KR20190042979A - 대장균 선별용 펩타이드 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 대장균(Escherichia coli)의 외막단백질에 특이적으로 결합하는 펩타이드, 이를 암호화하는 핵산 분자, 핵산 분자를 포함하는 재조합 발현 벡터, 재조합 발현 벡터로 형질 전환된 형질전환체, 상기 펩타이드를 포함하는 검출용 조성물, 상기 펩타이드를 포함하는 키트 및 상기 펩타이드를 이용한 대장균의 검출방법에 관한 발명이다.
Description
본 발명은 대장균(Escherichia coli)의 외막단백질에 특이적으로 결합하는 펩타이드, 이를 암호화하는 핵산 분자, 핵산 분자를 포함하는 재조합 발현 벡터, 재조합 발현 벡터로 형질 전환된 형질전환체, 상기 펩타이드를 포함하는 검출용 조성물, 상기 펩타이드를 포함하는 키트 및 상기 펩타이드를 이용한 대장균의 검출방법에 관한 발명이다.
수인성 전염병에 의한 오염은 오랜 세월에 걸쳐 누적되어 나타나는 만성적인 질병을 유발하는 대부분의 화학물질과 달리 급성질병을 유발하여 단기간에 결과aa 나타나고 2차 감염에 의한 확산의 우려가 있기 때문에 예방이 매우 중요하다. 물이나 부적당한 위생에 기인하는 질병이 모든 질병의 80% 정도로 추정되며 직접적인 병원성 미생물의 검사는 방법상의 장애 등 현실적으로 어려움이 많아 간접적인 방식으로 대장균군과 같은 지표 미생물을 사용하여 오염 여부를 검사한다. 대장균은 사람을 포함해서 포유류의 장관을 기생 장소로 하고 있는 장내세균으로, 사람이나 동물의 분변에 오염된 외계에 널리 존재하기 때문에 음료수, 수영장이나 식품의 변질에 의한 오염을 검사하는 지표가 된다.
세포의 외막 단백질(Outer membrane protein; OMPs)은 세포와 환경 사이에서 중요한 분자를 말한다. 외막 단백질은 일반적으로 풍부하며 숙주 면역 시스템과 직접 접촉하기 때문에 좋은 백신 후보로 쓰이고 있다. 외막 단백질은 여러 박테리아 감염에 대한 백신의 항원 가능성으로 연구되고 있으며, 성공적으로 사용되고 있다.
광범위하게 이용되고 있는 분자진화기술 중 하나인 phage display는 박테리오파지의 캡시드 단백질에 외래 펩타이드와 단백질을 삽입, 융합시켜 파지 표면에 외래 단백질을 발현되도록 하는 기술로써, 펩타이드 라이브러리를 이용하여 타겟분자에 대해서 높은 결합력을 가지는 펩타이드 선별할 수 있어졌다. Phage display library로부터 분리한 특정 리간드나 펩타이드는 약물 설계 및 백신 개발에 사용될 수 있으며, 새로운 아미노산 서열을 가지는 신규 펩타이드를 발굴하고, 개량화하여 질병조기진단용으로 사용하고자 많은 연구들이 이루어지고 있다.
현재 광범위하게 이용되고 있는 phage display 기술을 이용하여 Escherichia coli의 외막 단백질을 표적으로 하여 특이적 결합력을 보이는 펩타이드를 선별하였다. 이 펩타이드는 Escherichia coli의 외막 단백질과 특이적으로 결합력을 보이며 대장균의 검출 및 질환 진단 기술 개발은 물론 다양한 질병에 대한 치료제 개발에서도 활용 범위를 넓힐 수 있다.
본 발명의 목적은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 대장균(Escherichia coli)의 외막단백질에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 전술한 펩타이드의아미노산 서열을 암호화하는 핵산분자를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 1 내지 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 펩타이드를 포함하는 대장균검출용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 펩타이드를 포함하는 대장균 검출용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 (a) 서열번호 1 내지 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 펩타이드와 검출 대상 시료를 접촉시키는 단계; 및 (b) 상기 펩타이드와 검출 대상 시료에 포함될 수 있는 대장균의 결합여부를 확인하는 단계를 포함하는 대장균의 검출 방법을 제공하는 것이다.
