KR20190064756A

KR20190064756A - 면역력 개선 및 바이러스 질환 예방 효과를 지닌 유산균 발효액

Info

Publication number: KR20190064756A
Application number: KR1020170163915A
Authority: KR
Inventors: 노한승
Original assignee: 노한승
Priority date: 2017-12-01
Filing date: 2017-12-01
Publication date: 2019-06-11
Also published as: KR102025115B1

Abstract

본 발명은 면역력 개선 효과 및 바이러스 질환 예방 효과를 지닌 유산균 발효액에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 생균제제로 제조된 빵을 건조시킨 후 분쇄시켜 수득된 빵 분말에 정제수 및 당류를 넣고 당도를 조절시킨 후 락토바실러스속 nhs221 균주(기탁번호 KCTC-11749BP호) 배양액을 넣어 발효 숙성시킨 면역력 개선 효과 및 바이러스 질환 예방 효과를 지닌 유산균 발효액에 관한 것이다.

Description

면역력 개선 및 바이러스 질환 예방 효과를 지닌 유산균 발효액 {Lactobacillus fermented mixture both improving immunity and preventing virus infection}

면역계는 출생과 더불어 개체가 생존하는 동안 지속적으로 보유되고 있으면서 생체 내, 외부로부터 출현하는 각종 병원체 등의 이물질을 백혈구가 외래물질로 인식하여 그것을 파괴하고 소멸시켜 개체를 효과적으로 방어하는 생체방어체계를 의미한다.

생체는 병원성 미생물과 같은 다양한 외부인자로부터 방어작용을 하는데 이를 면역계라고 한다. 인체의 면역계는 감염에 대한 신체방어기전으로서, 태어날 때부터 가지고 있는 선천면역과 생활 등에 적응되어 얻어지는 후천면역의 두가지 메커니즘으로 구성되어 있다. 후천면역은 B 림프구, T 림프구의 면역세포를 포함하며 외부 항원에 대하여 특이적으로 작용하여 면역반응을 나타내고 면역 조절물질을 통하여 활성화된다.

면역조절물질은 생체 내의 면역세포를 비 특이적으로 자극해서 생체의 면역기능을 활성 또는 증진시켜 생체의 방어력을 증강시키는 물질을 말한다. 호중구와 대식세포 등의 식세포와 종양세포 괴사 활성을 가진 NK 세포 등이 활성화되는 선천성 자연 면역과 면역계를 총괄하는 T-림프구, 항체생성세포인 B-림프구 등이 활성화되는 획득 면역으로 분류된다.

B-림프구는 다시 T-림프구 등의 면역세포가 직접 반응을 활성화시키는 세포성 면역과 항체와 각종 세포의 신호전달분자인 사이토카인 등의 분자가 반응을 담당하는 체액성 면역으로 나눌 수 있다. 따라서 면역계에서 면역 초기 단계에서 중요한 역할을 하는 세포가 대식세포이며 일반적으로 면역 활성을 보기 위한 표적세포로 이용되는 것으로 이 대식세포에 의하여 활성화된 면역 반응 산물이 T 세포를 활성화하고 이를 통해 다른 면역반응을 유도하게 된다.

최근 비피도박테리아 균주를 포함하는 살아있는 미생물 제제인 생균제(프로바이오틱스)를 사용한 각종 건강기능성 제제가 개발되고 있다.

이에 본 발명자는 대한민국 특허출원 제10-2017-0017318호 '체중 조절 효과를 지닌 유산균 발효액'이라는 특허출원을 통해 상기 빵 분말에 정제수 및 당류를 넣고 당도를 조절시킨 후 락토바실러스속 nhs221 균주(기탁번호 KCTC-11749BP호) 배양액을 넣어 발효 숙성시킨 유산균 발효액을 비만 예방 및 체중 조절 효과를 지닌 기능성 음료로서 개시한 바 있다.

