KR101706047B1 - 아토피 질환 치료용 siRNA 하이드로젤 기반 나노입자 및 이의 제조방법 - Google Patents

아토피 질환 치료용 siRNA 하이드로젤 기반 나노입자 및 이의 제조방법 Download PDF

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한현구
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장혜진
박수현
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Abstract

본 발명은 아토피 치료용 유전체 약물을 응축시키고 외부를 히알루론산으로 코팅하여 유전체 수준에서 아토피 질환을 치료할 수 있는 유전체 나노입자 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명은 아토피 질환 유전자를 표적하는 핵산 하이드로젤 입자 외곽에 양이온성 고분자층과 히알루론산 층을 더 포함하므로 피부 내 RNA를 분해시키는 효소로부터 핵산 입자를 보호할 수 있다.
또한, 본 발명은 마이크로 사이즈 또는 이에 준하는 나노 사이즈의 크기를 갖는 TNF-α siRNA 하이드로젤을 응축시켜 나노 사이즈로 입자 크기를 줄이고, 또한, 최외곽층을 (-) 전하를 띄는 히알루론산으로 코팅함에 따라 피부 장벽 통과가 용이한 유전체 나노입자를 제공할 수 있다.

Description

아토피 질환 치료용 siRNA 하이드로젤 기반 나노입자 및 이의 제조방법{siRNA hydrogel-based nanoparticles for the treatment of atopic dermatitis method for preparing the same}
본 발명은 아토피 질환 치료용 siRNA 하이드로젤 기반의 유전체 나노입자 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 보다 자세하게는, 지속적으로 방출 가능한 아토피 치료용 유전체 약물인 siRNA 하이드로젤을 양이온성 고분자를 이용하여 응축시키고 외부를 히알루론산으로 코팅하여 유전체 수준에서 아토피 질환을 치료할 수 있는 유전체 나노입자 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
아토피(Atopy) 혹은 아토피 증후군은 알레르기 항원에 대한 직접적인 접촉 없이 신체가 극도로 민감해지는 과도한 알레르기 반응을 일컫는 것으로 면역반응을 동반하는 대사성 질환이다. 이에 대한 증상으로는 아토피성 피부염, 알레르기성 결막염, 알레르기성 비염 그리고 천식이 있다.
아나필락시스(anaphylaxis)와 같은 심각한 알레르기 반응을 보이는 경우, 환자의 생명을 위협할 수 있는데, 발병 요인으로는 인체의 면역 기작 중, 간에서 생성된 알부민이 폐에 있는 혈관 밖으로 빠져 체내에 누적되면서 염증이 동반되고 세균으로 인한 감염에 취약해졌기 때문으로 알려져 있다. 이 밖에도 피부 장벽 기능의 손상과 이에 관련된 면역 반응이 주요 병인이 된다고 알려져 있으며, 다른 요인으로 유전적 장애가 있다.
유아기에 아토피가 생겨 성인이 됨에 따라 상태가 호전되는 경우도 있지만, 환경오염 및 스트레스로 인한 성인 아토피 환자 수도 증가하고 있는 실정이다. 현재 치료법으로는 아토피 유발요인을 회피하는 생활습관 개선과 스테로이드 계열 약물의 국소 사용 등이 있다. 그러나 생활습관 개선은 장기적으로 유지되기 힘들다는 점과 스테로이드 계열 약물의 경우, 장기간 사용시 피부염 등의 부작용을 초래할 수 있다는 점에서 아토피 치료의 궁극적인 해결책이 되기 힘들다는 문제점이 있다.
[참고특허]
한국공개특허 10-2004-0064190호
한국공개특허 10-2015-0024805호
본 발명은 면역반응에 관련된 인자(factor)인 TNF-α(Tumor-necrosis factor-alpha, 종양괴사인자)를 이용한 siRNA 하이드로젤기반의 유전체 나노입자를 제공하는 것이다.
본 발명은 아토피 질환을 근본적으로 예방 및 치료할 수 있는 유전체 수준에서의 치료제를 제공하는 것이다.
본 발명의 하나의 양상은
아토피 질환 유전자를 표적하는 핵산으로 구성된 하이드로젤 입자 ;
상기 핵산 하이드로젤 입자를 둘러싸고 응축하는 양이온성 고분자층 ; 및
상기 양이온성 고분자층 외면에 코팅되고 (-)전하를 띄는 음이온성 고분자층을 포함하는 아토피 질환 치료용 유전체 나노입자에 관계한다.
