KR20180135928A - 간 질환을 치료하거나 예방하는 방법 - Google Patents

간 질환을 치료하거나 예방하는 방법

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KR20180135928A
KR20180135928A KR1020187032889A KR20187032889A KR20180135928A KR 20180135928 A KR20180135928 A KR 20180135928A KR 1020187032889 A KR1020187032889 A KR 1020187032889A KR 20187032889 A KR20187032889 A KR 20187032889A KR 20180135928 A KR20180135928 A KR 20180135928A
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Abstract

본 기재내용은 대상체에게 VEGF-B 신호전달을 억제하는 화합물을 투여함을 포함하여, 대상체에서 비알콜성 지방간 질환을 치료하는 방법을 제공한다.

Description

간 질환을 치료하거나 예방하는 방법
관련 출원 데이터
본 출원은 "간 질환을 치료하거나 예방하는 방법"이라는 제목으로 2016년 4월 21일자로 출원된 오스트레일리아 특허 출원 제2016901494호 및 "간 질환을 치료하거나 예방하는 방법"이라는 제목으로 2016년 4월 21일자로 출원된 오스트레일리아 특허 출원 제2016901483호로부터 우선권을 청구한다. 이들의 전체 내용은 본원에 참고로 포함된다.
서열 목록
본 출원은 전자 양식으로 서열 목록과 함께 제출된다. 서열 목록의 전체 내용은 본원에 참고로 포함된다.
분야
본 출원은 간 질환을 치료하거나 예방하는 방법에 관한 것이다.
간에의 지방 축적을 특징으로 하는 질환이, 대부분, 건강하지 못한 식습관 및 비만으로 인해, 산업화된 국가의 성인 및 아동에서 점점 만연해지고 있다. 만성적인 과잉 알콜 섭취로부터 야기되는 알콜성 지방간 질환(AFLD)은 본질적으로 지방증, 지방간염(ASH), 염증, 간경변, 및, 몇몇 경우에, 간세포 암종을 포함한 병리 과정에 뒤따른다. 가장 흔한 간질환으로 간주되는 비-알콜성 지방간 질환(NAFLD)은 중증도에 있어서 간 지방증(간에 지방 축적), 비-알콜성 지방간염(NASH), 간경변에서 간세포 암종에 이르는 AFLD와 유사한 일련의 간 병리학을 포함하는 용어이다.
U.S. 인구의 30%가 NAFLD에 걸린 것으로 추정된다. 이러한 유병률은 비만 대상체에서 및 2형 당뇨병을 앓고 있는 대상체에서 60% 이상으로 증가한다. NAFLD는 간 지방증에서 NASH로 점진적으로 악화될 수 있으며, 이것은 간세포 손상, 염증 세포의 침윤 및/또는 섬유증에 의해 입증되는 바와 같이 간 손상의 발병을 특징으로 한다. 결국, NASH는 간경변으로 진행될 수 있으며, 이것은 반흔 조직으로의 간세포의 대체, 및 보다 진행된 단계에서, 간세포 암종과 관련된다. NAFLD는 간경변 및 간부전의 중요하면서도 일반적인 원인으로 인식된다. NAFLD는 또한 심혈관 질환의 증가된 위험과 관련된다. NAFLD는 대사 증후군의 일부로 간주된다. 대사 증후군을 가진 개체와 유사하게, NAFLD를 가진 개체의 >80%은 과체중이고, 대략 30%는 비만이다. 게다가, NAFLD를 가진 개체는 또한 종종 동시에 고지혈증, 2형 진성 당뇨병(T2DM)을 갖고, 고혈압이다.
현재 NAFLD에 대한 효과적인 치료법은 없으며, 대부분의 치료들은 비만, 진성 당뇨병, 및 고지혈증과 같은 관련 병태를 관리하는데 달려 있다. NAFLD를 위한 다른 치료법들은 주로 운동 및 식이와 같은 생활 습관을 목표로 한다. 체중 감량 및 인슐린 내성을 표적화함을 목표로 하는 약리학적 개입은 제한된 효능을 갖는다. 예를 들면, 메트포르민 및 스타틴의 연구는 NAFLD 또는 NASH를 갖는 환자에서 간 조직학을 개선시키는데 있어서의 효과 부족을 나타내었다.
본 발명을 만들어 내는데 있어서, 본 발명자들은 NAFLD 및 NASH의 승인된 모델에서 VEGF-B를 억제하는 효과를 연구하였다. 본 발명자들은 고지방식을 공급받거나 콜린-결핍 고지방식을 공급받은 녹아웃 마우스에서 VEGF-B의 발현을 억제시키는 효과를 연구하여, 이러한 단백질을 억제하는 예방 효과를 입증하였다. 본 발명자들은 또한 고지방식 또는 콜린-결핍 고지방식을 공급받은 마우스에게 길항작용 항체를 투여하여 이러한 단백질을 억제하는 치료 효과를 연구하였다. 모든 경우에서, VEGF-B 억제는 간에서의 지질 축적을 감소시키거나 방지하며, 모든 접근법은 지질을 대조군 동물과 유사한 수준으로 감소 또는 유지시킨다. 따라서, VEGF-B의 억제는 지질 축적을 잠재적으로 해로울 수 있는 낮은 수준이라는 보다는 정상적인 또는 건강한 수준으로 감소시킨다. VEGF-B의 억제는 또한 간 염증, 및 NASH의 주요 병리학 중의 하나인 간세포 풍선화(hepatocellular ballooning), 멜러리-덴크체(MDB: Mallory-Denk body) 형성, 염증 병소 및 위성증을 포함한 NASH의 몇 가지 특징을 감소시키거나 예방하였다. 따라서, 본 발명자들은 이들이 NAFLD를 예방 또는 치료할 수 있고 NASH의 발병을 막거나 치료할 수 있음을 보여주었다. 분명히, 이러한 방법은 간경변, 간 섬유증 및/또는 간세포 암종을 예방하는데 있어서 추가의 이득을 갖는다.
본 발명자들에 의한 조사결과들은 VEGF-B 신호전달을 억제함으로써 대상체에서 NAFLD 또는 이의 합병증을 치료하거나 예방하는 방법에 대한 근거를 제공한다. 예를 들면, 본 기재내용은 대상체에게 VEGF-B 신호전달을 억제하는 화합물을 투여함을 포함하여, 대상체에서 NAFLD 또는 이의 합병증을 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다.
하나의 예에서, NAFLD는 간 지방증, 예를 들면, 분리된 간 지방증이다.
하나의 예에서, NAFLD는 NASH이다.
하나의 예에서, NAFLD는 간경변이다.
하나의 예에서, NAFLD는 NASH-유래 간경변이다.
또 다른 예에서, NAFLD는 NASH-관련 간경변이다.
또 다른 예에서, NAFLD는 NASH-관련 간 섬유증이다.
하나의 예에서, 본 기재내용은 대상체에게 VEGF-B 신호전달을 억제하는 화합물을 투여함을 포함하여, NAFLD를 앓고 있는 대상체에서 간경변의 개시를 예방 또는 지연시키는 방법을 제공한다.
예를 들면, 대상체는 NASH를 앓고 있으며 방법은 간경변의 개시를 예방하거나 지연시킨다.
하나의 예에서, 본 기재내용은 대상체에게 VEGF-B 신호전달을 억제하는 화합물을 투여함을 포함하여, NAFLD를 앓고 있는 대상체에서 간경변의 진행을 지연시키는 방법을 제공한다.
하나의 예에서, 본 기재내용은 대상체에게 VEGF-B 신호전달을 억제하는 화합물을 투여함을 포함하여, NAFLD를 앓고 있는 대상체에서 NAFLD에서 간경변으로의 진행을 지연시키는 방법을 제공한다.
하나의 예에서, NAFLD의 합병증은 간세포 암종이다.
하나의 예에서, 간세포 암종은 NASH-유래 간세포 암종이다.
또 다른 예에서, 간세포 암종은 NASH-관련 간세포 암종이다.
하나의 예에서, 본 기재내용은 대상체에게 VEGF-B 신호전달을 억제하는 화합물을 투여함을 포함하여, NAFLD를 앓고 있는 대상체에서 간세포 암종의 개시를 예방 또는 지연시키는 방법을 제공한다.
예를 들면, 대상체는 NASH를 앓고 있고 방법은 간세포 암종의 개시를 예방하거나 지연시킨다.
하나의 예에서, 본 기재내용은 대상체에게 VEGF-B 신호전달을 억제하는 화합물을 투여함을 포함하여, NAFLD를 앓고 있는 대상체에서 간세포 암종의 진행을 지연시키는 방법을 제공한다.
하나의 예에서, 본 기재내용은 대상체에게 VEGF-B 신호전달을 억제하는 화합물을 투여함을 포함하여, NAFLD를 앓고 있는 대상체에서 NAFLD에서 간세포 암종으로의 진행을 지연시키는 방법을 제공한다.
하나의 예에서, 대상체는 NAFLD를 앓고 있고 방법은 상기 질환을 치료한다. 예를 들면, 대상체는 간 지방증을 앓고 있다. 예를 들면, 대상체는 NASH를 앓고 있다.
하나의 예에서, NAFLD를 앓고 있는 대상체는 또한 과체중이거나 비만이고/이거나 당뇨병, 예를 들어 2형 당뇨병을 앓고/앓거나 대사 증후군을 앓는다.
하나의 예에서, 본 기재내용은 대상체에게 VEGF-B 신호전달을 억제하는 화합물을 투여함을 포함하여, 과체중 또는 비만인 대상체에서 NAFLD 또는 이의 합병증을 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다.
하나의 예에서, 화합물을 투여하는 것은 투여 전 대상체의 체중에 비해 대상체의 체중을 실질적으로 또는 상당히 감소시키지 않는다.
하나의 예에서, 대상체는 NAFLD(e.g., 상기한 바와 같음)를 앓고 있으며 방법은 질환의 진행을 예방하거나 늦춘다. 예를 들면, 대상체는 지방증을 앓고 있고 방법은 NASH로의 진행을 늦추거나 예방한다. 또 다른 예에서, 대상체는 NASH를 앓고 있고 방법은 간경변으로의 진행을 늦추거나 예방한다.
하나의 예에서, 대상체는 NAFLD(e.g., 상기한 바와 같음)를 앓고 있고 방법은 NAFLD의 합병증 발병 위험을 예방하거나 감소시킨다. 예를 들면, 대상체는 NAFLD를 앓고 있고 방법은 간세포 암종의 발병을 예방하거나 위험을 감소시킨다.
하나의 예에서, NAFLD를 앓고 있는 대상체는 간 효소, 예를 들어, 알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALAT) 또는 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제(ASAT)의 증가된 혈청 수준, 간 초음파 또는 간 생검 중의 하나 이상에 기초하여 진단된다.
하나의 예에서, 대상체는 NAFLD를 발병할 위험에 있으며, 예를 들어, NAFLD의 동반이환을 앓는다. 예를 들면, 대상체는 비만이고/이거나 당뇨병, 예를 들어 2형 당뇨병을 앓고/앓거나 대사 증후군을 앓는다.
하나의 예에서, 화합물은 다음 효과들 중의 하나 이상을 갖기에 효과적인 양으로 투여된다:
· 예를 들어, 간 생검에서 평가되는 바와 같이, 대상체의 간에 축적된 지질, 예를 들어 중성 지질을 감소 또는 예방함;
· 예를 들어, 대상체의 간에서 면역 세포의 수를 감소시킴으로써 대상체의 간에서 염증을 감소 또는 예방함;
· 대상체의 간에서 멜러리-덴크체 또는 간세포 풍선화 또는 염증 병소 또는 위성증과 같은 NAFLD의 병리적인 변화의 발병을 감소 또는 예방함;
· 간 섬유증 및/또는 간경변의 발병을 감소 또는 예방함;
· 간세포 암종의 발병을 감소 또는 예방함.
하나의 예에서, 본 기재내용은 대상체에게 VEGF-B 신호전달을 억제하는 화합물을 투여함을 포함하여, NAFLD를 앓고 있는(예를 들어, NASH를 앓고 있는) 대상체의 간에서 지질, 예를 들어, 중성 지질의 수준을 감소시키는 방법을 제공한다. 하나의 예에서, 지질의 수준은 화합물 투여 전 대상체에서의 수준에 비해 또는 NAFLD를 앓고 있는 대상체 집단에서 관찰되는 수준에 비해 감소된다. 또 다른 예에서, 지질의 수준은 NAFLD를 앓지 않는 대상체 또는 NAFLD를 앓지 않는 대상체의 집단과 유사하거나(e.g., 이의 10%) 또는 동일한 수준으로 감소된다.
본 기재내용은 또한 대상체에게 VEGF-B 신호전달을 억제하는 화합물을 투여함을 포함하여, NAFLD를 앓고 있는 대상체의 수준에서 염증을 감소시키는 방법을 제공한다.
하나의 예에서, VEGF-B 신호전달을 억제하는 화합물은 VEGF-B 신호전달을 특이적으로 억제한다. 이것은 본 기재내용의 방법이 다중 VEGF 단백질의 신호전달을 억제함을 포함하지 않으며, 단지 VEGF-B 신호전달을 억제하는 화합물(또는 이의 일부)이 VEGF-B에 특이적이고, 예를 들어, VEGF 단백질의 일반적인 억제제가 아님을 의미한다. 이 용어는 또한, 예를 들어, 하나(또는 그 이상)의 결합 도메인으로 VEGF-B 신호전달을 특이적으로 억제할 수 있고 다른 결합 도메인으로 다른 단백질의 신호전달을 특이적으로 억제할 수 있는 이중특이 항체 또는 이의 결합 도메인을 포함하는 단백질을 배제하지 않는다.
하나의 예에서, VEGF-B 신호전달을 억제하는 화합물은 VEGF-B에 결합한다. 예를 들면, 화합물은 VEGF-B에 결합하거나 특이적으로 결합하여 VEGF-B 신호전달을 중화시키는 항체 가변 영역을 포함하는 단백질이다.
하나의 예에서, 화합물은 항체 모방체(antibody mimetic)이다. 예를 들면, 화합물은 면역글로불린의 항원 결합 도메인을 포함하는 단백질, 예를 들어, IgNAR, 낙타과 항체(camelid antibody) 또는 T 세포 수용체이다.
하나의 예에서, 화합물은 도메인 항체(e.g., VEGF-B에 결합하는 중쇄 가변 영역 만을 또는 경쇄 가변 영역 만을 포함함) 또는 중쇄 단독 항체(e.g., 낙타과 항체 또는 IgNAR) 또는 이의 가변 영역이다.
하나의 예에서, 화합물은 Fv를 포함하는 단백질이다. 예를 들면, 단백질은 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다:
(i) 단일 쇄 Fv 단편 (scFv);
(ii) 이량체성 scFv (di-scFv); 또는
(iv) 디아바디;
(v) 트리아바디;
(vi) 테트라바디;
(vii) Fab;
(viii) F(ab')2;
(ix) Fv; 또는
(x) 항체의 불변 영역, Fc 또는 중쇄 불변 도메인(CH) 2 및/또는 CH3에 결합된 (i) 내지 (ix) 중의 하나.
또 다른 예에서, 화합물은 항체이다. 예시적인 항체는 전장 및/또는 네이키드 항체이다.
하나의 예에서, 화합물은 재조합, 키메라, CDR 이식, 인간화, 합성인간화(synhumanized), 영장류화(primatized), 탈면역화(deimmunized) 또는 인간 단백질이다.
하나의 예에서, 화합물은 VEGF-B에 대한 항체 2H10의 결합을 경쟁적으로 억제하는 항체 가변 영역을 포함하는 단백질이다. 하나의 예에서, 단백질은 서열 번호 3에 제시된 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) 및 서열 번호 4에 제시된 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함한다.
하나의 예에서, 화합물은 항체 2H10의 인간화 가변 영역을 포함하는 단백질이다. 예를 들면, 단백질은 항체 2H10의 VH 및/또는 VL의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 가변 영역을 포함한다. 예를 들면, 단백질은 다음을 포함한다:
(i) 다음을 포함하는 VH:
(a) 서열 번호 3의 아미노산 25-34에 제시된 서열을 포함하는 CDR1;
(b) 서열 번호 3의 아미노산 49-65에 제시된 서열을 포함하는 CDR2; 및
(c) 서열 번호 3의 아미노산 98-108에 제시된 서열을 포함하는 CDR3; 및/또는
(ii) 다음을 포함하는 VL:
(a) 서열 번호 4의 아미노산 23-33에 제시된 서열을 포함하는 CDR1;
(b) 서열 번호 4의 아미노산 49-55에 제시된 서열을 포함하는 CDR2; 및
(c) 서열 번호 4의 아미노산 88-96에 제시된 서열을 포함하는 CDR3.
하나의 예에서, 화합물은 VH 및 VL을 포함하는 단백질이며, VH 및 VL은 항체 2H10의 인간화 가변 영역이다. 예를 들면, 단백질은 다음을 포함한다:
(i) 다음을 포함하는 VH:
(a) 서열 번호 3의 아미노산 25-34에 제시된 서열을 포함하는 CDR1;
(b) 서열 번호 3의 아미노산 49-65에 제시된 서열을 포함하는 CDR2; 및
(c) 서열 번호 3의 아미노산 98-108에 제시된 서열을 포함하는 CDR3; 및
(ii) 다음을 포함하는 VL:
(a) 서열 번호 4의 아미노산 23-33에 제시된 서열을 포함하는 CDR1;
(b) 서열 번호 4의 아미노산 49-55에 제시된 서열을 포함하는 CDR2; 및
(c) 서열 번호 4의 아미노산 88-96에 제시된 서열을 포함하는 CDR3.
하나의 예에서, 상기한 단락들 중 어느 것에서 가변 영역 또는 VH는 서열 번호 5에 제시된 서열을 포함한다.
하나의 예에서, 상기한 단락들 중 어느 것에서 가변 영역 또는 VL은 서열 번호 6에 제시된 서열을 포함한다.
하나의 예에서, 화합물은 항체이다.
하나의 예에서, 화합물은 서열 번호 5에 제시된 서열을 포함하는 VH 및 서열 번호 6에 제시된 서열을 포함하는 VL을 포함하는 항체이다.
하나의 예에서, 단백질 또는 항체는 상기한 단백질 또는 항체 중 어느 것을 암호화하는 핵산에 의해 암호화되는 단백질 또는 항체의 임의의 형태이다.
하나의 예에서, 단백질 또는 항체는 다음을 포함한다:
(i) 다음을 포함하는 VH:
(a) 서열 번호 11을 포함하는 핵산에 의해 암호화된 서열을 포함하거나 서열 번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1;
(b) 서열 번호 12를 포함하는 핵산에 의해 암호화된 서열을 포함하거나 서열 번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및
(c) 서열 번호 13을 포함하는 핵산에 의해 암호화된 서열을 포함하거나 서열 번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 및/또는
(ii) 다음을 포함하는 VL:
(a) 서열 번호 14를 포함하는 핵산에 의해 암호화된 서열을 포함하거나 서열 번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1;
(b) 서열 번호 15를 포함하는 핵산에 의해 암호화된 서열을 포함하거나 서열 번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및
(c) 서열 번호 16을 포함하는 핵산에 의해 암호화된 서열을 포함하거나 서열 번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3.
하나의 예에서, 단백질 또는 항체는 다음을 포함한다:
(i) 다음을 포함하는 VH:
(a) 서열 번호 23을 포함하는 핵산에 의해 암호화된 서열을 포함하거나 서열 번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1;
(b) 서열 번호 24를 포함하는 핵산에 의해 암호화된 서열을 포함하거나 서열 번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및
(c) 서열 번호 25를 포함하는 핵산에 의해 암호화된 서열을 포함하거나 서열 번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 및/또는
(ii) 다음을 포함하는 VL:
(a) 서열 번호 26을 포함하는 핵산에 의해 암호화된 서열을 포함하거나 서열 번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1;
(b) 서열 번호 27을 포함하는 핵산에 의해 암호화된 서열을 포함하거나 서열 번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및
(c) 서열 번호 28을 포함하는 핵산에 의해 암호화된 서열을 포함하거나 서열 번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3.
하나의 예에서, 단백질 또는 항체는 다음을 포함한다:
(i) 다음을 포함하는 VH:
(a) 서열 번호 35를 포함하는 핵산에 의해 암호화된 서열을 포함하거나 서열 번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1;
(b) 서열 번호 36을 포함하는 핵산에 의해 암호화된 서열을 포함하거나 서열 번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및
(c) 서열 번호 37을 포함하는 핵산에 의해 암호화된 서열을 포함하거나 서열 번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 및/또는
(ii) 다음을 포함하는 VL:
(a) 서열 번호 38을 포함하는 핵산에 의해 암호화된 서열을 포함하거나 서열 번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1;
(b) 서열 번호 39를 포함하는 핵산에 의해 암호화된 서열을 포함하거나 서열 번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및
(c) 서열 번호 40을 포함하는 핵산에 의해 암호화된 서열을 포함하거나 서열 번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3.
하나의 예에서, 화합물은 조성물 내에 있다. 예를 들면, 조성물은 항체 가변 영역 또는 VH 또는 VL 또는 본원에 기술된 바와 같은 항체를 포함하는 단백질을 포함한다. 하나의 예에서, 조성물은 단백질 또는 항체의 하나 이상의 변이체를 추가로 포함한다. 예를 들면, 이것은 암호화된 C-말단 라이신 잔기가 결실된 변이체, 단백질의 예를 들어 N-말단에서 탈아미드화된 변이체 및/또는 글리코실화된 변이체 및/또는 피로글루타메이트를 포함하는 변이체, 및/또는 항체 또는 V 영역의 N-말단 잔기, 예를 들어 N-말단 글루타민이 결실된 변이체, 및/또는 분비 신호의 전부 또는 일부를 포함하는 변이체를 포함한다. 암호화된 아스파라긴 잔기의 탈아미드화 변이체는 이소아스파르트산과 아스파르트산 이성체 또는 심지어 인접한 아미노산 잔기를 포함하는 숙신아미드를 생성할 수 있다. 암호화된 글루타민 잔기의 탈아미드화 변이체는 글루탐산을 초래할 수 있다. 이러한 서열 및 변이체의 이종 혼합물을 포함하는 조성물은 특정 아미노산 서열에 대해 언급될 때 포함되는 것으로 의도된다.
하나의 예에서, VEGF-B 신호전달을 억제하는 화합물은 VEGF-B의 발현을 억제 또는 예방한다. 예를 들면, 화합물은 안티센스, siRNA, RNAi, 리보자임 및 DNAzyme 그룹으로부터 선택된다.
하나의 예에서, VEGF-B는 포유동물 VEGF-B, e.g., 인간 VEGF-B이다.
하나의 예에서, 대상체는 포유류, 예를 들면 영장류, 예를 들어 인간이다.
본원에 기술된 치료방법은 NAFLD를 치료하거나 예방하는 추가의 화합물을 투여함을 추가로 포함할 수 있다.
본원에 기술된 NAFLD의 치료방법은 비만을 치료하거나 예방(또는 이의 진행을 지연)하는 추가의 화합물을 투여함을 추가로 포함할 수 있다. 예시적인 화합물은 본원에 기술되어 있다.
본 기재내용은 또한 NAFLD 또는 이의 합병증의 치료 또는 예방에서 사용하기 위한 VEGF-B 신호전달을 억제하는 화합물을 제공한다.
