KR20190041154A

KR20190041154A - 항암치료 및 유전자 치료용 나노입자를 포함하는 간동맥 화학색전술용 조성물

Info

Publication number: KR20190041154A
Application number: KR1020170132259A
Authority: KR
Inventors: 김현철; 박수현; 한현구; 김도연; 서민규
Original assignee: 서강대학교산학협력단
Priority date: 2017-10-12
Filing date: 2017-10-12
Publication date: 2019-04-22
Also published as: WO2019074258A1; KR102075823B1

Abstract

본 발명은 유전자 치료가 가능한 siRNA 하이드로겔에 항암제가 담지된 나노입자와 색전물질을 포함하여 화학색전술에 사용됨과 동시에 유전자 치료와 약물 치료를 동시에 수행할 수 있는 나노입자 및 이를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 약물을 담지한 siRNA 하이드로겔 코어와 이를 둘러싸는 양이온의 키토산 중간층과 음이온의 히알루론산 외곽층을 구비함으로서 siRNA와 약물을 장기간에 걸쳐 방출시킬 수 있으므로 약효의 지속성이 매우 크다.
본 발명의 나노입자를 포함하는 화학색전술용 조성물은 화학색전술 및 약물 치료와 함께 타겟 유전자의 발현을 효율적으로 억제할 수 있으므로 항암 치료 효과를 높일 수 있다.
본 발명의 나노입자는 (-) 전하를 띄는 히알루론산으로 코팅함으로서 간암세포에 발현된 CD44 receptor를 통하여 효과적으로 세포내로 전달되어 유전자 치료 및 항암치료 효과를 극대화 할 수 있다.

Description

항암치료 및 유전자 치료용 나노입자를 포함하는 간동맥 화학색전술용 조성물{Composition for hepatic arterial embolization comprising Nanoparticles for genes and anticancer drug delivery}

본 발명은 항암치료 및 유전자 치료용 나노입자를 포함하는 간동맥화학색전술용 조성물에 관한 것으로서, 보다 자세하게는, 유전자 치료가 가능한 siRNA 하이드로젤에 항암제가 담지된 나노입자가 색전물질을 포함하여 화학색전술에 사용됨과 동시에 유전자 치료와 약물 치료를 동시에 수행할 수 있는 나노입자 및 이를 포함하는 조성물에 관한 것이다.

최근 영상기술이 발전하여 몸 안에 숨어 있는 암의 정확한 위치를 찾아내어 방사선 조사, 내시경 수술 등 여러 가지 방법으로 제거할 수 있게 되었다. 하지만, 암의 위치를 정확히 발전하더라도 암이 전체 장기에 퍼져 있거나, 다른 장기와 붙어 있는 경우 등 여러 가지 이유로 인해 수술적 제거가 불가능한 경우가 있다. 또한, 간암, 췌장암은 발견하더라도 수술적 완치가 불가능한 경우가 많다.

현재, 간 종양의 치료에 가장 많이 시행되고 있는 시술인 화학색전술은 간 종양에 영양을 공급하는 동맥을 찾아 항암제를 투여한 다음 혈관을 막아주는 치료법이다. 간 조직은 소장 및 대장 등을 돌아 나오는 문맥 (portal vein)과 대동맥에서 직접 나오는 간동맥을 통하여 산소와 영양을 공급받는데, 정상 간 조직은 주로 문맥에서, 종양 조직은 주로 간동맥에서 혈액을 공급받는다. 따라서, 종양에 영양을 공급하는 간동맥에 항암제를 투여하고 혈관을 막아주면 정상 간 조직에 해를 입히지 않으면서 종양만을 선택적으로 괴사시킬 수 있다. 이러한 치료법은 암의 진행 정도에 따른 제약이 없이 적용범위가 넓고, 치료 대상의 제한이 적은 등 장점이 많기 때문에 현재 간암 치료율 향상에 가장 큰 기여를 하고 있는 방법이다. 화학색전술은 먼저 서혜부에 위치한 대퇴동맥에 카테터를 삽입하여 간동맥으로 접근한 후 혈관 조영제를 주사하여 종양의 위치, 크기 및 혈액 공급 양상 등 치료에 필요한 정보를 얻고, 치료 방침이 정해지면 약 1mm 정도 굵이의 가는 관을 카테터에 삽입하여 표적이 되는 동맥을 찾아 시술한다.

간동맥 화학 색전술을 위하여 주입되는 색전물질, 항암제 혼합액은 색전물질과 항암제로 이루어진 에멀젼 (emulsion)으로, 색전물질인 리피오돌 (Lipiodol)과 항암제인 아드리아마이신(Adriamycin)을 1:4 비율로 혼합하여 에멀젼 (emulsion) 형태로 사용되는 것이 일반적이다. 이때 아드리아마이신은 리피오돌과 비중이 비슷한 Xray 조영제인 파미레이에 용해시켜 사용되어 장시간 에멀젼 형태로 유지할 수 있도록 한다. 본 혼합액에 의해 간암치료 효과는 Lipiodol의 색전 효과와 함께 항암제가 간암으로 집중 전달됨으로써, 영양분 공급을 차단함과 동시에 항암 효과의 극대화가 유도된다.

