KR20230064568A - 엔테로코커스 속 균주 유래 다당체의 용도 - Google Patents

엔테로코커스 속 균주 유래 다당체의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 엔테로코커스 속(Enterococcus genus) 균주 유래 다당체 및 이의 용도에 관한 것으로, 엔테로코커스 속 균주 유래 다당체는 줄기세포의 골 분화를 촉진할 수 있어 골 형성 촉진에 이용될 수 있고, 골 재생에 의해 치료 가능한 골 질환의 예방 또는 치료에 이용될 수 있다.

Description

엔테로코커스 속 균주 유래 다당체의 용도{Uses of polysaccharide derived from strains belonging to the Enterococcus genus}
본 발명은 엔테로코커스 속 균주 유래의 다당체의 용도에 관한 것이다.
뼈는 신체의 단단한 결합 조직이며 다양한 장기 보호, 적혈구 및 백혈구 생성, 미네랄 저장, 신체지지 구조 등 여러 기능을 가지고 있다. 뼈는 스스로 복구할 수 있는 본질적인 능력을 가지고 있다. 그러나 심한 뼈 결손이 발생한 후에는 뼈의 자가 복구가 어려운 경우가 많다. 뼈 재생은 재건 수술에서 중요하고, 줄기 세포의 골 분화는 골 결손 치료를 위한 도구를 제공할 수 있다.
줄기 세포는 자가 재생 능력이 있고 다양한 세포로 분화할 수 있기 때문에 부상이나 질병 후 조직 재생에 사용된다. 치과 치수 줄기 세포 (DPSC)는 신경 능선 유래 중간엽 줄기 세포로 지방 생성, 골 형성, 연골 생성 및 근 생성 세포로 분화할 수 있다. DPSC는 비외과적인 방법으로 치아의 치수 조직에서 분리할 수 있다. DPSC는 신경계 질환, 면역 결핍 질환 및 연골 질환과 같은 일부 질병을 치료하는 데 사용할 수 있는 잠재력이 있다.
한편, 세포외다당체(exopolysaccharides)는 미생물 세포벽의 일부로서 세포벽주위에 협막을 형성하거나 세포벽 외부에 점질 형태로서 발효 중에 축적되는 미생물 다당류로, 1차 또는 2차 대사산물이다. EPS는 대부분 다당류 (exopolysaccharides)와 단백질 로 구성되지만, DNA, 지질, 휴믹 물질과 같은 다른 거대분자도 포함한다. EPS는 박테리아 정착의 구성 물질이며 세포의 외부 표면에 부착된 상태로 유지되거나 성장 배지로 분비된다.
한국등록특허 제 10-2135272호
본 발명은 엔테로코커스 페시움 균주 유래의 다당체를 포함하는 골 형성 촉진용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 골 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
1. 엔테로코커스 속(Enterococcus genus) 균주 유래의 다당체를 포함하는 골 형성 촉진용 조성물.
2. 위 1에 있어서, 엔테로코커스 속 균주는 엔테로코커스 페시움(Enterococcus faecium) 또는 엔테로코커스 락티스(Enterococcus lactis)인, 골 형성 촉진용 조성물.
3. 위 1에 있어서, 다당체는 엔테로코커스 속 균주가 포함된 성장 배지를 원심분리하는 단계; 성장 배지의 상층액을 분리하고, 분리된 상층액에 트리클로로 아세트산을 첨가하여 배양하는 단계; 배양된 상층액을 무수 에탄올과 혼합 배양하여 침전물을 얻는 단계 및 침전물을 투석하는 단계를 포함하는 다당체의 제조방법으로 얻어진 것인, 골 형성 촉진용 조성물.
4. 위 1에 있어서, 다당체의 농도는 0.5 내지 2 μg/ml인, 골 형성 촉진용 조성물.
5. 위 1에 있어서, 줄기세포의 골 분화 유도를 촉진하는, 골 형성 촉진용 조성물.
6. 위 5에 있어서, 상기 줄기세포는 치수 줄기세포인, 골 형성 촉진용 조성물.
7. 위 1에 있어서, 인공골, 인공관절, 골 고정재, 골 대체제, 골 수복재, 골 충진재 또는 골 이식재 중 하나 이상에 사용되는, 골 형성 촉진용 조성물.
8. 엔테로코커스 속(Enterococcus genus) 균주 유래의 다당체를 포함하는 골 형성 또는 골 재생에 의해 치료 가능한 골 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
9. 위 8에 있어서, 상기 엔테로코커스 속 균주는 엔테로코커스 페시움(Enterococcus faecium) 또는 엔테로코커스 락티스(Enterococcus lactis)인 다당체를 포함하는, 골 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
10. 위 8에 있어서, 다당체는 엔테로코커스 속 균주가 포함된 성장 배지를 원심분리하는 단계; 성장 배지의 상층액을 분리하고, 분리된 상층액에 트리클로로 아세트산을 첨가하여 배양하는 단계; 배양된 상층액을 무수 에탄올과 혼합 배양하여 침전물을 얻는 단계 및 침전물을 투석하는 단계를 포함하는 다당체의 제조방법으로 얻어진 것인, 골 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
11. 위 8에 있어서, 다당체의 농도는 0.5 내지 2 μg/ml인, 골 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
12. 위 8에 있어서, 상기 골 질환은 치주질환(periodontal disease), 치주염(periodontitis), 치조골 질환(alveolar bone disease), 골다공증(osteoporosis), 골연화증(osteomalacia), 골감소증(osteopenia), 골위축(bone atrophy), 골관절염(osteoarthritis), 류마티스 관절염(rhermatoid arthritis), 골용해(osteolysis), 섬유이형성증(fibrous dysplasia), 파제트병(Paget's disease), 골 형성부전증(osteogenesis imperfect) 및 고칼슘혈증(hypercalcemia)으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나인, 골 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
본 발명의 엔테로코커스 속 균주 유래의 다당체는 줄기세포의 골 분화 유도를 통해 골 형성을 촉진할 수 있다.
본 발명의 엔테로코커스 속 균주 유래의 다당체를 포함한 조성물은 골 형성 촉진에 적용될 수 있으며, 골 재생 및 골 형성이 필요한 골 질환의 치료 또는 예방에 적용될 수 있다.
