KR20190054434A - 신규한 1,3,4-옥사디아졸 화합물 및 이를 포함하는 혈당 강하용 약학 조성물 - Google Patents

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KR20190054434A
KR20190054434A KR1020170150675A KR20170150675A KR20190054434A KR 20190054434 A KR20190054434 A KR 20190054434A KR 1020170150675 A KR1020170150675 A KR 1020170150675A KR 20170150675 A KR20170150675 A KR 20170150675A KR 20190054434 A KR20190054434 A KR 20190054434A
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methoxyphenethyl
glucosidase
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KR1020170150675A
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이기환
라피끄 무하마드
살림 무하마드
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공주대학교 산학협력단
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Abstract

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 1,3,4-옥사디아졸 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다:
[화학식 1]
Figure pat00017

(상기 R은 메톡시 기이고, 상기 X는 수소, 메톡시 또는 플루오로 기이며, 상기 n 및 n'는 독립적으로 0, 1 또는 2임).
본 발명은 상기 신규한 1,3,4-옥사디아졸 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효 성분으로 함유하여, 상기 화합물은 α-글루코시다아제를 저해함으로서 혈당 강하 효능이 있어 당뇨병 치료용 약학 조성물로 사용할 수 있다.

Description

신규한 1,3,4-옥사디아졸 화합물 및 이를 포함하는 혈당 강하용 약학 조성물 {Novel 1,3,4-oxadiazole Compound and Pharmaceutical Composition For Lowering Blood Glucose Comprising The Same}
본 발명은 본 발명은 이하의 화학식 1로 표시되는 1,3,4-옥사디아졸 화합물및 이를 포함하는 약학 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 하기 화학식 1로 표시되는 2,5-이치환-1,3,4-옥사디아졸 화합물 및 이를 포함하는 α-글루코시다아제 저해용 약학 조성물에 관한 것이다:
Figure pat00001
(상기 R은 메톡시 기이고, 상기 X는 수소, 메톡시 또는 플루오로 기이고, 상기 n 및 n'는 0, 1 또는 2임).
천연 또는 무독성 전구체를 이용한 새로운 치료제의 개발은, 신약의 설계 및 개발을 위한 의약 화학의 기본 목표 중 하나이다. 1,3,4-옥사디아졸은 합성, 의약 및 재료 화학 분야에서 영향력이 높은 헤테로고리 시스템으로, 항균제, 항미생물제, 항진균제, 항산화제, 항암제, 항경련제, 증식저해제, 항염증제 및 살충제 활성과 같은 현저한 생물학적 및 약리학적 특성을 가질 뿐만 아니라, 과산화물 디스뮤타아제(superoxide dismutase), 당 신생합성(gluconeogenesis), 텔로머라아제 (telomerase), α-글루코시다아제(α-glucosidase), α-아밀라아제(α-amylase), 히스톤 디아세틸라제(histone deacetylase) 및 티미딘 포스포릴라제(thymidine phosphorylase)를 포함하는 다양한 효소들에 대한 뚜렷한 저해 효과도 보고되었다. 또한, 집광 능력으로 광학 센서, 착색제로도 주목받아 왔다.
미국 특허 제8,754,099 B2호에서는 2형 당뇨병, 및 이 질병과 관련 있는 고혈당, 인슐린 저항성, 비만, 지질 이상 및 고혈압을 포함하는 질환에 효과적인 옥사디아졸 핵 포함 헤테로고리 골격 a (도 1 참고)에 대한 특허가 등록되었다. 또한, Eur. J. Med. Chem. 45 (2010) 1753~1759에서는, 1,3,4-옥사디아졸 화합물 b (도 1 참고)의 뛰어난 항당뇨 잠재성이 보고된 바 있다. 최근에는 Eur. J. Med. Chem. 87 (2014) 175~185 및 Eur. J. Med. Chem. 87 (2014) 125~130에서는 상당한 혈당 강하 효과, 및 α-글루코시다아제 저해 효능을 나타내는 1,3,4-옥사디아졸 함유 헤테로 고리 c, d 및 e (도 1 참고)가 보고된 바 있다.
미국 특허 제8,754,099 B2호 (2014.06.17)
Eur. J. Med. Chem. 45 (2010) 1753-1759. Eur. J. Med. Chem. 87 (2014) 175-185. Eur. J. Med. Chem. 87 (2014) 125-130.
본 발명은 1,3,4-옥사디아졸 화합물의 구조 활성 관계를 고려하여 2,5-이치환된 새로운 1,3,4-옥사디아졸 화합물을 합성하고, 이의 α-글루코시다아제 효소 저해 활성을 검증함으로서, 혈당 강하용 약제를 개발하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 1,3,4-옥사디아졸 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다:
[화학식 1]
Figure pat00002
(R은 메톡시 기이고, X는 수소, 메톡시 또는 플루오로 기이며, n 및 n'는 독립적으로 0, 1 또는 2임).
일 실시예에서, 상기 화합물은 상기 식에서 R은 파라 메톡시 기이고, X는 플루오로 기이고, n은 1이고, n'는 2인 1,3,4-옥사디아졸 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염일 수 있다.
일 실시예에서, 상기 화합물은 (4a) 2,5-비스(4-메톡시벤질)-1,3,4-옥사디아졸; (4b) 2-(4-플루오로페네틸)-5-(4-메톡시벤질)-1,3,4-옥사디아졸; (4c) 2-(3-플루오로페네틸)-5-(4-메톡시벤질)-1,3,4-옥사디아졸; (4d) 2-(2-플루오로페네틸)-5-(4-메톡시벤질)-1,3,4-옥사디아졸; (4e) 2-(4-메톡시벤질)-5-(2-메톡시페네틸)-1,3,4-옥사디아졸; (4f) 2-(4-메톡시벤질)-5-(4-메톡시페네틸)-1,3,4-옥사디아졸; (4g) 2-(2-플루오로벤질)-5-(2-메톡시페네틸)-1,3,4-옥사디아졸; (4h) 2-(2-플루오로페네틸)-5-(2-메톡시페네틸)-1,3,4-옥사디아졸; (4i) 2,5-비스(4-메톡시페네틸)-1,3,4-옥사디아졸; (4j) 2-(2-메톡시페네틸)-5-페닐-1,3,4-옥사디아졸; 및 (4k) 2-(4-메톡시벤질)-5-(2-메톡시페네틸)-1,3,4-옥사디아졸로 구성되는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염일 수 있다(도 2 참고).
