KR20190047293A - 케피어 그레인 유래 세포외다당체를 유효성분으로 함유하는 비만의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 케피어 그레인 유래 세포외다당체를 유효성분으로 함유하는 비만의 개선, 예방 또는 치료용 기능성 식품 및 약학 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 조성물은 전단 유동화 특성과 겔 혈성능을 가졌기 때문에 식품이나 약학 조성물에 적용하기 유리한 특성을 가진다. 또한, 본 발명의 조성물은 세포 내 지방세포의 분화를 저해하고, 고지방 식이와 함께 섭취하였을 경우 체중증가 감소 및 지방조직 무게 감소 효과와 혈중 콜레스테롤, 특히 VLDL를 낮추는 효과를 발휘하며, 장내세균총을 변화시켜 비만을 억제할 수 있는 효능을 발휘한다.

Description

케피어 그레인 유래 세포외다당체를 유효성분으로 함유하는 비만의 예방 또는 치료용 조성물{Composition for Preventing or Treating Obesity Comprising Exopolysaccharides from Kefir Grains}

본 발명은 케피어 그레인 유래 세포외다당체를 유효성분으로 함유하는 비만의 개선, 예방 또는 치료용 기능성 식품 및 약학 조성물에 관한 것이다.

지질대사의 장애인 비만(obesity)은 대사장애를 동반하는 경우가 많고, 전세계적으로 그 인구가 증가 추세이며, 최근 비만 인구가 저영양 및 전염병 인구를 넘어서기도 하였다. 비만의 원인은 내분비적, 유전적, 그리고 환경적인 요소들까지 다양하다. 최근, 몇몇 연구자들은 장내균총의 불균형을 비만의 원인으로 주장하고 있는데, 이러한 장내균총 불균형을 개선해주는 것으로 가장 잘 알려진 것이 프로바이오틱스이다.

프로바이오틱스(probiotics)는 건강에 도움이 되는 장내 세균총 즉, 숙주의 건강에 이로움을 제공하는 살아있는 미생물 즉 생균류를 의미한다. 일반적으로 프로바이오틱스는 요거트 등의 발효식품의 일부 또는 식이보충제로서 소비된다. 프로바이오틱스로 알려진 미생물에는 유산균(lactic acid bacteria; LAB), 비피도박테리아(bifidobacteria), 바실러스 등이 있다. 상기 프로바이오틱스 중 일부는 비만, 인슐린 저항, 비알코올성 지방간 등에 치료 효과가 있는 것으로 알려져 있다.

케피어(Kefir)는 코카서스 산간 지방에서 유래한 발효유의 일종으로, 티벳지방 승려들이 건강을 위해 음용하던 것이 대중화된 음료이다. 케피어의 구성영양소로는 단백질 및 다당체가 포함되어 있고 비타민 A, 비타민 B1, 비타민B2, 비타민B6, 비타민D, 비타민K2, 엽산, 니코틴산 및 칼슘, 철분, 요오드 등을 고루 포함하고 있다. 이러한 케피어는 유산균과 효모 복합체인 케피어 그레인으로 불리우는 균종(케피어 과립균이라고도 한다)을 개시제로 하여 우유를 발효시켜 얻어진 요구르트상의 음료이다.

케피어 그레인은 케피어 제품을 생산하기 위한 출발물질로서, 유산균(Lactobacillus, Leuconostic , Lactococcus , Streptococcus 등), 초산균(Acetobacter 등) 및 효모(Saccharomyces , Kluyveromyces , Torula 등)를 함유하는 겔 형태의 물질이다. 배양에 의하여, 케피어 미생물들은 점액질의 세포외다당체(exo-polysaccharides; EPS)를 형성한다.

EPS는 유제품에 점성을 주는 성분으로, 주로 점성, 안정성, 조직감, 겔 혈성능, 유화능 등을 중심으로 유제품 산업에서 중요하게 연구되어 왔다. EPS는 유산균을 포함한 미생물이 생육 과정에서 생산 및 배출하는 고분자 다당체다.

EPS는 두 가지 종류로 구성되는데, 하나는 오직 일종의 단당류(예를 들어, 덱스트란(dextran), 레반(levan), 이눌린(inulin) 등)로 구성되는 균일-다당체(homo-polysaccharide)이고, 다른 하나는 다양한 종류의 단당류 또는 이당류(예를 들어, 젤란(gellan), 잔탄(xanthan), 케퍼란(kefiran) 등)으로 구성되는 불균일-다당체(hetero-polyssharide)이다.