도 1 및 2는 fluorescence-activated cell sorting(FACS)에 의한 계대수 3 및 8 hDPSCs(human dental pulp stem cells)의 특성 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 엔테로코커스 페시움 L15 추출물(L 15 추출물)이 hDPSC의 골 형성 분화를 촉진함을 보여준다. A는 다양한 농도의 L15 추출물 처리에 따른 세포생존율(%)을 나타낸다. B는 L15 추출물을 처리한 또는 처리하지 않은 hDPSC에 ALP 염색한 후의 명시야 현미경 사진(EVOS™ XL Core Imaging System, 스케일 바 = 200μm)이다. C는 L15 추출물을 처리한 또는 처리하지 않은 hDPSC의 ARS 염색을 통한 칼슘 침착 여부를 보여준다. D는 실시간 PCR로 분석된 골 형성 분화 마커 유전자(RUNX2, ALP 및 COL1A1)의 상대적 발현 수준을 나타낸다. GAPDH는 정규화에 사용되었다. E는 골 형성 분화 마커 단백질(BMP4, RUNX2 및 ALP)의 상대적 발현 수준을 나타낸다. F는 E에서 나타난 GAPDH 대비 각 단백질의 발현 강도를 정량적으로 분석한 결과이다. 오차 막대는 평균의 표준 편차를 나타낸다(*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001. N = 3). Extract: 엔테로코커스 페시움 L15 추출물 처리군, Control: 아무것도 처리하지 않은 대조군.
도 4의 A는 엔테로코커스 페시움 L15 유래 세포외다당체(L15 EPS)의 크기배제 크로마토그램을 나타낸다. B 및 C는 각각 3일 및 7일 동안 골 형성 분화 배지를 사용하여 다양한 용량의 L15 EPS에 노출 시 hDPSC의 생존율을 나타낸다(***p < 0.001. 스케일 바 = 200 μm. N = 3).
도 5는 엔테로코커스 페시움 L15 유래 세포외다당체(L15 EPS)이 hDPSC의 골 형성 분화를 촉진함을 보여준다. A는 L15 EPS를 처리한 또는 처리하지 않은 hDPSC에 ALP 염색한 후의 명시야 현미경 사진(EVOS™ XL Core Imaging System, 스케일 바 = 200μm)이다. B는 L15 추출물을 처리한 또는 처리하지 않은 hDPSC의 ARS 염색을 통한 칼슘 침착 여부를 보여준다. C는 실시간 PCR로 분석된 골 형성 분화 마커 유전자(RUNX2, ALP 및 COL1A1)의 상대적 발현 수준을 나타낸다. GAPDH는 정규화에 사용되었다. D는 골 형성 분화 마커 단백질(BMP4, RUNX2 및 ALP)의 상대적 발현 수준을 나타낸다. E는 D에서 나타난 GAPDH 대비 각 단백질의 발현 강도를 정량적으로 분석한 결과이다. 오차 막대는 평균의 표준 편차를 나타낸다(*p < 0.05. N = 3). EPS: 엔테로코커스 페시움 L15 유래 세포외다당체 처리군, Control: 아무것도 처리하지 않은 대조군.
도 6 및 7은 L15 EPS가 p38 MAPK 경로를 활성화함을 보여준다. 도 6의 A는 L15 EPS로 처리된 hDPSC에서 MAPK(ERK, JNK 및 p38) 및 Wnt 신호 경로의 웨스턴 블롯 분석결과이다. 도 6의 B는 A에서 인산화 수준, 세포질 및 핵 β-카테닌 발현 수준의 정량적 분석결과이다. 도 7의 C는 p38 MAPK 경로 억제 후 단백질 p38 및 p-p38 발현 수준에 대한 웨스턴 블롯 분석결과이다. 도 7의 D는 C의 각 단백질 발현 수준의 정량적 분석결과이다. 도 7의 E는 p38 MAPK 경로 억제 후 골 형성 분화 마커 단백질(BMP4, RUNX2 및 ALP) 발현 수준에 대한 웨스턴 블롯 분석결과이다. 도 7의 F는 E의 각 단백질 발현 수준의 정량적 분석결과이다(*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001. N = 3). EPS: 엔테로코커스 페시움 L15 유래 세포외다당체 처리군, SB: p38 억제제 SB203580(SB) 처리군, SB+EPS: SB 및 EPS 병용 처리군, Control: 아무것도 처리하지 않은 대조군.
도 8은 1차 조골세포 전구체 및 뼈 형성에 대한 L15 EPS의 효과를 보여준다. A는 7일 동안 L15 EPS를 처리한 또는 처리하지 않은 일차 조골세포 전구체(ICR 신생아의 calvaria에서 얻음)의 ALP 염색 현미경 사진이다(스케일 바 = 200 μm). B는 일차 조골세포 전구체에서 골 형성 분화 마커 유전자(RUNX2, COL1A1, ALP)의 발현을 실시간 PCR로 분석한 결과이다. C는 10μg/mL L15 EPS를 처리한 또는 처리하지 않은 hDPSC 배양 배지에서 배양된 calvaria의 두께를 나타낸다. H&E 염색에 의해 평가되었다(스케일 바 = 25 μm, *p < 0.05. N = 3).
도 9의 A는 여러 종류의 유산균 추출물의 hDPSC의 골 형성 분화를 촉진여부를 나타낸다. A는 L7.5, L15, L28, L30, L31 또는 M34 추출물 처리 후하고 ALP 염샘한 후의 디지털 이미지 및 L15 및 L28의 명시야 현미경 사진을 나타낸다(스케일 바 = 200μm).
도 9의 B는 Enterococcus lactis L28 균주 유래 세포외다당체(EPS)처리한 후 hDPSC 배양물의 칼슘 침착 여부를 나타낸다. ARS 염색후의 디지털 이미지이다.
본 발명은 엔테로코커스 속 균주 유래 다당체의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 엔테로코커스 속(Enterococcus genus) 균주 유래의 다당체를 포함하는 골 형성 촉진용 조성물을 제공한다.