본 발명은 또한 상기 화합물을 유효 성분으로 포함하는 혈당 강하용 약학 조성물을 제공한다.
일 실시예에서, 상기 약학 조성물은 상기 화합물을 조성물 총 중량을 기준으로 0.001 내지 90 중량%로 포함할 수 있다.
일 실시예에서, 상기 약학 조성물은 약학적으로 허용가능한 희석제 또는 담체를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 이하의 (ⅰ) 내지 (ⅳ)의 단계들을 포함하는 상기 화합물의 제조 방법을 제공할 수 있다(이하의 반응식 1 참고):
(ⅰ) 용매로서 1,2-디클로로에탄과 염소화제로서 옥시염화인의 존재하에, 아르알칸산(1)을 환류하에 반응시켜, 아르알칸산 클로라이드(2)를 합성하는 단계; (ⅱ) 상기 (ⅰ) 단계에서 수득된 아르알칸산 클로라이드(2)를 아세토니트릴에 용해시킨 후, 이를 히드라진 수화물, TEA 및 아세토니트릴을 함유하는 용액에 적가하여 환류시켜, 아르알칸산 히드라자이드(3)를 수득하는 단계; (ⅲ) 상기 (ⅱ) 단계에서 수득된 아르알칸산 하이드라자이드(3)와 치환된 방향족산을 등몰량으로 옥시염화인에서 혼합한 후, 100~120℃에서 환류 하에 가열시키는 단계; 및 (ⅳ) 상기 (ⅲ) 단계에서 수득된 혼합물을 냉각 및 침전시킨 후, 메탄올로 결정화시켜 상기 1,3,4-옥사디아졸 화합물을 수득하는 단계.
본 발명은 α-글루코시다아제의 저해 효과가 있는 신규한 1,3,4-옥사디아졸 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효 성분으로 함유하며, 혈당 강하 효능이 있어 당뇨병 치료에 사용할 수 있다.
도 1은 공지의 항당뇨병 화합물의 분자 구조를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 신규한 1,3,4-옥사디아졸 화합물의 예를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 4b 화합물인 2-(4-플루오로페네틸)-5-(4-메톡시벤질)-1,3,4-옥사디아졸의 α-글루코시다아제 저해 분석을 위한 그래프이다.
도 4는 본 발명의 4c 화합물인 2-(3-플루오로페네틸)-5-(4-메톡시벤질)-1,3,4-옥사디아졸의 α-글루코시다아제 저해 분석을 위한 그래프이다.
도 5는 상기 4b, 4c 화합물 및 표준물질 아카보스(acarbose)에 의한 농도 의존적 α-글루코시다아제의 저해를 나타낸 그래프이다.
도 6은 상동성 모델링된 α-글루코시다아제의 활성 부위 내부의 리간드의 중첩을 나타낸 개념도이다. (a) 결합 부위로의 리간드 클러스터(하늘색, 스틱 모드)를 보여주는 효모 α-글루코시다아제 (청색, 황색 및 적색)의 상동 모델. 녹색은 결합 부위를 둘러싼 아미노산 잔기(빨간색)를 나타내고; (b) 활성 부위의 근접 모습, 포켓은 표면으로 표시되며(라인 모드); (c) 리간드 클러스터 (아미노산 잔기는 기본색, 고체 표면으로 표시됨)를 포함하고 있는 결합 부위 캐비티를 나타낸다.
도 7은 2차원 공간에서 활성 부위 내부에서 가장 많은 리간드가 도킹된 구조로서, a)는 4b를 나타낸 것이고, b)는 4c를 나타낸 것이고, c)는 4d를 나타낸 것이다.
본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 1,3,4-옥사디아졸 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다:
[화학식 1]
Figure pat00003
(R은 메톡시 기이고, X는 수소, 메톡시 또는 플루오로 기이며, n 및 n'는 독립적으로 0, 1 또는 2임).
일 실시예에서, 상기 화합물은 상기 식에서 R은 파라 메톡시 기이고, X는 플루오로 기이고, n은 1이고, n'는 2인 1,3,4-옥사디아졸 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염일 수 있다.
일 실시예에서, 상기 화합물은 (4a) 2,5-비스(4-메톡시벤질)-1,3,4-옥사디아졸, (4b) 2-(4-플루오로페네틸)-5-(4-메톡시벤질)-1,3,4-옥사디아졸, (4c) 2-(3-플루오로페네틸)-5-(4-메톡시벤질)-1,3,4-옥사디아졸, (4d) 2-(2-플루오로페네틸)-5-(4-메톡시벤질)-1,3,4-옥사디아졸, (4e) 2-(4-메톡시벤질)-5-(2-메톡시페네틸)-1,3,4-옥사디아졸, (4f) 2-(4-메톡시벤질)-5-(4-메톡시페네틸)-1,3,4-옥사디아졸, (4g) 2-(2-플루오로벤질)-5-(2-메톡시페네틸)-1,3,4-옥사디아졸, (4h) 2-(2-플루오로페네틸)-5-(2-메톡시페네틸)-1,3,4-옥사디아졸, (4i) 2,5-비스(4-메톡시페네틸)-1,3,4-옥사디아졸, (4j) 2-(2-메톡시페네틸)-5-페닐-1,3,4-옥사디아졸, 및 (4k) 2-(4-메톡시벤질)-5-(2-메톡시페네틸)-1,3,4-옥사디아졸로 구성되는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물; 바람직하게는 (4b) 2-(4-플루오로페네틸)-5-(4-메톡시벤질)-1,3,4-옥사디아졸, 또는 (4c) 2-(3-플루오로페네틸)-5-(4-메톡시벤질)-1,3,4-옥사디아졸; 더욱 바람직하게는 (4b) 2-(4-플루오로페네틸)-5-(4-메톡시벤질)-1,3,4-옥사디아졸일 수 있거나, 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염, 용매화물, 수화물, 구조 입체이성질체 또는 입체 이성질체를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 상기 화합물을 유효 성분으로 포함하는 혈당 강하용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 약학적 조성물은 제1형 및 제2형 당뇨병, 당뇨 합병증의 치료에 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 실시예에서, 상기 1,3,4-옥사디아졸 화합물의 혈당 강하 효과가 α-글루코시다아제 저해에 의한 것일 수 있다.
특히, 상기 화학식 1에서 치환기 X가 전자 흡인기, 즉 플루오르기인 경우, α-글루코시다아제 저해능이 개선된 것으로 나타났다.
일 실시예에서, 상기 α-글루코시다아제 저해 효과는 상기 (4b) 2-(4-플루오로페네틸)-5-(4-메톡시벤질)-1,3,4-옥사디아졸의 경우 경쟁적 저해에 의한 것일 수 있고, 상기 (4c) 2-(3-플루오로페네틸)-5-(4-메톡시벤질)-1,3,4-옥사디아졸의 경우, 경쟁적 저해와 비경쟁적 저해의 혼합 저해 방식에 의할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 실시예에서, 상기 약학 조성물은 상기 화합물을 조성물 총 중량을 기준으로 0.001 내지 90 중량%로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않고 질환의 증상, 진행 정도, 환자의 상태 등에 따라서 적절히 조절할 수 있다.
일 실시예에서, 상기 약학 조성물은 약학적으로 허용가능한 희석제 또는 담체를 추가로 포함할 수 있다.