EPS의 산업적 용도는 단당류 구성, 결합구조, 분자량 등에 의해 결정되기 때문에 기존의 연구들은 주로 EPS의 구성, 구조, 추출 방법, 물성 등에 주로 초점을 맞춰왔다. 최근에 들어서야 EPS의 건강증진 효과(항균, 항암, 항산화, 면역 조절 효과 등)에 대한 연구가 이루어져왔다. 예를 들어, 대한민국 등록특허 제10-1751682호에서는 트라우스토키트리드계 변이균주에 의해 생성된 EPS의 암세포 증식억제 활성에 대해서 기재를 하고 있고, 대한민국 등록특허 제10-1655882호에서는 세리포리아 락세라타에 의해 생산되는 세포외다당체를 유효성분으로 함유하는 숙취해소용 조성물에 대해서 기재하고 있다. 그러나, 아직까지 대부분의 연구는 in vitro 시험관 실험에 제한되고 있다.

본 발명자들은 케피어 유래 EPS의 건강증진 효과에 대해서 연구한 결과, 케피어 그레인으로부터 분리한 EPS가 in-vitro 및 동물 실험에서 비만의 예방 또는 치료에 효과적이라는 결과를 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 케피어 그레인 유래 세포외다당체를 유효성분으로 함유하는 비만 개선용 기능성 식품을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 케피어 그레인 유래의 세포외다당체를 유효성분으로 함유하는 비만의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 케피어 그레인(Kefir grain) 유래 세포외다당체(exopolysaccharide)를 포함하는 비만 개선용 기능성 식품을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 케피어 그레인 유래 세포외다당체는 70 내지 90중량%의 탄수화물 및 0.01중량% 이하의 단백질을 포함할 수 있다.

본 발명에서, 상기 탄수화물은 글루코오스 및 갈락토오스를 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 케피어 그레인 유래 세포외다당체는 전단 유동화 특성을 가질 수 있다.

본 발명에서, 상기 세포외다당체는 세포 내 지방세포의 분화를 억제할 수 있다.

본 발명에서, 상기 세포외다당체는 혈중 콜레스테롤 수치를 낮출 수 있다.

본 발명의 기능성 식품은 장내 아커만시아(Akkermansia) 속 균을 증가시킬 수 있다.

본 발명은 또한, 케피어 그레인(Kefir grain) 유래 세포외다당체(exopolysaccharide)를 포함하는 비만의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 케피어 유래 세포외다당체를 유효성분으로 함유하는 조성물은 전단 유동화 특성과 겔 혈성능을 가졌기 때문에 식품이나 약학 조성물에 적용하기 유리한 특성을 가진다.

또한, 본 발명의 조성물은 세포 내 지방세포의 분화를 저해하고, 고지방 식이와 함께 섭취하였을 경우 체중증가 감소 및 지방조직 무게 감소 효과와 혈중 콜레스테롤, 특히 VLDL를 낮추는 효과를 발휘하며, 장내세균총을 변화시켜 비만을 억제할 수 있는 효능을 발휘한다.

도 1은 다양한 농도의 EPS의 전단 속도에 따른 전단 응력(a) 및 겉보기 점도(b)를 나타낸다.
도 2는 2% EPS 및 2% 베타글루칸(BG) 용액의 전단속도에 따른 겉보기 점도를 나타낸다.
도 3(a)는 EPS 용액의 진동수에 따른 저장 및 손실 지수의 변화를 나타내고,
도 3(b)는 EPS cryogel의 진동수에 따른 저장 및 손실 지수의 변화를 나타내며,
도 3(c)는 EPS 용액 및 EPS cryogel의 진동수에 따른 저장 지수의 변화를 나타낸다.
도 4는 EPS의 농도에 따른 지방세포(3T3-L1)의 세포생존율을 나타낸다.
도 5(a)는 EPS의 농도에 따른 지방세포(3T3-L1)의 외관 사진이다.
도 5(b)는 EPS의 농도에 따른 세포 내 상대적 지방량을 나타낸다.
도 6(a)는 식이 종류에 따른 실험쥐의 일일 에너지 섭취량을 나타낸다.
도 6(b)는 식이 종류에 따른 실험쥐의 제충 증가량을 나타낸다.
도 7은 식이 종류에 따른 실험쥐 군별 간 조직 무게(a) 및 지방 조직 무게(b)의 변화를 나타낸다.
도 8은 식이 종류에 따른 실험쥐 군별 혈중 콜레스테롤 수치를 나타낸다.
도 9는 식이 종류에 따른 장내 세균총의 변화를 나타낸다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 발명의 일 구현 양태는, 케피어 그레인(kefir grains) 유래 세포외다당체(exo-polysaccharide; EPS)를 유효성분으로 함유하는 비만 개선용 기능성 식품에 관한 것이다.

본 발명에서, 케피어(kefir)는 코카서스 산간 지방에서 유래한 발효유의 일종으로, 케피어는 유산균과 효모 복합체인 케피어 그레인으로 불리우는 균종을 개시제로 하여 우유를 발효시켜 얻어진 요구르트상의 음료를 의미한다.

