KR20180137763A

KR20180137763A - 골조직 재생을 위한 일체형 바이오소재 및 그 제조방법

Info

Publication number: KR20180137763A
Application number: KR1020170077400A
Authority: KR
Inventors: 박윤정; 정종평; 이주연; 채주연
Original assignee: 주식회사 나이벡; 서울대학교산학협력단
Priority date: 2017-06-19
Filing date: 2017-06-19
Publication date: 2018-12-28
Also published as: ES2946546T3; US20210138111A1; EP3643333A1; EP3643333A4; WO2018235984A1; KR102183048B1; CN110997023A; EP3643333B1

Abstract

본 발명은 골조직 재생을 위한 일체형 바이오소재 및 그 제조방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 세포외기질 단백질 및 골미네랄로 구성된 하부구조와 세포외기질 단백질로 구성된 상부층을 포함하는 골조직 재생용 일체형 바이오소재 및 그 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 의한 골조직 재생을 위한 일체형 바이오소재는 세포외기질 단백질 및 골미네랄 성분으로 구성된 하부구조가 자연적인 골조직 환경을 재현하여 신생골의 재생을 용이하게 하며, 특히 세포외기질 단백질로 구성된 상부층을 적정 비율로 적층시킴으로써 상피조직 또는 결체조직의 침입을 막는 동시에 골조직 재생능을 극대화시킨 장점이 있다.

Description

골조직 재생을 위한 일체형 바이오소재 및 그 제조방법{An assembled biomaterial for bone tissue regeneration and method for preparing the same}

본 발명은 골조직 재생을 위한 일체형 바이오소재 및 그 제조방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 세포외기질 단백질 및 골미네랄로 구성된 하부구조와 세포외기질 단백질로 구성된 상부층을 포함하는 골조직 재생용 일체형 바이오소재 및 그 제조방법에 관한 것이다.

치아를 지지하는 치주조직은 크게 치조골, 치조골과 치아 사이의 치근막을 구성하는 치주 인대조직, 상피조직, 그리고 결체조직으로 이루어진다. 치주염의 진행으로 인한 치조골의 소실은 치주 인대조직의 상실을 동반하며, 치주염 치료 후 소실된 조직 부위에서는 결체조직의 과다생장으로 인해 치조골과 치주 인대조직의 정상적인 회복이 불가능하여진다. 또한, 새로운 뼈가 생성되더라도 치주 인대조직이 정상적으로 분화되지 않아 치아기능상실을 유발할 수 있다. 따라서, 이러한 문제를 해결하기 위하여 치조골 재생술로 골이식술(bone substitute grafting)과 함께 인위적인 차폐막을 이용하고 있다. 골이식재만 사용할 경우, 이식부위에서 골이식재가 유지되기 어려운 단점이 있기 때문에 골이식재를 골손상 부위에 채워놓고 그 위에 차폐막을 덮어 봉합하는 기법으로 조직의 재생을 유도하고 있다 (도1). 골이식재와 차폐막을 동시에 사용할 경우, 하부에 이식한 골이식재와 상부의 차폐막이 서로 밀착되어야 골재생이 원활하게 이루어져 골이식술의 성공률이 높아진다. 반대로, 골이식재와 차폐막 사이에 틈이 생기면 골재생의 성공률이 낮아진다. 그러나, 골이식재와 차폐막의 개별제품을 적용하는 것으로는 두 제품 사이의 완벽한 밀착을 얻을 수 없다. 따라서, 골이식재와 차폐막 기능을 동시에 가진 일체형 제품이 개발된다면, 골재생의 성공률을 현재보다 증가시킬 수 있다. 골이식재의 골전도성과 차폐막의 결체조직 차단효과를 한 제품에서 동시에 얻을 수 있으므로 사용의 편리성을 증진시킬 수 있다 (도 2 (a), (b)).

최근까지 이러한 골재생 이식술에 있어 가장 빈번하게 활용되는 이식재는 자가골, 동종골, 이종골, 합성 골이식 재료가 있는데 자가골은 골채취를 위한 이차적인 수술 필요 등 수득이 어려운 단점이 있고 동종골의 경우 질환의 전염가능성 등의 어려움이 있으며, 합성골은 자연적인 골조직 (natural bone tissue)와 생체친화성이 작기 때문에, 이종골이 많이 활용되고 있다.