본 문서에서 사용되는 약제학적으로 허용되는 담체는 약제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 탄수화물류 화합물(예: 락토스, 아밀로스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 셀룰로스, 등), 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 염 용액, 알코올, 아라비아 고무, 식물성 기름(예: 옥수수 기름, 목화 종자유, 두유, 올리브유, 코코넛유), 폴리에틸렌 글리콜, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 상기 화합물을 유효 성분으로 포함하는 혈당 강하용 건강 식품을 제공한다.
일 실시예에서, 상기 혈당 강하용 건강식품은 부형제, 결합제, 붕해제, 활택제, 교미제, 착향제 등의 통상의 식품 첨가제를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 이하의 (ⅰ) 내지 (ⅳ)의 단계들을 포함하는 상기 화합물의 제조 방법을 제공할 수 있다(이하의 반응식 1 참고):
(ⅰ) 용매로서 1,2-디클로로에탄과 염소화제로서 옥시염화인의 존재하에, 아르알칸산(1)을 환류하에 반응시켜, 아르알칸산 클로라이드(2)를 합성하는 단계; (ⅱ) 상기 (ⅰ) 단계에서 수득된 아르알칸산 클로라이드(2)를 아세토니트릴에 용해시킨 후, 이를 히드라진 수화물, TEA 및 아세토니트릴을 함유하는 용액에 적가하여 환류시켜, 아르알칸산 히드라자이드(3)를 수득하는 단계; (ⅲ) 상기 (ⅱ) 단계에서 수득된 아르알칸산 하이드라자이드(3)와 치환된 방향족산을 등몰량으로 옥시염화인에서 혼합한 후, 100~120℃에서 환류 하에 가열시키는 단계; 및 (ⅳ) 상기 (ⅲ) 단계에서 수득된 혼합물을 냉각 및 침전시킨 후, 메탄올로 결정화시켜 상기 1,3,4-옥사디아졸 화합물을 수득하는 단계.
이하 실시예를 들어 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다. 이하의 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 권리범위를 한정하기 위한 것이 아니다.
<실시예>
실시예 1: 신규한 1,3,4- 옥사디아졸 화합물의 합성
재료 및 시약
실시예에서 페닐, 아릴 및 아르알킬 카르복실산은 알파 에이서(Alfa Aesar)사 및 알드리치(Aldrich)사로부터 구입하였고, 에탄올, 메탄올, 클로로포름, 물 (삼천 화학), H2SO4 및 HCl(Jin Chemical & Pharmaceutical Co. Ltd.)이 사용되었다. 효모(Saccharomyces Cerevisiae) 유래의 α-글루코시다아제, EDTA, 소듐 니트로푸루시드 및 활성 클로라이드는 시그마 알드리치사로부터 구입하였다. 사용된 모든 시약은 분석 등급이었다.
본 발명의 1,3,4- 옥사디아졸 화합물 4a 내지 4k의 합성
이하의 반응식 1은 표적 화합물 4a 내지 4k에 대한 합성경로를 개략적으로 나타낸 것이다.
[반응식 1]
Figure pat00004
(i) POCl3, ClCH2CH2Cl, 환류 3시간; (ⅱ) 히드라진 수화물, TEA, MeCN, 환류 3시간; (ⅲ) 치환된 방향족산, POCl3, 환류, 3시간.
먼저, 용매로서 1,2-디클로로에탄 12㎖ 및 염소화제로서의 옥시염화인 0.4㎖의 존재하에, 아르알칸산(1) 1 mmol을 환류하에 3시간 동안 반응시킨다. 상기 반응 용액을 실온으로 냉각시키고 용매를 감압 하에서 제거하여, 아르알칸산 클로라이드(2)를 수득하여 추가 정제 없이 이후 단계에 사용하였다.
수득된 아르알칸산 클로라이드(2)를 아세토니트릴 80㎖에 용해시킨 후, 히드라진 수화물 1 mmol, TEA 0.5㎖ 및 아세토니트릴 20㎖을 함유하는 용액에 적가하고, 박층 크로마토그래피(TLC)로 모니터링하면서 3시간 동안 환류시켰다. 개시 물질이 모두 소비된 후, 반응 혼합물을 실온 냉각한 후, 감압 하에서 용매를 증발시켜, 백색 고체로서 조 치환 방향족산 히드라자이드(3)를 수득하였다. 이를 컬럼 크로마토그래피로 정제하고 메탄올로 결정화시켰다.
상기 아르알칸산 하이드라자이드(3) 및 치환 방향족산의 등몰 혼합물 (equimolar mixture)을 옥시염화인에 혼합하고, 107℃에서 3시간 동안 환류 하에 가열하였다. 반응 과정을 박층 크로마토그래피로 모니터링하여 개시 물질이 소비된 후, 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고 얼음에 부어서 침전시켰다. 이들 침전물을 여과하고, 냉수 및 디에틸에테르로 세척 및 여과한 후 메탄올로 결정화시켜, 최종 생성물로서 2, 5-위치에서 치환된 1,3,4-옥사디아졸 화합물 4a 내지 4k를 수득하였다. 수득된 생성물은 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다.
합성 산물의 모니터링
반응 과정은 TLC 분석에 의해 모니터링되었고, Rζ 값은 예비-코팅된 실리카겔 알루미늄 플레이트 [키셀겔(Kieselgel) 60 F254](Merck)를 사용하여 결정하였다. UV 램프(VL-4LC) 하에서 TLC를 시각화하였다. 융점은 피셔 사이언티픽 융점 측정장치(Fisher Scientific melting point apparatus)로 측정하여, 보정없이 (uncorrected) 사용하였다.
실시예 2: 합성 산물의 분광학적 분석
FTIR 스펙트럼은 FTIR-8400S 분광기(Shimadzu)에 의해 KBr 펠렛에서 기록되었다. 1H 및 13C NMR 스펙트럼은 Bruker Avance 400 MHz 분광분석기로 기록되었고, 화학적 이동(chemical shift)은 지정된 유기 용액의 내부 테트라메틸실란으로부터 하류의 δ값 (ppm)으로 기록되었다. 피크 다중성은 s은 단일선으로, d는 이중선으로, m은 다중선으로 표현된다. 단결정 데이터는 상온에서 Mo X-선 튜브 및 흑연 모노크로메이터(monochromator)가 장착된 브러커 스마트 아펙스 Ⅱ 엑스레이 회절기 CCD(Bruker SMART APEX Ⅱ X-ray diffractometer CCD)를 사용하여 수득하였다.
(4a) 2,5- 비스 (4-메톡시벤질)-1,3,4- 옥사디아졸
미색(off white) 고체; 수율 71%; R f : 0.64 (n-헥산:에틸아세테이트, 8:2); FT-IR (υ/cm-1): 3026 (sp2 CH), 2945 (sp3 CH), 1579 (C=N), 1551, 1498 (페닐 고리의 C=C); 1H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ 7.19~7.00 (m, 4H, 방향족 양성자), 6.98~6.89 (m, 2H, 방향족 양성자), 6.88~6.68 (m, 2H, 방향족 양성자), 3.66 (s, 2H, 지방족 CH2), 3.64 (s, 3H, 메톡시 양성자), 3.60 (s, 2H, 지방족 CH2); 13C NMR (100MHz, DMSO-d6) δ 158.4, 155.1, 149.3, 147.0, 130.0, 127.6, 125.8, 120.5, 114.1, 120.0, 56.1, 55.9, 31.5.
