KR20190042609A - 허혈/재관류 손상 - Google Patents

Abstract

본 발명은 허혈 조직에서 BAG3 수준을 증가시키는 조성물을 사용하여 허혈/재관류 손상을 치료하는 방법 및 조성물을 특징으로 한다. 또한 허혈/재관류 손상 위험을 감소시키기 위해 상기 조성물을 사용하는 방법을 특징으로 한다.

Description

허혈/재관류 손상

연방 기금 연구에 관한 성명

본 발명은 미국 국립 보건원이 지급하는 정부 보조금 지원 제 P01 HL 091799-01 및 RO1 HL 123093호로 이루어졌다. 미국 정부는 본 발명에 대해 특정 권리를 가지고 있다.

발명의 분야

본 발명은 또한 허혈/재관류 손상의 치료 및 예방을 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 상기 조성물은 Bc12-관련 아타노겐 3 (BAG3)의 수준을 증가시키는 물질들을 포함할 수 있고, 허혈/재관류 손상을 앓고 있거나 허혈/재관류 손상 위험이 있는 대상체에 투여될 수 있다.

배경

허혈은 일반적으로 장기 또는 조직에 대한 혈액 공급의 제한을 지칭한다. 특정 조직에 따라 혈액 공급의 감소는 세포사 및 조직 손상을 초래할 수 있다. 역으로, 재관류로도 공지되어 있는 혈액 공급의 복원은 이미 손상된 조직에 대한 추가 손상을 가져올 수 있다. 허혈/재관류 손상은 심근 경색증, 뇌졸중, 및 말초 혈관 질환을 비롯한 다양한 장애들과 관련되어 있다. 허혈/재관류 손상은 또한 수술 중에 그리고 공여자로부터 이식을 기다리는 장기에서 발생할 수도 있다. 허혈/재관류 손상에 관련된 사망율 및 이환율의 발생빈도는 광범위하다. 예를 들어, 미국에서만, 735,000명 이상의 환자들이 매년 심장 발작, 즉, 심근 경색증을 경험한다. 허혈 심장 질환은 2012년에 대략 740만명이 사망한 전세계 인류 인구의 주요 사망 원인이다. 뇌졸중은 2012년에 대략 670만명이 사망한 전세계 2번째 주요 사망 원인이다. 급성 심근 경색증 환자에서 관상 폐쇄 발생과 관상 동맥 중재술 사이의 시간을 제한하려는 노력이 성공하였음에도 불구하고, 재관류 손상으로 인한 심근 경색증은 다수의 약리학적 접근법에 의해 영향을 받지 않았다는 중요한 임상 문제가 여전히 남아있다. 허혈/재관류 손상의 치료 및 예방을 위한 새로운 치료법이 지속적으로 필요하다.

요약

본 명세서는 허혈/재관류 손상의 치료와 관련된 방법 및 조성물을 제공한다. 상기 방법은 허혈 조직에서 BAG3 수준을 증가시키는 치료적 유효량의 제약학적 조성물을 대상체에게 투여하는 방법을 포함할 수 있다. 일부 구체예들에서, 허혈/재관류 손상은 심근 경색증, 뇌졸중, 또는 말초 혈관 질환의 결과이다. 상기 조성물은 BAG3 폴리펩티드 또는 이의 단편을 인코딩하는 핵산, BAG3 폴리펩티드 또는 이의 단편, 또는 프로테오좀 억제제를 포함할 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 조성물은 재관류 중 투여된다. 또한 허혈/재관류 손상 위험이 있는 대상체를 치료하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 일부 구체예들에서, 상기 대상체는 혈관 중재 시술이 예정되어 있을 수 있다. 상기 방법은 허혈 조직에서 BAG3 수준을 증가시키는 치료적 유효량의 제약학적 조성물을 대상체에게 투여하는 방법을 포함할 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 조성물은 재관류 이전에 투여된다.

도면의 간단한 설명
본 발명의 이러한 그리고 다른 특징들과 이점들은 유사한 번호들이 유사한 부분들을 지칭하는 첨부한 도면을 함께 고려하여 본 발명의 바람직한 구체예에 관한 하기 상세한 설명에서 보다 상세히 개시되거나, 상세한 설명에 의해 명확해질 것이며, 여기서:
도 1은 저산소증/재산소화 (I/R)가 신생아 심근세포에서의 BAG3 수준을 감소시킴을 보여준다. 신생아 마우스 심실 심근세포 (NMVC)는 저산소 조건 하에서 (3 L/분으로 5% CO2 및 95% 질소) 그리고 글루코오스 없이 14 시간 동안 37°C에서 배양되었으며 이 세포들을 5% CO2 및 95% 가습 대기로 4시간 동안 글루코오스를 함유하는 배양 배지로 재산소화시켰다. 그 후 근육세포들을 수집하고 세포 용해물들을 BAG3, 절단된-카스파제-3, Bcl-2, 및 LAMP2의 수준을 결정하기 위해 면역탁본하였다. β액틴은 웨스턴 블롯 상에 부하되는 단백질의 양에 대한 대조군으로 기능하였다. 각 실험은 3번의 독립 시험으로 반복되었으며 각 실험에서 n=3이었다. 데이터는 평균 ± SEM으로 제시된다. 본페로니 (Bonferroni) 다중 비교 조정과 함께 양 방향 ANOVA를 사용하여 조사 그룹들 전반의 차이를 평가하였다. 도 1A는 한 실험의 대표적인 면역탁본을 보여준다. 도 1B는 I/R 후 BAG3 수준에 관한 웨스턴 블롯의 정량을 도시하는 그래프를 보여준다. 도 1C는 I/R 후 Bc12 수준에 관한 웨스턴 블롯의 정량을 도시하는 그래프를 보여준다. 도 1D는 I/R 후 절단된 카스파제-3의 수준에 관한 웨스턴 블롯의 정량을 도시하는 그래프를 보여준다. 도 1E는 I/R 후 리소좀-관련 막 단백질 2 (LAMP-2)의 수준에 관한 웨스턴 블롯의 정량을 도시하는 그래프를 보여준다. 도 1F는 아데노바이러스 (Ad-siBAG3)로 형질감염시킨 siRNA에 의한 BAG3 녹다운이 BAG3 수준의 유의한 감소, 뿐만 아니라 Bc12 및 LAMP-2의 감소 그리고 절단된 카스파제-3의 증가를 가져왔음을 증명하는 대표적인 웨스턴 블롯을 보여준다. 신생아 생쥐 심근세포를 Ad-siBAG3 또는 Ad-GFP (대조군)으로 3일 동안 배양중에 감염시켰으며 그 후 세포들을 수집하고 특정 항체들로 면역탁본하였다. 각 실험을 3번 반복하였으며 각 개개 실험에서 n=3 이었다. 단백질 수준에 대한 대조로 기능하는 β액틴 수준을 평가하였다. 데이터는 평균 ± SEM으로 제시하였다. 도 1G는 BAG3 수준의 감소를 보여주는 웨스턴 블롯의 정량을 도시하는 그래프를 보여준다. 도 1H는 Bc12 수준의 감소를 보여주는 웨스턴 블롯의 정량을 도시하는 그래프를 보여준다. 도 1I는 절단된 카스파제3 수준의 증가를 보여주는 웨스턴 블롯의 정량을 도시하는 그래프를 보여준다. 도 1J는 LAMP-2 수준의 감소를 보여주는 웨스턴 블롯의 정량을 도시하는 그래프를 보여준다.
도 2는 BAG3의 과발현이 신생아 생쥐 심실 심근세포 (NMVCs)에서의 저산소증/재산소화와 관련된 세포자멸사 및 자가포식의 표지자들에서의 변화를 개선시켰으며 자가포식을 차단하였음을 보여준다: NMVCs들은 Ad-BAG3 또는 Adv-GFP로 3일 동안 감염되었다. 그 후 NMVC들을 저산소 조건 (3 L/분으로 5% CO2 및 95% 질소)에서 14 시간 동안 37°C에서 노출시킨 다음, 4 시간 동안 5% CO2 및 95% 가습 대기로 재산소화시키거나 정상 산소 조건 (5% CO2 및 95% 가습 대기) 하에서 배양하였다. 그 후 상기 세포들을 수집하고 면역탁본하였다. 각 실험은 각 실험 그룹에 n=3을 포함하였으며 별개로 실험을 3회 반복하였다. 도 2A는 정상 양의 02 및 CO2 하에서 배양된 세포들에서의 BAG3 과발현이 BAG3 수준을 증가시켰으나 (도 2B에 보이는 그래프에 도시됨) p-JNK (도 2C에 보이는 그래프에 도시됨), LAMP-2 (도 2D에 보이는 그래프에 도시됨), Bc12 (도 2E에 보이는 그래프에 도시됨), 또는 절단된 카스파제-3 (도 2F에 보이는 그래프에 도시됨)의 수준을 유의하게 변화시키지 않았음을 증명하는 3회의 별개 실험들 중 하나의 대표적인 웨스턴 블롯을 보여준다. 대조적으로, Ad-BAG3에 의한 BAG3의 과발현은 BAG3 (도 2B에 보이는 그래프에 도시됨), p-JNK, (도 2C에 보이는 그래프에 도시됨) LAMP-2, (도 2D에 보이는 그래프에 도시됨) Bc12, (도 2E에 보이는 그래프에 도시됨) 및 절단된 카스파제-3 (도 2F에 보이는 그래프에 도시됨)의 수준을 정상 산소 조건하에서 Ad-BAG3 또는 Ad-GFP로 치료받았던 NMVCs에서 관찰된 수준으로 유의하게 변화시켰다.
도 3은 자가포식 수준은 저산소증/재산소화 및 BAG3 녹다운 중에 감소되었으나 BAG3의 과발현에 의해 증가되었음을 보여준다: 자가포식은 정적인 과정이라기 보다 포식소체의 자가포식소체로, 그 후 자가리소좀으로의 지속적인 전이를 나타낸다. 그러므로, 자가포식이 BAG3의 심장 수준의 변화에 비례하여 증가 또는 감소되었는지 여부를 결정하기 위해, 이중-라벨된 mRFP-GFP-LC3-I으로 구성된 자가포식 리포터 시스템으로 NMVCs를 형질감염시켰다. RFP (적색 형광) 및 GFP (녹색 형광) 모두는 자가포식소체에서 황색 반점으로 확인될 수 있으나; 자가포식소체가 리소좀과 융합된 경우, 자가리소좀의 산성도는 GFP 형광을 소광시키며 이는 우세한 적색 반점을 생성한다. 도 3A는 황색 형광이 H/R 처리되었거나 siBAG3로 감염되었던 NMVCs에서 더욱 우세하였던 공초점 이미지를 보여준다. 대조적으로, RFP 신호들은 Ad-BAG3으로 처리된 세포들에서 더욱 우세하였으며, 이는 LC3의 자가리소좀으로의 혼입 증가가 자가포식 수준의 증가와 일치함을 제시하는 것이다. 도 3B는 도 3A의 이미지들의 정량 분석을 도시하는 그래프이다. 각 그룹에서 (대조, H/R, siBAG3 및 H/R + Ad-BAG3) 황색 및 적색 반점의 수를 계수함으로써 공초점 이미지들의 객관적 평가를 확인하였다. 도 3C는 자가포식의 양을 결정하기 위하여 자가리소좀 (적색 반점)/자가포식소체 (황색 반점)/전체 반점의 비율을 비교하는 그래프이다. 도 3C는 상기 비율이 H/R 후 유의하게 감소되었음을 보여주며, 이러한 변화는 Ad-BAG3에 의한 BAG3의 과발현에 의해 둔화된 것으로, 이는 H/R 및 BAG3의 수준 감소 모두가 자가포식을 차단하는 반면, BAG3 과발현은 자가포식의 수준을 회복시켰음을 제시하는 것이다.
도 4는 BAG3 수준이 저산소증/재산소화 (I/R)에 의해 감소된 후 또는 Ad-siBAG3 감염에 의한 녹다운 후 BAG3가 신생아 생쥐 심실 심근세포 (NMVC)에서 핵으로 전위됨을 보여준다. 도 4A는 H/R 또는 Ad-siBAG3로 BAG3 녹다운 처리된 NMVCs의 대표적인 공초점 이미지들을 보여준다. NMVCs들을 정상 조건 (CTRL), 저산소 조건 (3 L/분으로 5% CO2 및 95% 질소)하에 37°C에서 14시간 동안 배양한 후, 5% CO2 및 95% 가습 대기(HR)로 4시간 동안 재산소화시키거나, 또는 Ad-siBAG3로 감염시켰다. 그 후 심근세포들을 고정시키고 BAG3 항체, α-액티닌 항체 또는 핵 대비-염색 4',6-다이아미디노-2-페닐인돌 (DAPI)로 염색하였다. 최소 10개 세포들을 각 실험으로부터 계수하였으며 각 실험을 3회 반복하였다. 도 4B는 저산소증/재산소화 (I/R) 하에서 또는 Ad-siBAG3 감염에 의한 녹다운 후 세포액과 핵 분획들의 BAG3 수준에 관한 면역탁본 분석을 보여준다. NMVCs들을 Ad-siBAG3 또는 Ad-GFP로 하룻밤 동안 감염시켰으며, 배지를 바꾸고 세포들을 정상 조건하에서 3일의 기간 동안 배양하였다. 그 후 세포들을 무작위 배정하여, 저산소 조건 (3 L/분으로 5% CO2 및 95% 질소)하에서 37°C 에서 14 시간 동안 배양한 후, 5% CO2 및 95% 가습 대기로 4시간 동안 재산소화시키거나 또는 정상 산소 조건하에서 배양시켰다. 그 후 근육세포들을 수집하여 단계식 세포 용해 및 핵과 세포질 단백질 분획들의 원심 분리를 사용하여 세포질 및 핵 분획들을 분리하였다. 단백질 분획들을 SDS-Page로 분리하고 막에 이식하였다. 이후 이들을 BAG3, p-튜불린 또는 히스톤 항체로 면역탁본하였다. 도 4C는 Ad-GFP 또는 Ad-BAG3에 노출된 후 저산소증-재산소화 또는 정상 산소 조건에 노출된 세포들의 핵 추출물 또는 세포질 추출물에서 BAG3의 수준을 평가하는 3회 독립 실험들의 정량 분석을 도시하는 그래프를 보여준다. 데이터를 평균 ± SEM로 표현하였으며 다중 비교를 위한 본페로니 보정을 수반하는 양방향 ANOVA를 사용하여 분석하였다. p값 < 0.05를 유의한 것으로 간주하였다.
도 5는 생쥐들에서 허혈/재관류 후 BAG3의 과발현이 심장 기능을 보존하였으며 경색 크기를 한정하였음을 보여준다. 8 내지 10주령의 수컷 야생형 FVB 생쥐들에게 거대세포바이러스 (CMV) 프로모터 (rAAV9-BAG3)의 제어하에 BAG3를 함유하는 아데노-관련 바이러스 혈청형 9 (AAV9)를 안와 정맥총을 통해 주사하였다. 3주 후 좌측 전방 하행 관상동맥을 30분 동안 폐쇄한 후 72시간 재관류시켰다. 재관류 종료시 심장초음파검사로 심장 기능을 측정하였다. 도 5A는 AAV9-GFP를 주사한 야생형 FVB 생쥐의 LV 단축, AAV9-GFP를 주사한 생쥐에서 I/R 후 72시간시 에코 및 AAV9-BAG3를 주사한 생쥐에서 I/R 후 72시간 시 에코를 보여주는 대표적인 M-방식 심장초음파사진을 보여준다. 도 5B는 AAV9-BAG3 또는 AAV9-GFP를 주사한 후 72시간 동안 재관류한 생쥐들에서 심장초음파검사로 측정한 좌심실 박출률 (LVEF)을 보여준다. 도 5C는 I/R 후 AAV9-BAG3 또는 AAV9-GFP를 주사한 생쥐들의 심근 BAG3 수준을 보여준다. 도 5D는 다음에서 얻은 대표적인 에반스 블루/트라이페닐테트라졸리움 염색된 횡단면을 보여준다: 허위 수술 생쥐, I/R 이전 rAAV-GFP를 주사한 생쥐; 및 I/R 전 rAAV9-BAG3을 주사한 생쥐. 에반스 블루 염색된 부위는 위험하지 않은 심실 부위를 나타내고; TTC-음성 부위는 경색 부위를 나타내지만 위험 부위 (AAR)는 TTC-음성 부위 및 TTC-양성 부위 모두를 포함한다. 위험 부위 (AAR)는 전체 LV의 퍼센트로 표현되나 경색 부위는 AAR의 퍼센트로 표현된다. 도 5E는 AAV9-GFP 또는 AAV9-BAG3 그리고 후속 I/R 후 생쥐들의 위험 부위 (AAR/LV)의 정량적 평가를 보여준다. 도 5F는 I/R 3주 전 AAV9-GFP 또는 AAV9-BAG3를 주사한 생쥐들의 경색 크기를 보여주며, AAV9-BAG3을 주사한 그룹에서 경색 크기의 유의한 감소를 입증한다.
도 6은 허혈/재관류 중인 생쥐들에서 BAG3의 과발현이 세포자멸사 및 자가포식의 표지자 변화를 개선시킴을 보여준다. 도 6A는 I/R 3주 전 안와 정맥총에 rAAV9-GFP 또는 rAAV9-BAG3를 주사했던 야생형 생쥐들의 경계 구역으로부터 얻은 조직에서의 생물표지자에 관한 대표적인 웨스턴 블롯을 보여주며, NMVCs의 Ad-BAG3 처리 후 관찰되었던 웨스턴 블롯과 일치하는 변화를 보여준다. 도 6B는 I/R 전 rAAV9-GFP 또는 rAAV9-BAG3으로 주사한 생쥐들의, Bc12에 대한 웨스턴 블롯 (GFP에 대한 n=5 이고 BAG3에 대한 n=4) 정량을 도시하는 그래프를 보여준다. 도 6C는 I/R 전 rAAV9-GFP 또는 rAAV9-BAG3으로 주사한 생쥐들의, 절단된 카스파제-3에 대한 웨스턴 블롯 (GFP에 대한 n=5 이고 BAG3에 대한 n=4) 정량을 도시하는 그래프를 보여준다. 도 6D는 I/R 전 rAAV9-GFP 또는 rAAV9-BAG3으로 주사한 생쥐들의, LAMP-2에 대한 웨스턴 블롯 (GFP에 대한 n=5 이고 BAG3에 대한 n=4) 정량을 도시하는 그래프를 보여준다. 도 6E는 I/R 전 rAAV9-GFP 또는 rAAV9-BAG3으로 주사한 생쥐들의, p-JNK에 대한 웨스턴 블롯 (GFP에 대한 n=5 이고 BAG3에 대한 n=4) 정량을 도시하는 그래프를 보여준다.

