 생물학적 활성의 보존
도 5. 생체내 IL-2-의존적 세포 집단을 확장시키는 IL-2 K35E의 능력
5a. IL-2 K35E 변이체 및 PBS가 주사된 마우스 비장의 사진
5b. 비장에서 CD3+CD8+ 기억 표현형(CD44hi) 세포 집단의 유세포분석 히스토그램
도 6. IL-2-유도 뮤테인에 대해서 이미 설명된 IL-2 수용체 알파 서브유닛에 대한 결합 능력의 상실과 K35E 치환의 양립성(ELISA). 인간(a) 및 마우스(b) 알파 서브유닛으로 미소적정 플레이트가 코팅되었다.
도 7. IL-2-유도 뮤테인에 대해서 이미 설명된 IL-2 수용체 베타 서브유닛에 대한 결합 능력의 증가와 K35E 치환의 양립성(ELISA)
실시예
실시예 1
기능적 돌연변이 인간 IL-2를 전시한 사상 파지의 분비 및 특성화
인간 IL-2의 몇몇 위치를 표적화하는 가벼운 무작위 라이브러리를 구성했다. 선택된 위치는 알파 서브유닛 수용체 인터페이스에 기여하는 측쇄가 있는 잔기를 가진 것들을 포함했다(K35, R38, T41, F42, K43, F44, Y45, E61, E62, K64, P65, E68, V69, N71, L72, Q74 및 Y107). 인간 IL-2는 각 표적화된 위치에서 모 뉴클레오타이드의 85%를 유지하고 나머지 3개 뉴클레오타이드의 등몰 혼합물 15%가 더해진 스파이크된 돌연변이 유발성 올리고뉴클레오타이드로 쿤켈(Kunkel) 돌연변이 유발에 의해 다양화되었고, 이로써 모든 선택된 영역에 중간 정도의 다양성을 도입했다. 생성된 109 클론의 라이브러리는 인터페이스의 각 위치에서 전체 20개의 아미노산을 포함하는 반면, 라이브러리 내의 각 분자는 새로운 폴리펩타이드의 탐색을 시작 분자에 가까운 기능적 서열 공간으로 제한하면서 단지 몇 개의 치환을 가졌다. 확립된 과정을 사용하여 폴리에틸렌 글리콜과 함께 침전시킴으로써 라이브러리 파지를 정제했다(Marks, J. et al, J. Mol. Biol. 222:581-597, 1991). 정제된 바이러스 입자를 재조합 알파 IL-2 수용체 서브유닛(R&D)으로 코팅된 면역튜브(Nunc, 덴마크) 상에서 인큐베이션했고, 이로써 파지 상에 전시되는 능력으로 인해 기능적 돌연변이된 IL-2 변이체들을 분리할 수 있었다. 두 독립된 패닝 과정을 인간 및 마우스 IL-2 수용체 서브유닛에 대해 수행했다. 미결합 파지의 세척 후, 염기성 트리에틸아민 용액을 첨가하여 결합된 파지를 용출했다. TG1 박테리아를 선택된 파지로 감염시키고, 이것을 M13KO7 헬퍼 파지를 사용하여 증폭시켜 새로운 선택 라운드에서 출발 물질로 사용했다. 4번의 파지 선택 라운드를 수행했다. 선택된 파지미드(세 번째에서 네 번째 선택 라운드까지)에서 삽입체의 서열화는 생성된 돌연변이 변이체들에서 유사성을 드러냈다. 돌연변이되지 않은 모 IL-2 유전자의 우세에도 불구하고(모 라이브러리에 매우 높게 표시된), K35E, K35D 및 K35Q 치환을 가진 변이체도 소량 있었으며, 이것은 사상 파지 상에 기능적 IL-2의 전시에 있어 위치 35에서 비-보존적 변화의 영향을 나타낸다. K35E가 가장 빈번한 치환이었다. IL-2/수용체 복합체(PDB 코드 3B5I 및 2ERJ)의 결정 구조 분석이 알파 서브유닛과의 인터페이스의 극성 주변 영역에서의 이온 상호교환에서 모 K35 잔기의 개입을 시사하기 때문에 이 발견은 놀라운 것이었다. 셀렉터 분자와의 상호작용을 유지할 수 있는 비-보존적 치환(사례 중 두 가지에서는 전하 반전)의 능력은 예상되지 않았다.