하지만, 상기 기술은 색전을 시행하였으나, 색전물질이 일정시간 이후에 씻겨져 나가 약물이 혈관을 따라 전신으로 퍼짐에 따라 정상 세포를 사멸시킬 수 있는 반면 암세포를 사멸시키기에는 한계가 있었다.

본 발명은 약물을 효과적으로 암세포에 집중 침투시킴과 동시에 장기간 지속적으로 약물 방출 효과를 제공할 수 있는 나노입자 및 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명은 화학 색전술과 항암제에 의한 치료뿐만 아니라 유전자 치료까지도 병행 할 수 있는 나노입자 및 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 하나의 양상은

항암치료 및 유전자 치료용 나노입자, 수성조영제 및 색전물질을 포함하는 간동맥 색전술용 조성물에 관련된다.

상기 조성물은 상기 수성조영제나 색전물질에 분산 내지 용해되는 제 1 항암제를 추가로 포함할 수 있다.

상기 항암치료 및 유전자 치료용 나노입자는 제 2 항암제를 담지한 siRNA 하이드로젤, 상기 하이드로젤 외면에 코팅된 키토산 또는 폴리에틸렌이민 및 상기 키토산을 둘러싸는 히알루론산 외곽층을 포함할 수 있다.

다른 양상에서 본 발명은

항암치료 및 유전자 치료용 나노입자를 증류수에 분산시키는 단계 ;

분산용액을 수성 조영제와 혼합하는 단계 ; 및

유성조영제인 색전물질을 상기 수성 조영제를 포함하는 혼합용액에 넣어 에멀젼을 형성하는 단계를 포함하는 간동맥 색전술용 조성물의 제조방법에 관련된다.

상기 조성물 제조방법은 상기 색전물질에 제 1 항암제를 분산 내지 혼합한 후 상기 혼합용액에 넣어 에멀젼을 형성할 수 있다.

본 발명은 기존의 화학색전술 제형에 제 2 항암제가 담지된 유전자 치료용 siRNA 나노입자를 포함함으로서 화학색전술 및 약물 치료와 함께 타겟 유전자의 발현을 효율적으로 억제할 수 있으므로 항암 치료 효과를 높일 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 siRNA 나노입자에 담지된 제 2 항암제뿐만 아니라 에멀젼 조성물에 함유된 free한 제 1 항암제를 포함하고 있어 초기에는 제 1 항암제가 방출되고 제 2 항암제는 siRNA 나노입자 분해와 함께 약물을 장기간에 걸쳐 방출시킬 수 있으므로 항암치료를 효율적으로 수행할 수 있다.

본 발명의 나노입자는 히알루론산으로 코팅함으로서 간암세포에 발현된 CD44 receptor를 통하여 효과적으로 세포내로 전달되어 유전자 치료 및 항암치료 효과를 극대화 할 수 있다.

도 1은 본 발명의 일구현예에 의한 항암치료 및 유전자 치료용 나노입자를 포함한 간동맥화학색전술 조성물의 개념도를 나타낸다.
도 2는 siRNA 하이드로젤에 아크릴레이트 키토산 중간층과 히알루론산 외곽층으로 코팅된 항암-siRNA 나노입자의 SEM 이미지를 나타낸다.
도 3은 파미레이에 녹인 free 항암제 (독소루비슨)와 항암-siRNA 하이드로젤 기반 나노입자를 리피오돌과 섞어 에멀젼이 형성된 것을 보여주는 DIC 이미지와 형광 이미지를 나타낸다.
도 4는 siRNA 하이드로젤에 각각 아크릴레이트 키토산 또는 branched PEI 로 중간층을 코팅한 후 외곽층을 히알루론산으로 코팅하여 완성된 나노입자의 사이즈를 보여준다.
도 5는 중간층을 키토산 또는 아크릴레이트 키토산으로 코팅한 후 외곽층을 히알루론산으로 코팅하여 완성된 나노입자의 생체 외 조건하 세포에 전달된 나노입자가 목표로 하는 VEGF 유전자의 발현을 선택적으로 억제함을 보여주는 PCR 데이터이다.
도 6는 충간층을 branched PEI 로 코팅한 후 최외각층을 히알루론산으로 코팅하여 완성된 나노입자의 생체 외 조건하 세포에 전달된 나노입자가 목표로 하는 VEGF 유전자의 발현을 선택적으로 억제함을 보여주는 PCR 데이터이다.
도 7은 제작된 항암-siRNA 나노입자로부터 지속적으로 방출된 항암제에 의한 세포 독성 실험을 한 결과이다.