본 발명에서, 케피어 그레인은 케피어 제품을 생산하기 위한 출발물질로서, 유산균(Lactobacillus, Leuconostic , Lactococcus , Streptococcus 등), 초산균(Acetobacter 등) 및 효모(Saccharomyces , Kluyveromyces , Torula 등)를 함유하는 겔 형태의 물질이다.

본 발명에서, 세포외다당체(EPS)는 유제품에 점성을 주는 성분으로, 유산균을 포함한 미생물이 생육 과정에서 생산 및 배출하는 고분자 다당체를 의미한다.

상기 케피어 유래 세포외다당체는 70 내지 90중량%의 탄수화물 및 0.01중량% 이하의 단백질을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 79 내지 89중량%의 탄수화물 및 0.002중량% 이하의 단백질을 포함할 수 있다. 상기 탄수화물은 주로 글루코오스 및 갈락토오스로 구성된다.

상기 세포외다당체는 건조된 케피어 그레인을 2 내지 20배의 끓는 물에 녹이는 단계; 물에 녹인 케피어 그레인을 원심분리하고, 상등액에 에탄올을 첨가하여 침전시키는 단계; 및 혼합물을 다시 원심분리하고, 응고물을 약 2 내지 20배의 끓는 물에 녹이는 단계에 의하여 제조될 수 있으며, 바람직하게는 상기 방법을 2 내지 5회 반복하여 분리할 수 있다.

본 발명에 따른 케피어 그레인 유래 세포외다당체는 전단속도(shear rate)가 증가함에 따라 낮은 겉보기 점도(apparent viscosity)를 나타내고, 세포외다당체의 농도가 높아짐에 따라 전단응력(shear stress) 및 겉보기 점도가 증가하는 전단 유동화(shear thinning) 특성을 나타낸다. 이러한 전단 유동화 특성은 본 발명의 세포외다당체가 액상 식품 등의 식품에 적용되기 용이하게 한다.

또한, 상기 케피어 그레인 유래의 세포외다당체는 겔-유사 특성을 갖기 때문에, 식품에 겔화 특성을 주기 위한 용도로 활용될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 케피어 그레인 유래 세포외다당체의 저장 모듈(G')이 모든 측정 범위에서 손실 모듈(G'')보다 높은 것으로 나타나 겔-유사 특성을 나타낸다는 것을 확인하였고, 또한 동결 및 융해하여 겔을 형성하는 경우, G' 및 G''가 증가하고 진동수에 덜 의존적인 경향을 나타냄에 따라 더욱 강한 겔-유사 특성을 나타낸다는 것을 확인하였다.

본 발명에 따른 케피어 그레인 유래의 세포외다당체는 독성을 갖지 않기 때문에 식품 또는 의약 용도에서 인체에 유익하게 사용될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 세포외다당체가 농도에 상관없이 높은 수준의 세포생존율을 나타낸다는 것을 확인하였다.

본 발명에서는 케피어 그레인으로부터 분리한 세포외다당체가 세포 실험 및 동물 실험 결과 비만을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다는 것을 발견하였다.

구체적으로, 본 발명의 케피어 그레인 유래 세포외다당체는 세포 내 지방세포의 분화를 효과적으로 억제함으로써 비만을 예방 또는 치료할 수 있다.

또한, 동물 실험에서 실제로 적용한 결과, 케피어 그레인 유래 세포외다당체를 고지방 식이와 함께 섭취한 실험쥐 그룹은 고지방 식이만 섭취한 실험쥐 그룹에 비하여 체중 증가가 감소되고, 간 및 지방의 무게가 감소한다는 것을 확인하였으며, 혈중 콜레스테롤 수치를 감소시킨다는 것을 확인하였다. 본 발명의 일 실시예에서는 케피어 그레인 유래 세포외다당체를 섭취한 실험쥐가 항-비만 활성을 갖는 것으로 알려진 베타글루칸(β-glucan) 보다 더 낮은 체중 증가, 간 및 지방 무게 감소 및 VLDL-C(very low density lipoprotein cholesterol) 수치 감소를 나타낸다는 것을 확인하였다. 본 발명의 세포외다당체는 VLDL-C 뿐만 아니라, LDL-C, TOTAL-C도 어느정도 감소시킨다는 것을 확인하였다.

VLDL-C 농도의 감소는 지방 세포 내에 축적된 트리아실글리세롤(triacylglycerol; TG)의 감소와 관련이 있다. TG는 간에서 생성된 VLDL의 주요한 성분이고 지방 세포의 감소는 간에서 TG 및 VLDL를 생성하는 자유 지방산을 감소하게 한다. 비만인 사람에게서, 플라즈마 VLDL-C 농도는 일반인보다 약 40배 가량 높게 나타난다.

또한, 본 발명의 케피어 그레인 유래의 세포외다당체는 장내세균총의 바람직한 변화를 발생시켜 비만을 효율적으로 억제할 수 있다. 구체적으로, 상기 세포외다당체를 섭취하는 경우 장내 세균은 박테로이데테스(Bacteroidetes), 베루코마이크로비아(Verrucomicrobia), 프로테오박테리아(Proteobacteria) 문(phyla)의 균이 증가하고, 퍼미쿠테스( Firmicutes ) 및 액티노박테리아( Actinobacteria ) 문의 균이 감소한다.