실시예 2
위치 35에 비-보존적 변화를 가진 인간 IL-2의 분비 및 파지 전시의 증가
라이브러리로부터 선택된 상이한 IL-2 변이체들의 이콜리 세포주변질로 분비되고 파지 상에 전시되는 능력을 비교했다. 자생 IL-2를 기준 분자로서 사용했다. 또한, 쿤켈 돌연변이 유발에 의해 K35R-함유 변이체(위치 35에 보존적 변화)를 구성하여 추가 대조군으로 사용했다. 모든 단백질은 파지미드 벡터 pCSM(M13 유전자 3에 융합된)에 코딩 유전자를 삽입하고 이어서 생성된 유전자 구성물로 형질전환된 TG1 박테리아로부터 파지를 생성하여 얻었다(Rojas G. et al, Immunobiology. 218: 105-113, 2013). 각 변이체의 파지 전시 수준을 9E10 단클론성 항체로 코팅된 미소적정 플레이트에서 ELISA에 의해 평가했다. 결합된 파지를 양고추냉이 퍼옥시다아제와 결합된 항-M13 항체로 검출했다. K35E, K35D 및 K35Q 치환은 모 분자와 비교하여 인간 IL-2의 전시를 증가시키는 것으로 나타났다(도 1). 이 증가는 전하 반전 변화인 K35E 및 K35D에서 10배, K35Q에서 7배였다. 한편, 보존적 변화인 K35R은 IL-2의 전시 능력을 변형시키지 않았다(도 1). 추가 연구를 위해 K35E를 선택했다.
실시예 3
분비 및 파지 전시에 대한 K35E 치환의 효과는 IL-2 돌연변이된 변이체 패널로 확장된다
쿤켈 돌연변이 유발에 의해 K35E를 인간 IL-2의 몇 개의 돌연변이된 변이체(파지-전시된 형태)의 유전자에 도입했다. 패널은 상이한 면역조정 기능을 수행할 수 있는 다음과 같은 4개의 뮤테인을 포함했다: 이펙터 T 세포에 대해 선택적 효현제 기능을 가진 노-알파 뮤테인 하나(Carmenate, T. et al, J. Immunol. 190:6230-6238, 2013; US 9,206,243 B2), 감마 IL-2 수용체 서브유닛에 대한 결합 능력을 상실한 길항제 뮤테인 하나(노-감마)(US 8,759,486 B2), 및 베타(수퍼-베타) 또는 알파(수퍼-알파) IL-2 수용체 서브유닛에 대한 증진된 결합 능력을 가진 초효현제 뮤테인 둘(Levin, A.M. et al, Nature. 484: 529-533, 2012; WO 2005/007121). 이들 단백질 각각을 전시한 파지를 생성 및 정제했고(K35E가 없는 모 분자와 함께), 이 외래 단백질의 전시 수준을 9E10 단클론성 항체로 코팅된 미소적정 플레이트에서 ELISA에 의해 평가했다. 자생 IL-2를 전시한 파지 제조물을 기준(그것 안에 100개 임의 단위/ml의 존재를 가정)으로 사용하여 표준 곡선을 구성해서 각 변이체에 대한 상대적 전시 수준을 계산했다. 표 1은 K35E의 도입과 관련된 각 뮤테인의 전시 수준의 증가를 나타낸다.