본 발명은 하기의 설명에 의하여 모두 달성될 수 있다. 하기의 설명은 본 발명의 바람직한 구체 예를 기술하는 것으로 이해되어야 하며, 본 발명이 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.

도 1은 본 발명의 일구현예에 의한 항암치료 및 유전자 치료용 나노입자를 포함한 간동맥(화학)색전술용 조성물의 개념도를 나타낸다.

도 1을 참고하면, 본 발명의 간동맥 색전술 조성물은 항암치료 및 유전자 치료용 나노입자(10), 수성조영제(20) 및 색전물질(30)을 포함한다.

상기 색전물질(30)은 유성 조영제이고, 상기 나노입자(10)는 수성 조영제(20)에 분산된다. 상기 조성물은 유성조영제와 수성 조영제가 혼합되어 오일(유성)-in-물(수성) 형태의 에멀젼을 형성한다.

상기 조성물은 상기 수성조영제나 유성인 색전물질에 분산 내지 용해되는 제 1 항암제(40)를 추가로 포함할 수 있다. 즉, 상기 제 1항암제로 친수성이나 소수성 항암제를 모두 사용할 수 있다.

상기 색전물질은 리피오돌, 콜라겐, 트롬빈, 젤라틴, 알기닉산, 알기네이트, 초산 섬유소, 폴리아세트산비닐, 폴리에틸렌비닐알코올, 에틸렌-비닐알코올 공중합체, 폴리비닐 알코올 또는 이들의 혼합물일 수 있다.

상기 조성물은 상기 나노입자와 상기 색전물질을 1 : 1~5, 바람직하게는 1 : 1~4, 더욱 바람직하게는 1 : 2~5의 부피비로 포함할 수 있다.

상기 수성조영제는 이오파미돌(Iopamidol), 파미레이(Pamiray), 메트리자미드(Metrizamide), 디아트리조에이트 (Diatrizoate), 이옥사글레이트(Ioxaglate), 이오펜톨(Iopentol), 이오메프롤(Iomeprol), 이오트롤란(Iotrolan), 이오헥솔(Iohexol), 이오베르솔 (Ioversol), 이옥실란(Ioxilan), 이오프로마이드(Iopromide), 이오딕사놀 (Iodixanol) 및 이오비트리돌(Iobitridol)의 군에서 선택될 수 있다.

상기 수성 조영제(20)는 상기 나노입자(10)와 상기 제 1 항암제(40)를 분산시킬 수 있다.

상기 항암치료 및 유전자 치료용 나노입자(10)는 제 2 항암제(14)를 담지한 siRNA 하이드로젤(11), 상기 하이드로젤 외면에 코팅된 키토산(12) 또는 폴리에틸렌이민, 및 상기 키토산 또는 폴리에틸렌이민을 둘러싸는 히알루론산 외곽층(13)을 포함할 수 있다.

상기 siRNA 하이드로젤(11)은 특정 유전자의 mRNA 들을 표적한다. siRNA는 그의 센서 (sense) 가닥과 염기 서열이 동일한 메신저 RNA (messenger RNA, mRNA)와 결합하여 RNA 유도 침묵 복합체 (RNA induced silencing complex, RISC)가 결합된 mRNA를 분해시킴으로서 특정 단백질의 발현을 저해할 수 있다.

상기 특정 유전자로는 암 또는 특정 질병을 유발하는 모든 mRNA가 해당될 수 있다. 예를 들면, 상기 siRNA 하이드로젤(11)은 과도하게 발현되면 암을 유발하는 혈관내피 성장인자 (VEGF)를 표적하는 anti-VEGF siRNA 하이드로젤일 수 있다.

상기 siRNA 하이드로젤은 분자량이 1× 10⁵ g/mol 이상일 수 있다. 상기 siRNA 하이드로젤은 작은 간섭 RNA(siRNA) 단위 서열이 1× 10³ 이상 탑재될 수 있으며, 1× 10³ ~ 1× 10¹⁰ 개 범위 이상 복제되어 탑재될 수 있다.

상기 제 2 항암제(14)는 상기 siRNA의 이중 나선 사이에 담지될 수 있다.

상기 제 2 항암제(14)는 독소루비신 (DOX), 마이토마이신, 시스플라틴, 아드리아마이신일 수 있다.

상기 제 1항암제(40)와 제 2 항암제(14)는 동일할 수 있다.

약물을 siRNA 하이드로젤에 담지시키는 방법은 다음과 같다.

약물과 siRNA 하이드로젤을 용매(물)에 넣어 혼합한 후 소정시간 동안 보관하는 단계 및 siRNA 하이드로젤이 침전되면 용매로부터 분리하는 단계를 포함한다.