상기 특허문헌에 개시된 기능성 음료는 본 발명자가 이미 개발하여 상용화시킨 대한민국 특허등록 제10-923,051호 '기능성 생균제제 및 이를 이용하여 제조된 빵'을 주재료로 하고 정제수를 첨가시켜 혼합액을 제조한 후 여기에 락토바실러스속 nhs221 균주(기탁번호 KCTC-11749BP호) 배양액을 첨가 발효 숙성시켜 유산균 발효액을 제조한 것이다.

그런데 본 발명자는 락토바실러스속 nhs221 균주(기탁번호 KCTC-11749BP호) 유산균 발효액의 건강 기능성을 예의 주시하여 시험하던 중 지질 다당류(LPS)로 유도된 염증 마우스 모델에서 인터루이킨-6, 인터루이킨-1β 등의 면역증강물질을 분비 증가시킴으로써 면역력 개선 효과를 나타내며 돼지 인플루엔자 바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스 등의 바이러스 질환 예방 효과를 나타냄을 확인하고 이에 따라 면역력 개선 효과 및 바이러스 질환 예방 효과를 지닌 유산균 발효액을 개발함으로써 본 발명을 완성하게 된 것이다.

본 발명이 해결하고자 하는 과제는 락토바실러스속 nhs221 균주(기탁번호 KCTC-11749BP호) 유산균 발효액이 지질 다당류(LPS)로 유도된 염증 마우스 모델에서 인터루이킨-6, 인터루이킨-1β 등의 면역증강물질을 분비 증가시킴으로써 면역력 개선 효과를 나타내며 돼지 인플루엔자 바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스 등의 바이러스 질환 예방 효과를 나타냄을 측정코자 한 것이다. 또한 면역력 개선 효과 및 바이러스 질환 예방 효과를 지닌 유산균 발효액을 개발코자 한 것이다.

본 발명의 목적은 ⅰ) 생균제제로 제조된 빵을 건조시킨 후 분쇄시켜 수득된 빵 분말 100 중량부에 대해 정제수 300~500 중량부를 넣고 설탕 및/또는 과당을 첨가하여 10~15°Brix 농도로 당도를 조절하는 단계; 및 ⅱ) 락토바실러스속 nhs221 균주(기탁번호 KCTC-11749BP호) 배양액 0.8~1.2 중량부(1.0 ~ 6.0 ×10⁸ cfu)를 넣어 실온에서 40~80일 간 발효 숙성시켜 유산균 발효액을 수득하는 단계;로 이루어진 유산균 발효액의 제조 방법에 있어서, 상기 생균제제는 류코노스톡(Leuconostoc) 속의 생균주(기탁번호 KCTC-11226BP호)와 사카로마이세스(Saccharomyces) 속의 효모균주(기탁번호 KCTC-11227BP호)를 혼합시킨 생균제제임을 특징으로 하는 면역력 개선 효과 및 바이러스 질환 예방 효과를 지닌 유산균 발효액의 제조 방법을 제공하는 것이다.

또한 상기 유산균 발효액은 지질 다당류(LPS)로 유도된 염증 마우스 모델에서 인터루이킨-6, 인터루이킨-1β 등의 면역증강물질을 분비 증가시킴으로써 면역력 개선 효과를 나타냄을 특징으로 한다.

한편 상기 유산균 발효액은 돼지 인플루엔자 바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스 등의 바이러스 질환 예방 효과를 지님을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 유산균 발효액 1 중량부와 사료 100~10,000 중량부를 포함하는 면역력 개선 효과 및 바이러스 질환 예방 효과를 지닌 동물 사료를 제공하는 것이다.

본 발명의 효과는 락토바실러스속 nhs221 균주(기탁번호 KCTC-11749BP호) 유산균 발효액이 지질 다당류(LPS)로 유도된 염증 마우스 모델에서 인터루이킨-6, 인터루이킨-1β 등의 면역증강물질을 분비 증가시킴으로써 면역력 개선 효과를 나타내며 돼지 인플루엔자 바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스 등의 바이러스 질환 예방 효과를 나타내는 유산균 발효액을 제공하는 것이다.상기 유산균 발효액의 비만 예방 및 체중 조절 효과를 제공하는 것이다.