본 기재내용은 또한 NAFLD 또는 이의 합병증을 치료하거나 예방하기 위한 약제의 제조에 있어서의 VEGF-B 신호전달을 억제하는 화합물의 용도를 제공한다.
본 기재내용은 또한 NAFLD 또는 이의 합병증의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 지침서가 패키징된 VEGF-B 신호전달을 억제하는 화합물을 포함하는 키트를 제공한다.
예시적인 NAFLD 및 이의 합병증 및 화합물은 본원에 기술되어 있으며 상기 세 개 단락에 제시된 기재내용의 예에 필요한 부분만 약간 수정하여 적용되어야 한다.
도 1은 음식-공급 WT, HFD-공급 WT 및 HFD-공급 Vegfb -/- 마우스에서 A. 혈당 수준, B. 체중 및 C. 혈청 알라닌 아미노트랜스퍼라제 수준을 보여주는 그래프이다. 값은 평균 ± s.e.m.이다. #### 음식-공급 WT와 비교하여 P<0.0001. * HFD-공급 WT 마우스와 비교하여 P<0.05. n=3-8/그룹 (A), n=3-8/그룹 (B), n=6-10/그룹 (C).
도 2는 음식-공급 WT, HFD-공급 WT 및 HFD-공급 Vegfb -/- 마우스에서 A. 간 절편의 오일 레드(Oil red) O 염색 및 B. 지방산 합성효소(fasn)의 상대적 간 mRNA 발현의 정량을 보여주는 그래프이다. 값은 평균 ± s.e.m.이다. ### 음식-공급 WT와 비교하여 P<0.001. * HFD-공급 WT 마우스와 비교하여 P<0.05. n=6-11/그룹 (A), n=3-6/그룹 (B).
도 3은 음식-공급 WT, HFD-공급 WT 및 HFD-공급 Vegfb -/- 마우스에서 간 절편에서의 A. 아디포필린, B. 만노스-6-포스페이트 수용체 결합 단백질 1(tip47) 및 C. 아디포필린(plin2a)의 상대적 간 mRNA 발현의 정량을 보여주는 그래프이다. 값은 평균 ± s.e.m.이다. #### 음식-공급 WT와 비교하여 P<0.0001. **** HFD-공급 WT 마우스와 비교하여 P<0.0001. n=4-11/그룹 (A), n=5-8/그룹 (B), n=3-6/그룹 (C).
도 4는 음식-공급 WT, HFD-공급 WT 및 HFD-공급 Vegfb -/- 마우스에서 간 절편에서의 A. 단백질 티로신 포스파타제, 수용체 타입, C (CD45), B. EGF-유사 모듈-함유 뮤신-유사 호르몬 수용체-유사 1(F4/80) 및 C. 단핵구 화학주성인자 단백질-1(mcp1)의 상대적 간 mRNA 발현의 정량을 보여주는 그래프이다. 값은 평균 ± s.e.m.이다. ## 음식-공급 WT와 비교하여 P<0.01, ### P<0.001. * HFD-공급 WT 마우스와 비교하여 P<0.05, ** P<0.01, **** P<0.0001. n=4-6/그룹 (A), n=4-8/그룹 (B), n=4-5/그룹 (C).
도 5는 음식-공급 WT, HFD-공급 WT 및 HFD-공급 Vegfb -/- 마우스에서 간 절편에서의 모든 확인된 풍선화 간세포, 멜러리-덴크체, 염증 병소 및 위성증의 총 수의 정량을 보여주는 그래프이다. 값은 평균 ± s.e.m.이다. #### 음식-공급 WT와 비교하여 P<0.0001 및 **** HFD-공급 WT 마우스와 비교하여 P<0.0001. n=5-9/그룹.
도 6은 음식-공급 WT 및 항-VEGF 항체 (2H10) 또는 대조 항체로 처리한 HFD-공급 마우스에서 A. 혈당 수준, B. 체중, C. 간 중량, D. 간 중량과 체중의 비 및 E. 혈청 알라닌 아미노트랜스퍼라제 수준을 보여주는 그래프이다. 값은 평균 ± s.e.m.이다. #### 음식-공급 WT와 비교하여 P<0.0001. n=6-10/그룹.
도 7은 음식-공급 WT 및 항-VEGF 항체 (2H10) 또는 대조 항체로 처리한 HFD-공급 마우스에서 A. 간 절편의 오일 레드 O 염색 및 B. 지방산 합성효소(fasn)의 상대적 간 mRNA 발현의 정량을 보여주는 그래프이다. 값은 평균 ± s.e.m.이다. #### 음식-공급 WT와 비교하여 P<0.001. * 대조 처리된 HFD-공급 마우스와 비교하여 P<0.01. n=6-11 (A), n=3-6 (B).
도 8은 음식-공급 WT 및 항-VEGF 항체 (2H10) 또는 대조 항체로 처리한 HFD-공급 마우스에서 간 절편에서의 A. 아디포필린, B. 만노스-6-포스페이트 수용체 결합 단백질 1(tip47) 및 C. 아디포필린 (plin2a)의 상대적 간 mRNA 발현의 정량을 보여주는 그래프이다. 값은 평균 ± s.e.m.이다. #### 음식-공급 WT와 비교하여 P<0.0001. ** 대조 처리된 HFD-공급 마우스와 비교하여 P<0.01, ****P<0.0001. n=5-11/그룹 (A), n=6-8/그룹 (B), n=3-5/그룹 (C).
도 9는 음식-공급 WT 및 항-VEGF 항체 (2H10) 또는 대조 항체로 처리된 HFD-공급 마우스에서 간 절편에서의 A. 단백질 티로신 포스파타제, 수용체 타입, C (CD45), B. EGF-유사 모듈-함유 뮤신-유사 호르몬 수용체-유사 1(F4/80) 및 C. 단핵구 화학주성인자 단백질-1 (mcp1)의 상대적 간 mRNA 발현의 정량을 보여주는 그래프이다. 값은 평균 ± s.e.m.이다. ## 음식-공급 WT와 비교하여 P<0.01, ###P<0.001. ** 대조 처리된 HFD-공급 마우스와 비교하여 P<0.01, ****P<0.0001. n=4-7/그룹 (A), n=4-8/그룹 (B), n=4-7/그룹 (C).
도 10은 음식-공급 WT 및 항-VEGF 항체 (2H10) 또는 대조 항체로 처리된 HFD-공급 마우스의 간 절편에서 모든 확인된 풍선화 간세포, 멜러리-덴크체, 염증 병소 및 위성증의 총 수의 정량을 보여주는 그래프이다. 값은 평균 ± s.e.m.이다. #### 음식-공급 WT와 비교하여 P<0.0001 및 **** 대조 처리된 HFD-공급 마우스와 비교하여 P<0.0001. n=5-9/그룹.
도 11은 단기 CD 식이(5개월간 CD 식이; CD5) 중인 WT, Vegfb +/- 및 Vegfb -/- 마우스에서 A. 체중 및 혈당 수준, B. 복강내 포도당 및 C. 복강내 인슐린 내성 시험 (IPGTT 및 IPITT)과 AUC 분석으로서 나타낸 정량을 보여주는 그래프이다. 값은 평균 ± s.e.m.이다. * CD 식이 중인 WT와 비교하여 P<0.05. n=4-13/그룹.
도 12는 CD5 식이 중인 WT, Vegfb +/- 및 Vegfb -/- 마우스에서 A. 간 중량 및 간 중량 대 체중의 비, 및 B. 혈청 알라닌 아미노트랜스퍼라제 (ALAT) 수준의 정량을 보여주는 그래프이다. 값은 평균 ± s.e.m.이다. * CD 식이 중인 WT 마우스와 비교하여 P<0.05, *** P<0.001. n=4-13/그룹.
도 13은 CD5 식이 중인 WT, Vegfb +/- 및 Vegfb -/- 마우스에서 A. 간 절편의 오일 레드 O (ORO) 염색의 정량 및 B. 트리글리세라이드 (TGs), 케톤 (KBs) 및 비-에스테르화 지방산 (NEFAs)의 혈장 수준의 정량을 보여주는 그래프이다. 값은 평균 ± s.e.m.이다. * CD 식이 중인 WT 마우스와 비교하여 P<0.05, ** P<0.01, *** P<0.001. n=4-13/그룹.
도 14는 CD5 식이 중인 WT, Vegfb +/- 및 Vegfb -/- 마우스로부터의 간 절편에서 A. 단백질 티로신 포스파타제, 수용체 타입, C (CD45) 및 B. EGF-유사 모듈-함유 뮤신-유사 호르몬 수용체-유사 1 (F4/80)의 면역표지화의 정량을 보여주는 그래프이다. 값은 평균 ± s.e.m.이다. * CD 식이 중인 WT와 비교하여 P<0.05, ** P<0.01, *** P<0.001. n=4-13/그룹.
도 15는 음식-공급 WT 마우스 및 항-VEGF 항체 (2H10) 또는 대조 항체로 처리된 CD5 식이 중인 WT 마우스에서 A. 체중 및 혈당 수준, B. 복강내 포도당 (IPGTT) 및 C. 복강내 인슐린 내성 시험 (IPITT)과 곡선하면적 분석으로 나타낸 정량을 보여주는 그래프이다. 값은 평균 ± s.e.m.이다. # 음식-공급 WT와 비교하여 P<0.05. n=8-10/그룹.
도 16은 음식-공급 WT 마우스 및 항-VEGF 항체 (2H10) 또는 대조 항체로 처리된 CD5 식이 중인 WT 마우스에서 A. 간 중량 및 간 중량 대 체중의 비 및 B. 혈청 알라닌 아미노트랜스퍼라제 (ALAT) 수준의 정량을 보여주는 그래프이다. 값은 평균 ± s.e.m.이다. ## 음식-공급 WT 마우스와 비교하여 P<0.01, ### P<0.001. ** CD 식이 중인 대조 처리된 C57BL/6 마우스와 비교하여 P<0.01. n=8-10/그룹.
도 17은 음식-공급 WT 마우스 및 항-VEGF 항체 (2H10) 또는 대조 항체로 처리된 CD5 식이 중인 WT 마우스에서 A. ORO 염색의 정량 및 B. 트리글리세라이드 (TG), 케톤 (KB) 및 비-에스테르화 지방산 (NEFA)의 혈장 수준의 정량을 보여주는 그래프이다. 값은 평균 ± s.e.m.이다. # 음식-공급 WT 마우스와 비교하여 P<0.05, ##P<0.01, ###P<0.001. * CD 식이 중인 대조 처리된 마우스와 비교하여 P<0.05, ****P<0.0001. n=8-10/그룹.
도 18은 음식-공급 WT 마우스 및 항-VEGF 항체 (2H10) 또는 대조 항체로 처리된 CD5 식이 중인 WT 마우스의 간 절편에서의 A. 아디포필린 발현의 정량을 보여주는 그래프이다. 값은 평균 ± s.e.m.이다. #### 음식-공급 WT 동물과 비교하여 P<0.0001. **** CD 식이 중인 대조 처리된 마우스와 비교하여 P<0.0001. n=8-10/그룹.
도 19는 음식-공급 WT 마우스 및 항-VEGF 항체 (2H10) 또는 대조 항체로 처리된 CD5 식이 중인 WT 마우스의 간 절편에서의 A. 단백질 티로신 포스파타제, 수용체 타입, C (CD45) 및 B. EGF-유사 모듈-함유 뮤신-유사 호르몬 수용체-유사 1 (F4/80)의 면역표지화의 정량을 보여주는 그래프이다. 값은 평균 ± s.e.m.이다. ## 음식-공급 WT 마우스와 비교하여 P<0.01, ###P<0.001. ** CD 식이 중인 대조 처리된 마우스와 비교하여 P<0.01, ***P<0.001. n=8-10/그룹.
도 20은 음식-공급 WT 마우스 및 항-VEGF 항체 (2H10) 또는 대조 항체로 처리된 CD5 식이 중인 WT 마우스로부터의 간 절편의 Masson 삼색 염색을 사용한 간 섬유증의 정량을 보여주는 그래프이다. 값은 평균 ± s.e.m.이다. #### 음식-공급 WT 마우스와 비교하여 P<0.001. *** CD 식이 중인 대조 처리된 마우스와 비교하여 P<0.001. n=8-10/그룹.
도 21은 음식-공급 WT 마우스 및 항-VEGF 항체 (2H10) 또는 대조 항체로 처리된 CD5 식이 중인 WT 마우스의 H&E 염색된 간 절편에서의 NASH의 총 간 스코어링을 보여주는 그래프이다. 값은 평균 ± s.e.m.이다. #### 음식-공급 동물과 비교하여 P<0.0001 및 *** CD 식이 중인 C57BL/6 마우스 대조 처리된 WT 마우스와 비교하여 P<0.001. n=5-10/그룹.
도 22는 음식-공급 WT 마우스 및 항-VEGF 항체 (2H10) 또는 대조 항체로 처리된 장기 CD 식이(12개월간 CD 식이; CD12) 중인 WT 마우스에서 A. 체중 및 혈당 수준, B. 복강내 포도당 및 C. 복강내 인슐린 내성 시험 (IPGTT 및 IPITT)과 AUC 분석으로 나타낸 정량을 보여주는 그래프이다. 값은 평균 ± s.e.m.이다. ## 음식-공급 WT 마우스와 비교하여 P<0.01, ###P<0.001. n=8/그룹.
도 23은 A. 간 중량 및 간 중량 대 체중의 비, B. 혈청 알라닌 아미노트랜스퍼라제 (ALAT) 수준의 정량, C. 가돌리늄-강화 MRI 스캔의 대표적인 이미지를 보여주는 WT 음식 공급 마우스 및 항-VEGF 항체 또는 대조 항체로 처리된 CD12 식이 중인 WT 마우스의 일련의 그래프이다. 종양 부담(tumor burden)은 화살표로 나타내어진다. D. 장기 CD 식이 중인 종양을 갖지 않는 및 종양을 갖는 2H10 또는 대조 항체로 처리된 마우스를 요약한 그래프. 기호는 개별 마우스를 묘사한다. E . 간의 육안검사의 대표적인 이미지, F. CD12 식이 중인 대조 항체로 처리된 마우스에서의 간 종양 부위. 값은 평균 ± s.e.m.이다. ## 음식-공급 WT 마우스와 비교하여 P<0.01, ###P<0.001. * CD 식이 중인 C57BL/6 마우스 대조 처리된 마우스와 비교하여 P<0.05, **P<0.01. n=8/그룹 (A-E); n=4 (F)
도 24는 음식-공급 WT 및 종양을 갖거나 종양을 갖지 않는 항-VEGF 항체 또는 대조 항체로 처리된 CD12 식이 중인 WT 마우스의 간에서 ORO 염색의 정량을 보여주는 그래프이다. 값은 평균 ± s.e.m.이다. # 음식-공급 WT 마우스와 비교하여 P<0.01, ##P<0.01, ###P<0.001. **** 종양 없는 CD 식이 중인 대조 처리된 마우스와 비교하여 P<0.0001. n=4-8/그룹.
도 25는 음식-공급 WT 마우스 및 종양을 갖거나 종양을 갖지 않는 항-VEGF (2H10) 항체 또는 대조 항체 처리된 CD12 식이 중인 WT 마우스의 간 절편에서의 A. 단백질 티로신 포스파타제, 수용체 타입, C (CD45) 및 B. EGF-유사 모듈-함유 뮤신-유사 호르몬 수용체-유사 1 (F4/80)의 면역표지화의 정량을 보여주는 그래프이다. 값은 평균 ± s.e.m.이다. # 음식-공급 WT 마우스와 비교하여 P<0.01, ###P<0.001. * 종양을 갖지 않는 CD 식이 중인 대조 처리 마우스와 비교하여 P<0.01. ^^^ 종양을 갖는 CD 식이 중인 대조 처리 마우스와 비교하여 P<0.001. n=4-8/그룹.
서열 목록에 대한 단서
서열 번호 1은 21개 아미노산 N-말단 신호 서열을 함유하는 인간 VEGF-B186 이소형의 아미노산 서열이다.
서열 번호 2는 21개 아미노산 N-말단 신호 서열을 함유하는 인간 VEGF-B167 이소형의 아미노산 서열이다.
서열 번호 3은 항체 2H10의 VH로부터의 아미노산 서열이다.
서열 번호 4는 항체 2H10의 VL로부터의 아미노산 서열이다.
서열 번호 5는 항체 2H10의 인간화 형태의 VH로부터의 아미노산 서열이다.
서열 번호 6은 항체 2H10의 인간화 형태의 VL의 아미노산 서열이다.
서열 번호 7은 항체 4E12의 VH로부터의 아미노산 서열이다.
서열 번호 8은 항체 4E12의 VL의 아미노산 서열이다.
서열 번호 9은 항체 2F5의 VH로부터의 아미노산 서열이다.
서열 번호 10은 항체 2F5의 VL의 아미노산 서열이다.
서열 번호 11은 항체 2H10의 VL CDR1로부터의 뉴클레오티드 서열이다.
서열 번호 12는 항체 2H10의 VL CDR2로부터의 뉴클레오티드 서열이다.
서열 번호 13은 항체 2H10의 VL CDR3으로부터의 뉴클레오티드 서열이다.
서열 번호 14는 항체 2H10의 VH CDR1로부터의 뉴클레오티드 서열이다.
서열 번호 15는 항체 2H10의 VH CDR2로부터의 뉴클레오티드 서열이다.
서열 번호 16은 항체 2H10의 VH CDR3으로부터의 뉴클레오티드 서열이다.
서열 번호 17은 항체 2H10의 VL CDR1로부터의 아미노산 서열이다.
서열 번호 18은 항체 2H10의 VL CDR2로부터의 아미노산 서열이다.
서열 번호 19는 항체 2H10의 VL CDR3으로부터의 아미노산 서열이다.
서열 번호 20은 항체 2H10의 VH CDR1로부터의 아미노산 서열이다.
서열 번호 21은 항체 2H10의 VH CDR2로부터의 아미노산 서열이다.
서열 번호 22는 항체 2H10의 VH CDR3으로부터의 아미노산 서열이다.
서열 번호 23은 항체 2F5의 VL CDR1로부터의 뉴클레오티드 서열이다.
서열 번호 24는 항체 2F5의 VL CDR2로부터의 뉴클레오티드 서열이다.
서열 번호 25는 항체 2F5의 VL CDR3으로부터의 뉴클레오티드 서열이다.
서열 번호 26은 항체 2F5의 VH CDR1로부터의 뉴클레오티드 서열이다.
서열 번호 27은 항체 2F5의 VH CDR2로부터의 뉴클레오티드 서열이다.
서열 번호 28은 항체 2F5의 VH CDR3으로부터의 뉴클레오티드 서열이다.
서열 번호 29는 항체 2F5의 VL CDR1로부터의 아미노산 서열이다.
서열 번호 30은 항체 2F5의 VL CDR2로부터의 아미노산 서열이다.
서열 번호 31은 항체 2F5의 VL CDR3으로부터의 아미노산 서열이다.
서열 번호 32는 항체 2F5의 VH CDR1로부터의 아미노산 서열이다.
서열 번호 33은 항체 2F5의 VH CDR2로부터의 아미노산 서열이다.
서열 번호 34는 항체 2F5의 VH CDR3으로부터의 아미노산 서열이다.
서열 번호 35는 항체 4E12의 VL CDR1로부터의 뉴클레오티드 서열이다.
서열 번호 36은 항체 4E12의 VL CDR2로부터의 뉴클레오티드 서열이다.
서열 번호 37은 항체 4E12의 VL CDR3으로부터의 뉴클레오티드 서열이다.
서열 번호 38은 항체 4E12의 VH CDR1로부터의 뉴클레오티드 서열이다.
서열 번호 39는 항체 4E12의 VH CDR2로부터의 뉴클레오티드 서열이다.
서열 번호 40은 항체 4E12의 VH CDR3으로부터의 뉴클레오티드 서열이다.
서열 번호 41은 항체 4E12의 VL CDR1로부터의 아미노산 서열이다.
서열 번호 42는 항체 4E12의 VL CDR2로부터의 아미노산 서열이다.
서열 번호 43은 항체 4E12의 VL CDR3으로부터의 아미노산 서열이다.
서열 번호 44는 항체 4E12의 VH CDR1로부터의 아미노산 서열이다.
서열 번호 45는 항체 4E12의 VH CDR2로부터의 아미노산 서열이다.
서열 번호 46은 항체 4E12의 VH CDR3으로부터의 아미노산 서열이다.
상세한 설명
일반
본 명세서 전반에 걸쳐, 특별히 달리 명시되거나 문맥상 달리 필요로 하지 않는 한, 단일 단계, 물질의 조성물, 단계들의 그룹 또는 물질의 조성물들의 그룹에 대한 언급은 이러한 단계들, 물질의 조성물들, 단계들의 그룹 또는 물질의 조성물들의 그룹 중의 하나 및 다수(즉, 하나 이상)를 포함하는 것으로 간주되어야 한다.
당업계의 숙련가들은 본 기재내용이 구체적으로 기술된 것들 이외의 변화 및 수정을 허용함을 인지할 것이다. 본 기재내용은 이러한 모든 변화 및 수정을 포함하는 것으로 이해해야 한다. 본 기재내용은 또한 본 명세서에 언급되거나 나타낸 단계, 특징, 조성물 및 화합물 모두를 개별적으로 또는 총괄적으로, 및 상기 단계 또는 특징들의 임의의 및 모든 조합 또는 임의의 둘 이상을 포함한다.
본 기재내용은 본원에 기술된 특정 예들에 의해 범위가 제한되는 것은 아니며, 상기 예들은 오직 예시의 목적을 위한 것이다. 기능적으로 등가인 생성물, 조성물 및 방법들은 명백하게 본 기재내용의 범위 내에 있다.
본 기재내용의 임의의 예는 본원에서 특별히 달리 언급되지 않는 한 개시내용의 임의의 다른 예에 필요한 부분만 약간 수정하여 적용되는 것으로 간주되어야 한다.
NAFLD의 치료 또는 예방과 관련하여 본 기재내용의 임의의 예는 NAFLD를 앓고 있는 대상체에서 선천적 면역 반응(e.g., 소화계에서의 선천적 면역 반응 및/또는 전신 선천적 면역 반응)을 억제 또는 예방하기 위해 필요한 부분만 약간 수정하여 적용되는 것으로 간주되어야 한다.
특별히 달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술 및 과학 용어들은 당업계(예를 들면, 세포 배양, 분자 유전학, 면역학, 면역조직화학, 단백질 화학 및 생화학)의 통상의 숙련가에 의해 일반적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는 것으로 간주되어야 한다.
달리 나타내지 않는 한, 본 기재내용에 사용된 재조합 단백질, 세포 배양 및 면역학적 기술들은 당업계의 숙련가들에게 널리 공지된 표준 절차들이다. 이러한 기술들은 문헌[참조; J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984), J. Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), T.A. Brown (editor), Essential Molecular Biology: A Practical Approach, Volumes 1 and 2, IRL Press (1991), D.M. Glover and B.D. Hames (editors), DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes 1-4, IRL Press (1995 and 1996), and F.M. Ausubel et al. (editors), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988, 현재까지 모든 업데이트 포함), Ed Harlow and David Lane (editors) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, (1988), and J.E. Coligan et al. (editors) Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons(현재까지 모든 업데이트 포함)]과 같은 출처들에 문헌 전반에 걸쳐 기술되고 설명되어 있다.