예를 들면, 먼저 anti-VEGF siRNA 하이드로젤을 용매 (Nuclease free water)에 원하는 농도로 풀어주고 1분 정도 bath sonication을 시켜준 후 제 2 항암제 약물(예를 들면, 독소루비신, DOX)를 로딩하고 싶은 만큼 섞어서 암실에 하루 동안 보관한다. 이어서, 바닥에 붉은 색으로 제 2 항암제가 loading 된 입자가 가라앉은 것이 확인되면 원심분리시켜(13,200rpm, 10분) 상층액을 제거하면 약물이 로딩된 siRNA 하이드로젤을 수득할 수 있다. 상층액은 따로 보관하여 로딩된 DOX의 양을 확인할 수 있다.

본 발명의 나노입자는 중간층(12)으로 키토산 또는 양이온성 고분자를 사용한다. 바람직하게는 상기 키토산은 아크릴레이트 키토산일 수 있다.

상기 양이온성 고분자는 폴리에틸렌이민, 폴리아민 및 폴리비닐아민으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있으며, 바람직하게는 독성이 상대적으로 낮은 branched PEI를 사용할 수 있다.

본 발명에서 상기 키토산과 bPEI 는 양전하를 띠므로 음전하를 띠는 siRNA 하이드로젤과 히알루론산 (HA)의 상이에 코팅되는 중간층으로 사용된다. 상기 키토산과 bPEI 는 음전하를 띠는 siRNA 하이드로젤을 응축 또는 압축하여 하이드로젤의 입자 사이즈를 줄일 수 있다. 또한, 상기 키토산과 bPEI 는 코어인 하이드로젤 외면에 강한 (+) 전하를 띠는 양이온성 고분자층을 형성할 수 있으므로 (-) 전하를 띠는 히알루론산과 강한 정전기적 인력으로 결합하여 히알루론산 외곽 코팅 구조를 견고히 유지할 수 있다.

또한, 상기 키토산은 우리 인체조직과 매우 유사한 구조를 이루고 있고 인체 친화성이 우수하여 면역반응이 일어나지 않기 때문에 인체 내 약물 전달 물질로 유용하다.

키토산은 산성에서만 녹기 때문에 인체 내 중성 조건에서 잘 용해되지 않아 코어의 항암 약물이나 siRNA 하이드로젤의 방출을 방해할 수 있다. 이러한 문제를 해결하기 위해, 본 발명에서는 키토산의 표면 기능기를 아크릴레이트로 개질하여 중성인 물에도 키토산이 잘 분해되도록 하였다.

상기 외곽층(13)은 상기 중간층(12) 외면에 코팅된 히알루론산층이다.

상기 히알루론산 외곽층은 (-)전하를 나타내고, 따라서, 본 발명의 코어를 포함한 입자도 그 외부가 (-) 전하를 나타낸다.

본 발명의 목적에는 다양한 형태의 히알루론산이 가능하다. 특히, 분자량이 큰 것과 작은 히알루론산이 이용될 수 있으며, 바람직하게는 5~10K, 더욱 바람직하게는 5K 히알루론산을 사용할 수 있다.

히알루론산(HA)은 기본단위로 디사카라이드 글루쿠로닌산-β(1-3) N-아세틸글루코즈-아민β(1-4)이 최고 50,000쌍으로 구성된 큰 복합 올리고사카라이드이다. 이는 세포외 매트릭스(extracellular matrix)의 주요 성분으로써 생체 내에서 발견된다. 이의 3차 구조는 직경이 약 50nm인 무작위(random) 코일 형태이다.

본 발명의 나노입자는 (-) 전하를 띠는 히알루론산으로 코팅함으로써 간암세포에 발현된 CD44 receptor를 통하여 효과적으로 세포내로 전달되어 유전자 치료 및 항암치료 효과를 극대화 할 수 있는 장점이 있다.

상기 방법은 상기 아크릴레이트된 키토산 또는 bPEI, 히알루론산을 상기 siRNA 하이드로젤 수용액의 RNA 농도가 100nmole 정도일 때 siRNA 하이드로젤 대비 1 : 0.1~1 : 0.5~2, 바람직하게는 1 : 0.1~0.5 : 1~2(하이드로젤 : 키토산/bPEI : 히알루론산)를 첨가할 수 있다.

본 발명의 상기 항암치료 및 유전자 치료용 나노입자는 사이즈가 100~400nm, 바람직하게는 200nm 이내일 수 있다.

다른 양상에서 본 발명은 간동맥 색전술용 조성물의 제조방법에 관련된다.

상기 조성물 제조방법은

항암치료 및 유전자 치료용 나노입자(10)를 증류수에 분산시키는 단계 ;

분산용액을 수성 조영제(20)와 혼합하는 단계 ; 및

유성조영제인 색전물질(30)을 상기 수성 조영제를 포함하는 혼합용액에 넣어 에멀젼을 형성하는 단계를 포함한다.