[표 1]
K35E 치환의 도입과 관련하여 시험된 뮤테인의 전시 수준의 증가
Figure pct00001

실시예 4
K35 치환은 IL-2 및 그것의 유도된 뮤테인에 기초한 융합 단백질의 인간 숙주 세포에 의한 분비를 증진시킨다
pCMX 발현 벡터에서, 인간 IgG1 Fc 영역 유전자에 인간 IL-2 및 그것의 유도된 뮤테인의 유전자를 융합하기 위한 유전자 구성물을 설계했다. 돌연변이 K35E를 가진 등가 구성물의 추가 패널을 또한 제조했다. HEK 293 T 세포(현탁액에서 성장하도록 적응된)를 폴리에틸렌이민과 적절히 혼합된 상기 유전자 구성물 각각으로 트랜스펙션했다. 트랜스펙션 부피는 50mL였다. 배양 6일 후에 트랜스펙션된 세포로부터 상청액을 수집했다. 재조합 IL-2-유도 단백질의 존재를 IL-2.2 단클론성 항체(모든 뮤테인 상에 존재하는 선형 에피토프에 대해 지정된)로 코팅된 미소적정 플레이트에서 ELISA에 의해 확인했다. 캡처된 융합 단백질을 양고추냉이 퍼옥시다아제와 결합된 항-인간 Fc 항체로 검출했다. 상청액 중 융합 단백질의 수준은 모 대응물과 비교하여 K35E 치환을 함유하는 분자에서 더 높았다(도 2a-e). 이러한 재조합 단백질을 단백질 A 친화성 크로마토그래피로 정제했다. 표 2는 정제 후 수율을 나타낸다.
[표 2]
현탁액에서 트랜스펙션된 HEK293 T 세포로부터의 인간 면역글로불린의 Fc 도메인에 융합된 IL-2 및 그것의 유도된 뮤테인의 정제 수율
Figure pct00002

실시예 5
K35E 치환은 자생 IL-2의 분자 상호작용과 양립성이다
인간 Fc-융합된 동종이량체 형태의 재조합 돌연변이된 IL-2(K35E)의 결합 능력을 자생 IL-2와 상호작용한다고 알려진 상이한 분자들로 코팅된 미소적정 플레이트에서 ELISA에 의해 평가했다. 코팅 분자 패널은 IL-2 상의 상이한 에피토프들을 인식하는 4개의 단클론성 항체는 물론 IL-2 수용체 알파 서브유닛(인간 또는 마우스 기원의)을 포함했다. 캡처된 융합 단백질을 양고추냉이 퍼옥시다아제와 결합된 항-인간 Fc 항체로 검출했다. 동일한 발현 시스템에서 생성된, 돌연변이되지 않은 IL-2를 포함하는 유사한 융합 동종이량체를 대조군으로 사용했다. 항체 및 수용체에 대한 돌연변이된 동종이량체의 결합은 K35E의 존재에 영향을 받지 않았고, 오히려 그것은 반대 효과를 야기했다. 모든 코팅 분자에 대한 돌연변이된 변이체의 반응성은 그것의 돌연변이되지 않은 재조합 대응물의 반응성보다 더 높았으며(도 3), 이것은 K35E 변이체의 항원성 및 기능성이 유사한 조건하에서 얻어진 돌연변이되지 않은 재조합 단백질보다 더 큰 정도로 자생 IL-2의 항원성과 기능성을 재현한다는 것을 시사한다.
실시예 6
Fc -융합된 IL-2 K35E는 CTLL -2 세포의 증식을 자극하는 능력을 유지한다
Fc-융합된 동종이량체 형태(현탁액에서 트랜스펙션된 HEK 293 T 세포로부터 정제된)의 돌연변이된 IL-2(K35E)의 CTLL-2 증식을 유도하는 능력을 평가했다. 재조합 인간 IL-2를 대조군으로 사용했다. 두 단백질의 상이한 농도의 존재하에 세포를 성장시켰고, 알라마르 블루 환원 비색 분석을 통해서 증식을 측정했다(도 4). GraphPad 소프트웨어를 사용하여 절반-최대 증식을 생성한 분자의 용량으로부터 비활성을 매번 계산했다. Fc-융합된 돌연변이된 IL-2(K35E를 포함하는)의 비활성은 4 x 106 IU/mg였고, 이는 기준 재조합 IL-2의 비활성(2, 3 x 106 IU/mg)과 동일한 범위였다. 이 결과는 K35E의 존재하에 IL-2 생물학적 활성의 보존을 나타냈다.
