KR20190019129A - 개선된 세포 트랜스펙션 및 생존율을 위한 나노스트로 웰 인서트 디바이스 - Google Patents

개선된 세포 트랜스펙션 및 생존율을 위한 나노스트로 웰 인서트 디바이스 Download PDF

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라이언 티. 스워보다
유홍 차오
세르지오 릴-오티즈
스테파니 로트쾨터
니콜라스 에이. 멜로쉬
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더 보드 어브 트러스티스 어브 더 리랜드 스탠포드 주니어 유니버시티
더 보드 어브 트러스티스 어브 더 리랜드 스탠포드 주니어 유니버시티
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Abstract

전기 에너지(예를 들어, 전기천공 에너지)가 가해지는 때에 물질이 유체 저장 창고로부터의 멤브레인을 통해 나노튜브 상에서 성장되는 세포로 통과할 수 있도록 멤브레인을 거쳐 이의 외부로 연장되는 나노튜브를 포함하는 나노스트로 웰 인서트 장치(예를 들어, 디바이스 및 시스템)가 본원에 기재된다. 특히, 본원에 기재된 디바이스, 시스템 및 방법은 세포 성장 생존율 및 트랜스펙션 효율(예를 들어, >70%)에 적합해질 수 있다. 이러한 장치는 개선된 트랜스펙션 효율, 세포내 수송, 및 세포 생존율을 위해 세포 배양 공정으로 용이하게 통합 가능할 수 있다.

Description

개선된 세포 트랜스펙션 및 생존율을 위한 나노스트로 웰 인서트 디바이스
관련 출원에 대한 상호 참조
본 특허 출원은 2016년 6월 9일 출원된 미국 가특허 출원 제62/347,928호의 우선권을 주장하고, 상기 출원의 전체는 본원에 참조로 포함된다.
참조에 의한 포함
본 명세서에서 언급된 모든 공보 및 특허 출원은 각각의 개별 공보 또는 특허 출원이 참조로 포함되는 것으로 구체적으로 및 개별적으로 지시된 것과 같이 동일한 정도로 이의 전체가 참조로 본원에 포함된다.
연방 후원 연구에 대한 진술
본 발명은 국립 과학 재단(National Science Foundation)에 의해 수여되는 협정 1549696 하에 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에 특정 권리를 갖는다.
트랜스펙션(Transfection), 또는 일반적으로 지질 이중층에 걸친 시토졸 또는 핵으로의 분자 종의 전달은 세포 리프로그래밍(cell reprogramming), 세포내 이미징 및 감지, 분자 농업(molecular farming), siRNA 녹아웃, 약물 스크리닝(drug screening), 및 약제 요법을 포괄하는 다수의 적용에서 강력한 분석 도구이다. 그러한 광범위한 적용 범위를 충족시키기 위해서, 생물학자들은 신흥 기술을 지배하는 물리적 중재 기술로 생물학적, 화학적, 및 물리적 부류에 광범위하게 속하는 통상적인 트랜스펙션 접근법을 개발하였다. 이러한 방법들은 모두 세포를 거의 손상시키지 않고 가능한 높은 효율로 멤브레인을 횡단하는 것에 맞춰 회전한다. 그러나, 거의 반세기의 기술 혁신, 개발, 및 최적화에도 불구하고, 트렌스펙션 분야에는 세포로의 전달을 위한 보편적인 도구가 부족하다. 즉, 기존의 방법들은 모두 실험 설계 및 목적에 크게 의존하는 이점 및 단점을 갖는다. 원칙적으로, 이상적인 트렌스펙션 기술은 높은 처리량 및 세포 생리학의 보존으로 크기 또는 구조에 상관없이 어떠한 세포 유형으로 화물의 효율적인 수송을 가능하게 할 것이다.
VanDersarl 등(US 9266725호)은 흔히 사용되는 나노다공성 멤브레인 필터의 세포-침투형 구조물, 또는 나노스트로(Nanostraw)를 함유하는 나노유체 기재로의 처리를 포함하여 2012년에 바이오나노기술 분야에서 간단하지만 고급스러운 생체모방 혁신을 기술하였다. 나노스트로는 본질적으로 폴리머 필름에 엠베딩된 대략 100 nm의 직경을 갖는 금속 산화물 나노튜브 구조물이다. 나노스트로 기술은 독특하게도 생물활성 분자 화물의 전달, 또는 추출에 필수적인 실시간 비-파괴적 세포내 접근을 확립한다. 나노스트로 디바이스 상에 배양된 세포는 자발적으로 침투되어 세포 안 또는 밖으로 유체 물질 종의 전달 시에 안정한 외부 취급을 제공한다. 더욱이, 전기천공(electroporation)과 조합된 향상된 침투가 제안되었는데, 이는 결국 훨씬 더 높은 전달률을 야기할 수 있다.
본원의 작업은 일차 사용자, 즉, 학술 나노과학 실험실의 연구원으로부터의 나노스트로 기술을, 기술의 개발과 실제 영향 둘 모두를 가속화시킬 수 있는 인접한 학술 생물학 실험실과 같은 이차 사용자에게 이해시키는 것을 목표로 훨씬 더 광범위한 관점에서 동기가 부여되었다. 나노바이오기술 분야에서 이러한 종류의 기술 전달에 대한 장벽은 이것이 나노공학과 생물공학 둘 모두에서 전문성과 협업을 필요로 하기 때문에 전형적으로 어렵다. 이러한 목적상, 본원에 기재된 방법 및 장치는 트랜스펙션 효율 및 세포 생존율과 관련하여 측정되는 반복가능하고 균일한 디바이스 성능을 제공할 수 있다. 게다가, 본원에 기재된 방법 및 장치는 다중 세포 유형에 걸쳐 최적화된 성능으로 나노스트로 디바이스 제작을 제공할 수 있다.
발명의 요약
전기 에너지(예를 들어, 전기천공 에너지)가 가해지는 때에 물질이 유체 저장 창고(reservoir depot)로부터의 멤브레인을 거쳐 나노튜브 상에서 성장되는 세포로 통과할 수 있도록 멤브레인을 거쳐 이의 외부로 연장되는 나노튜브를 포함하는 나노스트로 웰 인서트 장치(예를 들어, 디바이스 및 시스템)이 본원에 기재된다. 특히, 본원에 기재된 장치(디바이스 및 시스템) 및 방법은 장기간 세포 성장 생존율(>5일) 및 트랜스펙션 효율(예를 들어, >70%)에 적합해질 수 있다. 이러한 장치는 개선된 트랜스펙션 효율, 세포내 수송, 및 세포 생존율을 위해 세포 배양 공정으로 용이하게 통합 가능할 수 있다.
예를 들어, 하나 이상의 나노스트로 웰 인서트 디바이스 및/또는 나노스트로 웰 인서트 디바이스(들)를 홀딩(holding)하도록 구성된 하나 이상의 어댑터(adapter)를 포함하는 나노스트로 세포 배양 시스템이 본원에 기재된다. 장기간 세포 성장 및 트랜스펙션을 위한 나노스트로 세포 배양 시스템은 나노스트로 웰 인서트 디바이스 및 나노스트로 웰 인서트 디바이스를 홀딩하도록 구성된 어댑터를 포함할 수 있다. 원통형 벽, 복수의 나노스트로가 돌출(projecting)되는 멤브레인, 및 웰을 형성하도록 원통형 벽의 기저부에 걸쳐 멤브레인을 연결하는 생체적합성 접착제를 전형적으로 포함하고, 나노스트로가 0.1 마이크론 초과(예를 들어, 0.1 내지 25 마이크론, 0.5 내지 5 마이크론, 1 내지 3 마이크론 등)로 웰에 돌출되는 것들을 포함하여, 임의의 적합한 나노스트로 웰 인서트 디바이스가 사용될 수 있다. 본원에서 보다 상세하게 기재될 바와 같이, 일부 변형예에서, 하프니아(hafnia)로 형성된 나노스트로를 사용하는 것이 특히 유리하다. 나노스트로 웰 인서트 디바이스를 홀딩하도록 구성된 어댑터는 하부 전극(base electrode)을 포함하는 기저부(여기서, 기저부는 복수의 나노스트로가 하부 전극 위의 저장 창고와 유체 소통되도록 나노스트로 웰 인서트 디바이스의 원통형 벽을 견고하게 홀딩하도록 구성된다); 상부 전극(top electrode)을 포함하는 커버(여기서, 커버는 나노스트로 웰 인서트 디바이스가 기저부 내에서 홀딩되는 때에 상부 전극이 하부 전극과 이들 사이에서 엔클로징(enclosing)되는 나노스트로 인서트 디바이스로, 예를 들어, 0.25 cm 내지 1.25 cm의 거리로 분리되도록 기저부에 맞물리도록 구성된다); 어댑터의 외표면 상의 제1 전기 접점(제1 전기 접점은 하부 전극과 전기적 소통된다); 및 어댑터의 외표면 상의 제2 전기 접점(여기서, 제2 전기 접점은 상부 전극과 전기적 소통된다)을 포함할 수 있다.
임의의 나노스트로 웰 인서트 디바이스는 원통형 벽을 가질 수 있다. 실린더는 임의의 적절한 높이(예를 들어, 1 cm 내지 5 cm, 1 cm 내지 3 cm, 1 cm 내지 2 cm 등) 및 폭(예를 들어, 0.5 cm 내지 5 cm, 0.5 cm 내지 2 cm, 0.75 cm 내지 1.5 cm 등의 외경(outer diameter: OD), 및 0.3 cm 내지 5 cm, 예를 들어, 0.3 cm 내지 2 cm, 0.4 cm 내지 1.4 cm 등의 내경(inner diameter: ID))을 가질 수 있다. 실린더의 횡단면은 원형, 타원형, 삼각형, 직사각형, 정사각형, 오각형, 팔각형 등일 수 있다.
멤브레인은 다공성 멤브레인일 수 있고, 여기서 복수의 나노스트로는 원통형 벽에 의해 형성되는 웰의 내부 상의 멤브레인 위에서 0.1 마이크론 초과(예를 들어, 0.1 내지 25 마이크론, 0.5 내지 5 마이크론 등)로 돌출된다. 복수의 나노스트로의 공극 직경은 10 nm 내지 1000 nm(예를 들어, 10 nm 내지 900 nm, 30 nm 내지 800 nm, 70 nm 내지 400 nm, 80 nm 내지 200 nm; 80 nm 내지 150 nm 등)일 수 있다. 생체적합성 접착제는 전형적으로 아크릴 접착제일 수 있다. 특히, 생체적합성 접착제는 양면 테이프, 예컨대, 아크릴 양면 테이프일 수 있다.
나노스트로 웰 인서트 디바이스를 홀딩하도록 구성된 어댑터는 일반적으로, 멤브레인의 바닥면(예를 들어, 나노스트로의 바닥 개구)이 저장 창고와 유체 소통되고 저장 창고가 자체로 하부 전극과 전기적 소통되도록, 어댑터 내에서 하나 이상의 나노스트로 웰 인서트 디바이스를 고정시키도록 구성될 수 있다. 어댑터의 내표면은 나노스트로 웰 인서트 디바이스가 저장 창고에 대해 지지되도록 캐비티(cavity) 내에 나노스트로 웰 인서트 디바이스의 원통형 벽 및/또는 바닥 림과 메이팅(mating)되고 이를 고정시키도록 구성될 수 있다. 저장 창고는 캐비티의 바닥에서 하부 전극에 의해 적어도 일부 형성될 수 있다. 어댑터는 일반적으로, 예를 들어, 멤브레인의 바닥과 저장 창고 사이에 공기(예를 들어, 기포)의 포집을 방지하기 위해 나노스트로 웰 인서트의 바닥과 저장 창고 사이에서 공기가 배출되도록 조정될 수 있다.
어댑터의 커버는 전형적으로 어댑터 내에 나노스트로 웰 인서트 디바이스를 엔클로징하기 위해서 나노스트로 웰 인서트 디바이스 상에서 핏팅되고 기저부와 메이팅된다. 어댑터의 커버는 일반적으로 나노스트로 웰 인서트 디바이스가 그 안에 완전히 엔클로징되도록 기저부 상에서 고정되도록 구성될 수 있다.
커버는 또한 상부 전극을 홀딩하고, 디바이스의 멤브레인의 나노스트로 상에서 성장하는 임의의 세포가 상부 전극과 하부 전극 사이에 위치되도록 상부 전극을 하부 전극으로부터 이들 사이의 나노스트로 웰 인서트 디바이스에 의해 소정 이격 거리로 위치시키도록 구성된다. 커버는 마찰 피트(friction fit), 스냅 피트(snap fit), 스크류-피트(screw-fit) 등으로 기저부에 고정될 수 있다. 어댑터의 외부 상의 전기 접점은 저장 창고로부터 유체 중의 물질을 나노튜브를 거쳐 하나 이상의 세포로 세포의 손상 없이 제어 가능하게(및 높은 효율로) 전달하기 위해 에너지를 가하도록 전압원에 연결될 수 있다.
