KR20190047222A

KR20190047222A - 벼 유래 OsAIR2 유전자를 이용한 중금속 스트레스 내성이 증가된 형질전환 식물체의 제조방법 및 그에 따른 식물체

Info

Publication number: KR20190047222A
Application number: KR1020170140819A
Authority: KR
Inventors: 장철성; 황선구; 박용찬; 한아름
Original assignee: 강원대학교산학협력단
Priority date: 2017-10-27
Filing date: 2017-10-27
Publication date: 2019-05-08
Also published as: KR101985321B1

Abstract

본 발명은 벼 유래 OsAIR2 유전자를 이용한 중금속 스트레스 내성이 증가된 형질전환 식물체의 제조방법 및 그에 따른 식물체에 관한 것으로, 보다 상세하게는 본 발명에 따른 벼 유래의 OsAIR2 유전자를 과발현시킨 형질전환 식물체는 비소 스트레스 내성을 나타내고, 동동한 조건에서 키운 대조구 식물에 비해 발아율 및 뿌리 생장이 우수하므로, 식물체에서 OsAIR2 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 조절을 통해, 중금속 내성 및 생산성이 증가된 안전한 작물을 개발하는데 기여할 수 있다.

Description

벼 유래 OsAIR2 유전자를 이용한 중금속 스트레스 내성이 증가된 형질전환 식물체의 제조방법 및 그에 따른 식물체{Method for producing transgenic plant with increased heavy metal stress tolerance using OsAIR2 gene from Oryza sativa and plant thereof}

본 발명은 벼 유래 OsAIR2 유전자를 이용한 중금속 스트레스 내성이 증가된 형질전환 식물체의 제조방법 및 그에 따른 식물체에 관한 것이다.

비소(As; Arsenic)는 자연적으로 토양에 소량 존재하지만, 높은 함량이 축적 될 경우 이로 오염된 작물로부터 유래된 식품의 섭취로 인하여 인간의 건강에 치명적인 위협이 된다. 특히, 세계적으로 가장 중요한 식품인 벼의 경우, 토양 및 방사능 물의 비소가 잘 축적되기 때문에 논이 쉽게 오염된다. 이러한 비소의 식물 내 축적은 광합성, 탄수화물 대사 등을 포함하는 식물 대사에 직간접적으로 영향을 주며, 뿌리는 비소 노출 후 그 화합물과 접하는 최초 조직으로서 뿌리 신장 및 증식은 비소 독성에 의하여 저해되고, 신초로 전달된 비소는 수율 감소를 야기할 수 있다.

RING(Really Interesting New Gene) E3 리가아제는 시스테인과 히스티딘 잔기로 이루어진 공통서열(Cys-x2-Cys-x9-Cys-x1-3-His-x2-3-Cys/His-x2-Cys-x4-48-Cys-x2-Cys, x는 모든 아미노산이 위치할 수 있음)을 가지고 있으며, 이들 구조는 2개의 아연 원자와 결합하고 있다. 이러한 구조는 일반적으로 RING-핑거 단백질들이 시스테인 또는 히스티딘 위치에 근거하여 RING-H2 및 RING-HC를 포함하는 2개의 기본 형태로 분류된다고 알려져있다. 또한, RING-D, RING-v, RING-S/T, RING-G 및 RING-C2와 같은 몇 가지 변형된 형태가 애기장대 또는 벼의 게놈을 포함하는 고등식물에서 발견되었다. 연구진들은 RING-도메인을 가진 E3 유비퀴틴 리가아제가 극심한 환경, 병원균에 대한 방어기작, 그리고 식물의 성장에 있어서 적응하는데 중요한 역할을 수행하는 것을 입증하였다. 예를 들면, 고추의 E3 유비퀴틴 리가아제 (즉, Rma1H1)의 기능은 세포막(plasma membrane)으로 아쿠아포린 수송 억제를 수반하며, 이후 프로테아좀에 의한 가수분해는 가뭄 스트레스에 대해 향상된 내성을 제공한다. 애기장대 SDIR1(salt- and drought-induced RING finger1) 유전자는 스트레스-반응 ABA 신호전달을 조절하는 것으로 여겨진다. 유사하게, OsSDIR1 유전자를 과발현시킨 형질전환체 벼가 가뭄에 대한 내성을 가지는 것이 확인되었다.

