KR20190078827A

KR20190078827A - 서향 추출물 및 감초 추출물을 유효성분으로 함유하는 치약용 또는 구강세정제용 조성물

Info

Publication number: KR20190078827A
Application number: KR1020170180539A
Authority: KR
Inventors: 임재윤; 김주은; 함하늘; 아빈; 김진옥
Original assignee: 우석대학교 산학협력단; 유한회사 비엔트리니티
Priority date: 2017-12-27
Filing date: 2017-12-27
Publication date: 2019-07-05

Abstract

본 발명은 서향 추출물 및 감초 추출물을 유효성분으로 함유하는 치약용 또는 구강세정제용 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 항염증 활성을 갖는 서향 추출물과 항뮤탄스균 및 항소브리누스균 활성을 갖는 감초 추출물을 유효성분으로 함유하는 치약용 또는 구강세정제용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 조성물은 우수한 항염증 활성을 갖는 서향 추출물을 유효성분으로 함유하고, 항뮤탄스균 및 항소브리누스균 활성을 갖는 감초 추출물을 유효성분으로 함유함으로써 기존 치약이나 구강세정제에 사용되던 유해성분 없이도 구강질환을 효과적으로 예방할 수 있다.

Description

서향 추출물 및 감초 추출물을 유효성분으로 함유하는 치약용 또는 구강세정제용 조성물{Composition for tooth paste or mouth washing agent comprising Daphne odora Thunb. extract and Glycyrrhiza uralensis Fisch. extract as active ingredients}

본 발명은 서향 추출물 및 감초 추출물을 유효성분으로 함유하는 치약용 또는 구강세정제용 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 항염증 활성을 갖는 서향 추출물과 항뮤탄스균 및 항소브리누스균 활성을 갖는 감초 추출물을 유효성분으로 함유하는 치약용 또는 구강세정제용 조성물에 관한 것이다.

현대인들의 식생활 습관이 바뀜에 따라 각종 치주 질환이 증가하고 있는 추세이다. 또한, 점차 나이가 들수록 치아가 세균에 대한 저항력이 약해져 구강질환이 발생할 가능성이 높아지는데, 현대 사회가 점차 고령화되어 감에 따라 구강질환의 유병률 또한 점차 증가하고 있다.

그리고 최근 가계 의료 관련 지출 1위가 치과 진료비일 정도로 치과 진료에 상당한 비용이 소요되고 있으며, 치과 외래 환자수 또한 2007년 1,210만명에서 2014년 1,600만명으로 급증하는 추세이므로 치과 진료에 소요되는 가계비용은 더욱 증가할 것으로 보인다.

이에 따라 사람들의 구강건강에 대한 관심이 점점 높아지고 있다.

한편, 일반인들이 구강건강을 쉽게 관리할 수 있는 방법이 바로 치약이나 구강세정제를 이용하는 방법인데, 시판되는 대부분의 제품에는 파라벤, 트리클로산, 합성계면활성제와 같은 유해성분이 함유되어 있는 경우가 많고, 이 성분들의 유해성이 이슈화되면서 많은 소비자들이 천연소재로 만든 제품을 원하고 있다.

지금 우리사회는 경제 성장과 더불어 삶의 질을 향상시키고 웰빙(well-being)을 추구하는 생활 패턴으로 바뀌어가고 있으며, 신체건강은 물론 구강건강에도 관심이 높아지고 있다. 이에 따라 일반치약보다는 기능성치약의 수요가 점차 증가하고 있다.

최근 기능성 치약 종류는 갈수록 다양해지고 있으며, 의약외품으로 분류되어 약국에서 구매할 수 있었지만, 요즘은 시중에서 쉽게 구입할 수 있는 일반치약에도 각종 기능성을 포함하는 추세이다.