도 1은 SIV-GFP(돼지 인플루엔자 바이러스 - 녹색 형광 단백질)에 대한 본 발명의 제조실시예 1에서 제조된 유산균 발효액이 지니는 항바이러스 활성 실험결과를 나타낸 도면이다. 도 1A는 세포 생존능을 나타낸 도면이며 도 1B는 GFP 흡수도를 나타낸 도면이다.
도 2는 HSV-GFP(헤르페스 심플렉스 바이러스 - 녹색 형광 단백질)에 대한 본 발명의 제조실시예 1에서 제조된 유산균 발효액이 지니는 항바이러스 활성 실험결과로서, 도 2A는 세포 생존능을 나타낸 도면이며 도 2B는 GFP 흡수도를 나타낸 도면이다.

본 발명은 ⅰ) 생균제제로 제조된 빵을 건조시킨 후 분쇄시켜 수득된 빵 분말 100 중량부에 대해 정제수 300~500 중량부를 넣고 설탕 및/또는 과당을 첨가하여 10~15°Brix 농도로 당도를 조절하는 단계; 및 ⅱ) 락토바실러스속 nhs221 균주(기탁번호 KCTC-11749BP호) 배양액 0.8~1.2 중량부(1.0 ~ 6.0 ×10⁸ cfu)를 넣어 실온에서 40~80일 간 발효 숙성시켜 유산균 발효액을 수득하는 단계;로 이루어진 유산균 발효액의 제조 방법에 있어서, 상기 생균제제는 류코노스톡(Leuconostoc) 속의 생균주(기탁번호 KCTC-11226BP호)와 사카로마이세스(Saccharomyces) 속의 효모균주(기탁번호 KCTC-11227BP호)를 혼합시킨 생균제제임을 특징으로 하는 면역력 개선 효과 및 바이러스 질환 예방 효과를 지닌 유산균 발효액의 제조 방법에 관한 것이다.

또한 본 발명은 상기 유산균 발효액이 지질 다당류(LPS)로 유도된 염증 마우스 모델에서 인터루이킨-6, 인터루이킨-1β 등의 면역증강물질을 분비 증가시킴으로써 면역력 개선 효과를 나타냄을 특징으로 한다.

또한 본 발명은 상기 유산균 발효액이 돼지 인플루엔자 바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스 등의 바이러스 질환 예방 효과를 지님을 특징으로 한다.

또한 본 발명은 상기 유산균 발효액 1 중량부와 사료 100~10,000 중량부를 포함하는 면역력 개선 효과 및 바이러스 질환 예방 효과를 지닌 동물 사료에 관한 것이다.

이하 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

표 1은 본 발명의 분리된 유산균주 락토바실러스속 nhs221 균주(기탁번호 KCTC-11749BP호)의 분리 동정 자료이다. 일반적 균학적 특성이 락토바실러스속 균주와 거의 유사하였다. 그러나 통상의 락토바실러스속 균주와는 달리 전분 배지 내에서 많은 양의 락트산을 발효 생성하는 신균주이므로 본 균주를 락토바실러스속 nhs221이라 명명하고 대전광역시 유성구 어은동 52번지 생명공학연구원 내의 Korean Collection for Type Cultures에 2010년 8월 24일자로 기탁번호 KCTC-11749BP호로 기탁하였다.

	락토바실러스속 균주의 일반적 특성	본 발명의 균주(기탁번호 KCTC-11749BP호)
세포의 형상	페어, 체인	페어, 체인
호기성	-	+/-
혐기성	+	+
카탈라제 반응	-	약함
아라비노스	+	+
셀룰로스	d	d
과당	+	+
설탕	+	+
트레할로스	+	+
말토스	+	+
자일로스	d	d
에스쿨린 가수분해	d	-
락트산 형성	+	++
pH 4.8에서 성장	-	+/-
pH 5.6에서 성장	+	+
3.0% NaCl에서 성장	+	+/-
6.5% NaCl에서 성장	d	d
TJF 요구성	-	-
10% 에탄올에서 성장	-	-
구연산 동화성	d	d

d는 지연된 반응을 나타냄

한편 본 발명의 유산균 발효액은 지질 다당류(LPS)로 유도된 염증 마우스 모델에서 인터루이킨-6, 인터루이킨-1β 등의 면역증강물질을 분비 증가시킴으로써 면역력 개선 효과를 나타낸다.

