KR20190011359A

KR20190011359A - 대장암 진단용 조성물 및 상기 조성물을 이용한 대장암 진단 방법

Info

Publication number: KR20190011359A
Application number: KR1020170093461A
Authority: KR
Inventors: 김철우; 김용대; 신용성; 연은희; 강경남; 신호상; 권오란
Original assignee: (주) 바이오인프라생명과학
Priority date: 2017-07-24
Filing date: 2017-07-24
Publication date: 2019-02-07
Also published as: KR102018205B1; CN111108389A; WO2019022371A1

Abstract

본 발명은 대장암 진단용 조성물 및 상기 조성물을 이용한 대장암 진단 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명의 대장암 진단용 조성물은 체액 내 특정 단백질의 발현량을 확인하여 간편하게 대장암을 조기 진단함으로써, 대장암의 조기 치료가 가능하게 하고, 대장암 환자의 생존율을 향상시키는데 유용하게 사용될 수 있다.

Description

대장암 진단용 조성물 및 상기 조성물을 이용한 대장암 진단 방법{DIAGNOSIS COMPOSITION OF COLORECTAL CANCER AND DIAGNOSIS METHOD OF COLORECTAL CANCER USING THE SAME}

본 발명은 대장암 진단용 조성물 및 상기 조성물을 이용한 대장암 진단 방법에 관한 것이다.

대장암은 결장과 직장에 생기는 악성 종양으로서, 근래에 식생활 양상이 서구화되어 가면서 발생 빈도가 가파르게 증가하고 그 연령도 점점 낮아지고 있다. 대장암은 고지방, 저섬유 식이와 가족성 용종증 등의 몇몇 유전성 질환 및 궤양성 대장염과 같은 염증성 장 질환 등에 의해 발병된다.

일반적으로 대장암의 초기에는 대부분 증상이 없고 있다 하더라도 대장에 특이한 증상이 아니어서 대장암의 특징적인 증상이라고 말하기 어렵다. 그러나 일반적으로 배변 습관의 변화, 혈변이나 점액변(변에 점액이 섞임), 굵기가 가늘어진 변, 체중 감소, 복부 불편감(복통·복부팽만), 피로, 식욕부진, 구토, 오심빈혈 등의 증상을 보인다.

대장암의 예후는, 초기(1기) 환자의 경우 5년 생존율이 90% 이상이나 전이된(4기) 환자의 5년 생존율은 5%에 불과하다(Cancer Facts and Figures, 2004; American Cancer Society, 2004). 따라서 대장암의 정확한 조기 진단 및 치료는 대장암으로 인한 사망률을 낮추고, 암의 치료비용을 낮추는데 기여할 것이다.

대장암은 제거할 수 있는 전암성 병변이나 치료할 수 있는 초기단계 암에서 발달되는 속도가 느리기 때문에 대장암 선별검사는 질병의 발생률과 사망률을 줄이는데 중요하다. 현재 대장암의 진단을 위한 선별검사로는 분변잠혈 검사, 종양표지자 검사, 대장조영술, 대장 내시경검사, 전산화 단층촬영, 복부 초음파 검사, 경직장 초음파 및 에스결장경 검사 등이 있다. 그러나 현재 가장 신뢰성 있는 대장암 선별검사인 대장 내시경은 순응도와 보급률이 낮으며, 현재 가장 널리 시행되는 비침입성 스크리닝(noninvasive screening)의 옵션인 분변잠혈 검사는 민감도가 낮다는 문제점이 있다. 이외의 다른 선별검사도 조기진단에는 한계가 있다.

상기의 문제점들을 극복하기 위해서 대장암의 조기진단이 가능한 새로운 방법의 개발이 필요하다. 최근에 대장암의 혈액 마커를 찾기 위해 단백질을 대상으로 하여 ELISA, RIA와 같은 표준방법뿐 아니라 크로마토그래피 검사나 질량분석 검사 방법도 시도되고 있으며 세포학적 마커, DNA 마커 또는 mRNA 마커 등을 찾기 위한 다양한 연구가 진행되고 있다(Sabrina H. et al., Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev., 16(10):1935-53, 2007). 또한, SELDI-TOF-MS(Surface-Enhanced Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry) 기술을 이용한 단백질 프로파일링에 의해 바이오마커를 발굴하고 바이오마커 패널의 패턴을 비교함으로써 암을 진단하고자 하는 방법(Petricoin EF et al., Lancet 359(9306);572-577, 2002)도 연구되고 있다. 대장암 발병 여부의 정확한 판별을 가능하게 하는 바이오마커의 선별 및 진단마커를 측정하는 제제의 개발은 대장암을 정복하는 가장 큰 과제이다.

이에, 본 발명자들은 대장암의 진단을 위한 바이오마커를 선별하고자 노력하던 중, 대장암 환자와 정상인 혈청으로부터 단백질의 발현 양상을 분석하고, 통계적 기법을 이용해 대장암의 바이오마커로서 TTR(transthyretin), EGFR(epidermal growth factor receptor), D.Dimer, CRP(c-reactive protein) 및 ApoA4(apolipoprotein A4) 단백질을 선별하였다. 또한, 상기 단백질 마커들의 조합을 대장암 진단 및 스크리닝에 적용하였을 때, 대장암 환자와 정상인을 높은 정확도로 구별할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은, 선별된 바이오마커에 특이적으로 결합하는 검출시약을 포함하는 대장암 진단용 조성물 및 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은, 상기 대장암 진단용 조성물을 이용하여 대장암 진단의 정보를 제공하기 위한 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 TTR, EGFR, D.Dimer, CRP 및 ApoA4로 구성된 바이오마커에 특이적으로 결합하는 검출시약을 포함하는 대장암 진단용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 대장암 진단용 조성물을 포함하는 대장암 진단용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 TTR, EGFR, D.Dimer, CRP 및 ApoA4로 구성된 바이오마커를 암호화하는 유전자의 핵산 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브(probe) 및 안티센스 뉴클레오티드(anti-sense nucleotide)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 대장암 진단용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 1) 시료로부터 TTR, EGFR, D.Dimer, CRP 및 ApoA4로 구성된 단백질 발현량을 측정하는 단계; 및 2) 상기 단계 1)의 단백질 발현량을 정상개체의 단백질 발현량과 비교하는 단계를 포함하는 대장암 진단의 정보를 제공하기 위한 방법을 제공한다.