상술한 과제를 해결하기 위해 본 발명은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 대장균(Escherichia coli)의 외막단백질에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 제공할 수 있다.
본 발명의 서열번호 1 및 2번의 아미노산 서열은 파지디스 디스플레이를 이용하여 대장균(Escherichia coli)의 외막단백질에 특이적으로 결합하는 펩타이드 서열을 찾아 낸 것이다. 본 발명에 따른 펩타이드는 항체에 비해 상대적으로 대량 생산이 용이하고, 독성이 거의 없는 장점이 있다. 또한, 대장균(Escherichia coli)의 에대한 결합력이 높은 장점이 있으며, 열/화학 처리시에도 변성이 일어나지 않는다. 또한, 분자 크기가 작기 때문에 다른 단백질에 결합시켜 융합 단백질로의 이용이 가능하다. 본 발명의 펩타이드는 당업계에 공지된 화학적 합성에 의해 제조될 수 있다. 대표적인 방법으로는 액체 또는 고체상 합성, 단편 응축, F-MOC 또는 T-BOC 화학법이 포함되나, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 펩타이드는 유전공학적 방법에 의해 제조될 수 있다. 우선, 통상적인 방법에 따라 상기 펩타이드를 코딩하는 DNA 서열을 제작한다. DNA 서열은 적절한 프라이머를 사용하여 PCR 증폭함으로써 제작할 수 있다. 다른 방법으로 당업계에 공지된 표준 방법에 의해, 예컨데, 자동 DNA 합성기(예: Biosearch 또는 Applied Biosystem사에서 판매하는 것)을 사용하여 DNA 서열을 합성할 수도 있다. 제작된 DNA 서열은 이 DNA 서열에 작동가능하게 연결되어(operatively linked) 그 DNA 서열의 발현을 조절하는 하나 또는 그 이상의 발현 조절 서열(expreesion control sequence)(예:프로모터, 인해서 등)을 포함하는 벡터에 삽입시키고, 이로부터 형성된 재조합 발현 벡터로 숙주 세포를 형질전환시킨다. 생성된 형질 전환체를 상기 DNA 서열이 발현되도록 적절한 배지 및 조건하에서 배양하여, 배양물로부터 상기 DNA 서열에 의해 코딩된 실질적으로 순수한 펩타이드를 회수한다. 상기 회수는 이 기술분야에서 공지된 방법(예컨대, 크로마토그래피)을 이용하여 수행할 수 있다. 상기에서 '실질적으로 순수한 펩타이드'라 함은 본 발명에 따른 펩타이드가 숙주로부터 유래된 어떠한 다른 단백질도 실질적으로 포함하지 않은 것을 의미한다. 본 발명의 펩타이드는 N-말단의 아미노 말단의 반응성 제거를 위한 공지된 변성이 가능하고, 예를 들어 아세틸화(Acetylation)가 가능하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 펩타이드의 타겟인 대장균(Escherichia coli)은 대표적인 대장균 종의 균주에 해당한다.
특히나,본 발명을 통해 위생 지표인 대장균(Escherichia coli)의 외막 단백질을 인식하는 펩타이드는 신소재로써 유해미생물 검출을 위한 바이오마커 단백질로 사용될 수 있다.
본 발명의 일 실시예 따르면, 펩타이드의 아미노산 서열을 암호화하는 핵산분자를 제공한다. 본 발명에서 용어 "핵산 분자"는 DNA(gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 가지며, 핵산 분자에서 기본 구성단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다. 본 발명의 펩타이드를 코딩하는 핵산 분자의 서열은 변형될 수 있다. 상기 변형은 뉴클레오타이드의 추가, 결실, 또는 비보존적 치환 또는 보존적 치환을 포함한다.
본 발명의 뉴클레오타이드는 상기한 뉴클레오타이드 서열에 대하여 실질적인 동일성을 나타내는 뉴클레오타이드 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 뉴클레오타이드 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 정렬(align)하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 정렬된 서열을 분석한 경우에, 최소 80%의 상동성, 일 특정예에서는 최소 90%의 상동성, 다른 특정예에서는 최소 95%의 상동성을 나타내는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다.