차폐막의 경우, 최근 20여년 동안 차폐막을 사용하여 효과적으로 치주조직의 재생을 유도한 사례(J. Gottlow, et al., J. Clin. Perio, 13, (1986) pp. 604~616)가 보고된 이래 여러가지 소재를 차폐막으로 이용하여 조직유도재생에 대한 연구가 진행되어 왔다. 최근에는 생분해성 차폐막 중 콜라겐으로 제조된 차폐막을 가장 많이 사용하고 있으나, 기계적인 강도가 약하고, 골이식재와 완벽하게 밀착되지 않는 한계가 있다.

한편, 인체 내 골 및 치아는 대략 80%의 무기질 및 수분과 20%의 유기물질을 포함하고 있고, 유기물 중 80%는 콜라겐성 단백질, 그리고 20%는 비콜라겐성 단백질로 이루어져 있다. 이들 단백질 성분은 경조직의 생성, 구조적인 강도 및 탄성을 유지하는데 기여할 뿐 아니라 골아세포 등의 경조직 형성 세포의 부착을 유도하고, 경조직 성분을 구성하는 무기이온 성분을 배향시키는 매트릭스로서 작용한다 (Anselme, Osteoblast adhesion on biomaterials, Biomaterials, 21 (7): 667-81, 2000).

기존의 이종골 유래 골이식재는 단백질을 완전히 제거한 미네랄 성분만 존재하기 때문에, 뼈의 자연적인 구조와 동일하지는 않다. 이것을 해결하기 위해 콜라겐과 같은 골조직을 구성하는 단백질을 도입하여 바이오소재를 개발하고 있다. 그러나, 콜라겐과 골이식재를 단순히 혼합하는 것만으로는 안정한 바이오소재를 제조할 수 없으며, 여기에 차폐막 기능까지 갖춘 바이오소재를 제조하기 위해서는 기존 바이오소재 제조방법으로는 한계가 있다.

한편, 상부층과 하부구조를 각각 제조 후 완제품 단계에서 화학적 가교제를 사용하여 공유결합을 통해 상부층과 하부구조를 결합시키는 방법을 시도해 보았으나, 고체상 (solid phase) 상태에서 가교반응이 일어나기 어려워, 충분한 결합을 형성시킬 수 없었으며, 제품을 사용하고자 생리식염수를 충분히 흡수(수화)시킬 경우, 상부층과 하부구조가 분리되는 문제점이 발생하였다. 또한, 화학적 가교제를 사용할 경우, 제품내에 잔류하는 화학적 가교제가 없어야 하며, 잔류하는 경우에는 이식된 부위에서 독성을 유발할 수 있으므로 안전성 측면에서 부정적인 영향이 발생하였다. 그리고, 하부구조와 상부층을 각각 이식하였을 때, 두 구조물 사이의 공간이 발생하기 때문에, 상부에서 뿐만 아니라, 측면으로부터 결체조직이 침입하여 들어올 수 있어 하부로부터 유입되는 골재생 과정을 방해하게 되어 골재생 효율이 현저히 감소되는 경향이 확인되었다.

따라서 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 골조직 환경을 구현하면서 동시에 결체조직의 침입을 막을 수 있는 차폐막의 기능이 있는 일체형 바이오소재의 개발이 필요하게 되었다.

이에, 본 발명자들은 상기와 같은 종래기술의 문제점을 해결하고자 예의 노력한 결과, 골조직의 구성과 유사한 조성을 가지도록 세포외기질과 골미네랄 성분이 유기적으로 결합되며, 여기에 차폐막 기능을 가진 일체형 바이오소재를 개발하였고, 이러한 일체형 바이오소재가 골재생에 탁월한 효과를 가진다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 골조직 환경을 구현하면서 동시에 결체조직의 침입을 막아 골조직 재생능을 극대화시킨 골조직 재생용 일체형 바이오소재 및 그 제조방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 세포외기질 단백질 및 골미네랄 성분을 함유하는 하부구조와 세포외기질 단백질을 함유하는 상부층을 포함하는 골조직 재생용 일체형 바이오소재를 제공한다.