본원에서 가변 영역 및 이의 부분들, 면역글로불린, 항체 및 이의 단편들에 대한 설명 및 정의는 문헌[Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1987 and 1991, Bork et al., J Mol . Biol . 242, 309-320, 1994, Chothia and Lesk J. Mol Biol . 196:901 -917, 1987, Chothia et al. Nature 342, 877-883, 1989 and/or or Al-Lazikani et al., J Mol Biol 273, 927-948, 1997]에서의 논의에 의해 더 명확해질 수 있다.
본원에서 단백질 또는 항체에 대한 임의의 논의는 제조 및/또는 저장 동안에 생성된 단백질 또는 항체의 임의의 변이체를 포함하는 것으로 이해될 것이다. 예를 들면, 제조 또는 저장 동안 항체는 탈아미드화 (예를 들면, 아스파라긴 또는 글루타민 잔기에서)되고/되거나, 변이된 글리코실화를 갖고/갖거나, 피로글루타민으로 전환된 글루타민 잔기를 갖고/갖거나, 제거되거나 "고정된(clipped)" N-말단 또는 C-말단을 갖고/갖거나, 불완전하게 처리되어 그 결과 항체의 말단에 남아 있는 신호 서열의 일부 또는 전부를 가질 수 있다. 특정 아미노산 서열을 포함하는 조성물은 명시되거나 암호화된 서열 및/또는 상기 명시되거나 암호화된 서열의 변이체의 이종 혼합물일 수 있는 것으로 이해된다.
용어 "및/또는", 예를 들면, "X 및/또는 Y"는 "X 및 Y" 또는 "X 또는 Y"를 의미하는 것으로 이해해야 하며, 두 의미 모두에 대한 또는 어느 한 의미에 대한 명백한 뒷받침을 제공하는 것으로 간주되어야 한다.
본 명세서 전반에 걸쳐, 단어 "포함하다(comprise)", 또는 "포함하다(comprises)" 또는 "포함하는(comprising)"과 같은 변형은 명시된 요소, 정수 또는 단계, 또는 요소들, 정수들 또는 단계들의 그룹의 포함을 의미하지만, 임의의 다른 요소, 정수 또는 단계, 또는 요소들, 정수들 또는 단계들의 그룹의 배제를 의미하는 것은 아님을 이해할 것이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "로부터 유도된(derived from)"은 명시된 정수가 특정 공급원으로부터 꼭 직접적으로는 아닐지라도 상기 특정 공급원으로부터 수득될 수 있음을 나타내는 것으로 간주되어야 한다.
선택된 정의
VEGF-B는 VEGF-B186 및 VEGF-B167이라고 하는 두 가지 주요 이소형으로 존재하는 것으로 알려져 있다. 제한하는 것이 아니라 단지 명명의 목적으로 인간 VEGF-B186의 예시적인 서열이 NCBI 참조 서열: NP_003368.1, NCBI 단백질 수탁 번호 NP_003368, P49765 및 AAL79001로 및 서열 번호 1로 제시되어 있다. 본 기재내용의 맥락에서, VEGF-B186의 서열은 21개 아미노산 N-말단 신호 서열(예를 들어, 서열 번호 1의 아미노산 1 내지 21에 제시된 바와 같음)이 결여될 수 있다. 제한이 아니라 단지 명명을 위한 목적으로 인간 VEGF-B167의 예시적인 서열은 NCBI 참조 서열: NP_001230662.1, NCBI 단백질 수탁 번호 AAL79000 및 AAB06274 및 서열 번호 2로 제시되어 있다. 본 기재내용의 맥락에서, VEGF-B167의 서열은 21개 아미노산 N-말단 신호 서열(예를 들어, 서열 번호 2의 아미노산 1 내지 21에 제시된 바와 같음)이 결여될 수 있다. VEGF-B의 추가의 서열은 본원에 및/또는 공개적으로 이용 가능한 데이터베이스에 제공된 서열을 사용하여 결정될 수 있고/있거나 표준 기술(예를 들어, 문헌[Ausubel et al., (editors), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988, including all updates until present) or Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)]에 기술된 바와 같음)을 사용하여 결정될 수 있다. 인간 VEGF-B에 대한 언급은 hVEGF-B로 약칭될 수 있다. 하나의 예에서, 본원에서 VEGF-B에 대한 언급은 VEGF-B167 이소형에 대한 것이다.
본원에서 VEGF-B에 대한 언급은 또한 제WO2006/012688호에 기술된 바와 같은 VEGF-B10-108 펩티드를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "비알콜성 지방간 질환" 또는 "NAFLD"는 지나친 알콜 사용의 부재하에서 염증 및 섬유증(즉, 간 섬유증)을 갖거나 갖지 않으면서 지방이 간에 쌓여 있는 상태(간 지방증)를 가리킨다. 이 용어는 지방증, NASH 및 간경변을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "NAFLD를 갖는 대상체"는 NAFLD로 진단된 대상체를 가리킨다. 몇몇 예에서, NAFLD는 일상적인 검진, 대사 증후군 및 비만의 모니터링, 또는 약물(e.g., 콜레스테롤 강하제 또는 스테로이드)의 가능한 부작용에 대한 모니터링 동안 의심된다. 몇몇 예에서, ASAT 및 ALAT와 같은 간 효소가 높다. 몇몇 예에서, 대상체는 복부 또는 흉부 이미징, 간 초음파, 또는 자기 공명 이미징 후 진단된다. 몇몇 예에서, 지나친 알콜 소비, C형 간염, 및 윌슨병과 같은 다른 병태들은 NAFLD 진단 전에 제외되었다. 몇몇 예에서, 대상체는 간 생검 후 진단되었다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "지방증" 및 "비-알콜성 지방증"은 상호교환 가능하게 사용되며, 지나친 알콜 사용의 부재하에 염증 및 섬유증을 갖지 않는 경증, 중등도, 및 중증 지방증을 포함한다.
여기서 사용되는 바와 같이, 용어 "간의(hepatic)" 및 "간(liver)"은 상호교환 가능하게 사용된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "지방증을 갖는 대상체" 및 "비-알콜성 지방증을 갖는 대상체"는 상호교환 가능하게 사용되고, 지방증으로 진단된 대상체를 가리킨다. 몇몇 예에서, 지방증은 일반적으로 NAFLD에 대해 본원에 기술된 방법으로 진단된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "비알콜성 지방간염" 또는 "NASH"는 간에 염증 및/또는 섬유증(즉, 간 섬유증)이 있는 NAFLD를 가리킨다. NASH의 단계를 결정하는 예시적인 방법은, 예를 들면, 문헌[Kleiner et al, 2005, Hepatology, 41(6): 1313-1321, and Brunt et al, 2007, Modern Pathol, 20: S40-S48]에 기술되어 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "NASH를 갖는 대상체"는 NASH로 진단된 대상체를 가리킨다. 몇몇 예에서, NASH는 일반적으로 NAFLD에 대해 상기 기술된 방법에 의해 진단된다. 몇몇 예에서, 진행성 섬유증은, 예를 들면, 문헌[Gambino R, et.al. Annals of Medicine 2011 ;43(8):617-49]에 따르면 NAFLD를 갖는 환자에서 진단된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "NASH-유래 간경변" 또는 "NASH-유래 간경변을 갖는 대상체"는 NASH에 의해 유발되는 간경변을 갖는, 즉, NASH가 간경변으로 진행된 대상체를 가리킨다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "NASH-관련 간경변" 또는 "NASH-연관 간경변" 또는 "NASH-관련 간경변을 갖는 대상체"는 간경변 및 NASH로 진단되지만, 간경변이 반드시 NASH에 의해 유발되는 것은 아닌 대상체를 가리킨다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "NASH-관련 간 섬유증" 또는 "NASH-연관 간 섬유증" 또는 "NASH-관련 간 섬유증을 갖는 대상체"는 간 섬유증 및 NASH로 진단되지만, 간 섬유증이 반드시 NASH에 의해 유발되는 것은 아닌 대상체를 가리킨다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "NASH-유래 간세포 암종" 또는 "NASH-유래 간세포 암종을 갖는 대상체"는 NASH에 의해 유발되는 간세포 암종을 갖는, 즉, NASH가 간세포 암종으로 진행된 대상체를 가리킨다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "NASH-관련 간세포 암종" 또는 "NASH-연관 간세포 암종" 또는 "NASH-관련 간세포 암종을 갖는 대상체"는 간세포 암종 및 NASH로 진단되지만, 간세포 암종이 반드시 NASH에 의해 유발되는 것은 아닌 대상체를 가리킨다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 대상체와 관련하여 "과체중"은 25 내지 <30의 BMI를 갖는 대상체를 가리킨다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 대상체와 관련하여 "비만"은 30 이상의 BMI를 갖는 대상체를 가리킨다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "NAFLD 발병 위험이 있는 대상체"는 하나 이상의 NAFLD 동반이환, 예를 들면, 비만, 복부 비만, 대사 증후군, 심혈관 질환, 및 당뇨병을 갖는 대상체를 가리킨다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "지방증 발병 위험이 있는 대상체"는 지방증을 갖는 것으로 진단되지는 않았지만, 하나 이상의 NAFLD 동반이환, 예를 들면, 비만, 복부 비만, 대사 증후군, 심혈관 질환, 및 당뇨병을 갖는 대상체를 가리킨다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "NASH 발병 위험이 있는 대상체"는 하나 이상의 NAFLD 동반이환, 예를 들면, 비만, 복부 비만, 대사 증후군, 심혈관 질환, 및 당뇨병을 계속해서 갖는 지방증을 지닌 대상체를 가리킨다.
용어 "재조합"은 인공적인 유전자 재조합의 산물을 의미하는 것으로 이해해야 한다. 따라서, 항체 가변 영역을 포함하는 재조합 단백질의 맥락에서, 이 용어는 B 세포 성숙 동안 일어나는 자연적인 재조합의 산물인 대상체 신체내에서 자연적으로 발생하는 항체를 포함하지 않는다. 그러나, 이러한 항체가 단리된다면, 항체 가변 영역을 포함하는 단리된 단백질로 간주되어야 한다. 유사하게, 단백질을 암호화하는 핵산이 단리되고 재조합 수단을 사용하여 발현된다면, 생성되는 단백질은 항체 가변 영역을 포함하는 재조합 단백질이다. 재조합 단백질은 또한, 예를 들면, 그것이 발현되는 세포, 조직 또는 대상체 내에 있는 경우 인공적인 재조합 수단에 의해 발현된 단백질을 포함한다.
용어 "단백질"은 단일 폴리펩티드 쇄, 즉, 펩티드 결합에 의해 연결된 일련의 인접 아미노산 또는 서로에 공유적 또는 비-공유적으로 연결된 일련의 폴리펩티드 쇄(즉, 폴리펩티드 복합체)를 포함하는 것으로 간주되어야 한다. 예를 들면, 일련의 폴리펩티드 쇄들은 적당한 화학적 또는 디설파이드 결합을 이용하여 공유적으로 연결될 수 있다. 비-공유 결합의 예는 수소 결합, 이온 결합, 반데르발스(Van der Waals) 힘 및 소수성 상호작용을 포함한다.
용어 "폴리펩티드" 또는 "폴리펩티드 쇄"는 펩티드 결합에 의해 연결된 일련의 인접 아미노산을 의미하는 것으로 상기 단락으로부터 이해될 것이다.
숙련가는 "항체"가 일반적으로 다수의 폴리펩티드 쇄, 예를 들어, 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하는 폴리펩티드 및 중쇄 가변 영역 (VH)을 포함하는 폴리펩티드로 이루어진 가변 영역을 포함하는 단백질로 간주된다는 것을 인지할 것이다. 항체는 또한 일반적으로 불변 도메인을 포함하며, 이들 중 일부는 중쇄의 경우에 불변 단편 또는 결정가능 단편(Fc)을 포함하는 불변 영역으로 배열될 수 있다. VH 및 VL은 상호작용하여, 하나 또는 수 개의 밀접하게 관련된 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 영역을 포함하는 Fv를 형성한다. 일반적으로, 포유동물로부터의 경쇄는 κ 경쇄 또는 λ 경쇄이고 포유동물로부터의 중쇄는 α, δ, ε, γ, 또는 μ이다. 항체는 임의 유형(e.g., IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, 및 IgY), 클래스(e.g., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 서브클래스의 항체일 수 있다. 용어 "항체"는 또한 인간화 항체, 영장류화 항체, 인간 항체, 합성인간화 항체 및 키메라 항체를 포함한다.
용어 "전장 항체", "온전한 항체" 또는 "전 항체"는 항체의 항원 결합 단편과 대조적으로 실질적으로 온전한 형태의 항체를 가리키기 위해 상호교환 가능하게 사용된다. 구체적으로, 전 항체는 Fc 영역을 포함한 중쇄 및 경쇄를 갖는 것들을 포함한다. 불변 도메인은 야생형 서열 불변 도메인(e.g., 인간 야생형 서열 불변 도메인) 또는 이의 아미노산 서열 변이체일 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "가변 영역"은 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 본원에 정의된 바와 같은 항체의 경쇄 및/또는 중쇄의 부분을 가리키며, 상보성 결정 영역(CDR); 즉, CDRl, CDR2, 및 CDR3, 및 골격 영역(FR)의 아미노산 서열을 포함한다. 예시적인 가변 영역은 세 개의 CDR과 함께 세 개 또는 네 개의 FR(e.g., FR1, FR2, FR3 및 임의로 FR4)을 포함한다. IgNAR로부터 유도된 단백질의 경우에, 단백질은 CDR2가 결여될 수 있다. VH는 중쇄의 가변 영역을 가리킨다. VL은 경쇄의 가변 영역을 가리킨다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "상보성 결정 영역"(syn . CDR; 즉, CDRl, CDR2, 및 CDR3)은 그 존재가 항원 결합을 위해 필수적인 항체 가변 도메인의 아미노산 잔기를 가리킨다. 각 가변 도메인은 전형적으로 CDRl, CDR2 및 CDR3으로서 확인된 세 개의 CDR 영역을 갖는다. CDR 및 FR에 배정된 아미노산 위치는 문헌[Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1987 and 1991] 또는 본 기재내용의 실행에 있어서의 다른 넘버링 시스템, 예를 들어, 문헌[Chothia and Lesk J. Mol Biol . 196: 901-917, 1987; Chothia et al. Nature 342, 877-883, 1989; 및/또는 Al-Lazikani et al., J Mol Biol 273: 927-948, 1997]의 정규 넘버링 시스템; 문헌[Lefranc et al., Devel . And Compar . Immunol ., 27: 55-77, 2003]의 IMGT 넘버링 시스템; 또는 문헌[Honnegher and Pl
Figure pct00001
kthun J. Mol . Biol ., 309: 657-670, 2001]의 AHO 넘버링 시스템에 따라 정의될 수 있다.
"골격 영역"(FR)은 CDR 잔기 이외의 이러한 가변 도메인 잔기이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "Fv"는 다중 폴리펩티드로 이루어지든 또는 단일 폴리펩티드로 이루어지든간에, VL 및 VH가 결합하여 항원 결합 부위를 갖는, 즉, 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 복합체를 형성하는 임의의 단백질을 의미하는 것으로 간주되어야 한다. 항원 결합 부위를 형성하는 VH 및 VL은 단일 폴리펩티드 쇄이거나 상이한 폴리펩티드 쇄일 수 있다. 게다가, 본 기재내용의 Fv(뿐만 아니라 본 기재내용의 임의의 단백질)는 동일한 항원에 결합할 수 있거나 결합할 수 없는 다중 항원 결합 부위를 가질 수 있다. 이 용어는 항체로부터 직접적으로 유도된 단편 뿐만 아니라 재조합 수단을 사용하여 생산된 이러한 단편에 상응하는 단백질을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 몇몇 예에서, VH는 중쇄 불변 도메인 (CH) 1에 결합되지 않고/않거나 VL은 경쇄 불변 도메인(CL)에 결합되지 않는다. 예시적인 Fv 함유 폴리펩티드 또는 단백질은 Fab 단편, Fab' 단편, F(ab') 단편, scFv, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디 또는 보다 고차 복합체, 또는 불변 영역 또는 이의 도메인, e.g., CH2 또는 CH3 도메인에 결합된 상기 중의 어느 것, e.g., 미니바디를 포함한다. "Fab 단편"은 항체의 일가 항원-결합 단편으로 이루어지며, 전 항체를 효소 파파인으로 소화시켜 온전한 경쇄 및 중쇄의 일부로 이루어진 단편을 수득함으로써 생산할 수 있거나, 재조합 수단을 이용하여 생산할 수 있다. 항체의 "Fab' 단편"은 전 항체를 펩신으로 처리한 다음 환원시켜 온전한 경쇄, 및 VH 및 단일 불변 도메인을 포함하는 중쇄의 일부로 이루어진 분자를 생성함으로써 수득될 수 있다. 이러한 방식으로 처리된 항체당 두 개의 Fab' 단편이 수득된다. Fab' 단편은 또한 재조합 수단에 의해 생산될 수 있다. 항체의 "F(ab')2 단편"은 두 개의 디설파이드 결합에 의해 함께 유지된 두 개의 Fab' 단편의 이량체로 이루어지고, 후속적인 환원 없이 전 항체 분자를 효소 펩신으로 처리함으로써 수득된다. "Fab2" 단편은, 예를 들면 류신 지퍼 또는 CH3 도메인을 사용하여 연결된 두 개의 Fab 단편을 포함하는 재조합 단편이다. "단일 쇄 Fv" 또는 "scFv"는 경쇄의 가변 영역과 중쇄의 가변 영역이 적합한, 가요성 폴리펩티드 링커에 의해 공유적으로 연결된 항체의 가변 영역 단편 (Fv)을 함유하는 재조합 분자이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 단백질 또는 이의 항원 결합 부위와 항원과의 상호작용과 관련하여 용어 "결합한다"는 상기 상호작용이 항원 상의 특정 구조(예를 들면, 항원 결정기 또는 에피토프)의 존재에 의존함을 의미한다. 예를 들면, 항체는 일반적으로 단백질이 아니라 특정 단백질 구조를 인식하고 그에 결합한다. 항체가 에피토프 "A"에 결합한다면, 표지된 "A" 및 단백질을 함유하는 반응에서, 에피토프 "A"(또는 유리, 비표지된 "A")를 함유하는 분자의 존재는 항체에 결합된 표지된 "A"의 양을 감소시킬 것이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "특이적으로 결합한다(specifically binds)" 또는 "특이적으로 결합한다(binds specifically)"는 본 기재내용의 단백질이 대안적인 항원 또는 세포와 그러한 것보다 더 자주, 더 신속하게, 더 긴 지속시간으로 및/또는 더 큰 친화도로 특정 항원 또는 이를 발현하는 세포와 반응하거나 결합하는 것을 의미하는 것으로 간주되어야 한다. 예를 들면, 단백질은 다른 성장 인자(e.g., VEGF-A)에 대해서 또는 다반응성 천연 항체에 의해 (즉, 인간에서 자연적으로 발견되는 각종 항원과 결합하는 것으로 알려진 자연 발생적 항체에 의해) 통상적으로 인식되는 항원에 대해서 보다 실질적으로 더 큰 친화도(e.g., 20배 또는 40배 또는 60배 또는 80배 내지 100배 또는 150배 또는 200배)로 VEGF-B에 결합한다. 일반적으로, 그러나 반드시 그렇지는 않지만, 결합에 대한 언급은 특이 결합을 의미하며, 각각의 용어는 다른 용어에 대한 명백한 뒷받침을 제공하는 것으로 이해해야 한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "중화시킨다"는 단백질이 VEGF-R1을 통해 세포에서 VEGF-B-신호전달을 차단, 감소 또는 방지할 수 있음을 의미하는 것으로 간주되어야 한다. 중화를 결정하는 방법은 당업계에 공지되어 있고/있거나 본원에 기술되어 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "VEGF-B 신호전달을 특이적으로 억제시킨다"는 화합물이 VEGF-B 신호전달을 억제시키고 하나 이상의 다른 VEGF 단백질, e.g., VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D 및/또는 PIGF에 의한 신호전달은 상당히 또는 검출 가능하게 억제시키지 못하는 것을 의미하는 것으로 이해될 것이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "상당히 억제시키지 못한다"는 본원에 기술된 화합물의 존재하에서 VEGF-B 이외의 VEGF 단백질에 의한 신호전달(e.g., VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D 및/또는 PIGF에 의한 신호전달)의 억제 수준이 본원에 기술된 화합물의 부재하에서(e.g., 이소형 대조 항체의 존재하에서 수행될 수 있는 대조 검정에서)보다 통계적으로 유의적으로 더 낮지 않음을 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "검출 가능하게 억제시키지 못한다"는 본원에 기술된 바와 같은 화합물이 VEGF-B 이외의 VEGF 단백질의 신호전달(e.g., VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D 및/또는 PIGF에 의한 신호전달)을 본원에 기술된 화합물의 부재하에서(e.g., 이소형 대조 항체의 존재하에서 수행될 수 있는 대조 검정에서) 검출된 신호전달의 수준의 고작 10% 또는 8% 또는 6% 또는 5% 또는 4% 또는 3% 또는 2% 또는 1%까지 억제시킴을 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "예방하는", "예방하다" 또는 "예방"은 본 기재내용의 화합물을 투여함으로써 병태의 적어도 하나의 증상의 발병을 중단시키거나 방해하는 것을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "치료하는", "치료하다" 또는 "치료"는 본원에 기술된 단백질을 투여함으로써 명시된 질환 또는 병태의 적어도 하나의 증상을 경감 또는 제거하거나, 질환 또는 병태의 진행을 지연시키는 것을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "대상체"는 인간을 포함한 임의의 동물, 예를 들면, 포유동물을 의미하는 것으로 간주되어야 한다. 대표적인 대상체는 인간 및 비-인간 영장류를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 예를 들면, 대상체는 인간이다.
NAFLD의 치료
본 기재내용은 대상체에게 VEGF-B 신호전달의 억제제를 투여함을 포함하여, 대상체에서 NAFLD를 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다.
몇몇 예에서, 상기 방법은 대상체가 NAFLD를 갖는지를 결정하고, NAFLD를 갖는다면 대상체를 선택한 다음 본원에 기술된 바와 같은 VEGF-B를 억제하는 화합물을 투여함을 포함한다. 대상체가 NAFLD를 갖는지를 결정하는 단계는 이들의 병력을 검토함, 또는 진단을 내리는데 필요한 바와 같은 시험을 주문하거나 실행함을 포함할 수 있다. NAFLD를 갖는 대부분의 개체는 무증상이다; 병태는 통상적으로 비정상적인 간 기능 검사 또는 간비대, 예를 들어, 관련없는 의학 상태에서 주지되는 바의 결과로서 우연히 발견된다. 증가된 간 생화학이 단순 지방증을 가진 환자의 50%에서 발견된다(예를 들어, 문헌[Sleisenger, Sleisenger and Fordtran's Gastrointestinal and Liver Disease. Philadelphia: W.B. Saunders Company (2006)] 참조). 일반적으로, 진단은 알라닌 아미노트랜스퍼라제 (ALAT) 또는 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제 (ASAT)와 같은 일상적인 혈액 검사 패널에 포함된 간 검사에서의 증가의 존재로 시작한다. 간 지방 축적의 아무리 대단하지 않는 준임상적 증가라도 대사 증후군의 점진적인 발병에 있어서의 초기 성분인 것으로 나타났다(예를 들어, 문헌[Almeda-Valdes et al., Ann. Hepatol. 8 Suppl 1:518-24 (2009); Polyzos et al., Curr Mol Med. 9(3):299-314 (2009); Byrne et al., Clin. Sci. (Lond). 116(7):539-64 (2009)] 참조).