상기 항암치료 및 유전자 치료용 나노입자는 앞에서 상술한 나노입자(10)를 사용할 수 있다. 상기 나노입자(10)는 제 2 항암제(14)를 담지한 siRNA 하이드로젤(11), 상기 하이드로젤 외면에 코팅된 키토산(12) 또는 양이온성 고분자 및 상기 키토산 또는 양이온성 고분자를 둘러싸는 히알루론산 외곽층(13)을 포함할 수 있다.

상기 나노입자(10)를 제조하는 방법은 제 2 항암제를 상기 siRNA 하이드로젤에 담지하는 단계, 중간층 코팅단계, 히알루론산 코팅단계 및 분리 건조 단계를 포함한다.

제 2 항암제를 상기 siRNA 하이드로젤에 담지하는 단계는 제 2 항암제(14)와 siRNA 하이드로젤(11)을 용매(RNA 분해 효소 활성을 제거한 증류수)에 넣어 혼합한 후 소정시간 동안 보관하는 단계 및 siRNA 하이드로젤이 침전되면 용매로부터 분리하는 단계를 포함할 수 있다.

중간층 코팅단계는 제 2 항암제가 담지된 상기 siRNA 하이드로젤 용액에 키토산 또는 양이온성 고분자를 혼합하여 코팅하는 단계이다.

외곽층 코팅단계는 상기 용액에 히알루론산을 혼합하여 상기 키토산 또는 양이온성 고분자 표면에 히알루론산을 코팅하는 단계를 포함한다.

상기 분리 건조 단계는 외곽층이 코팅된 나노입자를 용액에서 분리시켜 건조시키는 단계이다.

상기 방법은 상기 아크릴레이트된 키토산, 히알루론산을 상기 siRNA 하이드로젤 대비 1 : 0.1~1 : 0.5~2, 바람직하게는 1 : 0.1~0.5 : 1~2(하이드로젤 : 키토산/bPEI : 히알루론산)를 첨가할 수 있다.

상기 방법은 상기 색전물질(30)에 제 1 항암제(40)를 분산 내지 혼합한 후 상기 혼합용액에 넣어 에멀젼을 형성할 수 있다.

상기 색전물질(30), 수성조영제(20), 제 1 항암제(40) 및 제 2 항암제(14)는 앞에서 상술한 내용을 참고할 수 있다.

상기 방법은 상기 나노입자와 상기 색전물질을 1 : 1~5, 바람직하게는 1 : 1~4 또는 1 : 2~5의 부피비로 혼합할 수 있다.

상기 방법은 상기 색전물질과 상기 수성 조영제를 1 : 1~5, 바람직하게는 1 : 1 ~ 4의 부피비로 혼합할 수 있다.

본 발명의 조성물 제조 방법은 제 2 항암제가 담지된 유전자 치료용 나노입자를 증류수(RNA 분해 효소 활성을 제거한 증류수임)에 원하는 농도로 재분산시킨다. 이후에 제 1항암제를 원하는 농도가 되도록 수성조영제(예를 들면, 오파미돌 (Iopamidol) 또는 파미레이 (Pamiray))에 분산시켜 항암치료 및 유전자 치료용 나노입자가 재분산된 용액과 섞어준다.

이때 수성 조영제는 충분한 양을 사용할 수 있다. 색전물질과의 혼합을 위하여 나노입자와 제 1 항암제(DOX)가 섞인 수성 조영제 용액에 색전물질(예를 들면, 리피오돌)을 1 : 1~5의 부피비(색전물질 : 수성 조영제)로 분산시킨다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위해 바람직한 실시예를 제시하지만, 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1

anti- VEGF siRNA 하이드로젤 합성

쥐의 혈관내피 성장 인자 (vascular endothelial growth factoer A (VEGF-A))의 센스는 5’-AUGUGAAUGCAGACCAAAGAA TT-3’이고, 안티센스는 5’-UUCUUUGGUCUGCAUUCA CAU TT-3’이다. 상기 센스 및 안티센스를 인코딩한 긴 선형 단일가닥 DNA를 제조하였다.

Ligase된 원형 DNA 템플릿을 T7 RNA 폴리머레이즈와 같이 37℃에서 20 시간 동안 반응버퍼 (8mM Tris-HCl, 0.4mM spermidine, 1.2mM MgCl₂, and 2mM dithiothreitol)에서 배양하였다. 생성된 용액을 여러 번 피펫하고 5분 동안 초음파처리해서 입자를 분해하였다. 용액을 4℃ 조건하 13,200rpm에서 20분 동안 원심분리하고 상층액을 제거하였다. 그 후 RNase-free water를 첨가해 입자를 세척하였다. 용액을 1분 동안 다시 초음파처리하고 원심 분리하였다. 세척단계를 세 번 더 반복해서 RCT 시약을 제거하여 RNA-microsponge (anti-VEGF siRNA 하이드로젤)를 수득하였다. RNA-microsponge의 농도는 Quant-iT RNA BR assay kits (Invitrogen)를 사용하여 측정하였다. 코어 제조는 본 발명자의 선행 논문을 참고하였다.(Self-assembled RNA interference microsponges for efficient siRNA delivery(nature material, 2012. 11. 26 공개))