특히, 케피어 그레인 유래 세포외다당체를 섭취한 실험군은 아커만시아(Akkermansia) 속의 균이 베타글루칸에 비하여 2배 이상 증가한다. 상기 아커만시아 균은 장내 유익균으로서 비만 및 염증에 관여하는 것으로 알려져 있다. 예를 들어, 아커만시아 무시니필라(Akkermansia muciniphila)는 식이-유도된 비만을 감소시키는 것으로 알려졌다.

본 발명의 케피어 그레인 유래 세포외다당체는 베타글루칸에 비하여 훨씬 낮은 수준의 점도를 갖지만, 오히려 더 우수한 항-비만 활성을 나타낸다. 이는 종래의 많은 연구에서, 더 점성이 높은 다당체가 식욕을 억제하여 에너지 흡수나 글루코오즈 및 지질의 흡수를 억제함으로써 더 우수한 항-비만 효과를 나타낸다는 것과 상반된다. 이는 케피어 그레인 유래 세포외다당체의 항-비만 활성이 이의 점도에서부터 발휘된 것이 아니라는 것을 의미한다.

장내세균총의 변화에 있어서, 베타글루칸을 섭취한 실험쥐는 장내에서 알로바쿠룸(Allobaculum) 속의 균이 약 4배 가량 증가하였지만, EPS 섭취 실험군의 경우 알로바쿠룸 균이 전혀 증가하지 않았다. 알로바쿠룸 균은 트립토판(tryptophan)을 아릴 탄화수소 수용체(aryl hydrocarbon receptor; AHR) 리간드로 분해하여 장 내의 염증을 방지한다. 즉, 본 발명의 세포외다당체는 베타글루칸과 상이한 메커니즘에 의해 비만을 억제한다는 것을 알 수 있다.

본 발명에 따른 케피어 그레인 유래 세포외다당체를 유효성분으로 함유하는 조성물은 비만을 개선하기 위한 기능성 식품으로 적용될 수 있다. 상기 조성물은 전단 유동성을 갖고 겔-유사 특성을 갖기 때문에 식품에 적용되기 유용하다.

상기 기능성 식품은 발효식품인 것이 바람직하지만, 이에 제한되지는 않는다. 예를 들어서, 상기 기능성 식품은 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류일 수 있으며, 더욱 자세히는, 유제품, 제과물, 조미료, 음료 및 드링크제, 스낵, 캔디류, 젤리류, 아이스크림 및 냉동용 디저트, 아침 곡물류, 영양바, 스낵 바 초콜렛 제품, 가공 식품, 곡물 제품 및 파스타, 스프, 소스 및 드레싱, 과자 제품, 오일 및 지방 제품, 유제품 음료 (dairy drink) 및 우유 음료, 차, 두유 및 콩 유제품 (soy dairy-like product), 냉동식품, 조리 음식 및 대체 음식, 육류 제품, 치즈, 요구르트, 빵 및 롤빵, 케이크, 쿠키 및 크래커로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있다.

또한, 상기 기능성 식품은 케피어 그레인 유래 세포외다당체를 포함하는 캡슐, 정제, 분말, 액상 현탁액, 환제 및 과립제 등의 제형으로 제조될 수 있다.

또한, 상기 기능성 식품은 케피어 그레인 유래 세포외다당체 외에도 유효성분으로서 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 기능성 식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있으며, 과일주스나 야채 음료 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.

본 발명의 케피어 그레인 유래 세포외다당체는 또한, 비만의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 적용될 수 있다.

상기 약학 조성물은 케피어 그레인 유래 세포외다당체를 유효성분으로서 함유하며, 통상의 방법에 따른 적절한 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 약학 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제화에 관해서는 레밍턴의 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)]에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 경구 또는 비경구 투여 모두 가능하며, 비경구 투여는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등을 포함한다.

경구 투여용 제형으로는 예를 들면 정제, 환제, 경질, 연질 캅셀제, 액제, 현탁제, 유화제, 시럽제, 과립제 등이 있는데, 이들 제형은 유효성분 이외에 희석제(예: 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 및/또는 글리신), 활택제(예: 실리카, 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및/ 또는 폴리에틸렌 글리콜)를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 정제는 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 트라가칸스, 메틸셀룰로즈, 나트륨 카복시메틸셀룰로즈 및/또는 폴리비닐피롤리딘과 같은 결합제를 함유할 수 있으며, 경우에 따라 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염과 같은 붕해제 또는 비등 혼합물 및/또는 흡수제, 착색제, 향미제 및 감미제를 함유할 수 있다. 상기 제형은 통상적인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 의해 제조될 수 있다.