영상화 연구들이 평가 과정 동안 종종 입수된다. 초음파 검사에서는 증가된 에코발생을 갖는 "밝은" 간이 드러났다. 따라서, 의료 영상화는 NAFLD의 진단에 도움을 줄 수 있으며; 지방간은 컴퓨터 단층촬영(CT)에서 비장보다 더 낮은 밀도를 가지며 지방은 T1-강조 자기 공명 영상(MRI)에서 밝게 보인다.
단순 지방간과는 대조적으로 비알콜성 지방간염 (NASH)의 감별 진단은 간 생검을 사용하여 수행된다. 간 생검을 위해, 바늘을 피부를 통해 삽입하여 간의 작은 조각을 제거한다. NASH는 현미경으로 조직을 검사하여 간 세포에 염증 및 손상과 함께 지방이 보이는 경우에 진단된다. 조직이 염증 및 손상 없이 지방을 보인다면, 단순 NAFLD로 진단된다. 따라서, 간 생검에 의한 조직학적 진단은 중증도의 평가가 지시되는 경우에 추구된다.
하나의 예에서, 대상체는 지방증을 앓고 있다.
하나의 예에서, 대상체는 NASH를 앓고 있다.
하나의 예에서, 대상체는 간경변을 앓고 있다. 하나의 예에서, 간경변은 NASH-유래 간경변이다. 또 다른 예에서, 간경변은 NASH-관련 간경변이다.
하나의 예에서, 본 기재내용의 방법은 NAFLD의 진행, 예를 들어, 지방증에서 NASH로 또는 NASH에서 간경변으로의 진행을 예방하거나 지연시킨다.
하나의 예에서, 대상체는 비만이다. 예를 들면, 대상체은 30 이상의 BMI를 갖는다. 따라서, 본 기재내용은 대상체에게 VEGF-B를 억제하는 화합물을 투여함을 포함하여, 비만 대상체에서 NAFLD를 치료하는 방법을 제공한다.
하나의 예에서, 대상체는 대사 증후군을 앓고 있다. 예를 들면, 대상체는 진성 당뇨병, 내당능 장애, 공복 혈당 장애 또는 인슐린 내성, 및 다음 중의 두 가지를 갖는다:
· 혈압: ≥ 140/90mmHg;
· 이상지질혈증: 트리글리세라이드 (TG): ≥ 1.695mmol/L 및 고밀도 지단백 콜레스테롤 (HDL-C) ≤ 0.9mmol/L (남성), ≤ 1.0mmol/L (여성);
· 중심성 비만: 허리:엉덩이 비 > 0.90 (남성); > 0.85 (여성), 또는 체질량 지수 > 30kg/m2;
· 미세알부민뇨증: 뇨 알부민 배설 비 ≥ 20μg/min 또는 알부민:크레아티닌 비 ≥ 30mg/g.
하나의 예에서, 대상체는 당뇨병을 앓고 있다. 예를 들면, 당뇨병을 앓고 있는 대상체는 다음과 같은 당뇨병의 임상적으로 허용된 마커를 갖는다:
· 7mmol/L 또는 126mg/dl 이상의 공복 혈장 포도당;
· 당뇨병의 증상을 갖는 11.1mmol/L 또는 200mg/dl 이상의 (그 날의 임의의 시간에 채혈한) 평소 혈장 포도당.
· 2시간 간격으로 측정된 11.1mmol/L 또는 200mg/dl 이상의 경구 포도당 부하 시험(OGTT) 값. OGTT는 두 시간 또는 세 시간의 기간에 걸쳐 제공된다.
하나의 예에서, 대상체는 2형 당뇨병을 앓고 있다.
VEGF-B 신호전달 억제제
항체 가변 영역을 포함하는 단백질
예시적인 VEGF-B 신호전달 억제제는 항체 가변 영역을 포함하며, 예를 들어 VEGF-B에 결합하고 VEGF-B 신호전달을 중화시키는 항체 또는 항체 단편이다.
하나의 예에서, 항체 가변 영역은 VEGF-B에 특이적으로 결합한다.
적합한 항체 및 이의 가변 영역을 포함하는 단백질은 당업계에 공지되어 있다.
예를 들면, 항-VEGF-B 항체 및 이의 단편은 제WO2006/012688호에 기술되어 있다.
하나의 예에서, 항-VEGF-B 항체 또는 이의 단편은 VEGF-B에의 2H10의 결합을 경쟁적으로 억제하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 하나의 예에서, 항-VEGF-B 항체 또는 이의 단편은 항체 2H10 또는 이의 키메라, CDR 이식 또는 인간화 버전 또는 이의 항원 결합 단편이다. 이와 관련하여, 항체 2H10은 서열 번호 3에 제시된 서열을 포함하는 VH 및 서열 번호 4에 제시된 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 이러한 항체의 예시적인 키메라 및 인간화 버전은 제WO2006/012688호에 기술되어 있다.
하나의 예에서, 항-VEGF-B 항체 또는 이의 단편은 서열 번호 5에 제시된 서열을 포함하는 VH 및 서열 번호 6에 제시된 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
하나의 예에서, 항-VEGF-B 항체 또는 이의 단편은 VEGF-B에의 4E12의 결합을 경쟁적으로 억제하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 하나의 예에서, 항-VEGF-B 항체 또는 이의 단편은 항체 4E12 또는 이의 키메라, CDR 이식 또는 인간화 버전 또는 이의 항원 결합 단편이다. 이와 관련하여, 항체 4E12는 서열 번호 7에 제시된 서열을 포함하는 VH 및 서열 번호 8에 제시된 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
하나의 예에서, 화합물은 항체 4E12의 인간화 가변 영역을 포함하는 단백질이다. 예를 들면, 단백질은 항체 4E12의 VH 및/또는 VL의 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함하는 가변 영역을 포함한다. 예를 들면, 단백질은 다음을 포함한다:
(i) 다음을 포함하는 VH:
(a) 서열 번호 7의 아미노산 25-34에 제시된 서열을 포함하는 CDR1;
(b) 서열 번호 7의 아미노산 49-65에 제시된 서열을 포함하는 CDR2; 및
(c) 서열 번호 7의 아미노산 98-105에 제시된 서열을 포함하는 CDR3; 및/또는
(ii) 다음을 포함하는 VL:
(a) 서열 번호 8의 아미노산 24-34에 제시된 서열을 포함하는 CDR1;
(b) 서열 번호 8의 아미노산 50-56에 제시된 서열을 포함하는 CDR2; 및
(c) 서열 번호 8의 아미노산 89-97에 제시된 서열을 포함하는 CDR3.
하나의 예에서, 항-VEGF-B 항체 또는 이의 단편은 VEGF-B에의 2F5의 결합을 경쟁적으로 억제하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 하나의 예에서, 항-VEGF-B 항체 또는 이의 단편은 항체 2F5 또는 이의 키메라, CDR 이식 또는 인간화 버전 또는 이의 항원 결합 단편이다. 이와 관련하여, 항체 2E5는 서열 번호 9에 제시된 서열을 포함하는 VH 및 서열 번호 10에 제시된 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
하나의 예에서, 화합물은 항체 2F5의 인간화 가변 영역을 포함하는 단백질이다. 예를 들면, 단백질은 항체 2F5의 VH 및/또는 VL의 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함하는 가변 영역을 포함한다. 예를 들면, 단백질은 다음을 포함한다:
(i) 다음을 포함하는 VH:
(a) 서열 번호 9의 아미노산 25-34에 제시된 서열을 포함하는 CDR1;
(b) 서열 번호 9의 아미노산 49-65에 제시된 서열을 포함하는 CDR2; 및
(c) 서열 번호 9의 아미노산 98-107에 제시된 서열을 포함하는 CDR3; 및/또는
(ii) 다음을 포함하는 VL:
(a) 서열 번호 10의 아미노산 24-34에 제시된 서열을 포함하는 CDR1;
(b) 서열 번호 10의 아미노산 50-56에 제시된 서열을 포함하는 CDR2; 및
(c) 서열 번호 10의 아미노산 89-96에 제시된 서열을 포함하는 CDR3.
또 다른 예에서, 항체 또는 이의 가변 영역을 포함하는 단백질은, 예를 들어, 당업계에 공지되거나 본원에 간략하게 기술된 바와 같이, 표준 방법을 사용하여 생산된다.
면역화-기반 방법
항체를 생성하기 위해, 임의의 적절한 또는 바람직한 아주반트 및/또는 약제학적으로 허용되는 담체를 사용하여 임의로 제형화된 VEGF-B 또는 에피토프 함유 단편 또는 이의 일부 또는 이의 변형된 형태 또는 이를 암호화하는 핵산("면역원")을 주사 가능한 조성물의 형태로 대상체(예를 들어, 마우스, 래트, 닭 등과 같은 비-인간 동물 대상체)에게 투여한다. 예시적인 비-인간 동물은 포유동물, 예를 들어, 뮤린 동물(예를 들어, 래트 또는 마우스)이다. 주사는 비내, 근육내, 피하, 정맥내, 피내, 복강내, 또는 다른 공지된 경로에 의해 이루어질 수 있다. 임의로, 면역원은 수차례 투여된다. 항체를 제조하고 특성화하기 위한 방법은 당업계에 공지되어 있다(예를 들면, 문헌[Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988] 참조). 마우스에서 항-VEGF-B 항체를 생산하는 방법이 제WO2006/012688호에 기술되어 있다.
다클론 항체의 생산은 면역화 후 다양한 시점에서 면역화된 동물의 혈액을 채혈하여 모니터링할 수 있다. 목적하는 항체 역가를 달성하기 위해 필요한 경우, 2차 추가접종(booster) 주사가 제공될 수 있다. 추가접종 및 역가측정 과정은 적절한 역가가 달성될 때까지 반복한다. 목적하는 수준의 면역원성이 달성되면, 면역화된 동물을 채혈하고 혈청을 단리하고 저장하고/하거나, 상기 동물을 이용하여 단클론 항체(mAb)를 생성한다.
단클론 항체는 본 기재내용에 의해 고려되는 예시적인 항체이다. 일반적으로, 단클론 항체의 생산은 항체 생성 세포를 자극하기에 충분한 조건하에서 대상체(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 마우스 또는 래트)을 면역원으로 면역화시킴을 포함한다. 몇몇 예에서, 인간 항체는 발현하고 뮤린 항체 단백질은 발현하지 않도록 유전자-조작된 마우스를 면역화시켜 항체를 생산한다(예를 들면, 제PCT/US2007/008231호 및/또는 문헌[Lonberg et al., Nature 368 (1994): 856-859]에 기술된 바와 같음). 면역화 후, 항체 생성 체세포(예를 들어, B 림프구)를 불멸 세포, 예를 들면, 불멸 골수종 세포와 융합시킨다. 이러한 융합 세포(하이브리도마)를 생산하기 위한 다양한 방법들이 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들면, 문헌[Kohler and Milstein, Nature 256, 495-497, 1975]에 기술되어 있다. 그후, 하이브리도마 세포를 항체 생산에 충분한 조건하에서 배양할 수 있다.
본 기재내용은 항체를 생산하기 위한 다른 방법, 예를 들면, ABL-MYC 기술(예를 들면, 문헌[Largaespada et al, Curr . Top. Microbiol . Immunol , 166, 91-96. 1990]에 기술된 바와 같음)을 고려한다.
라이브러리-기반 방법
본 기재내용은 또한 VEGF-B 결합 항체 또는 이의 가변 영역을 포함하는 단백질을 동정하기 위해 항체 또는 이의 항원 결합 도메인을 포함하는(예를 들어, 이의 가변 영역을 포함하는) 단백질의 라이브러리를 스크리닝함을 포함한다.
본 기재내용에 의해 고려되는 라이브러리의 예는 (항원자극되지 않은 대상체로부터의) 미감작(naive) 라이브러리, (항원으로 면역화된 대상체로부터의) 면역화 라이브러리 또는 합성 라이브러리를 포함한다. 항체 또는 이의 영역(예를 들어, 가변 영역)을 암호화하는 핵산은 통상의 기술(예를 들어, 문헌[Sambrook and Russell, eds, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed, vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001]에 개시된 바와 같음)에 의해 클로닝되고 당업계에 공지된 방법을 이용하여 단백질을 암호화하고 디스플레이하는데 사용된다. 단백질의 라이브러리를 생산하기 위한 다른 기술은, 예를 들면, 제US6300064호(예를 들어, Morphosys AG의 HuCAL 라이브러리); 제US5885793호; 제US6204023호; 제US6291158호; 또는 제US6248516호에 기술되어 있다.
본 기재내용에 따르는 단백질은 분비된 가용성 단백질일 수 있거나, 세포 표면 상의 융합 단백질, 또는 입자(예를 들면, 파지 또는 다른 바이러스, 리보솜 또는 포자)로서 존재할 수 있다. 다양한 디스플레이 라이브러리 포맷이 당업계에 공지되어 있다. 예를 들면, 라이브러리는 시험관내 디스플레이 라이브러리(예를 들면, 제US7270969호에 기술된 바와 같은, 리보솜 디스플레이 라이브리러, 공유 디스플레이 라이브러리 또는 mRNA 디스플레이 라이브러리)이다. 또 다른 예에서, 디스플레이 라이브러리는, 예를 들어, 제US6300064; 제US5885793; 제US6204023; 제US6291158; 또는 제US6248516호에 기술된 바와 같이 항체의 항원 결합 도메인을 포함하는 단백질이 파지상에서 발현되는 파지 디스플레이 라이브러리이다. 다른 파지 디스플레이 방법들도 당업계에 공지되어 있으며 본 기재내용에 의해 고려된다. 유사하게, 세포 디스플레이 방법, 예를 들면, 제US5516637호에 기술된 바와 같은 세균 디스플레이 라이브러리; 예를 들면, 제US6423538호에 기술된 바와 같은 효모 디스플레이 라이브러리, 또는 포유동물 디스플레이 라이브러리가 본 기재내용에 의해 고려된다.
디스플레이 라이브러리를 스크리닝하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 하나의 예에서, 본 기재내용의 디스플레이 라이브러리는, 예를 들면, 문헌[Scopes, In: Protein purification: principles and practice, Third Edition, Springer Verlag, 1994]에 기술된 바와 같은 친화성 정제를 이용하여 스크리닝된다. 친화성 정제 방법은 전형적으로 라이브러리에 의해 디스플레이된 항원 결합 도메인을 포함하는 단백질을 표적 항원(예를 들어, VEGF-B)과 접촉시키고, 세척 후에, 항원에 결합된 채로 있는 이러한 도메인들을 용출시킴을 포함한다.
스크리닝에 의해 동정된 임의의 가변 영역 또는 scFv는 경우에 따라 완전 항체로 용이하게 변형된다. 가변 영역 또는 scFv를 완전 항체로 변형하거나 재포맷화하기 위한 예시적인 방법은, 예를 들면, 문헌[Jones et al., J Immunol Methods. 354:85-90, 2010; 또는 Jostock et al., J Immunol Methods, 289: 65-80, 2004]에 기술되어 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 예를 들면, 문헌[Ausubel et al (In: Current Protocols in Molecular Biology. Wiley Interscience, ISBN 047 150338, 1987] 및/또는 [Sambrook et al (In: Molecular Cloning: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York, Third Edition 2001]에 기술된 바와 같은 표준 클로닝 방법들이 이용된다.
탈면역화 , 키메라 , 인간화, 합성인간화, 영장류화 및 인간 단백질
본 기재내용의 단백질은 인간화 단백질일 수 있다.
용어 "인간화 단백질"은 인간 항체로부터의 FR에 이식되거나 삽입된 비-인간 종(예를 들어, 마우스 또는 래트 또는 비-인간 영장류)으로부터의 항체로부터의 CDR을 포함하는, 인간-유사 가변 영역을 포함하는 단백질을 가리키는 것으로 이해되어야 한다(이러한 유형의 항체를 "CDR-이식 항체"라고도 함). 인간화 단백질은 또한 인간 단백질의 하나 이상의 잔기가 하나 이상의 아미노산 치환에 의해 변형되고/되거나 인간 단백질의 하나 이상의 FR 잔기가 상응하는 비-인간 잔기로 치환된 단백질을 포함한다. 인간화 단백질은 또한 인간 항체에서도 비-인간 항체에서도 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 단백질의 임의의 추가 영역(예를 들어, Fc 영역)은 일반적으로 인간 영역이다. 인간화는 당업계에, 예를 들어, 제US5225539호, 제US6054297호, 제US7566771호 또는 제US5585089호에 공지된 방법을 사용하여 수행할 수 있다. 용어 "인간화 단백질"은 또한, 예를 들어, 제US7732578호에 기술된 바와 같은 초-인간화 단백질을 포함한다.
본 기재내용의 단백질은 인간 단백질일 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이 용어 "인간 단백질"은 인간에서, 예를 들어, 인간 생식 세포 또는 체세포에서 또는 이러한 영역을 사용하여 생산된 라이브러리로부터 발견되는 가변, 및 임의로 불변 항체 영역을 갖는 단백질을 가리킨다. "인간" 항체는 인간 서열에 의해 암호화되지 않는 아미노산 잔기, 예를 들면, 시험관내에서 랜덤 또는 부위 지향 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이(특히 보존적 치환을 포함하는 돌연변이 또는 단백질의 소수의 잔기, 예를 들어, 단백질의 잔기들 중 1, 2, 3, 4 또는 5개 잔기에서의 돌연변이)를 포함할 수 있다. 이러한 "인간 항체"는 반드시 인간의 면역 반응의 결과로서 생성되어야 하는 것은 아니며, 오히려 이들은 재조합 수단(예를 들어, 파지 디스플레이 라이브러리 스크리닝)을 이용하고/하거나 인간 항체 불변 및/또는 가변 영역을 암호화하는 핵산을 포함하는 유전자전이 동물(예를 들어, 마우스)에 의해 및/또는 유도 선택(예를 들면, 제US5565332호에 기술된 바와 같음)을 이용하여 생성될 수 있다. 이 용어는 또한 이러한 항체들의 친화도 성숙된 형태를 포함한다. 본 기재내용의 목적을 위하여, 인간 단백질은 또한 인간 항체로부터의 FR 또는 인간 FR의 컨센서스 서열로부터의 서열을 포함하는 FR을 포함하는 단백질을 포함하는 것으로 간주될 것이며, 여기서 CDR 중 하나 이상은, 예를 들어, 제US6300064호 및/또는 제US6248516호에 기술된 바와 같이 랜덤 또는 준-랜덤이다.
본 기재내용의 단백질은 합성인간화 단백질일 수 있다. 용어 "합성인간화 단백질"은 제WO2007/019620호에 기술된 방법으로 제조된 단백질을 가리킨다. 합성인간화 단백질은 항체의 가변 영역을 포함하며, 여기서 가변 영역은 신세계 영장류(New World primate) 항체 가변 영역으로부터의 FR 및 비-신세계 영장류(non-New World primate) 항체 가변 영역으로부터의 CDR을 포함한다. 예를 들면, 합성인간화 단백질은 항체의 가변 영역을 포함하며, 여기서 가변 영역은 신세계 영장류 항체 가변 영역으로부터의 FR 및 마우스 또는 래트 항체로부터의 CDR을 포함한다.
본 기재내용의 단백질은 영장류화 단백질일 수 있다. "영장류화 단백질"은 비-인간 영장류(예를 들면, 사이노몰거스 마카크(cynomolgus macaque))의 면역화 후에 생성된 항체로부터의 가변 영역(들)을 포함한다. 임의로, 비-인간 영장류 항체의 가변 영역은 인간 불변 영역에 결합되어 영장류화 항체를 생산한다. 영장류화 항체를 생산하기 위한 예시적인 방법은 제US6113898호에 기술되어 있다.
하나의 예에서 본 기재내용의 단백질은 키메라 단백질이다. 용어 "키메라 단백질"은 항원 결합 도메인은 특정 종(예를 들면, 마우스 또는 래트와 같은 뮤린)으로부터의 것이거나 특정 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 반면, 단백질의 나머지 부분은 또 다른 종(예를 들면, 인간 또는 비-인간 영장류와 같은)으로부터 유래된 단백질로부터의 것이거나 또 다른 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 단백질을 가리킨다. 하나의 예에서, 키메라 단백질은 비-인간 항체(예를 들면, 뮤린 항체)로부터의 VH 및/또는 VL을 포함하는 키메라 항체이며, 항체의 나머지 영역은 인간 항체로부터의 것이다. 이러한 키메라 단백질의 생산은 당업계에 공지되어 있으며, 표준 방법(예를 들면, 제US6331415호; 제US5807715호; 제US4816567호 및 제US4816397호에 기술된 바와 같음)에 의해 달성될 수 있다.
본 기재내용은 또한, 예를 들어, 제WO2000/34317호 및 제WO2004/108158호에 기술된 바와 같은 탈면역화 단백질을 고려한다. 탈면역화 항체 및 단백질은 하나 이상의 에피토프, 예를 들어, B 세포 에피토프 또는 T 세포 에피토프가 제거(즉, 돌연변이)됨으로써 대상체가 항체 또는 단백질에 대한 면역 반응을 야기할 가능성을 감소시킨다.
항체 가변 영역을 포함하는 다른 단백질들
본 기재내용은 또한 다음과 같은 항체의 가변 영역 또는 항원 결합 도메인을 포함하는 다른 단백질들을 고려한다:
(i) 항체의 VH 또는 VL의 전부 또는 일부를 포함하는 단일 폴리펩티드 쇄인 단일-도메인 항체(예를 들어, 제US6248516호 참조);
(ii) 예를 들어, 제US5844094호 및/또는 제US2008152586호에 기술된 바와 같은 디아바디, 트리아바디 및 테트라바디;
(iii) 예를 들어, 제US5260203호에 기술된 바와 같은 scFvs;
(iv) 예를 들어, 제US5837821호에 기술된 바와 같은 미니바디;
(v) 제US5731168호에 기술된 바와 같은 "키 앤 홀(key and hole)" 이중특이성 단백질;
(vi) 예를 들어, 제US4676980에 기술된 바와 같은 이종접합체 단백질;
(vii) 예를 들어, 제US4676980에 기술된 바와 같은 화학적 가교결합제를 사용하여 생산된 이종접합체 단백질;
(viii) 예를 들어, 문헌[Shalaby et al, J. Exp . Med ., 175: 217-225, 1992]에 기술된 바와 같은 Fab'-SH 단편; 또는
(ix) Fab3 (예를 들어, 제EP19930302894호에 기술된 바와 같음).
불변 도메인 융합
본 기재내용은 항체의 가변 영역 및 불변 영역 또는 Fc 또는 이의 도메인, 예를 들어, CH2 및/또는 CH3 도메인을 포함하는 단백질을 포함한다. 적절한 불변 영역 및/또는 도메인은 숙련가에게 자명할 것이고/이거나 상기 폴리펩티드의 서열은 공개적으로 이용가능한 데이터베이스로부터 용이하게 이용가능하다. 카밧 등(Kabat et al)이 또한 일부 적합한 불변 영역/도메인에 대한 설명을 제공한다.