다당체는 당이 여러 개 붙어 있는 화합 물질을 말하는 것으로, 탄수화물의 구성 성분으로, 유산균을 포함한 미생물이 생육 과정에서 생산 및 배출하는 고분자 다당체라면 그 종류에는 제한되지 않는 것으로, 구체적으로는 세포외다당체(exopolysaccharides, EPS)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다당체는 엔테로코커스 속(Enterococcus genus) 균주로부터 유래된 것이면 충분하며, 균주의 종류는 한정되지 않는다.
상기 엔테로코커스 속 균주는 예컨대 엔테로코커스 페시움(Enterococcus faecium) 또는 엔테로코커스 락티스(Enterococcus latics)일 수 있다.
일 실시예에 따르면, 엔테로코커스 속(Enterococcus genus) 균주 유래의 다당체는 엔테로코커스 페시움 L-15 유래 다당체이다. 엔테로코커스 페시움 L-15는 한국생명공학연구원 생물자원센터에 2018.3.15자로 기탁된 균주로, 기탁번호는 KCTC13498BP이다.
본 발명의 엔테로코커스 속 균주 유래의 다당체는 다음과 같이, 엔테로코커스 속 균주가 포함된 성장 배지를 원심분리하는 단계; 상기 성장 배지의 상층액을 분리하는 단계; 상기 분리된 상층액에 트리클로로 아세트산(trichloroaceticacid)을 첨가하여 배양하는 단계; 상기 배양된 상층액을 무수 에탄올과 혼합 배양하여 침전물을 얻는 단계; 및 상기 침전물을 투석하는 단계를 포함하는 엔테로코커스 속 균주 유래의 다당체의 제조방법으로 얻어진 것일 수 있다.
상기 엔테로코커스 속 균주가 포함된 성장 배지의 원심분리는 8,000 내지 12,000 xg에서 15 내지 25분 동안 수행되는 것일 수 있다.
상기 분리된 상층액에 트리클로로 아세트산(trichloroaceticacid)을 첨가하여 배양시 배양 조건은 34 내지 38℃에서 30분 내지 2시간 동안 배양하는 것일 수 있다.
상기 분리된 상층액에 트리클로로 아세트산을 첨가하여 배양함으로써 단백질과 핵산을 변성시킬 수 있다.
상기 배양된 상층액과 무수 에탄올의 혼합 부피 비율은 1: 1.5 내지 3일 수 있다. 혼합 배양 조건은 3 내지 5℃에서 1일 내지 2일 동안 배양하는 것일 수 있다. 상기 혼합 배양을 통해 침전물이 형성된다.
투석은 상기 혼합 배양 침전물을 ddH2O에 녹인 후 3 내지 5℃에서 18 내지 54 시간 동안 수행하는 것일 수 있다. 투석을 통해 침전물 내 미량의 단백질을 제거할 수 있다.
투석 후 침전물을 동결 건조하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 엔테로코커스 속 균주 유래의 다당체는 줄기세포의 골 분화를 유도하여 골 형성을 촉진할 수 있다.
본 발명의 엔테로코커스 속 균주 유래의 다당체가 골 형성 분화를 유도할 수 있는 줄기세포는, 중간엽 줄기세포(MSC)일 수 있다.
본 발명의 중간엽 줄기세포는 신경능선, 골수, 지방조직, 말초혈액 유래일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 줄기세포는 치수줄기세포(dental pulp stem cell, DPSC)일 수 있고, 예컨대 신경능선 유래의 치수줄기세포일 수 있다.
치수 줄기세포는 치수 조직에 존재하는 줄기세포를 의미하고, 치수 및 상아질 재생에 필요한 다분화성 줄기세포로서, 골, 지방 조직, 뉴런, 상아질 등 다양한 조직으로 분화할 수 있다. 구체적으로, 상기 치수 줄기세포는 인간의 치아로부터 분리된 인간 치수 줄기세포(hDPSC)일 수 있고, 자가 (autologous), 동종 (allogenic), 이종(xenogenic) 세포일 수 있다.
일 실시예에 따르면, 엔테로코커스 속 균주 유래의 다당체는 줄기세포의 골 형성 관련 유전자의 발현 수준을 증가시킬 수 있다. 예를 들어, RUNX2, ALP, 및 COL1A1 유전자 발현 수준을 증가시킬 수 있다.
일 실시예에 따르면, 엔테로코커스 속 균주 유래의 다당체는 줄기세포의 골 형성 관련 단백질의 발현 수준을 증가시킬 수 있다. 예를 들어, BMP4, RUNX2, 및 ALP 단백질의 발현 수준을 증가시킬 수 있다.
일 실시예에 따르면, 엔테로코커스 속 균주 유래의 다당체는 줄기세포의 p38 MAPK(mitogen-activated protein kinases) 경로를 활성화시킬 수 있다.
구체적으로, 엔테로코커스 속 균주 유래의 다당체는 줄기세포의 p38의 인산화를 증가시킬 수 있다.
골 형성 촉진용 조성물 내 다당체의 농도는 0.5 내지 25 μg/ml, 0.5 내지 20 μg/ml, 0.5 내지 15 μg/ml, 0.5 내지 10 μg/ml, 0.5 내지 5 μg/ml, 0.5 내지 2 μg/ml, 0.5 내지 1 μg/ml, 1 내지 10 μg/ml, 1 내지 5 μg/ml, 1 내지 3 μg/ml, 1 내지 2 μg/ml 또는 1 내지 1.5 μg/ml일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 골 형성 촉진용 조성물은 예를 들면 인공골, 인공관절, 골 고정재, 골 대체제, 골 수복재, 골 충진재 또는 골 이식재 중 하나 이상의 에 사용될 수 있다.
예컨대, 골 이식재나 골 대체체는 협의로는 골 조직 내의 공간을 충진하기 위하여 사용될 수도 있고, 광의로는 뼈나 치아의 일부를 대체하는데 사용될 수 있으므로, 상기 골 형성 촉진용 조성물은 압착, 압축, 가압접촉, 패킹, 압박, 굳힘 등의 방법을 사용하여 퍼티, 페이스트, 주형 가능한 스트립, 블록, 칩 등의 형태로 사용될 수 있고, 화학적 첨가물을 이용하여, 겔, 과립, 페이스트, 정제, 펠렛 등의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 분말 형태로도 사용될 수 있다.