실시예 7
Fc -융합된 IL-2 K35E는 시험관내 기억 표현형 CD8 T 세포의 확장을 자극하는 능력을 가진다
IL-2-의존적 세포 모집단의 증식을 생체내 자극하는 단백질의 능력을 연구하기 위해 C57BL/6 마우스에게 Fc-융합된 돌연변이된 IL-2(K35E)를 4 x 104 IU 용량으로 매일 5회 5일 연속하여 제공했다. 처치 후 동물을 죽이고 비장을 관찰했다. 또한, 기억 표현형(CD44hi)을 가진 CD3+CD8+ 세포의 모집단 크기를 유세포계수법에 의해 결정했다. 실험 대조군은 포스페이트 완충 식염수(PBS)가 주사된 마우스 그룹이었다. 재조합 Fc-융합된 IL-2(K35E)는 비장의 확대(도 5a)와 기억 표현형 CD8 T 세포의 비율이 2배가 된 것(도 5b)으로 판단하건대 기억 CD8 T 세포에 대해 예상된 효과를 가졌다.
실시예 8
K35E 치환은 선택적 효현제의 특성을 결정하는 IL-2 수용체 알파 서브유닛에 대한 결합 능력의 상실과 양립성이다
이종이량체 베타/감마 수용체를 가진 이펙터 세포에 대한 작용에는 영향 없이 T 조절성 세포에 대한 자극 잠재성을 감소시키기 위해, IL-2 수용체 알파 서브유닛에 결합하는 능력의 상실을 가져오는 R38A, F42A, Y45A 및 E62A 치환을 함유하는, 이미 개시된(Carmenate, T. et al, J. Immunol. 190: 6230-6238, 2013; US 9,206,243) 인간 IL-2 및 노-알파 뮤테인의 결합 특성을 비교했다. 두 재조합 단백질은 모두 추가 K35E 돌연변이를 가졌고, 인간 면역글로불린의 Fc 도메인을 함유하는 융합 단백질로서 생성되었다. 미소 적정 플레이트를 인간(a) 및 마우스(b) 기원의 재조합 IL-2 수용체 알파 서브유닛으로 코팅했다. 캡처된 융합 단백질을 양고추냉이 퍼옥시다아제와 결합된 항-인간 Fc 항체로 검출했다. K35E의 도입은 모 대응물보다 더 높은 발현 수준을 가지며(도 2b) K35E 치환을 가지면서 돌연변이되지 않은 IL-2와 비교하여 인간 및 마우스 알파 사슬 결합이 심하게 감소된(도 6) 새로운 노-알파 분자를 발생시켰다. 이들 결과는 IL-2의 상호작용 및 면역조정 기능의 선택적 조정과 K35E의 양립성에 대한 첫 번째 증거가 되었다.
실시예 9
K35E 치환은 초효현제 변이체에 대해 이미 개시된 IL-2 수용체 베타 서브유닛 결합 능력의 증가와 양립성이다
돌연변이 L80F, R81D, L85V, I86V 및 I92F를 함유하는 IL-2 및 수퍼-베타 뮤테인(모두 추가 돌연변이 K35E를 가지며 인간 IgG1의 Fc 도메인에 융합된)의 결합 능력을 IL-2 수용체 베타 서브유닛으로 코팅된 플레이트에서 ELISA에 의해 평가했다. 캡처된 융합 단백질을 양고추냉이 퍼옥시다아제와 결합된 항-인간 Fc 항체로 검출했다. K35E의 도입은 모 수퍼-베타 뮤테인와 비교하여 더 높은 발현 수준을 가지며(도 2c) 초효현제 기능에 기초한 증진된 베타 서브유닛 결합 능력을 가지는(도 7) 새로운 분자를 발생시켰다. 이 결과는 수용체 서브유닛과의 상호작용 및 면역조정 기능에 변형을 가진 새로운 IL-2-유도 분자의 설계와 K35E 치환의 양립성에 대한 증거가 되었다.