Doxorubicin(DOX)을 담지한 siRNA 하이드로젤 ( DOX - siRNA 하이드로젤 ) 합성

DOX에 anti-VEGF siRNA 하이드로젤을 섞어서 암실에 overnight 보관하였다. 바닥에 붉은 색으로 DOX가 loading 된 입자가 가라앉아 있는 게 확인되면 13,200 rpm 으로 10분 동안 원심 분리시켰다. 상층액을 따로 걷어서 DOX의 loadiing 양을 측정하고 상층액을 제거한 DOX-siRNA 하이드로젤 입자를 수득하였다.

DOX에 anti-VEGF siRNA hydrogel을 섞어서 암실에 overnight 보관하였다. 바닥에 붉은 색으로 DOX가 loading 된 입자가 가라않아 있는 게 확인되면 13,200 rpm으로 10분 동안 원심분리 시켰다. 상층액을 따로 걷어서 DOX의 loading 양을 측정하고 상층액을 제거한 DOX-siVEGF hydrogel 입자를 수득하였다.

아크릴레이트 키토산 합성

48kDa 키토산 80mg을 8 mL distilled water (DW)에 섞은 다음 0.4 M acetic acid 182.4 μL를 넣어서 60℃에 stirring 시키면서 1~2시간 정도 완전히 녹였다. 0.05% NaOH 400 μL 와 Glycidyl methacrylate (GMA) 472 μL를 첨가하고 60℃에 overnight stirring 하였다. 이를 상온으로 온도를 내린 후에 2M NaOH 5mL와 Acetic anhydride 10μL 첨가하고 3~4 hr 교반하였다. Dialysis membrane을 이용하여 4,000 rpm에 10분씩 여러 번 원심 분리시켜서 미반응물을 제거하여 하기 아크릴레이트 키토산을 수득하였다.

나노입자 제조

앞에서 제조한 아크릴레이트 키토산을 1 mg/mL으로 nuclease free water에 녹였다. 48kDa 키토산과 25 kDa bPEI 역시 1 mg/mL 으로 nuclease free water에 녹였다.

(1)1 mg/mL chitosan/bPEI 1㎕와 nuclease free water 9㎕를 섞고

(2)sonication 시킨 DOX-siRNA hydrogel 3㎕에 nuclease free water 12 ㎕를 섞은 후 두 개의 용액(1, 2)을 모두 섞었다.

혼합용액을 10분간 incubation한 후 sonication 처리하였다. 혼합용액에 1 mg/mL hyaluronic acid (HA)를 5ul 섞어서 30분 정도 incubation하였다.

최종적으로 제조된 나노입자의 SEM 사진을 도2에 나타냈고 나노입자의 사이즈는 도3에 나타냈다.

도 3은 각각 중간층을 키토산과 bPEI 로 코팅한 나노입자의 사이즈로서 중간층이 키토산으로 코팅된 입자의 평균 사이즈는 386.6nm이고 bPEI로 코팅된 입자의 평균 사이즈는 362.5nm이다. 두 입자 모두 제타 전위는 마이너스 10 정도로 나타났다.

색전술용 조성물 제조 형광 dye 인 YOPRO-1을 로딩한 DOX-siRNA 하이드로젤에 bPEI 와 히알루론산으로 코팅한 나노입자와 파미레이에 녹인 free DOX를 섞어주었다. 이때 나노입자에 로딩된 DOX의 양과 free DOX의 양이 총 6.25mg/mL이 되도록 섞었다. 이 용액에 리피오돌을 1:2 비율이 되도록 3 way pumping을 이용하여 섞어주면 나노입자와 free DOX를 함유한 에멀젼을 수득할 수 있다.

도 4를 참고하면 수용액 상에 DOX와 siRNA 나노입자를 함유한 에멀젼이 존재하는 것을 확인할 수 있다.

도4의 좌측 그림은 에멀젼의 형성 여부를 볼 수 있는 마이크로현미경 사진이고, 중간 그림은 에멀젼 내에 포함된 DOX의 여부를 알 수 있는 DOX 형광 현미경 사진이며 우측 그림은 에멀젼 내에 포함된 siRNA hydrogel 여부를 알 수 있는 siRNA hydrogel 의 형광 현미경 사진이다. DOX는 그 자체로 형광을 띠기 때문에 따로 형광을 입히지 않았고 siRNA hydrogel은 YOPRO-1이라는 형광 물질을 킬레이트하여 형광을 확인하였다. 즉, 도 4 사진을 참고하면, 용액 내 에멀젼 형성 여부와 에멀젼 내에 DOX와 siRNA hydrogel이 포함되었다는 것을 확인할 수 있다.