상세한 설명

바람직한 구체예들에 관한 본 설명은 본 발명의 전체적인 기재의 일부로 간주되는 첨부한 도면과 함께 읽어야 한다. 도시된 도면들은 반드시 일정한 축척을 갖는 것은 아니며 본 발명의 특정한 특징들은 명료함과 간결함을 위해 축척으로 또는 어느 정도 도식적인 형태로 과장되어 도시될 수 있다. 상세한 설명에서, 상대어들, 가령, "수평", "수직", "위", "아래", "상부" 및 "하부", 그리고 이의 유래어들 (예컨대, "수평으로", "아래쪽으로", "위쪽으로" 등)은 기재된 바와 같은 또는 논의 중인 도면에 도시된 바와 같은 방향을 지칭하는 것으로 해석되어야 한다. 이러한 상대어들은 설명의 편의를 위한 것이며 통상적으로 특정 방향을 필요로 하는 것을 의도한 것은 아니다. "안쪽으로" 대 "바깥쪽으로," "세로방향으로" 대 "가로방향으로" 등을 비롯한 용어들은 적절하게 서로에 상대적으로 또는 연신축 또는 회전축 또는 회전중심에 상대적으로 해석되어야 한다. 부착, 커플링 등에 관한 용어들, 가령, "연결된" 그리고 "상호연결된"은, 달리 명확하게 기재되지 않는 한, 구조들이 중개 구조를 통해 직접 또는 간접적으로 서로에게 단단한 또는 서로에 부착된 관계, 뿐만 아니라 이동가능한 또는 견고한 부착 또는 관계 모두를 지칭한다. 용어 "작동적으로 연결된"은 해당 관계에 의해 의도된 대로 작동할 수 있게 하는 부착, 커플링 또는 연결을 의미한다. 오직 하나의 기기를 설명할 때, 용어 "기기"는 또한 본 명세서에서 논의된 하나 이상의 방법론들을 수행하기 위한 일련의 (또는 복수의 일련의)의 지침들을 개별적으로 또는 공동으로 수행하는 기기들의 집합을 포함하기 위해 사용되어야 한다. 청구항에서, 기능식 청구항들이 사용되는 경우, 이들은 구조적 균등물 뿐만 아니라 균등 구조들을 비롯하여, 언급된 기능을 수행하기 위한 기재 또는 도면에 의해 기재된, 제시된, 또는 자명해지는 구조들을 포함하는 것으로 한다.

본 발명은 Bc12-관련 아타노겐3 (BAG3)의 과발현이 재관류 손상으로부터 심장을 보호하였다는 우리의 소견에 일부 기초한 것이다. 우리는 신생아 생쥐 심실 근육세포 (NMVMs)에서의 저산소증/재산소화 (H/R)의 시험관내 모델 그리고 성체 생쥐들에서의 허혈/재관류 (I/R)의 생체내 모델 모두를 사용하였다. 우리는 저산소증/ 재산소화 (H/R) 및 허혈/재관류 (I/R)가 BAG3의 수준 감소와 관련되어 있으며 I/R 전 생쥐들에서 BAG3의 과발현이 경색 크기를 유의하게 감소시켰고 좌 심실 (LV) 기능을 유의하게 개선시켰음을 발견하였다.

더욱 구체적으로, 우리는 BAG3의 수준이 신생아 생쥐 심실 심근세포 (NMVCs)에서 저산소증/ 재산소화 (H/R) 그리고 생쥐들의 심실 심근의 경색 경계 구역에서 허혈/재관류 (I/R) 모두 이후 실질적으로 감소되었음을 발견하였다. H/R 이후 NMVCs에서 그리고 I/R 후 생쥐 심장 근육에서 BAG3의 수준 감소는 절단된 카스파제 2의 수준 증가 및 Bc12와 LAMP-2의 수준 감소를 비롯하여 자가포식 및/또는 세포자멸사의 표지자 수준 변화와 관련되어 있었다. 우리는 또한 NMVCs의 siRNA (siBAG3)를 이용한 BAG3 녹다운이 H/R 후 NMVCs에서 나타났던 정확히 거울형인 세포자멸사/자가포식 생물표지자 표현형을 생성하였음을 발견하였다. 우리는 또한 NMVCs에서 아데노-바이러스 (Ad-BAG3)에 의한 BAG3의 과발현이 H/R 후 세포자멸사 및 자가포식에 관한 생물표지자 변화를 정상화시켰음도 발견하였다. 또한, CMV 프로모터의 제어하에 BAG3에 커플된 아데노-관련 바이러스 혈청형 9 (rAAV9-BAG3)가 좌심실 (LV) 기능을 유의하게 향상시켰으며 생쥐에서 I/R 후 경색 크기를 감소시켰던 반면, NMVCs에서 나타났던 것과 비슷하게 자가포식 및 세포자멸사에 관한 생물표지자 수준을 변형시켰다. 이러한 결과는 BAG3의 정상 수준이 저산소증/허혈 및 재관류 부하 동안 심장 항상성을 유지함에 필요함을 제시하였다.

따라서, 본 출원은 BAG3 수준을 증가시키는 하나 이상의 물질들을 포함하는 조성물 뿐만 아니라 허혈/ 재관류 손상 위험이 있는 또는 이에 의해 영향을 받는 조직에서 BAG3 수준을 증가시키는 물질들의 제약학적 제제를 특징으로 한다. 또한 허혈/재관류 손상 위험이 있거나 이를 앓고 있는 환자에게 상기 조성물을 투여하는 방법을 특징으로 한다. 본 명세서에 기재된 치료 방법들은 다른 치료들, 예를 들어, 약물 치료 또는 의학 장치들과 함께 실시될 수 있다.

조성물

Bc12-관련 아타노겐3 (BAG3)는 심장, 골격근에서 그리고 많은 암에서 풍부하게 존재하는 575개 아미노산 단백질이다. BAG3은 열충격 단백질 군 구성원들과 함께 단백질 품질 관리를 조절하기 위한 보조-샤페론으로서 기능하며, Bc12와 상호작용하여 세포자멸사를 억제하고, 그리고 액틴 캡핑 단백질 베타-1 (CapZβ과의 결합을 통해 Z-디스크와 섬유들을 연결함으로써 근섬유분절의 구조적 완전성을 유지시킨다.

BAG3는 심장 항상성을 유지함에 일정한 역할을 한다. 생쥐들에서 BAG3의 동형접합 결실은 심각한 LV 기능이상, 근육원섬유 해체 및 4주령시 사망을 초래하였으며; 어린이에서 하나의 대립유전자 돌연변이는 점진적인 사지 및 축방향 근육 쇠약, 심각한 호흡기능 부전 및 심근병증과 관련되어 있었다. BAG3에서의 결실은 말초 근육 쇠약 또는 신경학적 합병증과 독립적으로 박출률 (HFrEF) 감소와 함께 심부전과 연관되어 왔으며; BAG3 수준은 LAD 폐색에 부차적인 HFrEF 생쥐 및 돼지들에서 그리고 말기 HFrEF 환자들에서 감소되었다. 신생아 근육세포에서 BAG3의 녹다운은 이들 세포들이 연신되었을 때 근육원섬유 무질서(disarray)를 초래하였다. 성체 근육세포에서, BAG3는 근섬유막 및 t-세관들에 국부화되어 있었으며 여기서 이것은 131-아드레날린 수용체 및 L-형 Ca²⁺ 채널과의 특이적 상호작용을 통해 근육세포 수축 및 활동 전위 기간을 조절한다.

BAG3에서의 단일 뉴클레오티드 다형태 및 근육원섬유 근육병증 환자들은 미토콘드리아 구조의 이상을 보유할 수 있다. 우리는 최근 BAG3가 자가포식-리소좀 경로를 통해 그리고 미토콘드리아와의 직접 상호작용을 통해 손상된 미토콘드리아의 제거를 촉진시켰음을 발견하였다. 대조적으로, BAG3 녹다운은 손상된 미토콘드리아를 축적시키고 세포자멸사를 증가시키는 자가포식 유동을 유의하게 감소시켰다.

MFM6; Bcl-2-결합 단백질 비스; CAIR-1; 도킹단백질 CAIR-1; BAG 군 분자 샤페론 조절자 3; BAG-3; BCL2-결합 아타노겐 3; 또는 BIS로도 공지되어 있는 BAG3는, HSP 70에 결합하기 위해 Hip-1과 경쟁하는 폴리펩티드이다. BAG3에 관한 NCBI 참조 아미노산 서열은 Genbank에서 승인 번호 NP 004272.2; Public GI:14043024로 찾을 수 있다. 우리는 Genbank 승인 번호 NP 004272.2; Public GI:14043024의 아미노산 서열을 서열 번호: 1로 지칭한다. BAG3에 대한 NCBI 참조 핵산 서열은 Genbank에서 승인 번호 NM 004281.3 GI:62530382로 찾을 수 있다. 우리는 Genbank 승인 번호 NM 004281.3 GI:62530382의 핵산 서열을 서열 번호: 2로 지칭한다. 다른 BAG3 아미노산 서열들에는, 예를 들어, 제한 없이, 095817.3 GI:12643665 (서열 번호: 3); EAW49383.1 GI:119569768 (서열 번호: 4); EAW49382.1 GI:119569767(서열 번호: 5); 및 CAE55998.1 GI:38502170 (서열 번호: 6)이 포함된다. 본 발명의 BAG3 폴리펩티드는 기능성을 보유하는 한, 본 명세서에 기재된 폴리펩티드의 변이체가 될 수 있다.

본 출원은 허혈/ 재관류 손상 위험이 있거나 이에 의해 영향을 받은 조직에서 BAG3 수준을 증가시키는 물질들을 제공한다. 우리는 통계적으로 유의한 양만큼의 BAG3의 수준 증가를 일반적으로 의미하기 위해 용어 "증가된", "증가하다" 또는 "상향 조절된"을 사용할 수 있다. 일부 구체예들에서, 대조 샘플 또는 기준 수준과 비교시 최소한 10% 증가, 예를 들어, 최소한 약 20%, 또는 최소한 약 30%, 또는 최소한 약 40%, 또는 최소한 약 50%, 또는 최소한 약 60%, 또는 최소한 약 70%, 또는 최소한 약 80%, 또는 최소한 약 90% 증가 또는 100%를 포함한 최대 100% 증가 또는 기준 수준과 비교시 10-100% 사이의 증가, 또는 기준 수준과 비교시 최소한 약 0.5-배, 또는 최소한 약 1.0-배, 또는 최소한 약 1.2-배, 또는 최소한 약 1.5-배, 또는 최소한 약 2-배, 또는 최소한 약 3-배, 또는 최소한 약 4-배, 또는 최소한 약 5-배 또는 최소한 약 10-배 증가, 또는 1.0-배와 10-배 사이 또는 그 이상의 증가일 수 있다.

대조 샘플은 기준 샘플이 될 수 있다. 기준 샘플은 하나 이상의 이전 시점들에서 대상체로부터 얻은 샘플일 수 있다. 대안적으로, 또는 추가로, 기준 샘플은 보다 큰 개체 모집단으로부터 유래한 BAG3 수준의 표준 기준 수준이 될 수 있다. 기준 모집단은 대상체와 유사한 연령, 신체 크기, 인종 배경 또는 일반 건강을 가진 개체들을 포함할 수 있다. 그러므로, BAG3의 수준들은 건강한 개체들, 즉, 허혈/ 재관류 손상을 앓고 있지 않은 또는 허혈/ 재관류 손상 위험이 없는 개체들로부터 유래된 값들과 비교될 수 있다. 기준 샘플은 또한 허혈/ 재관류 손상으로부터 회복되었던 개체들의 모집단으로부터 얻은 샘플이 될 수도 있다. 개체들의 모집단은 허혈/ 재관류 손상, 예컨대, 심근 경색증 또는 뇌졸중을 초래하는 유사한 장애를 보유한 개체들을 포함할 수 있다.