(4b) 2-(4- 플루오로페네틸 )-5-(4-메톡시벤질)-1,3,4- 옥사디아졸
갈색 고체; 수율 77%; R f : 0.62 (n-헥산:에틸아세테이트, 8:2); FT-IR (υ /cm-1): 3041 (sp2 CH), 2947 (sp3 CH), 1579 (C=N), 1568, 1478 (페닐 고리의 C=C); 1H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ 7.35~7.31 (m, 1H, 방향족 양성자), 7.25~7.23 (m, 1H, 방향족 양성자), 7.03~7.01 (m, 1H, 방향족 양성자), 6.97~6.91 (m, 1H, 방향족 양성자), 6.88~6.81 (m, 2H, 방향족 양성자), 6.78~6.73 (m, 2H, 방향족 양성자), 3.69 (t, 2H, 지방족 CH2), 3.66 (s, 3H, OCH3), 2.34 (t, 2H, 지방족 CH2); 13C NMR (100MHz, DMSO-d6) δ 158.4, 154.9, 146.7, 139.2, 133.2, 130.1, 129.6, 128.4, 127.4, 124.9, 114.1, 55.4, 31.6, 21.1.
(4c) 2-(3- 플루오로페네틸 )-5-(4-메톡시벤질)-1,3,4- 옥사디아졸
미색 고체; 수율 76%; R f : 0.64 (n-헥산:에틸아세테이트, 8:2); FT-IR (υ/cm-1): 3044 (sp2 CH), 2947 (sp3 CH), 1581 (C=N), 1565, 1514, 1497 (페닐 고리의 C=C); 1H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ 7.50-7.44 (m, 1H, 방향족 양성자), 7.31~7.27 (m, 1H, 방향족 양성자), 7.25-7.18 (m, 1H, 방향족 양성자), 7.12~7.10 (m, 1H, 방향족 양성자), 6.90~6.85 (m, 2H, 방향족 양성자), 6.77~6.75 (m, 2H, 방향족 양성자), 3.78 (s, 2H, 지방족 CH2), 3.73 (t, 2H, J= 6.4 Hz, 지방족 CH2), 3.72 (s, 3H, 지방족 OCH3), 1.25 (t, 2H, J= 7.2 Hz, 지방족 CH2); 13C NMR (100MHz, DMSO-d6) δ 161.1, 158.4, 155.6, 154.6, 153.8, 146.4, 131.3, 130.8, 129.0, 128.0, 124.1, 116.0, 55.4, 31.6, 29.2, 14.9.
(4d) 2-(2- 플루오로페네틸 )-5-(4-메톡시벤질)-1,3,4- 옥사디아졸
갈색 고체; 수율 77%; R f : 0.60 (n-헥산:에틸 아세테이트, 8:2); FT-IR (υ /cm-1): 3055 (sp2 CH), 2936 (sp3 CH), 1588 (C=N), 1556, 1533, 1501 (페닐 고리의 C=C); 1H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ 7.29~7.23 (m, 1H, 방향족 양성자), 7.14~7.00 (m, 4H, 방향족 양성자), 6.99~6.98 (m, 2H, 방향족 양성자), 6.82~6.80 (m, 2H, 방향족 양성자), 3.99 (s, 2H, 지방족 CH2), 3.73 (t, 2H, J= 6.4 Hz, 지방족 CH2), 3.68 (s, 3H, 지방족 OCH3), 1.24 (t, 2H, J= 7.2 Hz, 지방족 CH2); 13C NMR (100MHz, DMSO-d6) δ 158.2, 154.1, 146.7, 139.4, 133.2, 130.9, 129.6, 128.4, 127.4, 124.9, 114.1, 55.4, 31.6, 29.2, 14.9.
(4e) 2-(4-메톡시벤질)-5-(2- 메톡시페네틸 )-1,3,4- 옥사디아졸
황색(yellow) 고체; 수율 76%; R f : 0.65 (n-헥산:에틸 아세테이트, 8:2); FT-IR (υ/cm-1): 3045 (sp2 CH), 2951 (sp3 CH), 1584 (C=N), 1556, 1511, 1494 (페닐 고리의 C=C); 1H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ 7.48~7.22 (m, 4H, 방향족 양성자), 7.12~7.10 (m, 2H, 방향족 양성자), 6.89~6.74 (m, 2H, 방향족 양성자), 3.86 (s, 2H, 지방족, CH2), 3.72 (t, 2H, J= 6.0 Hz, 지방족 CH2), 3.63 (s, 3H, 지방족, OCH3), 3.34 (s, 3H, 지방족, OCH3), 1.15 (t, 2H, J= 7.2 Hz, 지방족 CH2); 13C NMR (100MHz, DMSO-d6) δ 158.7, 153.2, 151.4, 146.7, 139.4, 133.2, 130.9, 129.4, 128.4, 127.4, 124.9, 114.1, 112.0, 56.1, 55.9, 31.4, 29.4, 14.1.
(4f) 2-(4-메톡시벤질)-5-(4- 메톡시페네틸 )-1,3,4- 옥사디아졸
황색(yellowish) 고체; 수율 74%; R f : 0.61 (n-헥산:에틸아세테이트, 8:2); FT-IR (υ/cm-1): 3033 (sp2 CH), 2951 (sp3 CH), 1584 (C=N), 1563, 1510, 1489 (페닐 고리의 C=C); 1H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ 7.36~7.23 (m, 2H, 방향족 양성자), 7.14~7.10 (m, 2H, 방향족 양성자), 7.09-7.05 (m, 4H, 방향족 양성자), 3.87 (s, 2H, 지방족 CH2), 3.72 (t, 2H, J= 6.8 Hz, 지방족 CH2), 3.63 (s, 3H, 지방족, OCH3), 3.13 (s, 3H, 지방족, OCH3), 1.09 (t, 2H, J= 6.4 Hz, 지방족 CH2); 13C NMR (100MHz, DMSO-d6) δ 159.4, 154.8, 145.3, 139.3, 133.0, 131.6, 129.6, 128.3, 124.8, 122.5, 115.6, 55.4, 25.9, 21.1.
(4g) 2-(2- 플루오로벤질 )-5-(2- 메톡시페네틸 )-1,3,4- 옥사디아졸
미색 고체; 수율 74%; R f : 0.60 (n-헥산:에틸아세테이트, 8:2); FT-IR (υ/cm-1): 3037 (sp2 CH), 2945 (sp3 CH), 1584 (C=N), 1571, 1522, 1501 (페닐 고리의 C=C); 1H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ 7.50~7.44 (m, 1H, 방향족 양성자), 7.31~7.18 (m, 2H, 방향족 양성자), 7.12~7.10 (m, 3H, 방향족 양성자), 6.90~6.75 (m, 2H, 방향족 양성자), 3.78 (s, 2H, 지방족 CH2), 3.72 (t, 2H, 지방족, J= 6.4 Hz, CH2), 3.68 (s, 3H, 지방족, OCH3), 1.25 (t, 2H, J= 7.2 Hz, CH2); 13C NMR (100MHz, DMSO-d6) δ 158.5, 154.9, 146.7, 139.2, 133.2, 130.1, 129.6, 128.4, 127.4, 124.9, 114.1, 55.4, 31.6, 29.2, 14.9.