상기한 본 발명 유산균 발효액의 면역증강물질 분비 증가 효과는 지질 다당류(LPS)로 유도된 염증 마우스 모델에서 인터루이킨-6, 인터루이킨-1β의 분비 증가를 관찰 측정함으로써 확인하였다. 본 발명의 유산균 발효액의 면역증강물질 분비는 제조비교예 1에서 제조된 유산균 발효액의 면역증강물질 분비보다 약 20% 이상 인터루이킨-6 및 인터루이킨-1β의 분비가 증가됨으로써 확인하였다.

본 발명의 이러한 면역력 개선 효과는 빵 제조시 사용된 생균제제인 류코노스톡(Leuconostoc) 속의 생균주(기탁번호 KCTC-11226BP호)와 사카로마이세스(Saccharomyces) 속의 효모균주(기탁번호 KCTC-11227BP호)를 혼합시킨 생균제제와 본 발명의 유산균 발효액 제조에 사용되는 유산균주인 락토바실러스속 nhs221 균주(기탁번호 KCTC-11749BP호)와의 상승적 복합 생균제제 효과로 여겨진다.

이때 본 발명의 락토바실러스속 nhs221 균주(기탁번호 KCTC-11749BP호)의 함량은 식품 소재 1g 당 0.1 ~ 100 × 10⁸ cfu 정도이다.

또한 본 발명의 유산균 발효액 발효 제조 단계에서 발효 숙성을 위해 질소 공급원으로 0.001~0.1 중량부의 효모 추출물 및 0.001~0.1 중량부의 미네랄을 발효조에 추가로 첨가시킬 수 있다.

또한 본 발명의 유산균 발효액은 돼지 인플루엔자 바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스 등의 바이러스 질환 예방 효과를 나타낸다.

돼지 인플루엔자 바이러스(Swine influenza virus)는 오르토믹소 바이러스과 인플루엔자 바이러스속에 속하는 A형 인플루엔자 바이러스의 아형으로서, 대표주는 H1N1이 있다. 바이러스에 감염된 돼지의 예후는 양호하지만 전파성은 강하다. 발열, 호흡속박, 기침, 눈물, 쇠약, 식욕부진 등이 나타난다.

헤르페스 심플렉스 바이러스(Herpes simplex virus)는 헤르페스 바이러스과에 속하는 바이러스의 일종으로, 항원성, DNA의 성상, 생물학적 차이에 따라 HSV-1형과 HSV-2형으로 구별한다. 초기감염의 대부분은 부현성 감염이지만, 1형에 의한 현성감염으로는 소아기의 치육구내염의 형태를 취하는 경우가 많다. HSV-1형은 삼차신경절에 교차 감염되어 구진헤르페스 또는 각막헤르페스로 회귀 발증한다. HSV-2형은 초기 감염의 대부분이 성적 행위에 의해 감염되며 음부헤르페스를 유발한다. 치료 후에 요선추신경절에 잠복 감염되었다가 회귀성 음부헤르페스를 일으키기도 한다.

상기한 돼지 인플루엔자 바이러스 및 헤르페스 심플렉스 바이러스에 대한 본 발명 유산균 발효액의 항바이러스 효과는 마우스 대식세포주 RAW 264.7을 통해 측정하였으며 바이러스의 생존능을 녹색 형광 단백질을 통해 관찰 측정하였다. 본 발명의 유산균 발효액의 항바이러스 효과는 제조비교예 1에서 제조된 유산균 발효액의 항 바이러스 효과보다 15% 이상의 바이러스 세포 생존능의 감소를 나타내었다.

이러한 본 발명의 유산균 발효액은 그대로 음용할 수도 있으나 예를 들면 빵, 초콜렛, 과자, 라면, 아이스크림, 육가공 제품, 낙농 제품 등과 같은 다른 식품 또는 올리고당, 과당 또는 설탕과 같은 정량의 감미료, 향미료, 비타민, 무기질 및 색소 등을 첨가하여 유산균 발효 음료로 개발 음용할 수도 있다.