본 발명은 엔테로코커스 속(Enterococcus genus) 균주 유래의 다당체를 포함하고 골 형성 또는 골 재생에 의해 치료 가능한 골 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
엔테로코커스 속(Enterococcus genus) 균주 유래의 다당체에 대해서는 앞서 설명한 골 형성 촉진물에서 설명한 것과 동일하다.
엔테로코커스 속 균주 유래의 다당체는 앞서 설명한 방법으로 제조된 것일 수 있다.
일 실시예에 따르면, 엔테로코커스 속(Enterococcus genus) 균주 유래의 다당체는 엔테로코커스 페시움 L-15(기탁번호 KCTC13498BP) 유래 다당체이다.
본 발명의 약학 조성물은 골 소실로 인해 골밀도의 증가가 필요한 골 질환, 골 형성 또는 골 재생에 의해 치료 가능한 골 질환 예방 또는 치료에 사용될 수 있다.
예컨대 상기 질환은 치주질환(periodontal disease), 치주염(periodontitis), 치조골 질환(alveolar bone disease), 골다공증(osteoporosis), 골연화증(osteomalacia), 골감소증(osteopenia), 골위축(bone atrophy), 골관절염(osteoarthritis), 류마티스 관절염(rhermatoid arthritis), 골용해(osteolysis), 섬유이형성증(fibrous dysplasia), 파제트병(Paget's disease), 골 형성부전증(osteogenesis imperfect) 및 고칼슘혈증(hypercalcemia)으로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 실시예에 따르면, 상기 약학 조성물은 골 형성 촉진이 필요한 대상체에 투여됨으로써, 골 재생 또는 골 형성을 유도하여 뼈의 두께를 증가시키거나 치조골 재생(alveolar bone regeneration)을 촉진시킬 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 따른 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있다.
본 발명에 있어서, "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜 또는 위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
구체적으로, 본 발명에 따른 조성물의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1 kg 당 0.1 mg 내지 100 mg, 바람직하게는 0.2 mg 내지 17 mg을 매일 또는 격일로 투여하거나 1일 1회 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
상기 조성물을 제제화할 경우, 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조된다.
경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환자, 산제, 과립제, 캡슐제, 트로키제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 유산균 사균체 프로피오니바크테리움 후레우덴레이키 MJ2 (Propionibacterium freudenreichii KCCM12272P)에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose) 또는 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 또는 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁용제, 유제, 동결 건조 제제, 좌제 등이 포함된다.
비수성용제, 현탁 용제로는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸 렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween)61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
이하, 실시예를 통해 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
방법
1. Enterococcus faecium L15(E. faecium L15) 추출물의 준비
E. faecium L15 균주(KCTC13498BP, "L15")는 NeoRegen Biotech(경기도 수원)에서 입수했다. L15 추출물 준비 과정은 "Kim H, Park S, Kim K, Ku S, Seo J, Roh S. Enterococcus faecium L-15 cell-free extract improves the chondrogenic differentiation of human dental pulp stem cells. Int J Mol Sci. 2019;20(3):624.”을 참조하였다. 이 균주는 원래 가자미를 함유한 한국의 전통 쌀 발효 식품에서 분리되었다. L15를 TSB(tryptic soy broth) 배지(Hardy Diagnostics, Santa Maria, CA, USA)에서 18시간 동안 35℃로 배양했다. 배양된 L15를 수확하고 PBS(phosphate-buffered saline)로 3회 세척하고 이중 탈이온수(ddH2O)에 재현탁시켰다. 세척된 L15를 얼음 위에서 30분 동안 초음파 처리(Sonics, Strat-ford, CT, USA)했다. 세포 파편을 제거하기 위해 12,000xg에서 10분 동안 원심분리했다. 상층액을 0.45μm 필터에 통과시키고 밤새 -80℃에서 동결건조 시켰으며, 이후 실험에 사용하기 위해 PBS로 재구성(reconstitution)했다.
2. E. faecium 및 E. lactis 유래 EPS 정제
E. faecium 및 E. lactis 유래 세포외다당체(exopolysaccharide, EPS)는 에탄올 침전법을 사용하여 정제되었다.
E. faecium L15 및 E. lactis L28을 각각 TSB(tryptic soy broth) 배지(Hardy Diagnostics, Santa Maria, CA, USA)에서 18시간 동안 35℃로 배양했다. 배양된 L15 및 L28dmf 20분 동안 10,000xg에서 원심분리하여 성장 배지로부터 분리하였다. 원심분리 후 상층액을 채취하여 최종 농도 14% trichloroacetic acid를 첨가하여 단백질과 핵산을 변성시킨 후 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 2:1의 비율로 용액을 4℃에서 1일 동안 인큐베이션하여 응집시켰다. 침전물을 ddH2O에 용해하고 4℃에서 24-48시간 동안 투석하여 미량의 단백질을 제거했다. 침전물을 -80℃에서 동결건조 시켰으며, 이후 실험에 사용하기 위해 PBS로 재구성(reconstitution)했다.
3. EPS 분획
위에서 정제하여 얻은 crude EPS를 대상으로 크기 배제 크로마토그래피를 수행하였다. 정제된 crude EPS를 PBS로 평형화된 HiLoad™ 16/600 Superdex 200(GE Healthcare, Chicago, IL, USA) 컬럼에 적용했다. 용출은 1 ml min-1의 유속으로 수행하였고, 프랙션 컬렉터(fraction collector)를 사용하여 2 ml의 분획(fraction)을 얻었다.