한편, 한국등록특허 제1740176호는 식물의 비소 내성 증가용 단백질, 유전자 및 그 용도를 개시하고 있으며, 한국등록특허 제1511190호는 식물의 중금속 스트레스 내성 증가 및 중금속 흡수를 감소시키는 OsHIR1 유전자 및 이의 용도를 개시하고 있다. 하지만, 본 발명의 벼 유래 OsAIR2 유전자를 이용한 중금속 스트레스 내성이 증가된 형질전환 식물체의 제조방법 및 그에 따른 식물체에 대해 아직까지 개시된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 벼에서 비소 처리에 의해 발현이 현저하게 증가하는 OsAIR2(Oryza sativa Arsenic-Induced RING E3 ligase 2) 유전자를 선발하였고, OsAIR2 유전자가 과발현된 애기장대 식물체가 비소 스트레스 내성이 증가하는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 벼 유래의 OsAIR2(Oryza sativa Arsenic-Induced RING E3 ligase 2) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜 OsAIR2 유전자의 발현을 조절하는 단계를 포함하는 식물체의 중금속 스트레스 내성을 조절하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진, 벼 유래의 OsAIR2(Oryza sativa Arsenic-Induced RING E3 ligase 2) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및 상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 중금속 스트레스 내성이 조절된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 중금속 스트레스 내성이 조절된 형질전환 식물체 및 이의 형질전환된 종자를 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진, 벼 유래의 OsAIR2(Oryza sativa Arsenic-Induced RING E3 ligase 2) 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 함유하는 식물체의 중금속 스트레스 내성 조절용 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 벼 유래의 OsAIR2 유전자를 과발현시킨 형질전환 식물체는 비소 스트레스 내성을 나타내고, 동등한 조건에서 키운 대조구 식물에 비해 발아율 및 뿌리 생장이 우수하므로, 식물체에서 OsAIR2 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 조절을 통해, 중금속 내성 및 생산성이 증가된 안전한 작물을 개발하는데 기여할 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 구현 예에 따른 2주 동안 다양한 농도(50, 100, 150, 200, 250 및 300μM)의 비소(AsV) 스트레스를 처리한 벼 뿌리에서 18개의 OsRFP(Oryza sativa RING finger protein) 유전자들의 발현 패턴을 확인한 결과이다. OsActinII 유전자는 내부 대조군(internal control)이며, 적색 및 녹색 화살표는 유전자의 업 및 다운 조절을 나타낸다.
도 2는 본 발명의 일 구현 예에 따른 비소(AsV, 1900μM) 스트레스를 처리한 벼 뿌리에서 시간대별로 OsAIR2 유전자 발현량을 나타낸 것이다. 별표는 대조군(0h)과 비교하여, two-tailed Student t-test를 사용한 통계적 유의성을 나타내며; *는 P value < 0.05, **는 P value < 0.01 및 ***는 P value < 0.001인 것을 의미한다.
도 3은 본 발명의 일 구현 예에 따른 벼 유래 OsAIR2 유전자의 번역된 아미노산 서열과 이의 상동 유전자들(밀 유래 GRMZM2G11930, 수수 유래 Sobic.005G160400, 큰개기장 유래 Pavir.Ha00474, Pavir.JI2507, 조 유래 Si026471m.g, 야생잔디 유래 Bradi4g16000 및 애기장대 유래 AT5G22000, 489047 단백질의)의 아미노산 서열의 다중 정렬 결과를 나타낸 것이다. 정렬은 ClustalW2 소프트웨어(http://www.ebi.ac.uk/clustalw/)를 사용하여 수행하였으며, 적색 박스 근처 별표는 RING-HC 도메인을 형성하는 시스테인(C) 또는 히스티딘(H)의 보존된 금속-리간드 위치의 Cys 및 His 잔기를 나타낸다.