아울러, 본 발명은 1) 시료로부터 TTR, EGFR, D.Dimer, CRP 및 ApoA4로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 단백질을 암호화하는 유전자의 발현량을 측정하는 단계; 및 2) 상기 단계 1)의 유전자 발현량을 정상개체의 유전자 발현량과 비교하는 단계를 포함하는 대장암 진단의 정보를 제공하기 위한 방법을 제공한다.

본 발명의 대장암 진단용 조성물은 체액 내 특정 단백질의 발현량을 확인하여 간편하게 대장암을 조기 진단함으로써, 대장암의 조기 치료가 가능하게 하고, 대장암 환자의 생존율을 향상시키는데 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 다양한 갯수의 대장암 바이오마커 조합에 따른 AUC 값을 확인한 그래프이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 TTR, EGFR, D.Dimer, CRP 및 ApoA4로 구성된 바이오마커에 특이적으로 결합하는 검출시약을 포함하는 대장암 진단용 조성물을 제공한다.

상기 TTR, EGFR, D.Dimer, CRP 및 ApoA4 단백질은 통상의 기술분야에 알려진 어떠한 서열로 구성되는 폴리펩티드일 수 있다. 상기 폴리펩티드는 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위 내에서, 아미노산 잔기의 결실, 삽입, 치환 또는 이들의 조합에 의해서 상이한 서열을 가지는 아미노산의 변이체 또는 단편일 수 있다. 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 또는 펩티드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다. 경우에 따라서는 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation) 등으로 수식(modification)될 수 있다.

상기 검출시약은 항체, 항체 단편, 앱타머 및 D-펩티드로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다. 상기 항체는 단일클론항체, 다클론항체 또는 재조합항체일 수 있다. 항체는 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다. 상기 항체 단편은 항체 분자의 기능적인 단편을 포함할 수 있다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab')₂ 및 Fv 등일 수 있다. 상기 앱타머는 소정의 표적 분자에 대한 결합 활성을 갖는 올리고뉴클레오티드 분자로 RNA, DNA, 수식(modified) 올리고뉴클레오티드 또는 이들의 혼합물일 수 있으며, 직쇄상 또는 환상의 형태일 수 있다.

상기 단일클론 항체는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마 방법, 또는 파지 항체 라이브러리 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 일반적으로, 단일클론항체를 분비하는 하이브리도마 세포는 항원 단백질을 주사한 마우스와 같이 면역학적으로 적합한 숙주 동물로부터 분리된 면역 세포와 암 세포주를 융합하여 만들 수 있다. 이와 같은 두 집단의 세포 융합은 폴리에틸렌글리콜과 같이 본 발명이 속하는 기술 분야에 공지되어 있는 방법을 이용하여 수행되고 항체를 생산하는 세포는 표준적인 배양 방법으로 증식시킬 수 있다. 구체적으로, 한계 희석법을 이용하여 서브 클로닝을 실시하고, 균일한 세포 집단을 수득한 뒤 항원에 특이적인 항체를 생산할 수 있는 하이브리도마 세포를 시험관 또는 생체 내에서 대량으로 배양하여 제조할 수 있다. 상기 방법으로 제조된 항체는 겔 전기영동, 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등의 방법을 이용하여 분리 및 정제될 수 있다.

상기 다클론 항체는 당업계에 널리 알려진 방법에 따라 면역원인 바이오마커 단백질 또는 그 단편을 외부 숙주에 주사함으로써 제조될 수 있다. 외부 숙주는 마우스, 래트, 양, 토끼와 같은 포유동물일 수 있다. 상기 면역원이 근내, 복강내 또는 피하 주사 방법으로 주사되는 경우, 항원성을 증가시키기 위한 보조제(adjuvant)와 함께 투여될 수 있다. 이후, 외부 숙주로부터 정기적으로 혈액을 채취하여 향상된 역가 및 항원에 대한 특이성을 보이는 혈청을 수득하고 이로부터 항체를 분리 및 정제하여 제조될 수 있다.

상기 검출시약은 발색효소, 형광물질, 방사성 동위원소 또는 콜로이드 등의 검출체로 표지된 접합체일 수 있다. 발색효소는 퍼록시다제, 알칼라인 포스파타제 또는 산성 포스파타제일 수 있고, 형광물질은 플루오레신카복실산(FCA), 플루오레신 이소티오시아네이트(FITC), 플루오레신 티오우레아(FTH), 7-아세톡시쿠마린-3-일, 플루오레신-5-일, 플루오레신-6-일, 2',7'-디클로로플루오레신-5-일, 2',7'-디클로로플루오레신-6-일, 디하이드로 테트라메틸로사민-4-일, 테트라메틸로다민-5-일, 테트라메틸로다민-6-일, 4,4-디플루오로-5,7-디메틸-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-에틸 또는 4,4-디플루오로-5,7-디페닐-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-에틸, Cy3, Cy5, 폴리 L-라이신-플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC), 로다민-B-이소티오시아네이트(RITC), PE(Phycoerythrin) 또는 로다민일 수 있다.