예를 들어, 제1 전기 접점은 커버의 맨 위에 있을 수 있고, 제2 전기 접점은 기저부의 맨 아래에 있을 수 있다. 커버가 기저부와 맞물리는 경우, 상부 전극은 하부 전극과 그 사이가 예를 들어, 0.3 cm 및 0.8 cm로 분리될 수 있다.
상부 전극은 하부 전극의 표면적보다 작은 표면적을 가질 수 있다. 전극 둘 모두는 백금 및/또는 알루미늄을 포함하여 임의의 전도성 물질(동일하거나 상이함)일 수 있다. 예를 들어, 상부 전극은 0.1 내지 0.4 cm(예를 들어, 0.1 내지 0.3 cm, 0.1 내지 0.25 cm, 0.12 내지 0.22 cm, 0.15 내지 0.2 cm 등)의 직경을 갖는 디스크 전극(또는 디스크 표면)일 수 있고; 기저부는 나노스트로 웰 인서트 디바이스 하부 멤브레인의 바닥을 많이(>80%, >90%, 100%) 커버링하는 평면 전극일 수 있다. 저장 창고는 하부 전극의 하나 이상의 면에 의해 적어도 일부 형성될 수 있다. 예를 들어, 하부 전극은, 물질(예를 들어, 하나 이상의 세포로 트랜스펙션될 물질을 포함하는 유체)이 나노스트로 웰 인서트 디바이스의 바닥과 접촉되도록 배치되는 저장 창고의 일부 또는 이들 모두를 형성시키는 오목한 표면을 포함할 수 있다.
언급되는 바와 같이, 또한, 장기간 세포 성장 및 트랜스펙션을 위한 나노스트로 웰 인서트 디바이스가 본원에 기재된다. 어댑터의 나노스트로 웰 인서트 디바이스 중 어느 하나는 독립적으로 또는 시스템의 일부로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 나노스트로 웰 인서트 디바이스는 원통형 벽; 복수의 하프니아(HfO2) 나노스트로가 돌출되는 멤브레인; 및 웰을 형성시키도록 원통형 벽의 기저부에 걸쳐 멤브레인을 연결하는 생체적합성 접착제를 포함할 수 있고, 여기서 나노스트로는 0.1 마이크론 초과(예를 들어, 0.5 내지 5 마이크론 등)로 웰에 돌출된다.
원통형 벽은 특히 폴리카보네이트 튜브를 포함하여 임의의 적절한 물질일 수 있다. 언급되는 바와 같이, 나노스트로 웰 인서트 디바이스는 또한 멤브레인과 원통형 벽(튜브) 사이에 접착제를 포함할 수 있고; 예를 들어, 양면 아크릴 테이프와 같은 아크릴 접착제가 원통형 벽과 멤브레인 사이에 사용될 수 있다.
복수의 하프니아 나노스트로는 10 nm 내지 1000 nm(예를 들어, 10 nm 내지 900 nm, 30 내지 500 nm, 예를 들어, 70 nm 내지 130 nm, 80 nm 내지 120 nm 등)의 공극 크기를 갖는다. 복수의 하프니아 나노스트로는 0.1 마이크론 초과(예를 들어, 0.1 내지 25 마이크론, 0.1 내지 5 마이크론, 0.5 내지 3 마이크론 등)로 웰에 돌출된다. 전형적으로, 복수의 나노스트로는 각각 디바이스의 외부로부터 멤브레인을 거쳐 웰로 연장되는 연속 채널을 포함한다.
본원에 기재된 장치 및 방법이 전형적으로 나노스트로를 지칭하지만, 본원에 기재된 방법 및 장치는 또한 나노와이어와 사용될 수 있다.
또한, 세포를 성장시키기고/거나 트랜스펙션시키기 위해 본원에 기재된 임의의 장치를 사용하는 방법이 본원에 기재된다. 예를 들어, 세포를 배양하고 트랜스펙션시키는 방법으로서, 하나 이상의 세포를 나노스트로 웰 인서트 디바이스에서 5일 넘게 배양하는데, 나노스트로 웰 인서트 디바이스가 원통형 벽 및 웰을 형성하도록 원통형 벽의 기저부에 걸쳐 연장되는 멤브레인을 포함하고, 복수의 나노스트로가 멤브레인을 거쳐 0.1 마이크론 초과(예를 들어, 0.5 내지 5 마이크론 등)로 웰에 돌출되고; 복수의 나노스트로가 기저부에서 저장 창고와 유체 소통되도록 어댑터의 기저부로 나노스트로 웰 인서트 디바이스를 배치하는데, 저장 창고가 기저부에서 하부 전극과 유체 소통되고; 기저부 위에 커버를 배치하는데, 상부 전극이 나노스트로 웰 인서트 디바이스로 연장되고 상부 전극이 하부 전극과 0.25 내지 1.25 cm로 분리되도록 커버가 상부 전극을 포함하고; 하부 전극과 상부 전극 사이에 전압을 인가하여 저장 창고로부터의 물질을 복수의 나노스트로를 거쳐 하나 이상의 세포로 전달하고; 어댑터로부터 나노스트로 웰 인서트를 제거하고, 하나 이상의 세포를 나노스트로 웰 인서트에서 배양함을 포함하는 방법이 본원에 기재된다.
전압을 인가하는 것은 어댑터의 외표면 상의 제1 전기 접점과 어댑터의 표면의 외부 상의 제2 전기 접점 사이에 전압을 인가함을 포함할 수 있고, 여기서 제1 전기 접점은 어댑터의 내부에서 상부 전극과 전기적 소통되고, 제2 전기 접점은 어댑터의 내부에서 하부 전극과 전기적 소통된다. 전압은 특히 15V 또는 그 미만을 포함하여 약 0.1 V 내지 20 V일 수 있다.
임의의 이러한 방법들은 표적 물질을 세포로 전달하기 위해 전압을 인가하기 전 또는 그 후에 나노스트로 웰 인서트 디바이스에서 하나 이상의 세포를 이미징(imaging)시킴을 포함할 수 있다. 전압을 인가하는 것은, 예를 들어, 10 내지 500 마이크로초(예를 들어, 50 내지 400 마이크로초, 70 내지 300 마이크로초, 100 내지 200 마이크로초 등)의 펄스 폭을, 예를 들어, 1 Hz 내지 10 kHz(예를 들어, 15 Hz 내지 800 Hz, 20 Hz 내지 400 Hz, 10 Hz 내지 250 Hz 등)의 펄스 주파수로 인가함을 포함할 수 있다. 자극의 총 기간은 1 내지 600 초일 수 있다(예를 들어, 펄스가 있는 순 시간은 20 초 내지 120 초, 25 초 내지 100 초, 30 초 내지 80 초, 40 초 내지 60 초 등일 수 있다).
세포를 배양하는 것은 복수의 하프니아(HfO2) 나노스트로 상에 세포를 배양함을 포함할 수 있다. 일반적으로, 배양하는 것은 다중-웰 디시(예를 들어, 2, 4, 6, 8, 16, 32개 등의 다중-웰 디시)에서 나노스트로 웰 인서트 디바이스와 배양함을 포함할 수 있고; 성장 배지는 일반적으로 나노스트로 웰 인서트 디바이스에서(예를 들어, 웰 내에서) 둘 모두 배치될 수 있고, 또한 다중-웰 디시 내에서 나노스트로 웰 인서트 디바이스 주위에 배치될 수 있다. 다중-웰 디시의 커버는 나노스트로 웰 인서트 디바이스(들) 위에 배치될 수 있다.
임의의 이러한 방법들에서, 방법은 또한 나노스트로 웰 인서트 디바이스를 기저부에 배치하기 전에 저장 창고에 물질을 투입함을 포함할 수 있다.
본 발명의 신규한 특징들은 특히 후술되는 청구항들에서 기술된다. 본 발명의 특징 및 이점의 보다 우수한 이해는 본 발명의 원리가 이용되는 예시적인 구체예를 기재한 하기 상세한 설명, 및 첨부된 도면을 참조로 얻어질 것이다.
도 1a는 나노스트로 웰 인서트의 한 가지 예를 개략적으로 도시한 것이다. 도 1b는 예시적인 치수가 나타나 있는 이러한 인서트의 분해도를 보여주는 것이다.
도 2의 A는 세포를 배양하고 시험하기 위한 나노스트로 웰 인서트의 또 다른 개략도를 보여주는 것이다. 도 2의 A는 트랜스펙션 동안의 일반적인 나노스트로 웰 인서트 디바이스를 도시한 것이다. 이러한 예에서, 디바이스는 배양 웰을 제조하기 위해서 바닥에 결합된 나노스트로 멤브레인을 갖는 폴리카보네이트 튜브로 이루어진다. 세포는 웰 내에 배지가 있는 디바이스 웰에서 직접적으로 배양된다. 전기천공을 통한 트랜스펙션을 위하여, 디바이스는, 전달될 분자 종을 함유하는, 멤브레인 아래의 화물 저장소와 접촉되어 배치된다(본원에는 용액 중의 소구체, 예를 들어, 물 중의 DNA/RNA로서 나타나 있음). 전기 펄스는 세포막에서 공극을 개방하기 위해 두 개의 백금 전극에 걸쳐 발사되어 세포내 접근을 가능하게 한다. (도 2의 A에서, 세포 및 나노스트로는 축척으로 도시되지 않음). 도 2의 B는 주사 전자 현미경(scanning electron microscopy)을 통해 이미징된 나노스트로를 보여주는 것이고; 스트로 길이는 전형적으로 1 내지 3 마이크론의 범위이고, 외경은 대략 100 nm이다. 도 2의 C 및 도 2의 D는 실제 디바이스 원리를 도시하고자 나노스트로 멤브레인 상에 극저온-고정된 CHO 세포의 인조색 SEM 이미지를 도시한 것이다. 이와 같은 나노스트로는 세포막을 자발적으로 침투하는 것으로 입증되었고, 인가된 전기 펄스는 전달 효율을 향상시킬 수 있다.
도 3a는 도 2의 A 내지 도 2의 D에 나타나 있는 나노스트로 웰 인서트 디바이스를 위한 예시적인 파라미터를 도시하는 표이다. 도 3b는 도 2의 A 내지 도 2의 D에 나타나 있는 나노스트로 웰 인서트 디바이스를 위한 예시적인 기술적 파라미터를 도시한 것이다. 도 3a 및 3b의 표에 제공된 값은 단지 한 가지 예를 나타내는 것이고, 본원에서 보다 충분히 기재되는 바와 같이 다른 예들이 이용될 수 있음을 주지하라.
도 4의 A 내지 도 4의 C는 나노스트로 웰 삽입 디바이스의 형성에 개략적인 공정 흐름을 도시한 것이다. 도 4의 A에서, PCTE 멤브레인은 p-타입(100) 실리콘 캐리어 웨이퍼 상에서 마운팅(mounting)된다. 도 4의 B.1 내지 B.4는 나노스트로를 포함하는 멤브레인의 제작을 도시한 것이다. 도 4의 C.1 내지 C.3은 배양 플레이트에서 생물학적 시험을 위한 준비가 된 나노스트로 웰 인서트 디바이스의 어셈블리를 도시한 것이다.
도 5는 나노스트로 인서트의 생산의 개요를 보여주는 그래프이다.
도 6의 A 내지 도 6의 D는 기재 상의 알루미나 층의 원자층 증착을 도시한 것이다. 공정은 일반적으로 층별 필름 성장을 발생시키기 위해 반응성 가스 전구체의 교대 펄스를 포함한다. 도 6의 A에서, Al2O3 필름 공정은 알루미늄 운반 전구체(TMA, 또는 트리메틸 알루미늄)의 첨가에 의해 개시된다. 도 6의 B에서, TMA 전구체는 기재 상에서 자연적으로 흡착된 표면 하이드록실 기와 반응하여 알루미늄을 산소에 결합시키고, 부산물로서 메탄을 방출한다. 도 6의 C에서, 모든, 또는 거의 모든 표면 산소 자리가 TMA 전구체 분자와 반응된 후에, H2O 증기는 챔버로 펌핑된다. 도 6의 D에서, 물 분자는 표면 알루미나 원자와 반응하여 "단층"의 알루미나, Al2O3를 형성시킨다. 이러한 공정은 요망되는 필름 두께가 달성될 때까지 반복된다.