<110> Centro de Inmunologia Molecular <120> Method for increasing the secretion levels of interleukin 2 and proteins derived from it <130> HIP0283CU <150> CU 2016-0171 <151> 2016-11-15 <160> 18 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 133 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> by DNA recombinant technology <400> 1 Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His 1 5 10 15 Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys 20 25 30 Asn Pro Glu Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys 35 40 45 Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys 50 55 60 Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu 65 70 75 80 Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu 85 90 95 Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala 100 105 110 Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile 115 120 125 Ile Ser Thr Leu Thr 130 <210> 2 <211> 133 <212> PRT <213> Artificial Sequence 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130 <210> 9 <211> 133 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> by DNA recombinant technology <400> 9 Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His 1 5 10 15 Leu Leu Leu Asp Leu Val Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys 20 25 30 Asn Pro Gln Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys 35 40 45 Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys 50 55 60 Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu 65 70 75 80 Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu 85 90 95 Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala 100 105 110 Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Ala Ser Ile 115 120 125 Asp Gly Thr Leu Thr 130 <210> 10 <211> 133 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> by DNA recombinant technology <400> 10 Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His 1 5 10 15 Leu Asn Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys 20 25 30 Asn Pro Glu Leu Thr 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Claims (15)

  1. 인간 IL-2의 서열에 단일 돌연변이를 도입하는 것을 특징으로 하는, 생물학적 기능에는 영향 없이 재조합 인간 IL-2 및 그것의 유도된 뮤테인의 분비 수준을 증가시키는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 분비 수준은 원래의 재조합 인간 IL-2 및 그것의 유도된 뮤테인과 비교하여 적어도 3배 더 높은 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 유도된 뮤테인은 인간 IL-2에 대하여 90%를 초과하는 동일성을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 도입된 돌연변이는 비-보존적인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 4 항에 있어서, 비-보존적 돌연변이는 주 서열의 위치 35에 도입되는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 5 항에 있어서, 위치 35의 돌연변이는 K35E, K35D 및 K35Q를 포함하는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 5 항 또는 제 6 항에 있어서, 재조합 인간 IL-2 및 그것의 유도된 뮤테인은 사상 파지의 캡시드 단백질, 알부민, 항체의 Fc 영역, 완전 항체 및 그것의 가변 도메인을 포함하는 항체 단편을 포함하는 군으로부터 선택된 단백질 중 어느 것에 융합되는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 5 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주는 이콜리, 포유류 세포 및 효모를 포함하는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 8 항의 방법에 의해서 얻어진 단백질.
  10. 서열목록 제1서열, 서열목록 제2서열, 서열목록 제3서열, 서열목록 제4서열, 서열목록 제5서열, 서열목록 제6서열, 서열목록 제7서열, 서열목록 제8서열, 서열목록 제9서열, 서열목록 제10서열, 서열목록 제11서열, 서열목록 제12서열, 서열목록 제13서열, 서열목록 제14서열, 서열목록 제15서열, 서열목록 제16서열, 서열목록 제17서열 및 서열목록 제18서열을 포함하는 군으로부터 선택된 제 5 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 얻어진 단백질.
  11. 실험실 또는 상업적 규모의 제 8 항에 따른 방법의 용도.
  12. 치료적 목적을 위한 제 9 항 또는 제 10 항에 따라서 얻어진 단백질의 용도.
  13. 입양 이식 요법(adoptive transfer therapy)에서의 T 세포의 시험관내 확장을 위한 제 9 항 또는 제 10 항에 따라서 얻어진 단백질의 용도.
  14. 제 5 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 정상 또는 종양 세포 및/또는 조직의 생리학을 변형시키기 위한 것임을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 14 항에 있어서, 변형된 세포는 NK 세포, T 또는 B 림프구인 것을 특징으로 하는 방법.
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