또한, 비경구 투여용 제형의 대표적인 것은 주사용 제제이며, 주사용 제제의 용매로서 물, 링거액, 등장성 생리 식염수 또는 현탁액을 들 수 있다. 상기 주사용 제제의 멸균 고정 오일은 용매 또는 현탁 매질로서 사용할 수 있으며 모노-, 디-글리세라이드를 포함하여 어떠한 무자극성 고정오일도 이러한 목적으로 사용될 수 있다. 또한, 상기 주사용 제제는 올레산과 같은 지방산을 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 따른 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 통상의 지식을 가진 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

구체적으로, 본 발명에 따른 조성물의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1kg 당 0.001 내지 150mg, 바람직하게는 0.01 내지 100mg을 매일 또는 격일 투여하거나 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

실시예

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 케피어 그레인의 배양

케피어 그레인을 건국대학교 수의학대학 식품안전연구센터에서 구입하여, 10배 무게에 해당하는 초고온 멸균 우유(서울우유)에 첨가한 후, 밀폐 플라스틱 용기에 넣어 30℃에서 배양하였다.

상기 케피어 그레인을 매일 새로운 멸균 우유로 갈아주면서 50g의 그레인이 1000g이 될 때까지 6주간 발효한 후, 배양된 케피어 그레인을 플라스틱 체(기공 크기: 1mm)로 거른 후 동결건조하고 -20℃에서 보관하였다.

실시예 2: 케피어 그레인으로부터 세포외다당체 (EPS) 분리

EPS를 공지의 기술을 약간 변형하여 추출하였다. 건조된 케피어 그레인의 무게를 측정한 후 10배 부피의 끓는 물에 녹여 500rpm에서 1시간 동안 끓인 후, 현탁액을 10,000×g로 20분간 20℃에서 원심분리하였다. 분리된 상등액에 2배 부피의 식용 에탄올(대정화학)을 부어 EPS를 침전시키고, 하룻밤 동안 -20℃에서 유지하였다. 혼합물을 10,000×g로 20분간 원심분리한 후, 뭉친 응고물을 10배 부피의 끓는 물에서 1시간 동안 교반하여 녹였다. 이와 같은 침지 과정을 3회 반복하였다. 원심분리한 응고물을 최종적으로 3배 부피의 뜨거운 물에 녹인 후 동결건조하였다.

EPS의 순도는 단당류와 단백질 성분 함유 여부로 확인하는데, 환원당 시험(Miller, G.L., chemistry, 1959. 31(3): p. 426-428.)과 단백질 시험(Bradford, M.M., Analytical biochemistry, 1976. 72(1-2): p. 248-254.)을 통해 평가하였다. 또한, 총 탄수화물 성분 함량은 페놀황산 시험으로 측정하였다(Enikeev, R., Food Chem, 2012. 134(4): p. 2437-41).

실험 결과, EPS가 높은 순도로 분리되었고, 수율은 건조된 케피어 그레인 무게 100g에서 569.1 ± 25.3mg이었다.

분리된 EPS는 0.0016%의 단백질을 함유하고, 환원당은 함유하고 있지 않았다. 총 탄수화물 농도는 84.1 ± 4.6%이었으며, 주요한 탄수화물은 글루코오스와 갈락토오스였다.

실시예 3: EPS의 전단 유동화 특성 분석

3-1: EPS 농도에 따른 전단유동화 특성

EPS의 전단유동화 특성을 분석하기 위하여 다양한 농도의 EPS 용액을 준비하였다. EPS 용액은 건조된 EPS를 70℃의 물에 원하는 농도로 녹인 후, 측정 전까지 25℃에서 보관하였다.

3, 5, 11, 13 및 15% 농도의 EPS에 대한 겉보기 점도(apparent viscosity, η_a)와 흐름 특성(flow behavior)을 1mm gap과 35mm 지름의 평행판이 장착된 레오미터(RheoStress, Thermo Haake)로 측정하였다. 전단 속도(shear rate)는 0에서 500S^-1까지 높여 25℃에서 측정하였으며, 전단응력은 실험 데이터를 power law 모델에 적용하여 RheoWin data maganer(RheoWin pro v.2.96, Hakke)를 사용하여 계산된 유동지수(flow index; n) 및 점조지수(consistency index; K)를 아래의 식에 적용하여 계산하였다.

σ = K

ⁿ

σ는 전단응력(shear stress, Pa), K는 유동점조지수(Pa·sⁿ),

는 전단속도(s^-1), 및 n은 유동행동지수(무차원)을 의미한다.

계산된 전단응력 및 겉보기 점도를 도 1에 나타내었다.

도 1에서, EPS 용액은 전단속도가 증가함에 따라 낮은 겉보기 점도를 보였고, 전단응력 및 겉보기 점도 모두 EPS 용액의 농도가 높아짐에 따라 함께 증가하였다. 따라서 EPS은 전형적인 유사-가소성(pseudo-plastic) 또는 전단 유동화 특성(shear thinning)을 나타내었다.