도 4는 본 발명의 일 구현 예에 따른 MBP-OsAIR2, MBP-OsAIR2C33A 및 Empty-MBP를 인간 유래 E1(ubiquitin-activating enzyme) 및 애기장대 유래 E2(ubiquitin-conjugating enzyme UBC10) 효소가 포함된 유비퀴틴화 반응 버퍼에서 반응시킨 후, 유비퀴틴화된 밴드 유무를 확인하여 OsAIR2 유전자의 유비퀴틴화 활성을 확인한 결과(A)와 MBP-OsAIR2 단백질과 E1 및 E2 반응 시간별 유비퀴틴화 활성을 확인한 결과(B)이다. 유비퀴틴화된 밴드는 항-His 항체를 사용한 면역 블롯 분석으로 검출하였다.
도 5는 본 발명의 일 구현 예에 따른 RT-PCR 분석을 통해 OsAIR2 과발현 형질전환 식물체(35S:OsAIR2-EYEP) 및 대조구 식물체(35S:EYFP)에서 OsAIR2 유전자의 과발현 여부를 확인한 결과이다. AtUBC는 로딩 컨트롤이다.
도 6은 본 발명의 일 구현 예에 따른 2주간 100, 150 및 200μM의 비소를 각각 처리한 OsAIR2 과발현 형질전환 식물체(35S:OsAIR2-EYEP) 및 대조구 식물체(35S:EYFP)의 종자 발아 사진(A) 및 발아율을 측정한 그래프(B)이다. 별표는 two-tailed Student t-test를 사용한 통계적 유의성을 나타내며; *는 P value < 0.05, **는 P value < 0.01 및 ***는 P value < 0.001인 것을 의미한다.
도 7은 본 발명의 일 구현 예에 따른 2주간 100, 150 및 200μM의 비소를 각각 처리한 OsAIR2 과발현 형질전환 식물체(35S:OsAIR2-EYEP) 및 대조구 식물체(35S:EYFP)의 뿌리 생장 사진(A) 및 뿌리 길이를 측정한 결과(B)이다. 별표는 two-tailed Student t-test를 사용한 통계적 유의성을 나타내며; *는 P value < 0.05, **는 P value < 0.01 및 ***는 P value < 0.001인 것을 의미한다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 벼 유래의 OsAIR2(Oryza sativa Arsenic-Induced RING E3 ligase 2) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜 OsAIR2 유전자의 발현을 조절하는 단계를 포함하는 식물체의 중금속 스트레스 내성을 조절하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 OsAIR2 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어질 수 있으며, OsAIR2 유전자는 서열번호 1의 염기 서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 OsAIR2 단백질은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 2로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. "실질적으로 동질의 생리활성"이란 식물체의 중금속 스트레스 내성을 조절하는 활성을 의미하며, 바람직하게는 식물체의 비소 스트레스 내성을 조절하는 활성을 의미한다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 식물체의 중금속 스트레스 내성을 조절할 수 있는 방법으로, 서열번호 1의 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜 OsAIR2 유전자를 과발현시켜 식물체의 중금속 스트레스 내성을 증가시킬 수 있으며, 바람직하게는 식물체의 비소 스트레스 내성을 증가시킬 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 "유전자 과발현"이란 야생형 식물에서 발현되는 수준 이상으로 상기 유전자가 발현되도록 하는 것을 의미한다. 식물체 내로 상기 유전자를 도입하는 방법으로는 프로모터의 조절을 받는 상기 유전자가 포함된 발현 벡터를 이용하여 식물체를 형질전환하는 방법이 있다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 중금속은 아연, 납, 카드뮴, 구리, 마그네슘, 망간, 니켈, 코발트, 철, 안티몬 또는 비소일 수 있으며, 바람직하게는 비소일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한, 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