상기 검출시약은 추가로 상기 검출시약에 특이적으로 결합할 수 있는 리간드를 포함할 수 있다. 상기 리간드는 발색효소, 형광물질, 방사성 동위원소 또는 콜로이드 등의 검출체로 표지된 접합체, 및 스트렙타비딘 또는 아비딘이 처리된 리간드일 수 있다.

본 발명의 진단용 조성물은 상기 서술한 바와 같은 검출시약 외에도 이들의 구조를 안정하게 유지시키는 증류수 또는 완충액을 포함할 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 대장암 환자와 정상인 혈청으로부터 단백질의 발현 양상을 분석하고, 통계적 기법을 이용해 대장암의 바이오마커인 TTR, EGFR, D.Dimer, CRP 및 ApoA4 단백질을 선별하였다. 또한, 상기 바이오마커들의 조합을 이용하여 분류모델을 만들고, 상기 분류모델이 대장암 환자와 정상인을 높은 정확도로 구별할 수 있음을 확인하였다(도 1 및 표 3 내지 6).

또한, 본 발명은 본 발명의 대장암 진단용 조성물을 포함하는 대장암 진단용 키트를 제공한다.

상기 대장암 진단용 조성물 및 검출시약은 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 대장암 진단용 조성물은 TTR, EGFR, D.Dimer, CRP 및 ApoA4로 구성된 바이오마커에 특이적으로 결합하는 검출시약을 포함할 수 있다.

한편, 검출시약은 항체, 항체 단편, 앱타머 및 D-펩티드로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다. 상기 검출시약은 세척이나 복합체의 분리 등 그 이후의 단계를 용이하게 하기 위해 고형 기질에 결합될 수 있다. 고형 기질로는 합성수지, 니트로셀룰로오스, 유리기판, 금속기판, 유리섬유, 미세구체 또는 미세비드가 사용될 수 있다. 또한, 합성수지로는 폴리에스터, 폴리염화비닐, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, PVDF 또는 나일론 등이 사용될 수 있다.

상기 키트는 피검사자가 대장암 위험군인지 아닌지를 구별하여 의사 등 진료 행위자가 대장암을 진단하는 것을 가능하게 할 뿐 아니라, 치료에 대한 환자의 반응을 모니터하여 그 결과에 따라 치료를 변경할 수 있게 한다. 또한, 마우스 및 랫트 등의 대장암 모델의 생체 내 또는 생체 외에서 하나 이상의 마커의 발현을 조절하는 화합물을 동정하는데 사용될 수 있다.

상기 대장암 진단용 키트는 당업자에게 알려진 종래의 제조방법에 의해 제조될 수 있으며, 버퍼, 안정화제, 불활성 단백질 등을 더 포함할 수 있다.

상기 키트는 검출시약의 양을 탐색하기 위해 검출체로서 부착된 형광물질의 형광을 검출함으로써 수행되는 형광법 또는 검출체로서 부착된 방사선 동위원소의 방사선을 검출함으로써 수행되는 방사선법을 통한 초고속 스크리닝(high throughput screening, HTS) 시스템, 검출체의 표지 없이 표면의 플라즈몬 공명 변화를 실시간으로 측정하는 SPR(surface plasmon resonance) 방법 또는 SPR 시스템을 영상화하여 확인하는 SPRI(surface plasmon resonance imaging) 방법을 이용할 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 대장암 환자와 정상인 혈청으로부터 단백질의 발현 양상을 분석하고, 통계적 기법을 이용해 대장암의 바이오마커인 TTR, EGFR, D.Dimer, CRP 및 ApoA4 단백질을 선별하였다. 또한, 상기 바이오마커들의 조합을 이용하여 분류모델을 만들고, 상기 분류모델이 대장암 환자와 정상인을 높은 정확도로 구별할 수 있음을 확인하였다(도 1 및 표 3 내지 6 참조).

또한, 본 발명은 TTR, EGFR, D.Dimer, CRP 및 ApoA4로 구성된 바이오마커를 암호화하는 유전자의 핵산 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 및 안티센스 뉴클레오티드로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 대장암 진단용 키트를 제공한다.

상기 TTR, EGFR, D.Dimer, CRP 및 ApoA4 단백질은 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 상기 프라이머는 본 발명에서 탐색된 바이오마커를 암호화하는 유전자와 상보적이며, 이를 증폭할 수 있도록 설계된 프라이머라면 모두 사용할 수 있다.

상기 프로브는 DNA 또는 RNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수개 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 핵산 단편으로서, 특정 DNA 또는 RNA의 존재 유무를 확인하는데 사용될 수 있다. 상기 프로브는 올리고뉴클레오티드 프로브, 단쇄 DNA 프로브, 이중쇄 DNA 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있고, 비오틴, FITC, 로다민, DIG(digoxigenin) 등으로 표지되거나 방사선 동위원소 등으로 표지될 수 있다.

상기 안티센스 뉴클레오티드는 이중나선 또는 단일나선 DNA, 이중나선 또는 단일나선 RNA, DNA/RNA 하이브리드, DNA 및 RNA 아날로그 및 염기, 당 또는 백본 변형을 지닌 것일 수 있다.

상기 대장암 진단용 키트는 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다.

상기 단계 1)의 시료는 소변, 혈액, 혈청 또는 혈장 등 정상적인 상태와 구별될 수 있는 질환 특이적 폴리펩타이드를 확인할 수 있는 생체 시료를 포함할 수 있다. 구체적으로는, 생물학적 액체 시료인 혈액, 혈청 또는 혈장일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 시료는 혈청일 수 있다.