Gene silencing 실험 방법 및 RT- PCR 데이터

도 5의 경우 6 well cell culture plate (세포배양 플레이트)에 HepG2 세포 (한국세포주은행)을 40만개씩 seeding 하고 하루 동안 incubation 하였다. 3시간 후에 opti-MEM을 제거하고 DPBS로 washing 해 준 후에 나노입자를 섞은 opti-MEM을 조심스럽게 넣어주고 12시간 후에 일반 meida로 갈아주었다. 24시간 incubtaion 시킨 후 cell을 걷어서 RNA를 추출하고 cDNA로 만든 후 PCR과 전기영동을 거쳐 젤 이미지를 확인하였다. 상기 cell에 control(1), siVEGF hydrogel + 1mg/ml chitosan + HA(2), siVEGF hydrogel + 1mg/mL acylated chitosan + HA(3)을 medium과 섞어 처리하였다.

도 5를 참고하면, control (1)에 비해 chitosan (2) 이나 acrylated chitosan (3) 으로 코팅된 나노입자를 처리한 세포의 VEGF 유전자의 발현이 현저히 줄어든 것을 확인할 수 있다. 또한 일반 키토산으로 코팅을 했을 때 보다 acrylated chitosan 으로 코팅을 했을 때 VEGF 유전자 발현이 더욱 잘 억제됨을 확인할 수 있다.

도 6의 경우 B16F10 cell을 이용하였고 처리한 나노입자의 중간층을 bPEI로 코팅하였다는 점을 제외하고는 위 실험과 같은 방식으로 진행되었다(1mg/mL bPEI 사용하였음). 이 때, control(1)에 비해 bPEI(2,3)로 코팅한 나노입자를 처리한 cell의 VEGF 유전자의 발현이 현저히 줄어든 것을 확인할 수 있다.

세포 생존율 시험

96 well plate 에 B16F10 암세포를 1×10⁴ seeding 한 후 24시간 경과 후, 대조군, free DOX (항암제) 그리고 실시예 1의 나노입자(DOX-siVEGF + 아크릴레이트 키토산 + HA)로 처리한 그룹으로 구분하여 실험을 진행하였다.

세 개 그룹 모두 DOX 농도를 200nM로 처리한 후, 6 시간 동안 보관하였다. 항암제 약물을 제거한 후에 새로운 cell media를 처리한 후에 24시간, 48시간, 그리고 72시간 후에 cell viability를 도 7에 나타내었다.

도 7을 참고하면, 48시간 경과 후, 실시예 1은 대조군에 비해 23% 의 사멸효과를 보였고, 72시간 경과 후에는 대조군에 비해 52%의 사멸효과를 보여주고 있다.

본 발명의 단순한 변형 내지 변경은 모두 본 발명의 영역에 속하는 것으로, 본 발명의 구체적인 보호범위는 첨부된 특허청구범위에 의하여 명확해질 것이다.