본 발명에서, 상기 OsAIR2 유전자 서열은 재조합 발현 벡터 내로 삽입될 수 있다. 용어 "재조합 발현 벡터"는 세균 플라스미드, 파아지, 효모 플라스미드, 식물 세포 바이러스, 포유동물 세포 바이러스, 또는 다른 벡터를 의미한다. 대체로, 임의의 플라스미드 및 벡터는 숙주 내에서 복제 및 안정화할 수 있다면 사용될 수 있다.

본 발명의 OsAIR2 유전자 서열 및 적당한 전사/번역 조절 신호를 포함하는 발현 벡터는 당업자에 주지된 방법에 의해 구축될 수 있다. 상기 방법은 시험관 내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술 및 생체 내 재조합 기술 등을 포함한다. 상기 DNA 서열은 mRNA 합성을 이끌기 위해 발현 벡터 내의 적당한 프로모터에 효과적으로 연결될 수 있다. 또한 발현 벡터는 번역 개시 부위로서 리보좀 결합 부위 및 전사 터미네이터를 포함할 수 있다.

본 발명의 재조합 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터(EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.

발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 것이다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자, aadA 유전자 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 재조합 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS, 히스톤 프로모터, Clp 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "구성적(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 구성적 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 구성적 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.

본 발명의 재조합 벡터에서, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터, 대장균의 rrnB1/B2 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알려져 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.

식물의 형질전환에 이용되는 "식물 세포"는 어떤 식물 세포도 된다. 식물 세포는 배양 세포, 배양 조직, 배양 기관 또는 전체 식물, 바람직하게는 배양세포, 배양 조직 또는 배양 기관 및 더욱 바람직하게는 배양 세포의 어떤 형태도 된다.

용어 "식물 조직"은 분화된 또는 미분화된 식물의 조직, 예를 들면 이에 한정되진 않으나, 뿌리, 줄기, 잎, 꽃가루, 종자, 암 조직 및 배양에 이용되는 다양한 형태의 세포들, 즉 단일 세포, 원형질체(protoplast), 싹 및 캘러스 조직을 포함한다. 식물 조직은 인 플란타(in planta)이거나 기관 배양, 조직 배양 또는 세포 배양 상태일 수 있다.

본 발명의 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은 미세주입법, 칼슘포스페이트 침전법, 전기천공법, 리포좀-매개 형질감염법, DEAE-덱스트란 처리법, 및 유전자 밤바드먼트 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있다.

또한, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진, 벼 유래의 OsAIR2(Oryza sativa Arsenic-Induced RING E3 ligase 2) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및

상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 중금속 스트레스 내성이 조절된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법은 벼 유래의 OsAIR2 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 과발현시켜 식물의 중금속 스트레스에 대한 내성을 증가시키는 것을 특징으로 하나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 방법은 본 발명에 따른 재조합 벡터로 식물 세포를 형질전환하는 단계를 포함하는데, 상기 형질전환은 예를 들면, 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefiaciens)에 의해 매개될 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 상기 형질전환된 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함한다. 형질전환 식물세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다. 상기 형질전환된 식물세포는 전식물로 재분화되어야 한다. 캘러스 또는 원형질체 배양으로부터 성숙한 식물의 재분화를 위한 기술은 수많은 여러 가지 종에 대해서 당업계에 주지되어 있다.

상기 식물체는 벼, 밀, 보리, 옥수수, 대두, 감자, 밀, 팥, 귀리 및 수수로 이루어진 군에서 선택된 식량 작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파 및 당근으로 이루어진 군에서 선택된 채소작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩 및 유채로 이루어진 군에서 선택된 특용 작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구 및 바나나로 이루어진 군에서 선택된 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합 및 튤립으로 이루어진 군에서 선택된 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐 및 페레니얼라이그라스로 이루어진 군에서 선택된 사료작물류일 수 있다. 바람직하게는, 상기 식물체는 애기장대, 감자, 가지, 담배, 고추, 토마토, 우엉, 쑥갓, 상추, 도라지, 시금치, 근대, 고구마, 샐러리, 당근, 미나리, 파슬리, 배추, 양배추, 갓무, 수박, 참외, 오이, 호박, 박, 딸기, 대두, 녹두, 강낭콩, 또는 완두 등의 쌍자엽 식물 또는 벼, 보리, 밀, 호밀, 옥수수, 사탕수 수, 귀리, 양파 등의 단자엽 식물일 수 있다.

상기 조성물은 유효성분으로 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 OsAIR2 단백질을 코딩하는 유전자를 함유하며, 상기 유전자 또는 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물체를 형질전환시킴으로써 식물체의 중금속 스트레스 내성, 바람직하게는 비소 스트레스 내성을 증가시킬 수 있는 것이다.

이하, 실시예를 이용하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명한 것이다.