본 발명은 또한, (a) 세포외기질 단백질과 골미네랄 입자를 함유하는 하부구조 혼합체를 성형하는 단계 (b) 세포외기질 단백질과 골미네랄 입자를 함유하는 하부구조 혼합체의 구조를 정렬하는 단계 (c) 세포외기질 단백질을 함유하는 상부층을 적층하는 단계 (d) 적층된 상부층과 하부구조를 결합시키는 단계 (e) 동결건조하는 단계 및 (f) 상부층의 세포외기질 단백질을 열가교하는 단계를 포함하는 세포외기질 단백질 및 골미네랄 성분을 함유하는 하부구조와 세포외기질 단백질을 함유하는 상부층을 포함하는 골조직 재생용 일체형 바이오소재의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 의한 골조직 재생을 위한 일체형 바이오소재는 세포외기질 단백질 및 골미네랄 성분으로 구성된 하부구조가 자연적인 골조직 환경을 재현하여 신생골의 재생을 용이하게 하며, 특히 세포외기질 단백질로 구성된 상부층을 적정 비율로 적층시킴으로써 상피조직 또는 결체조직의 침임을 막는 동시에 골조직 재생능을 극대화시킨 장점이 있다.

도 1은 일반적인 골이식시술 과정을 나타낸 모식도이다. 골이식재를 먼저 채운 후, 차페막을 그 위에 덮은 후에 봉합을 한다.
도 2는 (a) 골이식재와 차폐막 기능이 결합된 일체형 바이오소재의 모식도이다. (b) 골이식재와 차폐막의 기능이 결합된 일체형 바이오소재의 시차주사전자현미경 사진이다. (c) 골이식재와 차폐막을 각각 사용한 경우와 골이식재와 차폐막의 기능이 결합된 일체형 바이오소재에 의한 골재생 과정을 나타낸 모식도이다.
도 3은 실시예 1, 2, 3에서 제조된 일체형 바이오소재의 시차주사현미경사진이다. (화살표: 콜라겐 층)
도 4는 실시예 1, 2, 3에서 제조된 일체형 바이오소재의 콜라겐 상부층의 콜라겐 분해효소에 의한 분해정도 시차주사현미경으로 관찰한 결과이다. (화살표: 콜라겐 층)
도 5는 실시예 1, 2, 3에서 제조된 일체형 바이오소재를 토끼의 골결손 부위에서 이식 후, 골재생 정도를 관찰한 결과이다. (화살표: 콜라겐 층, G: 골 이식재, NB: 신생골)

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 발명에서는 세포외기질 단백질 및 골미네랄로 구성된 하부구조에 세포외기질 단백질로 구성된 상부층을 적층하여 제조된 일체형 바이오소재를 골 이식재로 사용하는 경우, 하부구조는 자연적인 골조직 환경을 재현하여 신생골의 재생을 용이하게 하며 상부층은 상피조직 또는 결체조직의 침입을 막는 이식부위에서 골이식재가 골 손상 부위에 안정적으로 유지되고 자연적인 골조직 환경을 재현함으로써 골조직 재생능을 극대화시킬 수 있음을 확인하였다.

또한, 일체형 바이오소재는 초기 제조공정에서 두 구조물간의 물리적인 결합을 유도함으로써, 주원료 이외의 화학적 가교제 등의 부가적인 시약을 사용하지 않고 제조가 가능하므로, 화학적 가교제에 의한 독성 문제를 막을 수 있으며, 수화 후에도 상부층과 하부층이 분리되지 않아 구조적 안정성도 달성할 수 있음을 확인하였다.

그리고, 하부구조와 상부층을 각각 이식하였을 때, 두 구조물 사이의 공간에 결체조직이 침입하여 골재생 과정을 방해하는 것과 비교하여, 일체형 바이오소재의 경우, 두 구조물 사이의 공간이 없으므로, 측면으로의 결체조직이 침입되지 않아 하부로부터 유입되는 골재생 과정이 원할하고 효과적으로 유도되는 것을 확인하였다. (도 2 (c)).

따라서, 본 발명은 일 관점에서 세포외기질 단백질 및 골미네랄 성분을 함유하는 하부구조와 세포외기질 단백질을 함유하는 상부층을 포함하는 골조직 재생용 일체형 바이오소재에 관한 것이고,

다른 관점에서, (a) 세포외기질 단백질과 골미네랄 입자를 함유하는 하부구조 혼합체를 성형하는 단계; (b) 세포외기질 단백질과 골미네랄 입자를 함유하는 하부구조 혼합체의 구조를 정렬하는 단계; (c) 세포외기질 단백질을 함유하는 상부층을 적층하는 단계; (d) 적층된 상부층과 하부구조를 결합시키는 단계; (e) 동결건조하는 단계; 및 (f) 상부층의 세포외기질 단백질을 열가교하는 단계;를 상기 골조직 재생용 일체형 바이오소재의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 세포외기질 단백질을 함유하는 상부층은 세포외기질-골미네랄 성분을 함유하는 하부구조인 골조직 유사 바이오소재에 결합이 유기적으로 이루어져야 하며, 생체 내에서 적용시 분리가 되지 않아야 한다. 또한, 세포외기질 단백질을 함유하는 상부층은 생체 내에 이식시 일주일 이상 유지되어야 하므로, 콜라겐 분해효소와 같은 단백질 분해효소에 의한 분해 정도가 전체 중량의 10%(w/w) 이하이어야 한다. 본 발명에서는 실시예 1 내지 3에서 제조된 일체형 바이오소재에서 콜라게네이즈에 의한 상부층의 콜라겐 분해율이 2주가 경과된 시점에서 모두 2.41~5.90%(w/w)로 나타나, 상부층의 차폐막으로서의 유지력이 일주일 이상 지속될 수 있음을 확인할 수 있었다.