한편, power law 모델에 적용한 EPS 용액의 물성 특성을 하기 표 1에 나타내었다.

상기 표 1에서, EPS의 유동행동지수(n)는 1보다 낮았으며, 겉보기 점도(η, 300S^-1)는 EPS 용액의 농도에 의존적으로 증가하였다.

3-2: EPS 용액 및 베타글루칸 용액의 특성 비교

EPS 용액의 점도 특성을 베타클루칸(β-glucan; BG)과 비교하였다.

2%의 EPS 용액 및 2%의 베타글루칸(Cargil)를 각각 끓는 물에 첨가하여 10분간 완전히 용해시키고 냉각하였다. EPS 및 BG 용액의 유동 특성을 회전형 레오미터(AR-2000, TA instruments)를 사용하여 25℃에서 1에서 100s^-1까지 전단속도를 증가시켜 측정한 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2에서, EPS과 BG 용액의 점도를 비교한 결과, BG(46.74mPa·s)가 EPS(7.69mPa·s)보다 유의적으로 높은 점도를 가지는 것으로 확인되었다.

실시예 4: EPS의 겔 형성능 측정

EPS의 겔 형성 능력을 분석하기 위하여, 2% EPS 용액을 사용하여 EPS cryogel(동결 융해로 만들어진 겔)을 제조하였다.

동결건조된 EPS를 70℃에서 2%로 용해하고, 실온에서 식힌 후, 35mm 지름의 원통형 플라스틱 용기에 붓고 파라필름으로 입구를 봉한 후, EPS 용액은 96시간 동안 4℃에서 방치하고, EPS cryogel은 처음 48시간 동안 -20℃에서 유지하고 다음 48시간 동안은 4℃에서 방치하여 제조하였다.

작은 진폭 진동 전단(small-amplitude oscillatory shear) 흐름 특성을 EPS 용액의 경우 원형 실린더, EPS cryogel의 경우 평행판을 설치한 회전 레오미터를 사용해 1 내지 100Hz, 25℃에서 측정하였다. 측정 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3(a)는 EPS 용액의 진동수에 따른 저장 및 손실 지수의 변화를 나타내고, 도 3(b)는 EPS cryogel의 진동수에 따른 저장 및 손실 지수의 변화를 나타내며, 도 3(c)는 EPS 용액 및 EPS cryogel의 진동수에 따른 저장 지수의 변화를 나타낸다.

도 3(a)에서, EPS 용액은 조사된 주파수 범위 내에서 저장 모듈(G')이 손실 모듈(G'')보다 높은 것으로 나타나, 겔 유사 특성을 나타낸다는 것을 확인할 수 있었으며, 진동수 증가에 강하게 의존하는 것을 확인하였다.

동결 및 융해 겔 형성 후, EPS cryogel은 G'과 G''이 증가하고 진동수에 덜 의존적인 성향을 보임에 따라 더 강한 겔 유사 특성을 나타내었다.

도 3(c)에서, 10Hz 주파수에서, EPG cryogel의 G'값은 23.5 ± 0.4Pa로서, EPS 용액의 5.2 ± 0.5Pa에 비하여 5배 높은 값을 나타내었다.

EPS 용액과 cryogel의 tanδ(G''/G') 값은 모두 1 미만을 나타내었는데, 이는 두 시료 모두 탄성 특성이 점성 특성보다 더 우세하다는 것을 나타낸다.

실시예 5: EPS의 세포독성 및 지방세포 분화저해 특성 평가

5-1. 세포 배양 및 분화

3T3-L1 지방전구세포를 ATCC로부터 구입하여 사용하였다. 세포를 6-well 플레이트(Corning Inc.)를 이용하여, high glucose(Gibco), 10% 소혈청(bovine serum) 및 1% 페니실린 스트렙토마이신(P/S, Gibco)을 함유하는 둘베코수정이글배지(Dulbecco's modified Eagle's medium; DMEM)에서 confluence까지 배양하였다.

Confluence 2일 후, 3T3-L1 세포를 10% FBS/DMEM에 1% P/S, 0.5mM 3-이소부틸-1-메틸잔틴(IBMX), 1μM 덱사메타손, 및 10μg/mL 인슐린 용액(Sigma-Aldrich)으로 처리한 MDI 배지로 계대 배양하였다.

이때를 분화 0일로 하여 분화 2일 후에는 10% FBS, 1% P/S 및 10μg/mL 인슐린 용액을 함유하는 DMEM 배지로 교체하여 2일간 배양하였으며, 4일 째는, 10% FBS 및 1% P/S 함유 DMEM 배지에서 24시간 배양하여 분화를 완료하였다.

세포는 37℃, 5% CO₂에서 CO₂ incubator(Thermo Fisher Scientific Korea)에서 배양하였다.