다른 양상에서 본 발명은
아토피 질환 유전자를 표적하는 핵산 하이드로젤 입자와 양이온성 고분자를 혼합하여 이온 상호 작용으로 상기 핵산 하이드로젤 입자를 응축하는 단계 ; 및
음이온성 고분자를 넣어 상기 입자 외면에 상기 음이온성 고분자층을 정전기적 인력으로 코팅하는 단계를 포함하는 유전체 약물 전달용 나노입자 제조방법에 관계한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 상기 유전체 나노입자를 포함하는 아토피 치료제에 관련된다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 상기 아토피 치료제를 피부에 도포하는 단계 ; 및 도포된 상기 치료제에 초음파를 가하는 단계를 포함하는 아토피 치료용 연고 사용 방법에 관계한다.
본 발명은 아토피 질환 유전자를 표적하는 핵산 하이드로젤 입자 외곽에 양이온성 고분자층과 히알루론산 층을 더 포함하므로 피부 내 RNA를 분해시키는 효소로부터 핵산 입자를 보호할 수 있다.
또한, 본 발명은 마이크로 사이즈 또는 이에 준하는 나노 사이즈의 크기를 갖는 TNF-α siRNA 하이드로겔을 응축시켜 나노 사이즈로 입자 크기를 줄이고, 또한, 최외곽층을 (-) 전하를 띄는 히알루론산으로 코팅함에 따라 피부 장벽 통과가 용이한 유전체 나노입자를 제공할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일구현예에 의한 유전체 전달용 나노입자의 개념도를 나타낸다.
도 2는 본 발명의 일구현예에 의한 유전체 나노입자를 제조하는 방법을 도시한 것이다.
도 3은 TNF-α siRNA 기반의 유전체 나노의약품을 연고 형태로 만들어 아토피 질환 치료에 이용하는 것을 보여주는 모식도이다.
도 4는 TNF-α siRNA 기반의 유전체 나노의약품을 유화액 또는 현탁액으로 만들어 아토피 질환 치료에 이용하는 것을 보여주는 모식도이다.
도 5는 TNF-α siRNA 하이드로젤의 전기영동 분석 결과이다.
도 6은 실시예 1에서 제조한 나노입자의 사이즈 분포를 나타낸다.
도 7은 실시예 1에 의해 제조된 나노입자를 촬영한 TEM 이미지이다.
도 8은 실시예 1과 비교예 1, 비교예 2에서 TNF-α mRNA가 감소되었는지를 보여주는 gene knockdown 효과를 보여준다.
본 발명은 하기의 설명에 의하여 모두 달성될 수 있다. 하기의 설명은 본 발명의 바람직한 구체 예를 기술하는 것으로 이해되어야 하며, 본 발명이 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.
도 1은 본 발명의 일구현예에 의한 유전체 나노입지의 개념도를 나타낸다. 도 2는 본 발명의 일구현예에 의한 유전체 나노입자를 제조하는 방법을 도시한 것이다. 도 1을 참고하면, 본 발명의 유전체 나노입자는 핵산 하이드로젤 입자(10), 양이온성 고분자층(20) 및 히알루론산 외곽층(30)을 포함한다.
상기 핵산 하이드로젤 입자(10)는 아토피 질환 유전자를 표적하는 작은 간섭 RNA(siRNA), 안티센스 핵산(antisense nucleic acids) 또는 핵산 앱타머(aptamer)일 수 있으며, 바람직하게는 작은 간섭 RNA(siRNA)일 수 있다.
상기 핵산 하이드로젤 입자는 TNF-α (Tumor-necrosis factor-alpha, 종양괴사인자)를 표적하는 작은 간섭 RNA(siRNA) 또는 안티센스 핵산(antisense nucleiv acids)일 수 있다.
TNF-α는 염증반응에 포함되는 인자로 면역 세포의 조절 역할을 수행하고 있으며, 표피 분화 단백질로 하여금 아토피 질환에 걸렸을 시의 상태와 같은 표피의 형태 형성 및 기능을 갖도록 유도하는 것으로 알려져 있다. 본 발명에 사용되는 핵산은 TNF-α mRNA의 과발현을 막아주는 작은 간섭 RNA(siRNA) 또는 안티센스 핵산(antisense nucleiv acids)을 사용할 수 있다.