실시예 1. 비소에 특이적으로 반응하는 OsRFP ( Oryza sativa RING finger protein) 유전자의 선발

비소 스트레스에 반응하는 RING 핑거 단백질 코딩 유전자의 발현 양상을 확인하기 위해, 다양한 농도(50, 100, 150, 200 및 300μM)의 비소(AsV; Arsenate)가 처리된 벼(품종 'Donganbyeo') 식물체의 뿌리 샘플을 확보하였으며, 확보된 뿌리 샘플로부터 RNA를 추출하여 반정량적 RT-PCR(semi-quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction) 분석을 통해 18개의 OsRFP 유전자의 발현 양상을 확인하였다. 그 결과, 18개의 OsRFP 유전자 중에 Os05g32350 및 Os11g36430 유전자가 AsV의 처리 농도가 증가함에 따라 발현량도 증가하였으며, 특히, 발현량이 가장 증가된 Os11g36430 유전자를 선발하여 OsAIR2(Oryza sativa Arsenic-Induced RING E3 ligase 2)로 명명하였다(도 1).

또한, 고농도(1900μM)의 AsV가 처리된 벼 식물체의 뿌리를 대상으로 정량적 RT-PCR(quantitative real time-polymerase chain reaction) 분석을 통해 시간대별 OsAIR2 유전자의 발현 양상을 확인한 결과, AsV를 처리한 시간이 경과함에 따라 OsAIR2 유전자의 발현량도 증가하였으며, 24시간 후에는 OsAIR2 유전자의 발현량이 약 15배 정도 증가한 것을 확인할 수 있었다(도 2).

실시예 2. OsAIR2 유전자의 E3 리가아제로서의 기능 분석

OsAIR2 유전자는 395개의 아미노산으로 이루어져 있으며, 단백질의 분자량은 42.38kDa으로 추정된다. 이후 벼 유래의 OsAIR2 아미노산 서열과 밀(Zea mays), 수수(Sorghum bicolor), 조(Setaria italica), 큰개기장(Panicum virgatum), 야생잔디(Brachypodium distachyon) 및 애기장대(Arabidopsis lyrata 및 Arabidopsis thaliana) 유래 상동 유전자들의 아미노산 서열을 정렬(alignment)한 결과, N 말단 영역의 RING 도메인(RING-HC 타입) 내에서 잘 보존된 Cys- 및 His- 잔기(C-X2-C-X12-C-X1-H-X2-C-X2-C-X11-C-X2-C)들이 확인되었다.

이전의 많은 연구를 통해 RING 도메인은 E3 리가아제 활성을 가지는 것으로 알려졌다. 이러한 이유로 RING-HC 도메인을 가지고 있는 OsAIR2 단백질의 E3 리가아제 활성을 확인하기 위하여, 전장 OsAIR2 유전자에 MBP(maltose-binding protein)를 결합시킨 융합 단백질을 대장균(E. coli BL21)에서 발현시켰으며, RING 도메인 중 33번째 시스테인을 알라닌으로 치환하여 도메인의 활성을 검정하였다. 이어서, 본 발명자는 OsAIR2 단백질의 RING-HC 도메인이 E3 유비퀴틴 리가아제 활성을 갖는지 확인하였다. 재조합 MBP-OsAIR2 및 MBP-OsAIR2^C33A 와 비재조합 empty-MBP를 각각 대장균 시스템에서 발현시켰으며, 정제된 각각의 단백질들은 인간 유래 E1(ubiquitin-activating enzyme) 및 애기장대 유래 E2(ubiquitin-conjugating enzyme UBC10)와 함께 유비퀴틴화 버퍼(50mM Tris-HCl, pH 7.5, 1 mM MgCl₂, 0.05mM ZnCl₂, 1mM ATP, 0.2mM DTT, 10mM 포스포크레아틴 및 0.1 유닛의 크레아틴 키나아제)에서 30℃의 조건으로 3시간 동안 반응시켰다. 유비퀴틴화 활성은 항-유비퀴틴 항체를 이용하여 측정하였다.

그 결과, MBP-OsAIR2은 다수의 유비퀴틴화된 밴드를 나타낸 반면, MBP-OsAIR2^C33A 및 Empty-MBP에서는 유비퀴틴화된 밴드가 나타나지 않았다(도 4A). 또한, MBP-OsAIR2 단백질과 E1 및 E2 효소들의 반응 시간별 유비퀴틴화 활성을 확인해본 결과, 시간대별로 유비퀴틴화 밴드가 점차 강하게 나타남으로써, RING-HC 도메인을 포함하는 OsAIR2 단백질이 E3 유비퀴틴 리가아제로서 작용한다는 것을 확인하였다(도 4B).