4. 인간 치수 줄기 세포(hDPSC)의 분리 및 배양
인간 상악 중심 과잉치(Human maxillary central supernumerary teeth, n = 3)는 IRB가 승인한 지침에 따라 서울대학교 치과병원에서 발치하였다. 발치된 치아는 절단 디스크를 사용하여 CEJ(cemento-enamel junction) 주변을 짧게 절단했다. 치수 조직이 노출되고 크라운에서 부드럽게 분리되었다. 펄프 조직을 메스 블레이드로 1mm2 조각으로 잘게 썰고 12웰 배양 접시에 옮겼다. 그런 다음 세포를 10% 소 태아 혈청(FBS; Hyclone Laboratories Inc.)이 보충된 Minimum essential medium eagle―alpha modification(α-MEM; Hyclone Laboratories Inc., Logan, UT, USA)에서 성장시키고 5% CO2 및 37℃ 조건의 인큐베이터에서 배양했다. 배양 배지는 3일마다 교체되었다.
5. 형광 활성화 세포 분류(FACS)를 이용한 hDPSC의 특성분석
FACS는 hDPSC를 식별하기 위해 수행되었다. 계대 3 및 8에서 hDPSC를 분리하고 5% FBS를 함유하는 차가운 PBS에 재현탁했다. 세포를 CD10-플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC), CD29-Alexa 488, CD44-FITC, CD73-FITC, CD90-FITC, D105-FITC, CD14-알로피코시아닌(allophycocyanin, APC), CD34-Alexa 647, CD45-APC 및 CD31-APC에 대한 단일 클론 항체와 함께 얼음 위에서 30분 동안 배양했다.
FACSVerse(Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA)를 사용하여 분석을 수행했다.
6. hDPSC의 골 형성 분화
hDPSC는 10% FBS(Hyclone Laboratories Inc.), 100nM 덱사메타손(Sigma-Aldrich), 10mM β-글리세로포스페이트(Sigma-Aldrich) 및 0.05mM 아스코르브산 2-포스페이트(Sigma-Aldrich)가 보충된 α-MEM(Hyclone Laboratories Inc.)으로 구성된 골 형성 분화 배지에서 12웰 배양 접시에 15,000 cells/cm2로 시딩되었다. 2~3일마다 배지를 교체하고 28일 동안 골 형성 분화를 진행하였다.
7. 세포 생존율 분석
세포 생존율은 수용성 tetrazolium salt(WST) 방법을 기반으로 하는 EZ-Cytox kit(Daeil Lab Service, Seoul, Korea)를 사용하여 측정하였다. hDPSC를 96웰 플레이트에 웰당 1 x 104 세포의 밀도로 시딩했다. 세포는 3일 동안 다양한 농도의 L15 추출물과 배양되었고, 3일 및 7일 동안 L15 EPS가 포함된 골 형성 분화 배지에서 배양되었다. WST 용액을 각 웰에 첨가했다. 혼합물을 37℃에서 30분 동안 배양하였다. 각 웰의 흡광도는 Emax Plus Microplate 판독기(Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 사용하여 450nm에서 측정되었다.
8. 역전사 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR) 및 실시간 PCR
RT-PCR과 real-time PCR은 유전자 발현을 정량화하는 데 사용되었다. PureLink™ RNA Mini 키트(Life Technologies, Camarillo, CA, USA)를 사용하여 펠렛에서 총 RNA를 추출했다. cDNA 합성은 제조사의 지침에 따라 M-MLV 역전사효소(Promega Corporation, Fitchburg, WI, USA)를 사용하여 수행되었다. Real-time PCR은 SYBR Pre-mix Ex Taq™ II(Takara, Tokyo, Japan)와 7500 Real-Time PCR System(Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 수행되었다. 사용된 프라이머는 표 1에 나열되어 있다. PCR 반응은 95℃에서 30초 동안 수행한 다음 95℃에서 5초 및 60℃에서 34초의 증폭 주기를 40회 수행했다. 발현 정도를 측정하기 위해 비교 CT법을 사용하였다. Glyceralde-hyde 3-phosphate dehydrogenase(GAPDH)는 정상화를 위한 하우스키핑 유전자로 사용되었다.
표 1은 실시간(real timer) PCR에 사용한 프라이머 서열에 관한 것이다
구별 유전자 정방향 프라이머 역방향 프라이머
인간 유전자 Runx2 CAGACCAGCAGCACTCCATA(서열번호 1) TTCAATATGGTCGCCAAACA(서열번호 7)
COL1A1 GCGAGAGCATGACCGATGGA(서열번호 2) GCGGATCTCGATCTCGTTGGA(서열번호 8)
ALP GGGATAAAGCAGGTCTTGGGGTGC(서열번호 3) CGCTTGGTCTCGCCAGTACTTGG(서열번호 9)
GAPDH ACATGTTCCAATATGATTCC(서열번호 4) TGGACTCCACGACGTACTCA(서열번호 10)
마우스 유전자 Runx2 인간 프라이머와 동일(서열번호 1) 인간 프라이머와 동일(서열번호 7)
COL1A1 인간 프라이머와 동일(서열번호 2) 인간 프라이머와 동일(서열번호 8)
ALP CCAACTCTTTTGTGCCAGAGA(서열번호 5) GGCTACATTGGTGTTGAGCTTTT(서열번호 11)
GAPDH AGGTCGGTGTGAACGGATTTG(서열번호 6) TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA(서열번호 12)
9. 알리자린 레드 S(ARS) 염색
골 형성 분화 평가는 칼슘 침착물을 가시화하기 위해 ARS 염색을 이용하였다. 분화된 세포를 4% 파라포름알데히드(PFA)로 고정하고 알리자린 레드 용액(Sigma-Aldrich)으로 염색한 후 디지털 카메라(Canon, Tokyo, Japan)로 촬영하여 도립현미경(EVOS™ XL Core Imaging system, Thermo Scientific™, Waltham, MA, USA)으로 관찰하였다.
10. 알칼리성 인산분해효소(ALP) 염색
ALP 염색은 제조사의 지침에 따라 StemAb Alkaline Phosphatase Staining Kit II(Reprocell, Beltsville, MD, USA)를 사용하여 수행되었다. L15 추출물 또는 세포외다당체(EPS)의 유무에 관계없이 hDPSC 및 마우스 calvaria 유래 조골세포를 7일 동안 처리하였다. 세포를 고정 용액을 사용하여 2분 동안 고정하고, PBS로 2회 세척하고, ALP 염색 용액으로 30분 동안 배양하였다. ALP 염색 용액을 제거하고 도립 현미경(EVOS™ XL Core Imaging System; Thermo Scientific™, Waltham, MA, USA)으로 염색을 관찰했다.