핵산

허혈/ 재관류 손상 위험이 있는 또는 이에 의해 영향을 받은 조직에서 BAG3 수준을 증가시키는 물질은 BAG3 폴리펩티드 또는 이의 단편을 인코딩하는 핵산일 수 있다. 우리는 cDNA, 유전체 DNA, 합성 DNA, 및 핵산 유사체를 내포하는 DNA (또는 RNA)를 비롯한 RNA와 DNA 모두를 지칭하기 위해 용어 "핵산" 및 "폴리뉴클레오티드"를 호환적으로 사용할 수 있으며, 이들은 본 발명의 폴리펩티드를 인코딩할 수 있고 이들 모두는 본 발명에 포함된다. 폴리뉴클레오티드는 본질적으로 임의의 3차원 구조를 가질 수 있다. 핵산은 이중 가닥 또는 단일-가닥 (즉, 센스 가닥 또는 안티센스 가닥)일 수 있다. 폴리뉴클레오티드들의 비-제한적 예들에는, 유전자, 유전자 단편, 엑손, 인트론, 전령 RNA (mRNA) 및 이의 일부분, 전달 RNA, 리보솜 RNA, siRNA, 마이크로-RNA, 리보자임, cDNA, 재조합 폴리뉴클레오티드, 분지형 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 벡터, 임의의 서열의 단리된 DNA, 임의의 서열의 단리된 RNA, 핵산 프로브, 및 프라이머, 뿐만 아니라 핵산 유사체가 포함된다. 본 발명의 내용에서, 핵산은 자연 발생 BAG3의 단편 또는 이의 생물학적 활성 변이체를 인코드할 수 있다.

"단리된" 핵산은, 예를 들어, 자연 발생 유전체에서 해당 DNA 분자의 바로 옆에 연접되어 정상적으로 발견되는 핵산 서열들 중 최소한 하나가 제거되거나 결여된, 자연 발생 DNA 분자 또는 이의 단편일 수 있다. 그러므로, 단리된 핵산에는, 제한 없이, 다른 서열들과 무관하게 별도의 분자로 존재하는 DNA 분자 (예컨대, 화학적 합성 핵산, 또는 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 또는 제한 내부핵산 가수분해 효소 처리에 의해 생성된 cDNA 또는 유전체 DNA 단편)가 포함된다. 단리된 핵산은 또한 벡터, 자가복제 플라스미드, 바이러스에, 또는 원핵생물 또는 진핵생물의 유전체 DNA에 통합되는 DNA 분자를 지칭한다. 또한, 단리된 핵산은 유전자조작 핵산, 가령, 하이브리드 또는 융합 핵산의 일부인 DNA 분자를 포함할 수 있다. 예를 들어, 유전체 DNA 제한 분해를 내포하는 cDNA 라이브러리 또는 유전체 라이브러리, 또는 겔 절편들에 속하는 많은 (예컨대, 수십, 또는 수백 내지 수백만) 다른 핵산들 중에 존재하는 핵산은 단리된 핵산이 아니다.

단리된 핵산 분자들은 표준 기술들에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 기술은 본 출원에 기재된 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열들을 비롯한, 본 출원에 기재된 뉴클레오티드 서열을 내포하는 단리된 핵산을 수득하기 위하여 사용될 수 있다. PCR은 전체 유전체 DNA 또는 전체 세포 RNA로부터의 서열들을 비롯한, DNA 뿐만 아니라 RNA로부터의 특정 서열들을 증폭시키기 위해 사용될 수 있다. 다양한 PCR 방법들은, 예를 들면, 1995년 Cold Spring Harbor Laboratory 출판, Dieffenbach 및 Dveksler, eds.의 문헌 PCR Primer: A Laboratory Manual 에 기재되어 있다. 일반적으로, 관심 영역의 단부 또는 그 이상으로부터 얻은 서열 정보는 증폭될 주형의 반대 가닥들과 서열이 동일하거나 유사한 올리고뉴클레오티드 프라이머들을 설계하기 위해 사용된다. 부위-특이적 뉴클레오티드 서열 변형들을 주형 핵산 내부로 도입시킬 수 있는 다양한 PCR 전략들 또한 가능하다.

단리된 핵산은 또한 단일 핵산 분자 (예컨대, 포스포라미다이트 기술을 사용하는 3'에서 5' 방향으로의 자동화된 DNA 합성을 사용함)로서 또는 일련의 올리고뉴클레오티드들로서 화학적으로 합성될 수 있다. 예를 들면, 원하는 서열을 내포하는 하나 이상의 긴 올리고뉴클레오티드들 (예컨대, >50-100개 뉴클레오티드들)의 쌍들이 합성될 수 있는데, 올리고뉴클레오티드 쌍이 어닐링 될 때 이중나선이 형성될 수 있도록 각각의 쌍은 상보성을 띠는 짧은 분절 (예컨대, 약 15개 뉴클레오티드)을 내포한다. DNA 중합효소는 올리고뉴클레오티드들을 연장시키기 위해 사용되는데, 올리고뉴클레오티드 쌍 당 하나의 이중-가닥 핵산 분자가 생성되며, 이러한 핵산은 그 후 벡터 내부로 결찰될 수 있다. 본 발명의 단리된 핵산은 또한, 예컨대, (예를 들면, 상기 구조에 따른) BAG3-인코딩 DNA 중 자연 발생 부분의 돌연변이유발에 의해 수득될 수 있다.

두 개의 핵산 또는 이들이 인코딩하는 폴리펩티드는 서로에 대한 특정 정도의 동일성을 가지는 것으로 설명될 수 있다. 예를 들면, BAG3 단백질 및 이의 생물학적 활성 변이체는 특정 정도의 동일성을 나타내는 것으로 설명될 수 있다. 정렬들은 단백질 정보 리서치 (PIR) 사이트 (http://pir.georgetown.edu)에서 짧은 BAG3 서열들의 위치를 결정한 후, NCBI 웹사이트( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast) 상에서 “short nearly identical sequences” 베이직 로컬 정렬 서치 툴 (BLAST) 알고리즘을 이용하여 분석함으로써 어셈블될 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 “서열 동일성 퍼센트”는 임의의 주어진 문의 서열과 대상 서열 간의 동일성 정도를 지칭한다. 예를 들어, 자연 발생 BAG3은 관심 서열이 될 수 있으며 BAG3 단백질의 단편은 대상 서열이 될 수 있다. 유사하게, BAG3 단백질의 단편이 관심 서열이 될 수 있고 이의 생물학적 활성 변이체가 대상 서열이 될 수 있다.

서열 동일성을 결정하기 위하여, 관심 핵산 또는 아미노산 서열은 컴퓨터 프로그램 ClustalW (버전 1.83, 기본 매개변수들)를 사용하여 각각 하나 이상의 대상 핵산 또는 아미노산 서열들에 대해 정렬될 수 있는데, 이 프로그램은, 핵산 또는 단백질 서열들 전체 길이에 걸쳐서 핵산 또는 단백질 서열들의 정렬이 이루어질 수 있게 한다 (포괄 정렬).

ClustalW는 문의 서열과 하나 이상의 대상 서열들 간의 가장 우수한 매치를 계산하고 이들을 정렬하여, 동일성, 유사성 및 차이를 결정할 수 있다. 서열 정렬을 최대화하기 위하여 하나 이상의 잔기들의 갭이 문의 서열, 대상 서열, 또는 이들 모두에 삽입될 수 있다. 핵산 서열들의 신속한 쌍 방식 정렬을 위해, 다음과 같은 기본 매개변수들이 사용된다: 글자 크기: 2; 윈도우 크기: 4; 점수화 방법: 백분율; 상부 대각선의 수: 4; 및 갭 벌점: 5. 핵산 서열의 다중 정렬을 위해, 다음과 같은 매개변수들이 사용된다: 갭 시작 벌점: 10.0; 갭 연장 벌점: 5.0; 및 가중치 변이: 있음. 단백질 서열들의 신속한 쌍 방식 정렬을 위해, 다음과 같은 기본 매개변수들이 사용된다: 글자 크기: 1; 윈도우 크기: 5; 점수화 방법: 백분율; 상부 대각선의 수: 5; 갭 벌점: 3. 단백질 서열들의 다중 정렬을 위해, 다음과 같은 매개변수들이 사용된다: 가중치 행렬: 블로섬; 갭 시작 벌점: 10.0; 갭 연장 벌점: 0.05; 친수성 갭: 온; 친수성 잔기: Gly, Pro, Ser, Asn, Asp, Gln, Glu, Arg, 및 Lys; 잔기-특이적 갭 벌점: 온. 출력결과는 서열들 간 관계를 반영하는 서열 정렬이다. ClustalW는, 예를 들어, at the Baylor College of Medicine Search Launcher 사이트 (searchlauncher.bcm.tmc.edu/multi-align/multi-align.html) 및 World Wide Web 상의 European Bioinformatics Institute 사이트 (ebi.ac.uk/clustalw)에서 실행될 수 있다.

문의 서열과 대상 서열 간의 퍼센트 동일성을 결정하기 위하여, ClustalW는 가장 우수한 정렬에서 동일성의 수를 비교되는 잔기들의 수 (갭 위치들은 제외됨)로 나누고, 그 결과에 100을 곱한다. 출력결과는 문의 서열에 대한 대상 서열의 동일성 퍼센트이다. 퍼센트 동일성 값은 가장 근사한 10분의 1까지 반올림될 수 있음을 유의하라. 예를 들어, 78.11, 78.12, 78.13, 및 78.14는 78.1로 내림되나, 78.15, 78.16, 78.17, 78.18, 및 78.19는 78.2로 올림된다.

본 명세서에 기재된 핵산 및 폴리펩티드는 "외인성"으로 지칭될 수 있다. 용어 “외인성”은 핵산 또는 폴리펩티드가 재조합 핵산 구조체의 일부이거나 재조합 핵산 구조체에 의해 인코딩되거나, 자연 환경에 존재하는 것이 아님을 나타낸다. 예를 들면, 외인성 핵산은 하나의 종으로부터 또 다른 종 내부로 도입된 서열, 즉, 이종 핵산일 수 있다. 일반적으로, 이러한 외인성 핵산은 재조합 핵산 구조체를 통해 다른 종 내부로 도입된다. 외인성 핵산은 또한 유기체 고유의(native) 그리고 그 유기체의 세포들 내부로 재도입된 서열일 수 있다. 고유 서열을 포함하는 외인성 핵산은 종종 외인성 핵산에 연결된 비-자연 서열들, 예컨대, 재조합 핵산 구조체 내 고유 서열을 연접시킨 비-고유 조절 서열들의 존재에 의해 자연 발생 서열과 구별될 수 있다. 또한, 안정하게 형질전환된 외인성 핵산은 일반적으로 고유 서열이 발견된 위치 이외의 다른 위치들에 통합된다.

재조합 구조체들 또한 본 명세서에 제공되며 BAG3를 발현하도록 세포들을 형질전환하기 위해 사용될 수 있다. 재조합 핵산 구조체는 특정 세포에서 BAG3를 발현시키기에 적합한 조절 영역에 작동적으로 연결된 BAG3 서열을 인코딩하는 핵산을 포함한다. 수많은 핵산이 특정 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드를 인코딩할 수 있음은 이해될 것이다. 유전자 코드의 축퇴성은 해당 분야에 잘 알려져있다. 많은 아미노산들에 있어서, 아미노산에 대한 코돈으로 기능하는 하나 이상의 뉴클레오티드 트리플렛이 존재한다. 예를 들면, BAG3에 대한 코딩 서열 내 코돈들은 특정 유기체에서 최적의 발현을 얻을 수 있도록 해당 유기체에 관한 적절한 코돈 바이어스 표를 사용하여 변형될 수 있다.

본 명세서에 기재된 것들과 같은 핵산들을 내포하는 벡터 또한 제공된다. "벡터"는 복제단위, 가령, 플라스미드, 파지, 또는 코스미드로서, 내부로 또 다른 DNA 분절을 삽입하여 삽입되는 분절의 복제가 일어나도록 할 수 있다. 일반적으로, 벡터는 적절한 제어 요소들과 결합시 복제가능하다. 적합한 벡터 골격들에는, 예를 들어, 해당 분야에서 통상적으로 사용되는 것들, 가령, 플라스미드, 바이러스, 인공 염색체, BACs, YACs, 또는 PACs가 포함된다. 용어 "벡터"는 클로닝 및 발현 벡터, 뿐만 아니라 바이러스 벡터 및 통합 벡터를 포함한다. "발현 벡터"는 조절 영역을 포함하는 벡터이다. 널리 다양한 숙주/발현 벡터 조합들이 본 명세서에 기재된 핵산 서열들을 발현시키기 위해 사용될 수 있다. 적합한 발현 벡터에는, 제한 없이, 예를 들어, 박테리오파지, 배큘로바이러스, 및 레트로바이러스에서 유래한 플라스미드 및 바이러스 벡터가 포함된다.

유용한 벡터에는, 예를 들어, 바이러스 벡터 (가령, 아데노바이러스 ("Ad"), 아데노-관련 바이러스 (AAV), 렌티바이러스, 및 소수포 구내염 바이러스 (VSV) 및 레트로바이러스)가 포함된다. 복제-결손 재조합 아데노바이러스 벡터 또한 사용될 수 있다. 벡터는 또한 다른 성분들 또는 유전자 전달 및/또는 유전자 발현을 추가로 조절하는 또는 표적화된 세포들에 다른 유익한 성질들을 제공하는 기능들을 포함할 수 있다. 하기 더욱 상세히 기재 및 설명하는 바와 같이, 이러한 다른 성분들은 예를 들면, 세포들에 대한 결합 또는 표적화에 영향을 주는 성분들 (세포-유형 또는 조직-특이적 결합을 매개하는 성분들을 포함; 세포에 의한 벡터 핵산의 흡수에 영향을 주는 성분들; 흡수 후 세포 내부에서 폴리뉴클레오티드의 위치선정에 영향을 주는 성분들 (가령, 핵 위치선정을 매개하는 제제들); 및 폴리뉴클레오티드의 발현에 영향을 주는 성분들을 포함한다. 이러한 성분들은 또한 표지자, 가령, 벡터에 의해 전달된 핵산을 흡수해서 발현시키는 세포들을 탐지 또는 선택하기 위해 사용될 수 있는 탐지가능한 및/또는 선택가능한 표지자를 포함할 수도 있다. 이러한 성분들은 벡터의 자연적 특성으로서 제공될 수 있고 (가령, 결합 및 흡수를 매개하는 성분들 또는 기능성들을 가지는 특정 바이러스 벡터의 사용), 또는 벡터는 이러한 기능성들을 제공하도록 변형될 수 있다. 다른 벡터들은 Chen 외; BioTechniques, 34: 167-171 (2003)에 기재된 것들을 포함한다.

"재조합 바이러스 벡터”는 하나 이상의 이종 유전자 생성물 또는 서열들을 포함하는 바이러스 벡터를 의미한다. 많은 바이러스 벡터들이 패키징과 관련한 크기-제약을 나타내기 때문에, 일반적으로 이종 유전자 생성물들 또는 서열들은 바이러스 유전체의 하나 이상의 부분들을 대체하여 도입된다. 이러한 바이러스들은 복제-결손이 될 수 있는데, 이 결손된 기능(들)은 (예컨대, 복제 및/또는 캡시드형성에 필요한 유전자 생성물들을 운반하는 패키징 세포주 또는 헬퍼 바이러스를 사용함으로써) 바이러스 복제 및 캡시드형성 중 운반되는 과정에서 (in trans) 제공될 필요가 있다. 전달될 폴리뉴클레오티드가 바이러스 입자 외부에 운반되는 변형된 바이러스 벡터들 또한 기재되어 있다.

바이러스 벡터는 폴리뉴클레오티드, 예컨대, 거대세포바이러스 (CMV) 프로모터에 작동적으로 연결된 강한 진핵생물 프로모터를 포함할 수 있다. 재조합 바이러스 벡터는 본 명세서의 하나 이상의 폴리뉴클레오티드, 바람직하게는 약 하나의 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 구체예들에서, 본 발명의 방법들에서 사용되는 바이러스 벡터의 pfu (플라크 형성 단위)는 약 10⁸ 내지 약 5x 10¹⁰ pfu이다. 폴리뉴클레오티드가 비-바이러스 벡터와 함께 투여되는 구체예들에서, 약 0.1 나노그램 내지 약 4000 마이크로그램, 예컨대, 약 1 나노그램 내지 약 100 마이크로그램의 사용이 종종 유용할 것이다.