또한 본 발명의 유산균 발효액에는 약제학적으로 허용되는 통상의 담체, 부형제 및 희석제를 포함시켜 의약품 제제 형태로 개발, 투여, 복용할 수 있다.

이러한 본 발명의 유산균 발효액의 투여 용량은 복용자의 상태, 연령, 성별 및 질환 정도 등의 다양한 요인에 따라 결정될 수 있지만 통상 성인 1kg/day 당 0.5~20ml, 바람직하게는 5~10ml 정도이며 이때 1ml 당 유산균 함유량은 0.1 ~ 200 × 10⁸ cfu이다.

한편 본 발명의 유산균 발효액은 사료에 첨가하여 면역력 개선 효과 및 바이러스 질환 예방 효과를 지닌 동물 사료를 제조할 수 있다. 이를 통해 유산균 발효액 1 중량부와 사료 100~10,000 중량부를 포함하는 면역력 개선 효과 및 바이러스 질환 예방 효과를 지닌 동물 사료를 제조할 수 있다.

이하 본 발명을 준비예, 제조실시예, 제조비교예 및 실시예를 통해 더욱 상세히 설명한다.

(준비예 1) 생균 제제로 제조된 빵

밀가루 반죽 100g에 중량부에 류코노스톡(Leuconostoc) 속의 생균주(기탁번호 KCTC-11226BP호) 0.2g와 사카로마이세스(Saccharomyces) 속의 효모균주(기탁번호 KCTC-11227BP호) 0.2g를 첨가 발효시킨 후 오븐에서 구워 빵을 제조한다. 이 때 밀가루 반죽은 밀가루 40g, 물 58g, 기타 식염, 설탕, 아미노산, 포도당 등의 첨가 성분 2g으로 구성되어 있다. 이는 본 발명자의 이전 등록 특허인 대한민국 등록특허 제10-923051호 '기능성 생균제제 및 이를 이용하여 제조된 빵'에 개시된 방법에 따라 생균 제제로 빵을 제조한 것이다.

(준비예 2) 본 발명의 유산균주의 분리

빵 제조용 스폰지에 천연 과일 액즙을 첨가시킨 후 1주 동안 상온에서 방치하면 공기 중의 미생물이 스폰지에 붙어 발효 배양된다. 발효 배양된 스폰지를 건조시킨 후 상온에서 혐기성 조건 하에 2~3일 경과시키면서 미생물의 생장을 촉진시킨다. 미생물이 함유된 건조 스폰지를 잘게 분쇄시킨 후 평판 플레이트에 넣고 평판 플레이트에서 분쇄된 건조 스폰지 5mg씩을 10군데에서 분리 취득한다.

취득된 10군데의 분쇄 건조 스폰지 5mg씩을 10개의 배양 접시에 나누어 넣고, 배양 접시에 5g의 전분 배지를 첨가시킨 후, 20℃, 75% 습도 조건 하에서 48시간 배양시켜 10개의 배양 접시 중 가장 많은 락트산이 발효 생성된 배양 접시를 선별하고 그 균주를 분리하였다.

이때 분리된 균주는 효모 균주와 유산균 균주의 혼합 상태로 존재하였으며 그 중 유산균주 만을 분리 동정하여 본 발명의 유산균 락토바실러스속 nhs221 균주(기탁번호 KCTC-11749BP호)를 분리하였다.

(비교준비예 1) 화학적 팽창제로 제조된 빵

밀가루 반죽 100g에 중량부에 화학적 팽창제인 베이킹파우더를 0.5g 첨가하여 오븐에서 구워 빵을 제조한다. 이 때 밀가루 반죽은 밀가루 40g, 물 58g, 기타 식염, 설탕, 아미노산, 포도당 등의 첨가 성분 2g으로 구성되어 있다.