11. 웨스턴 블롯 분석
세포질 및 핵 단백질은 proteinase inhibitor(MedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USA) 및 phosphatase inhibitor(MedChemExpress)가 포함된 NE-PER™ Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents(Thermo Scientific™)로 추출되었다. 세포 용해물을 소듐 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 분리하고 다음의 표시된 항체로 면역블롯팅했다. bone morphogenetic protein-4 (BMP4; Cusabio Life Science, Wuhan, China), runx family transcription factor 2 (Runx2; Novus Biologicals, Centennial, Colorado, USA), ALP (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA), 세포외 신호조절 인산화효소(ERK; Cell Signaling Technology), phospho-ERK (p-ERK; Cell Signaling Technology), c-Jun N-terminal kinase (JNK; Cell Signaling Technology), p-JNK (Cell Signaling Technology), p38 (Cell Signaling Technology), p-p38 (Cell Signaling Technology), β-catenin (Cell Sign- aling Technology), Lamin B1 (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA), and GAPDH (BioLegend, SanDiego, CA, USA). GAPDH는 정상화를 위한 하우스키핑 유전자로 사용되었다. 라민 B1은 핵 β-카테닌의 정상화에 사용되었다.
12. Calvaria 유래 조골 세포 전구체 분리
마우스 calvaria에서 일차 조골 세포 전구체를 분리하였다. calvaria는 4일 된 마우스에서 분리되었고 30분 동안 37℃에서 0.25% 트립신 및 0.2% 콜라게나아제로 소화되었다. 방출된 세포를 100mm 접시에 플레이팅하고, 10% FBS(Hyclone Laboratories Inc.)가 보충된 α-MEM(Hyclone Laboratories Inc.)에서 성장시키고, 5% CO2 및 37℃ 조건의 인큐베이터에서 배양했다. 3일 후, 부착 세포를 조골세포 전구체로 사용하였다. 조골세포 전구체는 L15 세포외다당체(EPS)를 사용한 골 형성 분화에 사용되었다.
13. 마우스 calvarial 기관 배양 및 hematoxylin 및 eosin 염색
출생 후 4일째에 ICR 마우스의 calvaria를 12웰 배양 플레이트의 그리드에서 배양했다. Calvaria는 10μg/mL L15 EPS가 있거나 없는 hDPSC 배양 배지에서 배양되었다. 배지는 2일마다 교체하고 7일째에 칼바리아를 수확하였다. 칼바리아는 4% PFA에서 24시간 동안 고정하고 14% EDTA에서 2일 동안 탈회하였다. 석회화 제거 후, calvaria는 파라핀 왁스에 매립되었다. 블록을 800μm 깊이로 트리밍하고 정중선에서 10μm(Leica Microsystems, Wetzlar, Germany) 두께로 시상 절단했다. 절단된 조직을 헤마톡실린과 에오신(H&E)으로 염색하고 Olympus BX50 현미경(Olympus, Tokyo, Japan)으로 명시야 현미경 사진을 캡처했다. 골두께는 Image Pro 소프트웨어(Media Cybernetics Inc., Silver Spring, MD, USA)를 사용하여 특정 위치[calvaria의 정중선 봉합사에서 1mm 떨어진]에서 얻은 시상 절편에서 측정되었다.
14. 통계 분석
결과는 평균 ± SD로 표시되었다. 데이터는 Tukey post hoc 테스트 및 GraphPad Prism V5.0 소프트웨어(GraphPad Software, La Jolla, CA, USA)를 사용한 Student's t-test에 이어 일원 분산 분석(ANOVA)을 사용하여 분석되었다. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001을 통계적 유의성으로 정의하였다.
결과
1. 인간 치수 줄기 세포(hDPSC)의 특성
hDPSC의 특성을 조사하기 위해 형광 활성화 세포 분류(FACS)에 의해 중간엽, 조혈 및 내피 줄기 세포의 세포표면항원무리(cluster of differentiation, CD) 마커를 각각 분석하였다(도 1 및 2, 표 2 및 3). hDPSC의 계대 3에서 세포는 높은 수준의 중간엽 줄기세포 마커를 발현했지만 조혈 및 내피 줄기 세포 마커의 낮은 수준을 발현했다 (표 2 및 3). hDPSC의 계대 8에서 표면 마커 발현 비율은 계대 3의 비율과 유사했다. 따라서 3-8 계대 세포가 골 형성 분화에 사용되었다.
표 2 및 3은 도 1 및 2에서 측정한 각각의 줄기세포 CD 마커들이 발현하는 세포의 비율을 백분율로 정량 표기한 것이다. (n=3).
구분 CD10 CD29 CD44 CD73 CD90 CD105
계대수 3 68.67±7.56 99.02
±0.55		 99.15
±0.59		 99.10
±0.55		 99.07
±0.48		 80.45
±17.99
계대수 8 76.66±8.76 99.08
±0.90		 99.21
±0.78		 99.16
±0.82		 95.18
±5.14		 74.29
±33.73
구분 CD14 CD31 CD34 CD45
계대수 3 31.16±14.55 1.24±0.17 4.5±2.7 1.24±0.32
계대수 8 33.10±9.91 1.89±0.61 5.75±2.29 1.84±0.65
2. hDPSC 생존에 대한 L15 추출물의 효과
도 3A에 나타낸 바와 같이, hDPSC 생존율은 L15 추출물 5㎍/mL 이상 처리시 유의하게 감소하였다(p < 0.001). 이는 1㎍/mL의 L15 추출물 농도가 세포에 무독성임을 시사했으며, 이 농도는 후속 골 형성 분화에 사용되었다.