보다 구체적으로는, 아토피 질환 치료를 위한 유전체 약물로 공지된 siRNA로 구성된 siRNA 하이드로젤일 수 있다.
본 발명에 사용 가능한 TNF-α siRNA sequence는 다음과 같다.
Sense : 5′-GUCUCAGCCUCUUCUCAUUCCUGCT-3′
Antisense : 5′-AGCAGGAAUGAGAAGAGGCUGAGACAU-3′
상기 핵산 하이드로젤 입자, 바람직하게는 TNF-α siRNA 하이드로젤 입자는 그 자체로는 인체 내 RNA를 분해시키는 효소에 대해 무방비 상태이기 때문에 그 효능을 온전히 피부내부로 전달하기 힘들다는 문제점이 있다. 또한, 상기 TNF-α siRNA 하이드로젤은 입자 크기가 크게는 3~5㎛, 작게는 500nm 이상으로 최상층에 죽은 세포들이 서로 밀착 연결되어 있는 촘촘한 피부 세공을 투과하기에는 어려운 문제점이 있다.
도 2를 참고하면, 본 발명에서는 siRNA 자체가 음이온을 띄고 있다는 특성에 착안하여 양전하를 띄는 고분자로 상기 TNF-α siRNA 하이드로젤을 코팅하였다. 좀 더 구체적으로 살펴보면, 상기 양이온성 고분자층(20)은 상기 핵산 하이드로젤 입자(10)를 둘러싸며, 상기 핵산 하이드로젤 입자를 응축시킨다.
이 때, 상기 핵산 하이드로젤 입자와 양이온성 고분자의 중량비는 1 : 0.1~2, 바람직하게는 1 : 0.1~1, 더욱 바람직하게는 1 : 0.3 일 수 있다.
상기 핵산 하이드로젤 입자는 핵산 하이드로젤 하나당 생성되는 siRNA의 개수가 대략 102,000이고 siRNA 한 개의 중량평균 분자량이 90000~100000g/mole이라고 하면 중량평균 분자량이 1,377,000~1,479,000K 일 수 있으며, 양이온성 고분자는 중량평균 분자량이 5.1~250K 일수 있다.
상기 양이온성 고분자층와 핵산 하이드로젤 입자는 이온 상호 작용에 의해 응축된다. (-) 전하를 띄는 상기 핵산과 (+) 전하를 띄는 양이온성 고분자가 서로 혼합되면 응축(condense)될 수 있다. 좀 더 구체적으로, 강한 양전하를 가지는 키토산, 프로타민 설페이트(protamine sulfate) 또는 폴리에틸렌이민(branched PEI)이 음전하의 TNF-α siRNA 하이드로젤을 둘러싸면서 응축 또는 압축하여 TNF-α siRNA 하이드로젤의 입자 크기를 줄일 수 있다.
상기 양이온성 고분자는 키토산, 프로타민 설페이트(protamine sulfate), 폴리에틸렌이민, 폴리-L-라이신, 젤라틴, 양이온성 덱스트란(dextran), 덴드리머, 폴리아민 및 폴리비닐아민으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있다. 바람직하게는 상기 양이온성 고분자로는 생체적합성을 띠고 강한 양이온성을 가지며 제조가 용이한 것을 사용할 수 있다.
본 발명의 유전체 나노입자는 상기 양이온성 고분자층(20) 외면에 코팅된 음이온성 고분자층(30)을 포함한다.
상기 핵산 하이드로젤 입자 외면을 코팅하고 있는 양이온성 고분자층은 강한 양전하를 띠고 있어 아토피 질환의 병변인 피부장벽을 통과하기 힘들다는 문제가 있다. 본 발명에서는 이러한 문제점을 해결하고자 생체 적합성이 좋으며 음전하를 띄고 있는 음이온성 고분자를 사용하여 2차로 상기 양이온성 고분자층 외면에 코팅하였다.
상기 음이온성 고분자는 음전하를 띄며 생체적합성이 있는 고분자를 제한없이 사용할 수 있다. 상기 음이온성 고분자로는 히알루론산(Hyaluronic acid), 카복시 메틸 셀룰로스(Carboxy methyl cellulose), 펙틴(Pectin), 카보폴스(Carbopols), 폴리아크릴레이츠(Polyacrylates)를 사용할 수 있다.