본 발명의 (a) 단계에서는 세포외기질 단백질과 골미네랄 입자를 함유하는 하부구조 혼합체를 성형몰드에 충진하여 성형한다.

본 발명의 (b) 단계에서 세포외기질 단백질과 골미네랄 입자의 혼합체의 구조를 정렬하는 단계란 단백질 사슬간의 위치가 가까워지면서, 단백질 사슬사이의 소수성결합, 수소결합 등이 형성되어 단백질 사슬의 배열을 정렬시킴으로써 구조를 안정화하는 것을 의미한다.

본 발명의 (c)단계에서 사용하는 세포외기질 단백질의 농도는 바이오소재 전체에서 0.5-10%(w/w)의 농도가 되도록 적층하고, 더 바람직하게는 2-5% (w/w)의 농도가 되도록 적층한다.

본 발명의 (d)단계는 적층된 상부층(즉, 세포외기질 단백질 층)과 하부구조(즉, 세포외기질 단백질과 골미네랄 입자를 함유하는 혼합체)를 강염기를 이용하여 젤화 과정을 통해 결합시키는 단계로, 상기 강염기는 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화칼슘, 수산화바륨, 수산화암모늄, 탄산칼슘, 탄산칼륨 및 암모니아로 구성된 군에서 선택되는 것이 바람직하나, 이에 한정되지는 않는다.

본 발명의 (e) 단계는 -1.5℃에서 2시간 이상 동결 유지 후, 동결속도를 1℃/min으로 -20℃까지 동결할 수 있으나, 당업계에서 통상적으로 사용되는 동결건조 방법을 적용할 수 있다.

본 발명의 (f)단계는 상부층의 세포외기질 단백질을 열가교 (dehydrothermal treatment)함으로써 분해기간을 연장시키기 위한 것으로, 140 내지 160℃에서 48 내지 168 시간 동안 처리하여 열가교 시키는 것이 바람직하다.

한편, 상기 골조직 재생용 일체형 바이오소재의 제조방법은 (e) 단계 이후, (g) 항균 또는 항염증 기능성 물질을 첨가하는 단계; 및 (h) 동결건조하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에서, 상기 하부구조 및 상부층의 세포외기질 단백질은 콜라겐, 히알루론산, 엘라스틴, 황산콘드로이틴 및 피브로인으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있다. 이들 세포외기질은 사람, 동물에서 유래한 것과 미생물에서 생산된 재조합 단백질 모두를 사용할 수 있으며, 특히, 콜라겐의 경우, 돼지 피부에서 분리한 타입 1, 또는 타입 3를 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명에서, 상기 골미네랄 성분은 동종골 또는 이종골에서 기인한 생물유래 골미네랄 분말, 합성 수산화아파타이트 및 트리칼슘인산 마이크로분말로 구성된 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다.

본 발명에서, 골미네랄 성분과 세포외기질 단백질의 비율은 다양하게 변화시킬 수 있으며, 골미네랄 성분의 함량은 전체 중량 중 80 중량% 이상인 것이 바람직하고, 80 내지 95 중량%인 것이 더욱 바람직하다. 하부구조와 상부층을 합한 세포외기질 단백질의 함량은 전체 중량 중 5 중량% 이상인 것이 바람직하고, 5 내지 20 중량%인 것이 더욱 바람직하다.