도 7의 A는 Al2O3 필름을 성장시키는데 사용될 수 있는 Savannah 100 장치(Cambridge NanoTech)를 보여주는 것이다. 도 7의 B는 도 7의 A에 나타나 있는 디바이스를 작동시키기 위한 사용자 인터페이스를 보여주는 것이다. 도 7의 C에서, 압력 프로파일이 품질 제어 목적을 위하여 전구체 펄스 및 챔버 퍼지 특징을 모니터링하는데 사용된다. 도 7의 D 및 도 7의 E는 표준 ALD 증착 프로토콜을 통해 실리콘 상의 10 nm +/- 1 nm 두께의 알루미나 필름을 보여주는 5-점 엘립소미트리(five-point ellipsometry) 두께 균일성 시험 보고서를 보여주는 것이다.
도 8의 a 내지 도 8의 e는 사이클 횟수의 증가에 따른 폴리머 기재 상의 옥사이드 물질의 원자 층 증착을 위한 한 가지 가능한 메카니즘을 도시한 것이다. 도 8의 a에서, 가스 전구체의 확산은 임계 사이클 횟수 이후에 차단되고, 불균일한 확산은 표면 거칠기로서 표현된다. 엘립소미트리를 통해 측정하는 경우에 실리콘 상의 알루미나 증착의 두께는, 도 8의 e에서 보여지는 바와 같이, SEM로부터 추정되는 두께와 비슷하다. SEM으로부터의 두께 관찰은 몇 가지 가능한 인공적인 원료로부터 왜곡될 수 있다: 폴리머 탈기로부터의 비정질 물질이 ALD 진공 조건 동안 증착될 수 있고, SEM 준비를 위해 은/금 스퍼터링이 이미징 동안 두께, 및 상당한 표면 하전을 부가한다. 그러나, 개방된 공극은 SEM을 통해 용이하게 이미징되고, 품질 제어에 도움을 줄 수 있다.
도 9는 실리카 나노스트로를 보여주는 SEM이다(100 nm의 공극 크기). 실리카 구조에 대한 세포 생존율은 매우 우수했지만, 트랜스펙션을 위한 표준 생물학적 프로토콜은 비슷한 알루미나 스트로보다 덜 효율적이었다.
도 10의 A 내지 도 10의 C는 하프니아 나노스트로의 제작 및 특징화를 보여주는 것이다. 도 10의 A에서, 하프니아 나노스트로는 Savannah 200(Cambridge Nanotech)을 이용하여 성공적으로 제작되었다. 도 10의 B 및 도 10의 C는, 스트로 길이 전체에 따라 균일한 직경을 갖는 것으로 보이는 깨끗하고 개방된 공극을 보여주는, 상이한 배율의 하프니아 나노스트로의 SEM 이미지를 보여주는 것이다.
도 11의 A 내지 도 11의 D는 본원에 기재된 바와 같은 나노스트로 웰 인서트 장치의 적어도 일부를 어셈블링하는 한 가지 방법을 도시한 것이다. 도 11의 A는 관형 몸체(예를 들어, 폴리카보네이트 튜브) 및 접착제(양면-스틱 테이프)를 보여주는 것이고; 도 11의 B는 바닥 표면 상의 접착제와 관형 몸체를 보여주는 것이고; 도 11의 C에서, 기재 상의 나노스트로는 관형 몸체에 양면 테이프를 통해 결합되어 있다. 인서트는 도 11의 D에서 웰에 삽입되어 나타나 있다.
도 12는 모델 세포주로의 핵산 전달의 발현을 위한 표준 트랜스펙션 프로토콜의 예를 도시한 것이다. 이러한 예에서, 방법에는 전형적으로, 전좌(translocation)가 발현에 필요한지의 여부에 좌우하여, 살균에서 이미지 분석까지 24 내지 72시간이 소요된다. 트랜스펙션 단계는 살균, 세포 배양, 전기천공, 세포 인큐베이션, 및 광학 현미경을 포함한다.
도 13은 더 긴 세포 배양 및 트랜스펙션 방법을 도시한 것이다(예를 들어, 본원에 기재되는 개선된 나노스트로 웰 인서트 장치에서 배양하는 것을 포함하여 5일 넘게 소요됨).
도 14의 A 내지 도 14의 G는 본원에 기재된 장치 및 방법을 이용한 모델 세포주로의 핵산의 전달을 도시한 것이다.
도 15a는 나노스트로 웰 인서트 및 전기천공 어댑터 또는 캐리어를 포함하는 장치의 예를 보여주는 것이다. 도 15b는 어댑터/캐리어의 기저부에 삽입되어 있는 웰 인서트를 보여주는 것이고; 도 15c는 세포가 위에 배양된 나노스트로 웰 인서트를 홀딩하는 폐쇄된 어댑터/캐리어를 보여주는 것이다. 어댑터/캐리어 및 엔클로징된 나노스트로 웰 인서트는, 전류의 전달을 위해 전기천공 장치에 배치함을 포함하여, 배양된 세포를 보호하면서 홀딩되고 조종될 수 있다.
상세한 설명
생세포의 시토졸 및/또는 핵으로의 외부 물질, 전형적으로 핵산의 트랜스펙션, 또는 수송 및 통합은 세포 리프로그래밍, 세포내 이미징 및 감지, 분자 농업, siRNA 녹아웃, 약물 스크리닝, 및 약제 요법을 포함하는 광범위한 세트의 현대 생물학, 생물의학, 및 생물공학 방법을 위한 필수 기술이다.
VanDersarl 등은 종래에 분자 화물의 세포내 전달, 및 추출의 목적을 위하여 세포 내부로 연속적인 유체 접근을 확립하는 간단한 생체모방 나노구조물, 또는 "나노스트로"를 보고하였다. 나노스트로는 광범위하게 사용되는 폴리머 멤브레인 필터에 엠베딩된 대략 100 nm의 직경을 갖는 금속 산화물 나노튜브 구조물이다. 나노스트로 디바이스 상에 배양된 세포는 자발적으로 침투되어 세포로의 유체 물질 종의 전달에 대한 안정한 외부 취급을 제공한다. 나노스트로는 비교적 짧은 시간 규모에 걸쳐 이온으로부터 분자를 6000개의 염기 쌍 DNA 구조로 성공적으로 전달하는 것으로 입증되었다. 더욱이, 기존 문헌은 관심의 대상이 되는 화물의 전달을 위해 나노스트로 접근과 통합된 전기천공의 복합 효과를 강조하고 있다. 나노스트로 플랫폼의 안정성, 다양성, 및 비-침습성 성질로 인해, 이러한 기술은 세포의 기본 생물학을 이해하려는 목적으로 세포내 접근을 위한 보편적인 해결책에 대한 가능한 후보로서 자리 잡고 있다.
도 4의 B1-B4는 세 가지 단계 공정을 보여주는 나노스트로 멤브레인 제작의 개요를 도시한 것이다. 트랙-에칭된 멤브레인 필터(B.1)는 금속 산화물 원자 층 증착을 통해 코팅된다(B.2). 증착 공정 후, 상부 금속 산화물 표면 층은 플라즈마에서 에칭된 반응성 이온이다(B.3). 나노스트로 길이는 지지용 폴리머 매트릭스에 선택적인 산소 플라즈마 에칭을 통해 제어된다(B.4). 출발 트랙-에칭된 멤브레인 공극 크기가 선택되는 경우, 모든 나노스트로 치수는 조정될 수 있다: 스트로 길이, 밀도, 외경 및 내경.
모델 세포(예를 들어, CHO, HEK293)에 대한 세포-막에 걸친 물질의 전달/추출의 일관된 확인에도 불구하고, 스트로-시토졸의 자발적인 침투의 경우는 최근에 확률적으로는 10% 미만의 확률로(~ 5 내지 15회 침투/세포) 발생하는 것으로 보고되었다. 연속적인 새는 접근은 세포에 바람직하지 않고 해로울 수 있지만, 침투의 증가는 설계 및 최적화를 확실히 복잡하게 할 수 있는 유도장을 필요로 한다. 특히, 전기천공은 침투 및 전달의 경우를 증가시키는 것으로 입증되었지만; 제곱센티미터 디바이스 면적(~100,000개의 세포/단층)과 관련하여 비교적 불균일한 공간 트랜스펙션 효율(transfection efficiency: TE)이 내부 관찰로 보고되었다. 유도장과 관련된 비교적 가능성이 없는 자발적인 침투 및 공간적으로 불균일한 트랜스펙션 효율은 기존의 디바이스 제작에 있어서 문제가 되는 것으로 증명되었다.
다수의 이러한 문제들을 해결할 수 있는 나노스트로 장치 및 방법이 본원에 기재된다. 예를 들어, 본원에 기재된 방법 및 장치는 면역 세포 리프로그래밍 및 줄기 세포 변형과 같은 광범위하게 다양한 생물학적 적용에 사용될 수 있다. 본원에 기재된 나노스트로 툴은 향상된 균일성을 가질 수 있으며, 특히, 종래의 디바이스에 비해 증가된 세포 생존율을 제공할 수 있다.
세포간 전달을 위한 나노스트로 웰 인서트의 생산은 다섯 가지 단계 공정이다: (1) 실리콘 캐리어 웨이퍼 상의 트랙-에칭된 폴리머 멤브레인 필터의 마운팅 및 배치(도 4의 A); (2) 트랙-에칭된 나노다공성 폴리머 멤브레인 상의 금속 산화물의 컨포말한 원자 층 증착(ALD)(도 4의 B.1 및 B.2); ALD의 상부 표면의 방향성 이온 에칭으로 폴리머 노출(도 4의 B.3); 폴리머 멤브레인의 산소 플라즈마 에칭으로 나노스트로 길이 제어(예를 들어, 1 내지 3 마이크론)(도 4의 B.4); 및 고리형 접착 테이프를 통한 나노스트로 웰 인서트 디바이스의 어셈블리 및 과도한 나노스트로 멤브레인의 트리밍(도4, C.1 내지 C.3).
도 5에 도시된 바와 같이, 나노스트로 인서트의 생산은 고정된 치수, 가요성 치수, 및 형태 인자와 관련된 고려 사항을 기초로 하여 3개의 생산 노드(production node)로 분해될 수 있다. 상업적으로 입수 가능한 폴리머 멤브레인은 다양한 고정된 출발 치수, 예컨대, 나노스트로 밀도(예를 들어, 106개 공극/cm2 내지 109개 공극/cm2), 스트로 외경(예를 들어, 50 nm 내지 10 μm), 및 멤브레인 두께(예를 들어, 5 μm 내지 20 μm)를 제공한다. 가요성 치수/특성, 예컨대, 벽 두께, 내경, 스트로 높이, 거칠기, 팁의 날카로운 정도(tip sharpness), 및 생물학적 적합성(기능화)은 ALD을 위한 물질 선택, 뿐만 아니라 각각의 증착 및 에칭 처리 파라미터에 의해 좌우된다. 예를 들어, 도 2의 A 내지 2의 D를 참조하라. 다양한 마이크로유체 설계가 이용될 수 있지만, 본원에 기재된 나노스트로 웰 인서트 장치는 본원에 기재된 바와 같이 구성될 수 있다.
도 5는 나노스트로 웰 인서트 생산의 노드를 보여주는 공정 흐름이다. 원료 물질(단계 I) 준비로 출발하여, 그 다음은 나노스트로 제작(단계 II, III, 및 IV)이고, 디바이스 어셈블리(단계 V)로 종결된다. 제1 노드(즉, 원료 물질)는 폴리머 물질 및/또는 밀도의 선택 및 준비를 포함할 수 있다. 제2 노드에서의 처리 단계(즉, 나노스트로 제작)는 나노스트로 치수, 예컨대, 내경, 길이 및 스트로 물질을 충족시키도록 조정될 수 있다. 제3 노드(디바이스 어셈블리)는 디바이스 형태 인자를 설정할 수 있다.
이전 단계와 비교하여, 본원에 기재된 방법은 균일한 나노스트로 웰 디바이스와 표준 세포주로 일관하여 75 퍼센트가 넘는 트랜스펙션 효율 둘 모두를 수득할 수 있다.