천연소재를 이용한 미용품, 의약품 산업은 사용범위가 매우 다양하고, 합성성분에 비해 안전하며 사람들의 관심 또한 많아 소비량이 매우 많다. 따라서 기능성 천연소재를 이용한 새로운 산업의 발달을 모색할 수 있으며, 아울러 수출 면에서도 전망이 밝아 농가 소득 증가의 측면에서도 도움이 될 것으로 기대된다.

이에 본 발명자는 구강관리에 유용한 천연소재를 발굴하고 이를 이용하여 구강질환의 예방에 우수한 효과를 갖는 치약용 또는 구강세정제용 조성물을 개발하고자 하였다.

대한민국 등록특허 제10-1777322호

따라서 본 발명의 주된 목적은 천연소재를 이용함으로써 기존에 사용되던 유해한 성분을 사용하지 않고도 구강질환의 예방에 우수한 효과를 갖는 치약용 또는 구강세정제용 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 서향(Daphne odora Thunb.) 추출물 및 감초(Glycyrrhiza uralensis Fisch.) 추출물을 유효성분으로 함유하는 치약용 또는 구강세정제용 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물에 있어서, 상기 서향 추출물은 50 내지 80%(v/v) 에탄올 추출물인 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 65 내지 75%(v/v) 에탄올 추출물인 것이 좋다.

본 발명의 조성물에 있어서, 상기 감초 추출물은 50 내지 80%(v/v) 에탄올 추출물인 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 65 내지 75%(v/v) 에탄올 추출물인 것이 좋다.

본 발명의 조성물에 있어서, 상기 서향 추출물과 감초 추출물의 비율은 2 : 1 내지 4 : 1의 중량비인 것이 바람직하다.

본 발명의 조성물은 우수한 항염증 활성을 갖는 서향 추출물을 유효성분으로 함유하고, 항뮤탄스균 및 항소브리누스균 활성을 갖는 감초 추출물을 유효성분으로 함유함으로써 기존 치약이나 구강세정제에 사용되던 유해성분 없이도 구강질환을 효과적으로 예방할 수 있다.

도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 감초 추출물(FBM173-46)의 Streptococcus mutans에 대한 항균활성을 조사한 결과이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따른 감초 추출물(FBM173-46)의 S. sobrinus에 대한 항균활성을 조사한 결과이다.
도 3은 본 발명의 일실시예에 따른 서향 추출물(DO)이 염증관련 단백질(COX-2 및 iNOS)의 발현에 미치는 영향을 western blot으로 조사한 결과이다.
도 4는 본 발명의 일실시예에 따른 서향 추출물(DO)이 NO 생성에 미치는 영향을 조사한 결과이다.
도 5는 본 발명의 일실시예에 따른 서향 추출물(DO)이 염증 사이토카인(IL-6, IL-1β 및 TNF-α)의 분비에 미치는 영향을 조사한 결과이다.
도 6은 본 발명의 일실시예에 따른 서향 추출물(DO)이 염증관련 단백질(COX-2 및 iNOS)의 발현에 미치는 영향을 Real-time PCR로 조사한 결과이다.

본 발명의 서향 추출물은 우수한 항염증 활성이 있고, 감초 추출물은 우수한 항뮤탄스균 및 항소브리누스균 활성이 있어, 이들을 유효성분으로 하여 치약 또는 구강세정제의 용도로 사용할 수 있다.

본 발명의 서향 추출물 및 감초 추출물은 에탄올이 함유된 용매를 사용하는 당업계의 통상적인 추출방법으로 제조될 수 있다. 이때 용매로는 에탄올이 50 내지 80%(v/v)로 함유된 용액을 사용하는 것이 본 발명의 항염증 및 항균활성을 위해 바람직하다. 보다 바람직하게는 에탄올의 함량이 65 내지 75%(v/v)인 용매를 사용하는 것이 좋다. 이에 따르면 본 발명에서 기대하는 효과를 위한 성분들을 가장 효과적으로 추출할 수 있을 것이라 판단된다.