(4h) 2-(2- 플루오로페네틸 )-5-(2- 메톡시페네틸 )-1,3,4- 옥사디아졸
미색 고체; 수율 65%; R f : 0.54 (n-헥산:에틸아세테이트, 8:2); FT-IR (υ/cm-1): 3041 (sp2 CH), 2942 (sp3 CH), 1584 (C=N), 1548, 1511, 1489 (페닐 고리의 C=C); 1H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ 7.58~7.41 (m, 1H, 방향족 양성자), 7.32~7.23 (m, 2H, 방향족 양성자), 7.19~7.11 (m, 2H, 방향족 양성자), 6.90~6.74 (m, 3H, 방향족 양성자), 3.78 (s, 2H, 지방족, CH2), 3.72 (t, 2H, J= 6.4 Hz, 지방족, CH2), 3.65 (s, 3H, 지방족, OCH3), 1.25 (t, 2H, J= 8.0 Hz, 지방족, CH2); 13C NMR (100MHz, DMSO-d6) δ 158.4, 155.1, 149.3, 147.0, 139.2, 133.2, 130.1, 129.6, 128.4, 127.4, 124.9, 114.1, 112.0, 55.4, 31.6, 29.2, 14.9.
(4i) 2,5- 비스 (2- 메톡시페네틸 )-1,3,4- 옥사디아졸
미색 고체; 수율 63%; R f : 0.56 (n-헥산:에틸아세테이트, 8:2); FT-IR (υ/cm-1): 3038 (sp2 CH), 2937 (sp3 CH), 1587 (C=N), 1554, 1522, 1499 (페닐 고리의 C=C); 1H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ 7.56~7.39 (방향족, 4H, m), 7.25~6.94 (방향족, 4H, m), 3.56 (s, 6H, OCH3), 2.90 (t, 4H, J= 6.0 Hz, CH2), 2.88 (t, 4H, J= 6.0 Hz, CH2); 13C NMR (100MHz, DMSO-d6) δ 166.5, 161.9, 159.4, 159.0, 137.9, 135.1, 133.4, 127.5, 120.1, 119.4, 116.5, 56.0, 35.4, 33.7.
(4j) 2-(2- 메톡시페네틸 )-5-페닐-1,3,4- 옥사디아졸
갈색 고체; 수율 76%; R f : 0.61 (n-헥산:에틸아세테이트, 8:2); FT-IR (υ/cm-1): 3051 (sp2 CH), 2939 (sp3 CH), 1585 (C=N), 1561, 1511, 1499 (페닐 고리의 C=C); 1H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ 7.36~7.35 (m, 1H, 방향족 양성자), 7.29~7.23 (m, 2H, 방향족 양성자), 7.14~7.12 (m, 1H, 방향족 양성자), 7.10~7.05 (m, 4H, 방향족 양성자), 3.72 (t, 2H, J= 6.4 Hz, 지방족, CH2), 3.68 (s, 3H, 지방족, OCH3), 1.25 (t, 2H, J= 7.2 Hz, 지방족, CH2); 13C NMR (100MHz, DMSO-d6) δ 158.4, 154.8, 145.3, 139.3, 133.0, 131.6, 131.5, 129.6, 129.5, 129.4, 128.3, 124.8, 124.7, 124.6, 122.5, 122.3, 55.4, 25.8, 21.6.
(4k) 2-(2-메톡시벤질)-5-(2- 메톡시페네틸 )-1,3,4- 옥사디아졸
갈색 고체; 수율 69%; R f : 0.60 (n-헥산:에틸아세테이트, 8:2); FT-IR (υ/cm-1): 3041 (sp2 CH), 2948 (sp3 CH), 1589 (C=N), 1560, 1510, 1484 (페닐 고리의 C=C); 1H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ 7.29~7.23 (m, 2H, 방향족 양성자), 7.14~7.11 (m, 2H, 방향족 양성자), 7.10~7.00 (m, 2H, 방향족 양성자), 6.99~6.80 (m, 2H, 방향족 양성자), 3.78 (s, 2H, 지방족, CH2), 3.73 (t, 2H, J= 6.0 Hz, 지방족, CH2), 3.72 (s, 3H, 지방족, OCH3), 3.71 (s, 3H, 지방족, OCH3), 1.24 (t, 2H, J= 7.2 Hz, 지방족, CH2); 13C NMR (100MHz, DMSO-d6) δ 158.7, 154.8, 151.4, 146.7, 133.3, 131.2, 129.7, 129.0, 114.1, 112.0, 56.1, 55.9, 25.9, 21.1.
구조 해석 및 보정
데이터 수집: APEX Ⅱ (Bruker, 2005); 셀 정제: SAINT (Bruker, 2005); 데이터 정리: SAINT(Bruker, 2005); 구조 해석 프로그램: SHELXS97 (Sheldrick, 2008); 구조 보정 프로그램: SHELXL97 (Sheldrick, 2008); 분자 그래픽: SHELXTL (Sheldrick, 2008); 분자 그래픽 및 물질의 계산은 윈도우용 Ortep-3 (Farrugia, 2012) 및 Win GX 출판 루틴 (Farrugia, 2012)에 의해 수행되었다. 결정학적 데이터는 캠브리지 결정학 데이터 센터(Cambridge Crystallographic Data Center)에 보충 공개 번호(supplementary publication number) CCDC-1033154로 기탁되어 있다.
<실험예>
실험예 1: α-글루코시다아제 저해 시험
α-글루코시다아제 저해 시험 프로토콜
α-글루코시다아제에 대한 효소 저해 활성은 이하의 방법에 의해 결정되었다. 시험 용액은 50㎕의 인산나트륨 완충액(0.1M, pH 7.0), 25㎕의 기질 [p-니트로페닐-α-D-글루코피라노사이드(p-NPG, 0.5mM), 20㎕의 농도가 증가하는 시험 화합물들과 25㎕의 α-글루코시다아제 효소 용액으로 구성되었다. 이 반응 혼합물을 37℃에서 30분 동안 배양한 후, 100㎕의 탄산나트륨 용액(0.2M)을 가하여 반응을 중단하고, 분석 측정은 마이크로플레이트 판독기(OPTIMax, Tunable)를 사용하여 405nm에서 흡광도를 측정하였다. 시험 화합물의 반응 속도를 기준 약물과 비교하고, 저해 백분율을 수식 100-(Abs실험군/Abs대조군)×100을 사용하여 계산하였다. 기준 저해제로서 아카보스(acarbose)를 사용하였고, 효소를 제외한 모든 성분을 함유하는 음성 대조군을 사용하여 분석을 수행하였다. 각각의 농도는 3회의 개별적인 실험으로 분석되었고, 각 실험은 3회씩 반복되었다. IC50 값은 데이터 분석 및 그래프 작성 소프트웨어 Origin 8.6, 64 비트에 의해 결정하였다.
α-글루코시다아제 저해 시험을 위한 속도 분석