추가 벡터들에는 레트로바이러스 벡터, 가령, Moloney 마우스 백혈병바이러스 및 HIV-계 바이러스가 포함된다. 하나의 HIV계 바이러스 벡터는 적어도 두 개의 벡터들을 포함하는데, 여기서 gag 및 pol 유전자들은 HIV 유전체로부터 온 것이고 env 유전자는 또다른 바이러스에서 온 것이다. DNA 바이러스 벡터에는 폭스 (pox) 벡터, 가령, 오르토폭스 또는 아비폭스 벡터, 헤르페스바이러스 벡터, 가령, 단순 헤르페스 I 바이러스 (HSV) 벡터가 포함된다.

폭스 바이러스 벡터는 유전자들을 세포들의 세포질 내부로 도입한다. 아비폭스 바이러스 벡터는 핵산의 단기 발현만을 생성한다. 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스 벡터 및 단순 헤르페스 바이러스 (HSV) 벡터는 일부 본 발명의 구체예들에서 나타날 수 있다. 아데노바이러스 벡터는 아데노-관련 바이러스 보다 단기의 발현 (예컨대, 약 1개월 미만)을 생성하며, 일부 구체예들에서, 훨씬 더 긴 발현을 나타낼 수 있다. 선택된 특정 벡터는 표적 세포 및 처리되는 조건에 따라 달라질 것이다. 적절한 프로모터들은 용이하게 선택될 수 있다. 적합한 프로모터의 한 예는 763개-염기-쌍의 거대세포바이러스 (CMV) 프로모터이다. 유전자 발현에 사용될 수 있는 다른 적합한 프로모터들에는, 라우스 육종바이러스 (Rous sarcomvirus, RSV), SV40 초기 프로모터 영역, 헤르페스 티미딘 키나아제 프로모터, 메탈로싸이오닌 (MMT) 유전자의 조절 서열들, 진핵생물 발현 벡터, 가령, 0-락타마제 프로모터, tac 프로모터, 효모 또는 다른 진균의 프로모터 요소들, 가령, Gal 4 프로모터, ADC (알콜 탈수소효소) 프로모터, PGK (포스포글리세롤 키나아제) 프로모터, 알칼리성 인산분해효소 프로모터; 및 조직 특이성을 나타내며 유전자삽입 동물들에서 이용되어 왔던 동물 전사 제어 영역: 이자 세엽 세포에서 활성인 엘라스타제 I 유전자 제어 영역, 이자 베타 세포에서 활성인 인슐린 유전자 제어 영역, 림프계 세포에서 활성인 면역글로불린 유전자 제어 영역, 고환, 유방, 림프구 및 비만 세포에서 활성인 생쥐 포유동물 종양 바이러스 제어 영역, 간에서 활성인 알부민 유전자 제어 영역, 간에서 활성인 알파-태아단백질 유전자 , 간에서 활성인 알파 1-항트립신 유전자 제어 영역, 수초 세포에서 활성인 베타-글로빈 유전자 제어 영역, 뇌의 희소돌기아교세포에서 활성인 수초 기본 단백질 유전자 제어 영역, 골격근에서 활성인 미오신 경쇄-2 유전자 제어 영역, 및 시상하부에서 활성인 생식샘자극 방출 호르몬 유전자 제어 영역이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 특정 단백질들은 그 고유의 프로모터를 사용하여 발현될 수 있다. 발현을 개선할 수 있는 다른 요소들, 가령, 고 수준의 발현을 가져오는 인핸서 또는 시스템, 가령, tat 유전자 및 tar 요소 또한 포함될 수 있다. 그 후 이러한 카세트는, 벡터, 예컨대, 플라스미드 벡터, 가령, pUC19, pUC118, pBR322, 또는, 예를 들어, 대장균 복제 원점을 포함하는 다른 공지의 플라스미드 벡터에 삽입될 수 있다. 플라스미드 벡터는 또한 선택적 표지자, 가령, 암피실린 내성을 위한 0-락타마제 유전자를 포함할 수도 있으며, 이러한 표지자 폴리펩티드는 처리되는 유기체의 대사에 유해하게 영향을 주지 않는다. 상기 카세트는 또한 합성 전달 시스템에서 핵산 결합 모이어티에 결합될 수 있다.

일부 구체예들에서, 전달 시스템들은 심근세포, 예를 들어, 강한 심장 친화성을 가지는 AAV 혈청형만을 선택적으로 형질도입하는 벡터를 이용한 말초 정맥내 주사를 포함할 수 있다. 경피 및 수술 기술들을 포함하는 다른 시스템들에는, 예를 들어, 관상 동맥 폐색이 있거나 없는 앞방향 관상동맥 주입; 벡터가 체외에서 산소화된 관상 정맥동 외측으로 산소첨가된 관상 정맥동으로부터의 순환으로부터 제거된 관상 동맥 내부로 주입되어 관상 동맥으로 재반환되는 밀폐형-루프 재순환; 관상 정맥동을 통한 역방향 주입; 직접 심근 주사; 말초 정맥내 주입; 및 심장막 주사가 포함된다.

일부 구체예들에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 또한 마이크로전달 비히클, 가령, 양이온성 리포좀, 다른 지질-함유 복합체, 및 폴리뉴클레오티드의 숙주 세포로의 전달을 매개할 수 있는 다른 거대분자 복합체와 함께 사용될 수 있다.

또 다른 전달 방법은 발현된 생성물들을 세포내 생성할 수 있는 단일 가닥 DNA 생성 벡터를 사용하는 것이다. 예를 들면, Chen 외, BioTechniques, 34: 167-171 (2003)를 참고하고, 이 문헌은 그 전문이 본 출원에 참고문헌으로 포함된다.

본 명세서에 제공된 벡터는 또한, 예를 들어, 복제 원점, 스캐폴드 부착 영역 (SARs), 및/또는 표지자를 포함할 수 있다. 표지자 유전자는 숙주 세포 상에 선택가능한 표현형을 부여할 수 있다. 예를 들면, 표지자는 살균제 내성, 가령, 항생제 (예컨대, 카나마이신, G418, 블레오마이신, 또는 하이그로마이신)에 대한 내성을 부여할 수 있다. 상기 논의한 바와 같이, 발현 벡터는 발현된 폴리펩티드의 조작 또는 탐지 (예컨대, 정제 또는 위치선정)을 용이하게 하도록 설계된 태그 서열을 포함할 수 있다. Tag 서열, 가령, 녹색 형광 단백질 (GFP), 글루타티온 S-전달효소 (GST), 폴리히스티딘, c-myc, 적혈구응집소, 또는 플래그TM 태그 (Kodak, New Haven, CT) 서열들은 일반적으로 인코딩된 폴리펩티드와의 융합으로서 발현된다. 이러한 태그들은 카르복실 또는 아미노 말단을 비롯한, 폴리펩티드 내부의 어디에나 삽입될 수 있다.

부가적인 발현 벡터들은 또한, 예를 들면, 염색체, 비-염색체 및 합성 DNA 서열들의 분절들도 포함할 수 있다. 적합한 벡터들에는 SV40의 유도체들 및 공지의 세균 플라스미드, 예컨대, E. 콜라이 플라스미드 col El, pCR1, pBR322, pMal-C2, pET, pGEX, pMB9 및 이들의 유도체들, 플라스미드, 가령, RP4; 파지 DNA, 예컨대, 파지 1의 수많은 유도체들, 예컨대, NM989, 및 다른 파지 DNA, 예컨대, M13 및 필라멘트형 단일 가닥 파지 DNA; 효모 플라스미드, 가령, 2μ 플라스미드 또는 이의 유도체들, 진핵 세포들에 유용한 벡터들, 가령, 곤충 또는 포유동물 세포들에 유용한 벡터들; 플라스미드 및 파지 DNA의 조합으로부터 유래된 벡터들, 가령, 파지 DNA 또는 다른 발현 제어 서열들을 이용하도록 변형되어 있는 플라스미드를 포함한다.

벡터는 또한 조절 영역을 포함할 수도 있다. 용어 “조절 영역”은 전사 또는 번역 개시와 속도, 그리고 전사 또는 번역 생성물의 안정성 및/또는 이동성에 영향을 주는 뉴클레오티드 서열들을 지칭한다. 조절 영역들은, 제한없이, 프로모터 서열, 인핸서 서열, 반응 요소, 단백질 인식 부위, 유도 요소, 단백질 결합 서열, 5' 및 3' 비번역 구역 (UTR), 전사 시작 부위, 종료 서열, 폴리아데닐화 서열, 핵 위치 신호, 및 인트론을 포함한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "작동적으로 연결된”은 핵산에서 전사될 서열 및 조절 영역을 이러한 서열의 전사 또는 번역에 영향을 주기 위해 배치하는 것을 지칭한다. 예를 들면, 코딩 서열을 프로모터의 제어하에 두기 위하여, 폴리펩티드의 번역 해독 프레임(translational reading frame)의 번역 개시 부위는 일반적으로 프로모터의 1 내지 약 50개 뉴클레오티드 하류에 배치된다. 그러나 프로모터는 번역 개시 부위의 약 5,000개 뉴클레오티드 상류에 또는 전사 시작 부위의 약 2,000개 뉴클레오티드 상류에 배치될 수 있다. 프로모터는 일반적으로 최소한 코어 (기초) 프로모터를 포함한다. 프로모터는 또한 최소한 하나의 제어 요소, 가령, 인핸서 서열, 상류 요소 또는 상류 활성화 구역 (UAR)을 포함할 수 있다. 포함시킬 프로모터들의 선택은 효율성, 선택능, 유도능, 원하는 발현 수준, 및 세포- 또는 조직-선호적 발현을 비롯한 여러 인자들에 따라 달라지지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 코딩 서열에 비추어 프로모터들과 다른 조절 구역들을 적절하게 선택하고 배치함로써 코딩 서열의 발현을 조절하는 것은 해당 분야의 숙련된 기술자에게는 관용적인 일이다.

폴리펩티드

일부 구체예들에서, 본 발명의 조성물들은 상기 기재된 임의의 핵산 서열들에 의해 인코딩되는 BAG3 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 용어 "펩티드", "폴리펩티드", 및 "단백질"은 본 명세서에서 호환적으로 사용되지만, 전형적으로 이들은 다양한 크기의 펩티드 서열들을 지칭한다. 우리는 아미노산 잔기들의 선형 폴리머들임을 전달하기 위해, 그리고 전장 단백질들과 이들을 구별함에 도움을 주기 위해 본 발명의 아미노산-기초 조성물을 "폴리펩티드"로 지칭할 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드는 BAG3의 단편을 "구성"하거나 "포함"할 수 있으며, 본 발명은 BAG3의 생물학적 활성 변이체들을 구성하거나 포함하는 폴리펩티드들을 포함한다. 그러므로 폴리펩티드는 BAG3의 단편 (또는 이의 생물학적 활성 변이체)만을 포함할 수 있으나 추가 잔기들 또한 포함할 수도 있음이 이해될 것이다. BAG3의 단편 및 BAG3의 생물학적 활성 변이체 및 이의 단편은 본 명세서에 개시된 방법들에서 기능하기에 충분한 생물학적 활성을 보유할 것이다.

아미노산 잔기들 사이의 결합들은 종래의 펩티드 결합 또는 또 다른 공유 결합 (가령, 에스터 또는 에터 결합)일 수 있으며, 폴리펩티드들은 아마이드화, 인산화 또는 당화에 의해 변형될 수 있다. 변형은 폴리펩티드 골격 및/또는 하나 이상의 측쇄에 영향을 줄 수 있다. 화학적 변형들은 폴리펩티드를 인코딩하는 mRNA의 번역 후 생체내에서 이루어지는 자연 발생 변형들 (예컨대, 세균 숙주에서 당화) 또는 시험관내에서 이루어지는 합성 변형들일 수 있다. BAG3의 생물학적 활성 변이체는 자연 발생 (즉, 생체내에서 자연적으로 이루어지는)과 합성 변형 (즉, 시험관내에서 이루어지는 자연 발생 또는 비-자연 발생 변형들)을 임의 조합하여 생성되는 하나 이상의 구조적 변형들을 포함할 수 있다. 변형의 예들에는, 아마이드화 (예컨대, C-말단의 유리 카르복실기의 아미노기에 의한 대체); 비오티닐화 (예컨대, 리신 또는 다른 반응성 아미노산 잔기들의 비오틴 분자와의 아실화); 당화 (예컨대, 아스파라긴, 하이드록시리신, 세린 또는 트레오닌 잔기에 글리코실기를 부가하여 당단백질 또는 당펩티드 생성); 아세틸화 (예컨대, 전형적으로 폴리펩티드의 N-말단에서 아세틸기의 부가); 알킬화 (예컨대, 알킬기의 부가); 아이소프레닐화 (예컨대, 아이소프레노이드기의 부가); 리포일화 (예컨대, 리포에이트 모이어티의 부착); 및 인산화 (예컨대, 세린, 티로신, 트레오닌 또는 히스티딘에 대한 포스페이트기의 부가)가 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다.

생물학적 활성 변이체에서 하나 이상의 아미노산 잔기는 비-자연 발생 아미노산 잔기일 수 있다. 자연 발생 아미노산 잔기들은 유전자 코드에 의해 자연적으로 인코딩되는 잔기들 뿐만 아니라 비-표준 아미노산들 (예컨대, L-구조 대신 D-구조를 가지는 아미노산)을 포함한다. 본 발명의 펩티드들은 또한 표준 잔기들의 변형된 형태들인 아미노산 잔기들을 포함할 수 있다 (예컨대 피로리신이 리신 대신 사용될 수 있고 셀레노시스테인이 시스테인 대신 사용될 수 있다). 비-자연 발생 아미노산 잔기들은 자연에서 발견되지 않았으나, 아미노산의 기본 구조로 정합되어 펩티드 내부로 혼입될 수 있는 잔기들이다. 이들은 D-알로이소류신(2R,3S)-2-아미노-3-메틸펜타노익 애시드 및 L-시클로펜틸 글리신 (들)-2-아미노-2-시클로펜틸 아세틱 애시드를 포함한다. 다른 예들에 관하여, 교과서 또는 월드와이드 웹을 참고할 수 있다 (현재 이 사이트는 캘리포니아 기술 연구소 (California Institute of Technology)가 관리중이며 기능적 단백질들 내부로 성공적으로 혼입되었던 비-자연 아미노산들의 구조를 보여준다).

대안적으로, 또는 부가적으로, 생물학적 활성 변이체에서 하나 이상의 아미노산 잔기는 야생형 서열에서 상응하는 위치에서 발견되는 자연 발생 잔기와 상이한 자연 발생 잔기일 수 있다. 다시 말해, 생물학적 활성 변이체들은 하나 이상의 아미노산 치환기들을 포함할 수 있다. 우리는 아미노산 잔기의 치환, 부가 또는 결실을 야생형 서열의 돌연변이로 지칭할 수 있다. 상기와 같이, 치환은 자연 발생 아미노산 잔기를 비-자연 발생 잔기 또는 단지 상이한 자연 발생 잔기로 대체할 수 있다. 또한 치환은 보존적 또는 비-보존적 치환을 구성할 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 일반적으로 다음 그룹 안에서의 치환을 포함한다: 글리신 및 알라닌; 발린, 이소류신,및 류신; 아스파르트산 및 글루탐산; 아스파라긴, 글루타민, 세린 및 트레오닌; 리신, 히스티딘 및 아르기닌; 및 페닐알라닌 및 티로신.