용매를 사용한 추출방법으로 서향 또는 감초를 용기에 담고 여기에 용매를 첨가한 상태로 추출하는 방법을 사용할 수 있다. 이때 용매의 첨가량은 서향 또는 감초의 건조물 중량을 기준으로 5 내지 20배로 하는 것이 바람직하다. 용매를 너무 많이 첨가하면 용매를 낭비하는 것이 되며, 너무 적게 첨가하면 유용한 추출물이 충분이 추출되지 않을 수 있다. 추출시간은 3 내지 7시간으로 하는 것이 바람직하고, 추출온도는 70 내지 90℃인 것이 바람직하다. 추출시간이 너무 길면 유용하지 못한 부가적 성분까지 추출될 수 있으며, 너무 짧으면 유용한 성분이 충분히 추출되지 않을 수 있고, 추출온도가 너무 높으면 유용성분이 변질되거나 파괴될 수 있으며, 너무 낮으면 유용성분과 용매의 활성도가 낮아져 추출효율이 낮아질 수 있다. 또한 진탕추출하여 추출효율을 높이는 것이 바람직하다. 추출 이후에는 추출물에 포함된 추출용매의 제거과정을 거쳐 유용성분을 농축하는 것이 바람직하며, 적은 양의 물 등에 녹이고 동결건조함으로써 제제화를 용이하게 하는 것이 바람직하다.

본 발명의 추출물 제조에 사용되는 원료인 서향 및 감초는 재배한 것 또는 시판되는 것에 제한없이 사용될 수 있으며, 물로 세척하여 이물질 등을 제거한 후 건조하여 사용하는 것이 바람직하다. 건조는 그늘에서 바람이 잘 통하는 곳에서 이루어지는 것이 바람직하다. 직사광선 하에서 건조하는 경우 유용한 성분이 빛에 의해 물리화학적으로 변하거나 휘발될 수 있기 때문이다.

본 발명의 조성물은 상기 서향 추출물 및 감초 추출물의 혼합물일 수 있으며, 주성분인 상기 서향 추출물 및 감초 추출물에 1종 또는 2종 이상의 제제화에 허용가능한 통상적인 담체 및 1종 또는 2종 이상의 첨가제를 선택하여 통상적인 제형으로 제조할 수 있다.

본 발명 조성물의 사용량은 사용하는 사람의 체중, 연령, 성별, 구강상태 등에 따라 조절될 수 있어 그 범위가 다양하며, 본 발명의 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 자명하게 다양한 범위 내에서 사용할 수 있으나, 통상적으로 일일 사용량은 서향 추출물 및 감초 추출물의 혼합물(3 : 1 중량비) 건조중량을 기준으로 1 ~ 500㎎/㎏이고, 바람직하게는 5 ~ 300㎎/㎏이고, 더욱 바람직하게는 50 ~ 200㎎/㎏이며, 하루 1 ~ 10회 사용할 수 있다.

본 발명의 조성물은 여러 가지 향미제 등의 첨가물을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1. 추출물 제조

1-1. 서향 추출물 제조

서향의 줄기와 잎을 깨끗하게 수세하고 음건시켜 나온 것을 분쇄기로 분쇄하여 분말화한다. 준비된 서향의 건조분말 100g에 1000㎖의 70% 에탄올(HPLC 등급)을 가하여 80℃에서 6시간 진탕 추출하고, 추출액을 식힌 다음 3M 여과지(0.25㎜)를 사용한 감압 여과를 2회 반복 실시하여 추출잔사를 제거한다. 여과된 여과액을 회전감압농축기를 사용하여 추출용매를 완전히 제거한 후 물이 조금 남은 상태에서 -80℃의 초저온 냉동고에 이틀 정도 냉동시킨 후 동결건조하여 추출물을 얻는다.

1-2. 감초 추출물 제조

상기 서향 추출물 제조와 동일한 방법을 사용하되, 서향 대신 감초를 사용하여 추출물을 얻는다.