본 발명의 또 다른 일 실시예는 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다. 본 발명의 벡터 시스템은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있으며, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook et al. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 본 발명의 핵산 분자가 원핵 세포 유래이고, 배양의 편의성 등을 고려하여, 원핵 세포를 숙주로 하는 것이 바람직하다.
예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예컨대, tac 프로모터, lac 프로모터, lacUV5 프로모터, lpp 프로모터, pLλ프로모터, pRλ프로모터, rac5 프로모터, amp 프로모터, recA 프로모터, SP6 프로머터, trp 프로모터 및 T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 숙주 세포로서 E. coli가 이용되는 경우, E. coli 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위 (Yanofsky, C., J. Bacteriol., 158:1018-1024(1984)) 그리고 파아지 λ의 좌향 프로모터 (pLλ프로모터, Herskowitz, I. and Hagen, D., Ann. Rev. Genet., 14:399-445(1980) 가 조절 부위로서 이용될 수 있다.
한편, 본 발명에 이용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드(예: pSC101, ColE1, pBR322, pUC8/9, pHC79, pUC19 및 pET 등), 파지(예: λgt4·λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스(예: SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.
한편, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터(예: 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.
본 발명의 벡터는 그로부터 발현되는 대장균(Escherichia coli)에 특이적으로 결합하는 올리고펩타이드의 정제를 용이하게 하기 위하여, 다른 서열과 융합될 수도 있다. 융합되는 서열은 예컨대, 글루타티온 S-트랜스퍼라제 (Pharmacia, USA), 말토스 결합 단백질 (NEB, USA), FLAG (IBI, USA) 및 6x His (hexahistidine; Quiagen, USA) 등이 있고, 가장 바람직하게는 6x His이다. 상기 정제를 위한 추가적인 서열 때문에, 숙주에서 발현된 단백질은 친화성 크로마토그래피를 통하여 신속하고, 용이하게 정제된다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 융합 서열이 포함되어 있는 벡터에 의해 발현된 융합 단백질은 친화성 크로마토그래피에 의해 정제된다. 예컨대, 글루타티온-S-트랜스퍼라제가 융합된 경우에는 이 효소의 기질인 글루타티온을 이용할 수 있고, 6x His이 이용된 경우에는 Ni-NTA His-결합 레진 컬럼 (Novagen, USA)을 이용하여 소망하는 퍼옥시레독신를 신속하고 용이하게 얻을 수 있다.
한편, 본 발명의 발현 벡터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함하며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.
본 발명은 또한, 발현 벡터로 형질 전환된 형질전환체를 제공할 수 있다. 본 발명의 벡터를 안정하게 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주 세포는 당업계에 공지되어있는 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, E. coli Origami2, E. coli JM109, E. coli BL21(DE3), E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110와 같은 E. coli 균주, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다.
또한, 본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주 세포로서, 이스트(Saccharomyce cerevisiae), 곤충 세포 및 사람 세포(예컨대, CHO 세포주(Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 벡터를 숙주 세포 내로 운반하는 방법은, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl2 방법(Cohen, S.N. et al. Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114(1973)), 하나한 방법(Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114(1973); 및 Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580(1983)) 및 전기 천공 방법(Dower, W.J. et al., Nucleic.Acids Res., 16:6127-6145(1988)) 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주 세포가 진핵 세포인 경우에는, 미세 주입법(Capecchi, M.R., Cell, 22:479(1980)), 칼슘 포스페이트 침전법(Graham, F.L. et al. Virology, 52:456(1973)), 전기 천공법(Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841(1982)), 리포좀-매개 형질감염법(Wong, T.K. et al., Gene, 10:87(1980)), DEAE-덱스트란 처리법 (Gopal, Mol. Cell Biol., 5:1188-1190(1985)), 및 유전자 밤바드먼트(Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:9568-9572(1990)) 등에 의해 벡터를 숙주 세포내로 주입할 수 있다.