상기 히알루론산(HA)은 기본단위로 디사카라이드 글루쿠로닌산-β(1-3) N-아세틸글루코즈-아민β(1-4)이 최고 50,000쌍으로 구성된 큰 복합 올리고사카라이드이다. 이는 세포외 매트릭스의 주요 성분으로써 생체 내에서 발견된다. 이의 3차 구조는 직경이 약 50㎚인 무작위(random) 코일 형태이다.
히알루론산(HA)은 전신 또는 국소적으로 인체의 질병과 질환을 치료하는데 사용되어 왔는데 그 이유는 질병 또는 질환이 있는 부위로 활성물질을 표적 제공하는 능력이 있기 때문이다(International Patent Publications No WO 91/041058 ＆ WO 93/16733). 실험동물에서 손상된 경동맥(손상 안된 대측 동맥에 대해)과 칼로렉탈(colotectal) 종양에서 HA가 형성됨을 볼 수 있고 이와 같은 실험동물의 피부에 유지된다는 것이 알려져 있다. 본 발명에서 사용가능한 상기 음이온성 고분자로의 중량평균 분자량은 5 ~ 90 K 범위일 수 있다.
히알루론산 등의 상기 음이온성 고분자층(30)은 상기 양이온성 고분자층(20) 외면에 정전기적 인력으로 코팅된다. 상기 핵산 하이드로젤 입자와 상기 히알루론산의 중량비가 1 : 0.5~2(핵산 하이드로젤 입자:히알루론산) 범위일 수 있다.
상기 음이온성 고분자층은 최외곽층을 형성하고, 따라서, 상기 유전체 나노입자도 그 외부가 (-)전하를 나타낸다. 정상 피부의 경우에는 입자 표면의 정전기적 성질이 피부의 투과에 영향을 약간 미치긴 하는데, 양이온성 성질이 이를 더 높인다고 알려져 있다. 하지만, 아토피 환자의 피부 같은 경우에는 피지 지질 (sebaceous lipid)과 상피 인지질 (epidermal phospholipid)에서의 지방산의 구조가 손상되며, 이러한 결과로 인한 피부의 산성도 (acidity)의 감소는 본 발명과 같이 negative 성질을 띤 음이온성 입자의 침투를 용이하게 만든다.
본 발명의 유전체 나노입자는 TNF-α siRNA 하이드로젤(코어), 양이온성 고분자층(중간쉘) 및 음이온성 고분자층(최외각쉘)로 구성되며, 입자 크기는 50~500nm, 바람직하게는 100~400nm, 더욱 바람직하게는 150~300nm일 수 있다. 본 발명의 유전체 나노입자는 코어로 제공되는 TNF-α siRNA 하이드로젤보다 입자 사이즈가 감소되었다.
본 발명은 아토피 질환 유전자를 표적하는 핵산 하이드로젤 입자 외곽에 양이온성 고분자층과 히알루론산 층을 더 포함하므로 피부 내 RNA를 분해시키는 효소로부터 핵산 입자를 보호할 수 있다.
또한, 본 발명은 마이크로 사이즈 또는 이에 준하는 나노 사이즈의 크기를 갖는 TNF-α siRNA 하이드로젤을 응축시켜 나노 사이즈로 입자 크기를 줄이고, 또한, 최외곽층을 (-) 전하를 띄는 히알루론산으로 코팅함에 따라 피부 장벽 통과가 용이한 유전체 나노입자를 제공할 수 있다.
다른 양상에서 본 발명은 유전체 나노입자를 제조하는 방법에 관계한다. 상기 방법은 응축 단계 및 음이온성 고분자층 코팅 단계를 포함한다.
상기 응축단계는 아토피 질환 유전자를 표적하는 핵산 하이드로젤 입자와 양이온성 고분자를 혼합하여 이온 상호 작용으로 핵산 하이드로젤 입자를 응축시키는 단계이다.
상기 음이온성 고분자층 코팅단계는 음이온성 고분자를 넣어 상기 입자 외면에 상기 음이온성 고분자층을 정전기적 인력으로 코팅하는 단계이다.