각각 3가지 농도의 저해제 화합물 4b (0, 1.6 및 3.2 mM) 및 4c (0, 0.096 및 1.58 mM)에 대해, 기질인 p-니트로페놀-α-D-글루코피라노사이드 농도는 각각 1.25 mM, 2.5 mM 및 5 mM의 순서로 사용하였다. 사전 배양 및 측정시간은 α-글루코시다아제 저해 시험 프로토콜에서 논의된 것과 동일하다. 최대 초기 속도는 15초 간격으로 α-글루코시다아제를 첨가한 후, 5분까지의 흡광도에서 초기 선형 부분으로부터 측정하였다. 효소의 저해 유형은 속도의 역수(1/V) 대 기질 농도의 역수 1/[S] (mM- 1)에 대한 라인웨버-버크 플롯에 의해 시험되었고, 저해 상수 Ki는 Km 대 저해제 4b의 농도에 대한 2차 플롯에 의해 결정되었다. 화합물 4c의 경우, 효소 기질 저해제(ESI) 해리 상수 Ki ’는 절편(intercept) 대 4c 농도에 의해 결정되었고, 효소 저해제(EI) 해리 상수 Ki는 기울기 대 4c 농도의 2차 플롯에 의해 결정되었다.
실험예 2: 분자 도킹 연구
수용체의 제조
본 발명에는 화학 연산 그룹(Chemical Computing Group, CCG)에 의한 분자 운영 환경(MOE 2014)이 사용되었다. 단백질 준비 단계에는, 3D 양성자화, 에너지 최소화 및 활성 부위 식별이 포함된다. 단백질은 MOE의 구조 준비 모듈을 사용하여 에너지를 최소화하고 3-D 양성자화시켰다. 이후 단백질은 공-결정화된 리간드가 없으므로, MOE의 사이트 파인더(site finder) 모듈을 사용하여 활성 부위를 식별하였다. 활성 부위를 찾기 위해, 두 개의 니켈 이온이 결합하는 사슬을 선택하였다. 포켓은 내부에 두 개의 니켈 이온과 소수성 및 친수성 아미노산 잔기들 둘 다가 포함된(lined with) 깊은 틈새(cleft)인 것으로 밝혀졌다.
리간드의 제조
분자 도킹 연구를 위한 리간드 파일은 MOE-2014에서 준비한 후, 0.0001 kcal/mol 에너지 구배 수렴 기준을 사용하여 표준 MMFF 94 역장(force field) 수준에서 에너지 최적화가 수행되었다. 최적화된 기하구조들은 추가 연구를 위해 분자 데이터 베이스(mdb) 파일에 저장되었다.
α-글루코시다아제에 대한 분자 도킹 연구
최적화된 리간드는 모델화 효모 α-글루코시다아제 단백질에 도킹되었다. 위치 설정(Placement), 리스코링(Rescoring) 1 및 리스코링 2는 각각 트라이앵글 매처(Triangle Matcher), 런던 dG (London dG) 및 친화성 dG(affinity dG)로 설정되었다. 2가지 리스코링 함수인 런던 dG 및 GBⅵ/WSA dG을 갖는 알고리즘을 사용하여, 각각의 화합물 당 30개의 포즈(pose)를 생성하였다. 도킹 실행의 결과로서, mdb 출력 파일은 득점 및 리간드의 여러 구조를 포함하는 모든 도킹 결과가 생성되되었고, 상기 생성된 구조들 및 이들의 에너지는 분자 데이터베이스 파일에 기록되었다. 상호 작용의 발생(evolution) 및 검증에 대한 추가 연구를 위해, 각 화합물의 최상위 구조(최고득점 포즈)를 선택했다. 2D 리간드-단백질 상호 작용은 MOE 리간드 상호 작용 프로그램을 사용하여 시각화되었다. 효모 α-글루코시다아제의 3차원 구조는 이제까지 어떠한 실험 방법으로도 결정되지 않았기 때문에, 본 발명자들은 표적 단백질로 사용된 모델화 효모 α-글루코시다아제의 3D 좌표를 사용하였다.
결과: 표적 화합물 4a 내지 4k의 합성
치환 카복실산(1)의 치환 산 클로라이드(2)로의 전환은, FT-IR 스펙트럼 데이터에서 산성 히드록실 그룹으로 인해 3400~2500 cm-1 범위에서 넓은 신호가 사라지는 것으로 나타났다. 치환 산 히드라지드(3)의 형성은 IR 스펙트럼에서, 산 히드라지드의 1차 및 2차 아미노기로 인한 3346, 3296 및 3156 cm-1에서의 새로운 신호의 출현으로 알 수 있었다. 한편, 카보닐 스트레칭 진동은 1733cm-1에서 1634cm-1로 약간 변화하며, 이로 인해 치환된 산 클로라이드(2)가 치환된 방향족산 히드라지드(3)로 성공적으로 전환되었음을 알 수 있었다. 1H NMR 스펙트럼에서, 각각 9.23 ppm 및 4.25 ppm에서, 1차 및 2차 아미노기로 인한 넓은 단일선(singlet)의 출현은 산 히드라지드(3)의 성공적인 합성을 추가로 확인한다.
치환 방향족 산 히드라지드(3)와 수 개의 치환 카르복실산과의 커플링은 107℃에서 옥시염화인과 함께 환류함으로써 실시되며, 이로 인해 상응하는 1,3,4-옥사디아졸 화합물 4a 내지 4k를 수득하였다. 산 히드라지드의 1차 및 2차 아미노기로 인한 3346, 3296 및 3156cm-1에서의 신호 소실은, 치환 옥사디아졸 화합물의 형성을 나타낸다. 추가 확인은 NMR 스펙트럼 분석에 의해 수행되었다.
실험예 3: 생물 평가
화합물 4a-4k에 의한 α-글루코시다아제의 저해 활성
당뇨병은 전반적인 인구에서 비만 및 노화의 증가와 관련있는 가장 심각한 만성 질환 중 하나이다. 식후 혈당치를 관리하는 것은 당뇨병 및 그 합병증을 통제하는데 가장 중요한 치료 방법으로, 그 치료 방법 중 하나는, 소화 기관에서 탄수화물 가수 분해 효소(즉, α-글루코시다아제)를 저해함으로써, 정상적인 혈당치로 복귀시 포도당 흡수를 지연시키는 것이다. α-글루코시다아제 저해 활성을 갖는 약물은 제2형 당뇨병과 관련된 고혈당 위험의 초기 단계를 관리할 수 있는 강력한 후보로 생각된다. 이러한 사실을 바탕으로, 본 발명자들은 새로운 계열의 1,3,4-옥사디아졸 화합물 4a 내지 4k를 합성하고, 이들의 α-글루코시다아제 저해 활성을 관찰하였다. IC50 값이 0.382±0.023 mM인 아카보스를 기준 저해제로 사용하였다. 화합물 4b 및 4c는 각각 0.641±0.12 mM 및 0.873±0.18 mM의 IC50 값을 가져, α-글루코시다아제의 가장 강력한 저해제였다.
화합물 4b는 치환기 R로서 4-OCH3 기를 갖고, n 값이 1이고 n'=2이며, 치환기 X로서 전자 흡인 4-F기를 가지며; 화합물 4c는 치환체 R로서 전자 공여 4-OCH3 기를 갖고, 치환기 X로서 3-F 기를 가지며, 전자 수여 옥사디아졸 고리와 측결합 아릴기 사이에 동일한 수의 탄소 원자를 갖는 것으로 나타났다.
한편, 2-F 기로서 치환기 X에 변화가 있는 화합물 4d는, 약간 낮은 α-글루코시다아제 저해 활성을 갖는데, 즉 IC50 값은 1.021±0.13 mM이지만, 화합물 4a 내지 4k 중에서 세 번째로 활성도가 높은 화합물이었다.
다른 모든 화합물들은 1.161±0.09 mM 내지 1.44±0.05 mM 범위의 IC50 값을 가져, 중간 내지 양호한 α-글루코시다아제 저해 활성을 나타냈다.
화합물 4a-4k 중에서 중 가장 활성이 약한 화합물은, IC50 값이 1.44±0.05 mM인 화합물 4k인데, 치환체 R 및 X는 2-OCH3이고, n=2와 n=1이었다. 전체적으로, 본 발명자들은 기준 약물과 비교하여 우수한 항당뇨 효능을 가진 새로운 종류의 화합물을 합성했다.
이러한 결과로부터, 전자 흡인 F-기로 치환된 화합물이 더 강한 α-글루코시다아제 저해제이며, 전자 공여 작용기를 갖는 화합물은 중간 정도의 저해 가능성을 갖는 것을 알 수 있었다. 상기 1,3,4-옥사디아졸 화합물 4a-4k에 대한 α-글루코시다아제 저해 시험의 결과를 이하의 표 1에 나타내었다.
본 발명의 1,3,4-옥사디아졸 화합물 4a-4k에 대한 α-글루코시다아제 저해 시험의 결과