BAG3의 생물학적 활성 변이체인 폴리펩티드들은 그 서열이 상응하는 야생형 폴리펩티드와 유사하거나 이와 동일한 정도에 관해 특징될 수 있다. 예를 들어, 생물학적 활성 변이체의 서열은 야생형 폴리펩티드에서 상응하는 잔기와 최소한 또는 약 80% 동일할 수 있다. 예를 들어, BAG3의 생물학적 활성 변이체는 BAG3, 예를 들어, BAG3 기준 서열, 가령, 서열 번호: 2, 또는 이의 상동체 또는 이종상동체 (ortholog)에 최소한 또는 약 80% 서열 동일성 (예컨대, 최소한 또는 약 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성)을 가지는 아미노산 서열을 가질 수 있다.

BAG3 폴리펩티드의 생물학적 활성 변이체는 본 발명의 방법들에서 충분히 유용한 생물학적 활성을 보유할 것이다. 생물학적 활성 변이체들은 표적화된 DNA 절단에서 기능하기에 충분한 활성을 보유할 것이다. 생물학적 활성은 해당 분야의 숙련된 기술자들에게 공지된 방식으로 평가될 수 있으며, 이러한 방식에는, 제한 없이, 시험관내 절단 분석법 또는 기능적 분석법이 포함된다.

폴리펩티드들은, 예를 들어, 재조합 기술 또는 화학 합성을 포함하는 다양한 방법들에 의해 생성될 수 있다. 생성되면, 폴리펩티드들은 해당 분야에 널리 공지된 수단들에 의해 단리 및 원하는 정도까지 정제될 수 있다. 예를 들어, 역상 (바람직하게는) 또는 정상 상 HPLC, 또는 다당류 겔 배지, 가령, Sephadex G25 상에서 크기 배제 또는 분배 크로마토그래피 후 동결건조법이 사용할 수 있다. 최종 폴리펩티드의 조성은 표준 방법들에 의한 펩티드 분해 후 아미노산 분석에 의해, 아미노산 시퀀싱에 의해, 또는 FAB-MS 기법에 의해 확인될 수 있다. 폴리펩티드의 아미노 그룹의 산 염을 비롯한 염, 에스터, 아마이드, 및 N-아실 유도체들은 해당 분야에 공지된 방법들을 사용하여 제조될 수 있으며, 이러한 펩티드들은 본 발명과 관련하여 유용하다.

조성물이 핵산 또는 폴리펩티드로 투여되는지 여부와 관계없이, 이들은 포유동물 세포에 의한 흡수를 촉진시키는 방식으로 제형화된다. 유용한 벡터 시스템 및 제형들은 상기 기재되어 있다. 일부 구체예들에서 벡터는 특정 세포 유형에 상기 조성물을 전달할 수 있다. 본 발명은, 제한되는 것은 아니지만, 다른 DNA 전달 방법들, 가령, 예를 들면, 칼슘 포스페이트, DEAE 덱스트란, 리포좀, 리포플렉스, 계면활성제, 및 퍼플루오로 화학적 액체를 사용하는 화학적 형질감염 또한 고려되며, 물리적 전달 방법들, 가령, 전기천공, 마이크로 주사, 탄도 입자, 및 “유전자 건(gene gun)”시스템도 고려된다.

일부 구체예들에서, 허혈/ 재관류 손상 위험이 있거나 이에 의해 영향을 받는 조직에서 BAG3 수준을 증가시키는 물질은 Bc12 군을 표적으로 하는 물질일 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 물질은 프로테오좀 억제제, 예를 들어, 보르테지밉일 수 있다.

치료 방법

본 명세서에 개시된 조성물은 일반적으로 허혈/ 재관류 손상을 보유한 또는 허혈/재관류 손상 위험이 있는 대상체의 치료에 일반적으로 그리고 다양하게 유용하다. 우리는 대상체, 환자, 또는 개체를 호환적으로 지칭할 수 있다.

허혈/재관류 손상은 일반적으로 조직 손상 및/또는 사망을 가져오는 초기 허혈 발작 후 발생한다. 손상된 조직에 대한 혈액의 복원, 즉, 재관류는 모순적으로 추가 조직 손상을 가져온다. 재관류 손상의 기저 메커니즘은 아직 완전히 이해되지 않는다. 일반적으로, 허혈/재관류 손상은 최소한 다음을 포함하는 복합적인, 다요인적 현상으로 나타난다: 1) 혈류를 복구하는 동안 분자 산소를 재도입시킴으로써 공급되는 활성 산소종 (ROS)의 생성; 2) 칼슘 과부하; 3) 미토콘드리아 막 전위를 소산시키고 아데노신 트라이포스페이트 (ATP) 생성을 더욱 악화시키는 미토콘드리아 투과성 전이 공극의 개방 (MPT); 4) 내피 기능이상; 5) 전혈전유발 (prothrombogenic) 표현형의 출현; 및 6) 확연한 염증 반응.

허혈/재관류 손상은 심장, 뇌, 신장, 장, 골격근, 전립선 및 고환을 비롯한 많은 상이한 조직들에서 발생할 수 있다. 국소 손상 이외에도, 허혈/재관류는 또한 해로운 원격 효과를 유발하여, 전신 염증 반응 및 다발성 장기 기능이상 증후군을 발달시킬 수 있다. 대부분의 조직들은 탐지가능한 손상을 가져오지 않는 단기간의 허혈을 견딜 수 있다. 특정 조직이 허혈을 견딜 수 있는 시간의 길이는 세포 유형 및 장기에 따라 달라진다. 전형적으로, 허혈의 임계 기간이 초과되면, 세포 손상 및/또는 세포사가 발생한다.

특정 조직 또는 장기에서의 허혈은 해당 조직 또는 장기에 대한 혈액 공급의 손실 또는 심각한 감소에 의해 유발될 수 있다. 혈액 공급의 손실 또는 심각한 감소는, 예를 들어, 관상 죽상경화증, 혈전색전 뇌졸중, 또는 말초 혈관 질환으로 인한 것일 수 있다. 심장 근육 허혈은 전형적으로 심장 동맥 및 모세관 혈액 공급에 의한 심장 조직으로의 산소 전달 감소 또는 손실을 초래하는 죽상경화 또는 혈전 폐색에 의해 유발된다. 골격근 또는 장 평활근에서의 허혈 또한 죽상경화 또는 혈전성 폐색에 의해 유발될 수 있다.

재관류는 혈류가 감소되었거나 폐색되었던 장기 또는 조직으로의 혈류 복원이다. 혈류는 허혈 또는 저산소증에 의하여 영향받은 장기 또는 조직으로 복원될 수 있다. 재관류는 전형적으로 혈관 중재 시술, 예를 들어, 혈관성형술, 예를 들어, 풍선 혈관성형술, 또는 관상 동맥 우회술의 결과로 발생한다. 예시적인 혈관 중재 시술들은 스텐트, 혈관성형 카테터 (예컨대, 경피 혈관경유 혈관성형술), 레이저 카테터, 죽종절제 카테터, 혈관내시경 장치, 베타- 또는 감마-복사 카테터, 혈관내 초음파 장치, 회전식 죽종절제 장치, 방사능 풍선, 가열 와이어, 가열 풍선, 생분해성 스텐트 지주, 또는 생분해성 슬리브를 이용하는 시술들을 포함할 수 있다.

일부 구체예들에서, 혈류는 제약학적 물질, 예를 들어, 혈전용해 약물을 사용하여 복원될 수 있다. 일부 구체예들에서, 혈류는 중재 시술들 및 제약학적 물질들의 조합을 사용하여 복원될 수 있다.

허혈/재관류 손상 증후들은 관련 조직 또는 장기들에 따라 달라질 수 있다. 심장혈관 조직의 경우, 허혈/재관류 손상은 심근 경색증 정도의 증가, L/V 기능 손상, 수축능 기능이상 중증도의 증가, 및 부정맥 발병률 증가를 가져올 수 있다.

허혈/재관류 손상이 있는 또는 위험이 있는 환자에게 BAG3 수준을 증가시키는 조성물의 투여시 발생하는 특정 사건들을 이해하고 있다고 우리는 생각하지만, 본 발명의 조성물들은 임의의 특정 세포 기전에 영향을 미침으로써 기능하는 조성물들에 제한되지 않는다. 우리의 연구 가설은 허혈/재관류 손상이 있는 또는 위험이 있는 환자에서 BAG3 수준을 증가시키는 것은 세포자멸사를 제한하고 자가포식을 복원시킴으로써 심장 항상성을 일부분 유지시킴에 의해 조직을 손상으로부터 보호할 수 있다는 것이다.

본 명세서에 개시된 방법들은 허혈/재관류 손상을 가져올 수 있는 또는 환자를 허혈/재관류 손상 위험에 처할 수 있게 하는 질환 또는 장애의 치료에 유용하다. 이러한 장애들에는, 제한 없이, 심근경색, 심장 마비, 허혈 심장 질환 (즉, 플라크 축적으로 인한 관상 동맥의 좁아짐 및 폐색, 이는 심장에 대한 혈액 및 산소 유동 감소를 가져옴), 허혈 심장 질환으로 인한 심부전, 심장 정지, 동맥 혈류 불안정협심증감소, 뇌졸중 (예를 들어, 폐색 뇌졸중), 일과성 허혈 발작, 불안정 협심증, 대뇌 혈관 허혈, 말초 혈관 질환, 신부전, 염증 장애 (예컨대, 류마티스 관절염 또는 전신 홍반 루푸스), 머리 외상, 익사, 패혈증, 죽상경화증, 고혈압 (예컨대, 폐동맥 고혈압), 약물-유발 심장 질환, 출혈, 모세혈관 누출 증후군 (예컨대, 소아 및 성인 호흡 곤란 증후군), 다발성-장기 시스템 부전, 낮은 콜로이드 삼투압 상태 (예컨대, 기아, 신경성 식욕부진, 또는 간 부전으로 인한 것, 혈청 단백질들의 생성이 감소됨), 아나필락시스, 저체온, 한랭 손상 (예컨대, 동상), 간콩팥증후군, 진전 섬망, 장간막 기능부전, 절뚝거림, 화상, 감전사, 약물-유발 혈관확장, 약물-유발 혈관수축, 이식 후 조직 거부반응, 이식편 대 숙주 질환, 방사선 노출, 폐동맥 색전, 정맥 혈전증, 허혈 신경계 장애, 허혈 신장 질환, 또는 외상성 부상이 포함된다.

허혈/재관류 손상은 또한 혈류 및/또는 산소 유동이 방해 받거나 방해 받을 수 있는 수술로 인해 생길 수 있다. 특정 수술 절차들, 가령, 신경외과 또는 심장 수술은 허혈/재관류 손상 위험이 더 높으며, 수술 중에 기계적 수단들 (예컨대, 심장-폐 기기)를 사용한다 하여도 허혈/재관류 손상을 전적으로 예방하지 못할 수 있다. 본 명세서에 기재된 조성물들은 조직 및 장기들이 이러한 의학적 응급상황 (예컨대, 심각한 저체온 또는 저산소증) 또는 시술 (예컨대, 수술) 중에 또는 후에 경험할 수도 있는 허혈/재관류 손상을 유의하게 감소 또는 예방하기 위해 개체에게 투여될 수 있다.

그러므로, 본 명세서에 개시된 방법 및 조성물은 허혈/재관류 손상 위험이 있는 대상체, 예를 들어, 허혈/재관류 손상과 연관된 시술, 가령, 혈관 중재 시술 동안 조직에 혈류 폐색을 가져올 수 있는 시술을 받게 될 환자의 치료에 유용하다. 허혈/재관류 손상 증가 위험이 있는 대상체들은 심장혈관 또는 허혈 사건 위험이 있는 대상체들을 포함할 수 있다. 허혈/재관류 손상을 경험할 위험이 증가되는 대상체들은, 예를 들어, 흡연자, 당뇨병환자, 고혈압 또는 이상지질혈증 대상체, 관상 질환, 말초 혈관 질환, 또는 뇌혈관 질환 기록이 있는 대상체, 또는 진단 또는 치료 방사능요법 또는 화학요법 중인 대상체를 포함할 수 있다. 이러한 대상체들은 또한 신체적 무능력, 비만, 스트레스, 알콜 사용, 조악한 식단, 및 연령에 관계되는 위험 인자들이 존재할 수 있다.

대상체는 임상적으로 유익한 결과가 수반될 때는 언제나 효과적으로 치료된다. 이는, 예를 들면, 장애 증상들의 완전한 해결, 장애 증상들의 중증도 감소 또는 장애의 발달속도 저하를 의미할 수 있다. 이러한 방법들은 a) 허혈/재관류 손상이 있는 또는 이러한 위험이 있는 대상체 (예컨대, 환자 그리고, 더욱 구체적으로는, 인간 환자)를 식별하는 단계; 및 b) BAG3 수준을 증가시키는 치료적 유효량의 제약학적 조성물을 대상체에게 제공하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 대상체는 허혈/재관류 손상과 관련된 수술 절차를 필요로 하는 대상체일 수 있다. 예를 들어, 급성 심근 경색증 환자는 급성 심근 허혈 손상을 감소시키고 심근 경색증의 크기를 제한하기 위한 가장 효과적인 치료적 중재 시술이 혈전용해 치료 또는 일차 경피 관상 동맥 중재술 (PPCI)을 사용한 심근 재관류이다. 대상체는 표준 임상 검사들, 예를 들어, 혈액 검사, 흉부 x-선, 그리고 심전도 (ECG), 심장초음파사진, 스트레스 검사, CT 스캔, MRI, 또는 심장 카테터삽입을 사용하여 식별될 수 있다. 허혈/재관류 손상 증상들의 완전한 해결, 허혈/재관류 손상 증상들의 중증도 감소, 또는 허혈/재관류 손상의 진행속도 저하를 가져오는, 대상체에게 제공되는 조성물의 양이 치료적 유효량으로 간주된다. 본 발명의 방법들은 또한 투약 및 일정관리 최적화 뿐만 아니라 결과 예측에 도움을 주기 위한 모니터링 단계를 포함할 수도 있다.

상기 조성물의 투여 시간은 변화할 수 있다. 급성 허혈 사건들, 예를 들어, 심장 마비, 심폐 정지, 뇌졸중, 또는 다수의 출혈 사건의 경우, 상기 조성물은 재관류 전에 투여될 수 있다. 조성물들은, 예를 들어, 첫번째-응답자 (예컨대, 군대 의료원, 응급 구조 요원 (EMT) 또는 임의의 다른 숙련된 의료 요원)에 의해 대상체에게 볼루스로 투여될 수 있다. 볼루스 투여에 대한 대안으로 또는 이에 부가적으로, 상기 조성물은 일정 시기에 걸쳐 슬로우-드립 또는 주입으로서 투여될 수 있다. 예를 들어, 슬로우-드립 또는 주입은 외상 현장에서, 의료 시설까지 운송 중에, 및/또는 개체가 의료 시설에 도달시 투여될 수 있다. 생리학적으로, 손상 또는 외상 직후 기간이 중요하며 종종 "골든 아워 (golden hour)"로 지칭하지만, 개체에 대한 조성물의 투여는 최대 72 시간 이상 (예컨대, 최대 1 시간, 2 시간, 4 시간, 6 시간, 8 시간, 12 시간, 18 시간, 24 시간, 36 시간, 48 시간, 60 시간, 90 시간, 또는 그 이상) 동안 지속될 수 있다. 슬로우-드립 또는 주입에 대한 대안으로서, 조성물의 볼루스는, 예를 들어, 24, 48, 72 또는 90 시간의 시기에 걸쳐 복수회 투여될 수 있다.