시료는 음이온 교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피, 크기별 배제 크로마토그래피, 액체 크로마토그래피, 연속추출, 원심분리 또는 젤 전기영동 등의 방법을 이용하여 전처리될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 시료는 원심분리에 의해 전처리될 수 있다.

상기 단계 1)의 발현량은 웨스턴블랏, 효소-면역화학 검출법(ELISA), 면역조직화학 염색법, 면역침강 및 면역형광법으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 방법으로 측정될 수 있다. 이때, TTR, EGFR 및 ApoA4 단백질을 암호화하는 유전자의 발현량은 대조군에 비해 감소하며, CRP 및 D.Dimer 단백질을 암호화하는 유전자의 발현량은 대조군에 비해 증가할 수 있다.

또한, 본 발명은 1) 시료로부터 TTR, EGFR, D.Dimer, CRP 및 ApoA4로 구성된 단백질을 암호화하는 유전자의 발현량을 측정하는 단계; 및 2) 상기 단계 1)의 유전자 발현량을 정상개체의 유전자 발현량과 비교하는 단계를 포함하는 대장암 진단의 정보를 제공하기 위한 방법을 제공한다.

상기 단계 1)의 시료는 소변, 혈액, 혈청 또는 혈장 등 정상적인 상태와 구별될 수 있는 질환 특이적 뉴클레오티드를 확인할 수 있는 생체 시료를 포함할 수 있다. 구체적으로는 생물학적 액체 시료인 혈액, 혈청 또는 혈장일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 시료는 혈청일 수 있다.

상기 단계 1)의 발현량은 역전사 중합효소 연쇄반응 또는 실시간 중합효소 연쇄반응으로 측정될 수 있다. 이때, TTR, EGFR 및 ApoA4 단백질을 암호화하는 유전자의 발현량은 대조군에 비해 감소하며, CRP 및 D.Dimer 단백질을 암호화하는 유전자의 발현량은 대조군에 비해 증가할 수 있다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 이들에 의해 한정되는 것은 아니다.

혈청 수득

먼저, 서울대학교병원 가정의학과에서 정상인 290명(남자 176명, 여자 114명)을 대상으로 혈청을 수득하였으며, 계명대학교 바이오뱅크와 부산대학교 인체자원은행에서 각각 대장암 환자 75명 및 25명(남자 46명, 여자 54명)을 대상으로 혈청을 수득하였다. 상기 정상인 또는 대장암 환자로부터 말초혈액 5 ㎖을 채취하여 Vacutainer SST Ⅱ tube(Becton Dickinson)에 넣고, 이를 상온에서 방치하였다. 1시간 후, 상기 튜브를 3000 g에서 5분 동안 원심분리하고 상층액을 취해 혈청을 얻었으며 수득된 혈청은 사용하기 전까지 -80℃에 보관하였다.

단백질의 정량

대장암 바이오마커 후보를 선정하기 위해 인체 내에 존재하는 수만개 이상의 단백질들 중에서 먼저 120개의 단백질 표지자 후보군을 선정하였고, 이차원 전기영동, SELDI-TOF MS 분석법 등을 통하여 임상적 의의, 분석의 편이성, 알고리즘의 정확도, 비용 및 임상 여건 등을 고려하여 상기 120개의 단백질 표지자 후보군으로부터 50여개의 표지자들을 선택하였다. 이후, 대장암 환자 150여명, 정상인 400여명을 대상으로 결과 수치들의 통계 분석을 통해 유효성을 검증하여 최종적으로 대장암 바이오마커 후보로서 ApoA1, ApoA2, AFP, CEA, CA125, CA19-9, B2M, CRP, CYFRA21-1, VDBP, PAI-1, sVCAM-1, RANTES, EGFR, ApoA4, TTR 및 D.Dimer과 같은 17개의 단백질을 선별하였으며, 이의 통계학적 분석을 위해 하기와 같은 방법으로 실시예 1의 혈청 샘플을 이용해 상기 17개의 단백질을 정량하였다.

<2-1> 항체, 키트 및 표준단백질

ApoA1, ApoA2, AFP, CEA, CA125, CA19-9, B2M, CRP, CYFRA21-1, VDBP, PAI-1, sVCAM-1, RANTES, EGFR, ApoA4, TTR 및 D.Dimer의 단백질은 하기 표 1 및 2에 기재된 키트 혹은 항체를 이용하여 정량하였다. 표준 단백질의 경우, ApoA4 단백질은 자체 제작하였으며, EGFR 및 sVCAM-1 단백질은 R&D Systems사에서, PAI-1 단백질은 Calbiochem사에서, RNATES 단백질은 PeproTect사에서, VDBP 단백질은 Biodesign사에서 구입하여 사용하였다. 주시약 및 보정물질(calibrator)의 경우, TTR 및 CRP 단백질에 대한 것은 Siemens사에서, D.Dimer, CEA, CYFRA21-1, B2M, CA125, CA19-9 및 AFP 단백질에 대한 것은 Roche사에서, ApoA1 및 ApoA2 단백질에 대한 것은 Sekisui사에서 구입하여 사용하였다.