한편, 상부층의 세포외기질 단백질: 하부구조의 세포외기질 단백질의 함량비(중량비)는 0.13~1.3:1인 것이 바람직한데, 특히 상부층의 세포외기질 단백질: 하부구조의 세포외기질 단백질의 함량비(중량비)는 0.5:1인 경우에 있어서, 신생골 생성능이 현저히 증가한다는 점에서 가장 바람직하다. 이 경우, 하부구조의 세포외기질 단백질 1 중량부에 대하여 상부층의 세포외기질 단백질이 0.13 중량부 이하인 경우에는 상부층의 두께가 너무 얇게 (약 200㎛이하) 제작되어 상부층이 결체조직의 침입을 막는 차폐막으로서의 역할을 수행하지 못하여 골조직 재생용 일체형 바이오소재로 부적합하며, 1.3 중량부 이상인 경우에는 상부층의 세포외기질 단백질의 농도가 하부구조내의 단백질 농도보다 높아져 밀도가 더 높으므로 상부층을 적층 및 하부구조와 결합하는 단계에서 밀도차에 의해 상부층과 하부구조의 경계가 불분명해지며 하부구조내 골 미네랄이 상부층까지 혼입되는 등 상부층의 세포외기질 단백질층이 차폐막으로서의 역할을 제대로 수행하지 못하므로 골조직 재생용 일체형 바이오소재로 부적합하다.

본 발명에서 세포외기질 단백질을 포함하는 상부층은 전체 바이오소재 두께의 20 내지 35%의 두께인 것이 바람직하다. 바람직하게는 상부층의 두께는 0.5~1.5mm, 하부구조의 두께는 1~6mm로 제조하고, 더욱 바람직하게는 상부층의 두께는 1mm, 하부구조의 두께는 2~4mm로 제조할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.

본 발명의 일체형 바이오소재는 항균 또는 항염증 기능성 물질을 더 포함하여 구성될 수 있으며, 상기 항균 또는 항염증 기능성 물질은 항균제, 항생제, 항염증 기능을 가진 펩타이드 또는 단백질로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있으나 이에 한정되지는 않는다.

본 발명에서 상기 항균제는 소듐 에틸렌디아민테트라아세테이트(sodium ethylene diaminotetraacetate), 소듐 카퍼 클로로필린(sodium copper chlorophyllin), 소듐 플로라이드(sodium fluoride) 또는 벤제토니움 클로라이드 (benzethonium chloride) 등과 같은 불소와 염소성분이 함유된 합성물, 안식향산(benzoic aicd) 등을 포함하는 방향족 카르복시산, 알란토인(allantoin) 또는 초산 토코페롤을 사용할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.

본 발명에서 항생제는 미노사이클린(minocycline), 테트라사이클린(tetracycline), 독시싸이클린(doxycycline), 클로로헥시딘(chlorohexidine), 오플록사신(ofloxacin), 티니다졸(tinidazole), 케토나졸(Ketonazole) 또는 메트로니다졸 (metronidazole)을 사용할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.

항균 펩타이드는 인간 베타 디펜신(human β-defensin) 유래 펩타이드를 사용할 수 있으며, 항균 펩타이드는 하기 서열번호 1~3 아미노산 서열을 갖는 펩타이드에서 선택될 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.

서열번호 1 (BD3-3): G-K-C-S-T-R-G-R-K-C-C-R-R-K-K

서열번호 2 (BD3-3-M1): G-K-C-S-T-R-G-R-K-C-M-R-R-K-K

서열번호 3 (BD3-3-M2): G-K-C-S-T-R-G-R-K-M-C-R-R-K-K

[실시예]

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

실시예 1: 소뼈 유래 골미네랄 입자 및 콜라겐으로 이루어진 하부구조와 콜라겐 상부층이 결합된 일체형 바이오소재 (일체형 바이오소재: 7.7% 콜라겐 함유, 상부층 콜라겐 농도: 0.5%)

소뼈 유래 골미네랄 입자는 0.4-0.8mm의 입자도를 가지도록 제작하였다. 골미네랄 성분 27g에 0.5M 아세트산에 용해한 4.0% (w/v) 돼지피부 유래 콜라겐 용액 50mL (2g 콜라겐) 를 혼합하고 해당 혼합물을 성형몰드에 충진하여 이를 클린벤치에서 하부구조를 정렬하였다. 별도로 0.5M 아세트산에 용해한 0.5% (w/v) 돼지피부 유래 콜라겐 용액 50mL (0.25g 콜라겐)를 혼합물 위에 분주하여 콜라겐 상부층을 형성시켰다. 사용된 콜라겐 중량이 전체 중량비율의 7.7% (w/w)가 되도록 하였다. 콜라겐 상부층을 분주한 후, 클린벤치에서 일정시간 방치하였다. 이를 25~30% 암모니아수에 의해 포화된 암모니아 증기에 3시간 이상 방치하여 젤화시킨 후, 정제수로 세척하여 pH를 중화하였다.