불변 영역 및/또는 이의 도메인은 생물학적 활성, 예를 들면, 이량체화, 예를 들어, FcRn(신생아 Fc 수용체)에 결합시킴으로써 연장된 혈청 반감기, 항원 의존적 세포독성(ADCC), 보체 의존적 세포독성(CDC), 항원 의존적 세포 식균작용(ADCP)을 제공하는데 유용하다.
본 기재내용은 또한, 예를 들어, 제US7217797호; 제US7217798호; 또는 제US20090041770호(증가된 반감기를 가짐) 또는 제US2005037000호(증가된 ADCC)에 기술된 바와 같은 돌연변이 불변 영역 또는 도메인을 포함하는 단백질을 고려한다.
안정화된 단백질
본 기재내용의 중화 단백질은 IgG4 불변 영역 또는 안정화된 IgG4 불변 영역을 포함할 수 있다. 용어 "안정화된 IgG4 불변 영역"은, Fab 팔 교환, 또는 Fab 팔 교환 또는 절반-항체(half-antibody)의 형성을 겪는 경향 또는 절반-항체를 형성하는 경향을 감소시키도록 변형된 IgG4 불변 영역을 의미하는 것으로 이해될 것이다. "Fab 팔 교환"은, IgG4 중쇄 및 결합된 경쇄(절반-분자)가 또 다른 IgG4 분자로부터의 중쇄-경쇄 쌍과 교환되는, 인간 IgG4에 대한 일종의 단백질 변형을 가리킨다. 따라서, IgG4 분자는 2개의 별개의 항원을 인식하는 2개의 별개의 Fab 팔을 획득할 수 있다(이중특이성 분자 생성). Fab 팔 교환은 생체내에서 자연적으로 발생하며, 시험관내에서 정제된 혈액 세포 또는 환원된 글루타티온과 같은 환원제에 의해 유도될 수 있다. "절반 항체"는 IgG4 항체가 해리되어 각각 단일 중쇄 및 단일 경쇄를 함유하는 2개의 분자를 형성할 때 형성된다.
하나의 예에서, 안정화된 IgG4 불변 영역은 카밧 시스템에 따르는 힌지 영역의 위치 241에 프롤린을 포함한다(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest Washington DC United States Department of Health and Human Services, 1987 및/또는 1991). 이 위치는 EU 넘버링 시스템에 따르는 힌지 영역의 위치 228에 상응한다(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest Washington DC United States Department of Health and Human Services, 2001 and Edelman et al., Proc . Natl . Acad . USA, 63, 78-85, 1969). 인간 IgG4에서, 이 잔기는 일반적으로 세린이다. 프롤린의 세린으로의 치환 후에, IgG4 힌지 영역은 서열 CPPC를 포함한다. 이와 관련하여, 숙련가라면 "힌지 영역"이 Fc 및 Fab 영역을 결합시켜 항체의 2개의 Fab 팔에 이동성을 부여하는 항체 중쇄 불변 영역의 프롤린-풍부 부분인 것을 인지할 것이다. 힌지 영역은 중쇄간 디설파이드 결합에 포함되는 시스테인 잔기를 포함한다. 이것은 일반적으로 카밧의 넘버링 시스템에 따르는 인간 IgG1의 Glu226으로부터 Pro243까지의 연장부로 정의된다. 다른 IgG 이소형의 힌지 영역은 중쇄간 디설파이드(S-S) 결합을 형성하는 첫번째 및 마지막 시스테인 잔기를 동일 위치에 배치함으로써 IgG1 서열에 맞추어 정렬될 수 있다(예를 들면, 제WO2010/080538호 참조).
추가의 단백질-기반 VEGF-B 신호전달 억제제
VEGF-B와 이의 수용체와의 생산적 상호작용을 방해할 수 있는 다른 단백질은 돌연변이 VEGF-B 단백질을 포함한다.
하나의 예에서, 억제제는 VEGF-B에 결합하는(그리고, 예를 들어, VEGF-A에는 실질적으로 결합하지 않는) VEGF-R1의 하나 이상의 도메인을 포함하는 가용성 단백질이다. 하나의 예에서, 가용성 단백질은 IgG1 항체와 같은 항체의 불변 영역을 추가로 포함한다. 예를 들면, 가용성 단백질은 항체, 예를 들어, IgG1 항체의 Fc 영역 및, 임의로, 힌지 영역을 추가로 포함한다.
하나의 예에서, 단백질 억제제는 항체 모방체(antibody mimetic), 예를 들어, 항체와 유사한 방식으로 표적 단백질에 결합하는 가변 영역을 포함하는 단백질 스캐폴드이다. 예시적인 항체 모방체의 설명이 다음에 이어진다.
면역글로불린 및 면역글로불린 단편
본 기재내용의 화합물의 예는 면역글로불린, 예를 들면, T 세포 수용체 또는 중쇄 면역글로불린(예를 들면, IgNAR, 낙타과 항체)의 가변 영역을 포함하는 단백질이다.
중쇄 면역글로불린
중쇄 면역글로불린은 이들이 중쇄를 포함하지만 경쇄는 포함하지 않는 한 여러 다른 형태의 면역글로불린(예를 들어, 항체)과 구조적으로 상이하다. 따라서, 이러한 면역글로불린을 또한 "중쇄만 있는 항체"라고 한다. 중쇄 면역글로불린은, 예를 들면, 낙타과 및 연골 어류에서 발견된다(IgNAR로도 불림).
자연 발생적 중쇄 면역글로불린에 존재하는 가변 영역을, 통상의 4-쇄 항체에 존재하는 중쇄 가변 영역(이를 "VH 도메인"이라고 함) 및 통상의 4-쇄 항체에 존재하는 경쇄 가변 영역(이를 "VL 도메인"이라고 함)과 구별하기 위해, 일반적으로 낙타과 Ig에서는 "VHH 도메인" 및 IgNAR에서는 V-NAR이라고 한다.
중쇄 면역글로불린은 관련 항원에 높은 친화도 및 높은 특이성으로 결합하는 경쇄의 존재를 필요로 하지 않는다. 이것은 단일 도메인 결합 단편이 발현하기 쉽고 일반적으로 안정하고 가용성인 중쇄 면역글로불린으로부터 유도될 수 있음을 의미한다.
낙타과로부터의 중쇄 면역글로불린 및 이의 가변 영역 및 이의 생산 및/또는 단리 및/또는 사용을 위한 방법의 일반적인 설명은 그중에서도 하기 참고문헌 제WO94/04678호, 제WO97/49805호 및 제WO 97/49805호에서 발견된다.
연골 어류로부터의 중쇄 면역글로불린 및 이의 가변 영역 및 이의 생산 및/또는 단리 및/또는 사용을 위한 방법의 일반적인 설명은 그중에서도 제WO2005/118629호에서 발견된다.
V-유사 단백질
본 기재내용의 화합물의 예는 T-세포 수용체이다. T 세포 수용체는 항체의 Fv 모듈과 유사한 구조로 조합되는 두 개의 V-도메인을 갖는다. 노보트니 등(Novotny et al., Proc Natl Acad Sci USA 88: 8646-8650, 1991)은 T-세포 수용체의 두 개의 V-도메인(알파 및 베타라고 함)이 어떻게 융합하여 단일 쇄 폴리펩티드로서 발현될 수 있는지, 및 추가로, 어떻게 표면 잔기를 변형시켜 항체 scFv와 유사하게 직접적으로 소수성을 감소시키는지를 설명한다. 두 개의 V-알파 및 V-베타 도메인을 포함하는 단일-쇄 T-세포 수용체 또는 다량체성 T 세포 수용체의 생산을 설명하는 또 다른 간행물로는 제WO1999/045110호 또는 제WO2011/107595호가 포함된다.
항원 결합 도메인을 포함하는 다른 비-항체 단백질은 일반적으로 단량체성인 V-유사 도메인을 갖는 단백질을 포함한다. 이러한 V-유사 도메인을 포함하는 단백질의 예는 CTLA-4, CD28 및 ICOS를 포함한다. 이러한 V-유사 도메인을 포함하는 단백질의 추가의 기재내용은 제WO1999/045110호에 포함되어 있다.
에드넥틴
하나의 예에서, 본 기재내용의 화합물은 에드넥틴이다. 에드넥틴은 루프 영역이 변형되어 항원 결합을 부여하는 인간 피브로넥틴의 열번째 피브로넥틴 타입 III (10Fn3) 도메인을 기반으로 한다. 예를 들면, 10Fn3 도메인의 β-샌드위치의 한 쪽 말단에서 세 개의 루프는 에드넥틴이 항원을 특이적으로 인식할 수 있도록 조작될 수 있다. 추가의 세부사항에 대해서는 제US20080139791호 또는 제WO2005/056764호를 참고한다.
안티칼린
추가의 예에서, 본 기재내용의 화합물은 안티칼린이다. 안티칼린은 스테로이드, 빌린, 레티노이드 및 지질과 같은 소수성 소분자를 운반하는 세포외 단백질의 한 계열인 리포칼린으로부터 유도된다. 리포칼린은 항원에 결합하도록 조작될 수 있는 원뿔형 구조의 개방 말단에 다수의 루프를 갖는 견고한 β-시트 이차 구조를 갖는다. 이러한 조작된 리포칼린이 안티칼린으로 알려져 있다. 안티칼린에 대한 추가의 설명을 위해 제US7250297B1호 또는 제US20070224633호를 참고한다.
애피바디
추가의 예에서, 본 기재내용의 화합물은 애피바디이다. 애피바디는 항원에 결합하도록 조작될 수 있는 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)의 단백질 A의 Z 도메인(항원 결합 도메인)으로부터 유도되는 스캐폴드이다. Z 도메인은 대략 58개 아미노산의 3-나선 다발로 이루어진다. 라이브러리는 표면 잔기의 무작위화에 의해 생성되었다. 추가의 세부사항에 대해서는 제EP1641818호를 참고한다.
애비머
추가의 예에서, 본 기재내용의 화합물은 애비머이다. 애비머는 A-도메인 스캐폴드 계열로부터 유도되는 다중도메인 단백질이다. 대략 35개 아미노산의 네이티브 도메인이 정의된 디설파이드 결합 구조를 채택한다. 다양성은 A-도메인의 계열에 나타나는 자연?인 변형의 셔플링에 의해 생성된다. 추가의 세부사항에 대해서는 제WO2002088171호를 참고한다.
DARPin
추가의 예에서, 본 기재내용의 화합물은 설계된 안키린 반복 단백질(Designed Ankyrin Repeat Protein; DARPin)이다. DARPin은 세포골격에의 내재 막 단백질의 부착을 매개하는 단백질의 한 계열인 안키린으로부터 유도된다. 단일 안키린 반복체는 두 개의 α-나선 및 β-회전으로 이루어진 33개 잔기 모티프이다. 이들은 각 반복체의 첫번째 α-나선 및 β-회전에서 잔기를 무작위화함으로써 상이한 표적 항원에 결합하도록 조작될 수 있다. 이들의 결합 계면은 모듈의 수를 증가시킴으로써 증가될 수 있다(친화도 성숙의 방법). 추가의 세부사항에 대해서는 제US20040132028호를 참고한다.
단백질을 생산하는 방법
재조합 발현
재조합 단백질의 경우에, 이를 암호화하는 핵산을 발현 벡터에 클로닝시킬 수 있으며, 그후 달리 항체를 생성하지 않는 숙주 세포, 예를 들면, 이. 콜라이(E. coli) 세포, 효모 세포, 곤충 세포 또는 포유동물 세포, 예를 들면, 유인원 COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포, 인간 배아 신장(HEK) 세포 또는 골수종 세포에 형질감염시킨다. 본 기재내용의 단백질을 발현시키기 위해 사용되는 예시적인 세포는 CHO 세포, 골수종 세포 또는 HEK 세포이다. 이러한 목적을 달성하기 위한 분자 클로닝 기술은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들면, 문헌[Ausubel et al., (editors), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988, including all updates until present) or Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)]에 기술되어 있다. 매우 다양한 클로닝 및 시험관내 증폭 방법이 재조합 핵산의 작제에 적합하다. 재조합 항체를 생산하는 방법은 또한 당업계에 공지되어 있다. 제US4816567호 또는 제US5530101호를 참고한다.
단리 후, 핵산은 추가의 클로닝(DNA의 증폭)을 위해 또는 세포-비함유 시스템에서 또는 세포에서의 발현을 위해 발현 작제물 또는 발현 벡터에 삽입되고 프로모터에 작동 가능하게 연결된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "프로모터"는 이의 가장 넓은 맥락으로 이해되어야 하며, 예를 들면, 발달상 및/또는 외부 자극에 반응하여 또는 조직 특이적 방식으로 핵산의 발현을 변화시키는 추가의 조절 요소(예를 들면, 상류 활성화 서열, 전사 인자 결합 부위, 인핸서 및 사일렌서(silencer))의 존재 또는 부재하에서, 정확한 전사 개시에 필요한 TATA 박스 또는 개시 요소를 포함한 게놈 유전자의 전사 조절 서열을 포함한다. 본 맥락에서, 용어 "프로모터"는, 또한 재조합, 합성 또는 융합 핵산, 또는 이에 작동가능하게 연결된 핵산의 발현을 제공하거나 활성화하거나 증대시키는 유도체를 기술하기 위해 사용된다. 예시적인 프로모터는, 발현을 더 증대시키고/시키거나 상기 핵산의 공간적 발현 및/또는 시간적 발현을 변화시키기 위한 하나 이상의 특정 조절 요소들의 추가의 복제물을 함유할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "작동가능하게 연결된"은 핵산의 발현이 프로모터에 의해 조절되도록 핵산에 대해 프로모터를 위치시킴을 의미한다.
세포에서 발현을 위한 다수의 벡터들이 이용가능하다. 벡터 성분은 일반적으로 다음 중 하나 이상을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다: 신호 서열, 항체(예를 들면, 본원에 제공된 정보로부터 유도된)를 암호화하는 서열, 인핸서 요소, 프로모터, 및 전사 종료 서열. 숙련가라면 항체의 발현에 적합한 서열을 인지할 것이다. 예시적인 신호 서열은 원핵세포 분비 신호(예를 들어, pelB, 알칼리성 포스파타제, 페니실리나제, Ipp, 또는 열-안정성 엔테로톡신 II), 효모 분비 신호(예를 들어, 인버타제 리더, α 인자 리더, 또는 산 포스파타제 리더) 또는 포유동물 분비 신호(예를 들어, 단순 헤르페스 gD 신호)를 포함한다.
포유동물 세포에서 활성인 예시적인 프로모터는 사이토메갈로바이러스 극초기발현(immediate early) 프로모터(CMV-IE), 인간 연장 인자 1-α 프로모터(EF1), 소핵 RNA 프로모터(U1a 및 U1b), α-미오신 중쇄 프로모터, 유인원 바이러스 40 프로모터(SV40), 라우스 육종(Rous sarcoma) 바이러스 프로모터(RSV), 아데노바이러스(Adenovirus) 주요 말기발현 프로모터, β-액틴 프로모터; CMV 인핸서/β-액틴 프로모터 또는 면역글로불린 프로모터를 포함하는 하이브리드 조절 요소 또는 이의 활성 단편을 포함한다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 예는 SV40에 의해 형절전환된 원숭이 신장 CV1 세포주(COS-7, ATCC CRL 1651); 현탁 배양액에서의 성장을 위해 서브클로닝된 인간 배아 신장 세포주(293 또는 293개 세포); 베이비 햄스터 신장 세포(BHK, ATCC CCL 10); 또는 차이니즈 햄스터 난소 세포(CHO)이다.
효모 세포, 예를 들면, 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 사카로마이세스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae) 및 사카로마이세스 폼베(S. pombe)를 포함하는 그룹으로부터 선택된 효모 세포에서의 발현에 적합한 전형적인 프로모터는 ADH1 프로모터, GAL1 프로모터, GAL4 프로모터, CUP1 프로모터, PHO5 프로모터, nmt 프로모터, RPR1 프로모터, 또는 TEF1 프로모터를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
단리된 핵산 또는 이를 포함하는 발현 작제물을 발현을 위해 세포에 도입하기 위한 수단은 당업계의 숙련가에게 공지되어 있다. 소정의 세포에 사용되는 기술은 공지된 성공적인 기술에 따라 달라진다. 재조합 DNA를 세포에 도입하기 위한 수단은 미세주사, DEAE-덱스트란에 의해 매개된 형질감염, 예를 들면, 리포펙타민(깁코, MD, USA) 및/또는 셀펙틴(깁코, MD, USA)을 사용함으로써와 같은 리포솜에 의해 매개된 형질감염, PEG-매개된 DNA 흡수, 전기천공, 및 특히, DNA-코팅된 텅스텐 또는 금 입자(Agracetus Inc., WI, USA)를 사용함으로써와 같은 미립자 충격을 포함한다.
항체를 생산하기 위해 사용되는 숙주 세포는 사용되는 세포 유형에 따라 다양한 배지에서 배양될 수 있다. 상업적으로 이용 가능한 배지, 예를 들면, 함 F10(Ham's Fl0)(Sigma), 최소 필수 배지(MEM, Sigma), RPMl-1640(Sigma) 및 둘베코 변형 이글 배지(DMEM, Sigma)가 포유동물 세포를 배양하기에 적합하다. 본원에 논의된 다른 세포 유형을 배양하기 위한 배지는 당업계에 공지되어 있다.
단백질 정제
생산/발현 후, 본 기재내용의 단백질을 당업계에 공지된 방법을 이용하여 정제한다. 이러한 정제는 비특이 단백질, 산, 지질, 탄수화물 등을 실질적으로 함유하지 않는 본 기재내용의 단백질을 제공한다. 하나의 예에서, 단백질은 제제 중 단백질의 약 90% 이상(예를 들면, 95%, 98% 또는 99%)이 본 기재내용의 단백질인 제제로 존재할 것이다.
본 기재내용의 단리된 단백질을 수득하기 위해, 다양한 고압(또는 고성능) 액체 크로마토그래피(HPLC) 및 비-HPLC 폴리펩티드 단리 프로토콜, 예를 들면, 크기 배제 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 혼합방식 크로마토그래피, 상 분리 방법, 전기영동 분리, 침전법, 염용/염석 방법, 면역크로마토그래피 및/또는 기타 방법을 포함하지만 이에 제한되지 않는 펩티드 정제의 표준 방법이 사용된다.
하나의 예에서, 친화성 정제가 표지를 포함하는 융합 단백질을 단리하는데 유용하다. 친화 크로마토그래피를 사용하여 단백질을 단리하는 방법이 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들면, 문헌[Scopes (In: Protein purification: principles and practice, Third Edition, Springer Verlag, 1994)]에 기술되어 있다. 예를 들면, 표지(폴리히스티딘 태그의 경우, 이것은, 예를 들면, 니켈-NTA일 수 있다)에 결합하는 항체 또는 화합물을 고체 지지체 상에 고정화시킨다. 이어서, 단백질을 포함하는 샘플을 고정화된 항체 또는 화합물과 결합이 일어나기에 충분한 시간 동안 그러한 조건하에서 접촉시킨다. 세척하여 임의의 미결합 또는 비-특이 결합 단백질을 제거한 후, 단백질을 용출한다.
항체의 Fc 영역을 포함하는 단백질의 경우, 단백질 A 또는 단백질 G 또는 이의 변형된 형태를 친화성 정제에 사용할 수 있다. 단백질 A는 인간 γl, γ2, 또는 γ4 중쇄 Fc 영역을 포함하는 정제된 단백질을 단리하는데 유용하다. 단백질 G는 모든 마우스 Fc 이소형 및 인간 γ3에 대해 권장된다.
핵산-기반 VEGF -B 신호전달 억제제
본 기재내용의 하나의 예에서, 본 기재내용의 임의의 예에 따라 본원에 기술된 바와 같은 치료적 및/또는 예방적 방법은 VEGF-B의 발현을 감소시킴을 포함한다. 예를 들면, 이러한 방법은 핵산의 전사 및/또는 번역을 감소시키는 화합물을 투여함을 포함한다. 하나의 예에서, 상기 화합물은 핵산, 예를 들면, 안티센스 폴리뉴클레오티드, 리보자임, PNA, 간섭 RNA, siRNA, 마이크로RNA이다.
안티센스 핵산
용어 "안티센스 핵산"은, 본 기재내용의 임의의 예에서 본원에 기술된 바와 같은 폴리펩티드를 암호화하고 mRNA 번역과 같은 전사후 사건을 방해할 수 있는 특정 mRNA 분자의 적어도 일부에 상보적인 DNA 또는 RNA 또는 이의 유도체(예를 들어, LNA 또는 PNA) 또는 이들의 조합을 의미하는 것으로 간주되어야 한다. 안티센스 방법의 사용은 당업계에 공지되어 있다(예를 들면, 문헌[Hartmann and Endres (editors), Manual of Antisense Methodology, Kluwer (1999)] 참조).
본 기재내용의 안티센스 핵산은 생리적 조건하에서 표적 핵산과 하이브리드화될 것이다. 안티센스 핵산은, 구조적 유전자 또는 암호화 영역에, 또는 유전자 발현 또는 스플라이싱에 대한 조절을 수행하는 서열에 상응하는 서열을 포함한다. 예를 들면, 안티센스 핵산은 VEGF-B를 암호화하는 핵산의 표적화된 암호화 영역, 또는 이들의 5'-미번역 영역(UTR) 또는 3'-UTR에 상응할 수 있다. 이것은 부분적으로 인트론 서열에 상보적일 수 있으며, 상기 인트론 서열은 전사 동안이나 후에, 예를 들면, 표적 유전자의 엑손 서열에만 스플라이싱될 수 있다. 안티센스 서열의 길이는 VEGF-B를 암호화하는 핵산의 적어도 19개의 인접 뉴클레오티드, 예를 들면, 적어도 50개 뉴클레오티드, 예를 들면, 적어도 100, 200, 500 또는 1000개 뉴클레오티드이어야 한다. 전체 유전자 전사체에 상보적인 전장 서열이 사용될 수 있다. 길이는 100 내지 2000개 뉴클레오티드일 수 있다. 표적화된 전사체에 대한 안티센스 서열의 동일성 정도는 적어도 90%, 예를 들면, 95 내지 100%이어야 한다.
VEGF-B에 대한 예시적인 안티센스 핵산이, 예를 들면, 제WO2003/105754호에 기술되어 있다.
촉매적 핵산
용어 "촉매적 핵산"은, 별개의 기질을 특이적으로 인식하고 이 기질의 화학적 변형을 촉매하는 DNA 분자 또는 DNA-함유 분자(당해 분야에서는 "데옥시리보자임" 또는 "DNA자임"으로도 알려져 있음) 또는 RNA 또는 RNA-함유 분자("리보자임" 또는 "RNA자임"으로도 알려져 있음)를 가리킨다. 촉매적 핵산에서 핵산 염기는 염기 A, C, G, T(및 RNA의 경우 U)일 수 있다.
전형적으로, 촉매적 핵산은 표적 핵산, 및 효소 작용을 절단시키는 핵산(본원에서는 "촉매적 도메인"이라고 함)의 특이 인식을 위한 안티센스 서열을 함유한다. 이러한 기재내용에 유용한 리보자임의 유형은 망치머리형 리보자임 및 머리핀형 리보자임이다.