(제조실시예) 본 발명의 유산균 발효액의 제조

준비예 1에서 제조된 생균제제로 제조된 빵을 건조시킨 후 분쇄시켜 수득된 빵 분말 100g에 정제수 400ml를 넣고 여기에 적정 당도를 유지하기 위해 설탕, 과당 등을 적량 넣어 12°Brix 농도로 당도를 조절하고 준비예 2에서 분리된 락토바실러스속 nhs221 균주(기탁번호 KCTC-11749BP호) 배양액 1ml(1.0 ~ 6.0 ×10⁸ cfu)를 넣어 실온에서 60일간 발효 숙성시켜 본 발명의 유산균 발효액을 수득한다.

(제조비교예) 유산균 발효액의 제조 (화학적 팽창제로 제조된 빵)

비교준비예 1에서 제조된 화학적 팽창제로 제조된 빵을 건조시킨 후 분쇄시켜 수득된 빵 분말 100g에 정제수 400ml를 넣고 여기에 적정 당도를 유지하기 위해 설탕, 과당 등을 적량 넣어 12°Brix 농도로 당도를 조절하고 준비예 2에서 분리된 락토바실러스속 nhs221 균주(기탁번호 KCTC-11749BP호) 배양액 1ml(1.0 ~ 6.0 ×10⁸ cfu)를 넣어 실온에서 30일간 발효 숙성시켜 유산균 발효액을 수득한다.

(실시예 1) 본 발명 유산균 발효액의 면역 증강 물질 분비 시험

(시험군) 본 발명의 제조실시예에서 제조된 유산균 발효액 1ml와 생리식염수(PBS) 1ml를 혼합시킨 후 혼합된 유산균 발효액 2ml를 실험 마우스에 7일간 급이하였다.

(비교시험군) 제조비교예에서 제조된 유산균 발효액 1ml와 생리식염수(PBS) 1ml를 혼합시킨 후 혼합된 유산균 발효액 2ml를 실험 마우스에 7일간 급이하였다.

(음성대조군) 생리식염수(PBS) 2ml 만을 실험 마우스에 7일간 급이하였다.

지질다당류 (LPS)로 유도된 염증 마우스 모델 및 사이토카인 측정 정상군은 마리당 염수 200 ㎕를 경구투여하고, 제조실시예, 제조비교예에서 제조된 유산균 발효액을 마우스 마리당 2ml를 하루에 1회씩 7일간 급이하였다. 7일 후 지질다당류 (LPS) 1 ㎎/㎏을 복강에 주사한 후 60분 후에 에틸 에테르로 마취하고 심장 천자법으로 채혈하였다. 채혈 후 혈청을 분리하여 IL-1β 및 IL-6 생성량을 ELISA법으로 측정하였다. 각 웰에 마우스의 혈청 100 ㎕ (1/100 희석)씩 분주한 후 항체-바이오틴 콘주게이트된 100 ㎕를 처리하고 2시간 실온에서 방치한 후 2회 세척 완충 용액으로 세척한 다음 항체 아비딘-HRP 콘주게이트된 100 ㎕를 처리하고 2시간 실온에서 방치한 후 다시 세척하였다. 여기에 TMB 기질을 100 ㎕씩 분주하고 암소에서 30분간 방치한 후 100 ㎕의 정지(stop) 용액을 처리한 후 ELISA 판독기로 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.

(1) 인터루이킨-6

BALB/c 마우스에 7일간 유산균 발효액을 투여한 후 LPS로 유도된 급성 염증모델에서 혈청을 분리하여 IL-6를 측정한 결과 음성대조군은 132±32.7(pg/ml), 시험군은 302±54.7(pg/ml), 비교시험군은 212±9.8(pg/ml)로 나타났다.

(2) 인터루이킨-1β

BALB/c 마우스에 7일간 유산균 발효액을 투여한 후 LPS로 유도된 급성 염증모델에서 혈청을 분리하여 IL-1β를 측정한 결과 음성대조군은 27.6±5.6(pg/ml), 시험군은 43.2±11.1(pg/ml), 비교시험군은 32.6±8.2(pg/ml)로 나타났다.