세척 후에 -1.5℃에서 2시간 이상 동결 유지 후, 동결속도를 1℃ /min 으로 -20℃까지 동결하였다. -20℃에서 일체형 바이오소재가 완전히 동결된 것을 확인하고, 48시간 동안 동결건조를 진행하였다. 진공오븐에서 140℃로 120시간 동안 가교 후, 일체형 바이오소재를 얻었다.

실시예 2: 소뼈 유래 골미네랄 입자 및 콜라겐으로 이루어진 하부구조와 콜라겐 상부층이 결합된 일체형 바이오소재 (일체형 바이오소재: 10.0% 콜라겐 함유, 상부층 콜라겐 농도: 2.0%)

소뼈 유래 골미네랄 입자는 0.4-0.8mm의 입자도를 가지도록 제작하였다. 골미네랄 성분 27g에 0.5M 아세트산에 용해한 4.0% (w/v) 돼지피부 유래 콜라겐 용액 50mL (2g 콜라겐)를 혼합하고 해당 혼합물을 성형몰드에 충진하여 이를 클린벤치에서 하부구조를 정렬하였다. 별도로 0.5M 아세트산에 용해한 2.0% (w/v) 돼지피부 유래 콜라겐 용액 50mL (1g 콜라겐)를 혼합물 위에 분주하여 콜라겐 상부층을 형성시켰다. 사용된 콜라겐 중량이 전체 중량비율의 10.0% (w/w)가 되도록 하였다. 콜라겐 상부층을 분주한 후, 클린벤치에서 일정시간 방치하였다. 이를 25~30% 암모니아수에 의해 포화된 암모니아 증기에 3시간 이상 방치하여 젤화시킨 후, 정제수로 세척하여 pH를 중화하였다. 세척 후에 -1.5℃에서 2시간 이상 동결 유지 후, 동결속도를 1℃ /min 으로 -20℃까지 동결하였다. -20℃에서 일체형 바이오소재가 완전히 동결된 것을 확인하고, 48시간 동안 동결건조를 진행하였다. 진공오븐에서 140℃로 120시간 동안 가교 후, 일체형 바이오소재를 얻었다.

실시예 3: 소뼈 유래 골미네랄 입자와 및 콜라겐으로 이루어진 하부구조와 콜라겐 상부층이 결합된 일체형 바이오소재 (일체형 바이오소재: 14.3% 콜라겐 함유, 상부층 콜라겐 농도: 5.0%)

소뼈 유래 골미네랄 입자는 0.4-0.8mm의 입자도를 가지도록 제작하였다. 골미네랄 성분 27g에 0.5M 아세트산에 용해한 4.0% (w/v) 돼지피부 유래 콜라겐 용액 50mL (2g 콜라겐)를 혼합하고 해당 혼합물을 성형몰드에 충진하여 이를 클린벤치에서 하부구조를 정렬하였다. 별도로 0.5M 아세트산에 용해한 5.0% (w/v) 돼지피부 유래 콜라겐 용액 50mL (2.5g 콜라겐)를 혼합물 위에 분주하여 콜라겐 상부층을 형성시켰다. 사용된 콜라겐 중량이 전체 중량비율의 14.3%가 되도록 하였다. 콜라겐 상부층을 분주한 후, 클린벤치에서 일정시간 방치하였다. 이를 25~30% 암모니아수에 의해 포화된 암모니아 증기에 3시간 이상 방치하여 젤화시킨 후, 정제수로 세척하여 pH를 중화하였다. 세척 후에 -1.5℃에서 2시간 이상 동결 유지 후, 동결속도를 1℃ /min 으로 -20℃까지 동결하였다. -20℃에서 일체형 바이오소재가 완전히 동결된 것을 확인하고, 48시간 동안 동결건조를 진행하였다. 진공오븐에서 140℃로 120시간 동안 가교 후, 일체형 바이오소재를 얻었다.