트랙 에칭된 폴리머는 상대적인 이용 가능성 및 산업적 경험에 좌우하여 선택될 수 있다. 궁극적으로, 폴리머 물질은, 하기에서 논의되는 바와 같이, 세포 배양, 증착, 및 플라즈마 공정 조건과 상용 가능해야 한다. 폴리카보네이트(PC) 트랙 에칭된(PCTE) 멤브레인은 큰 규모의 여과 및 세포 배양 적용을 위해 사용되고 있다. 따라서, PCTE는 본원에 기재된 나노스트로 제작을 위한 나노다공성 멤브레인 기재의 한 가지 예이다. PCTE에 더하여, 또한, PET, 또는 폴리에틸렌 테레프탈레이트의 기재가 본원에 기재되는데, 발명자들은 이들을 이의 적용가능한 유리 전이 온도 및 높은 투명도로 인해 제작, 배양, 및 이미징 조건에 적합한 것으로 확인하였다.
한 가지 예에서, PC 필름의 롤-투-롤(roll-to-roll) 제조는 이용될 수 있는 예시적인 공정이다. 공정은 소정 두께(~5-20 μm)로 PC 필름을 압출시키고, 필름을 특정 밀도(나노스트로 제작의 경우, 2-4 x 107개 공극/cm2)의 베타 입자 침투에 필름을 노출시키는 것으로 이루어진다. 공극들이 도입되면, 공정 엔지니어들은 공극들을 UV 광 및 염기성 용액(1M NaOH)과 조합하여 요망되는 직경(<100 nm)으로 습식 에칭시키고, 소수성을 조정하기 위해 선택된 습윤제로 변형시킨다. 전형적으로 사용되는 습윤제의 예는 세포 배양을 위해 표면 친수성을 증가시키는데 사용되는 폴리비닐피롤리돈(PVP)이다.
처리된 PCTE의 회수 시에, 그리고 추가의 처리 단계 전에, 멤브레인은 외과용 가위를 이용하여 1.5 cm x 1.5 cm 정사각형 조각으로 절단되고, P-타입(100) 실리콘 웨이퍼 상에 사분면으로 위치되고, 캡톤 프로세싱 테이프(kapton processing tape)를 통해 코너에서 마운팅된다. 정사각형 길이는 멤브레인 정사각형 당 4개의 디바이스, 즉, 16개의 디바이스/웨이퍼가 생산될 수 있도록 나노스트로 웰 디바이스의 크기에 의해 결정된다. 디바이스 제작에서 약간의 침입형 멤브레인 물질을 희생시킴에도 불구하고, 멤브레인은 내부-배치식 처리 조건(within-batch processing condition)을 로깅(logging)하여 품질 보증 프로토콜을 추가로 개발하기 위해서 이와 같이 위치된다. 더욱이, 잔여의 침입형 멤브레인 물질은 SEM과 같이 파괴 특징화를 위해 흔히 사용된다. 은 스퍼터링(silver sputtering)은 나노스트로를 세포독성으로 효과적으로 만드는 나노스트로 표면 화학을 변화시키는 것으로 관찰되었다. 그러나, 품질 제어 과정을 개발하려는 방향으로, Au가 더 생체적합성인 것으로 입증되었기 때문에 스트로 형태와 트랜스펙션 성능 사이에 연관성을 조사하기 위해 금 스퍼터링이 잠재적으로 사용될 수 있다
원자 층 증착(ALD)은 열적으로 및/또는 플라즈마(PEALD) 또는 라디칼 종의 사용에 의해 강화될 수 있는 화학적 기상 증착(chemical vapor deposition) 기술이다. 원자 층 에피택시(atomic layer epitaxy), 또는 ALE 기술은 1990년대 후반에 비-에피택셜 증착을 포함하도록 변형되었고, 최근에는 원자 층 증착으로 지칭되었다. ALD는 MOSFET 기술을 위한 금속 산화물 고-k 게이트 물질 및 폴리머용 마모/보호 코팅을 포함하지만 이로 제한되지 않는 다양한 박막 기술에서 흔히 사용된다. 최근 수년간 ALD의 개발 및 가능성은 확장가능한 가공 기술의 진보 및 광범위한 가공 물질 및 전구체에 의해 특징화될 수 있는데, 이 둘 모두는 비용-효율성 및 물질 적합성과 관련하여 ALD 적용을 위한 시장을 확장시켰다.
ALD를 위한 기본 원리는 가열된 기재 상의 필름의 층별 성장이다. 이러한 증착 방법에서, 두 개의 화학적 전구체들이 이들의 높은 상대 반응성 때문에 선택되고, 표면에서 반응을 제어하기 위해 공정 챔버에 순차적으로 도입된다. 원칙적으로, 각각의 반응 단계는 자기-종결식(self-terminating)이다. 첫 번째 단계는 제1 반응물 전구체에 기재 표면을 노출시키고, 이후 반응물을 다른 곳으로 펌핑시키는 것을 포함한다. 이러한 노출 동안, 제1 반응물은 효과적으로는 기재 표면에 흡착된 "단층" 분자들 뒤에 남는다. 챔버는 이후 비워지고, 제2 반응물이 챔버로 도입된다. 이러한 제2 전구체는 단층의 제1 반응물과 반응하여 추구되는 한 층(전형적으로 전체 층보다 더 적은)의 고형 필름을 형성시킨다. 이후, 남아 있는 제2 반응물 및 임의의 가스 상 반응 생성물은 챔버로부터 제거된다. 도 6의 A 내지 6의 D에 도표로 도시된 이러한 공정은 요망되는 두께의 필름을 성장시키기 위해 필요한 만큼 여러 번 반복된다.
원자 층 증착은 전형적으로 다른 화학적 기상 증착 기술에 비해 오히려 느린 증착 속도(대략 옹스트롬/min)인 것이 특징이지만, ALD의 이점은 원자 수준에 대한 "디지털(digital)" 두께 제어(예를 들어, 필름 두께는 ALD 사이클의 횟수를 변화시킴으로써 원자적으로 제어될 수 있음); 덜 단단한 기재, 예컨대, 폴리머 및 일부 페이퍼와의 적합성을 가능하게 하는, 비교적 낮은 온도 및 압력; 지지 기재에 높은 종횡비로 컨포말한 필름 성장(가스 전구체는 임의의 노출된 표면에 이를 수 있다. 즉, 커버리지는 비-PEALD 공정의 경우에 시선(line-of-sight) 증기 공급원에 의해 제한되지 않음); 및 규모의 절약으로 비교적 저렴한 증착을 포함한다. 초고속 증착(~ 0.5nm/sec, 전형적인 ALD의 속도의 대략 300x)은 롤-투-롤 코팅 및 병렬 공간 처리로 달성될 수 있다.
본원에 기재된 나노스트로 생산은 높은 종횡비 구조물의 성장을 위해 나노미터 해상도를 활용하도록 선택적인 에칭과 함께 이러한 컨포말한 필름 증착을 이용할 수 있다.
ALD 공정을 제어하기 위한 파라미터는 시스템 전반에 걸친 온도 설정 지점, 전구체(Al2O3의 경우 TMA 및 H2O) 흐름 특징, 및 시스템 평형을 위한 지연 시간을 포함할 수 있다. 필름 균일도는 ALD 공정을 개시하기 전에 멤브레인의 산소 플라즈마 세정으로 향상될 수 있다. 사용되는 표준 필름 성장 파라미터에 의해서 p-타입 실리콘 상에서 5 % 이내의 웨이퍼 균일도로 10 nm +/- 1 nm의 대략적인 증착이 얻어진다(예를 들어, 도 7d에서 5개 지점의 분석을 참조하라). 실리콘 상의 Al2O3 필름 두께는 3 옹스트롬 해상도로 엘립소미트리를 통해 측정되었다. 실리콘 상의 알루미나 증착 두께는 폴리카보네이트 상의 증착 두께와 연관시키기 위해 사용되었다. 실제 ALD 두께는 FEI 주사 전자 현미경을 이용하여 완전 제작된 나노스트로의 측벽 두께로서 측정되었다(예를 들어, 전자 빔에 대해 표준인 도 8의 e를 참조하라).
도 7에서, 표준 Al2O3 필름은 도 7의 A에 나타나 있는 Savannah 100 장치(Cambridge NanoTech)를 이용하여 성장되었다. 도 7의 B는 도 7의 A에 나타나 있는 장치를 작동시키기 위한 사용자 인터페이스를 보여주는 것이다. 도 7의 C에서, 압력 프로파일이 품질 제어 목적으로 전구체 펄스 및 챔버 퍼지 특징화를 모니터링하기 위해 사용된다. 도 7의 D 및 도 7의 E는, 표준 ALD 증착 프로토콜을 통한 실리콘 상의 10 nm +/- 1 nm 두께의 알루미나 필름을 보여주는, 5-점 엘립소미트리 두께 균일도 시험 보고서를 보여주는 것이다.
원자 층 증착을 통해 박막을 증착시키는 경우(<10nm), 흔히 기재 표면 특성을 고려하는 것이 중요하다. 특히, 폴리머 상의 ALD의 경우에, 표면 거칠기는 자기-제한적 층별 성장에 이르기 전에 폴리머 물질로 확산되는 초기 ALD 사이클(15 내지 30회 사이클)에 기인할 수 있다. 임계 사이클 횟수를 넘어서면, ALD 물질은 결국 폴리머에 대한 확산 배리어로서 작용하고, 순차적인 성장이 진행될 수 있다. 폴리머 상의 ALD 핵형성/성장에 대한 메카니즘은, 문헌에 의해 지시되는 바와 같이, 도 8의 a 내지 도 8의 d에 도시되어 있다.
실험 관찰, 임피던스 분광법(impedance spectroscopy), 및 SEM으로부터, 실제 증착 두께는, 엘립소미트리를 통해 측정되는 실리콘 웨이퍼 상의 10 nm의 증착에 대략적으로 상응하는, 대략 15 내지 30 nm 가량의 범위인 것으로 여겨진다(예를 들어, 도 8의 e를 참조하라). 이러한 두께 추정치들 간의 불일치는 도 8의 a 내지 도 8의 e에 도시된 메카니즘의 고려를 통해 합리화될 수 있으며; 초기 핵형성 단계 동안 TMA 전구체의 확산 영역은 폴리머 상에 이미 확산 배리어가 존재한 경우에 예상될 요망되는 10 nm 증착에 효과적으로 추가될 수 있다. 고-종횡비의 절연 물질에 대한 SEM에는 흔히 스퍼터 물질 두께 형태의 인공물 및 전자 빔으로부터의 표면 하전이 수반된다. 다시 말해서, ALD 두께의 SEM 추정치는 정성적으로 이해되어야 한다.
생물학적 표면의 상호작용은 나노스트로의 외벽 상에서 우세하게 발생한다. 세포 접착과 표면 거칠기 사이의 강한 연관성을 뒷받침하는 증거가 있으며, 본원의 모델은 ALD 공정으로부터 표면 거칠기가 실제로 나노스트로-세포 침투에 유익할 수 있다는 것을 나타내고 있다. 이는 배치 내에서 공간적으로 균일한 디바이스 트랜스펙션 효율의 관찰과 일치한다.
상기 언급된 바와 같이, 나노스트로는 종래에 기재되어 있고, 알루미나로부터 최적화되었다. 놀랍게도, 요망되는 특성을 갖는 나노스트로는 실리카 또는 하프니아(HfO2)를 포함하는 다른 물질들로 형성될 수 있다는 것이 발견되었다. 이러한 물질들은 보다 용이하게 크기가 조정될 수 있으며, 또한 배양 시 세포 생존율과 또한 트랜스펙션 효율 둘 모두에 대하여 개선된 성능을 제공할 수 있다.
실리카(SiO2) 나노스트로는 실리카의 관찰된 생체적합성과 표면 화학으로 인해 TE와 CU 둘 모두의 관점에서 잘 수행될 것으로 예상되었다. 놀랍게도, 그러한 스트로의 생체적합성은 높았지만, 트랜스펙션 효율은 현저히 낮았다. 실리카 결정 구조는 실란 화학을 통해 세포 적합성을 유도하도록 용이하게 기능화될 수 있다. 추가로, 등전점(isoelectric point), 또는 수용액 중의 물질의 표면 전하가 중성인 pH는 알루미나보다 유의하게 더 낮다(~ 2-3 대 ~8-9).
나노스트로 물질의 등전점은 나노스트로-매개된 전달을 위한 용액 조건이 생체적합성이어야 하기 때문에, 즉, pH ~ 7에서 완충되어야 하기 때문에 나노스트로로서 작동할 때에는 물질의 특성과 관련될 수 있고, 스트로를 통해 세포로 통과되는 심지어 하전된 물질의 경우에도 포착되지 않아야 하는(또는 "점착성" 증명) 것으로 예상될 수 있다. 실리카 표면은 음으로 하전될 수 있는 반면, 알루미나 표면은 벌크 용액에 대해 양성일 것이다. 알루미나의 경우에, 양으로 하전된 표면은 음으로 하전된 핵산, 즉, 플라스미드 DNA의 수송에 바람직하지 않은 영향을 미칠 수 있는데, 그 이유는 이러한 화물이 전달 프로토콜 동안 높은 결합 확률, 및 나노스트로 내 클로깅(clogging)을 가질 수 있기 때문이다.