상기 시험에 나타난 바와 같이 본 발명의 유산균 발효액을 투여한 마우스 군에서 음성대조군에 비해 약 2배 이상의 IL-6가 분비 증가되었으며 약 1.5배 이상의 IL-1β의 분비가 증가된 것을 확인할 수 있었다.

또한 본 발명의 유산균 발효액을 투여한 마우스 군에서 제조비교예의 유산균 발효액을 투여한 마우스 군보다 약 40% 이상의 IL-6가 분비 증가되었으며 약 30% 이상의 IL-1β의 분비가 증가된 것을 확인할 수 있었다.

(실시예 2) 본 발명 유산균 발효액의 항바이러스 시험

(시험군) 본 발명의 제조실시예에서 제조된 유산균 발효액 1ml와 생리식염수(PBS) 1ml를 혼합시킨 후 혼합된 유산균 발효액 0.1ml를 마우스 대식세포주인 RAW 264.7에 분주한 후 바이러스를 접종하였다.

(비교시험군) 제조비교예에서 제조된 유산균 발효액 1ml와 생리식염수(PBS) 1ml를 혼합시킨 후 혼합된 유산균 발효액 0.1ml를 마우스 대식세포주인 RAW 264.7에 분주한 후 바이러스를 접종하였다.

(음성대조군) 생리식염수(PBS) 0.1ml 만을 마우스 대식세포주인 RAW 264.7에 분주하고 바이러스는 접종하지 않았다.

돼지 인플루엔자 바이러스(Swine Influenza virus), 헤르페스 심플렉스 바이러스(Herpes simplex virus)에 대한 본 발명의 유산균 발효액의 항바이러스 시험을 하기와 같이 수행하였다.

마우스 대식세포주인 RAW 264.7을 1×10⁶cell/well의 농도로 6-웰 TC 플레이트에 배양한 후, FBS가 10%(v/v) 첨가된 DMEM에 시험군, 비교시험군의 유산균 발효액 및 음성대조군의 생리식염수를 분주하였다. 시험군의 농도가 50㎍/㎖가 되도록 처리하였다. 시험군 처리 12시간 후, SIV-GFP(MOI:1), HSV-GFP(MOI:1)를 각각 RAW 264.7 세포에 접종하였다. 접종 2시간 후 접종액을 제거하고 PBS로 RAW 264.7 세포를 3회 세척하고 FBS가 10% 첨가된 신선한 DMEM으로 교환한 후 12~24시간 후에 자외선(345 nm) 필터를 이용하여 바이러스 감염 정도를 현미경 관찰하고 이를 측정하였다.

또한, 각 조건에서의 GFP 형광 발현량을 보다 정확하게 비교하기 위해, 통상의 GFP 발현량 확인 시스템을 통해 확인하였다. 도 1B는 돼지 인플루엔자 바이러스(SIV)에 대한 GFP 발현량을 측정한 데이터를 나타내고 도 2B는 헤르페스 심플렉스 바이러스(HSV)에 대한 GFP 발현량을 측정한 데이터를 나타낸다.

이때 대조군은 음성대조군으로서 생리식염수(PBS) 0.1ml 만을 마우스 대식세포주인 RAW 264.7에 분주하고 바이러스는 접종하지 않은 것이다.

도 1B 및 도 2B에 나타난 바와 같이 본 발명 시험군의 SIV-GFP 및 HSV-GFP 상대단위는 비교시험군의 SIV-GFP 및 HSV-GFP 상대단위보다 상당히 감소되었다.

상기 바이러스 감염 상태에서의 RAW 264.7 세포 생존능을 MTT 어세이를 통해 확인하였다. MTT 어세이를 수행하기 위해서는, RAW 264.7을 96웰 플레이트에 이식시키고 시험군, 비교시험군의 유산균 발효액, 음성대조군의 생리식염수 및 GFP 발현 바이러스를 처리시킨 후 48시간 후 100 ㎕의 1 ㎎/㎖ MTT 용액을 세포에 더하여 4시간 동안 반응시켰다. 이 후 DMSO 150 ㎕를 가하여 세포 내에 생성된 포마잔염을 용해시킨 후, 이 포마잔의 양을 마이크로플레이트 판독기를 이용하여 540 nm에서 측정하였다.