비교예 1: 소뼈유래 골미네랄 입자와 및 콜라겐으로 이루어진 하부구조만으로 이루어진 바이오소재 (일체형 바이오소재: 6.90% 콜라겐 함유, 상부층 콜라겐 농도: 0%)

소뼈 유래 골미네랄 입자는 0.4-0.8mm의 입자도를 가지도록 제작하였다. 골미네랄 성분 27g에 0.5M 아세트산에 용해한 4.0% (w/v) 돼지피부 유래 콜라겐 용액 50mL (2g 콜라겐)를 혼합하고 해당 혼합물을 성형몰드에 충진하여 이를 클린벤치에서 하부구조를 정렬하였다. 사용된 콜라겐 중량이 전체 중량비율의 6.90%가 되도록 하였다. 콜라겐 상부층을 분주한 후, 클린벤치에서 일정시간 방치하였다. 이를 강염기에 의해 젤화시킨 후, 정제수로 세척하여 pH를 중화하였다. 세척 후에 -1.5℃에서 2시간 이상 동결 유지 후, 동결속도를 1℃/min 으로 -20℃까지 동결하였다. -20℃에서 일체형 바이오소재가 완전히 동결된 것을 확인하고, 48시간 동안 동결건조를 진행하였다. 진공오븐에서 140℃로 120시간 동안 가교 후, 일체형 바이오소재를 얻었다. 골이식재 및 콜라겐의 사용량은 하기 표 1에 나타내었다.

실험예 1: 제조된 일체형 바이오소재의 구조 관찰

실시예 1, 2, 3에서 제조된 일체형 바이오소재와 대조군인 자사제품(℃S-B Xenomatrix Collagen, NIBEC, 한국)을 시차주사전자현미경으로 관찰하였다. 각각의 조직 구조 모사체를 백금으로 코팅하고, 시차주사현미경 (field emission scanning electron microscope, FE-SEM, Jeol, S-4700, Japan)으로 관찰하였다.

도 3는 각 실시예의 일체형 바이오소재의 시차주사현미경 사진이다. 실시예 1 내지 3에서 제조된 복합구조체에서 콜라겐과 골미네랄 성분이 고르게 혼합되어 있는 것을 관찰할 수 있었으며 골미네랄과 콜라겐으로 이루어진 하부구조와 콜라겐 상부층 사이에 빈 공간 없이 견고하게 결합되어 있는 것을 확인할 수 있었다.

실험예 2: Collagenase에 의한 분해시험

HBSS(Salt Solution) 용액 내 콜라겐 분해 효소 (Collagenase) (0.247U/mg lyophilizate) 20ug/mL를 포함시키고, 실시예 1, 2, 3의 일체형 바이오소재를 일정시간 방치하여 분해정도를 확인하였다.

계산식:

a: 분해능 시험 전 무게 (g)

b: 분해능 시험 후 무게 (g)

* 골이식재는 Collagenase에 의해 분해되지 않으므로 콜라겐 분해율에 영향을 미치지 않는다.

2주 경과된 시점에서 전체구조인 콜라겐 상부층과 하부구조(골이식재 및 콜라겐 혼합)내의 콜라겐 분해능 시험결과, 시험 전 무게대비 최대 6.90%, 최소 1%의 분해를 보였다. 대조군에서 하부구조 내의 콜라겐 분해율이 1%인 것을 감안하면, 실시예 1~3에서의 상부층에서만의 콜라겐의 분해율은 각각 1%를 차감한 2.41~5.90%의 분해율을 보였다.

2주까지 콜라겐 상부층이 유지됨을 확인할 수 있었으며 실시예 2, 3에서 콜라겐 상부층의 분해율은 3%이하로 유지되었다.

콜라겐 분해 효소(Collagenase)의 농도에 따른 분해정도는 하기 표 2에 나타내었다.

* 1) 일체형 구조(콜라겐 상부층 및 하부구조 전체포함)내 사용된 콜라겐 분해율

* 2) 콜라겐 상부 층 제조 시 사용된 콜라겐 분해율

도 4는 실시예 1, 2, 3와 대조군의 분해시험 완료 후, 콜라겐 상부층의 분해정도를 확인하기 위해, 일체형 바이오소재 표면을 시차주사전자현미경으로 관찰하였다.

실험예 3: 동물에서 골재생능 시험

Rabbit의 두개골에 8mm의 결손부를 형성시키고 실시예 1, 2, 3의 일체형 바이오소재와 비교예 1의 바이오소재를 대조군으로 이식하고 각각 8주간 식립한 후에 신생골의 형성 정도 및 주변 조직의 재생능력을 관찰하였다 (도 5).