Claims

항암치료 및 유전자 치료용 나노입자, 수성조영제 및 색전물질을 포함하는 간동맥 색전술용 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 색전물질은 유성 조영제이고, 상기 나노입자는 수성 조영제에 분산되어 상기 조성물은 에멀젼을 형성하는 것을 특징으로 하는 간동맥 색전술용 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 조성물은 상기 수성조영제나 색전물질에 분산 내지 용해되는 제 1 항암제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 간동맥 색전술용 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 색전물질은 리피오돌, 콜라겐, 트롬빈, 젤라틴, 알기닉산, 알기네이트, 초산 섬유소, 폴리아세트산비닐, 폴리에틸렌비닐알코올, 에틸렌－비닐알코올 공중합체, 폴리비닐 알코올 또는 이들의 혼합물인 것을 특징으로 하는 간동맥색전술용 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 조성물은 상기 나노입자와 상기 색전물질을 1 : 1~5의 부피비로 포함하는 것을 특징으로 하는 간동맥색전술용 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 수성조영제는 이오파미돌(Iopamidol), 파미레이(Pamiray), 메트리자미드(Metrizamide), 디아트리조에이트 (Diatrizoate), 이옥사글레이트(Ioxaglate), 이오펜톨(Iopentol), 이오메프롤(Iomeprol), 이오트롤란(Iotrolan), 이오헥솔(Iohexol), 이오베르솔 (Ioversol), 이옥실란(Ioxilan), 이오프로마이드(Iopromide), 이오딕사놀 (Iodixanol) 및 이오비트리돌(Iobitridol)의 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것임을 특징으로 하는 간동맥색전술용 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 항암치료 및 유전자 치료용 나노입자는
제 2 항암제를 담지한 siRNA 하이드로젤 ;
상기 하이드로젤 외면에 코팅된 키토산 또는 폴리에틸렌이민 ; 및
상기 키토산 또는 폴리에틸렌이민을 둘러싸는 히알루론산 외곽층을 포함하는 것을 특징으로 하는 간동맥 색전술용 조성물.
제 7항에 있어서, 상기 키토산은 아크릴레이트 키토산인 것을 특징으로 하는 간동맥 색전술용 조성물.
제 7항에 있어서, 상기 siRNA 하이드로젤은 특정 유전자의 mRNA를 표적하여 이의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 간동맥 색전술용 조성물.
제 7항에 있어서, 상기 제 2 항암제는 상기 siRNA의 이중 나선 사이에 담지되는 것을 특징으로 하는 간동맥 색전술용 조성물.
제 7항에 있어서, 상기 제 2 항암제는 약물은 독소루비신(DOX), 마이토마이신, 시스플라틴, 아드리아마이신, 젬시타빈 인 것을 특징으로 하는 간동맥 색전술용 조성물.
제 7항에 있어서, 상기 siRNA 하이드로겔과 히알루론산층은 (-) 전하, 상기 키토산 내지 폴리에틸렌이민층은 (+) 전하를 띄되, 상기 나노입자는 전체적으로 (-) 전하를 나타내는 것을 특징으로 하는 간동맥 색전술용 조성물.
제 7항에 있어서, 상기 항암치료 및 유전자 치료용 나노입자는 사이즈가 100~400nm인 것을 특징으로 하는 간동맥 색전술용 조성물.
항암치료 및 유전자 치료용 나노입자를 증류수에 분산시키는 단계 ;
분산용액을 수성 조영제와 혼합하는 단계 ; 및
유성조영제인 색전물질을 상기 수성 조영제를 포함하는 혼합용액에 넣어 에멀젼을 형성하는 단계를 포함하는 간동맥 색전술용 조성물의 제조방법.
제 14항에 있어서, 상기 방법은 상기 색전물질에 제 1 항암제를 분산 내지 혼합한 후 상기 혼합용액에 넣어 에멀젼을 형성하는 것을 특징으로 하는 간동맥 색전술용 조성물의 제조방법.
제 14항에 있어서, 상기 방법은 상기 나노입자와 상기 색전물질을 1 : 1~5의 부피비로 혼합하는 것을 특징으로 하는 간동맥 색전술용 조성물의 제조방법.
제 14항에 있어서, 상기 방법은 상기 색전물질과 상기 수성 조영제를 1 : 1~4의 부피비로 혼합하는 것을 특징으로 하는 간동맥 색전술용 조성물의 제조방법.
제 14항에 있어서, 상기 항암치료 및 유전자 치료용 나노입자는
제 2 항암제를 담지한 siRNA 하이드로젤 ;
상기 하이드로젤 외면에 코팅된 키토산 또는 폴리에틸렌이민 ; 및
상기 키토산 내지 폴리에틸렌이민을 둘러싸는 히알루론산 외곽층을 포함하는 것을 특징으로 하는 간동맥 색전술용 조성물의 제조방법.
제 14항에 있어서, 상기 항암치료 및 유전자 치료용 나노입자를 제조하는 방법은
제 2 항암제와 siRNA 하이드로젤을 용매에 넣어 혼합한 후 소정시간 동안 보관하는 단계 및 siRNA 하이드로젤이 침전되면 용매로부터 분리하는 단계를 포함하는 상기 제 2 항암제를 상기 siRNA 하이드로젤에 담지하는 단계 ;
제 2 항암제가 담지된 상기 siRNA 하이드로젤 용액에 아크릴레이트된 키토산 또는 폴리에틸렌이민을 혼합하여 코팅하는 단계 ; 및
상기 용액에 히알루론산을 혼합하여 상기 키토산 또는 폴리에틸렌이민 표면에 히알루론산을 코팅하는 단계 ; 및
입자를 분리 검조시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 간동맥 색전술용 조성물의 제조방법.
제 19항에 있어서, 상기 방법은 상기 아크릴레이트된 키토산, 히알루론산을 상기 siRNA 하이드로젤 대비 1 : 0.1~1 : 0.5~2(하이드로겔 : 키토산 : 히알루론산)를 첨가하는 것을 특징으로 하는 간동맥 색전술용 조성물의 제조방법.
항암제와 siRNA 하이드로젤을 용매에 넣어 혼합한 후 소정시간 동안 보관하는 단계 및 siRNA 하이드로젤이 침전되면 용매로부터 분리하는 단계를 포함하는 항암제를 상기 siRNA 하이드로젤에 담지하는 단계 ;
항암제가 담지된 상기 siRNA 하이드로젤 용액에 아크릴레이트된 키토산을 혼합하여 코팅하는 단계 ; 및
상기 용액에 히알루론산을 혼합하여 상기 키토산 표면에 히알루론산을 코팅하는 단계 ; 및
입자를 분리 검조시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 항암치료 및 유전자 치료용 나노입자 제조방법.