도 9는 실리카 나노스트로 물질의 예를 도시한 것이다. 실리카 나노스트로 제작은 100 nm 공극 크기의 나노스트로에 대한 것으로 나타났다. 실리카 구조 상의 세포 생존율은 탁월했지만, 트랜스펙션에 대한 표준 생물학적 프로토콜은 덜 최적인 것으로 증명되었다. 폴리카보네이트 상의 실리카 ALD는 또한 전구체 가스와 폴리머 기재 사이에 감소된 적합성을 가졌다. 흡착 커버리지 시간은 폴리카보네이트 상의 알루미나보다 폴리카보네이트 상의 실리카의 경우에 더 느렸다. 이러한 흡착 시간의 차이는 폴리카보네이트에 흡착된 알루미늄 전구체보다 폴리카보네이트에 흡착된 실리카 전구체에 대한 더 높은 활성 배리어에 기인할 수 있다. 이러한 흡착 배리어를 고려해 볼 때, 폴리카보네이트의 융점(~150 ℃)을 위반하지 않으면서, 실리카 원자 층 증착은 레독스 표면 화학에 더 잘 맞도록 플라즈마 강화되었다. 전구체 TDMAS, 또는 트리스(디메틸아미노)실란, 및 H2O는 상당한 흡착 커버리지를 위해 기재와의 계면에서 플라즈마 상에 사용되었다. 플라즈마 상 중의 물질 종은 가스 상과는 상이하게 거동했다. 이러한 프로토콜에 있어서 한 가지 난제는 실리콘-운반 플라즈마가 스트로에 아래로 도달할 수 있게 하여 다음 사이클 단계로 진행되기 전에 완전한 단계 커버리지 및 컨포말한 코팅을 보장하는 것이었다. 이는 전형적으로 층에 대한 더 높은 플라즈마 선량(~104 L)에 의해 저해된다. 나노스트로 디바이스를 위한 폴리카보네이트 상의 SiO2 ALD는 섭씨 60 내지 100도의 ALD 윈도우에서 입증되었다. 그러나, 더 높은 플라즈마 선량과 실리카 층의 원자 규모 표면 거칠기 사이의 관계는 처리 동안 폴리카보네이트 멤브레인 품질을 보존한다는 맥락에서 아직 충분히 조사되지 않았다.
놀랍게도, 하프니아(HfO2) 나노스트로는 예기치않게도 알루미나와 비교해서도 유리한 것으로 밝혀졌다. PCTE 멤브레인에 대한 저온 하프니아(HfO2) ALD 파라미터는 알루미나 파라미터와 유사하다. 하프니아 전구체, 테트라키스 (디에틸아미노) 하프늄 (TDEAH) 및 H2O는 알루미나 나노스트로에 대하여 앞서 기재된 바와 같이 열적으로 향상될 수 있다. 예를 들어, Savannah 200 ALD 시스템(상기 도 7a 참조)은 유사한 방식으로 사용될 수 있다. 그러나, 알루미나 스트로와 비슷한 크기의 하프니아 나노스트로의 사용은 더 높은 TE를 가졌다. 이는 하프니아의 등전점이 대략 7이라서 수용액에서 표면 화학이 전달 동안 대개 중성일 수 있기 때문일 수 있다. 중성 표면 화학은 용액에서 하전된 분자를 끌어 당기지 않을 것이고; 그에 따라서 화물의 클로깅 가능성이 낮을 것이다.
하프니아는 알루미나의 경우와 같이(상기 논의됨) 염소-기반 에칭 화학(BCl3)에 더하여 불소-기반 에칭된 화학(CF4)를 통해 에칭된 반응성 이온일 수 있다. 불소 화학의 이점은 염소-기반 에칭 화학의 유지와 관련된 비용, 수고, 및 위험에 비해 규제 및 유지가 상대적으로 용이하다는데 있다.
도 10은 하프니아 나노스트로를 도시한 것이다. 도 10의 A에 나타나 있는 바와 같이, 하프니아 나노스트로는 알루미나-기반 나노스트로와 유사한 가공 프로파일을 이용하여 Savannah 200(Cambridge Nanotech)을 사용함으로써 성공적으로 제작되었다. 도 10의 B에서, 하프니아 나노스트로는, 도 10의 C에도 나타나 있는 바와 같이, 깨끗하고 개방된 공극을 나타내고, 전체 스트로 길이를 따라 균일한 직경을 갖는 것으로 보인다. 하프니아는 저온 증착, 비교적 중성인 등전점, 및 불소-기반 에칭 화학과의 잠재적인 적합성의 이점을 제공한다.
나노스트로 생산은 비교적 느린 ALD 속도에도 불구하고 더 높은 처리량으로 규모가 조정될 수 있다. 열적 강화된 ALD 반응기에서의 증착 속도는 병렬로 뿐만 아니라 큰 기재 면적에 걸쳐 다양한 공정 가스의 투입을 위해 시간-제한적 도메인에서 공간 도메인으로 이동시킴으로써 상당히 증가될 수 있다. 3600 ALD 코팅된 웨이퍼/시간만큼 높은 처리량이 보고되었다. 또한, 가요성 폴리머 기재의 사용은 롤-투-롤 가공으로 ALD 코팅을 가능하게 할 수 있다.
본원에 기재된 임의의 나노스트로는 나노스트로를 형성시키는 때에 상부 금속 산화물 층을 에칭시키기 위해 이방성 건식 에칭 공정을 이용하여 형성될 수 있다. 예를 들어, 건식 에칭 기술은 이방성 에칭 프로파일을 발생시킬 수 있고, 선택성과 방향성의 이유로 최근 몇 년 동안 선호되고 있다. 에칭 공정은 일반적으로 다섯 가지 카테고리로 분류되어 그룹화될 수 있다: 스퍼터 에칭, 화학적 에칭 또는 가스화, 가속화된 이온-보조 에칭, 측벽-보호된 이온-강화 에칭, 및 반응성-이온 에칭.
용어 반응성-이온 에칭은 흔히 이방성 에칭을 지칭하는데 사용되고 있지만; 이는 전반적으로 옳지 않다. 저-밀도 플라즈마에서, 즉, 0.01 내지 1 mA/cm2의 전류 밀도의 경우, 실제 에칭률(etch rate)을 달성하기에는 충돌하는 이온이 너무 적게 존재한다. 그러나, 이온 플럭스를 퍼붓는 보다 최근의 고-밀도 플라즈마-에칭 시스템에서, 1 내지 10 mA/cm2의 전류 밀도의 경우, 충분한 농도의 "헝그리 이온(hungry ion)"이 기재를 수용하기 위해 형성될 수 있다. 그러한 경우에, 용어 반응-이온 에칭이 적절하다.
플라즈마 에칭에서 중요한 고려 사항 중 하나는 필름/기재에서의 온도 상승이다. 표면 상에서 충돌하는 플라즈마-에칭 종 및 스퍼터링된 원자는, 예를 들어, 증발원에서 나오는 비슷한 원자보다 훨씬 더 활발하다. 이온 충격, 응축, 및 반응 동안, 유리된 과도한 에너지가 기재를 통해 소산되어야 하고(진공에서의 열 소산은 방사성이기 때문에), 그렇지 않으면 이는 필름 품질에 해롭게 과도하게 가열할 수 있다.
플라즈마에 침지된 필름 또는 기재 표면으로부터 원자의 에칭 또는 제거는 물리적 수단과 화학적 수단 둘 모두에 의해 일어난다. 이온 에너지 및 압력을 변화시키는 것은 주된 물질-제거 공정을 바꾼다. 예를 들어, 물리적 스퍼터 에칭은 가장 낮은 압력(~1 mtorr) 및 가장 높은 에너지(keV)에서 일어난다. 표면 손상 메카니즘을 통한 이온-보조 에칭은 더 낮은 에너지 및 다소 더 높은 압력(~50 mtorr)에서 이루어진다. 둘 모두의 경우에, 표면 에칭은 이방성이 되려는 경향이 있다. 그러나, ~1 torr의 상승된 압력에서의 화학적 에칭의 경우, 활발한 이온 충격이 방지되고, 그 결과 필름의 등방성 공격이 발생한다. 실제 플라즈마 에칭 공정에서 다수의 이온 종의 질량이 크기 때문에, 이의 운동은 RF 장과 서로 일치하지 않을 수 있다. 그 결과, 이온-변위 진폭 및 에너지는 일반적으로 너무 낮아서 스퍼터링을 일으키지 않는다.
PlasmaQuest ECR 에쳐에서, 플라즈마는 전자-사이클로트론 공명 효과(electron-cyclotron resonance effect)에 의해 형성된다. 마이크로파는 가스에서 전자의 사이클로트론 공명 주파수에 맞춰 조정된다. 이들은 원자의 전자를, 원자에서 제거되어 가스를 이온화시키기에 충분한 운동 에너지를 얻는 지점으로 여기시킨다. 이는 플라즈마가 방전 없이 플라즈마 내 이온의 온도를 유의한 정도로 증가시키지 않으면서 형성될 수 있게 한다. 따라서, 생성된 플라즈마는 저온 및 저밀도를 가질 수 있고, 또한, 본원에 기재된 나노스트로를 형성시키는 플라즈마 에칭을 포함하여, 폴리머 기재 상의 플라즈마 에칭에 유용할 수 있는 높은 이온 분율을 갖는다.
본원에 기재된 나노스트로의 제작은 전형적으로 산화를 포함한다. 가스(예를 들어, 10%의 O2, 90%의 Ar)의 이온화에 의해 생성된 전자는 전기장에서 에너지를 얻는다. 이러한 활발한 전자와 중성 가스 분자 사이의 후속 충돌은 화학적 활성 원자, 자유 라디칼, 이온 및 자유 전자를 생성시키는 분자로의 에너지 전달을 야기한다. 소산되고 무해한 연소 생성물은 가스 스트림 출구에서 운반된다. 이러한 공정은 독성 화학물질을 사용하지 않으면서 주위 온도 부근에서 일어나며, 이는 알루미나, 실리카, 및 하프니아와 같은 금속 산화물 구조체 상에서 폴리머에 대해 매우 선택적이다.
플라즈마 산화의 메카니즘의 경우, 특징, 즉, 에칭률, 선택도, 거칠기 등은 RF 전력(W), 챔버 압력(mTorr), 가스 분압(mTorr), 챔버 압력, 및 기재 온도와 같은 플라즈마 특징의 함수일 수 있다.
표준 에칭 프로토콜은 1.0 내지 1.5의 나노스트로 길이(30 내지 45도 시야각 고려)를 수득할 수 있는 4회의 순차적인 에칭 사이클을 포함한다. 이러한 나노스트로 길이 범위에 걸쳐 성능에 명확한 차이가 나는 경향은 지금까지 내부적으로 관찰되지 않았다.
나노스트로 웰 인서트는 본원에 기재된 임의의 나노스트로를 사용하여 제작되거나 어셈블링될 수 있다. 예를 들어, 도 11의 A 내지 도 11의 D는 본원에 기재된 개선된 방법을 이용하여 어셈블링된 나노스트로의 한 가지 예를 도시한 것이다. 도 11의 A에서, 고리형 양면 테이프(1101), 폴리카보네이트(PC) 튜브(1103) 및 나노스트로 멤브레인(1105)을 포함하는 나노스트로 웰 인서트 장치에 대한 구성 요소들이 나타나 있다. 디바이스 어셈블리는 PC 튜브를 절단하거나 형성시키고, 양면 테이프를 각각의 치수로 절단하거나 형성시키는 것을 수반한다. 도 11의 B에서, 양면 테이프가 튜브와 메이팅된 다음, 나노스트로 멤브레인에 튜브를 달라 붙게 할 수 있다(나노스트로가 튜브 안을 향해 배향). 임의로, 도 11의 C에 나타나 있는 바와 같이, 과도한 물질(1105')은 트리밍될 수 있다. 도 11의 D는 기존의 배양 웰 플레이트(1107)와 일체형이 된 나노스트로 웰 인서트 디바이스를 도시한 것이다. 따라서, 나노스트로 웰 인서트의 어셈블리는 고리형 양면 테이프의 한 면을 폴리카보네이트 튜브-웰의 한 단부에 테이핑하고; 양면 테이프의 반대 면을 나노스트로 멤브레인(나노스트로는 디바이스에 수직임)에 테이핑하고; 임의로, 표준 트리밍 도구를 이용하여 나노스트로 웰 인서트의 에지로부터 과도한 나노스트로 멤브레인을 절단하고 트리밍함을 포함할 수 있다.