화합물
R
X
n
n'		 α-글루코시다아제 저해 생물 시험
{IC50(mM)±SEMa}
4a 4-OCH3 4-OCH3 1 1 1.161±0.09
4b 4-OCH3 4-F 1 2 0.641±0.12
4c 4-OCH3 3-F 1 2 0.873±0.18
4d 4-OCH3 2-F 1 2 1.021±0.13
4e 4-OCH3 2-OCH3 1 2 1.246±0.11
4f 4-OCH3 4-OCH3 1 2 1.144±0.06
4g 2-OCH3 2-F 2 1 3.371±1.73
4h 2-OCH3 2-F 2 2 1.339±1.02
4i 2-OCH3 2-OCH3 2 2 1.389±0.27
4j 2-OCH3 -H 2 0 1.236±1.38
4k 2-OCH3 2-OCH3 2 1 1.44±0.05
아카보스 0.382±0.023
상기 SEMa는 평균에 대한 표준 오차를 나타나는 것으로, 3회의 개별적 측정에 대해 평균±SEM으로 나타낸다.
화합물 4b 및 4c의 α-글루코시다아제 저해 기작
상기한 바와 같이 화합물 4b 및 4c가 α-글루코시다아제에 대한 가장 강한 저해능을 가지므로, 본 발명자들은 이들 화합물을 대상으로 하여 기초가 되는 메커니즘을 더 연구했다. 도 3 및 도 4에서는, 각각 상이한 농도의 화합물 4b 및 4c의 존재하, α-글루코시다아제 효소의 1/V 대 1/[S]의 라인웨버-버크 플롯을 제공하였다.
도 3a의 결과는, 화합물 4b가 농도 증가시 VMax는 동일하지만 상이한 Km 값을 갖기 때문에, 화합물 4b가 경쟁적인 저해제라는 것을 나타내었다. 자유 효소(free enzyme)와 결합하는 저해제에 대한 평형 상수 Ki는, 저해제 농도 4b 대 외관상 미카엘-멘텐 상수(Km)의 플롯으로부터 얻어졌는데, 이는 도 4b에서 선형으로 도시되어 있다. 얻어진 4b의 Ki는 1.5±10 mM이었다. 반응 속도 상수 및 저해 상수의 결과를 이하의 표 2에 요약하였다.
화합물 4b의 α-글루코시다아제 저해 시험의 반응 속도 상수 및 저해 상수
상수 화합물 4b
IC50 (mM)±SEM 0.641±0.12
Km (mM) 0.98
Vmax (mM/Sec) 4.08×10-3
저해 유형 경쟁적 저해
K i (M) 1.5×10-4
도 4a의 결과는, 화합물 4c의 농도가 증가하는 경우 Km가 증가함에 따라 VMax가 감소하는 것으로 나타났다. 저해제 화합물 4c의 이러한 거동은 두 가지 상이한 경로에 의해 α-글루코시다아제를 저해한다는 것을 나타내었다. 즉 비경쟁적 방식으로 효소-기질 저해제 (ESI) 복합체를 형성하거나, 또는 경쟁적 방식으로 효소 저해제(EI) 복합체를 형성한다. 4c의 농도에 대한 기울기 도표는 EI 해리 상수 값 Ki = 2.5×10-4 및 ESI 해리 상수 값 Ki' = 4.0×10-3을 나타냈다 (도 4b 및 4c). 낮은 해리 상수는 효소와 화합물 4c 사이의 결합이 강한 것을 가리키며, 비경쟁적 방식보다 경쟁적 방식이 선호되는 것으로 생각된다.
또한, 표 3 및 도 5에 도시된 바와 같이, 기준 아카보스의 저해에 필적할 만한 α-글루코시다아제 저해를 나타내어, 농도 의존 효소 저해 가능성이 화합물 4b 및 4c에서 관찰되었다. 그러나, 어떠한 농도의 저해제 약물에서도 완전한 활성 저해는 관찰되지 않았다.
화합물 4c의 α-글루코시다아제 저해의 속도론적 분석
농도 Vmax (mM/초) Km (mM) 저해 유형 Ki (M) Ki ' (M)
저해제 없음 5.55×10-3 2.77
0.096 mM 4.54×10-3 4.16 혼합 저해 2.5×10-4 4.0×10-3
1.58 mM 3.84×10-3 5.88
분자 도킹 연구
리간드-단백질 결합 모드 및 상호 작용은 촉매 활성을 이해하는데 중요한데, 이는 3차원 공간에서 단백질 결합 부위에 대한 리간드의 배향이 그 리간드의 활성을 결정하기 때문이다. 따라서 30개 입체 구조(conformation)의 리간드는, 결합 에너지의 준위 및 핵심 잔기와의 상호 작용이 서로 상이한 데도 불구하고, 모두 포켓 내부에 도킹되었다. 도킹된 구조는 결합 자유 에너지 및 리간드 상호 작용에 기초하여 우선 순위가 정해졌다. MOE는 ‘S’ 영역에서의 결합 자유 에너지 및 결합 에너지(런던 dG)에 기초하여 도킹된 구조의 순위를 매겼다. 자세한 도킹 결과는 표 4에 요약되어 있다.
이 결과는 가장 선호되는 도킹된 구조의 2차원 상호 작용을 기반으로 기록되었다. 모든 선호된 도킹 구조는 캐비티 내부에 잘 중첩되어 있었다. 모든 리간드 중 가장 제안된 도킹된 포즈는 어떠한 리간드도 아미노산의 측쇄 또는 백본 잔기와 수소 결합 및 파이-수소(Pi-H) 결합을 나타내지 않았다. Pi-Pi 스태킹은 또한 HSD239와 리간드 4e 및 4g만으로 이루어진 것으로 나타났다. 그러나 4e 및 4g는 더욱 우수한 활성을 나타내는 리간드와 비교하면, 적은 수의 비결합 상호 작용에 의해 결합 부위에 고정되어 있는 것으로 나타났다. 모든 리간드는 극성 잔기 및 소수성 잔기와의 비결합 상호 작용이 거의 없이, 활성 부위에서 결합하였다. 도킹 계산에서 얻은 결과는 실험적 연구와 거의 일치하였다.
도 7은 가장 활성이 높은 리간드 (4b, 4c 및 4d)가 2차원 공간에서 효소 활성 부위의 아미노산 잔기와 상호 작용하는 것을 도시한다. 모든 저해제는 좁은 범위의 S 필드 (-6.9187 내지 -7.6047 kcal/mol)에서의 결합 자유 에너지, 및 에스코르-1 필드 (-9.5093 내지 -9.7277 kcal/mol)에서의 런던 dG, 즉 결합 에너지를 나타내었고, 이러한 이론적 결과는 실험 결과와 잘 일치되었다. 화합물 4b, 4c 및 4d는 거의 비결합 상호 작용에 의하지 않고 α-글루코시다아제의 촉매 활성을 저해하였다.
α-글루코시다아제 촉매 작용에서 활성 부위 잔기의 특이성을 고려하면, 화합물 4a-4k 중 일부는 Phe 157, Phe 177, Phe 300, Arg 312, Arg 439 및 Asp 349과의 비결합 상호 작용을 통해 활성 부위에 결합한다는 결론을 내릴 수 있었다.