항체, 키트 및 표준단백질 구입처

바이오마커	표준물질 제조사	대응 항체 제조사 1	대응 항체 제조사 2
ApoA4	자체 제작	Abcam	자체 제작
EGFR	R&D Systems	R&D Systems	R&D Systems
PAI-1	Calbiochem	Innovative Research	US Biological Life Sciences
RANTES	PeproTech	R&D Systems	R&D Systems
sVCAM-1	R&D Systems	R&D Systems	R&D Systems
VDBP	Biodesign	ThermoFisher	ThermoFisher

항체, 키트 및 표준단백질 구입처

바이오마커	주시약	보정 물질(calibrator)	제조사
TTR	N Antiserum to human PreAlbumin	N Protein standard SL	Siemens
D.Dimer	D-DI2	D-Dimer Gen.2 Calibrator set	Roche
ApoA1	Apo A-1 Auto·N "Daiichi"	Apo auto N Daiichi	Sekisui
ApoA2	Apo A-2 Auto·N "Daiichi"	Apo auto N Daiichi	Sekisui
CEA	Elecsys CEA	CEA CalSet	Roche
CYFRA21-1	Elecsys CYFRA 21-1	CYFRA 21-1 CalSet	Roche
B2M	Tina-quant β2-microglobulin	β2-Microglobulin Calibrator	Roche
CA125	Elecsys CA 125 Ⅱ	CA 125 Ⅱ CalSet	Roche
CA19-9	Elecsys CA 19-9	CA 19-9 CalSet	Roche
CRP	CardioPhase hsCRP	N Rheumatology standard SL	Siemens
AFP	Elecsys AFP	AFP CalSetⅡ	Roche

<2-2> EGFR 단백질의 정량

EGFR 단백질의 혈청 내 농도는 항체가 항원에 효소를 표지해 효소의 활성을 측정하여 항원-항체 반응의 강도와 그 양을 정량적으로 측정하는 방법인 효소 결합 면역 흡착 분석(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, ELISA) 방법을 사용하여 측정하였다. EGFR 단백질의 검출항체는 바이오틴으로 표지한 후, ELISA에 이용하였다.

구체적으로, 먼저 EGFR 검출 항체를 바이오틴화시키기 위해 400 ㎍의 항-인간-EGFR 항체(R&D systems, US)를 800 ㎕의 PBS 용액에 넣은 후, 상기 용액의 몰 비율이 항체 대비 20배가 되도록 10 mM의 EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin(sulfosuccinimidyl-6-[biotin-amido]hexanoate, ThermoFisher Scientific, US) 용액을 넣어 주고 상온에서 30분간 반응시켰다. 바이오틴 표지가 완료되면 1 ℓ의 PBS 용액을 첨가하여 투석을 3회 반복한 뒤, 이를 -80℃에 보관하였다.

EGFR 단백질의 정량은 96-웰 마이크로플레이트(Nalgene Nunc Inc., US)의 각 웰에 0.8 ㎍/㎖ 농도의 인간 EGFR에 대한 포획 항체(R&D systems, US)를 100 ㎕씩 넣고 4℃에서 밤새 전처리하였다. 다음날 0.05% Tween 20을 함유한 PBS로 웰을 3회 세척한 후에 5% 탈지유가 포함된 PBS 용액을 웰에 넣고 실온에서 1시간 동안 교반하여 비특이적 결합을 차단하였다. 0.05% Tween 20을 함유한 PBS로 웰을 3회 세척한 후에 EGFR 표준 단백질, 실시예 1에서 얻은 정상 및 대장암 환자의 혈청을 각각 100 ㎕씩 각 웰에 첨가하고 실온에서 2시간 동안 반응시킨 후에 3회 세척하였다. 상기 방법으로 제조된 바이오틴이 표지된 검출 항체를 0.2 ㎍/㎖ 농도로 각 웰에 처리하고 실온에서 다시 2시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝나면 3회 세척한 후, 1X 스트랩타비딘-홀스래디쉬-과산화효소(streptavidin-horseradish-peroxidase, R&D systems, US)를 첨가하여 실온에서 20분 동안 반응시키고 반응이 끝나면 5회 세척하였다. 발색 반응을 유도하기 위하여 TMB(tetramethylbenzidine, R&D systems, US)를 각 웰에 50 ㎕씩 첨가하였고, 20분 후 2 N 황산을 각 웰에 50 ㎕씩 첨가하여 반응을 정지시켰다. 이후, 마이크로플레이트 리더기(Emax, Molecular Devices LLC., US)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정값은 SoftMax Pro 소프트웨어(Molecular Device)를 이용하여 5개 모수 커브 피팅(5-parametric-curve fitting)으로 분석하였다.

<2-3> RANTES, sVCAM-1, ApoA4, PAI-1 및 VDBP 단백질의 정량

RANTES, sVCAM-1, ApoA4, PAI-1 및 VDBP 단백질의 혈청 내 농도는 xMAP 기술 플랫폼(Luminex Corp. US)을 이용한 다중 면역분석법(multiplex immunoassay)으로 측정하였다. 미세구체(microspheres)는 카르보디이미드(carbodiimide) 방법으로 포획 항체를 결합시킨 후, 면역분석법에 이용하였으며 전체 과정에서 미세구체가 빛에 노출되는 것을 최소화하였다.