5-2. 세포 생존력 분석

세포를 96-well 플레이트에서 10% FBS 및 1% P/S 처리된 DMEM 배지에서 1 x 10⁴ Cells/well 농도로 24시간 배양한 후, 20μL EPS 용액 또는 대조군으로서 PBS(Lonza) 용액으로 처리하였다.

24시간 후, PBS 내의 0.5mg/mL MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(Sigma-Aldrich) 20μL를 첨가하고, 어두운 조건에서 4시간 유지하였다.

이후, Well 플레이트를 1,500rpm으로 5시간 원심분리하고, 상등액을 제거하였다. Well 내에 남은 포르마잔(formazan) 결정을 150μL의 디메틸 설폭사이드(대정화학)로 15분간 녹여내었다. 540nm에서의 흡광도를 Synergy HT Multi-microplate Reader(BioTek Instruments)로 측정하여 포르마잔 함량을 측정하였다. 결과를 세포생존율로 계산하여 도 4에 나타내었다.

EPS의 지방세포에 대한 독성 평가 결과, 모든 EPS 농도에서 80% 이상의 생존율을 보여 EPS가 독성을 가지지 않는 것을 확인하였다.

5-3. 오일 레드 O 염색 및 세포내 지질 정량화

세포 내 지질의 염색을 위하여 오일 레드 O 염색을 수행하였다.

세포를 6-well 플레이트에서 4 x 10^-4 cells/well의 밀도로 배양한 후 상술한 방법으로 6일간 분화시켰다.

0.01, 0.1 및 1mg/mL의 EPS 용액을 분화 동안 대조군을 제외한 각 well에 첨가하였다. 분화가 완료된 이후, 각 well을 PBS 용액으로 두 번 세척하고 PBS 내의 4% 파라포름알데하이드(Yakuri Pure Chemicals Co.)으로 1시간 동안 처리하여 세포를 well 표면에 고정하였다. 고정 후, 세포를 탈염수로 헹궈내고, 50% 이소프로판올(대정화학)으로 5분간 처리하였다. 이소프로판올을 제거한 후, 여과된 오일 레드 O 용액을 실온에서 10분간 첨가하였다. Well을 물로 세척한 후 사진으로 기록하고(도 5(a)), 100% 이소프로판올을 각 well에 첨가하였다. 추출된 오일 레드 O를 10,000 x g에서 2분간 원심분리하고, 상등액을 96-well 플레이트로 옮겼다.

마이크로플레이트 리더를 이용하여 오일 레드 O 염료의 흡광도를 480nm에서 측정하였다. 세포 내 지방의 상대적인 양(OD_sample / OD_control) x 100을 계산하여 도 5(b)에 나타내었다.

도 5에서, 0.01, 0.1 및 1mg/mL의 EPS 용액에서 각각 80.91%, 59.52% 및 42.05%의 상대적 세포 내 지방량을 보여, 농도의존적이고 유의적으로 지방 분화를 저해하는 것이 확인되었다.

즉, 케피어 그레인 유래의 EPS가 세포 내 지방의 분화를 억제함으로써 비만을 예방 또는 치료할 수 있다는 것을 확인하였다.

실시예 6: EPS 섭취에 따른 실험쥐의 체중, 지방 및 간 조직 무게, 및 혈중 콜레스테롤 변화 분석

6-1: 실험 절차

4주된 수컷 C57BL/6J 실험쥐에 chow diet와 물을 1주간 식이하여 적응기간을 가진 후, 실험쥐를 9마리씩 4개 그룹으로 나누어 각각 5% MCC(microcrystalline cellulose)를 함유한 고지방식이(high fat diet, HF), 5% 베타글루칸(BG) 함유 고지방식이, 5% EPS 함유 고지방식이, 및 5% 잔여물(케피어 그레인에서 EPS을 추출한 후 남은 잔여물, Res) 함유 고지방식이를 각각 4주간 제공하였다.

구체적인 식이 구성은 하기 표 2에 나타낸 바와 같다.

실험 마지막 날, 실험쥐를 12시간 동안 금식시킨 후, 4% 이소플루란으로 마취시킨 후 혈액 및 조직을 채취하였다. 혈장은 혈액을 2,000×g로 30분간 4℃에서 원심분리하여 얻었다. 총 콜레스테롤, 고밀도 지단백 콜레스테롤(HDL-C), 저밀도 지단백 콜레스테롤(LDL-C) 및 초저밀도 지단백 콜레스테롤(VLDL-C)은 배제크로마토그래피로 측정하였다.

6-2: 식이에 따른 체중 변화

도 6(a)는 식이 종류에 따른 실험쥐의 일일 에너지 섭취량을 나타내며, 도 6(b)는 식이 종류에 따른 실험쥐의 체중 증가량을 나타낸다.