숙주 세포 내로 주입된 벡터는 숙주 세포 내에서 발현될 수 있으며, 이러한 경우에는 다량의 대장균(Escherichia coli)에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 얻게 된다. 예를 들어, 상기 발현 벡터가 lac 프로모터를 포함하는 경우에는 숙주 세포에 IPTG를 처리하여 유전자 발현을 유도할 수 있다.
본 발명은 또한 서열번호 1 내지 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 펩타이드를 포함하는 대장균 검출용 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명의 펩타이드가 대장균(Escherichia coli)과 결합을 형성하였는지 여부를 용이하게 확인, 검출 및 정량하기 위하여, 본 발명의 펩타이드는 표지된 상태로 제공될 수 있다. 즉 검출 가능한 표지에 링크(예: 공유 결합 또는 가교)되어 제공될 수 있다. 상기 링크는 본 발명의 펩타이드와 검출 가능한 표지 사이에 직접 형성되는 것도 가능하지만, 링크를 통해서도 형성 가능하다. 상기 링커는 당업계에 공지된 어떠한 것도 사용 가능하며, 적합한 펩타이드 링커의 서열은 다음과 같은 요소를 고려하여 선택될 수 있다: (a) 유연한 연장된 컨포메이션에 적용될 수 있는 능력; (b) 에피토프와 상호작용 하는 이차구조를 생성하지 않는 능력; 및 (c) 에피토프와 반응할 수 있는 소수성 잔기 또는 전하를 갖는 잔기의 부재.
본 발명의 펩타이드는 발색효소, 방사성 동위원소, 크로모포어(chromopore), 발광물질 및 형광물질로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나로 표지될 수 있다.
상기 표지는 구체적으로 예를 들면, 발색효소에 해당하는 퍼옥시다제(peroxidase), 알칼라인 포스파타제(alkaline phosphatase)); 방사성 동위원소에 해당하는 124I, 125I, 111In, 99mTc, 32P,35S; 크로모포어(chromophore); 발광물질 또는 형광물질에 해당하는 FITC, RITC, 로다민(rhodamine), 텍사스레드(Texas Red), 플로레신(fluorescein), 피코에리트린(phycoerythrin), 퀀텀닷(quantum dots)일 수 있고, 이에 제한되지 않는다.
유사하게, 상기 검출 가능한 표지는 항체 에피토프(epitope), 기질(substrate), 보조인자(cofactor), 저해제 또는 친화 리간드일 수 있다. 이러한 표지는 본 발명의 펩타이드를 합성하는 과정 중에 수행할 수도 있고, 이미 합성된 펩타이드에 추가로 수행될 수도 있다.
상기 검출 가능한 표지를 포함하는 올리고펩타이드는 각각의 표지에 대하여 종래 공지된 검출 방법을 이용하여 검출하는 것이 가능하다. 구체적으로 예를 들어 형광 신호 FITC를 표지로 이용하는 경우, 형광광도계(Fluorometer)를 이용하여 펩타이드에 연결되어진 FITC의 최대 파장(Excitation: 495 nm, Emission: 520 nm)에서 각 펩타이드 농도에 대한 형광세기를 측정하는 방법을 이용할 수 있다.
서열번호 1 내지 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 펩타이드를 포함하는 대장균(Escherichia coli)검출용 키트를 제공할 수 있다.
본 발명인 대장균(Escherichia coli)검출 서열번호 1 내지 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 펩타이드 또는 이를 암호화하는 핵산분자를 포함할 수 있으며, 상기 펩타이드 또는 핵산분자는 앞서 기재한 바와 같이 화학적 또는 유전공학적 방법에 의해 수득된 것일 수 있다. 상기 펩타이드에 관해서는 본 발명의 다른 일 양태들에 대한 설명을 위해 상술한 바와 동일하다. 본 발명의 키트에는 펩타이드의 구조 또는 생리 활성을 안정하게 유지시키는 완충액 또는 반응액이 추가로 포함될 수 있다. 또한, 안정성을 유지하기 위해, 분말 상태 또는 적절한 완충액에 용해된 상태 또는 4℃ 유지된 상태로 제공될 수 있다.