어셈블리 후, 나노스트로 웰 인서트 디바이스는 물 중 70% 에탄올로 세정되고, 10 내지 15분 동안 공기 건조되고, UV 광에서 15분 동안 살균될 수 있다. 나노스트로 웰 인서트는 기존의 6-, 12- 및 24-웰 플레이트에 용이하게 피팅될 수 있으며, 친화적으로 이미징된다.
절단/트리밍 공정은 소정 규모로 금속 다이 커터에 의해 또는 폴리카보네이트 튜브-웰에 바로 CO2 레이저 용접에 의해 배치식으로 수행될 수 있다. 추가로, 튜브 웰의 치수는 인체공학적 고려 사항을 고려하여 설계될 가능성이 있을 수 있다.
본원에 기재된 임의의 나노스트로 웰 인서트 디바이스를 포함하여, 임의의 장치가 세포 배양, 및 특히 장기간 세포 배양(예를 들어, 5일 초과)을 위해 사용될 수 있으며, 임의의 시점에 세포의 내부 구조물에 접근하기 위해(물질을 세포로 트랜스펙션시키기 위해) 사용될 수 있다. 앞서 기재되고 특징화된 나노스트로 디바이스와 달리, 이러한 장치는 세포 생존율에 유의하게 영향을 미치지 않으면서 적어도 3주 이하를 포함하여 5일 초과 동안 사용될 수 있으며; 추가로, 이러한 기간 동안 임의의 시점에 나노스트로 구조물은 내부 세포 물질에 접근하기 위해 사용될 수 있다(예를 들어, 물질 전달, 물질 제거 등).
예를 들어, 도 12는 모델 세포주(예를 들어, CHO, HEK293T, 헬라(HeLa) 등과 같은)에 대한 단기간 종래의 표준 세포 배양 프로토콜을 도시한 것이다. 어셈블리 후, 나노스트로 웰 인서트 디바이스는, 예를 들어, 물 중 70% 에탄올로 살균되고, 10 내지 15 min 동안 공기 건조되고, UV 광(λ = 305nm) 하에 15 min 동안 배치될 수 있다. 일반적으로 말해서, 표준 프로토콜은 350 μl의 "일반(regular)" 배지(예를 들어, 10% 우태아혈청(Fetal bovine serum: FBS), Invitrogen 업체로부터의 DMEM 배지(Cat# 10564) 플러스 1X 페니실린/스트렙토마이신(Penicillin/Streptomycin: P/S))에서 4시간 이상 동안(전형적으로, 밤새 배양) 나노스트로 멤브레인의 상부 상에 세포를 배양함을 수반할 수 있다. 나노스트로 웰 인서트 장치는 350 μl의 1X 일반 배지(나노스트로 디바이스의 외부에서 제공)의 배쓰를 함유하는 24-웰 플레이트에 배치될 수 있다. 전기천공/트랜스펙션 후, 세포는 광학 현미경을 통한 분석 전에 추가 12-48시간 동안 배양된다.
본원에 기재된 바와 같이 형성된 것들을 포함하여 본 장치들은, 특히 알루미나 나노스트로를 포함하여 특히 앞서 기재된 것들에 비해, 세포 배양을 위하여 특히 장기간의 생존율(예를 들어, 5일 초과)을 갖는 것으로 밝혀졌기 때문에, 세포는 연장된 기간 동안 배양될 수 있다. 예를 들어, 도 13은 본원에 기재된 나노스트로 웰 인서트 장치를 사용하기 위한 한 가지 방법을 도시한 것이다. 도 13에서, 인서트는 먼저 살균되고, 이후 세포 배양을 위해 준비될 수 있다. 예를 들어, 세포 배양 배지는 인서트 디바이스의 내부에 추가될 수 있고, 인서트는 매우 적합한 전형적인 다중-웰 디시로 배치될 수 있다. 추가의 세포 배양 배지(동일하거나 상이한 배지)는 인서트가 배치되고 커버가 제공되는 디시에 추가될 수 있다. 세포가 또한 인서트 디바이스에 추가될 수 있다. 그 후에, 세포는 특히 매우 장시간(>5일)을 포함하여 요망되는 기간 동안 인큐베이션될 수 있다. 이는 세포 생존율이 3-4일 후에 급격히 떨어지는(예를 들어, 이 기간을 넘어서면 생존하는 세포가 절반 미만임) 종래의 나노스트로 디바이스 변형예와는 대조적이다. 본원에 기재된 장치는 5일 후에 >50%(예를 들어, >60%, >70% 등)의 생존율을 가질 수 있다.
상기 논의된 바와 같은 다중-웰 디시와 사용하기에 매우 적합하다는 것에 더하여, 본원에 기재된 나노스트로 웰 인서트 디바이스는 나노스트로 웰 인서트 디바이스를 견고하게 홀딩할 수 있는 전기천공 어댑터와 사용하기에 특히 적합할 수 있다. 전기천공 어댑터(본원에서 "셀 캡(cell cap)"으로도 지칭됨)는 이하에서 보다 상세하게 기재되고, 일반적으로 하부 전극과 인서트 디바이스의 바닥 사이에 기포/증기 형성을 방지하도록 또한 구성된 소정 거리로 나노스트로 웰 인서트 디바이스의 바닥이 하부 전극과 분리되게 보정된 화물 영역 위에서 홀딩될 수 있다. 캡 부분은 이후 제2 (상부) 전극이 기저 전극(bottom electrode)으로부터 고정된 소정 거리로 홀딩되고 인서트 디바이스에 돌출되도록 원통형 몸체 위에 배치될 수 있다. 전기천공 어댑터의 벽(셀 캡)은 절연될 수 있다(예를 들어, 열적 절연 및 전기적 절연 등). 캡은 또한 수송될 수 있도록(예를 들어, 전기천공 장치로) 장치를 밀봉할 수 있고, 상부 전극 및 하부 전극과 소통되는 외부 접점을 할 수 있어서, 전기천공은 장치의 외부로부터 수행되어, 화물(예를 들어, 플라스미드, 단백질 등)을 하부 전극 상의 화물 용액 영역으로부터 나노스트로를 거쳐 세포로 제어가능하게 수송할 수 있다.
나노스트로 웰 인서트 디바이스 및 전기천공 어댑터(셀 캡)를 최적화시키기 위해서, 트랜스펙션 효율(TE) 및 세포 생존율(CV)에 영향을 미치는 것으로 여겨지는 인자들이 정량화되었다. 이들 중에서, 시험된 인자들은 다음과 같았다: 컨플루언시(confluency), 상부 전극 기하학적 구조, 전극-전극 거리, 인가 전압 및 자극 기간, 상부 용액에서의 삼투압, 및 전기천공 전 세척 배지. 컨플루언시는 25,000개의 세포와 함께 가장 우수한 TE 및 CV를 갖는 25,000개의 세포 내지 200,000개의 세포로부터 시험되었다.
전극 거리는 나노스트로 디바이스 상에서 세포로 전달되는 전계 강도에 대해 중요한 역할을 하는 것으로 관찰되었다. 0.25 cm 내지 1.25 cm의 거리는 0.5 cm로 검사되어 비교적 더 높은 TE 및 CV를 보여주었다. TE 및 CV는 전계 강도의 증가(즉, 더 짧은 전극-전극 거리, 더 높은 인가 전압, 및 더 긴 자극 기간)과 반비례 관계에 있었다. 모델 세포주는 15V 이하의 인가 전압에서 80% 초과의 CV로 생존하였지만; 세포사(cell death)는 이러한 임계 전압 초과에서 빠르게 증가되었다. 전극 기하학적 구조는 평면, 점, 및 나선형 구성 사이에서 성능에 유의한 기여를 하는 것으로 관찰되지 않았다. 더 낮은 삼투압의 용액으로 전기천공 직전에 신선한 배지로 교체하는 것은(PBS 대 "일반" 배지)는 더 건강한 세포 및 더 높은 트랜스펙션율을 지시하였다.
따라서, 일부 변형예에서, 나노스트로 웰 인서트 디바이스 및/또는 전기천공 어댑터에 내장된 전극의 사용은 TE와 CV 둘 모두를 향상시키는데 중요할 수 있다. 예를 들어, 상부 전극과 하부 전극 사이의 분리는(둘 사이에 나노스트로 기재로, 인가 전압이 <15 V인 때에 쇼트는 최적으로 0.25 cm 내지 1.25 cm, 예를 들어, 0.3 cm 내지 0.8 cm일 수 있음). 이러한 범위 밖에서(예를 들어, > 1.25 cm), 세포 생존율, 특히, 더 긴 배양 시간 동안 세포 생존율이 급격히 떨어졌다.
한 가지 예로서, 본원에 기재된 장치를 검사하기 위해서 모델 세포주에서 핵산을 이용한 전기천공 트랜스펙션 프로토콜이 사용되었다. 전기천공을 통한 각각의 트랜스펙션 전에, 기저 Pt 전극(하부 전극)을 표준 킴와이프(Kimwipe)를 사용하여 물 중 70% 에탄올로 세정하였다. 60 μl의 액체 전달 전구체(예를 들어, 화물 용액, 예컨대, 핵산, 플라스미드, 단백질, 형광 염료, Co+2 등)을 전달 저장소로 떨어뜨렸다(도 2의 A 참조). 사전-배양된 나노스트로 웰 디바이스는 전달 전구체 홀더(예를 들어, 전기천공 어댑터/셀 캡) 내에 배치될 수 있고, 나노스트로 멤브레인의 바닥으로 액체 전달 전구체의 완전한 습윤을 보장하기 위해 약간의 압력이 가해질 수 있다. 상부 Pt 전극을 이후 기저 Pt 전극의 대략 0.7 cm 위에서 나노스트로 웰 디바이스 용액으로 낮추었다. 이전의 관찰로 볼 때, 전기를 적용하기 전에 1분을 허용하는 것이 중요하다. 이는 단순한 확산을 통해 전달 전구체로 나노스트로 멤브레인의 완전한 습윤을 보장하기 위해서이다.
확산을 위한 시간을 허용한 후에, DC 전기를 나노스트로 웰 디바이스에 걸쳐(예를 들어, 전기천공 홀더/셀 캡에 걸쳐) 적용하였다. 표준 전극 구성은 각각 기저 및 상부 전극에 대하여 음극 및 양극이다. 음으로 하전된 전구체는 상부 용액 및 세포 배양에 전기적으로 위를 향하게 될 수 있다. 표준 DC 펄스 프로파일은 다음과 같다: 10 V의 전압, 200 μs의 개별 펄스 폭, 20 Hz의 주파수, 40 초의 총 기간. 전기를 펄스화한 후, 나노스트로 웰 디바이스는 개방된 전기공극으로 종의 확산을 허용하기 위해 추가 몇 분 동안 전달 전구체와 접촉된 채로 유지되어야 한다. 디바이스는 이후 이미징 전에 추가 12 내지 48시간 동안 인큐베이터에 다시 배치된다.
도 14의 A 내지 도 14의 F는 모델 세포주로의 핵산의 전달이 상기 논의된 바와 같은 제작 및 실험 파라미터 최적화를 통해 향상될 수 있다는 것을 도시한 것이다. 도 14의 A에는 녹색-형광성 헬라 세포로의 올리고뉴클레오타이드 전달이 나타나 있다(녹색 채널 형광이 헬라 세포 컨플루언시를 지시하기 위해 사용됨). 도 14의 B에서, 적색 채널은 적색 염료 트랜스펙션을 지시하기 위해 이미징에 사용된다. 도 14의 C에는 트랜스펙션 효율을 정량화하기 위한 합쳐진 녹색 및 적색 채널이 나타나 있다. 이러한 예에서, TE는 > 90%이고; 상기 기재된 나노스트로 웰 인서트 플랫폼을 이용한 이러한 높은 TE 결과는 재현가능하고 꽤 효율적이었다. HEK 293T 세포 녹색-형광성 CHO 세포로의 플라스미드 전달을 또한 검사하였다. 이러한 예에서, HEK 293T 모델 세포주로의 pEGFP 전달은 > 75%의 효율을 나타냈다. 도 14의 D에서, 청색 채널을 세포 확인을 위해 Hoeschst 염색을 이미징하는데 사용하였고; 도 14의 E에서, TE의 정량화를 위한 pEGFP 발현 및 형광을 이미징하는데 녹색 채널을 사용하였다. 추가로, 녹색 형광성 CHO 세포로의 pmCherry 전달이 있는 표준 트랜스펙션 프로토콜은 >75%의 TE를 수득하였다(CHO 세포 확인을 위한 녹색 채널을 보여주는 도 14의 F, 및 TE 정량화를 위해 pmCherry 플라스미드 발현 및 형광에 대한 녹색 채널을 보여주는 도 14의 G에 나타나 있음). 모든 광학적 이미지를 동일한 노출(200ms)에서 각각 취하고, 여러 배율로 이미징시켰다(도 14의 A 내지 도 14의 C는 20x 배율이고, 도 14의 D 내지 도 14의 G는 10x 배율임).