도 6(a) 및 (b)에서, 일일 에너지 섭취량이 실험군 사이에 유의적인 차이가 없었음에도 불구하고, 식이 투여 3주 후 EPS 섭취군(7.31±0.46g)이 대조군(8.84±1.11g)에 비해 유의적으로 낮은 체중증가를 보였다.

식이 4주후에는 모든 군이 대조군에 비해 낮은 체중증가를 보였으며, EPS의 섭취가 가장 빠른 체중증가 감소 효과를 나타내었다.

6-3: 식이에 따른 간 및 지방 조직 무게 변화

도 7(a) 및 (b)는 각각 식이 종류에 따른 간 조직 무게(a) 및 지방 조직 무게(b)의 변화를 나타낸다.

간 조직 및 지방 조직 모두 EPS 섭취 군에서 무게가 가장 많이 감소한 것을 확인할 수 있으며, 특히, 부고환 무게를 통해 측정한 지방 조직의 무게가 EPS 섭취군에서 유의적으로 낮은 수치를 보였다.

6-4: 식이에 따른 혈중 콜레스테롤 수치 변화

도 8은 식이 종류에 따른 실험쥐 군별 혈중 콜레스테롤 수치를 나타낸다.

혈중 콜레스테롤 측정 결과에서도, EPS 섭취군에서 가장 낮은 콜레스테롤 값을 나타내었다. 특히, VLDL-C 수치의 경우 EPS 섭취군은 1.28±0.21mg/dL인 반면 대조군은 1.99±0.22mg/dL로서 약 36%정도 더 낮은 값을 나타내었다.

LDL-C 및 TOTAL-C의 경우도 EPS 섭취군이 32.5±4.1mg/dL 및 140±6.6mg/dL로 가장 낮은 수치를 나타내었다.

이는 EPS가 혈중 VLDL-C를 낮추는 효과를 가졌으며, 다른 혈중 지질 농도를 낮출 가능성을 가진 재료임을 나타낸다.

실시예 7: EPS 섭취에 따른 장내 세균총 변화 분석

유전체 DNA를 QIAamp DNA stool mini kit(QIAGEN)를 사용하여 200mg의 동결건조된 배설물 시료로부터 추출하였다.

Bacterial 16S rDNA의 V4 및 V5 도메인을 생성하여 만든 V4 및 V5 라이브러리를 분리한 후 클러스터를 생성하였다. QIIME program을 이용하여 Operational Taxonomic Units (OUT) tables과 alpha diversity를 산출해 내었다. MEGAN과 Explicet program을 사용하여 stacked bar와 통계학적 유의성을 얻었으며 Wilcoxon법에 의해 고지방식과 다른 실험군들의 통계학적 유의성을 산출하였다. 시료로부터 산출한 장내 세균총 분석 결과를 도 9 및 표 4에 나타내었다.

도 9에서, EPS 섭취군은 대조군 및 비교군에 비하여 박테로이데테스(Bacteroidetes), 베루코마이크로비아(Verrucomicrobia) 및 프로테오박테리아(Proteobacteria) 문(phyla)의 균이 증가하고, 퍼미쿠테스( Firmicutes) 및 액티노박테리아(Actinobacteria) 문의 균이 감소하였다.

특히, 표 3에서, EPS 섭취군은 베루코마이크로비아(Verrucomicrobia) 문에 있어서, 아커만시아(Akkermansia) 속 균을 BG 섭취군에 비하여 2배 이상 증가시키는 것이 확인되었다.

이상으로 본 발명의 내용의 특정부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (8)

1. 케피어 그레인(Kefir grain) 유래 세포외다당체(exopolysaccharide)를 유효성분으로 포함하는 비만 개선용 기능성 식품.
   
2. 제 1 항에 있어서,
   상기 케피어 그레인 유래 세포외다당체가 70 내지 90중량%의 탄수화물 및 0.01중량% 이하의 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는, 비만 개선용 기능성 식품.
   
3. 제 2 항에 있어서,
   상기 탄수화물이 글루코오스 및 갈락토오스를 포함하는 것을 특징으로 하는, 비만 개선용 기능성 식품.
   
4. 제 1 항에 있어서,
   상기 케피어 그레인 유래 세포외다당체가 전단 유동화 특성을 갖는 것을 특징으로 하는, 비만 개선용 기능성 식품.
   
5. 제 1 항에 있어서,
   세포 내 지방세포의 분화를 억제하는 것을 특징으로 하는, 비만 개선용 기능성 식품.
   
6. 제 1 항에 있어서,
   혈중 콜레스테롤 수치를 낮추는 것을 특징으로 하는, 비만 개선용 기능성 식품.
   
7. 제 1 항에 있어서,
   장내 아커만시아(Akkermansia) 속 균을 증가시키는 것을 특징으로 하는, 비만 개선용 기능성 식품.
   
8. 케피어 그레인(Kefir grain) 유래 세포외다당체(exopolysaccharide)를 유효성분으로 포함하는 비만의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
   

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