화합물 구조		 IC50
(μM)		 결합에너지
(kcal/mol)		 아렌-아렌 소수성
상호작용		 극성
상호작용
S 런던 dG 상호작용 잔기들 거리(Å)
Figure pat00005

4a
1.161
-7.6047
-10.2734
-
-		 Phe 177
Phe 157
Phe 300		 Arg 312
Arg 439
Figure pat00006

4b
0.641
-6.9187
-10.2657
-
-		 Phe 177
Phe 157
Phe 300		 Arg 312
Arg 439
Asp 349
Figure pat00007

4c
0.873
-7.2637
-10.2095
-
-		 Phe 177
Phe 157
Phe 300		 Arg 312
Asp 349
Figure pat00008

4d
1.021
-7.0610
-9.8360
-
-
Phe 177
Phe 157
Phe 300
Arg 312
Arg 439
Asp 349
Figure pat00009

4e
1.246
-7.2683
-10.0653
HSD239
3.61
Phe 157
Phe 300
Arg 312
Asp 349
Figure pat00010

4f
1.144
-7.6289
-11.4159
-
-		 Phe 177
Phe 157
Phe 300		 Arg 312
Arg 439
Asp 349
Figure pat00011

4g
3.371
-7.1901
-10.0836
HSD239
3.97		 Phe 157
Phe 300		 Arg 312
Arg 439
Asp 349
Figure pat00012

4h
1.339
-7.3688
-10.1365
-
-		 Phe 177
Phe 157
Phe 300
Arg 312
Asp 349
Figure pat00013

4i
1.389
-7.3688
-10.3031
-
-		 Phe 177
Phe 157
Phe 300
Pro 309		 Arg 312
Arg 439
Asn 241
Figure pat00014

4j
1.236
-7.3916
-9.5093
-
-		 Phe 177
Phe 157
Phe 300
Arg 312
Arg 439
Figure pat00015

4k
1.44
-6.3214
-9.5093
-
-
Phe 157
Phe 300
Arg 312
기준물질
(아카보스)		 0.382
결론
본 발명자들은 치환된 옥사디아졸 화합물 4a-4k를 합성하고, 이들의 구조를 FT-IR, 1H NMR, 13C NMR 및 단결정 X-선 회절 분석에 의해 특성화하였다. 합성된 화합물들은 생체 활성 및 동역학 분석에 대해 평가되었다.
화합물 4a 내지 4k는 강력한 α-글루코시다아제 저해제인 것으로 나타났다. 그 중, 화합물 4b 및 4c는 α-글루코시다아제의 가장 강력한 저해제로서, 각각 0.641±0.12 mM 및 0.873±0.18 mM의 IC50 값을 가지며, 기준 물질인 아카보스의 IC50 값 0.382±0.023 mM과 비교하여 우수한 저해 효능을 나타내었다.
한편, 화합물 4d는 IC50 값이 1.021±0.13 mM로, 화합물 4a 내지 4k 중 3번째로 활성이 강한 화합물로 스크리닝되었다. α-글루코시다아제에 대한 라인웨버-버크 플롯에 의한 저해 동역학적 분석에 의하면, 화합물 4b가 경쟁적 저해 작용을 하는 반면, 4c는 혼합 저해 작용을 하며, 각각 1.5×10-4 및 4.0×10-3 M의 저해 상수값을 나타내는 것으로 나타났다.

Claims (7)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 1,3,4-옥사디아졸 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염:
    [화학식 1]
    Figure pat00016

    (상기 식에서, R은 메톡시 기이고, X는 수소, 메톡시 또는 플루오로 기이며, n 및 n'는 독립적으로 0, 1 또는 2이다).
  2. 제1항에 있어서,
    상기 R이 파라 메톡시 기이고, X가 플루오로 기이고, n이 1이고, n'가 2인 것을 특징으로 하는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 1,3,4-옥사디아졸 화합물은
    (4a) 2,5-비스(4-메톡시벤질)-1,3,4-옥사디아졸;
    (4b) 2-(4-플루오로페네틸)-5-(4-메톡시벤질)-1,3,4-옥사디아졸;
    (4c) 2-(3-플루오로페네틸)-5-(4-메톡시벤질)-1,3,4-옥사디아졸;
    (4d) 2-(2-플루오로페네틸)-5-(4-메톡시벤질)-1,3,4-옥사디아졸;
    (4e) 2-(4-메톡시벤질)-5-(2-메톡시페네틸)-1,3,4-옥사디아졸;
    (4f) 2-(4-메톡시벤질)-5-(4-메톡시페네틸)-1,3,4-옥사디아졸;
    (4g) 2-(2-플루오로벤질)-5-(2-메톡시페네틸)-1,3,4-옥사디아졸;
    (4h) 2-(2-플루오로페네틸)-5-(2-메톡시페네틸)-1,3,4-옥사디아졸;
    (4i) 2,5-비스(4-메톡시페네틸)-1,3,4-옥사디아졸;
    (4j) 2-(2-메톡시페네틸)-5-페닐-1,3,4-옥사디아졸; 및
    (4k) 2-(4-메톡시벤질)-5-(2-메톡시페네틸)-1,3,4-옥사디아졸로 구성되는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
  4. 제1항의 화합물을 포함하는 혈당 강하용 약학 조성물.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 제1항의 화합물을 조성물 총 중량을 기준으로 0.001 내지 90 중량% 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  6. 제4항에 있어서,
    약학적으로 허용가능한 희석제 또는 담체를 추가로 포함하는 약학 조성물.
  7. 이하의 (ⅰ) 내지 (ⅳ)의 단계들을 포함하는, 제1항의 화합물의 제조 방법:
    (ⅰ) 용매로서 1,2-디클로로에탄과 염소화제로서 옥시염화인의 존재하에, 아르알칸산을 환류하에 반응시켜, 아르알칸산 클로라이드를 합성하는 단계;
    (ⅱ) 상기 (ⅰ) 단계에서 수득된 아르알칸산 클로라이드를 아세토니트릴에 용해시킨 후, 이를 히드라진 수화물, TEA 및 아세토니트릴을 함유하는 용액에 적가하여 환류시켜, 아르알칸산 히드라자이드를 수득하는 단계;
    (ⅲ) 상기 (ⅱ) 단계에서 수득된 아르알칸산 하이드라자이드와 치환된 방향족산을 등몰량으로 옥시염화인에서 혼합한 후, 100~120℃에서 환류 하에 가열시키는 단계; 및
    (ⅳ) 상기 (ⅲ) 단계에서 수득된 혼합물을 냉각 및 침전시킨 후, 결정화시켜 상기 1,3,4-옥사디아졸 화합물을 수득하는 단계.
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