이제 도 1a 내지 1b로 돌아가면, 나노스트로 웰 인서트 디바이스(101)가 나타나 있다. 이러한 예에서, 나노스트로 웰 인서트 디바이스는 인서트, 바람직하게는 투명한 물질, 예컨대, 폴리카보네이트로 형성된 원통형 몸체(103)를 포함한다. 나노스트로-함유 기재(105)는 양면 테이프(107)에 의해 실린더의 바닥 위에서 결합되어 세포가 성장될 수 있는 웰을 형성시킨다. 나노스트로 물질은, 특히, 하프니아와 같은 물질로 형성된 나노스트로일 수 있다. 도 1b는 원통형 몸체(103), 양면 테이프(107), 및 나노스트로 멤브레인(105)에 대한 예시적인 치수를 보여주는 나노스트로 웰 인서트 디바이스(101)의 분해도이다.
도 2의 A 내지 도 2의 D는 나노스트로 웰 인서트 장치의 또 다른 예를 도시한 것이다. 도 2의 A에는 트랜스펙션 동안의 포괄적인 나노스트로 웰 인서트 디바이스가 나타나 있다. 인서트 디바이스는, 언급된 바와 같이, 매칭하는 전달 전구체 홀더(예를 들어, 전기천공 어댑터/셀 캡)와 사용될 수 있다. 도 2의 A에서, 장치의 인서트 부분은, 상기 도 1a 내지 1b를 참조로 기재되는 바와 같이, 배양 웰을 제조하기 위해서 바닥에 결합된 나노스트로 멤브레인(205)이 있는 폴리카보네이트 튜브(203)로 이루어진다. 세포는 배지가 있는 디바이스 웰에서 바로 배양될 수 있다(상부 배지는 트랜스펙션 프로토콜에서 상술된 바와 같은 "일반 배지"임). 인서트 장치는 전달 전구체 홀더(예를 들어, 전기천공 어댑터/셀 캡)로 질화될 수 있거나 홀더/어댑터는 분리될 수 있다. 도 2의 A에서, 전기천공을 통한 트랜스펙션의 경우, 인서트는 전달시키고자 하는 분자 종을 함유하는 화물 저장소(209)와 접촉되어 배치된다(본원에서는 용액 중 소구체; 예를 들어, 물 중 DNA/RNA로 나타나 있음). 화물 저장소는 홀더/어댑터에서 형성될 수 있고, 트랜스펙션에 유해하게 영향을 미칠 수 있기 때문에 하부 전극(211)과 인서트의 멤브레인의 바닥 사이에서 기포가 형성되는 것을 방지하도록 구성될 수 있다.
전기 펄스는 이러한 예에서는 백금 전극으로 나타나 있는 상부 전극과 하부 전극 사이에서 발사되고; 이는 세포막에서 공극을 개방시켜 나노스트로를 통해 세포내 접근을 가능하게 할 수 있다.
도 2의 A 내지 도 2의 D는 이들 상에서 성장하는 세포를 포함하는 나노스트로 멤브레인의 일부를 형성할 수 있는 나노스트로의 주사 전자 현미경(SEM)을 보여주는 것이다. 이러한 예에서, 스트로 길이는 전형적으로 1 내지 3 마이크론의 범위이고, 외경은 대략 100 nm이다. 도 2c 내지 2d에서, SEM 이미지는 실제 디바이스 원리를 도시하기 위해 나노스트로 멤브레인 상의 극저온-고정된 CHO 세포를 보여준다. 나노스트로는 세포막을 자발적으로 침투하는 것으로 입증되었고, 전기 펄스는 "밸브(valve)"로서 작용하여 전달 효율을 향상시키는 작용을 한다.
이제 도 15a 내지 15c로 돌아가면, 나노스트로 웰 인서트 디바이스 및 적합성/매칭 전달 전구체 홀더(예를 들어, 전기천공 어댑터/셀 캡)을 포함하는 장치가 나타나 있다. 도 15a는 홀더(전기천공 어댑터 또는 셀 캡(1500)으로도 지칭됨) 내에 삽입된 나노스트로 웰 인서트(1501)를 보여주는 것이다. 나노스트로 웰 인서트는 실질적으로 도 1a 내지 1b 및 도 2의 A에서 상술된 바와 같다. 전기천공 어댑터는 인서트의 바닥이 평평해지고 하부 전극(1513)과 평행하도록 길어진 원통형 몸체(1515) 내에서 인서트를 고정시키도록 구성된다. 하부 전극은 어댑터의 바닥에 걸쳐 고정되고, 저장 창고(1503)를 홀딩하고 형성시키도록 평평하거나 오목할 수 있다. 언급된 바와 같이, 어댑터는 나노스트로 웰 인서트의 멤브레인과 하부 전극 사이에서 버블이 포집되는 것을 방지하도록 구성될 수 있고; 예를 들어, 어댑터는 인서트에서의 멤브레인의 평평한 바닥과 창고(1503) 사이에서 공기가 빠져나갈 수 있도록 측면 내에 및/또는 측면을 관통하는 하나 이상의 채널을 포함할 수 있다.
일반적으로, 전기천공 어댑터는 원통형 챔버 내에서 인서트를 견고하게 홀딩하도록 구성되고, 상부 전극(1509)을 포함하는 캡(1505)은 디바이스 내에서 홀딩되는 때에 인서트 위에서 결합될 수 있다. 캡은 마찰 피트 및/또는 기계적, 자성, 또는 그 밖의 결합(예를 들어, 스크류, 스냅 등)에 의해 그 위에서 제 자리에 홀딩될 수 있다. 캡은 특히 인서트 위에서 적어도 부분적으로 인서트 내에서 상부 전극을 제 자리에 홀딩할 수 있다. 전체 전기천공 어댑터는 상부 전극과 하부 전극 사이에서 본원에 최적으로 기재되는 바와 같이(예를 들어, 0.3 내지 0.8 cm, 또는 약 0.5 cm) 분리를 유지할 수 있다.
상부 전극(1509) 및 하부 전극(1513)은 나타나 있는 바와 같이 어댑터 내에 위치될 수 있지만, 상술된 바와 같이 전극에 걸쳐 전류를 인가하기 위해 전기천공 장치 내에 배치하는 것을 포함하여, 인서트가 어댑터의 무균 내부 챔버 내에서 홀딩되는 때에도 전체 장치가 수동으로 홀딩되고 조작될 수 있도록 어댑터 외부의 전기 접점에 하나 이상의 연결부를 포함할 수 있다.
본원에 기재된 임의의 방법(사용자 인터페이스 포함)은 소프트웨어, 하드웨어 또는 펌웨어로 구현될 수 있고, 프로세서에 의해 실행되는 때에 프로세서가 디스플레잉, 사용자와의 소통, 분석, 파라미터(타이밍, 주기, 세기 등) 변형, 결정, 또는 경보 등을 포함하지만 이로 제한되지 않는 임의의 단계들을 수행하는 것을 제어하도록 프로세서(예를 들어, 컴퓨터, 태블릿, 스마트폰 등)에 의해 실행될 수 있는 일련의 명령어들을 저장하는 비-일시적 컴퓨터-판독가능한 저장 매체로 기술될 수 있다.
특징 또는 요소(element)가 본원에서 또 다른 특징 또는 요소의 "위"에 있는 것으로 언급되는 경우, 이는 다른 특징 또는 요소 바로 위에 있을 수 있고/거나 개재되는 특징 및/또는 요소가 또한 존재할 수 있다. 대조적으로, 특징 또는 요소가 또 다른 특징 또는 요소의 "바로 위"에 있는 것으로 언급되는 경우, 개재되는 특징 또는 요소는 존재하지 않는다. 또한, 특징 또는 요소가 또 다른 특징 또는 요소에 "연결되어", "결합되어" 또는 "커플링되어" 있는 것으로 언급되는 경우, 이는 다른 특징 또는 요소에 바로 연결되거나, 결합되거나 커플링될 수 있고, 또는 개재되는 특징 또는 요소가 존재할 수 있음이 이해될 것이다. 대조적으로, 특징 또는 요소가 또 다른 특징 또는 요소에 "바로 연결되어", "바로 결합되어" 또는 "바로 커플링되어" 있는 것으로 언급되는 경우, 개재되는 특징 또는 요소는 존재하지 않는다. 한 가지 구체예에 대해서 기재되고 나타나 있을지라도, 이와 같이 기재되거나 나타나 있는 특징 또는 요소는 다른 구체예에 적용될 수 있다. 또한, 또 다른 특징에 "인접하여" 배치된 구조 또는 특징에 대한 언급은 그러한 인접한 특징과 겹치거나 그 아래에 있는 부분을 가질 수 있음이 당업자에게 인지될 것이다.
본원에 사용된 용어는 본 발명을 제한하고자 의도된 것이 아니고 단지 특정 구체예를 기술하려는 목적을 위한 것이다. 예를 들어, 본원에 사용된 단수형은, 달리 문맥에서 분명하게 지시되지 않는 한, 마찬가지로 복수형을 포함하는 것으로 의도된다. 추가로, 용어 "~을 포함하다" 및/또는 "~을 포함하는"은, 본 명세서에서 사용되는 경우, 명시된 특징, 단계, 동작, 요소, 및/또는 성분의 존재를 명시하는 것이지만, 하나 이상의 다른 특징, 단계, 동작, 요소, 성분, 및/또는 이의 그룹의 존재 또는 부가를 배제하는 것이 아님이 이해될 것이다. 본원에서 사용되는 용어 "및/또는"은 관련된 열거되어 있는 품목들 중 하나 이상의 임의의 및 모든 조합을 포함하고, "/"으로 약칭될 수 있다.
"아래", "밑", "하부", "상부", 및 "위" 등과 같은 공간적 상대어는 하나의 요소 또는 특징의 도면에 도시된 바와 같은 또 다른 요소(들) 또는 특징(들)에 대한 관계를 기술하려고 설명의 용이함을 위해 본원에서 사용될 수 있다. 공간적 상대어는 사용 또는 동작에 있어서 도면에 도시된 배향에 추가된 디바이스의 상이한 배향을 포함하고자 의도된 것임이 이해될 것이다. 예를 들어, 도면에서 디바이스가 반전된 경우, 다른 요소 또는 특징의 "아래" 또는 "밑"으로 기재된 요소는 다른 요소 또는 특징의 "위"로 배향될 수 있다. 따라서, 예시적인 용어 "아래"는 위와 아래 둘 모두의 배향을 포함할 수 있다. 디바이스는 다르게 배향될 수 있고(90도로 회전하거나 다른 배향으로), 본원에서 사용되는 공간적 상대 기술어는 이에 따라 해석된다. 마찬가지로, 용어 "상향", "하향", "수직", 및 "수평" 등은 달리 구체적으로 지시되지 않는 경우에만 설명의 목적을 위해 본원에서 사용된다.
용어 "제1" 및 "제2"는 다양한 특징/요소(단계 포함)를 기술하기 위해 본원에서 사용될 수 있지만, 이러한 특징/요소는, 문맥에서 달리 지시되지 않는 한, 이러한 용어들에 의해 제한되지 않아야 한다. 이러한 용어들은 어느 한 특징/요소를 또 다른 특징/요소와 구별하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 하기 논의되는 제1 특징/요소는 제2 특징/요소로 칭해질 수 있고, 마찬가지로, 하기 논의되는 제2 특징/요소가 본 발명의 교시로부터 벗어남 없이 제1 특징/요소로 칭해질 수 있다.
후술되는 본 명세서 및 청구항 전반에 걸쳐서, 문맥에서 달리 요구되지 않는 한, 단어 "~들을 포함하다", 및 변형어, 예컨대, "~을 포함하다" 및 "~을 포함하는"은 방법 및 물품(예를 들어, 디바이스 및 방법을 포함하여 조성물 및 장치)에서 공동으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 용어 "~을 포함하는"은 임의의 다른 요소 또는 단계의 배제가 아니라 임의의 명시된 요소 또는 단계의 포함을 암시하는 것으로 이해될 것이다.