RNA 간섭
RNA 간섭(RNAi)은 특정 단백질의 생산을 특이적으로 억제하는데 유용하다. 이론에 의해 제한하고자 하는 것은 아니지만, 이 기술은, 해당 유전자 또는 이의 일부의 mRNA, 이 경우에는 VEGF-B를 암호화하는 mRNA와 필수적으로 동일한 서열을 함유하는 dsRNA 분자의 존재에 의존한다. 편리하게, dsRNA는 재조합 벡터 숙주 세포에서 단일 프로모터로부터 생산될 수 있으며, 여기서 센스 및 안티센스 서열은 하이브리드화되어 루프 구조를 형성하는 비관련 서열을 갖는 dsRNA 분자를 형성할 수 있게 하는 비관련 서열이 측면에 있다. 본 기재내용에 적합한 dsRNA 분자의 설계 및 생산은, 특히 제WO99/32619호, 제WO99/53050호, 제WO99/49029호, 및 제WO01/34815호를 고려하여, 당업계의 숙련가의 재량 내에서 잘 이루어진다.
하이브리드화되는 센스 및 안티센스 서열의 길이는 각각 적어도 19개 인접 뉴클레오티드, 예를 들면, 적어도 30 또는 50개 뉴클레오티드, 예를 들면, 적어도 100, 200, 500 또는 1000개 뉴클레오티드이어야 한다. 전체 유전자 전사체에 상응하는 전장 서열을 사용할 수 있다. 길이는 100 내지 2000개 뉴클레오티드일 수 있다. 표적화된 전사체에 대한 센스 및 안티센스 서열의 동일성 정도는 적어도 85%, 예를 들면, 적어도 90%, 예를 들어, 95 내지 100%이어야 한다.
예시적인 간섭 RNA("siRNA") 소분자는 표적 mRNA의 약 19 내지 21개 인접 뉴클레오티드와 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 예를 들면, siRNA 서열은 디뉴클레오티드 AA로 시작하고, 약 30 내지 70%(예를 들면, 30 내지 60%, 예를 들어 40 내지 60%, 예를 들면, 약 45% 내지 55%)의 GC-함량을 포함하고, 예를 들면, 표준 BLAST 검색에 의해 결정되는 바와 같이, 그것이 도입될 포유동물의 게놈내 표적 이외의 다른 임의의 뉴클레오티드 서열에 대해 높은 동일성 퍼센트를 갖지 않는다. VEGF-B의 발현을 감소시키는 예시적인 siRNA는 산타 크루즈 바이오테크놀로지(Santa Cruz Biotechnology) 또는 노버스 바이올로지칼스(Novus Biologicals)로부터 상업적으로 이용 가능하다.
VEGF-B의 발현을 감소시키는 짧은 헤어핀 RNA(shRNA)도 또한 당업계에 공지되어 있으며 산타 크루즈 바이오테크놀로지로부터 상업적으로 이용 가능하다.
스크리닝 검정
VEGF-B 신호전달을 억제하는 화합물은, 예를 들면, 하기에 기술하는 바와 같이 당업계에 공지된 기술을 이용하여 확인할 수 있다. 유사하게, 본원에 기술된 방법에 사용하기에 적합한 VEGF-B 신호전달 억제제의 양은, 예를 들면, 하기에 기술하는 바와 같이 당업계에 공지된 기술을 이용하여 결정하거나 추정할 수 있다.
중화 검정
VEGF-B에 결합하여 신호전달을 억제하는 화합물의 경우, 중화 검정이 사용될 수 있다.
하나의 예에서, 중화 검정은 VEGF-B를 검출가능하게 표지된 가용성 VEGF-R1의 존재 또는 부재하에서 화합물과 접촉시키거나, 검출가능하게 표지된 VEGF-B를 VEGF-R1 또는 가용성 VEGF-R1을 발현하는 세포의 존재 또는 부재하에서 화합물과 접촉시킴을 포함한다. 그후, VEGF-R1에 결합된 VEGF-B의 수준을 평가한다. 화합물의 부재하에서와 비교하여 화합물의 존재하에서 결합된 VEGF-B의 감소된 수준은 화합물이 VEGF-R1에의 VEGF-B의 결합 및, 그 결과로서 VEGF-B 신호전달을 억제함을 나타낸다.
또 다른 중화 검정은 제WO2006/012688호에 기술되어 있으며 고체 지지체 상에 고정화된 제2 Ig-유사 도메인을 포함하는 VEGF-R1의 단편을 화합물과 함께 사전배양된 준포화 농도의 재조합 VEGF-B와 접촉시킴을 포함한다. 세척하여 미결합 단백질을 제거한 후, 고정화된 단백질을 항-VEGF-B 항체와 접촉시키고 결합된 항체의 양(고정화된 VEGF-B을 가리킴)을 결정한다. 화합물 부재하에서의 수준에 비해 결합된 항체의 수준을 감소시키는 화합물이 VEGF-B 신호전달의 억제제로 간주된다.
또 다른 예에서, VEGF-B 신호전달을 억제하는 화합물은, 증식을 위해 VEGF-B 신호전달에 의존성인 세포, 예를 들면, 인간 에리트로포이에틴 수용체의 세포내 도메인 및 VEGF-R1의 세포외 도메인을 혼입시킨 키메라 수용체를 발현시키기 위해 제WO 2006/012688호에 기술된 바와 같이 변형된 BaF3 세포를 사용하여 확인된다. 세포는 VEGF-B의 존재하에서 및 화합물의 존재 또는 부재하에서 배양된다. 그후, 표준 방법, 예를 들면, 콜로니 형성 검정, 티미딘 혼입 또는 세포 증식의 또 다른 적절한 마커의 흡수(예를 들면, MTS 염료 환원 검정)를 이용하여 세포 증식을 평가한다. VEGF-B의 존재하에서 증식 수준을 감소시키는 화합물이 VEGF-B 신호전달의 억제제로 간주된다.
화합물은 또한 표준 방법을 이용하여 VEGF-B에 결합하는 이의 능력에 대해 평가할 수 있다. 단백질에의 결합을 평가하는 방법은, 예를 들면, 문헌[Scopes,In: Protein purification: principles and practice, Third Edition, Springer Verlag, 1994]에 기술된 바와 같이 당업계에 공지되어 있다. 이러한 방법은 일반적으로 화합물을 표지화시키고 이것을 고정화된 VEGF-B와 접촉시킴을 포함한다. 세척하여 비-특이 결합된 화합물을 제거한 후, 표지의 양, 및 그 결과로서 결합된 화합물을 검출한다. 물론, 화합물은 고정화되고 VEGF-B는 표지화될 수 있다. 패닝(panning)-형 검정도 또한 이용할 수 있다. 대안적으로, 또는 추가적으로, 표면 플라즈몬 공명 검정을 이용할 수 있다.
발현 검정
VEGF-B의 발현을 감소시키거나 방지하는 화합물은 세포를 화합물과 접촉시키고 VEGF-B의 발현 수준을 결정함으로써 확인된다. 핵산 수준에서 유전자 발현을 결정하는데 적합한 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들면, 정량적 폴리머라제 연쇄 반응(qPCR) 또는 마이크로어레이 검정을 포함한다. 단백질 수준에서 발현을 결정하는데 적합한 방법 또한 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들면, 효소-결합 면역흡착 검정(ELISA), 형광 결합 면역흡착 검정(FLISA), 면역형광 또는 웨스턴 블롯팅을 포함한다.
생체내 검정
본원에 기술된 화합물은 NAFLD의 동물 모델에서 시험할 수 있다.
예를 들면, 고지방식을 공급받은 마우스(예를 들어, C57/BL6 마우스)는 비만, 내당능 장애, 인슐린 내성, 이상지질혈증 및 지방합성의 조절인자 및 전염증성 사이토킨의 증가된 발현을 갖는 인간 NASH에서 보여지는 유사한 대사적 특징들을 보인다.
또 다른 예에서, 콜린-결핍 고지방식을 공급받은 마우스(예를 들어, C57/BL6 마우스)는 비만, 내당능 장애, 인슐린 내성, 면역 세포 침윤 및 위성증을 포함한 인간 NASH의 유사한 특징들을 보인다. 이러한 마우스는 또한 섬유증 및 간경변을 발병하게 되고 장기간 간세포 암종으로 넘어갈 수 있다.
또 다른 적합한 마우스 모델은 마우스에게 고 지방 및 고 프럭토스 수준을 포함하는 "서양식(Western diet)"을 공급함으로써 유도된다. 이들 마우스는 비만, 인슐린 내성, 이상지질혈증, 고혈당증 및 NAFLD를 나타낸다.
다른 적합한 식이-기반 모델은 메티오닌이 낮은 식이를 공급받은 마우스를 포함한다.
스테롤 조절 요소 결합 단백질(SREBP)-1c-유전자전이 마우스 및 염색체 10 상에 결실된 포스파타제 및 텐신 동족체(PTEN)-null 마우스와 같은 NAFLD/NASH의 수많은 유전적 모델이 있다. 이러한 모델에서는 간 지방증이 먼저 발생한 다음 후속적으로 지방간염이 발병한다.
약제학적 조성물 및 치료방법
VEGF-B 신호전달을 억제하는 화합물(syn . 활성 성분)은 예방적 또는 치료적 치료를 위해, 비경구, 국부, 경구, 또는 국소 투여, 에어로졸 투여, 또는 경피 투여에 유용하다. 하나의 예에서, 화합물은 피하 또는 정맥내와 같은 비경구로 투여된다.
투여하고자 하는 화합물의 제형은 선택되는 투여 경로 및 제형(예를 들어, 용액, 에멀젼, 캡슐)에 따라 달라질 것이다. 투여하고자 하는 화합물을 포함하는 적합한 약제학적 조성물은 생리학적으로 허용되는 담체 중에서 제조될 수 있다. 용액 또는 에멀젼의 경우, 적합한 담체는, 예를 들면, 염수 및 완충 매질을 포함한 수성 또는 알콜성/수성 용액, 에멀젼 또는 현탁액을 포함한다. 비경구 비히클은 염화나트륨 용액, 링거 덱스트로스, 덱스트로스 및 염화나트륨, 락테이트화 링거액 또는 고정유를 포함할 수 있다. 물, 완충수, 완충 염수, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜), 덱스트로스 용액 및 글리신을 포함한 각종 적합한 수성 담체가 숙련가에게 알려져 있다. 정맥내 비히클은 각종 첨가제, 보존제, 또는 유체, 영양소 또는 전해질 보충제를 포함할 수 있다(일반적으로, 문헌[Remington's Pharmaceutical Science, 16th Edition, Mack, Ed. 1980] 참조). 조성물은 임의로 pH 조절 및 완충 제제 및 독성 조절제, 예를 들면, 아세트산나트륨, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘 및 락트산나트륨과 같은 생리학적 상태에 가깝도록 하기 위해 필요에 따라 약제학적으로 허용되는 보조 물질을 함유할 수 있다. 화합물은 당업계에 공지된 동결건조 및 재구성 기술에 따라 사용 전에 저장을 위해 동결건조되고 적합한 담체 중에서 재구성될 수 있다.
선택된 매질 중의 활성 성분(들)의 최적 농도는 숙련가에게 공지된 과정에 따라 경험적으로 결정될 수 있으며, 목적하는 최종 약제학적 제형에 따라 좌우될 것이다.
본 기재내용의 화합물의 투여를 위한 투여량 범위는 목적하는 효과를 야기하기에 충분할 정도로 큰 범위이다. 예를 들면, 조성물은 치료학적 또는 예방학적 유효량의 화합물을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "유효량"은 대상체에서 VEGF-B의 신호전달을 억제/감소/예방하기에 충분한 화합물의 양을 의미하는 것으로 간주되어야 한다. 숙련가는 이러한 양이 예를 들면, 화합물 및/또는 특정 대상체 및/또는 치료되는 NAFLD의 유형 및/또는 중증도에 따라 달라질 것임을 인지할 것이다. 따라서, 이 용어는 본 기재내용을 특정한 양, 예를 들어, 화합물의 중량 또는 수로 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "치료학적 유효량"은 NAFLD 또는 이의 합병증의 하나 이상의 증상을 감소 또는 억제하기에 충분한 화합물의 양을 의미하는 것으로 간주되어야 한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "예방학적 유효량"은 NAFLD 또는 이의 합병증의 하나 이상의 검출 가능한 증상의 개시를 예방 또는 억제 또는 지연시키기에 충분한 화합물의 양을 의미하는 것으로 간주되어야 한다.
하나의 예에서, 화합물은 다음의 효과 중의 하나 이상을 갖기에 효과적인 양으로 투여된다:
· 예를 들어, 간 생검에서 평가되는 바와 같이, 대상체의 간에서 지질 축적, 예를 들어, 중성 지질을 감소 또는 예방함;
· 예를 들어, 대상체의 간에서 면역 세포의 수를 감소시킴으로써 대상체의 간에서 염증을 감소 또는 예방함;
· 대상체의 간에서 멜러리-덴크체 또는 간세포 풍선화 또는 염증 병소 또는 위성증과 같은 NAFLD의 병리학적 변화의 발병을 감소 또는 예방함;
· 간 섬유증 및/또는 간경변을 감소 또는 예방함;
· 간세포 암종의 형성을 감소 또는 예방함.
하나의 예에서, 화합물은 대상체의 간에서 지질 축적의 수준을 NAFLD를 앓지 않는 대상체의 집단에서 보여지는 수준으로 감소시키기에 충분한 양으로 투여된다.
투여량은 과다점성 증후군, 폐 부종, 울혈성 심부전 등과 같은 유해한 부작용을 야기할 정도로 크지 않아야 한다. 일반적으로, 투여량은 환자의 연령, 상태, 성별 및 질환 정도에 따라 다를 것이며 당업계의 숙련가에 의해 결정될 수 있다. 투여량은 임의의 합병증의 경우에 개별 의사에 의해 조정될 수 있다.
투여량은 1일 하나 이상의 용량 투여로 1일 내지 수 일 동안 약 0.1mg/kg 내지 약 300mg/kg, 예를 들어, 약 0.2mg/kg 내지 약 200mg/kg, 예를 들어, 약 0.5mg/kg 내지 약 20mg/kg으로 다양할 수 있다.
몇몇 예에서, 화합물은 후속 용량(유지 용량)보다 높은 초기(또는 부하) 용량으로 투여된다. 예를 들면, 화합물은 약 1mg/kg 내지 약 30mg/kg의 초기 용량으로 투여된다. 그후, 화합물은 약 0.0001mg/kg 내지 약 1mg/kg의 유지 용량으로 투여된다. 유지 용량은 7-35일 마다, 예를 들면, 14일 또는 21일 또는 28일 마다 투여될 수 있다.
몇몇 예에서, 화합물이 초기에 후속 용량에서 사용되는 것보다 낮은 용량으로 투여되는 용량 증가 섭생(escalation regime)이 사용된다. 이러한 투여량 섭생은 대상체가 초기에 부작용을 겪는 경우에 유용하다.
치료에 적절하게 반응하지 않는 대상체의 경우, 1주일에 다중 용량이 투여될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 증가하는 용량이 투여될 수 있다.
대상체는 1회 이상의 노출 또는 용량 세트, 예를 들면 화합물의 적어도 약 2회 노출, 예를 들면, 약 2 내지 60회 노출, 보다 특히 약 2 내지 40회 노출, 가장 특히 약 2 내지 20회 노출이 제공되게 함으로써 화합물로 재치료될 수 있다.
하나의 예에서, 임의의 재치료는 질환의 징후 또는 증상이 재발한 경우, 예를 들어, 미세알부민뇨증이 진행된 경우에 제공될 수 있다.
또 다른 예에서, 임의의 재치료는 정의된 간격으로 제공될 수 있다. 예를 들면, 후속적인 노출은, 예를 들면, 약 24-28주 또는 48-56주 또는 그 이상과 같은 다양한 간격으로 투여될 수 있다. 예를 들면, 이러한 노출은 각각 약 24-26주 또는 약 38-42주, 또는 약 50-54주의 간격으로 투여된다.
본 기재내용의 방법은 또한 당뇨병 및/또는 비만의 예방 또는 치료를 위한 또 다른 치료학적으로 유효한 제제의 투여와 함께 본 기재내용에 따르는 적어도 하나의 화합물의 공동-투여를 포함할 수 있다.
하나의 예에서, 본 기재내용의 화합물(들)은 당뇨병의 예방 또는 치료를 위해 현재 사용되고 있거나 개발중인 적어도 하나의 추가의 공지된 화합물과 조합하여 사용된다. 이러한 공지된 화합물의 예는 일반 항-당뇨병 약물, 예를 들면, 설포닐우레아(e.g. 글리카지드, 글리피지드), 메트포르민, 글리타존(e.g. 로지글리타존, 피오글리타존), 나트륨-포도당 공동수송체-2(SGLT2) 억제제(예를 들어, 카나글리플로진, 다파글리플로진, 엠파글리플로진), 프란디알 포도당 방출제(e.g. 레파글리니드, 나테글리니드), 아카보스 및 인슐린(인간, 소 또는 돼지 기원의 인슐린; 예를 들면, 아이소페인 또는 아연에 현탁된 인슐린 및 유도체, 예를 들면, 인슐린 글룰리신, 인슐린 리스프로, 인슐린 리스프로 프로타민, 인슐린 글라르긴, 인슐린 데테미르 또는 인슐린 아스파르트와 같은 인슐린의 모든 자연-발생적, 합성 및 변형된 형태를 포함함)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
추가로, 본 기재내용의 방법은 또한 NAFLD와 직접 또는 간접적으로 관련된 다른 질환의 치료를 위한 적어도 하나의 치료제의 공동-투여를 포함할 수 있다. 본 발명에 따르는 화합물(들)과 공동-투여될 수 있는 제제의 추가의 예는 콜레스테롤 및 트리글리세라이드를 감소시키는데 사용되는 화합물(e.g. 피브레이트(예를 들어, Gemfibrozil™) 및 HMG-CoA 억제제, 예를 들면, Lovastatin™, Atorvastatin™, Fluvastatin™, Lescol™), Lipitor™, Mevacor™), Pravachol™, Pravastatin™, Simvastatin™, Zocor™, Cerivastatin) 등); 지질의 장관 흡수를 억제하는 화합물(예를 들어, 에제티민드); 니코틴산; 파네소이드 X 수용체 효능제(예를 들어, 오베티콜산, 6알파-에틸-케노데옥시콜산(6-ECDCA)) 및 비타민 D이다.
상기로부터 자명한 바와 같이, 본 기재내용은 유효량의 제1 화합물 및 제2 화합물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여함을 포함하여, 대상체의 병용 치료(concomitant therapeutic treatment) 방법을 제공하며, 여기서, 상기 제1 화합물은 본 기재내용의 화합물(즉, VEGF-B 신호전달의 억제제)이고, 제2 화합물은 당뇨병 또는 비만의 예방 또는 치료를 위한 것이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 어구 "병용 치료"에서와 같이 용어 "병용(concomitant)"은 제2 화합물의 존재하에서 제1 화합물을 투여함을 포함한다. 병용 치료 방법은 제1, 제2, 제3 또는 추가의 화합물이 공동-투여되는 방법을 포함한다. 병용 치료 방법은 또한 제1 또는 추가의 화합물이 제2 또는 추가의 화합물의 존재하에서 투여되는 방법을 포함하며, 여기서, 예를 들면, 제2 또는 추가의 화합물은 이전에 투여되었을 수 있다. 병용 치료 방법은 상이한 관계자에 의해 단계적으로 시행될 수 있다. 예를 들면, 한 관계자가 대상체에게 제1 화합물을 투여할 수 있고, 제2 관계자가 대상체에게 제2 화합물을 투여할 수 있으며 투여 단계는 제1 화합물(및/또는 추가의 화합물)이 제2 화합물(및/또는 추가 화합물)의 존재하에서의 투여를 추구하는 한 동시에, 또는 거의 동시에, 또는 별개 시간에 실행될 수 있다. 관계자 및 대상체는 동일한 존재(예를 들어, 인간)일 수 있다.
하나의 예에서, 본 기재내용은 또한 대상체에게 적어도 하나의 본 기재내용의 화합물을 포함하는 제1 약제학적 조성물 및 하나 이상의 추가의 화합물을 포함하는 제2 약제학적 조성물을 투여함을 포함하여, 대상체에서 NAFLD를 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다.
하나의 예에서, 본 기재내용의 방법은 VEGF-B 신호전달의 억제제를 NAFLD를 앓고 있는 대상체에게 투여하고 (예를 들어, 당뇨병을 위한) 다른 치료를 제공함을 포함한다.
키트
본 기재내용의 또 다른 예는 상기한 바와 같은 NAFLD의 치료에 유용한 화합물을 함유하는 키트를 제공한다.
하나의 예에서, 키트는 (a) 임의로 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제 중의 본원에 기술된 바와 같은 VEGF-B 신호전달을 억제하는 화합물을 포함하는 용기; 및 (b) 대상체에서 NAFLD 또는 이의 합병증을 치료하기 위한 지침서를 갖는 포장 인서트를 포함한다.
본 기재내용의 이러한 예에 따르면, 포장 인서트는 용기 상에 있거나 용기에 부착된다. 적합한 용기는, 예를 들면, 병, 바이알, 주사기 등을 포함한다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 재료들로부터 형성될 수 있다. 용기는 NAFLD를 치료하는데 효과적인 조성물을 보유하거나 함유하고 멸균 접근 포트를 가질 수 있다(예를 들면, 용기는 피하 주사 바늘에 의해 뚫릴 수 있는 마개를 갖는 정맥내 용액 백 또는 바이알일 수 있다). 조성물 중의 적어도 하나의 활성제는 VEGF-B 신호전달을 억제하는 화합물이다. 표지 또는 포장 인서트는 조성물이 화합물 및 임의의 다른 약제가 제공되는 투약량 및 투약 간격에 관한 구체적인 지침과 함께 치료할 수 있는 대상체, 예를 들어, NAFLD를 갖거나 성향이 있는 대상체를 치료하는데 사용됨을 나타낸다. 키트는 추가로 약제학적으로 허용되는 희석제 완충제, 예를 들면, 주사용 정균수(BWFI), 인산염-완충 염수, 링거액 및/또는 덱스트로스 용액을 포함하는 추가의 용기를 포함할 수 있다. 키트는 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘 및 주사기를 포함하여 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 재료를 추가로 포함할 수 있다.
키트는 임의로 제2 약제를 포함하는 용기를 추가로 포함하며, 여기서 VEGF-B 신호전달을 억제하는 화합물이 제1 약제이고, 제품은 대상체를 유효량의 제2 약제로 치료하기 위한 포장 인서트 상에 지침서를 추가로 포함한다. 제2 약제는 상기한 것들 중의 어느 것일 수 있다.
본 기재내용은 하기 비제한적인 실시예를 포함한다.
실시예 1: VEGF -B 결핍 마우스는 비알콜성 지방간 질환( NAFLD ) 및 비알콜성 지방간염(NASH)의 발병에 내성이 있다
VEGF -B 결핍 당뇨병 마우스는 간 손상으로부터 보호된다
5주령 C57BL/6 야생형(WT) 및 C57BL/6-Vegfb -/- 마우스에게 30주 동안 고지방식(지방으로부터 60% 열량)을 공급하였다. 연령 및 성별 일치된 C57BL/6 WT 마우스에게 30주 동안 저지방 대조식(정상적인 음식, 지방으로부터 10% 열량)을 공급하였다. 혈당 수준을 안정화시키는 수단으로서 2시간 동안 음식을 중단한 후 격주로 하루중 동일한 시간에 혈당을 측정하였다. 꼬리 끝을 자르고 한 방울의 혈액을 혈당 미터로 측정하였다. 종점에서 혈청 아미노트랜스퍼라제(ALAT) 수준을 측정하였다.