3. L15 추출물의 hDPSC의 골 형성 분화 촉진 효과
hDPSC를 L15 추출물과 함께 7일 동안 배양한 후 ALP 염색을 수행하였다. 대조군에 비해 L15 추출물 처리군에서 더 강렬한 ALP 염색이 관찰되었다(도 3B). 28일 동안 골 형성 분화 후 ARS 염색으로 칼슘 침착을 조사하였다. 대조군에 비해 L15 추출물 처리군에서 강화된 칼슘 침착이 관찰되었다(도 3C). 골 형성 관련 유전자인 RUNX2, ALP(alkaline phosphatase), I형 콜라겐(COL1A1)의 발현 정도를 Real-Time PCR로 조사하였다. RUNX2, ALP 및 COL1A1의 발현 수준은 L15 추출물 처리 후 유의하게 증가하였다(도 3D; p < 0.05, p < 0.01). 골 형성 관련 단백질(BMP4(Bone morphogenetic protein 4), RUNX2, ALP)의 수준에 대한 L15 추출물의 효과는 웨스턴 블롯으로 확인되었다(도 3E). BMP4, RUNX2 및 ALP 발현은 대조군에 비해 L15 추출물 처리군에서 유의하게 증가하였다(도 3F).
4. 세포독성을 나타내지 않는 최적의 EPS 농도 선별
E. faecium L15의 정제된 세포외다당체(EPS)를 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 분획화하였다. 도 4A에 도시된 바와 같이, L15 EPS는 저분자량 분획에 해당하는 단일 피크로 나타났다. L15 EPS가 hDPSC의 생존력에 미치는 영향을 확인하기 위해 수용성 테트라졸륨염(WST) 분석을 수행했다. 6가지 농도의 L15 EPS(0, 1, 2.5, 5, 10 및 25㎍/ml)를 3일 동안 처리했다. 그룹 간에는 유의한 차이가 없었다(도 4B). 동일한 농도의 L15 EPS를 7일 동안 골 형성 분화 배지로 처리했다. hDPSC의 생존력은 2.5㎍/mL 이상의 L15 EPS 처리에 의해 유의하게 감소하였다(도 4C). 이 결과는 2.5μg/ml L15 EPS의 연속 처리가 hDPSC의 골 형성 분화에 독성이 있음을 시사했으며, 1μg/ml L15 EPS가 후속 실험에 사용되었다.
5. E. faecium L15 유래 EPS(L15 EPS)의 hDPSC의 골 형성 분화 촉진 효과
7일 동안 L15 EPS를 처리한 후 ALP 염색을 수행하였다. ALP 염색은 대조군보다 L15 EPS 처리군에서 더 강렬한 것으로 관찰되었다(도 5A). 골 형성 분화 28일 후 ARS 염색을 이용해 칼슘 축적을 조사하였다. 칼슘 침착은 대조군에 비해 L15 EPS 처리군에서 유의하게 증가하였다(도 5B). 골 형성 관련 유전자인 RUNX2, ALP, COL1A1의 발현 수준은 대조군에 비해 L15 EPS 처리군에서 유의하게 상향 조절되었다(도 5C). BMP4, RUNX2 및 ALP의 단백질 발현 수준은 L15 EPS 처리군에서 현저하게 증가하였다(도 5D, E; p < 0.05).
6. L15 EPS의 hDPSC 골 형성 분화 촉진 경로(p38 MAPK 경로)
경로 단백질(즉, ERK, p-ERK, JNK, p-JNK, p38, p-p38, 세포질 β-카테닌 및 핵 β-카테닌) 수준에 대한 L15 EPS의 효과는 웨스턴 블롯 분석에 의해 확인되었다. (도 6A). β-카테닌의 핵 전위는 Wnt 경로 활성화의 주요 특징이기 때문에, β-카테닌의 핵 및 세포질 분획을 수행하였다. ERK, p-ERK, JNK, p-JNK, 세포질 β-카테닌 및 핵 β-카테닌의 발현 수준은 변하지 않았다(도 6B). p-p38의 발현은 L15 EPS 처리군에서 상향 조절되었다(도 6B). p-p38/p38의 비율은 대조군에 비해 L15 EPS 처리군에서 크게 증가하였다(도 6B). 이러한 결과는 L15 EPS 처리 후에 p38 MAPK 경로가 활성화되었음을 보여주었다.
7. p38 MAPK 경로의 억제를 통한 hDPSC의 L15 EPS 유발 골 형성 분화 억제
L15 EPS로 유도된 hDPSC의 골 형성 분화에서 p38의 역할은 p38 억제제 SB203580(SB)을 사용하여 추가로 분석되었다. SB의 효율은 웨스턴 블롯에 의해 확인되었다(도 7C). SB는 p-p38/p38의 비율을 현저하게 감소시켰다(도 7D). p-p38/p38의 비율은 대조군에 비해 EPS 처리군에서 현저하게 상향 조절되었다(도 7D). 정량적 분석은 SB + EPS 처리군에서 p-p38/p38의 비율이 억제되었음을 보여주었다(도 7D). 14일 동안 골 형성 분화 후, RUNX2 및 ALP 단백질 발현 수준은 EPS 처리군에 비해 SB + EPS 처리군에서 유의하게 하향 조절되었다(도 7E, F).
8. calvaria의 조골 세포 전구체에 대한 L15 EPS의 효과
L15 EPS가 조골세포 전구체의 골 형성 분화를 개선하는지 여부를 확인하기 위해 분리된 조골세포 전구체를 L15 EPS를 처리한 또는 처리하지 않은 골 형성 배지에서 7일 동안 배양했다. ALP 강도는 대조군에 비해 L15 EPS 처리군에서 더 강하였다(도 8A). L15 EPS로 골 형성 분화 14일 후, mRNA 수준을 qPCR로 분석했다. RUNX2, COL1A1 및 ALP의 mRNA 수준은 L15 EPS로 유의하게 상향 조절되었다(도 8B).
9. calvarial 기관 배양 모델에서 L15 EPS의 골 형성 촉진 확인
골 형성에 대한 L15 EPS의 효과는 calvarial ex vivo 기관 배양을 이용하여 확인되었다. H&E 염색을통해 L15 EPS가 골의 두께를 증가시키는 것을 확인했다(도 8C). 이러한 결과는 L15 EPS가 골 형성을 유도할 수 있음을 나타낸다.