본 발명인 대장균(Escherichia coli)검출 키트는 기존 PCR 방법에 비하여 빠르고 편리하게 현장에서 진단이 가능하고, 대장균(Escherichia coli)을 포함하는 식중독균 형광 검출 키트 형태로 제공될 수 있다. 종래 공지된 다른 프로브들에 대하여 본 발명의 펩타이드를 연결하여 식중독균에 대한 민감도를 증가시킬 수 있고, 식중독균을 특이적으로 검출이 가능하며, 형광현미경을 통하여 식중독균을 이미지화하여 검출 할 수 있는 시스템의 형태로 제공될 수 있다.
대장균(Escherichia coli)검출을 용이하게 하기 위하여, 본 발명의 검출 키트에 포함되는 펩타이드는 상술한 바와 같이 표지된 상태로 제공될 수 있다. 한편, 본 발명의 펩타이드가 표지되지 않은 채로 제공되는 경우에는, 본 발명인 대장균(Escherichia coli)검출 키트는 본 발명의 펩타이드의 시험관 내 또는 검출 대상에 포함된 대장균(Escherichia coli)균주와의 결합여부 또는 그 위치를 탐색하기 위한 성분을 추가로 포함할 수 있다. 상기 성분은 본 발명의 펩타이드의 표지를 위한 공지의 화합물이거나, 항원-항체반응을 통한 탐색을 위하여 본 발명의 펩타이드 또는 본 발명의 펩타이드와 결합하는 특정 수용체에 대한 항체 또는 이들에 대한 2차 항체 및 이의 검출을 위한 시약일 수 있다. 구체적으로 본 발명의 진단은 종래의 면역분석(immunoassay) 방식 또는 프로토콜을 변형하여 실시될 수 있다. 예컨대, 종래 면역분석에서 항체 대신에, 본 발명의 펩타이드를 사용하고, 프로세스는 동일하게 하여 본 발명의 진단을 실시할 수 있다. 예를 들어, ELISA(enzyme-linked immunosorbant assay)는 ELONA(enzyme-linked oligonucleotide assay)로 조금 변형하여 실시된다.
또한 본 발명인 진단용 키트의 펩타이드는 플레이트의 표면에 코팅된 형태로 제공될 수도 있다. 이 경우에는 상기 플레이트에 직접 대상 시료를 접종하여 적당한 조건에서 반응시킨 후, 플레이트의 표면상에서의 대상 시료에 포함된 대장균(Escherichia coli)과, 펩타이드의 결합을 관찰함으로써 대장균(Escherichia coli)를 검출할 수 있다.
본 발명의 대장균(Escherichia coli) 검출 키트는 병, 통(tub), 작은 봉지(sachet), 봉투(envelope), 튜브, 앰플(ampoule) 등과 같은 형태를 취할 수 있으며, 이들은 부분적으로 또는 전체적으로 플라스틱, 유리, 종이, 호일, 왁스 등으로부터 형성될 수 있다. 용기는 그 일부이거나 또는 기계적, 접착성 또는 기타 수단에 의해 용기에 부착될 수 있는 완전히 또는 부분적으로 분리가 가능한 마개를 장착할 수 있다. 또한 용기는 주사바늘에 의해 내용물에 접근할 수 있는 스토퍼가 장착될 수 있다.
다음 단계를 포함하는 대장균(Escherichia coli)검출 방법을 제공할 수 있다.
(a) 서열번호 1 내지 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 펩타이드와 검출 대상 시료를 접촉시키는 단계; 및
(b) 상기 펩타이드와 검출 대상 시료에 포함될 수 있는 대장균(Escherichia coli)의 결합여부를 확인하는 단계.
본 발명의 "검출 대상 시료"는 대장균(Escherichia coli)이 존재할 가능성이 있으며, 그 존재 여부를 확인할 필요가 있는 대상 시료를 의미한다. 구체적으로 예를 들면, 액체, 토양, 공기, 식품, 사료, 폐기물 및 동식물 중 어느 하나 이상에서 채취된 것일 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 더욱 구체적으로 상기 액체는 물, 혈액, 소변, 눈물, 땀, 타액, 림프 및 뇌척수액 등일 수 있으며, 상기 물은 강수(江水), 해수(海水), 호수(湖水) 및 우수(雨水) 등을 포함하고, 상기 폐기물은 하수, 폐수 등을 포함하며, 상기 동식물은 인체를 포함한다. 또한, 상기 동식물은 식품이나 동식물의 사료 등으로 이용될 수 있는 조직을 제공하는 것이면 특별히 제한되지 아니한다.