구체적으로, MagPlex(Luminex Corp.)의 미세구체 현탁액을 볼텍스(vortex)로 혼합한 후, 음파 용기(Sonicor Instrument Corporation, US)에서 20초 동안 현탁하였다. 1×10⁶개의 미세구체를 마이크로튜브에 옮겨 자석을 이용하여 분리하고 용액을 제거하고, 100 ㎕의 증류수로 세척한 뒤, 이를 다시 80 ㎕의 0.1 M 인산나트륨 완충용액(pH 6.2)에 재현탁하였다. 이후, 50 mg/㎖의 N-하이드록시-설포숙시니마이드(N-hydroxy-sulfosuccinimide, ThermoFisher Scientific, US) 및 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드 하이드로클로라이드(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide hydrochloride, ThermoFisher Scientific, US)를 각각 10 ㎕씩 차례로 넣은 후 실온에서 20분 동안 반응시켰다. 이때 반응물을 10분 간격으로 섞어 주었다. 상기 미세구체를 250 ㎕의 50 mM MES(pH 5.0)로 2회 세척한 후, 100 ㎕의 50 mM MES(pH 5.0)에 재현탁하였다. 상기 방법으로 카복실기가 활성화된 미세구체에 10 ㎍의 항-RANTES, 항-sVCAM-1, 항-ApoA4, 항-PAI-1 또는 항-VDBP 항체, 및 50 mM의 MES 용액을 첨가하여 최종 부피가 500 ㎕가 되도록 한 후, 이를 실온에서 2시간 동안 섞어 주었다. 항체 결합 반응이 끝난 미세구체는 500 ㎕의 PBS-TBN(1% BSA, 0.02% Tween 20 및 0.05% 소듐 아자이드가 포함된 PBS)으로 2회 세척한 후, 혈구 계산기로 계수하였다. 항체가 결합된 미세구체는 500 ㎕의 PBS-TBN 용액에 1×10⁶개 농도가 되도록 현탁하여 2 내지 8℃의 암실에서 보관하였다.

RANTES 및 sVCAM-1 단백질은 한 웰에서 동시에 측정하는 다중 검사법으로, ApoA4, PAI-1 및 VDBP 단백질은 한 웰에서 하나의 단백질만 측정하는 단일 검사법으로 정량하였다. 구체적으로, 실시예 1에서 얻은 정상 및 대장암 환자의 혈청 20 ㎕와 상기 방법으로 제조된 RANTES, sVCAM-1, ApoA4, PAI-1 또는 VDBP 단백질에 대한 포획 항체가 결합된 미세구체 혼합액 20 ㎕를 섞어준 후, 96-웰 마이크로플레이트의 각 웰에 RANTES, sVCAM-1, ApoA4, PAI-1 또는 VDBP 표준 단백질, 또는 상기 혈청이 포함된 미세구체 혼합액을 20 ㎕씩 넣고, 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 이후, 바이오틴이 표지된 검출 항체 20 ㎕와 스트렙타비딘-R-파이코에리쓰린(Streptavidin R-Phycoerythrin, Jackson ImmunoResearch) 20 ㎕를 순차적으로 넣고 각각 1시간 및 30분 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 플레이트에 각 웰당 200 ㎕의 PBST(0.05% Tween 20가 포함된 PBS)용액 및 마이크로플레이트 세척제(HydroFlex™, TECAN, Switzerland)를 넣어 2회 세척한 다음 미세구체를 100 ㎕의 PBST(0.05% Tween 20가 포함된 PBS)용액에 재현탁하여 Luminex TM200으로 형광의 세기를 측정하였다. 혈청 샘플의 RANTES, sVCAM-1, ApoA4, PAI-1 및 VDBP 단백질 농도는 비드뷰 소프트웨어(Beadview Software, Upstate, US)를 이용하여 5개 모수 커브 피팅으로 분석하였다.

<2-4> ApoA1, ApoA2, TTR, CEA, CYFRA21-1, B2M, CA125, CA19-9, CRP, D.Dimer 및 AFP 단백질의 정량

ApoA1, ApoA2 및 B2M 단백질은 Hitachi 7080(Hitachi Medical Corp., Japan) 장비를 이용해 제조사의 프로토콜에 따라 면역비탁법으로 측정하였다. TTR 및 CRP 단백질은 BN2 System(Siemens AG., Germany) 장비를 이용해 제조사의 프로토콜에 따라 면역비탁법으로 측정하였다. CEA, CYFRA21-1, CA125, CA19-9 단백질은 cobas e601(Hoffmann-La Roche AG., Switzerland) 장비를, D.Dimer 단백질은 Roche c501(Hoffmann-La Roche AG., Switzerland) 장비를 이용해 제조사의 프로토콜에 따라 전기화학발광면역측정법으로 측정하였다.

대장암 바이오마커의 통계분석

상기 17개 마커(ApoA1, ApoA2, AFP, CEA, CA125, CA19-9, B2M, CRP, CYFRA21-1, VDBP, PAI-1, sVCAM-1, RANTES, EGFR, ApoA4, TTR 및 D.Dimer)에 대한 대장암 환자와 정상인 간의 발현량 차이의 유의성을 t-test를 통해 확인하였다. 상기 실시예 2에서 얻은 실험값에 log₁₀ 변환을 취해 그 값(측정데이터)을 통계분석에 사용하였다. t-test 결과 p-value가 0.1 이하이면 유의한 마커로 판정하였다.

마커의 유의성

	t	df	P-value
ApoA1	-11.026	137.718	0.000
ApoA2	-8.910	112.951	0.000
AFP	-3.081	163.526	0.002
CEA	5.514	115.217	0.000
CA125	2.299	122.779	0.023
CA19-9	2.339	124.014	0.021
TTR	-15.595	115.429	0.000
B2M	1.969	147.882	0.051
CRP	13.036	159.103	0.000
CYFRA21-1	3.144	130.071	0.002
VDBP	-3.117	138.126	0.002
PAI-1	-3.362	134.633	0.001
sVCAM-1	3.648	138.161	0.000
RANTES	-4.036	118.763	0.000
EGFR	-14.944	132.346	0.000
D.Dimer	12.631	130.984	0.000
ApoA4	-9.172	134.678	0.000

그 결과 표 3에 나타낸 바와 같이, ApoA1, ApoA2, AFP, CEA, CA125, CA19-9, B2M, CRP, CYFRA21-1, VDBP, PAI-1, sVCAM-1, RANTES, EGFR, ApoA4, TTR 및 D.Dimer 마커가 대장암 환자 및 정상인 간의 발현량 차이에 유의성이 있었다(표 3).