실험예 1. 감초 추출물의 항균활성

균주 : Streptococcus mutans KCTC 3065, S. sobrinus KCTC 5809(생명공학연구소 유전자은행(KCTC)에서 분양받아 사용)

검정 방법 : Liquid growth inhibition assay

상기 균주에 대한 추출물 시료의 항균활성을 측정하기 위해, 96 well plate에 균주와 시료를 넣고 측정하는 liquid growth inhibition assay 방법을 사용하였다.

추출물 시료로는 한국식물추출물은행(KPEB)에서 구매한 국내와 해외의 다양한 자생식물의 추출물을 이용하였다.

각 시료들을 먼저 DMSO로 100㎎/㎖의 농도로 용해시킨 뒤, 다시 autoclave한 PBS를 사용해 1㎎/㎖의 농도로 희석하였다. 그 다음 각 시료를 10㎕씩 assay system의 96 well plate에 넣고, 2.5×10³ cells/㎖이 되도록 희석한 균액 90㎕를 넣어 시료의 최종농도가 100㎍/㎖이 되도록 하고, 37℃ 항온기에서 24시간 배양한 다음 650nm에서 흡광도를 측정하여 항균활성을 조사하였다.

항균활성은 추출물 시료를 넣지 않고 균액만 넣은 음성대조군의 흡광도를 100%로 하여 이에 대한 각 실험군의 흡광도를 %로 나타내었다. 추출물 시료 대신 암피실린(ampicillin)(200μM)을 넣은 것을 양성대조군으로 사용하였다.

다양한 추출물 시료의 항균활성을 측정한 결과, 도 1 및 2에서와 같이 감초 추출물이 두 균주 모두에 대해 암피실린과 비슷한 정도로 매우 우수한 항균활성을 보였다.

실험예 2. 서향 추출물의 항염증활성

2-1. 염증관련 단백질의 발현저해활성(I)

RAW 264.7 세포주에 LPS(lipopolysaccharide)(1㎍/㎖)를 처리하여 염증반응을 유발시키고 서향 추출물(DO)을 각각 10, 50, 100㎍/㎖의 농도로 처리한 후 염증관련 단백질인 COX-2와 iNOS 단백질을 western bolt 방법으로 측정하여 서향 추출물이 염증관련 단백질의 발현에 미치는 영향을 조사하였다.

이때 음성대조군은 LPS(lipopolysaccharide) 만을 처리하였고, 양성대조군은 소염진통제인 ibuprofen을 처리하였다.

이의 결과, 도 3에서와 같이 서향 추출물은 염증반응이 유도된 상황에서 COX-2와 iNOS 단백질 발현에 대한 우수한 저해활성을 나타내었다. 이 활성은 농도 의존적이며, 특히 100㎍/㎖의 농도에서는 양성대조군으로 사용한 ibuprofen과 비슷한 정도의 우수한 활성을 나타내었다.

Western blot

Polyacrylamide gel에 각 처리군 세포의 단백질을 로딩한 후 TG-SDS buffer 안에서 200V로 전기영동한다. Paper, gel paper 순으로 transfer 기기 장착 후 100V 1시간 혹은 30V로 16시간 실행한다. Ponceur로 염색하여 loading한 단백질량을 검정하고, blocking solution(PBS 90㎖ + milk 10g + 5% BSA 2㎖, pH 7)으로 2시간 bloking한다. 1차 antibody(blocking buffer로 항체희석)로 2시간동안 sealing pouch에 넣어 반응시킨 후 0.1% PBST로 5분씩 5번 세척한다. 2차 antibody로 45분 inverting하며 반응시킨 후, 0.1% PBST로 5분씩 5번 세척하고 ECL 1분 반응 후 암실에서 film exposure하여 현상하거나 이미징 장비로 분석한다.

2-2. NO 생성억제활성

RAW 264.7 세포주에 LPS(1㎍/㎖)를 처리하여 염증반응을 유발시키고 서향 추출물(DO)을 각각 10, 50, 100㎍/㎖의 농도로 처리한 후 체내 염증유발 분자인 NO(nitric oxide)의 양을 Griess 시험으로 측정하여 서향 추출물이 NO 생성에 미치는 영향을 조사하였다.