도 1A 및 1B는 고지방식(HFD) 공급 마우스가 연령-일치된 음식-공급 마우스에 비해 증가된 혈당 수준 및 체중(각각 도 1A 및 1B)을 나타내었음을 보여준다.
도 1C는 혈청 ALAT 수준이 HFD-공급 마우스에서는 15배까지 증가된 반면, VEGF-B 결핍 HFD-공급 마우스는 연령-일치된 HFD-공급 WT 마우스에 비해 감소된 혈청 ALAT 수준을 가졌음을 보여준다.
이러한 데이터는 HFD-공급 마우스에서 Vegfb의 절제(ablation)가 고혈당증을 표적으로 하지 않으면서 간 손상을 감소시킴을 입증한다.
Vegfb 의 결실은 HFD -공급 마우스에서 간 지질 축적을 감소시킨다
오일 레드 O(ORO) 분석을 HFD-공급 WT, HFD-공급 Vegfb -/- 및 음식-공급 WT 마우스로부터 단리된 간에서 수행하였다. 간략하게, 간을 절개하고 드라이 아이스 상에서 급속-냉동시키고 저온유지장치(cryostat)의 몰드 상에 직접 Tissue-Tek®(Sakura)에 매봉하였다. 동결절편(Cryosection)(12μm)을 ORO 작동 용액(400ml 99% 이소프로판올에 용해시키고, H2O 중에서 6:10로 추가로 희석시키며, 22μm 필터(Corning)를 통해 여과시킨 2.5g 오일 레드 O(Sigma-Aldrich))에 5분간 담그고 헤마톡실린 용액에 3초간 침지시킨 다음 이들을 설치하기 전에 LiCO3에 짧게 침지시키고 흐르는 수돗물 하에 10분간 헹구었다. 각 절편 내에 ORO 및 헤마톡실린에 대해 염색된 동물당 적어도 10개 프레임을 20x 배율로 명시야 현미경(Axio Vision microscope, Carl Zeiss)으로 촬영하였다. 지방 소립(lipid droplet)의 양을 간 ORO 염색(화소2/μm2)에 대해 Axio Vision Run wizard 프로그램을 사용하여 정량하였다.
지방산 합성효소(Fasn)의 발현 수준은 단리된 간에서 검출하였다. 전체 RNA를 제조자의 지침에 따라 RNeasy Mini 키트(Qiagen)를 사용하여 간으로부터 추출하고 정제하였다. 첫번째 가닥 cDNA는 iScript cDNA 합성 키트(Bio-Rad)를 사용하여 0.5-1μg 전체 RNA로부터 합성하였다. 실시간 정량적 PCR은 제조자의 지침에 따라 Rotor-Gene Q(Qiagen) 실시간 PCR 열 순환기에서 KAPA SYBR FAST qPCR Kit Master Mix (2x) Universal(KAPA Biosystems)을 사용하여 수행하였다. 발현 수준을 L19 및 β-2 마이크로글로불린의 발현으로 정규화하였다.
간 지방 소립 축적 및 구조는 감소된 VEGF-B 발현을 갖는 HFD-공급 마우스에서 개선되었다. 특히, 지방 소립은 WT HFD-공급 마우스에 비해 Vegfb 결핍 HFD-공급 마우스로부터의 간 절편에서 수 및 크기에 있어 감소되었다.
도 2는 HFD-공급 마우스에서 VEGF-B의 수준을 감소시키면 중성 지질의 간 함량이 감소됨을 보여준다.
HFD -공급 마우스에서 Vegfb 의 결실은 간 지방증의 발병을 예방한다
HFD-공급 WT, HFD-공급 Vegfb -/- 및 음식-공급 WT 마우스를 분석에 사용하였다. 간을 절개하고, 4% PFA에 24 h 동안 고정한 다음 표준 과정을 사용하여 파라핀 매봉을 위해 가공하고 6μm 절편을 제조하였다. 간략하게, 항원 회복 용액 pH6(Dako #S2367)을 사용하여 항원 회복을 실시하고 98℃에서 10분간 가열하였다. 절편을 일차 항체: 기니 피그 항-아디포필린(Fitzgerald) 또는 기니 피그 항-tip47(Progen) 항체와 함께 4℃에서 밤새 항온처리하였다. 적절한 형광 표지된 이차 항체(Invitrogen, Alexa Fluor)의 첨가 전에 샘플을 비오티닐화 당나귀 항-기니 피그 항체(Jackson)와 함께 RT에서 1시간 동안 항온처리하였다. 각 절편 내에 아디포필린 또는 tip47에 대해 염색된 동물당 적어도 10개 프레임을 20x 배율로 Axio Vision 현미경(Carl Zeiss)으로 촬영하였다. 각 염색의 양을 간 i) 아디포필린 염색(화소2/μm2) 또는 ii) tip47 염색(화소2/μm2)에 대해 Axio Vision Run wizard 프로그램을 사용하여 정량하였다.
음식-공급 WT, HFD-공급 WT 및 HFD-공급 Vegfb -/- 마우스에서 아디포필린 (plin2a)의 발현을 또한 상기한 방법을 사용하여 결정하였다.
도 3은 HFD-공급 Vegfb -/- 마우스의 간에서의 지질 함량이 HFD-공급 WT 마우스에 비해 PAT 단백질, 아디포필린(A, C) 및 만노스-6-포스페이트 수용체 결합 단백질 1(tip47; B)의 발현에 의해 측정되는 바와 같이 5-10배까지 감소됨을 보여준다. VEGF-B 발현 감소는 HFD-공급 WT 마우스에 비해 HFD-공급 Vegfb -/- 마우스에서 더 작은 지방 소립을 갖는 간 형태를 보존한다. 이러한 데이터는 HFD-공급 마우스에서 VEGF-B의 수준 감소가 간 지방증의 발병을 예방하고 VEGF-B 신호전달 경로가 비-알콜성 지방간 질환을 치료하기 위한 적합한 표적임을 나타낸다.
HFD -공급 마우스에서의 Vegfb 의 결실이 간 염증의 발병을 예방한다
HFD-공급 WT, HFD-공급 Vegfb -/- 및 정상 음식-공급 WT 마우스를 분석에 사용하였다. 간을 단리하고 드라이 아이스 상에서 급속 냉동시켰다. 간 생검을 저온유지장치의 몰드 상에 직접 Tissue-Tek®(Sakura)에 매봉하였다. 매봉 후, 12-μm 절편을 제조하고, 빙냉 4% PFA에 후-고정시킨 다음 CD45 또는 F4/80에 대해 면역염색하였다. 간략하게, 절편을 일차 래트 항-CD45(BD bioscience) 및 래트 항-F4/80(Serotec) 항체와 함께 4℃에서 12 h 동안 항온처리하였다. 적합한 형광 표지된 이차 항체(Invitrogen, Alexa fluor)를 적용하고 절편을 RT에서 1 h 동안 추가로 항온처리한 후 이들을 현미경 검사를 위해 준비시켰다. 각 절편 내에 CD45 또는 F4/80에 대해 염색된 동물당 적어도 10개 프레임을 20x 배율로 Axio Vision 현미경(Carl Zeiss)으로 촬영하였다. 각 염색의 양을 간 i) CD45 염색(화소2/μm2) 또는 ii) F4/80 염색(화소2/μm2)에 대해 Axio Vision Run wizard 프로그램을 사용하여 정량하였다.
음식-공급 WT, HFD-공급 WT 및 HFD-공급 Vegfb -/- 마우스에서 단핵구 화학주성인자 단백질-1(mcp1)의 발현을 또한 상기한 방법을 사용하여 결정하였다.
도 4에 도시된 바와 같이, 지방 간에서 염증성 세포군은 HFD-공급에 의해 2-3배까지 증가되었다(도 4A & 4B). 간 염증의 증가는 HFD-공급 마우스에서 mcp1의 상향-조절에 의해 입증되었다(도 4C). 간 지방증 및 염증 세포의 수 둘 다는 VEGF-B의 발현 감소를 갖는 HFD-공급 마우스에서 감소되었다(도 4A-C).
HFD -공급 마우스에서의 Vegfb 의 결실은 NASH 및 NASH 관련 병리학을 감소시킨다
HFD-공급 WT, HFD-공급 Vegfb -/- 및 음식-공급 WT 마우스를 분석에 사용하였다. 간을 절개하고, 4% PFA에 24 h 동안 후-고정한 다음 표준 과정을 사용하여 파라핀 매봉을 위해 가공하였다. 매봉 후, 6-μm 절편을 제조하고 제조자의 지침에 따라 헤마톡실린-에오신(H&E) (Sigma)으로 염색하였다. 각 절편 내에 H&E에 대해 염색된 동물당 적어도 20개 프레임을 40x 배율로 명시야 현미경(Axio Vision microscope, Carl Zeiss)으로 촬영하고, H&E-염색된 절편의 풍선화 간세포, MDB 형성, 염증 병소 및 위성증의 존재에 대해 분석하였다. 스코어링은 H&E-염색된 절편의 각 프레임에서 풍선 세포의 수, MDB 형성/염증 병소 또는 위성증에 기초한다. 각 동물에 대해, H&E 염색된 간 절편에서 모든 확인된 풍선화 간세포, MDB, 염증 병소 및 위성증의 평균을 계산하였다. NASH 총 스코어를 각 그룹 내의 평균의 합으로서 계산하였다.
표 1에서 보여지는 바와 같이, HFD-공급 마우스의 간은 풍선화된 간세포 및 MDB 형성, 및 보다 적은 정도로, 면역 세포 침윤 및 위성증을 나타내었다. HFD-공급 마우스에서 VEGF-B 수준을 감소시키면 이러한 인간 NASH 관련 병리학의 출현이 감소되었다.
도 5는 HFD-공급 마우스에서 VEGF-B 수준을 감소시키면 총 NASH 스코어가 HFD-공급 마우스에 비해 50% 이상까지 감소됨을 보여준다.
Vegfb의 유전적 절제를 갖는 HFD-공급 마우스에서의 간 NASH 스코어

마우스
항목
간세포 풍선화 MDB 염증 병소 위성증
WT 음식 (n=5) 0.1±0.1 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0
WT HFD (n=9) 2.4±0.2#### 0.7±0.1#### 0.4±0.1 0.4±0.1
Vegfb -/- HFD (n=6) 1.1±0.2#### 0.3±0.1* 0.1±0.0 0.0±0.0
결과는 평균 s.e.m.으로서 표현됨. #### 음식-공급 WT에 비해 P<0.0001 및 * HFD-공급 WT 마우스에 비해 P<0.05. 통계 분석은 이원 ANOVA를 사용하여 수행하였다.
실시예 2: 중화 항- VEGF -B 항체는 비알콜성 지방간 질환( NAFLD ) 및 비알콜성 지방간염(NASH)의 진행을 치료하거나 예방한다
VEGF -B의 항체- 매개된 억제는 HFD -공급 마우스에서 간 기능에 보통의 영향을 미친다
5주령 C57BL/6 야생형(WT)에게 30주 동안 고지방식(지방으로부터 60% 열량)을 공급하였다. 연령 및 성별 일치된 C57BL/6 WT 마우스에게 30주 동안 저지방 대조식(정상적인 음식, 지방으로부터 10% 열량)을 공급하였다. 항체 처리는 11주에 시작하였으며 마우스에게 20주 동안 400μg 2H10(중화 항-VEGF-B 항체) 또는 이소형-일치된 대조 항체를 매주 2회 복강내 주사하였다. 마우스의 식후 혈당 수준을 2시간의 음식 제거 후 격주로 모니터링하였다. 꼬리 정맥으로부터 채혈한 혈액에서 Bayer Contour 혈당 미터를 사용하여 혈당 측정을 실시하였다. 종점 혈청 아미노트랜스퍼라제(ALAT) 수준을 측정하였다.
도 6A 및 B는 항체 2H10으로 치료학적으로 처리된 HFD-공급 마우스의 혈당 수준 및 체중을 보여준다.
도 6C 및 D는 항체 2H10으로 치료학적으로 처리된 HFD-공급 마우스의 간 중량 및 간 중량과 체중의 비를 보여준다.
도 6D는 항체 2H10으로 치료학적으로 처리된 HFD-공급 마우스의 ALAT 수준의 혈청 분석을 보여준다.
이러한 데이터는 항-VEGF-B 항체 처리(2H10)를 사용하여 VEGF-B 수준을 감소시키면 HFD-공급으로 인한 간 기능의 감소를 예방할 수 있음을 시사한다.
( 2H10을 사용한) 치료학적 항- VEGF -B 처리는 HFD -공급 마우스에서 간 지질 축적을 감소시킨다
오일 레드 O(ORO) 분석을 20주 동안 2H10 또는 이소형-일치된 대조 항체로 처리된 30주령 음식-공급 WT 및 HFD-공급 마우스로부터 단리된 간에서 수행하였다. 간을 수집하고, 드라이 아이스 상에서 급속 냉동시키고, 저온유지장치의 몰드 상에 직접 Tissue-Tek®(Sakura)에 매봉하였다. 동결절편(12μm)을 ORO 작동 용액(400ml 99% 이소프로판올에 용해시키고, H2O 중에서 6:10로 추가로 희석시키며, 22μm 필터(Corning)를 통해 여과시킨 2.5g ORO(Sigma-Aldrich))에 5분간 담구었다. 그후, 절편을 헤마톡실린 용액에 3초간 침지시킨 다음 이들을 설치하기 전에 LiCO3에 침지시키고 흐르는 수돗물 하에 10분간 헹구었다. 염색된 절편을 명시야 현미경으로 검사하였다. 각 절편 내에 ORO 및 헤마톡실린에 대해 염색된 동물당 적어도 10개 프레임을 20x 배율로 Axio Vision 현미경(Carl Zeiss)으로 촬영하였다. 지방 소립의 양을 간 ORO 염색(화소2/μm2)에 대해 Axio Vision Run wizard 프로그램을 사용하여 정량하였다.
지방산 합성효소(fasn)의 발현을 또한 상기한 방법을 사용하여 결정하였다.
도 7에 도시된 바와 같이, ORO 염색의 양은 항-VEGF-B 항체 처리를 제공받은 HFD-공급 마우스에서 감소되었다. 이러한 데이터 및 염색된 절편의 분석은 지방 소립의 수와 크기 둘 다가 항-VEGF-B 항체로 처리한 HFD-공급 마우스에서 감소되었으며 HFD-공급 마우스에서 2H10의 투여가 중성 지질의 간 축적을 보호한다는 것을 나타낸다.
( 2H10을 사용한) 치료학적 항- VEGF -B 처리는 간 지방증의 발병을 예방한다
20주 동안 2H10 또는 이소형-일치된 대조 항체로 처리된 30주령 HFD-공급 마우스로부터의 간을 수집하고, 4% PFA에서 24시간 동안 고정시키고, 매봉시키며, 6μm 절편을 면역염색을 위해 제조하였다. 간략하게, 항원 회복 용액 pH6(Dako #S2367)을 사용하여 항원 회복을 수행하고 98℃에서 10분간 가열하였다. 절편을 일차 항체: 기니 피그 항-아디포필린(Fitzgerald) 및 기니 피그 항-tip47(Progen) 항체와 함께 4℃에서 밤새 항온처리하였다. 적절한 형광 표지된 이차 항체(Invitrogen, Alexa Fluor)의 첨가 전에 샘플을 비오티닐화 당나귀 항-기니 피그 항체(Jackson)와 함께 RT에서 1시간 동안 항온처리하였다. 각 절편 내에 아디포필린 또는 tip47에 대해 염색된 동물당 적어도 10개 프레임을 20x 배율로 Axio Vision 현미경(Carl Zeiss)으로 촬영하였다. 각 염색의 양을 간 i) 아디포필린 염색(화소2/μm2) 또는 ii) tip47 염색(화소2/μm2)에 대해 Axio Vision Run wizard 프로그램을 사용하여 정량하였다.
아디포필린(plin2a)의 발현을 또한 상기 방법을 사용하여 결정하였다.
도 8은 HFD-공급 마우스에서, 2H10을 사용한 항-VEGF-B 항체 처리가 지방 간에서 PAT 단백질의 발현을 감소시켰음을 보여준다. 항-VEGF-B 항체 처리는 간 지질 함량을 음식-공급 WT 및 HFD-공급 Vegfb -/- 마우스에서 수득된 것과 유사한 수준으로 감소시켰다. 간 지방증의 발병에 대한 영향은 HFD-공급 마우스에서 2H10 처리가 plin2의 mRNA 전사체 수준을 감소시킴에 따라 간 발현 분석에 의해 입증되었다.
( 2H10을 사용한) 치료학적 항- VEGF -B 처리는 HFD -공급 마우스에서 간 염증의 발병을 예방한다
20주 동안 2H10 또는 이소형-일치된 대조 항체로 처리된 30주령 HFD-공급 마우스로부터의 간을 수집하고, 드라이 아이스 상에서 급속 냉동시키고, 저온유지장치의 몰드 상에 직접 Tissue-Tek®(Sakura)에 매봉하였다. 매봉 후, 12-μm 절편을 제조하고, 10분간 빙냉 4% PFA에 후-고정시킨 다음 CD45 또는 F4/80에 대해 면역염색하였다. 간략하게, 절편을 일차 래트 항-CD45(BD bioscience) 및 래트 항-F4/80(Serotec) 항체와 함께 4℃에서 12 h 동안 항온처리하였다. 적합한 형광 표지된 이차 항체(Invitrogen, Alexa fluor)를 적용하고 절편을 RT에서 1 h 동안 추가로 항온처리한 후 이들을 현미경 검사를 위해 준비시켰다. 각 절편 내에 CD45 또는 F4/80에 대해 염색된 동물당 적어도 10개 프레임을 20x 배율로 Axio Vision 현미경(Carl Zeiss)으로 촬영하였다. 각 염색의 양을 간 i) CD45 염색(화소2/μm2) 또는 ii) F4/80 염색(화소2/μm2)에 대해 Axio Vision Run wizard 프로그램을 사용하여 정량하였다.
단핵구 화학주성인자 단백질-1(mcp1)의 발현을 또한 상기한 방법을 사용하여 결정하였다.
도 9는 항-VEGF 항체로 치료학적으로 처리된 HFD-공급 마우스의 간에서 CD45(A)의 수준 및 F4/80(B) 수준의 감소를 보여준다. HFD-공급 마우스를 항-VEGF-B 항체 2H10으로 처리하면 간 염증 세포의 수가 음식-공급 WT 및 HFD-공급 Vegfb -/- 마우스와 유사한 수준으로 감소되었다. mcp1의 발현 수준도 항-VEGF-B 항체 처리에 의해 감소되었다. 따라서, 이러한 데이터는 항-VEGF-B 항체로의 치료학적 처리가 NASH에서 주요 병리학의 발병을 예방한다는 것을 나타낸다.
( 2H10을 사용한) 치료학적 항- VEGF -B 처리는 NASH 및 NASH 관련 병리학을 감소시킨다
20주 동안 2H10 또는 이소형-일치된 대조 항체로 처리된 30주령 HFD-공급 마우스로부터의 간을 수집하고, 4% PFA에 24 h 동안 고정하고, 매봉하고, 6μm 절편을 제조하고, 제조자의 지침에 따라 헤마톡실린-에오신(H&E) (Sigma)으로 염색하였다. 각 절편 내에 H&E에 대해 염색된 동물당 적어도 20개 프레임을 40x 배율로 명시야 현미경(Axio Vision microscope, Carl Zeiss)으로 촬영하였다. 각 동물에 대해, H&E 염색된 간 절편에서 모든 확인된 풍선화 간세포, MDB, 염증 병소 및 위성증의 평균을 계산하였다. NASH 총 스코어를 각 그룹 내의 평균의 합으로서 계산하였다.
표 2에 보여지는 바와 같이, HFD-공급 마우스의 간은 풍선화된 간세포, MDB 형성, 및 보다 적은 정도로, 면역 세포 침윤 및 위성증을 나타내었다. 항-VEGF-B 항체로의 치료학적 처리는 이러한 인간 NASH 관련 병리학의 출현을 감소시켰다.
도 10은 2H10 항체 처리를 사용한 HFD-공급 마우스에서의 VEGF-B 수준 감소가 총 NASH 스코어를 50% 이상까지 감소시켰음을 보여준다.
2H10 또는 대조 항체로 처리한 HFD-공급 마우스에서의 간 NASH 스코어

마우스
항목
간세포 풍선화 MDB 염증 병소 위성증
WT 음식 (n=5) 0.1±0.1 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0
대조 HFD (n=9) 2.4±0.2#### 0.7±0.1#### 0.4±0.1 0.4±0.1
항-VEGF-B HFD (n=9) 1.2±0.2#### 0.3±0.1* 0.2±0.0 0.1±0.0
결과는 평균 s.e.m.으로서 표현됨. #### 음식-공급 WT 동물에 비해 P<0.0001 및 * 대조 처리된 HFD-공급 WT 마우스에 비해 P<0.05. 통계 분석은 이원 ANOVA를 사용하여 수행하였다.
실시예 3: 단기 콜린-결핍 고지방식(CD) 중인 VEGF -B 결핍 마우스는 비알콜성 지방간 질환(NAFLD) 및 비알콜성 지방간염(NASH)의 발병에 내성이 있다
Vegfb 결실은 포도당 및 인슐린 민감성을 증가시킨다
5주령 수컷 C57BL/6 마우스 및 연령 일치된 Vegfb +/- 및 Vegfb -/- 마우스에게 콜린-결핍 고지방식(CD)(Research Diets; D05010402)을 5개월 동안 공급하였다(CD5). 체중(BW) 및 혈당(BG) 수준을 시험 동안 기록하였다. BG 기록 전 2시간 동안 음식을 제거하였다. 포도당 측정은 꼬리 정맥으로부터 채혈한 혈액에서 Bayer Contour 혈당 미터를 사용하여 수행하였다. 복강내 포도당 내성 시험(IPGTT) 및 복강내 인슐린 내성 시험(IPITT)은 비공복 마우스 또는 실험하기 2h 전에 음식을 제거한 마우스에서 CD-식으로 17주 후에 수행하였다. 내성 시험을 위해 동물에게 BW g 당 1mg 포도당(IPGTT) 및 BW g 당 0.75 mU 인슐린(IPITT)을 복강내 주사하였다.
단기 CD는 C57BL/6 마우스에서 증가된 체중 증가, 혈당 수준, 포도당 불내성 및 인슐린 내성을 야기하였다. CD 식이 중인 C57BL/6 마우스에서 Vegfb의 절제는 체중 또는 고혈당증의 발병을 변화시키지 않았다. 그러나, 유전적 수단에 의해 CD 식이 중인 C57BL/6 마우스에서 VEGF-B 수준을 감소시키면 포도당 내성 및 인슐린 민감성에는 약간의 효과를 갖지만, 고혈당증을 표적으로 하지는 않았다.
도 11은 Vegfb의 결실이 단기 콜린-결핍 고지방식(CD) 중인 마우스에서 체중 (A) 또는 식후 혈당 수준 (A)에는 영향을 미치지 않았지만 포도당 및 인슐린 민감성(B 및 C)은 증가시켰음을 보여준다.