바이오마커의 기여도 측정

상기 실시예 3에서 유의한 마커로 판정된 ApoA1, ApoA2, AFP, CEA, CA125, CA19-9, B2M, CRP, CYFRA21-1, VDBP, PAI-1, sVCAM-1, RANTES, EGFR, ApoA4, TTR 또는 D.Dimer 마커들을 사용하여 분류모델을 구축하고, 각각의 분류모델에서 바이오마커의 기여도를 측정하였다.

구체적으로, 상기 분류모델은 로지스틱 회귀분석(logistic regression) 모형을 사용하여 구축하였으며, 하기 수학식 1과 같이 표현된다.

[수학식 1]

상기 수학식 1에서 X₁ 내지 X_p는 실시예 3에서 유의한 마커로 판정된 각 바이오마커의 측정데이터를 평균 0, 분산 1로 표준화한 값이고, β₀ 내지 β_p는 미지변수이다. 미지변수는 리지 추정(ridge estimator)을 사용하여 R 통계 패키지(R Development Core Team (2007). R: A language and environment for statistical computing. R Foundationfor Statistical Computing, Vienna, Austria. ISBN 3-900051-07-0, URL http://www.R-project.org.)를 통해 예측하였다. 리지 추정의 절대값이 클수록 해당 바이오마커의 로지스틱 회귀분석 모형에서의 기여도가 큰 것을 의미한다.

그 결과, TTR > EGFR > D.Dimer > CRP > ApoA4 > ApoA1 > CEA > ApoA2 > RANTES > B2M > PAI-1 > AFP > sVCAM-1 > CA125 > CYFRA21-1 > CA19-9 > VDBP 순으로 분류모델에서 기여도가 감소하였다.

다양한 바이오마커 조합의 성능 측정

실시예 4에서 측정한 기여도를 이용해 기여도가 낮은 마커를 제거해가며, 실시예 3에서 유의한 마커로 판정된 다양한 바이오마커 조합의 성능을 측정하였다.

구체적으로, 실시예 1에서 얻은 정상인과 대장암 환자의 샘플을 무작위로 나눠 80%는 훈련 집단(training data)으로 20%는 평가 집단(test data)으로 하였다. 한편, 실시예 3에서 유의한 마커로 판정된 17개의 마커로 1가지의 조합을 작성하였다. 이후, 훈련 집단을 이용하여 상기 조합에 대해 실시예 4와 동일한 방법으로 대장암 및 정상 분류 모형을 만들고, 상기 모형에 훈련 집단을 예측시켜보았다. 상기 단계를 1000번 반복하여 1000개의 AUC 값을 얻었고, 그 값의 평균을 계산하여 상기 모형이 훈련 집단을 얼마나 잘 예측했는지 판단하여 다양한 바이오마커 조합의 성능을 측정하였다.

다양한 바이오마커 조합의 성능

마커 조합	마커의 수	평균(AUC)
TTR, EGFR, D.Dimer, CRP, ApoA4, ApoA1, CEA, ApoA2, RANTES, B2M, PAI-1, AFP, sVCAM-1, CA125, CYFRA21-1, CA19-9, VDBP	17	0.9807
TTR, EGFR, D.Dimer, CRP, ApoA4, ApoA1, CEA, ApoA2, RANTES, B2M, PAI-1, AFP, sVCAM-1, CA125, CYFRA21-1, CA19-9	16	0.9811
TTR, EGFR, D.Dimer, CRP, ApoA4, ApoA1, CEA, ApoA2, RANTES, B2M, PAI-1, AFP, sVCAM-1, CA125, CYFRA21-1	15	0.9812
TTR, EGFR, D.Dimer, CRP, ApoA4, ApoA1, CEA, ApoA2, RANTES, B2M, PAI-1, AFP, sVCAM-1, CA125	14	0.9816
TTR, EGFR, D.Dimer, CRP, ApoA4, ApoA1, CEA, ApoA2, RANTES, B2M, PAI-1, AFP, sVCAM-1	13	0.9816
TTR, EGFR, D.Dimer, CRP, ApoA4, ApoA1, CEA, ApoA2, RANTES, B2M, PAI-1, AFP	12	0.9823
TTR, EGFR, D.Dimer, CRP, ApoA4, ApoA1, CEA, ApoA2, RANTES, B2M, PAI-1	11	0.9823
TTR, EGFR, D.Dimer, CRP, ApoA4, ApoA1, CEA, ApoA2, RANTES, B2M	10	0.9824
TTR, EGFR, D.Dimer, CRP, ApoA4, ApoA1, CEA, ApoA2, RANTES	9	0.9819
TTR, EGFR, D.Dimer, CRP, ApoA4, ApoA1, CEA, ApoA2	8	0.9809
TTR, EGFR, D.Dimer, CRP, ApoA4, ApoA1, CEA	7	0.9820
TTR, EGFR, D.Dimer, CRP, ApoA4, ApoA1	6	0.9817
TTR, EGFR, D.Dimer, CRP, ApoA4	5	0.9817
TTR, EGFR, D.Dimer, CRP	4	0.9786
TTR, EGFR, D.Dimer	3	0.9805
TTR, EGFR	2	0.9741
TTR	1	0.9577

그 결과, 도 1 및 표 4에 나타낸 바와 같이, 마커의 수가 3개까지는 AUC 값이 기하급수적으로 증가하지만, 5개 이상부터는 비슷한 AUC 값을 나타내었다. 비슷한 AUC 값을 가지는 경우, 마커의 수가 적을수록 비용이 절약되므로 최종적으로 대장암의 바이오마커로서 TTR, EGFR, D.Dimer, CRP 및 ApoA4를 선별하였다(도 1 및 표 4).