상기 핵산 하이드로젤 입자는 TNF-α (Tumor-necrosis factor-alpha, 종양괴사인자)를 표적하는 작은 간섭 RNA(siRNA) 또는 안티센스 핵산(antisense nucleiv acids)이고,
양이온성 고분자는 키토산, 프로타민 설페이트(protamine sulfate), 폴리에틸렌이민, 폴리-L-라이신, 젤라틴, 양이온성 덱스트란(dextran), 덴드리머, 폴리아민 및 폴리비닐아민으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상이고,
음이온성 고분자는 히알루론산(Hyaluronic acid) 또는 카복시 메틸 셀룰로스(Carboxy methyl cellulose), 펙틴(Pectin), 카보폴스(Carbopols), 폴리아크릴레이츠(Polyacrylates)일 수 있다.
예를 들면, 상기 응축 단계는 TNF-α siRNA 하이드로젤을 프로타민 설페이트(protamine sulfate)와 w/w (weight/weight) 1:0.3 비율로 섞은 후 상온에서 중성pH(6.5~7.5) 조건에서 반응시킬 수 있다.
상기 핵산(예를 들면, siRNA 하이드로젤) 과 양이온성 고분자의 중량비는 1 : 0.1~2, 바람직하게는 1 : 0.1~1일 수 있다. w/w의 비가 1 : 0.5이하의 환경에서는 더욱 응축되다가 1 : 1 이상으로 양이온성 고분자가 추가될 경우 나노 입자가 어그리게이션되어 마이크로 이상의 사이즈가 될 수 있다.
상기 응축단계 및 코팅단계에 대해서는 앞에서 상술한 나노입자의 내용을 참고할 수 있다.
본 발명은 상기 유전체 나노입자를 포함하는 아토피 치료용 조성물이거나 화장료 조성물일 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물은 다른 아토피 치료제와 상기 유전체 나노입자가 혼합된 것일 수 있다.
상기 아토피 치료용 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제 및 주사제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형일 수 있다.
상기 아토피 치료용 조성물이 크림, 젤, 연고, 유화액, 현탁액, 분무제 또는 경피 전달성 패치제로 사용될 수 있다.
유화액, 현탁액일 경우에는 경피 주사나 경피 전달성 패치제로 사용될 수 있다.
상기 화장료 조성물은 아토피용 비누, 클렌징 폼, 클렌징 크림, 클렌징 워터, 목욕제, 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 로숀, 크림, 에센스, 아스트린젠트, 유액, 젤, 립스틱, 분무제, 샴푸, 린스, 트리트먼트, 바디클렌져, 팩, 마사지제, 페이스파우더, 콤팩트, 파운데이션, 투웨이케이크 및 메이크업베이스로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 제형으로 제조될 수 있으나, 이로 한정되지 않는다.
본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 젤인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라가칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 사용될 수 있다.
본 발명은 상기 아토피용 연고, 크림, 젤 또는 페이스트를 피부에 도포하는 단계 및 도포된 상기 연고에 초음파를 가하는 단계를 포함하는 아토피 치료용 연고 사용 방법에 관련된다. 도 3은 TNF-α siRNA 기반의 유전체 나노의약품을 연고 형태로 만들어 아토피 질환 치료에 이용하는 것을 보여주는 모식도이다.
도 3을 참고하면, TNF-α siRNA 기반의 유전체 나노입자가 함유된 연고를 아토피 질환이 나타나는 피부에 일정량 묻힌 뒤 충분한 시간 동안 초음파 트랜스듀서로 골고루 펴 발라 준다. 초음파 트랜스듀서로 초음파를 가하여 주면 유전체 나노입자가 초음파의 추진력을 받아 피부 내부로 강제 주입될 수 있다.
도 4는 TNF-α siRNA 하이드로젤 기반의 유전체 나노입자가 함유된 유전체 나노의약품을 유화액 또는 현탁액으로 만들어 아토피 질환 치료에 이용하는 것을 보여주는 모식도이다. 도 4를 참고하면, 경피 주사나 마이크로니들을 이용하면, 유화액 또는 현탁액에 함유된 TNF-α siRNA 하이드로젤 기반의 유전체 나노입자가 표피 기저층(stratum basale)에 보다 쉽게 도달될 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위해 바람직한 실시예를 제시하지만, 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1
아토피 질환 치료용 유전체 나노입자의 제조
Sense : 5′-GUCUCAGCCUCUUCUCAUUCCUGCT-3′, Antisense : 5′-AGCAGGAAUGAGAAGAGGCUGAGACAU-3′인 TNF-α siRNA 하이드로젤(구입처 바이오니아, 1.8 ug/ul(62uM))에 양이온성 고분자인 protamine sulfate를 중량비 1:0.3으로 섞어준 뒤에 5분 정도 인큐베이팅 하였다. 이후에 다시 표면 개질을 위하여 음이온성 고분자인 히알루론산을 중량비 1:1로 섞어준 뒤 5분 정도 인큐베이팅하여 아토피 질환 치료용 유전체 나노입자를 수득하였다.