도 1A는 돼지 인플루엔자 바이러스(SIV)에 대한 RAW 264.7의 세포 생존능을 나타낸 것으로 본 발명의 유산균 발효액을 분주시킨 시험군의 경우 마우스 대식세포주인 RAW 264.7의 약 85%의 세포 생존능을 나타내었으며 비교시험군의 경우 마우스 대식세포주인 RAW 264.7의 약 70%의 세포 생존능을 나타내었다.

한편 SIV 바이러스만을 접종시킨 시험군(SIV-GFP)에서는 대식세포주인 RAW 264.7은 약 60%의 세포 생존능을 나타내었다. 이를 통해 본 발명의 시험군은 SIV 바이러스만을 접종시킨 시험군보다 약 25% 정도의 대식세포주인 RAW 264.7의 생존능을 증가시켰으며 비교시험군에 비해서도 약 10% 정도의 대식세포주인 RAW 264.7의 생존능을 증가시켰다. 이는 본 발명의 유산균 발효액의 SIV 항바이러스 활성을 확인한 것이다.

도 2A는 헤르페스 심플렉스 바이러스(HSV)에 대한 RAW 264.7의 세포 생존능을 나타낸 것으로 본 발명의 유산균 발효액을 분주시킨 시험군의 경우 마우스 대식세포주인 RAW 264.7의 약 90%의 세포 생존능을 나타내었으며 비교시험군의 경우 마우스 대식세포주인 RAW 264.7의 약 70%의 세포 생존능을 나타내었다.

한편 HSV 바이러스만을 접종시킨 시험군(HSV-GFP)에서는 대식세포주인 RAW 264.7은 약 55%의 세포 생존능을 나타내었다. 이를 통해 본 발명의 시험군은 HSV 바이러스만을 접종시킨 시험군보다 약 35% 정도의 대식세포주인 RAW 264.7의 생존능을 증가시켰으며 비교시험군에 비해서도 약 20% 정도의 대식세포주인 RAW 264.7의 생존능을 증가시켰다. 이는 본 발명의 유산균 발효액의 HSV 항바이러스 활성을 확인한 것이다.

한국생명공학연구원

KCTC11749BP

20100824

Claims

ⅰ) 생균제제로 제조된 빵을 건조시킨 후 분쇄시켜 수득된 빵 분말 100 중량부에 대해 정제수 300~500 중량부를 넣고 설탕 및/또는 과당을 첨가하여 10~15°Brix 농도로 당도를 조절하는 단계; 및
ⅱ) 락토바실러스속 nhs221 균주(기탁번호 KCTC-11749BP호) 배양액 0.8~1.2 중량부(1.0 ~ 6.0 ×10⁸ cfu)를 넣어 실온에서 40~80일 간 발효 숙성시켜 유산균 발효액을 수득하는 단계;
로 이루어진 유산균 발효액의 제조 방법에 있어서,
상기 생균제제는 류코노스톡(Leuconostoc) 속의 생균주(기탁번호 KCTC-11226BP호)와 사카로마이세스(Saccharomyces) 속의 효모균주(기탁번호 KCTC-11227BP호)를 혼합시킨 생균제제임을 특징으로 하는 면역력 개선 효과 및 바이러스 질환 예방 효과를 지닌 유산균 발효액의 제조 방법.
제 1항에 있어서, 상기 유산균 발효액은 지질 다당류(LPS)로 유도된 염증 마우스 모델에서 인터루이킨-6, 인터루이킨-1β 등의 면역증강물질을 분비 증가시킴으로써 면역력 개선 효과를 나타냄을 특징으로 하는 유산균 발효액의 제조 방법.
제 1항에 있어서, 상기 유산균 발효액은 돼지 인플루엔자 바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스 등의 바이러스 질환 예방 효과를 지님을 특징으로 하는 유산균 발효액의 제조 방법.
제 1항의 유산균 발효액 1 중량부와 사료 100~10,000 중량부를 포함하는 면역력 개선 효과 및 바이러스 질환 예방 효과를 지닌 동물 사료.