TTR, EGFR, D.Dimer, CRP 및 ApoA4 바이오마커 조합의 성능 측정

상기 실시예 5에서 AUC 값이 가장 컸던 TTR, EGFR, D.Dimer, CRP 및 ApoA4 바이오마커 조합으로 만든 분류모델의 특이도, 민감도 및 정확도를 측정함으로써, 바이오마커의 성능을 확인하였다. 특이도(specificity)는 정상인 사람을 정상으로 판정한 비율로, 하기 수학식 2와 같이 계산하였으며, 민감도(sensitivity)는 암환자를 암으로 판정한 비율로, 하기 수학식 3과 같이 계산하였고, 정확도(accuracy)는 암과 정상을 맞춘 비율로, 민감도와 특이도의 평균으로 계산하였다.

[수학식 2]

[수학식 3]

TTR, EGFR, D.Dimer, CRP 및 ApoA4 바이오마커 조합의 성능

특이도(specificity)	민감도(sensitivity)	정확도(accuracy)	역치값(threshold)
91.38%	93.91%	92.03%	0.227656

그 결과, 표 5에 나타낸 바와 같이, TTR, EGFR, D.Dimer, CRP 및 ApoA4 바이오마커 조합으로 만든 분류모델은 91.38%의 특이도, 93.91%의 민감도, 92.03%의 정확도 및 0.227656의 역치값을 나타내었다(표 5). 이를 통해, 역치값이 0.227656 초과이면 대장암환자로, 0.227656 미만이면 정상인으로 진단할 수 있음을 확인하였다.

TTR, EGFR, D.Dimer, CRP 및 ApoA4 바이오마커 조합으로 만든 분류모델의 검증

상기 실시예 5에서 생성한 TTR, EGFR, D.Dimer, CRP 및 ApoA4 바이오마커 조합으로 만든 분류모델을 하기와 같은 방법으로 검증하였다.

먼저, 서울대학교병원 가정의학과에서 정상인 95명을, 계명대학교 바이오뱅크와 부산대학교 인체자원은행에서 각각 대장암 환자 25명 및 70명을 대상으로 한 것을 제외하고는 <실시예 1>과 동일한 방법으로 혈청을 수득하였다. <실시예 2>와 동일한 방법으로 TTR, EGFR, D.Dimer, CRP 및 ApoA4 단백질을 정량한 후, <실시예 6>과 동일한 방법으로 특이도, 민감도, 정확도 및 역치값을 측정하여 역치값이 0.227656일때 특이도, 민감도 및 정확도를 확인하였다.

TTR, EGFR, D.Dimer, CRP 및 ApoA4 바이오마커 조합으로 만든 분류모델의 성능

역치값(threshold)	특이도(specificity)	민감도(sensitivity)	정확도(accuracy)
0.2276564	91.58%	92.63%	92.11%

그 결과, 표 6에 나타낸 바와 같이, TTR, EGFR, D.Dimer, CRP 및 ApoA4 바이오마커 조합으로 만든 분류모델은 역치값이 0.2276564일때 91.58%의 특이도, 92.63%의 민감도 및 92.11%의 정확도를 나타냄을 확인하였다(표 6). 이를 통해, TTR, EGFR, D.Dimer, CRP 및 ApoA4 바이오마커 조합으로 만든 분류모델은 대장암 환자와 정상인을 높은 정확도로 구별할 수 있음을 알 수 있었다.

Claims

TTR(transthyretin), EGFR(epidermal growth factor receptor), D.Dimer, CRP(c-reactive protein) 및 ApoA4(apolipoprotein A4)로 구성된 바이오마커에 특이적으로 결합하는 검출시약을 포함하는 대장암 진단용 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 검출시약이 항체, 항체 단편, 앱타머 및 D-펩티드로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 대장암 진단용 조성물.
제 2항에 있어서, 상기 항체가 단일클론항체 또는 다클론항체인, 대장암 진단용 조성물.
제 1항의 대장암 진단용 조성물을 포함하는 대장암 진단용 키트.
TTR, EGFR, D.Dimer, CRP 및 ApoA4로 구성된 바이오마커를 암호화하는 유전자의 핵산 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브(probe) 및 안티센스 뉴클레오티드(anti-sense nucleotide)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는, 대장암 진단용 키트.
1) 시료로부터 TTR, EGFR, D.Dimer, CRP 및 ApoA4로 구성된 단백질 발현량을 측정하는 단계; 및
2) 상기 단계 1)의 단백질 발현량을 정상개체의 단백질 발현량과 비교하는 단계를 포함하는 대장암 진단의 정보를 제공하기 위한 방법.
제 6항에 있어서, 상기 단계 1)의 시료가 소변, 혈액, 혈청 또는 혈장인, 대장암 진단의 정보를 제공하기 위한 방법.
제 6항에 있어서, 상기 TTR, EGFR 및 ApoA4 단백질의 발현량이 정상개체에 비해 감소하는, 대장암 진단의 정보를 제공하기 위한 방법.
제 6항에 있어서, 상기 CRP 및 D.Dimer 단백질의 발현량이 정상개체에 비해 증가하는, 대장암 진단의 정보를 제공하기 위한 방법.
1) 시료로부터 TTR, EGFR, D.Dimer, CRP 및 ApoA4로 구성된 단백질을 암호화하는 유전자의 발현량을 측정하는 단계; 및
2) 상기 단계 1)의 유전자 발현량을 정상개체의 유전자 발현량과 비교하는 단계를 포함하는 대장암 진단의 정보를 제공하기 위한 방법.