일부 구체예들에서, 상기 조성물은 잠재적인 허혈 또는 재관류 손상이 인정되는 즉시 대상체에게 투여될 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 조성물은 재관류 치료 직전 또는 치료 중에 투여될 수 있다. 상기 투여는 재관류 치료 완료 후 지속될 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 조성물은 재관류 치료 후 투여될 수 있다. 상기 조성물은 또한 허혈/재관류 손상을 가져올 가능성이 있는 의료 시술, 예를 들어, 수술 절차에 있어서 예정되어 있는 대상체에 대한 수술전 처치의 일부로서의 시술 이전에 투여될 수 있다.

본 명세서에 개시된 방법들은 광범위한 종, 예컨대, 사람, 비-사람 영장류 (예컨대, 원숭이), 말 또는 다른 가축, 개, 고양이, 흰담비 또는, 애완동물, 쥐, 생쥐 또는 기타 실험용 동물들로 길들여진 다른 포유동물들에 사용될 수 있다.

본 발명의 방법들은 약제 조제와 관련하여 표현될 수 있다. 따라서, 본 발명은 약제 조제에 있어서 본 명세서에 기재된 물질들 및 조성물들의 사용을 포함한다. 본 명세서에 기재된 화합물들은 본 명세서에 기재된 질환 또는 병태들의 치료에 사용하기 위한 치료적 조성물 및 요법들에 또는 약제의 제조에 유용하다.

본 명세서에 기재된 임의의 조성물은 표적 세포로의 후속 전달을 위하여 숙주 몸체 일부에 투여될 수 있다. 상기 조성물은, 제한 없이, 심장, 뇌, 뇌척수액, 신장, 관절, 코 점막, 혈액, 폐, 장, 근육 조직, 피부, 전립선, 고환, 또는 포유동물의 복막강으로 전달될 수 있다. 전달 경로 면에서, 조성물은 정맥내, 두개내, 복강내, 근육내, 피하, 근육내, 직장내, 질내, 수막강내, 기관내, 진피내, 또는 경피 주사에 의해, 경구 또는 코 투여에 의해, 또는 시간 경과에 따른 점진적 관류에 의해 투여될 수 있다. 또다른 예에서, 조성물의 에어로졸 제제는 흡입에 의해 숙주에 제공될 수 있다.

필요한 용량은 투여 경로, 제제의 성질, 환자 질병의 성질, 환자의 크기, 체중, 표면적, 연령, 및 성별, 투여될 다른 약물들, 및 담당 임상의사의 판단에 따라 달라질 것이다. 다양한 세포 표적 및 다양한 투여 경로들의 상이한 효율성을 고려할 때 필요한 용량의 폭넓은 변화가 예상된다. 이러한 용량 수준의 변화는 해당 분야에서 널리 공지된, 최적화를 위한 통상의 표준 실험을 사용하여 조절될 수 있다. 투여는 단회 또는 다회 (예컨대, 2- 또는 3-, 4-, 6-, 8-, 10-, 20-, 50-, 100-, 150-, 또는 그 이상) 일 수 있다. 적합한 전달 운반체 (예컨대, 중합체 미립자 또는 이식가능한 장치들) 내 화합물들의 캡슐화는 전달의 효율성을 증가시킬 수 있다.

본 명세서에서 제공되는 임의의 조성물을 이용한 치료 기간은 1일 만큼 짧은 기간부터 숙주의 수명만큼 오랜 기간(예컨대, 수 년) 까지 임의의 길이의 시간이 될 수 있다. 예를 들면, 화합물은 5년, 10년 또는 그 이상 동안 주 1회 (예를 들면, 4주 내지 수 개월 또는 수 년간); 월 1회(예를 들면, 3 내지 12 개월간 또는 수 년간); 또는 연 1회 투여될 수 있다. 치료 빈도 또한 달라질 수 있음을 유의하라. 예를 들면, 본 발명의 화합물들은 매일, 매주, 매월 또는 매년 1회 (또는 2회, 3회 등) 투여될 수 있다.

본 명세서에서 제공되는 조성물의 유효량은 치료를 필요로 하는 개체에 투여될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "유효한"은 환자에게서 원하는 반응을 유도하면서 유의한 독성을 유발하지 않는 임의의 양을 지칭한다. 이러한 양은 공지된 양의 특정 조성물 투여 후 환자의 반응을 평가함으로써 결정될 수 있다. 또한, 존재하는 경우 독성 수준은 공지된 양의 특정 조성물 투여 전 그리고 투여 후 환자의 임상 증상들을 평가함으로써 결정될 수 있다. 환자에게 투여되는 특정 조성물의 유효량은 원하는 결과, 뿐만 아니라 환자의 반응 및 독성 수준에 따라 조절될 수 있음을 유의하라. 유의한 독성은 각 특정 환자에 있어 달라질 수 있으며, 제한없이, 환자의 질환 상태, 연령 및 유해 효과에 대한 내성을 비롯한 다수의 인자들에 따라 달라질 수 있다.

특정 반응이 유도되는지를 결정하기 위하여 해당 분야의 숙련된 기술자에게 공지된 임의의 방법이 사용될 수 있다. 반응이 유도되는지를 결정하기 위해 특정 질환 상태의 정도를 평가할 수 있는 임상적 방법들이 사용될 수 있다. 반응을 평가하는데 사용되는 특정 방법들은 환자 장애의 성질, 환자의 연령, 및 성별, 투여될 다른 약물들, 및 담당 임상의사의 판단에 따라 달라질 것이다.

상기 조성물들은 또한 다른 치료제들과 함께 투여될 수 있다. 상기 조성물은, 예를 들어, 항-염증제 (예컨대, 아스피린, 이부프로펜, 케토프로펜, 피록시캄, 인도메타신, 디클로페낙, 술린닥, 나프록센, 또는 셀레콕시브), 혈관확장제 (예컨대, 니트로글리세린), 베타 차단제 (예컨대, 알프레놀, 부신돌롤, 카르텔롤, 카르베딜롤, 나돌롤, 핀돌롤, 프로프라놀롤, 아테놀롤, 비소프롤롤, 메토프롤롤, 네비볼롤, 아세부톨롤, 베탁솔롤, 또는 부탁사민), 콜레스테롤-저하 약제 (예컨대, 스타틴, 피브레이트, 니코틴산, 담즙산 수지, 또는 콜레스테롤 흡수 억제제), 칼슘 채널 차단제 (예컨대, 로메리진 또는 베프리딜), 안지오텐신-전환 효소 (ACE) 억제제 (예컨대, 베나제프릴, 캅토프릴, 에날라프릴, 포시노프릴, 리시노프릴, 모엑시프릴, 페린도프릴, 퀴나프릴, 라미프릴, 또는 트란돌라프릴), 라놀라진, 또는 항응고제 (예컨대, 쿠마딘 또는 헤파린)를 비롯한 (그러나 이에 제한되는 것은 아님) 또 다른 치료제와 함께 투여될 수 있다. 다른 예시적인 물질들에는 아데노신, 심방 나트륨이뇨 펩티드, 아토르바스타틴, 사이클로스포린-a, 델카세르팁, 에리쓰로포이에틴, 엑세나티드, 글루코오스 인슐린 포타슘 (GIK) 치료제, 및 소듐 나이트레이트가 포함될 수 있다.

상기 조성물은 또한 수술, 가령, 혈관 중재 시술, 예를 들어, 혈관성형술, 관상 동맥 우회술, 또는 스텐트를 비롯한 다른 치료 방식과 함께 투여될 수도 있다. 상기 조성물들은 또한 의료 장치 사용과 결합하여 투여될 수도 있다. 예시적인 의료 장치들에는 좌심실 보조 장치가 포함된다.

대안적으로, 또는 부가적으로, 상기 조성물은 급성 허혈심근의 간헐적 재관류인 허혈 후-조건화 (IPost) 동안 투여될 수 있다. 다른 치료 실제에는, 제한 없이, 원격 허혈 조건화, 치료적 저체온, 및 치료적 과산소혈증이 포함된다.

상기 조성물들은 또한 생활습관 변화, 가령, 금연, 체중 감소, 신체 운동, 식이 조절, 및 알콜 섭취 감소와 함께 투여될 수도 있다.

둘 이상의 치료제의 동시 투여는 상기 치료제들이 치료 효과를 발휘하는 시기와 중첩이 존재하는 한 치료제들이 동시에 또는 동일한 경로로 투여될 것을 필요로하지 않는다. 상이한 날 또는 주에 투여시 동시 또는 순차 투여가 고려된다. 치료제는 규칙적인 요법하에, 예컨대, 치료제의 지속적인 저-용량으로 투여될 수 있다.

이러한 조성물의 용량, 독성 및 치료 효능은, 예컨대, LD₅₀ (모집단의 50%에 대한 치사 용량) 및 ED₅₀ (모집단의 50%에서 치료적으로 유효한 용량)을 결정하기 위해, 세포 배양 또는 실험 동물들에서 표준 제약학적 절차들에 의해 결정될 수 있다. 독성 및 치료 효과간의 용량 비율이 치료 지수이며 이는 LD₅₀/ED₅₀ 비율로 표현될 수 있다.

세포 배양 분석 및 동물 연구로부터 얻은 데이터는 사람에서 사용하기 위한 용량 범위를 계산하는데 사용될 수 있다. 이러한 조성물의 용량은 바람직하게는 거의 또는 전혀 독성이 없이 ED₅₀을 포함하는 순환 농도 범위에 속한다. 용량은 사용되는 투약형 및 이용되는 투여 경로에 따라 이러한 범위 안에서 달라질 수 있다. 본 발명의 방법에서 사용되는 임의의 조성물에 있어서, 치료적 유효량은 세포 배양 분석으로부터 먼저 추정될 수 있다. 용량은 세포 배양에서 결정된 IC₅₀ (즉, 증상들의 반수 최대 억제를 구현하는 테스트 화합물의 농도)을 포함하는 순환 혈장 농도 범위를 구현하기 위해 동물 모델들에서 계산될 수 있다. 이러한 정보는 사람에서 유용한 용량을 보다 정확하게 결정하기 위하여 사용될 수 있다. 혈장 내 수준은, 예를 들면, 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 측정될 수 있다.

제조 품목

본 명세서에 기재된 조성물들은, 예를 들어, 허혈/재관류 손상을 경험했던 또는 이의 위험이 있는 대상체를 치료하기 위한 치료제로서의 사용에 관해 라벨된 적합한 용기들로 포장될 수 있다. 상기 용기들은 허혈 조직에서 BAG3 수준을 증가시키는 물질을 포함하는 조성물을 포함할 수 있다.

일부 구체예들에서, 상기 물질은 BAG3 폴리펩티드 또는 이의 단편을 인코딩하는 핵산 서열, 또는 이러한 핵산을 인코딩하는 벡터, 및 의도한 용도에 적절한 하나 이상의 적합한 안정화제, 담체 분자, 착향제 등등이 될 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 물질은 BAG3 폴리펩티드 또는 이의 단편, 및 의도한 용도에 적합한 하나 이상의 적합한 안정화제, 담체 분자, 착향제 등등이 될 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 물질은 표적화된 조직에서 BAG3 발현 또는 활성을 증가시키는 물질, 및 의도한 용도에 적합한 하나 이상의 적합한 안정화제, 담체 분자, 착향제 등등이 될 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 물질은 프로테오좀 억제제, 예를 들어, 보르테지밉일 수 있다. 따라서, 포장된 제품들 (예컨대, 본 명세서에 기재된 그리고 보관, 선적, 또는 판매를 위해 농축된 또는 사용준비된 농도로 포장된 하나 이상의 조성물들을 내포하는 무균 용기들) 및 키트는 본 발명의 최소한 하나의 조성물, 예컨대, BAG3 폴리펩티드 또는 이의 단편을 인코딩하는 핵산 서열 또는 이러한 핵산을 인코딩하는 벡터를 포함한다. 제품은 본 발명의 하나 이상의 조성물을 내포하는 용기 (예컨대, 바이얼, 통, 병, 주머니 등)를 포함할 수 있다. 또한, 제조 품목은, 예를 들면, 포장재, 사용 지시사항, 주사기, 전달 장치, 완충액 또는 예방 또는 치료를 요하는 병태를 치료 또는 모니터링하기 위한 다른 제어 시약들을 추가로 포함할 수 있다.

일부 구체예들에서, 상기 키트는 하나 이상의 추가 치료제들을 포함할 수 있다. 부가 제제들이, 허혈 조직에서 BAG3 수준을 증가시키는 물질, 즉, BAG3 폴리펩티드 또는 이의 단편을 인코딩하는 핵산 서열 또는 이러한 핵산, BAG3 폴리펩티드 또는 이의 단편을 인코딩하는 벡터, 또는 BAG3 폴리펩티드 또는 이의 단편, 또는 일부 억제제 생성과 동일한 용기에 함께 포장될 수 있거나, 또는 이들은 별도로 포장될 수 있다. 허혈 조직에서 BAG3 수준을 증가시키는 물질 및 추가 물질은 사용 직전에 조합되거나 별도로 투여될 수 있다.

제품은 또한 범례 (예컨대, 제품의 사용을 설명하는 프린트된 라벨 또는 삽입물 또는 다른 매체 (예컨대, 오디오- 또는 비디오 테이프))를 포함할 수 있다. 범례가 용기와 결합될 수 있으며 (예컨대, 용기에 고정됨) 내부의 조성물이 투여되어야 하는 방식 (예컨대, 투여 빈도 및 경로), 투여에 관한 지시사항들, 및 다른 용도들을 기재할 수 있다. 조성물은 투여용으로 준비될 수 있으며 (예컨대, 적절한 용량의 단위로 제공됨) 하나 이상의 부가적인 제약학적으로 허용가능한 보조제, 담체 또는 다른 희석제 및/또는 부가적인 치료제를 포함할 수 있다.

대안적으로, 조성물은 희석액 및 희석에 관한 지시사항과 함께 농축된 형태로 제공될 수 있다.

실시예

실시예 1: 재료 및 방법

동물 프로토콜: 암컷 FVB 생쥐들 (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME)로부터 태어난지 3일 이내인 신생아 생쥐들을 얻었다. 8 내지 10주령의 수컷 FVB 생쥐 (Jackson Laboratory사)들을 30분의 관상 결찰 그리고 후속하여 기존에 설명된 바와 같이 재관류 한 후 경색 크기를 평가하기 위하여 사용하였다. 허위-수술한 (Sham-operated) 대조 동물들을 동일한 방식으로 처리하였으나, LAD는 결찰시키지 않았다. 모든 실험들을 국립 보건원의 실험 동물 관리와 사용에 관한 지침에 따라 실시하였으며 템플 대학 학회 동물 관리 및 사용 위원회 (Temple University Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았다 (ACUP#4031).

일차 신생아 생쥐 심실 근육세포 (NMVC)의 준비:

제조업자의 지시사항에 따라 Pierce Primary 심장근육세포 단리 키트 (Cat.88281, Thermo scientific, Rockford, IL)를 사용하여 1 내지 3일령의 FVB 생쥐들로부터 NMVCs들을 단리하였다. 근육세포들을 6웰 플레이트의 각 웰에 플레이트 당 2 x 10⁶ 개 세포들의 농도로 접종하고 1% 소 태아 혈청 (Denville Scientific Inc. Holliston, MA) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신 (ThermoFisher Scientific,Waltham, MA)과 함께 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM, GIBCO, CA)에서 배양하였다. 24 시간 후, 완전 배지를 37 °C 및 5% CO2에서 심장근육세포 성장 보충물을 내포하는 새로운 DMEM으로 대체하였다.