실시예 2의 바이오소재를 이식하였을 때, 나머지 군보다 더 많은 신생골이 형성되었다. 또한, 실시예 2의 일체형 바이오소재는 비교예 1보다 신생골의 면적이 50% 정도 증가하였다. 이에 대한 조직계측학적 (Histomorphometry) 결과는 하기 표 3에 나타내었다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Nano Intelligent Biomedical Engineering Corporation. co. Ltd Seoul National University R&DB Foundation <120> An assembled biomaterial for bone tissue regeneration and method for preparing the same <130> P17-B091 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human beta-defensin derived peptide(BD3-3) <400> 1 Gly Lys Cys Ser Thr Arg Gly Arg Lys Cys Cys Arg Arg Lys Lys 1 5 10 15 <210> 2 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human beta-defensin derived peptide(BD3-3-M1) <400> 2 Gly Lys Cys Ser Thr Arg Gly Arg Lys Cys Met Arg Arg Lys Lys 1 5 10 15 <210> 3 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human beta-defensin derived peptide(BD3-3-M2) <400> 3 Gly Lys Cys Ser Thr Arg Gly Arg Lys Met Cys Arg Arg Lys Lys 1 5 10 15

Claims

세포외기질 단백질 및 골미네랄 성분을 함유하는 하부구조;와 세포외기질 단백질을 함유하는 상부층;을 포함하는 골조직 재생용 일체형 바이오소재.
제1항에 있어서, 상기 하부구조 및 상부층의 세포외기질 단백질은 콜라겐, 히알루론산, 엘라스틴, 황산콘드로이틴 및 피브로인으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 골조직 재생용 일체형 바이오소재.
제1항에 있어서, 상기 골미네랄 성분은 동종골 또는 이종골에서 기인한 생물유래 골미네랄 분말, 합성 수산화아파타이트 및 트리칼슘인산 마이크로분말로 구성된 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 골조직 재생용 일체형 바이오소재.
제1항에 있어서, 상기 골미네랄 성분의 함량이 전체 중량의 80 내지 95 중량%인 것을 특징으로 하는 골조직 재생용 일체형 바이오소재.
제1항에 있어서, 상기 하부구조와 상부층의 세포외기질 단백질 함량은 전체 중량의 5 내지 20 중량%인 것을 특징으로 하는 골조직 재생용 일체형 바이오소재.
제1항에 있어서, 상부층의 세포외기질 단백질 : 하부구조의 세포외기질 단백질의 함량비(중량비)는 0.13 ~ 1.3 : 1 인 것을 특징으로 하는 골조직 재생용 일체형 바이오소재.
제1항에 있어서, 항균 또는 항염증 기능성 물질을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 골조직 재생용 일체형 바이오소재.
다음 단계를 포함하는 제1항의 골조직 재생용 일체형 바이오소재의 제조방법:
(a) 세포외기질 단백질과 골미네랄 입자를 함유하는 하부구조 혼합체를 성형하는 단계;
(b) 세포외기질 단백질과 골미네랄 입자를 함유하는 하부구조 혼합체의 구조를 정렬하는 단계;
(c) 세포외기질 단백질을 함유하는 상부층을 적층하는 단계;
(d) 적층된 상부층과 하부구조를 결합시키는 단계;
(e) 동결건조하는 단계; 및
(f) 상부층의 세포외기질 단백질을 열가교하는 단계.
제8항에 있어서, 상기 세포외기질 단백질은 단백질은 콜라겐, 히알루론산, 엘라스틴, 황산콘드로이틴 및 피브로인으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제8항에 있어서, 상기 골미네랄 성분은 동종골 또는 이종골에서 기인한 생물유래 골미네랄 분말, 합성 수산화아파타이트 및 트리칼슘인산 마이크로분말로 구성된 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제8항에 있어서, 상기 골미네랄 성분의 함량이 전체 중량의 80 내지 95 중량%인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제8항에 있어서, 상기 하부구조와 상부층의 세포외기질 단백질 함량은 전체 중량의 5 내지 20 중량%인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제8항에 있어서, 상부층의 세포외기질 단백질 : 하부구조의 세포외기질 단백질의 함량비(중량비)는 0.13 ~ 1.3 : 1 인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제8항에 있어서, (d) 단계의 적층된 상부층과 하부구조는 강염기를 이용한 젤화 과정을 통해 결합되는 것을 특징으로 하는 방법.
제8항에 있어서, (e) 단계는 140 내지 160℃에서 48 내지 168 시간 동안 열가교 시키는 것을 특징으로 하는 방법.
제8항에 있어서, 상기 (e) 단계 이후, 다음 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
(g) 항균 또는 항염증 기능성 물질을 첨가하는 단계; 및
(h) 동결건조하는 단계.
제16항에 있어서, 상기 항균 또는 항염증 기능성 물질은 항균제, 항생제, 항염증 기능을 가진 펩타이드 또는 단백질로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
제17항에 있어서, 상기 항균제는 클로로헥시딘인 것을 특징으로 하는 방법.