10. 다양한 균주 유래 EPS의 골 형성 분화 촉진 여부
(1) 여러 균주 유래 추출물의 골 형성 분화 촉진 여부
엔테로코커스 속 균주인 Enterococcus faecium L15(L15) 및 Enterococcus lactis L28(L28) 추출물뿐만 아니라, 다른 속에 속하는 Lactococcus lactis L7.5(L7.5), Lactobacillus plantarum L30(L30, KCTC 3107), Bifidobacterium longum L31(L31) 및 Lactobacillus pentosus MS4(MS4) 균주 추출물의 골 형성 촉진 효과를 확인하기 위해 실험을 진행하였다.
위의 L15 및 L28 균주는 각각 TSB(tryptic soy broth) 배지에서, L7.5, L30, L31 및 MS4 균주들은 각각 MRS broth 배지에서 35℃ 조건으로 18시간 동안 배양했다. 배양된 균주들을 수확하고 PBS(phosphate-buffered saline)로 3회 세척하고 이중 탈이온수(ddH2O)에 재현탁시켰다. 세척된 균주들을 얼음 위에서 30분 동안 초음파 처리(Sonics, Strat-ford, CT, USA)했다. 세포 파편을 제거하기 위해 12,000xg에서 10분 동안 원심분리했다. 상층액을 0.45μm 필터에 통과시키고 밤새 -80℃에서 동결건조 시켜 각 균주 유래 추출물을 얻었다. 이후 실험에 사용하기 위해 PBS로 재구성(reconstitution)했다. 각 추출물을 전술한 것과 동일한 방법으로 hDPSC에 처리(각 추출물 7일 동안 처리, 추출물의 농도: 1ug/ml)하여 28일 동안 배양했으며, 이후 ALP 염색을 통해 골 형성 분화 여부를 관찰하였다.
그 결과, 도 9 A에 도시된 바와 같이 엔테로코커스 속 균주인 L15 및 L28의 추출물이 처리된 군에서만 골 형성 분화가 관찰되었다.
이를 통해 엔테로코커스 속 외에 다른 균주의 추출물(또는 이에 포함된 세포외다당체)은 골 형성 분화 촉진 효과가 없음을 확인하였다.
(2) 칼슘 침착 여부 관찰을 통한 L28 유래 세포외다당체의 골 형성 촉진 효과 확인
L28 유래 세포외다당체(L28 EPS)를 전술한 것과 동일한 방법(L28 EPS 7일 동안 처리, L28 EPS의 농도: 1ug/ml)으로 hDPSC에 처리하여 28일 동안 배양하였으며, 이후 ARS 염색을 통해 칼슘 침착 여부를 확인하였다.
그 결과, 도 9B에 도시된 바와 같이 아무것도 처리하지 않은 대조군(Control)과 달리, L28 EPS 처리군에서 칼슘침착이 확인되었다. 이를 통해, 엔테로코커스 페시움 뿐만 아니라 엔테로코코스 속에 해당하는 엔테로코커스 락티스 균주 유래 세포외다당체 또한 골 형성 분화 촉진 효과가 있음을 알 수 있었다.
한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC) KCTC13498BP 20180315

Claims (12)

  1. 엔테로코커스 속(Enterococcus genus) 균주 유래의 다당체를 포함하는 골 형성 촉진용 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 엔테로코커스 속 균주는 엔테로코커스 페시움(Enterococcus faecium) 또는 엔테로코커스 락티스(Enterococcus lactis)인, 골 형성 촉진용 조성물.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 다당체는 엔테로코커스 속 균주가 포함된 성장 배지를 원심분리하는 단계;
    상기 성장 배지의 상층액을 분리하고, 상기 분리된 상층액에 트리클로로 아세트산을 첨가하여 배양하는 단계;
    상기 배양된 상층액을 무수 에탄올과 혼합 배양하여 침전물을 얻는 단계 및
    상기 침전물을 투석하는 단계를 포함하는 다당체의 제조방법으로 얻어진 것인, 골 형성 촉진용 조성물.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 다당체의 농도는 0.5 내지 2 μg/ml인, 골 형성 촉진용 조성물.
  5. 청구항 1에 있어서, 줄기세포의 골 분화를 유도하는, 골 형성 촉진용 조성물.
  6. 청구항 5에 있어서, 상기 줄기세포는 치수 줄기세포인 골 형성 촉진용 조성물.
  7. 청구항 1에 있어서, 인공골, 인공관절, 골 고정재, 골 대체제, 골 수복재, 골 충진재 또는 골 이식재 중 하나 이상에 사용되는, 골 형성 촉진용 조성물.
  8. 엔테로코커스 속(Enterococcus genus) 균주 유래의 다당체를 포함하고 골 형성 또는 골 재생에 의해 치료 가능한 골 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  9. 청구항 8에 있어서, 상기 엔테로코커스 속 균주는 엔테로코커스 페시움(Enterococcus faecium) 또는 엔테로코커스 락티스(Enterococcus lactis)인, 골 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  10. 청구항 8에 있어서, 상기 다당체는 엔테로코커스 속 균주가 포함된 성장 배지를 원심분리하는 단계;
    상기 성장 배지의 상층액을 분리하고, 상기 분리된 상층액에 트리클로로 아세트산을 첨가하여 배양하는 단계;
    상기 배양된 상층액을 무수 에탄올과 혼합 배양하여 침전물을 얻는 단계 및
    상기 침전물을 투석하는 단계를 포함하는 다당체의 제조방법으로 얻어진 것인, 골 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  11. 청구항 8에 있어서, 상기 다당체의 농도는 0.5 내지 2 μg/ml인, 골 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  12. 청구항 8에 있어서, 상기 골 질환은 치주질환(periodontal disease), 치주염(periodontitis), 치조골 질환(alveolar bone disease), 골다공증(osteoporosis), 골연화증(osteomalacia), 골감소증(osteopenia), 골위축(bone atrophy), 골관절염(osteoarthritis), 류마티스 관절염(rhermatoid arthritis), 골용해(osteolysis), 섬유이형성증(fibrous dysplasia), 파제트병(Paget's disease), 골 형성부전증(osteogenesis imperfect) 및 고칼슘혈증(hypercalcemia)으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나인, 골 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
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