본 발명의 단계(b)에서의 결합 여부 확인은 본 발명의 다른 양태인 대장균(Escherichia coli) 검출용 조성물에 관하여 상술한 내용을 참조할 수 있고, 본 명세서 기재의 과도한 복잡성을 피하기 위해 생략하도록 한다.
펩타이드는 분자량이 낮아 기능화가 쉽고, 제조공정이 다소 간단한 장점을 가지고 있다. 특히, 본 발명의 펩타이드는 대장균(Escherichia coli)의 외막 단백질과 특이적으로 결합력을 보여 대장균의 검출 및 질환 진단에 효과적이다.
도 1은 phage display library를 이용한 펩타이드 선별을 위한 biopanning 과정을 도식화한 도면이다.
도 2는 PCR을 통해 추출한 주형 DNA를 아가로스 전기영동을 통하여 확인한 결과; (A) 2라운드에서 E. coli 의 외막단백질에 특이적으로 결합하는 library phage에서 추출한 주형 DNA, (B) 3라운드에서 E. coli 의 외막단백질에 특이적으로 결합하는 library phage에서 추출한 주형 DNA 에 대한 결과를 나타내는 사진이다.
도 3은 E.coli 에 대한 phage single DNA 서열 분석을 나타내는 도면이다.
도 2는 PCR을 통해 추출한 주형 DNA를 아가로스 전기영동을 통하여 확인한 결과; (A) 2라운드에서 E. coli 의 외막단백질에 특이적으로 결합하는 library phage에서 추출한 주형 DNA, (B) 3라운드에서 E. coli 의 외막단백질에 특이적으로 결합하는 library phage에서 추출한 주형 DNA 에 대한 결과를 나타내는 사진이다.
도 3은 E.coli 에 대한 phage single DNA 서열 분석을 나타내는 도면이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
<실시예 1> Escherichia coli의 외막단백질분리
본 실시예에서는 오염의 지표로서 사용되는 Escherichia coli의 외막단백질을 분리하였으며, 분리방법은 다음과 같다. 외막단백질을 분리하기 위하여 ReadyPrepTMProtein Extraction Kit (Bio-Rad Laboratories, Inc.)를 이용하였다. 대장균을 37에서 12시간 배양한 후, 3000rpm으로 15분간 원심 분리한 다음, 침전물에 키트에서 제공되는 M1 buffer (lysis buffer)와 0.1mM PIC (protease inhibitor cocktails)를 혼합해준 뒤, 초음파 분쇄기 (sonicator)를 이용하여 침전물을 분쇄시켜준다. 분쇄된 침전물에 키트에서 제공하는 M2 buffer를 1:1로 섞어 1분 vortexing, 1분 ice의 과정을 4~5번 반복한 뒤 10분간 ice에서 반응시키고 37에서 30분간 한 번 더 반응시켜준다. 원심분리기 13000 rpm으로 5분간 분리하여 상층액은 제거해주고 침전물만 모아준다. 이 과정을 2번 정도 더 반복해주면 침전물에는 보다 순수한 외막 단백질이 포함되어진다.