TNF -α siRNA 하이드로젤 크기 측정
TNF-α siRNA 하이드로젤은 siRNA 기반으로 구성되어 있기 때문에 온전한 구성 여부를 전기영동을 통해 분석하였다. 도 5는 TNF-α siRNA 하이드로젤의 전기영동 분석 결과이다. 도 5를 참고하면, 1kb DNA ladder를 기준으로 TNF-α siRNA 하이드로젤이 400 basepair(bp) 이상의 크기를 갖는 것으로 확인되었다. 일반적으로 사용되는 siRNA의 경우 대략 21bp를 가지는데 반하여 siRNA 하이드로젤의 경우, 다수의 21bp siRNA가 뭉쳐 있는 형태로 존재하기 때문에 약 20 배 정도 큰 bp를 가진다.
제조된 나노입자의 특성 측정
실시예 1에서 제조된 유전체 나노입자의 사이즈 분포를 도 6에 나타내었다. 도 6을 참고하면, 유전체 나노입자의 크기가 200nm 범위를 가짐을 확인할 수 있다. 이러한 유전체 나노입자는 코어로 제공된 TNF-α siRNA 하이드로젤에 비해 크기가 대략 5μm에서 200nm로 25배 정도 감소되었다.
제타 포텐셜 측정
하기 표 1은 TNF-α siRNA 하이드로젤, 양이온성 고분자만 코팅된 하이드로젤 및 실시예 1과의 제타 포텐셜을 측정한 것을 보여준다.
Sample Zeta potential (mV)
TNF-α siRNA 하이드로젤 -18.2±3.75
1차 표면 코팅된 TNF-α siRNA 하이드로젤 20.3±5.25
TNF-α siRNA 기반의 유전체 나노의약품 1.75±0.44
표 1을 참고하면, TNF-α siRNA 하이드로젤 자체는 강한 음전하를 띄고 있고, 양전하를 띤 고분자로 1차 코팅한 결과 양전하를 띄게 되며. 마지막 단계로 음전하를 띤 고분자를 이용하여 2차 코팅한 실시예 1의 경우, 약한 음전하를 띄고 있음을 확인할 수 있다.
도 7은 실시예 1에 의해 제조된 나노입자를 촬영한 TEM 이미지이다. 도 7을 참고하면, 전반적으로 200 나노미터의 크기를 가지는 것으로 관찰되었으며, 그 이하의 크기도 존재하는 것으로 확인됨. 도 2의 모식도와 같이, TEM 결과를 보면 가장 안쪽에 TNF-α siRNA 하이드로젤이 존재하고, 그 바로 바깥층에 양전하를 띤 Protamine sulfate가 표면에 코팅되었으며, 가장 바깥층에 음전하를 띤 Hyaluronic acid가 코팅되어 총 3개의 층을 지니는 것을 확인할 수 있다.
mRNA 발현 억제 시험
TNF-α mRNA가 과발현되는 세포주인 Raw264.7에서 gene knockdown 실험을 진행하였다. Raw264.7 세포주는 쥣과(mouse)의 세포주로 macrophage(대식세포) 형태이다. 실험군은 각각 아무것도 처리하지 않은 Raw264.7 세포주(Control 군 ,비교예 1), 실시예 1와 비교예 2(아무 효과 없는 siRNA로 구성되고 히알루산을 외면에 코팅한 siRNA 기반의 유전체 나노의약품, Scrambled siRNA 기반의 유전체 나노의약품)의 총 3개의 군으로 수행하였다.
Raw264.7 세포주에 각각의 군에 해당하는 물질을 12시간 동안 처리한 후, PBS(Phosphate buffered saline)를 이용하여 처리된 물질을 깨끗이 제거하였다. 이후에 세포가 분화하여 자라날 수 있도록 양분을 공급해주는 DMEM 배지를 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 24시간 경과 후, 세포를 떼어내어 세포 분해 용액(Cell lysis buffer)을 섞어 세포 안의 내용물을 추출한 뒤 mRNA 추출 키트를 이용하여 원하는 mRNA만 얻어내었다. 얻어낸 mRNA를 각 군끼리 동일한 양으로 맞춰준 뒤 PCR 장치를 이용하여 양을 증폭하여 전기영동을 통해 각 군 간의 발현량을 확인하였다.