실시예 3. OsAIR2 과발현 형질전환 애기장대의 비소 처리에 대한 반응 분석

RT-PCR 분석을 통해 OsAIR2 유전자가 발현되는 것이 확인된 3개의 OsAIR2 과발현 형질전환 라인(35S:OsAIR2-EYEP line #1, #2 및 #3)을 선발하였으며(도 5), 다양한 농도(100, 150 및 200μM)의 AsV 처리를 통해 대조구 식물체(35S:EYEP)와 비교하였다. 그 결과, 비소가 처리되지 않은 환경에서는 표현형에 있어 차이가 없었지만(데이터 미제시), 비소가 처리된 경우 OsAIR2 과발현 형질전환체가 대조구 식물체에 비해 발아율이 통계적으로 유의하게 증가한 것을 확인할 수 있었다(도 6). 또한, OsAIR2 과발현 형질전환 식물체와 대조구 식물체의 뿌리 길이를 측정하여 비교한 결과, 100μM의 비소를 처리하였을 때, OsAIR2 과발현 형질전환 식물체가 대조구 식물체에 비해 뿌리 길이가 약 1cm 정도 증가하였으며, 200μM의 비소 처리에서는 약 0.3cm 정도 증가한 것을 확인하였다(도 7).

<110> KNU-Industry Cooperation Foundation <120> Method for producing transgenic plant with increased heavy metal stress tolerance using OsAIR2 gene from Oryza sativa and plant thereof <130> PN17405 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1185 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 1 atggcatctg gaactgatga gaaagccaag atggagggtt tgacatcagc tgcagccttt 60 gttgagggtg ggattcagga tgcatgtgat gatgcatgta gtatctgcct tgaggcgttc 120 tgtgagagtg acccttccac attgactggt tgcaaacacg agttccacct ccaatgcatt 180 cttgaatggt gtcagagaag ttctcagtgt cctatgtgtt ggcagcctat cagtttgaag 240 gatcctacca gtcaagagct gctcgaggca gtggagcgtg aaaggaatgt aaggaccaat 300 caaactcgaa atacaactat atttcatcat cctgctcttg gagattttga ggttcagcat 360 ttacctgttg ttggtaatga tgctgaactt gaagagcgta tattacagca cctagcagca 420 gccgctgcaa tgggaaggtc acaccacctt ggtagaagag aaggacacag gggtcgttcc 480 ggctctcatg gtcgtccaca gttcttagtt ttttcttcgc atccaaacat gccttctgct 540 ggttcagttt cttcatcgtc cgttcaaggg gaagtggata atgaatcaag tcctgtccac 600 acaactggtg aattatcact gcatgctaac acccatgaag aagcaggcaa tcaaagtcct 660 gggatgctta cctacgatgc tgatcaagat gctgttgttt catctggaaa tagtacccct 720 gtatctagcc ctaggttttt caacaggagg cattccactg ggcaatcaac tccagtaaac 780 aacgacagag ctgggccttc agatcttcag tctttctcag actctctgaa gtctcgctta 840 aatgctgtct ctatgaagta caaggaatct attacaaaaa gtactcgagg atggaaggag 900 agactttttt cgcgtcattc atctgtggca gatcttggtt ctgaagtaag aagagaagtt 960 aatgctggaa ttgcatccgt atcaaggatg atggagcgtc tggaaactag aggtagtaat 1020 ggtagaacaa gtgatggccc agcaatatcc acttctgaag ttattcccag tacagaatca 1080 agcaatgaga gagttacaga aaacaatcca actactgcag cgacaagtag tggcaacact 1140 tctgcgtctt ctgccccttg tgttacaaca accggttcaa attag 1185 <210> 2 <211> 394 <212> PRT <213> Oryza sativa <400> 2 Met Ala Ser Gly Thr Asp Glu Lys Ala Lys Met Glu Gly Leu Thr Ser 1 5 10 15 Ala Ala Ala Phe Val Glu Gly Gly Ile Gln Asp Ala Cys Asp Asp Ala 20 25 30 Cys Ser Ile Cys Leu Glu Ala Phe Cys Glu Ser Asp Pro Ser Thr Leu 35 40 45 Thr Gly Cys Lys His Glu Phe His Leu Gln Cys Ile Leu Glu Trp Cys 50 55 60 Gln Arg Ser Ser Gln Cys Pro Met Cys Trp Gln Pro Ile Ser Leu Lys 65 70 75 80 Asp Pro Thr Ser Gln Glu Leu Leu Glu Ala Val Glu Arg Glu Arg Asn 85 90 95 Val Arg Thr Asn Gln Thr Arg Asn Thr Thr Ile Phe His His Pro Ala 100 105 110 Leu Gly Asp Phe Glu Val Gln His Leu Pro Val Val Gly Asn Asp Ala 115 120 125 Glu Leu Glu Glu Arg Ile Leu Gln His Leu Ala Ala Ala Ala Ala Met 130 135 140 Gly Arg Ser His His Leu Gly Arg Arg Glu Gly His Arg Gly Arg Ser 145 150 155 160 Gly Ser His Gly Arg Pro Gln Phe Leu Val Phe Ser Ser His Pro Asn 165 170 175 Met Pro Ser Ala Gly Ser Val Ser Ser Ser Ser Val Gln Gly Glu Val 180 185 190 Asp Asn Glu Ser Ser Pro Val His Thr Thr Gly Glu Leu Ser Leu His 195 200 205 Ala Asn Thr His Glu Glu Ala Gly Asn Gln Ser Pro Gly Met Leu Thr 210 215 220 Tyr Asp Ala Asp Gln Asp Ala Val Val Ser Ser Gly Asn Ser Thr Pro 225 230 235 240 Val Ser Ser Pro Arg Phe Phe Asn Arg Arg His Ser Thr Gly Gln Ser 245 250 255 Thr Pro Val Asn Asn Asp Arg Ala Gly Pro Ser Asp Leu Gln Ser Phe 260 265 270 Ser Asp Ser Leu Lys Ser Arg Leu Asn Ala Val Ser Met Lys Tyr Lys 275 280 285 Glu Ser Ile Thr Lys Ser Thr Arg Gly Trp Lys Glu Arg Leu Phe Ser 290 295 300 Arg His Ser Ser Val Ala Asp Leu Gly Ser Glu Val Arg Arg Glu Val 305 310 315 320 Asn Ala Gly Ile Ala Ser Val Ser Arg Met Met Glu Arg Leu Glu Thr 325 330 335 Arg Gly Ser Asn Gly Arg Thr Ser Asp Gly Pro Ala Ile Ser Thr Ser 340 345 350 Glu Val Ile Pro Ser Thr Glu Ser Ser Asn Glu Arg Val Thr Glu Asn 355 360 365 Asn Pro Thr Thr Ala Ala Thr Ser Ser Gly Asn Thr Ser Ala Ser Ser 370 375 380 Ala Pro Cys Val Thr Thr Thr Gly Ser Asn 385 390