<실시예 2> Phage display를 이용한 Escherichia coli의 외막단백질에 특이적으로 결합하는 펩타이드 선별
본 실시예에서는 phage display library를 이용하여 Escherichia coli의 외막 단백질에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 선별하였으며, 선별과정은 다음과 같다 (도 1 참조). 실시예 1에서 분리한 외막 단백질을 plate에 고정한 뒤 phage library와 혼합한 후, TBST 버퍼로 전체 반응 부피를 1ml로 조정하였으며, 이후 상온에서 60분간 반응시켰다. 각각의 외막 단백질과 특이적으로 결합하는 펩타이드를 선별하기 위하여 elution buffer (0.2M Glycine-HCl, pH2.2) 1ml씩 각 plate에 넣어 15 분간 상온에서 반응시켰다. 분리된 특이적 펩타이드를 포함한 phage library를 포함하는 반응액을 회수하여 1M Tris-HCl (pH9.1) buffer를 150 ㎕를 넣어 중화시켜주었다. 분리된 library phage 800 ㎕를 Kit에 phage 감염을 위한 재조합 및 구성되어 있는 E. coli ER2738에 접종시켜 20 ml의 LB배양액에 혼합하여 37에서 4.5시간동안 배양하여 증폭시켜주었다. 반응액을 4에서 12,000g로 원심분리하여 상층액의 80%를 회수하여 20% PEG/2.5M NaCl을 혼합하여 4에서 12시간동안 반응시켜 특이적 펩타이드를 포함하는 library phage를 침전시킨 뒤, 4에서 12,000g로 원심분리하여 특이적 펩타이드를 포함하는 library phage만을 회수하였다. 이후, phage display library는 3회까지 진행하였으며, phage display library 라운드가 진행될수록 반응 조건을 엄격하게 하여 표적 물질인 Escherichia coli의 외막단백질과 더욱 특이적으로 결합하는 펩타이드를 얻고자 하였다.
<실시예 3> 선별된 library phage 내의 특이적 펩타이드 추출
특이적 펩타이드 선별을 위하여 2, 3 라운드 각각에 해당되는 library phage를 10개~15개 회수하였으며, 회수한 특이적 펩타이드를 포함하는 library phage 내에서 펩타이드를 추출하기 위한 방법은 다음과 같다.
E. coli ER2738을 배양 한 후, 1ml의 LB 배양액에 1:100의 비율로 접종한 뒤 37℃에서 5시간 동안 배양하였다. 배양 후, 14000 rpm으로 1분간 원심분리하여 상층액 500 ㎕와 20% PEG/2.5M NaCl buffer 200㎕ 와 혼합하여 실온에서 15분간 반응시켰다. 반응액을 14000 rpm으로 4℃에서 10분 동안 원심분리하여 상층액을 제거하고 펩타이드만을 분리하였다. 원심분리를 통해 얻은 펩타이드는 ethanol을 이용하여 불순물을 제거하고 순수한 펩타이드만을 획득하는 세척 과정을 수행하였다. 획득한 펩타이드에 Iodide buffer 100 ㎕를 첨가하여 혼합해주고 200 ㎕ ethanol을 첨가해 15분 동안 실온에서 반응시켰다. 반응액을 14000 rpm으로 4℃에서 10분 동안 원심분리하여 상층액을 제거하고 500 ㎕ 70% ethanol로 펩타이드를 세척해준 다음, 한 번 더 원심분리하여 상층액을 완전히 제거해 준 뒤, 37℃에서 5분간 건조시켜 ethanol을 완전히 휘발시켰다. 이후 세척한 펩타이드에 30㎕ TE buffer를 혼합해주었다.
<실시예4> Escherichia coli의 외막 단백질에 특이적으로 결합하는 펩타이드 확인
SEscherichia coli의 외막 단백질에 특이적으로 결합하는 펩타이드(DNA 올리고뉴클레오타이드)를 증폭하기 위하여 프라이머 (primer) 한 쌍을 바이오니아(Bioneer, Korea)로부터 합성하였다 [정방향 프라이머: 5'-CCGATTCCTTTAGTGGTACCTTTCTAT-3' (서열목록 제 3 서열), 역방향 프라이머 5'-CCCTCATAGTTAGCGTAACG-3' (서열목록 제 4 서열)]. 상기의 프라이머를 이용한 PCR 반응을 통해 DNA 올리고뉴클레오타이드를 증폭하였으며, 반응 조성은 주형 DNA 5㎕, 10 X PCR 완충용액 5 ㎕, dNTP 혼합물 4 ㎕, 10 pM 정방향 프라이머 2 ㎕, 10 pM 역방향 프라이머 2 ㎕, Ex Taq 중합효소 (Takara, Japan) 0.2 ㎕ (1unit/㎕)와 31.8 ㎕의 증류수로 구성하였다. 랜던 주형 DNA의 증폭을 위한 반응 조건은 95에서 4분간 변성시키고, 95에서 30초, 42.5에서 30초, 그리고 72에서 30초간 반응을 30주기 반복한 후, 72에서 7분간 추가로 신장시키는 반응을 이용하였다. PCR 반응 후 4㎕를 취하여, 0.7% 아가로오스 겔 전기영동ㅇ르 통하여 증폭 산물을 확인 한 뒤, PCR 정제 키트 (GeneAll, Korea)를 이용하여 정제하여 증류수 30 ㎕에 회수하였다 (도 2 참조). 하기 유전자들은 모두 GeneAll PCR DNA purification kit로 정제한 후 사용하였다.