일반적으로, 본원에 기재된 임의의 장치 및 방법은 포괄적인 것으로 이해되어야 하지만, 다르게는 성분 및/또는 단계의 부분 집합 또는 이들 모두가 배제적일 수 있으며, 다양한 성분, 단계, 하위-성분 또는 하위-단계로 "이루어지고", 또는 다르게는 "이를 필수적으로 포함하여 이로 이루어지는" 것으로 표현될 수 있다.
실시예에서 사용되는 것들을 포함하여 명세서 및 청구항에서 본원에 사용되는 모든 수는, 달리 분명하게 명시되지 않는 한, 용어가 분명해 보이지 않을지라도 단어 "약" 또는 "대략"이 앞에 있는 것처럼 읽힐 수 있다. 어구 "약" 또는 대략"은 규모 및/또는 위치를 기재하는 경우에 기재된 값 및/또는 위치가 그러한 값 및/또는 위치의 합리적인 예상된 범위 내에 있음을 나타내기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 수치는 명시된 값(또는 값의 범위)의 +/- 0.1%인, 명시된 값(또는 값의 범위)의 +/- 1%인, 명시된 값(또는 값의 범위)의 +/- 2%인, 명시된 값(또는 값의 범위)의 +/- 5%인, 명시된 값(또는 값의 범위)의 +/- 10% 등등인 값을 가질 수 있다. 본원에 주어진 임의의 수치는 또한, 문맥에서 달리 지시되지 않는 한, 약 또는 대략적인 그러한 값을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 값 "10"이 기재되는 경우, "약 10"이 또한 기재된다. 본원에서 언급되는 임의의 수적 범위는 그 안에 포괄되는 모든 하위-범위를 포함하는 것으로 의도된다. 또한, 값이 기재되는 경우, 당업자에 의해 적절하게 이해되는 바와 같이, 그러한 값 "과 같거나 이보다 적은", "그러한 값과 같거나 이보다 큰", 및 그러한 값들 사이의 가능한 범위가 또한 기재되는 것으로 이해된다. 예를 들어, 값 "X"가 기재되는 경우, "X이거나 X보다 작은", 뿐만 아니라 "X이거나 X보다 큰"(예를 들어, X가 수치인 경우)이 또한 기재된다. 또한, 적용 전반에 걸쳐서, 데이터는 다양한 상이한 형식으로 제공되고, 이러한 데이터는 끝점과 시작점, 및 데이터 점들의 임의의 조합에 대한 범위를 나타내는 것으로 이해된다. 예를 들어, 특정 데이터 점 "10" 및 특정 데이터 점 "15"가 기재되는 경우, 10과 15 사이뿐만 아니라, 10 및 15보다 큰, 10 및 15와 같거나 더 큰, 10 및 15보다 작은, 10 및 15이거나 이보다 작은, 10 및 15가 기재되는 것으로 감주됨이 이해된다. 또한, 두 개의 특정 단위 사이의 각각의 단위가 또한 기재되는 것이 이해된다. 예를 들어, 10 및 15가 기재되는 경우, 11, 12, 13, 및 14가 또한 기재된다.
다양한 예시적인 구체예가 상술되어 있지만, 청구항에 의해 기재되는 바와 같은 본 발명의 범위로부터 벗어남 없이 다양한 구체예에 대하여 어떠한 다수의 변화가 이루어질 수 있다. 예를 들어, 다양한 기재된 방법 단계들이 수행되는 순서는 흔히 대안적인 구체예에서 변화될 수 있고, 다른 대안적인 구체예에서는 하나 이상의 방법 단계들이 함께 생략될 수 있다. 다양한 디바이스 및 시스템 구체예의 임의의 특징은 다른 구체예에서가 아니라 일부 구체예에서 포함될 수 있다. 따라서, 상기 설명은 주로 예시적인 목적으로 제공된 것이고, 청구항에 기재된 바와 같이 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다.
본원에 포함된 예 및 예시는, 제한이 아니라 예시로서, 주제가 실시될 수 있는 특정 구체예를 나타내는 것이다. 언급된 바와 같이, 본 개시 내용의 범위로부터 벗어남 없이 구조적 및 논리적 대체 및 변화가 이루어질 수 있도록 다른 구체예가 이용되고 이로부터 도출될 수 있다. 본 발명의 주제의 그러한 구체예는 실제로 하나 초과로 기재된다면 이러한 적용의 범위를 임의의 단일 발명 또는 본 발명의 개념으로 자발적으로 제한하고자 의도하지 않으면서 단지 편의상 용어 "본 발명"으로 개별적으로 또는 집합적으로 본원에서 언급될 수 있다. 따라서, 본원에서 특정 구체예가 예시되고 기재되지만, 동일한 목적을 달성하도록 계산된 어떠한 배열이 나타나 있는 특정 구체예에 대하여 대체될 수 있다. 본 개시 내용은 다양한 구체예에 대한 임의의 및 모든 변경 또는 변형을 포함하는 것으로 의도된다. 상기 구체예, 및 본원에 구체적으로 기재되지 않은 다른 구체예들의 조합은 상기 설명의 검토 시에 당업자에게 분명해질 것이다.

Claims (26)

  1. 장기간 세포 성장 및 트랜스펙션(transfection)을 위한 나노스트로 세포 배양 시스템(nanostraw cell culture system)으로서, 시스템이
    원통형 벽, 복수의 나노스트로가 돌출(projecting)되는 멤브레인, 및 웰을 형성하도록 원통형 벽의 기저부에 걸쳐 멤브레인을 연결하는 생체적합성 접착제를 포함하는, 나노스트로 웰 인서트 디바이스(nanostraw well insert device); 및
    나노스트로 웰 인서트 디바이스를 홀딩(holding)하도록 구성된, 어댑터(adapter)를 포함하고,
    나노스트로가 웰에 0.1 마이크론 초과로 돌출되고,
    어댑터가
    하부 전극(base electrode)을 포함하는 기저부로서, 기저부가, 복수의 나노스트로가 하부 전극 위의 저장 창고(reservoir depot)와 유체 소통되도록 나노스트로 웰 인서트 디바이스의 원통형 벽을 견고하게 홀딩하도록 구성되는, 기저부;
    상부 전극(top electrode)을 포함하는 커버로서, 커버가, 나노스트로 웰 인서트 디바이스가 기저부 내에서 홀딩되는 때에 상부 전극이 하부 전극과 이들 사이에 엔클로징(enclosing)되는 나노스트로 인서트 디바이스로 분리되도록 기저부에 맞물리도록 구성되는, 커버;
    어댑터의 외표면 상의 제1 전기 접점으로서, 제1 전기 접점이 하부 전극과 전기적 소통되는, 제1 전기 접점; 및
    어댑터의 외표면 상의 제2 전기 접점으로서, 제2 전기 접점이 상부 전극과 전기적 소통되는, 제2 전기 접점을 포함하는, 나노스트로 세포 배양 시스템.
  2. 제1항에 있어서, 기저부가 저장 창고와 나노스트로 웰 인서트의 바닥 사이에 공기를 배출시키도록 구성되는, 시스템.
  3. 제1항에 있어서, 어댑터가 기저부에서 저장 창고의 압력을 조절하도록 구성되는 입구를 추가로 포함하는, 시스템.
  4. 제1항에 있어서, 제1 전기 접점이 커버의 맨 위에 있고, 제2 접점이 기저부의 맨 아래에 있는, 시스템.
  5. 제1항에 있어서, 커버가 기저부와 맞물리는 때에, 상부 전극이 하부 전극과 0.25 cm 내지 1.25 cm로 분리되는, 시스템.
  6. 제1항에 있어서, 저장 창고가 하부 전극 상에 오목한 표면을 포함하는, 시스템.
  7. 제1항에 있어서, 기저부가 원통형 하우징을 포함하는, 시스템.
  8. 제1항에 있어서, 커버가, 나노스트로 웰 인서트 디바이스가 그 안에 완전히 엔클로징되도록 기저부 위에 고정되도록 구성되는, 시스템.
  9. 장기간 세포 성장 및 트랜스펙션을 위한 나노스트로 웰 인서트 디바이스로서, 디바이스가
    원통형 벽;
    복수의 하프니아(HfO2) 나노스트로가 돌출되는 멤브레인; 및
    웰을 형성하도록 원통형 벽의 기저부에 걸쳐 멤브레인을 연결하는 생체적합성 접착제를 포함하고;
    나노스트로가 웰에 0.1 마이크론 초과로 돌출되는, 나노스트로 웰 인서트 디바이스.
  10. 제9항에 있어서, 원통형 벽이 원형의 횡단면을 갖는, 디바이스.
  11. 제9항에 있어서, 원통형 벽이 폴리카보네이트 튜브, 아크릴 튜브, 폴리카보네이트 튜브, 또는 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET) 튜브 중 하나를 포함하는, 디바이스.
  12. 제9항에 있어서, 원통형 벽과 멤브레인 사이에 접착제를 추가로 포함하는, 디바이스.
  13. 제9항에 있어서, 원통형 벽과 멤브레인 사이에 아크릴 접착제를 추가로 포함하는, 디바이스.
  14. 제9항에 있어서, 복수의 하프니아 나노스트로가 10 nm 내지 1000 nm의 공극 크기를 갖는, 디바이스.
  15. 제9항에 있어서, 복수의 하프니아 나노스트로가 웰에 0.1 내지 25 마이크론으로 돌출되는, 디바이스.
  16. 제9항에 있어서, 복수의 나노스트로 각각이 디바이스의 외부로부터 멤브레인을 거쳐 웰로 연장되는 연속 채널을 포함하는, 디바이스.
  17. 제9항에 있어서, 원통형 벽의 외경이 1.5 cm 내지 0.5 cm인, 디바이스.
  18. 세포를 배양하고 트랜스펙션하는 방법으로서, 방법이
    하나 이상의 세포를 나노스트로 웰 인서트 디바이스에서 배양하는데, 나노스트로 웰 인서트 디바이스가 원통형 벽, 및 웰을 형성하도록 원통형 벽의 기저부에 걸쳐 연장되는 멤브레인을 포함하고, 복수의 나노스트로가 멤브레인을 거쳐 0.1 마이크론 초과로 웰에 돌출되고;
    복수의 나노스트로가 기저부에서 저장 창고와 유체 소통되도록 어댑터의 기저부로 나노스트로 웰 인서트 디바이스를 배치하는데, 저장 창고가 기저부에서 하부 전극과 전기적 소통되고;
    기저부 위에 커버를 배치하는데, 상부 전극이 나노스트로 웰 인서트 디바이스로 연장되고 상부 전극이 하부 전극과 이들 사이의 나노스트로 웰 인서트로 분리되도록 커버가 상부 전극을 포함하고;
    하부 전극과 상부 전극 사이에 전압을 인가하여 저장 창고로부터의 물질을 복수의 나노스트로를 거쳐 하나 이상의 세포로 전달하고;
    어댑터로부터 나노스트로 웰 인서트를 제거하고, 하나 이상의 세포를 나노스트로 웰 인서트에서 배양함을 포함하는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 배치하는 것이, 상부 전극이 하부 전극과 0.25 내지 1.25 cm로 분리되도록 커버를 기저부 위에 배치함을 포함하는 방법.
  20. 제18항에 있어서, 전압을 인가하는 것이 어댑터의 외표면 상의 제1 전기 접점과 어댑터의 표면의 외부 상의 제2 전기 접점 사이에 전압을 인가함을 포함하고, 제1 전기 접점이 어댑터의 내부에서 상부 전극과 전기적 소통되고, 제2 전기 접점이 어댑터의 내부에서 하부 전극과 전기적 소통되는 방법.
  21. 제18항에 있어서, 전압을 인가하는 것이 약 0.1 V 내지 20 V를 인가함을 포함하는 방법.
  22. 제18항에 있어서, 전압을 인가하는 것이 15V 미만을 인가함을 포함하는 방법.
  23. 제18항에 있어서, 나노스트로 웰 인서트 디바이스에서 세포를 이미징(imaging)시킴을 추가로 포함하는 방법.
  24. 제18항에 있어서, 전압을 인가하는 것이 1 Hz 내지 10 kHz의 펄스 주파수에서 10 내지 500 마이크로초의 펄스 폭을 인가함을 포함하는 방법.
  25. 제18항에 있어서, 세포를 배양하는 것이 복수의 하프니아(HfO2) 나노스트로 상에 세포를 배양함을 포함하는 방법.
  26. 제18항에 있어서, 나노스트로 웰 인서트 디바이스를 기저부에 배치하기 전에 물질을 저장 창고에 투입함을 추가로 포함하는 방법.
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