BAG3 아데노바이러스의 작제 및 사용: GFP (Ad-GFP), BAG3 (Ad-BAG3) 또는 siBAG3 (Ad-siBAG3)을 발현시키는 아데노바이러스를 BD 아데노-X 발현 시스템 2PT3674-1 및 BD 녹아웃 RNAi 시스템 PT3739 (BD Biosciences-Clontech, Palo Alto, CA)를 사용하여 기존에 설명된 바와 같이 작제하였다. 단리 48시간 후, NMVCs를 8의 감염 다중도로 아데노바이러스로 감염시켰다. NMVCs를 아데노바이러스에 하룻밤 동안 노출시킨 후 배지를 흡인시키고 새로운 배지를 가하였다. 배지를 매일 바꿔주었다. 다음으로 72시간 감염 후에 실험들을 실시하였다.

저산소증/재산소화: NMVCs를 기존에 설명된 바와 같이 변형하여 H/R 처리하였다. 요약하면, NMVCs를 가습 5% CO2: 95% N2에 14 시간 동안 37 °C에서 노출시키고 무 글루코오스 배지에서 배양하였다. 그 후 세포들을 글루코오스 함유 배지에서 5% CO2:95% 가습 대기로 4 시간 동안 재산소화시켰다. 배지를 매일 교체하였다.

면역탁본: 심장들을 절제하고 좌심실들을 경색 경계 (정점의 근위 최단 3 mm) 및 원위 구역들 (근위 중격)로 분할하였다. 조직들을 신속하게 액체 질소에 동결시키고 사용시까지 -80° C에서 보관하였다. 막 단백질들을 기존에 설명된 바와 같이 준비하였다. 요약하면, 조직들을 단백분해효소 및 인산분해효소 억제제 칵테일 (ThermoScientific; Rockford, IL)을 내포하는 완충액 (Cell Signaling Technologies 사, Beverly, MA)에서 용해시키고 Bullet 블렌더 (Next Advance사, Averill Park, NY)에서 비드와 함께 균질화시켰다. NMVCs를 얼음-저온 PBS로 헹구고, 수집하여 완충액에 용해시켰다. 13,000g으로 5분 동안 4°C에서 원심분리한 후, 상청액을 수집하고 단백질 수준을 Bradford 분석장치 (Bio-Rad, Philadelphia, PA)로 결정하였다. 동량의 단백질 (90 　μl)을 30μl의 4X NuPAGE SDS 샘플 완충액 (ThermoFisher, Carlsbad, CA, USA) 및 15μl의 10X NuPAGE 환원제 (ThermoFisher)와 함께 혼합하고, 끓이고, NuPAGE Novex 4-12% 비스-트리스 단백질 겔 (ThermoFisher) 상에서 NuPAGE 전기영동 시스템 (ThermoFisher)을 사용하여 분리하고, 니트로셀룰로오스 막 (LiCor, Lincoln, NE)으로 옮겼다. 막들을 Odyssey 차단 완충액 (LiCor)에서 1 시간 동안 실온에서 차단시킨 후 일차 항체로 하룻밤 동안 배양하였다. 막들을 1X PBS-T (0.1% Tween 20)으로 헹구고 이차 항체로 1 시간 동안 실온에서 배양하였다. 단백질 띠 신호들을 Odyssey 스캐너를 사용하여 탐지하였다. 일차 항체들은 Myc (Cell Signaling Technologies), BAG3 (Protein Tech), Bcl-2 (Cell Signaling Technologies), LAMP-2 (ThermoFisher), 절단된 카스파제-3 (Cell Signaling Technologies), JNK (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX), 포스포-JNK (Cell Signaling Technologies), 히스톤, β튜불린, 및 β액틴 (Santa Cruz Biotechnology)이었다. 이차 항체들은 다음과 같았다: 염소 항-생쥐 IRDye 800 (LiCor) 및 IRDye 680 염소 항-토끼 (Rockland, Gilbertsville, PA).

공초점 현미경검사: 성체 심근세포에서의 BAG3 국부화를 탐지하기 위해 상기한 기존에 설명된 바와 같이 공초점 현미경검사를 사용하였다. 요약하면, 신생아 생쥐 LV 심근세포들을 단리하고 라미닌-코팅된 4-웰 챔버 슬라이드 (Lab-Tek., Rochester, NY)에 도말하였다. BAG3를 일차 토끼 항체 (1:200; Proteintech Group Inc, Chicago IL)를 사용하여 식별하였으며 α-근절 액티닌은 생쥐 항체 (1:200, Sigma Ldrich)를 사용하여 식별하였다. 이차 항체는 Alexfluor 594-표지된 염소 항-토끼 항체 (1:500 Invitrogen, Eugene, OR)였으며 봉입제는 4',6-다이아미디노-2-페닐인돌 다이하이드로클로라이드 (DAPI)(벡터 Laboratories Burlingame, CA)를 함유하였다. ZEN 소프트웨어가 장착된 Carl Zeiss 710 공초점 현미경 (63x 오일 대물렌즈)을 BAG3 (594 nm ex., 667 nm em.), α-액티닌 (488 nm ex., 543 nm em.) 및 DAPI (405 nm ex., 495 nm em.) 이미지화에 사용하였다. 총 레이저 강도 및 광전자증배기 증폭을 모든 그룹들과 셋팅들에 대해 일정하게 설정하였으며 데이터를 실험 그룹에 맹검인 두 명의 독립 관찰자들이 확인하였다. 각 실험 그룹에 대해 최소 3개의 커버슬립(coverslip)들을 사용하였으며 최소한 3개의 세포 이미지들을 각 커버슬립으로부터 얻었다.

자가포식 RFP-GFP-LC3 리포터 시스템: 기존에 설명된 바와 같이, 단리된 NMVCs를 mRFP-GFP-LC3를 발현시키는 아데노바이러스로 1의 감염 다중도로 감염시켰다. NMVCs를 감염 후 24시간 후에 H/R 처리한 다음, 포스페이트 완충 식염수에서 파라포름알데하이드로 고정시켰다. PBS로 헹군 후, 세포들을 10% 정상 염소 혈청 차단 용액 (Invitogen, Life technologies corporation, Frederick. MD)에서 60 분 동안 0.3% Triton X-100으로 투과처리하였다. 커버슬립들을 Hardset 안티페이드 봉입제 (Vector Laboratories., Burlingame, Ca)와 함께 슬라이드들 위에 적재하였으며 상기한 바와 같이 공초점 이미지화를 실시하여 mRFP는 594 nm 여기 및 667 nm 방출에서 얻고 GFP는 488 nm 여기 및 543 nm 방출에서 얻었다. 디지털 이미지를 얻은 후 각 실험 그룹에서 7 내지 10개 세포들의 반점을 계수하였다. 병합된 채널에서 황색 반점의 수는 자가포식소체의 수를 나타내었다. 자가리소좀 (자가포식소체-리소좀 융합)의 수는 기존에 설명된 바와 같이 적색 반점의 수로 나타내었다.

세포 분획화: 제조업자의 지시에 따라 NMVCs의 세포질 및 핵 분획들을 NE-PER 핵 및 세포질 추출 시약 키트 (Thermo scientific, Rockford, IL, USA)를 사용하여 준비하였다. 세포질과 핵 추출물 모두를 웨스턴 블롯에 사용할 때까지 -80°C에서 보관하였다.

rAAV9-BAG3의 작제 및 투여: 거대세포바이러스 (CMV) 프로모터를 내포한 pAAV 벡터 (Vector Biolabs, Malvern, PA) 에 쥐과 myc-태그된 BAG3를 인코딩하는 서열 (NCBI 승인 #BC145765)을 삽입하였다. 그 후 구조체를 HEK293 세포들의 형질감염에 의해 AAV-9 내부에 포장하고, 바이러스 입자들을 CsC12 원심분리 (Vector Biolabs)에 의해 정제하였다. 재조합 AAV9-BAG3은 또한 녹색 형광 단백질 (GFP)을 발현시켰으나; GFP는 BAG3 서열에 존재하지 않았다. 클론의 피델리티 (fidelity) 및 최종 벡터들을 시퀀싱하여 확인하였다. MI 생쥐와 허위 (Sham) 생쥐 모두를 무작위 할당하고 37°C 의 무균 PBS에서 60-80 μl rAAV9-BAG3 (5.06.5 X 10¹³ 유전체 복제 (GC)/ml) 또는 rAAV9-GFP 대조 (3.1 x 10¹² GC/ml)를 기존에 설명된 바와 같이 안와 정맥총에 주사하여 투여하였다.

심장초음파검사: 광 진정 (2% 아이소플루레인) 후 모든 생쥐들에서 VisualSonics Vevo 770 이미지화 시스템 및 707 스캔 헤드 (Miami, FL)를 사용하여 기존에 설명된 바와 같이 전체 LV 기능을 평가하였다. 좌심실 박출률 (LVEF)을 공식 EF% = [(LVEDV ― LVESV)/LVEDV1x100을 사용하여 계산하였으며; 이 때 LVEDV 및 LVESV는 각각 좌심실 확장기말 부피 및 좌심실 수축기말 부피이다.

경색 크기의 결정: 기존에 설명된 바와 같이 경색 크기를 측정하기 위해 심근을 2% 트라이페닐테트라졸리움 (TTC)을 사용하여 염색하였다. 요약하면, I/R 72시간 후, LAD 주변의 슬립노트 (slipknot)를 다시 묶은 다음, 2% Evans Blue 염료 (0.2 ml)를 주사하였다. 심장들을 절제하고, LV를 심장의 단축에 수직인 3개의 1.2 mm 두께 절편들로 자르고 TTC 함유 PBS에서 배양하였다. 실온에서 20분 후, 절편들을 디지털 촬영하였다. Evans Blue-염색 부위 (위험하지 않은 부위), TTC-음성 부위 (경색된 심근) 및 위험 부위 (AAR; TTC-음성 및 양성 부위들 모두를 포함)들을 컴퓨터 기반 이미지 분석장치 SigmaScan Pro 5.0 (SPSS Science, Chicago, IL)으로 측정하였다. AAR은 전체 LV의 퍼센트로 표현되었으며 경색된 심근은 AAR의 퍼센트로 표현되었다. 웨스턴 블롯 분석을 위해, 경계 구역은 심장 정점으로부터 심실 3 mm 영역을 포함하였다.

통계적 분석: 데이터를 Graph Pad Prizm 6 또는 JMP 버전 12를 사용하여 분석하였다. 데이터를 연속 변수들에 대해 평균 ± SEM으로 제공한다. 본페로니 (Bonferroni) 다중 비교 조정과 함께 양 방향 ANOVA를 사용하여 조사 그룹들 전반의 차이를 평가하였다. 웨스턴 블롯 분석에 있어서, p<0.05의 p-값을 유의한 것으로 간주하였다. 각 실험에 대한 대조 (예컨대, Ad-GFP 또는 정상 산소 상태)를 1.0으로 설정하였다).

실시예 2: 저산소상태/재산소화는 NMVCs에서 BAG3 수준을 감소시킨다.

정상 산소 대조에 비해 H/R 후 NMVCs에서 BAG3 수준들은 유의하게 감소되었다 (도 1A 및 B; p<0.01). 실시예 1에 따라 NMVCs를 준비하여 배양하였다. 요약하면, NMVCs는 저산소 조건 하에서 (3 L/분으로 5% CO2 및 95% 질소) 그리고 글루코오스 없이 14 시간 동안 37°C에서 배양되었으며 이 세포들을 5% CO2 및 95% 가습 대기로 4시간 동안 글루코오스를 함유하는 배양 배지와 함께 재산소화시켰다. H/R 후 감소된 BAG3 수준들이 세포 손상에 영향을 줄 수 있는 가능한 신호전달 경로들을 조사하기 위하여, 우리는 세포자멸사 및 자가포식의 표지자를 측정하였다. 근육세포들을 수집하고 세포 용해물들을 BAG3, 절단된-카스파제-3, Bcl-2, 및 LAMP2의 수준을 결정하기 위해 면역탁본하였다. β액틴은 웨스턴 블롯 상에 부하되는 단백질의 양에 대한 대조군으로 기능하였다. 각 실험은 3번의 독립 시험으로 반복되었으며 각 실험에서 n=3이었다. 도 1에서 보는 바와 같이, 정상 산소 대조에 비해 Bcl-2 (도 1C; p<0.01) 및 LAMP-2 (도 1E; p<0.01) 수준들은 유의하게 감소되었던 반면, 절단된 카스파제-3 (도 1D; p<0.01) 수준들은 유의하게 증가되었다.

BAG3 수준의 감소만으로 세포자멸사 및 자가포식의 표지자 수준을 변화시킴에 충분하였는지 여부를 평가하기 위하여, 우리는 siRNA (Ad-siBAG3)를 사용하여 NMVCs에서의 내인성 BAG3를 Ad-GFP 대조로 감염된 세포들 (도 1F 및 G)과 비교하여 대략 90% 만큼 감소시켰다. NMVCs를 실시예 1에 기재된 바와 같이 Ad-siBAG3 또는 Ad-GFP (대조군)으로 3일 동안 배양중에 감염시켰으며 그 후 세포들을 수집하고 특정 항체들로 면역탁본하였다. H/R 후 NMVCs에서 관찰된 세포자멸사 및 자가포식의 표지자에서의 변화가 NMVCs에서 개괄되었으며, 여기서 BAG3 발현은 절단된 카스파제-3 수준이 증가됨에 따라 siRNA에 의해 감소되었던 반면 (도 1H; p<0.01), Bc12 (도 11; p<0.01) 및 LAMP-2 (도 1J; p<0.01)의 수준들은 Ad-GFP 대조에 노출된 세포들과 비교하여 유의하게 감소되었다.

실시예 3: BAG3 과발현은 자가포식 및 세포자멸사의 표지자에 있어서의 변화를 개선한다

상기 실시예 1에 기재한 바와 같이 NMVCs들을 준비하여, H/R에 노출시키고, 수집한 다음, 면역탁본하였다. 도 2A 및 2B에서 보는 바와 같이, 평가 3일 전 Ad-BAG3을 이용한 NMVCs의 감염은 Ad-GFP로 감염된 NMVC의 감염과 비교하여 BAG3 수준을 보통으로 증가시켰다 (p< 0.01). 유사하게, 도 2A 및 2B에서 보는 바와 같이, Ad-BAG3은 H/R에 노출되었던 근육세포에서 BAG3 수준을 실질적으로 증가시켰다 (p<0.05). 도 2A 및 2C 내지 2F에서 보는 바와 같이, Ad-BAG3는 정상 조건하에 배양된 NMVC에서 JNK 활성화 또는 절단된 카스파제-3, Bc12 및 LAMP-2의 수준에 영향을 미치지 않았다. 대조적으로, 도 2A 및 2C 내지 2F에서 보는 바와 같이, H/R 3일 전 Ad-BAG3을 투여받은 NMVCs는 Ad-GFP로 감염된 대조 NMVCs에 비해 p-JNK (p<0.05) 및 절단된 카스파제-3 (p<0.05)의 수준이 유의하게 더 낮았으며 Bc12 (p<0.05) 및 LAMP-2 (p<0.01)의 수준은 증가되었다.