Claims

벼 유래의 OsAIR2(Oryza sativa Arsenic-Induced RING E3 ligase 2) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜 OsAIR2 유전자의 발현을 조절하는 단계를 포함하는 식물체의 중금속 스트레스 내성을 조절하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 OsAIR2 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 식물체의 중금속 스트레스 내성을 조절하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 OsAIR2 유전자를 과발현시켜 식물체의 중금속 스트레스 내성을 증가시키는 것을 특징으로 하는 식물체의 중금속 스트레스 내성을 조절하는 방법.
제2항에 있어서, 상기 중금속은 비소인 것을 특징으로 하는 식물체의 중금속 스트레스 내성을 조절하는 방법.
서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진, 벼 유래의 OsAIR2(Oryza sativa Arsenic-Induced RING E3 ligase 2) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및
상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 중금속 스트레스 내성이 조절된 형질전환 식물체의 제조 방법.
제5항에 있어서, 상기 OsAIR2 유전자를 과발현시켜 식물체의 중금속 스트레스 내성을 증가시키는 것을 특징으로 하는 중금속 스트레스 내성이 조절된 형질전환 식물체의 제조 방법.
제5항 또는 제6항의 방법에 의해 제조된 중금속 스트레스 내성이 조절된 형질전환 식물체.
제7항의 식물체의 형질전환된 종자.
서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진, 벼 유래의 OsAIR2(Oryza sativa Arsenic-Induced RING E3 ligase 2) 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 함유하는 식물체의 중금속 스트레스 내성 조절용 조성물.