도 8은 실시예 1과 비교예 1, 비교예 2에서 TNF-α mRNA가 감소되었는지를 보여주는 gene knockdown 효과를 보여준다. 도 8의 β-actin은 세포에 풍부하게 존재하는 단백질로 일반적으로 PCR을 통한 전기영동 시 loading control로 사용된다. 도 8을 참고하면, 전기영동 상의 밴드 세기에서 확인할 수 있듯이 실시예 1의 유전체 나노의약품이 gene knockdown 효과가 Control 군에 비해 탁월함을 확인할 수 있다. 반면 비교예 2(아무 효능 없는 siRNA로 구성된 Scrambled siRNA 기반의 유전체 나노의약품)의 경우, gene knockdown 효과가 없어 Control 군과 유사한 밴드 세기를 보여주고 있다.
본 발명의 단순한 변형 내지 변경은 모두 본 발명의 영역에 속하는 것으로, 본 발명의 구체적인 보호범위는 첨부된 특허청구범위에 의하여 명확해질 것이다.
10 : 핵산 하이드로젤 입자 20 : 양이온성 고분자층
30 : 음이온성 고분자층

Claims (14)

  1. 아토피 질환 유전자를 표적하는 핵산 하이드로젤 입자 ;
    상기 핵산 하이드로젤 입자를 둘러싸고 응축하는 프로타민 설페이트(protamine sulfate)층 ; 및
    상기 프로타민 설페이트(protamine sulfate)층 외면에 코팅되고 (-)전하를 띄는 히알루론산층을 포함하는 유전체 나노입자로서,
    상기 핵산 하이드로젤 입자는 TNF-α (Tumor-necrosis factor-alpha, 종양괴사인자)를 표적하는 작은 간섭 RNA(siRNA) 또는 안티센스 핵산(antisense nucleiv acids)이고,
    상기 핵산 하이드로젤 입자와 프로타민 설페이트의 중량비가 1 : 0.1~2 범위이고, 상기 핵산 하이드로젤 입자와 상기 히알루론산의 중량비가 1 : 0.5~2(핵산 하이드로젤 입자:히알루론산) 범위이고
    상기 유전체 나노입자는 그 외부가 (-)전하를 나타내고,
    상기 유전체 나노입자는 입자의 크기가 50~300nm인 것을 특징으로 하는 아토피 질환 치료용 유전체 나노입자.
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  10. 아토피 질환 유전자를 표적하는 핵산 하이드로젤 입자와 프로타민 설페이트(protamine sulfate)층 를 혼합하여 이온 상호 작용으로 상기 핵산 하이드로젤 입자를 응축하는 단계 ; 및
    히알루론산을 넣어 상기 입자 외면에 상기 히알루론산을 정전기적 인력으로 코팅하는 단계를 포함하는 유전체 나노입자 제조방법으로서,
    상기 핵산 하이드로젤 입자는 TNF-α (Tumor-necrosis factor-alpha, 종양괴사인자)를 표적하는 작은 간섭 RNA(siRNA) 또는 안티센스 핵산(antisense nucleiv acids)이고,
    상기 유전체 나노입자 제조방법은 상기 핵산 하이드로젤 입자와 프로타민 설페이트의 중량비를 1 : 0.1~2 범위로 사용하고,
    상기 유전체 나노입자 제조방법은 상기 히알루론산을 상기 핵산 하이드로젤 입자 대비 중량비로 1 : 0.5~2(핵산 하이드로젤 입자:히알루론산)를 사용하고, 상기 유전체 나노입자는 입자의 크기가 50~300nm인 것을 특징으로 하는 유전체 약물 전달용 나노입자 제조방법.
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  13. 제 1항의 유전체 나노입자를 포함하는 아토피 치료제.
  14. 삭제
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WO2019074258A1 (ko) * 2017-10-12 2019-04-18 서강대학교 산학협력단 항암치료 및 유전자 치료용 나노입자를 포함하는 간동맥 화학색전술용 조성물

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