| 프라이머 서열 | |
| Phage-F | CCG ATT CCT TTA GTG GTA CCT TTC TAT |
| Phage-R | CCC TCAT AGT TAG CGT AACG |
<실시예 5> 특이적으로 결합하는 펩타이드 서열 분석
항원 인식 부위로서 작용하는 외막 단백질을 사용하여 실시예1에서 분리한 Escherichia coli의 외막 단백질에 특이적으로 결합하는 펩타이드 서열을 선별하고자 하였으며, 실시예 2와 3을 통해 획득한 특이적 결합력을 보이는 펩타이드를 선별 및 추출하여 실시예 4에서 증폭 회수한 펩타이드(DNA 올리고뉴클레오타이드)의 서열 분석(Cosmogenetech, Korea)을 수행하였다. 서열 분석을 통해, Escherichia coli의 외막단백질에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 펩타이드 (서열 목록 제 1 서열, 서열목록 제 2서열)을 확인하였다 (도 3 참조).
<110> INDUSTRIAL COOPERATION FOUNDATION CHONBUK NATIONAL UNIVERSITY
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> E.coli-specific peptide-1
<400> 1
Val Ser Pro Ala Lys Tyr Lys Pro Leu Ile Leu Ala
1 5 10
<210> 2
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> E.coli-specific peptide-2
<400> 2
Asp Arg Trp Val Ala Arg Asp Pro Ala Ser Ile Phe
1 5 10
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Phage-F
<400> 3
ccgattcctt tagtggtacc tttctat 27
<210> 4
<211> 20
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Phage-R
<400> 4
ccctcatagt tagcgtaacg 20
Claims (8)
- 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 대장균(Escherichia coli)의 외막단백질에 특이적으로 결합하는 펩타이드.
- 제 1 항의 펩타이드의 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 분자.
- 제 2항의 핵산 분자를 포함하는 재조합 발현벡터.
- 제 3항의 재조합 발현벡터로 형질 전환된 형질전환체.
- 서열번호 1 내지 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 펩타이드를 포함하는 대장균(Escherichia coli) 검출용 조성물.
- 제 7항에 있어서, 상기 펩타이드는 발색효소, 방사성 동위원소, 크로모포어(chromopore), 발광물질 및 형광물질로 이루어진 군에서 선택되는 어느 1종 이상으로 표지된 것인, 검출용 조성물.
- 서열번호 1 내지 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 펩타이드를 포함하는 대장균(Escherichia coli)검출용 키트.
- 다음 단계를 포함하는 대장균(Escherichia coli) 검출 방법:
(a) 서열번호 1 내지 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 펩타이드와 검출 대상 시료를 접촉시키는 단계; 및
(b)상기 펩타이드와 검출 대상 시료에 포함될 수 있는 대장균(Escherichia coli)의 결합여부를 확인하는 단계.
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Non-Patent Citations (3)
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| Biosci. Biotechnol. Biochem., Vol. 67, No. 6, pp. 1335-1341 (2003.)* * |
| Fiona Lickiss, 스코틀랜드 에든버러 대학교 박사학위 논문,「Role of the RING domain in MDM2-mediated ubiquitination of p53」(2014.)* * |
| Oncology Letters, Vol. 12, pp. 4547-4555 (2016.10.14.)* * |
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