이때 음성대조군은 LPS 만을 처리하였고, 양성대조군은 소염진통제인 ibuprofen을 처리하였다.

이의 결과, 도 4에서와 같이 서향 추출물은 염증반응이 유도된 상황에서 NO의 생성에 대한 우수한 저해활성을 나타내었다. 이 활성은 농도 의존적이며, 특히 100㎍/㎖의 농도에서는 양성대조군으로 사용한 ibuprofen 보다 더 우수한 활성을 나타내었다.

NO 측정

96 well plate에 각 실험군의 세포배양액을 100㎕씩 넣어준 뒤 Griess시약 1, 2를 각각 50㎕씩 넣고, 상온에서 10분간 차광상태로 반응시킨 다음 540nm에서 흡광도를 측정한다.

2-3. 염증 사이토카인 분비저해활성

RAW 264.7 세포주에 LPS(1㎍/㎖)를 처리하여 염증반응을 유발시키고 서향 추출물(DO)을 각각 10, 50, 100㎍/㎖의 농도로 처리한 후 배양액으로 분비되는 염증 사이토카인(cytokine) IL-6, IL-1β 및 TNF-α의 양을 cytokine ELISA 방법으로 측정하여 서향 추출물이 염증 사이토카인의 분비에 미치는 영향을 조사하였다.

이의 결과, 도 5에서와 같이 서향 추출물은 염증반응이 유도된 상황에서 IL-6와 IL-1β의 분비에 대한 농도 의존적인 우수한 저해활성을 나타내었다. 하지만, TNF-α 분비에 대한 저해활성은 없는 것으로 나타났다.

Cyrokine ELISA

분석에 필요한 시약들을 실험조건에 맞게 희석하여 준비한 다음 세포배양액을 희석한다(sample diluent로 2배 희석, sample diluent 50㎕ + sample 50㎕). 그 다음 well을 wash buffer(X20)(wash buffer 10㎖ + DW 190㎖)로 400㎕씩 2번 15초씩 washing하고, sample diluent를 50㎕씩 넣은 뒤, 희석한 sample도 50㎕씩 넣어준다. 그 다음 50㎕씩 biotin-conjugate를 모든 well에 넣어준 뒤 well을 상온에서 2시간 동안 방치하여 반응시킨다. 그 다음 wash buffer로 6회 washing고, TMB 기질액을 sample당 100㎕씩 넣은 다음 30분간 차광하여 반응시킨다. 청색이 되면 그 상태에서 정지액(stop solution)을 100㎕씩 넣고 450nm에서 흡광도를 측정한다.

2-4. 염증관련 단백질의 발현저해활성(II)

RAW 264.7 세포주에 LPS(1㎍/㎖)를 처리하여 염증반응을 유발시키고 서향 추출물(DO)을 각각 10, 50, 100㎍/㎖의 농도로 처리한 후 염증관련 단백질인 COX-2와 iNOS 단백질의 mRNA 발현을 real-time PCR로 측정하여 서향 추출물이 염증관련 단백질의 발현에 미치는 영향을 조사하였다.

이때 음성대조군은 LPS 만을 처리하였고, 양성대조군은 ASP를 처리하였다.

이의 결과, 도 6에서와 같이 서향 추출물은 염증반응이 유도된 상황에서 COX-2와 iNOS 단백질의 mRNA 발현에 대한 농도 의존적인 우수한 저해활성을 나타내었다.

Real-time PCR

Qiagen RNasy kit를 사용하여 각 처리군 세포에서 RNA를 분리하고, cDNA를 합성한다. 그 다음 Real-time PCR로 정량적 분석을 실행한다.

Claims

서향(Daphne odora Thunb.) 추출물 및 감초(Glycyrrhiza uralensis Fisch.) 추출물을 유효성분으로 함유하는 치약용 또는 구강세정제용 조성물.