실시예 4: BAG3는 심장근육세포 자가포식을 조절한다

자가포식의 표지자에 있어서의 변화가 H/R 후 자가포식의 양의 실제 변화를 나타내었는지 여부를 결정하기 위해, 상기 실시예 1에 기재된 바와 같이, BAG3 수준들을 Ad-BAG3 또는 Ad-siBAG3로 조작한 NMVCs를 이중-표지된 RFP-GFP-LC3-I 자가포식 리포터 시스템으로 형질감염시킨 다음 H/R에 노출시켰다. 이러한 시스템은, LC3-I을 그 지질화 LC3-II 형태로 전환시키는 유비퀴틴-유사 시스템에 의해 LC3-I이 번역후 변형된다는 사실을 이용한다. LC3-II는 자가리소좀 내부에 격리되고 여기서 이것은 분해되거나 재순환된다. LC3 반점은 자가포식소체에서 녹색 및 적색 모두로 형광된다. 그러나 자가리소좀의 산성 환경에서, GFP 형광은 소광되고 우세하게 적색 반점을 남긴다. 그러므로, 황색 반점은 GFP (녹색) 및 RFP (적색)의 형광 조합을 나타내어 자가포식소체의 존재를 반영하는 반면 적색 반점은 RFP만을 나타낸다. 정상 포식소체-리소좀 융합물에서, 황색 형광 보다 많은 적색 형광이 존재하게 될 것이나, 포식소체-리소좀 융합의 감소로 자가포식이 방해받는 경우, 황색 형광이 우세하다. 도 3A의 공초점 이미지들에서 보는 바와 같이, H/R을 거쳤던 또는 siBAG3로 감염되었던 NMVCs에서 황색 형광이 더 우세하였다. 대조적으로, RFP 신호들이 더 우세하였으며, 이는 자가리소좀 내부로의 LC3 혼입이 증가하였음을 제시하는 것이다. 각 그룹에서 (대조, H/R, siBAG3 및 H/R+ Ad-BAG3: 도 3B) 황색 및 적색 반점의 수를 계수함으로써 공초점 이미지들의 객관적 평가를 확인하였다. 또한, Ad-BAG3에 의한 BAG3의 과발현에 의해 약화되었던 변화, 즉, 자가리소좀 (적색 반점)/자가포식소체 (황색 반점)/계수된 세포들의 수의 비율은 H/R 후 유의하게 감소되었으며, 이는 H/R 및 BAG3 수준의 감소 모두는 자가포식의 양을 감소시켰으나 BAG3 과발현은 자가포식의 대조 수준을 회복시켰음을 제시하는 것이다 (도 3C).

실시예 5: BAG3는 저산소상태/재산소화의 부하 동안 핵막 및 핵 영역으로 전이한다.

정상 조건 하에서, 공초점 이미지는 우리의 이전 관찰결과와 일관되게 BAG3가 신생아 심근세포의 세포질에서 우세하게 발견되었음을 입증하였다. 그러나, 도 4A에서 보는 바와 같이, NMVCs가 H/R에 노출되었을 때, BAG3는 핵막 영역에서 그리고 핵에서 우세하게 발견되었다. 도 4A에서 보는 바와 같이, 정상 산소 NMVCs에서 siRNA에 의한 BAG3 녹다운 (Knocking down)은 또한 BAG3를 핵막 영역 및 핵으로 전이시켰다. 세포 분획화 연구는 공초점 현미경검사에 의한 형태학적 소견을 확인시켜 주었는데, H/R 후 또는 BAG3가 siRNA를 이용하여 녹다운 된 후 세포액 분획에서 BAG3는 감소하였으나 핵 분획에서 BAG3는 증가하였기 때문이다 (도 4B 및 4C). 도 4B에서 보는 바와 같이, 세포액 추출물에서 우세한 베타-튜불린의 존재 및 핵 분획에서 우세한 히스톤의 존재로 분획들의 특이성을 확인하였다.

실시예 6: BAG3 과발현은 생쥐들에서 허혈/재관류 (I/R) 후 좌심실 기능을 개선하였으며 경색 크기를 감소시켰다

NMVCs에서 BAG3의 연구가 생체내에서 생쥐들과 관련되어 있는지 여부를 평가하기 위하여, 우리는 CMV 프로모터의 대조하에서 myc^--태그된 BAG3를 발현시키는 rAAV9의 안와 주사 후 BAG3가 과발현되었던 심장들에서 I/R 후 심실 기능 및 경색 크기를 측정하였다. 도 5A 및 5B에서 보는 바와 같이, rAAV9-BAG3 안와 주사를 투여했던 쥐들에서 I/R 후 2일 후에 측정한 좌심실 (LV) 박출률 (EF)은 rAAV9-GFP 대조를 투여받았던 쥐들에서 보다 유의하게 컸다 (p<0.01). 신생아 근육세포에서의 결과와 일관되게, 심근 BAG3 수준들은 I/R 후 감소되었으나 rAAV9-BAG3 후 개선되었다.(도 5C) rAAV9-BAG3의 주사는 위험 부위를 변화시키지 않았으나 (도 5D 및 5E) rAAV9-GFP 주사를 투여받았던 생쥐들에서의 경색 크기에 비해 I/R 후 72시간에 경색 크기를 유의하게 (p<0.01) 감소시켰다 (도 5D 및 5F).

실시예 7: I/R 후 쥐들의 경색 경계 구역에서 BAG3 과발현은 H/R 후 NMVCs에서 나타났던 자가포식 및 세포자멸사 표지자에서의 변화를 요약하였다

rAAV9-BAG3를 투여받았던 생쥐의 심장에서는 관찰되었으나 rAAV9-GFP를 투여받았던 생쥐의 심장에서는 관찰되지 않았다는 결과에 의해 rAAV9-BAG3가 안와 주사 후 생쥐 심장에서 발현되었음이 나타났다 (도 6A). NMVCs에서의 결과와 일관되게, rAAV9-BAG3는 유의하게 Bc12 (p<0.01; 도 6A 및 6B) 및 LAMP-2 (p<0.01; 도 6A 및 6B)의 수준을 유의하게 증가시켰으며 절단된 카스파제-3 (p<0.01; 도 6A 및 6C) 및 p-JNK (p<0.01; 도 6A 및 6D)의 수준을 유의하게 감소시켰다.

LAMP2는 자가포식소체-리소좀 융합의 중요한 결정인자이며, Bc12는 베클린 1 (Beclin 1)과의 결합을 방해함으로써 베클린 1-관련 분류 III ptdlns3K 복합체를 활성화시킴으로써 자가포식을 자극하는 반면, 또한, BAG3의 Bc12 결합 부위에 결합할 때 세포자멸사를 제한함에 있어서 일정한 역할을 하며, 절단된 카스파제-3는 세포자멸사 실행기 동안 염색질 변연화, DNA 단편화 및 핵 붕괴를 유발하는 단백분해효소이다. 그러나, 자가포식을 측정하기 위한 생물표지자의 사용을 둘러싼 상당한 논란이 존재하였는데, 자가포식은 파고포어의 형성으로 시작하여, 상이한 세포내 출처들로부터 막을 동원하고 표적된 단백질들을 축적시키고, 그리고 마지막으로 단백질 분해 과정을 시작하기 위해 리소좀과 융합하여 자가리소좀을 형성함에 따라 파고포어의 성숙을 통해 진행되는 동적인 다단계 과정이기 때문이다.

자가포식에 대한 BAG3의 수준 감소 그리고 개선 효과 모두를 보다 잘 평가하기 위하여, 우리는 이중 표지된 미세관-관련 단백질 경쇄 3 (LC3-I)으로 구성된 자가포식 리포터 시스템을 사용하였다. 이러한 시스템은, LC3-I을 자가포식소체의 외부 및 내부 막에 고정되는 그 지질화 LC3-II 형태로 전환시키는 유비퀴틴-유사 시스템에 의해 LC3-I이 번역후 변형된다는 사실을 이용한다. LC3-II는 자가리소좀 내부에 격리되고 여기서 이것은 분해되거나 재순환된다. 상기 분석법은 LC3 반점이 자가포식소체에서 녹색 및 적색 모두로 형광한다는 사실을 이용한다. 그러나 자가리소좀의 산성 환경에서, GFP 형광은 소광되고 우세하게 적색 반점을 남긴다. 이들 연구들은 H/R 및 BAG3 녹다운 모두가 자가포식을 감소시켰으나 BAG3 과발현은 자가포식 과정을 복원시켰음을 입증하였다. 이러한 결과들은, 활성 산소종-유도된 LAMP-2의 저하에 의해 일부 매개되는 자가포식소체 제거율을 손상시킴을 입증하는 Ma 등에 의한 보다 이전의 보고와 일치하는 것이다.

BAG3 수준이 H/R 또는 I/R 동안 감소하였을 때 JNK는 활성화되었으나 (p-JNK), BAG3 수준이 NMVCs 또는 성체 심장에서 각각 Ad-BAG3 또는 rAA.V9-BAG3에 의해 증가될 때 활성화 수준은 감소하였다. JNK는 MAPK 군의 키나아제에 속하지만 전사 인자들 그리고 스캐폴드 단백질들을 포함하는 비-키나아제 기질을 인산화시킬 수 있는 MAPK들 (p-JNK, ERK1/2, 및 p38)의 그룹에 속한다는 점에서 다른 키나아제들과 구별된다. 기존의 연구들은 JNK가 허혈 후 재관류 동안 심장에서 활성화되지만 허혈만에 의해서는 활성화되지 않음을 입증한 바 있다. 더욱이, 비-근육세포들에서의 연구는 JNK의 활성화가 BAG3 유전자 발현을 개선했던 반면 JNK 억제제는 BAG3 발현을 감소시켰음을 제시한다. 그러므로, BAG3 수준이 높을 때 심장에서 JNK 활성화를 감소시키고 BAG3 수준이 낮을 때 JNK 활성화를 증가시키는 피드백 루프가 존재할 수 있다. 그러나, BAG3와 JNK 사이의 상호작용은 매우 복잡하므로, 추가 연구들이 심장에서 BAG3와 JNK 사이의 관계를 밝혀내기 위해서는 추가 연구가 필요하다.

BAG3는 저산소증 및 재산소화 부하동안 세포질로부터 핵으로 전이하였다. BAG3 전이는 근육세포에서 보고된 바 없었다. 이러한 결과는 BAG3가 인간 신경아교 세포들의 핵에서 발견될 수 있으며 그 결과 그 5'-비번역된 서열이 관여하는 양성 피드백 루프를 통해 그 자신의 전사를 자극하는 능력이 있음을 입증하는 기존의 연구와 일치한다. 그러므로, 심장에서 BAG3에 관한 증가하는 기능들의 목록 이외에도, BAG3는 또한 유전자 발현을 조절할 수 있는 것으로 보인다. 이러한 가소성은 BAG3 단백질 내부의 수많은 단백질 결합 모티프들의 존재로 인한 것이다.

실시예 8: 보르테조밉은 NMVCs에서 BAG3의 수준을 증가시켰다

NMVCs을 H/R 후 0.5, 1, 2, 4 또는 18 시간 동안 보르테조밉으로 처리하였다. 실시예 1에 기재된 바와 같이 BAG3 수준들을 면역탁본법으로 분석하였다. 보르테조밉 처리는 비히클 처리된 대조 세포들에 비해 BAG3 수준을 시간-의존적으로 증가시켰다.

Claims (26)

1. 허혈 조직에서 BAG3 수준을 증가시키는 치료적 유효량의 제약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체의 허혈/재관류 손상 치료 방법.
2. 청구항 1에 있어서, 허혈/재관류 손상을 보유한 대상체를 식별하는 단계를 추가로 포함하는 치료 방법.
3. 청구항 1에 있어서, 허혈/재관류 손상은 심근 경색증, 죽상경화증, 말초 혈관 장애, 폐동맥 색전, 정맥 혈전증, 일과성 허혈 발작, 불안정 협심증, 대뇌 혈관 허혈, 뇌졸중, 허혈 신경계 장애, 허혈 신장 질환, 혈관염, 이식, 동맥내막절제술, 동맥류 복원 수술, 염증 장애, 또는 외상성 손상의 결과인, 치료 방법.
4. 청구항 1에 있어서, 허혈/재관류 손상은 심장, 뇌, 골격근, 혈관, 신장 또는 간 조직에서 발생하는, 치료 방법.
5. 청구항 1에 있어서, 상기 제약학적 조성물은 BAG3 폴리펩티드 또는 이의 단편을 인코딩하는 핵산, BAG3 폴리펩티드 또는 이의 단편, 또는 프로테오좀 억제제를 포함하는, 치료 방법.
6. 청구항 5에 있어서, 상기 프로테오좀 억제제는 보르테조밉인, 치료 방법.
7. 청구항 1에 있어서, 상기 조성물은 재관류 동안 투여되는, 치료 방법.
8. 청구항 1에 있어서, 상기 조성물은 재관류 후에 투여되는, 치료 방법.
9. 청구항 1에 있어서, 상기 조성물은 정맥내 투여되는, 치료 방법.
10. 청구항 1에 있어서, 또 다른 치료제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 치료 방법.
11. 청구항 10에 있어서, 상기 치료제는 항염제, 혈관확장제, 베타 차단제, 콜레스테롤-저하제, 칼슘 채널 차단제, 안지오텐신-전환 효소 억제제 또는 항응고제를 포함하는, 치료 방법.
12. BAG3 수준을 증가시키는 치료적 유효량의 제약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 허혈/재관류 손상 위험이 있는 대상체의 치료 방법.
13. 청구항 12에 있어서, 허혈/재관류 손상 위험이 있는 대상체를 식별하는 단계를 추가로 포함하는, 치료 방법.
14. 청구항 12에 있어서, 상기 대상체는 혈관 중재 시술 예정인, 치료 방법.
15. 청구항 12에 있어서, 혈관 중재 시술은 카테터 또는 스텐트를 사용하는 시술을 포함하는, 치료 방법.
16. 청구항 15에 있어서, 상기 시술은 혈관성형술 카테터, 레이저 카테터, 죽종절제 카테터, 혈관내시경 장치, 베타- 또는 감마-복사 카테터, 혈관내 초음파 장치, 회전식 죽종절제 장치, 방사능 풍선, 가열 와이어, 가열 풍선, 생분해성 스텐트 지주, 또는 생분해성 슬리브를 사용하는 시술을 포함하는, 치료 방법.
17. 청구항 12에 있어서, 허혈/재관류 손상은 심근 경색증, 죽상경화증, 말초 혈관 장애, 폐동맥 색전, 정맥 혈전증, 일과성 허혈 발작, 불안정 협심증, 대뇌 혈관 허혈, 뇌졸중, 허혈 신경계 장애, 허혈 신장 질환, 혈관염, 이식, 동맥내막절제술, 동맥류 복원 수술, 염증 장애, 또는 외상성 손상의 결과인, 치료 방법.
18. 청구항 12에 있어서, 허혈/재관류 손상은 심장, 뇌, 골격근, 혈관, 신장 또는 간 조직에서 발생하는, 치료 방법.
19. 청구항 12에 있어서, 상기 제약학적 조성물은 BAG3 폴리펩티드 또는 이의 단편을 인코딩하는 핵산, BAG3 폴리펩티드 또는 이의 단편, 또는 프로테오좀 억제제를 포함하는, 치료 방법.
20. 청구항 12에 있어서, 상기 프로테오좀 억제제는 보르테조밉인, 치료 방법.
21. 청구항 12에 있어서, 상기 조성물은 재관류 전에 투여되는, 치료 방법.
22. 청구항 12에 있어서, 상기 조성물은 재관류 동안 투여되는, 치료 방법.
23. 청구항 12에 있어서, 상기 조성물은 재관류 후에 투여되는, 치료 방법.
24. 청구항 12에 있어서, 상기 조성물은 정맥내 투여되는, 치료 방법.
25. 청구항 12에 있어서, 또 다른 치료제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 치료 방법.
26. 청구항 25에 있어서, 상기 치료제는 항염제, 혈관확장제, 베타 차단제, 콜레스테롤-저하제, 칼슘 채널 차단제, 안지오텐신-전환 효소 억제제 또는 항응고제를 포함하는, 치료 방법.

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