Vegfb 의 결실은 간 손상으로부터 보호한다
C57BL/6, Vegfb -/- 및 Vegfb +/- CD 공급된 마우스를 분석에 사용하였다. 간을 절개하고 칭량하며 심장 천자에 의해 전체 혈액을 제거하였다. 혈액을 4℃에서 10분간 14000rpm에서 원심분리하고, 혈청을 분리하고 -80℃에서 분취량으로 동결시켰다. 알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALAT) 혈청 수준은 스웨덴 웁살라에 소재하는 스웨덴 농업과학 대학(the Swedish University of Agricultural Science)에서 분석하였다.
단기 CD 유도된 간 손상 및 혈청 ALAT 수준은 Vegfb +/- 및 Vegfb -/- 마우스에 비해 WT 마우스에서 증가되었다.
도 12A는 단기 CD 식이 중인 마우스에서의 Vegfb의 결실이 간 중량 또는 간 중량/체중 비에는 영향을 미치지 않았음을 보여준다.
도 12B는 혈청 ALAT 수준이 CD-공급 WT 마우스에서 증가된 반면, VEGF-B가 결핍된 CD-공급 마우스는 연령-일치된 CD-공급 WT 마우스에 비해 감소된 혈청 ALAT 수준을 가졌음을 보여준다.
이러한 데이터는 CD-공급 마우스에서 Vegfb의 절제가 고혈당증을 표적으로 하지 않으면서 간 손상을 감소시킴을 입증한다.
Vegfb 의 결실은 간 지질 축적을 감소시킨다
C57BL/6, Vegfb -/- 및 Vegfb +/- CD 공급 마우스를 분석에 사용하였다. 간을 절개하고 급속-냉동시키고 심장 천자에 의해 전체 혈액을 제거하였다. 혈액을 4℃에서 10분간 14000rpm에서 원심분리하고, 혈청을 분리하여 -80℃에서 분취량으로 동결시켰다.
오일 레드 O(ORO) 분석을 단리된 간에서 수행하였다. 간략하게, 간 생검을 저온유지장치의 몰드 상에 직접 Tissue-Tek®(Sakura)에 매봉하였다. 동결절편(12μm)을 오일 레드 O 작동 용액(400ml 99% 이소프로판올에 용해시키고, H2O 중에서 6:10로 추가로 희석시키며, 22μm 필터(Corning)를 통해 여과시킨 2.5g 오일 레드 O(ORO: Sigma-Aldrich))에 5분간 담구었다. 그후, 절편을 헤마톡실린 용액에 3초간 침지시킨 다음 이들을 설치하기 전에 LiCO3에 짧게 침지시키고 흐르는 수돗물 하에 10분간 헹구었다. 염색된 절편을 명시야 현미경으로 검사하였다. 각 절편 내에 ORO 및 헤마톡실린에 대해 염색된 동물당 적어도 10개 프레임을 20x 배율로 Axio Vision 현미경(Carl Zeiss)으로 촬영하였다. 지방 소립의 양을 간 ORO 염색(화소2/μm2)에 대해 Axio Vision Run wizard 프로그램을 사용하여 정량하였다.
상업적으로 이용 가능한 키트를 비-에스테르화 지방산(NEFAs; Wako Chemicals), 베타-하이드록시부티레이트(Stanbio Laboratories) 및 트리글리세라이드(Sigma-Aldrich)의 효소적 측정을 위해 사용하였다.
단기 CD는 C57BL/6 마우스에서 비-알콜성 지방산 간 질환(NAFLD)의 발병을 야기하였다. CD 식이는 ORO 분석에 의해 검출되는 바와 같은 중성 지질의 간 함량의 극적인 증가, 및 수반되는 간 기능의 감소를 유도하였다(도 12). CD 식이 중인 C57BL/6 마우스에서 Vegfb의 유전적 절제는 간 지질 축적을 감소시켰다. 지방 소립은 수 및 크기 둘 다에서 감소되었다. 단기 CD는 이상지질혈증을 야기하였으며 VEGF-B 수준 감소는 케톤체(KB), NEFA 및 트리글리세라이드(TG)의 혈장 수준을 감소시켰다.
도 13은 Vegfb의 결실이 단기 CD 식이 중인 마우스에서 간 지질 축적을 감소시켰고 간 지방증을 표적화하였음을 보여준다.
Vegfb 의 결실은 간 염증의 발병을 예방한다
C57BL/6, Vegfb -/- 및 Vegfb +/- CD 공급 마우스를 분석에 사용하였다. 간 생검을 저온유지장치의 몰드 상에 직접 Tissue-Tek®(Sakura)에 매봉하였다. 매봉 후, 12-μm 절편을 제조하고, 빙냉 4% PFA에 후-고정시킨 다음 CD45 또는 F4/80에 대해 면역염색하였다. 간략하게, 절편을 일차 래트 항-CD45(BD bioscience) 및 래트 항-F4/80(Serotec) 항체와 함께 4℃에서 12 h 동안 항온처리하였다. 적합한 형광 표지된 이차 항체(Invitrogen, Alexa fluor)를 적용하고 절편을 RT에서 1 h 동안 추가로 항온처리한 후 이들을 현미경 검사를 위해 준비시켰다. 각 절편 내에 CD45 또는 F4/80에 대해 염색된 동물당 적어도 10개 프레임을 20x 배율로 Axio Vision 현미경(Carl Zeiss)으로 촬영하였다. 각 염색의 양을 간 i) CD45 염색(화소2/μm2) 또는 ii) F4/80 염색(화소2/μm2)에 대해 Axio Vision Run wizard 프로그램을 사용하여 정량하였다.
단기 CD를 사용하여, C57BL/6 마우스에서 모든 범위의 비-알콜성 지방간염 질환(NASH) 즉, 비정상적인 간 지질 축적 및 염증을 유도할 수 있다. 간 지방증(도 13 및 14) 및 염증 세포의 수 둘 다는 CD 식이 중인 Vegfb의 동형접합성 또는 이형접합성 절제를 갖는 마우스에서 감소되었다. 이러한 데이터는 VEGF-B 신호전달을 감소시키는 것을 이용하여 NASH에서 주요 병리학의 발병을 예방할 수 있음을 시사한다.
도 14는 단기 CD 식이 중인 마우스에서 Vegfb의 결실이 감소된 CD45 및 F4/80 발현에 의해 나타내어지는 바와 같이 간 염증의 발병을 예방하였음을 보여준다.
실시예 4: 중화 항- VEGF -B 항체는 단기 콜린-결핍 고지방식(CD) 중인 마우스에서 비알콜성 지방간 질환( NAFLD ) 및 비알콜성 지방간염(NASH)의 진행을 치료하거나 예방한다
( 2H10을 사용한) 치료학적 항- VEGF -B 처리는 체중, 혈당 수준, 포도당 내성 또는 인슐린 민감성에 영향을 미치지 않는다
5주령 수컷 C57BL/6 마우스에게 5개월간 CD 식이(Research Diets; D05010402)를 공급하였다. 항체 처리는 12주에 시작하였으며 마우스를 10주간 2H10 또는 이소형-일치된 대조 항체로 처리하였다. 동물에게 80μg 용량의 항-VEGF-B 항체를 매주 2회 복강내(i.p.) 주사하였다. 연구는 또한 연령 및 성별 일치된 음식-공급 WT 마우스를 포함하였다. BW 및 BG 수준을 시험 동안 기록하였다. BG 기록 전 2 h 동안 음식을 제거하였다. 포도당 측정은 꼬리 정맥으로부터 채혈한 혈액에서 Bayer Contour 혈당 미터를 사용하여 수행하였다. IPGTT 및 IPITT는 비공복 마우스 또는 실험하기 2h 전에 음식을 제거한 마우스에서 CD-식으로 17주 후에 수행하였다. 내성 시험을 위해 동물에게 BW g 당 1mg 포도당(IPGTT) 및 BW g 당 0.75 mU 인슐린(IPITT)을 복강내 주사하였다.
항-VEGF-B 처리는 단기 CD에서 체중 또는 포도당 및 인슐린 민감성에 영향을 미치지 않았다. 이러한 데이터는 Vegfb -/- 마우스 및 WT 마우스에 비해 CD 식이-공급 Vegfb +/-에서 관찰된 개선된 포도당 내성 및 인슐린 민감성은 Vegfb -/- 마우스 모델과 관련된 발달상 효과에 연관될 수 있음을 나타낸다.
도 15는 (2H10를 사용한) 단기 CD 식이 중인 마우스에서 항-VEGF-B 처리가 (A) 체중, 혈당 수준, (B) 포도당 내성 또는 (C) 인슐린 민감성에 영향을 미치지 않았음을 보여준다.
( 2H10을 사용한) 치료학적 항- VEGF -B 처리는 간 기능을 개선시킨다
5주령 수컷 C57BL/6 마우스에게 5개월간 CD 식이(Research Diets; D05010402)를 공급하였다. 항체 처리는 12주에 시작하였으며 마우스를 10주간 2H10 또는 이소형-일치된 대조 항체로 처리하였다. 동물에게 80μg 용량의 항-VEGF-B 항체를 매주 2회 복강내(i.p.) 주사하였다. 연구는 또한 연령 및 성별 일치된 음식-공급 WT 마우스를 포함하였다. 동물을 이소플루오란 마취제로 희생시키고, 간을 절개하고 칭량하며 심장 천자에 의해 전체 혈액을 제거하였다. 혈액을 4℃에서 10분간 14000rpm에서 원심분리시키고, 혈청을 분리하여 -80℃에서 분취량으로 동결시켰다. ALAT 혈청 수준을 웁살라에 소재하는 스웨덴 농업과학 대학(the Swedish University of Agricultural Science)에서 분석하였다.
2H10 요법은 단기 CD 식이 중인 항-VEGF-B 처리된 C57BL/6 마우스에서, 감소된 혈청 ALAT 수준에 의해 측정되는 바와 같이, 간 손상을 예방하였다.
도 16은 (2H10을 사용한) 단기 CD 식이 중인 마우스에서의 항-VEGF-B 처리가 간 중량 및 간 중량과 체중의 비(A) 및 ALAT 수준의 혈청 분석(B)에 의해 나타내어지는 바와 같이 간 기능을 개선시켰음을 보여준다.
( 2H10을 사용한) 치료학적 항- VEGF -B 처리는 간 지질 축적을 감소시킨다
CD-공급 C57BL/6 마우스 및 연령과 성별 일치된 음식-공급 WT를 분석에 사용하였다. 동물에게 상기한 바와 같은 2H10 또는 이소형-일치된 대조 항체 처리를 제공하였다.
오일 레드 O(ORO) 분석을 이전에 기술된 바와 같이 단리된 간에서 실시하였다. 단기 CD 중인 C57BL/6 마우스에서 2H10을 사용하여 VEGF-B 수준을 감소시킴으로써, 간 지방증이 감소되었고 지방 소립이 수와 크기 둘 다에서 감소되었다.
단리된 혈청에서 비-에스테르화 지방산(NEFAs; Wako Chemicals), 베타-하이드록시부티레이트(Stanbio Laboratories) 및 트리글리세라이드(Sigma-Aldrich)의 효소적 측정을 위해 상업적으로 이용 가능한 키트를 사용하였다. 항-VEGF-B 요법은 CD 식이 중인 마우스에서 케톤(KB), 비-에스테르화 지방산(NEFA) 및 트리글리세라이드(TG)의 혈장 수준을 정상화시켰다.
도 17은 단기 CD 식이 중인 C57BL/6 마우스에서 (2H10을 사용한) 항-VEGF-B 처리가 간 지질 축적을 감소시켰음을 보여준다.
( 2H10을 사용한) 치료학적 항- VEGF -B 처리는 간 지방증의 발병을 예방한다
CD-공급 C57BL/6 마우스 및 연령과 성별 일치된 음식-공급 WT를 분석에 사용하였다. 동물에게 상기한 바와 같은 2H10 또는 이소형-일치된 대조 항체 처리를 제공하였다.
면역염색을 단리된 간에 대해 실시하였다. 간략하게, 동물을 이소플루오란 마취제로 희생시키고, 간을 절개하고 4% PFA에서 24시간 동안 고정시킨 다음 표준 과정을 사용하여 파라핀 매봉을 위해 가공하고 6μm 절편을 제조하였다. 항원 회복 용액 Ph6(Dako #S2367)을 사용하고 98℃에서 10분간 가열하여 항원 회복을 수행하였다. 절편을 기니 피그 항-아디포필린(Fitzgerald)과 함께 4℃에서 밤새 항원처리하였다. 적절한 형광 표지된 이차 항체(Invitrogen, Alexa Fluor)의 첨가 전에 샘플을 비오티닐화 당나귀 항-기니 피그 항체(Jackson)와 함께 RT에서 1시간 동안 항온처리하였다. 각 절편 내에 아디포필린 또는 tip47에 대해 염색된 동물당 적어도 10개 프레임을 20x 배율로 Axio Vision 현미경(Carl Zeiss)으로 촬영하였다. 각 염색의 양을 간 아디포필린 염색(화소2/μm2)에 대해 Axio Vision Run wizard 프로그램을 사용하여 정량하였다.
단기 CD 중인 C57BL/6 마우스에서 2H10을 사용하여 VEGF-B 수준을 감소시킴으로써 간 지방증 및 NASH의 발병이 예방되었다. 항-VEGF-B 항체 처리는 CD 식이 중인 대조 처리된 마우스와 비교하여 간 지질 함량을 50% 초과까지 감소시켰다.
도 18은 (2H10을 사용한) 단기 CD 식이 중인 C57BL/6 마우스에서 항-VEGF-B 처리가 간 아디포필린 발현 감소에 의해 나타내어지는 바와 같이 간 지방증의 발병을 예방하였음을 보여준다.
( 2H10을 사용한) 치료학적 항- VEGF -B 처리는 간 염증의 발병을 예방한다
CD-공급 C57BL/6 마우스 및 연령과 성별 일치된 음식-공급 WT를 분석에 사용하였다. 동물에게 상기한 바와 같은 2H10 또는 이소형-일치된 대조 항체 처리를 제공하였다.
면역염색을 단리된 간에 대해 실시하였다. 간략하게, 동물을 이소플루오란 마취제로 희생시키고, 간을 절개하고 드라이 아이스 상에서 급속 냉장시켰다. 간 생검을 저온유지장치의 몰드 상에 직접 Tissue-Tek®(Sakura)에 매봉하였다. 매봉 후, 12-μm 절편을 제조하고, 빙냉 4% PFA에 10분간 후-고정시킨 다음 CD45 또는 F4/80에 대해 면역염색하였다. 간략하게, 절편을 일차 래트 항-CD45(BD bioscience) 및 래트 항-F4/80(Serotec) 항체와 함께 4℃에서 12 h 동안 항온처리하였다. 적합한 형광 표지된 이차 항체(Invitrogen, Alexa fluor)를 적용하고 절편을 RT에서 1 h 동안 추가로 항온처리한 후 이들을 현미경 검사를 위해 준비시켰다. 각 절편 내에 CD45 또는 F4/80에 대해 염색된 동물당 적어도 10개 프레임을 20x 배율로 Axio Vision 현미경(Carl Zeiss)으로 촬영하였다. 각 염색의 양을 간 i) CD45 염색(화소2/μm2) 또는 ii) F4/80 염색(화소2/μm2)에 대해 Axio Vision Run wizard 프로그램을 사용하여 정량하였다.
CD 식이 중인 마우스에서 항-VEGF-B 요법으로서 2H10을 사용하면 간 염증 세포의 양이 음식-공급 마우스에서와 유사한 수준으로 감소되었다. 이러한 데이터는 (2H10 처리를 사용하여) VEGF-B 신호전달을 감소시키는 것이 NASH의 발병에 있어서 염증 단계를 표적화하는데 사용될 수 있음을 나타낸다.
도 19는 (2H10을 사용한) 단기 CD 식이 중인 마우스에서 항-VEGF-B 처리가 (A) CD45 및 (B) F4/80 발현의 감소에 의해 나타내어지는 바와 같이 간 염증의 발병을 예방함을 보여준다.
( 2H10을 사용한) 치료학적 항- VEGF -B 처리는 경증 간 섬유증의 발병을 예방한다
CD-공급 C57BL/6 마우스 및 연령과 성별 일치된 음식-공급 WT를 분석에 사용하였다. 동물에게 상기한 바와 같은 2H10 또는 이소형-일치된 대조 항체 처리를 제공하였다.
Masson 트리크롬 염색을 단리된 간에서 수행하였다. 간략하게, 동물을 이소플루오란 마취제로 희생시켰다. 간을 절개하고 4% PFA에 24 h 동안 후-고정시킨 다음 표준 과정을 사용하여 파라핀 매봉을 위해 가공하였다. 매봉 후, 6-μm 절편을 제조하고 제조자의 지침에 따라 Masson 트리크롬(MT)(Sigma)으로 염색하였다. 각 절편 내에 MT에 대해 염색된 동물당 적어도 20개 프레임을 20x 배율에서 명시야 현미경(Axio Vision microscope, Carl Zeiss)으로 촬영하였다. 섬유증의 양을 간 i) MT+ 염색(화소2/μm2)에 대해 Axio Vision Run wizard 프로그램을 사용하여 정량하였다.
단기 CD를 사용하여 섬유화 NASH를 유도할 수 있다. 섬유화 NASH는 NASH의 보다 진행된 상태로서 간주되며, 간경변 및 간-관련 사망률의 주요 원인이다. CD 식이는, 유조직에서 검출되고, 몇몇 경우에 또한 간 소엽 전반에 걸쳐 "브릿징" 패턴으로 존재하는 섬유증과 함께, 정상적인 세포외 기질(ECM) 용착을 가리키는, 혈관벽에서 입증되는 경증 간 섬유증을 유도하였다. CD 식이 중인 마우스에서 2H10을 사용하여 VEGF-B 수준을 감소시키면 섬유증의 발병이 감소되었으며, 이는 항-VEGF-B 요법이 섬유화 NASH의 치료에 사용될 수 있음을 시사한다.
도 20은 (2H10을 사용한) 단기 CD 식이 중인 마우스에서의 항-VEGF-B 처리가 간 절편의 Masson 트리크롬 염색을 사용한 섬유증의 발병을 예방함을 보여준다.
( 2H10을 사용한) 치료학적 항- VEGF -B 처리는 NASH 및 NASH 관련 병리학을 감소시킨다
CD-공급 C57BL/6 마우스 및 연령과 성별 일치된 음식-공급 WT를 분석에 사용하였다. 동물에게 상기한 바와 같은 2H10 또는 이소형-일치된 대조 항체 처리를 제공하였다.
간을 절개하고, 4% PFA에 24 h 동안 후-고정시킨 다음 표준 과정을 사용하여 파라핀 매봉을 위해 가공하였다. 매봉 후, 6-μm 절편을 제조하고 제조자의 지침에 따라 헤마톡실린-에오신(H&E)(Sigma)으로 염색하였다. 각 절편 내에 H&E에 대해 염색된 동물당 적어도 20개 프레임을 20x 배율에서 명시야 현미경(Axio Vision microscope, Carl Zeiss)으로 촬영하고 간세포의 퇴행, MDB 형성, 염증 병소 및 위성증의 존재에 대해 분석하였다. 총 스코어는 H&E 염색된 간 절편에서 모든 확인된 풍선화 간세포, MBD, 염증 병소 및 위성증의 양이다.
표 3에 나타낸 바와 같이, CD-공급 마우스의 간은 간세포의 풍선화, 멜러리-덴크체의 형성, 염증 병소 및 위성증과 같은 인간 NASH의 특징 중의 몇 가지를 나타내었다. 항-VEGF-B 항체로의 치료학적 처리는 이러한 인간 NASH 관련 병리학의 출현을 감소시켰다.
도 21은 2H10 항체 처리를 사용하여 CD-공급 마우스에서 VEGF-B 수준을 감소시키는 것이 총 NASH 스코어를 50% 초과까지 감소시켰음을 보여준다.
2H10 또는 대조 항체로 처리된 단기 CD 식이 중인 마우스에서의 간 NASH 스코어
마우스 항목
간세포 풍선화
MDB 염증 병소 위성증
음식-공급 WT 0,2±0 0.1±0.0 0.1±0.0 0.1±0.0
대조 CD 식이 3.2±0.3#### 0.6±0.2# 1.2±0.1#### 0.4±0.1#
항-VEGF-B CD 식이 1.2±0.2**** 0.3±0.1* 0.2±0.1*** 0.1±0.0
결과는 평균 s.e.m.으로서 표현됨. 통계 분석은 일원 ANOVA를 사용하여 수행하였다. 음식-공급 WT에 비해 #P<0.05, ###P<0.001, ####P<0.0001. CD 식이 중인 대조 처리된 마우스에 비해 *P<0.05, ***P<0.001, ****P<0.0001. 동물 숫자는 음식-공급 WT(n=5), CD 식이 중인 대조 처리 마우스(n=8) 및 CD 식이 중인 항-VEGF-B 처리된 마우스 (n=7)에 대한 것이었다.
실시예 5: 중화 항- VEGF -B 항체는 장기 CD 식이 중인 마우스에서 비알콜성 지방간 질환(NAFLD) 및 비알콜성 지방간염(NASH)의 진행을 치료하거나 예방한다
( 2H10을 사용한) 치료학적 항- VEGF -B 처리는 체중, 식후 혈당 수준, 포도당 내성 또는 인슐린 민감성에 영향을 주지 않는다
5주령 수컷 C57BL/6 마우스에게 12개월간 CD 식이(Research Diets; D05010402)를 공급하였다(CD12). 항체 처리는 32주령에서 시작하였으며 마우스를 20주간 2H10 또는 이소형-일치된 대조 항체로 처리하였다. 동물에게 80μg 용량의 항-VEGF-B 항체를 매주 2회 복강내(i.p.) 주사하였다. 연구는 또한 연령 및 성별 일치된 음식-공급 WT를 포함하였다. BW 및 BG 수준을 시험 동안 기록하였다. BG 기록 전 2 h 동안 음식을 제거하였다. 포도당 측정은 꼬리 정맥으로부터 채혈한 혈액에서 Bayer Contour 혈당 미터를 사용하여 수행하였다. IPGTT 및 IPITT는 비공복 마우스 또는 실험하기 2h 전에 음식을 제거한 마우스에서 CD-식으로 17주 후에 수행하였다. 내성 시험을 위해 동물에게 BW g 당 1mg 포도당(IPGTT) 및 BW g 당 0.75 mU 인슐린(IPITT)을 복강내 주사하였다.
도 22에 도시된 바와 같이, 항-VEGF-B 처리는 C57BL/6 마우스에서 장기 CD 식이에 의해 체중(A) 또는 포도당 및 인슐린 민감성(B 및 C)에 영향을 미치지 않았다.
( 2H10을 사용한) 치료학적 항- VEGF -B 처리는 간 기능을 개선시키고 간세포 암종의 발병을 개량한다
12개월 CD-공급 C57BL/6 마우스 및 연령과 성별 일치된 음식-공급 WT를 분석에 사용하였다. 동물에게 상기한 바와 같은 2H10 또는 이소형-일치된 대조 항체 처리를 제공하였다.
자기 공명 이미징(MRI) 데이터는 40mm의 내부 직경을 갖는 millipede 송신/수신 볼륨 코일(Agilent, Yarnton, UK)이 장착된 수평 보어(horizontal bore), 9.4 T 스캐너(Agilent, Yarnton, UK)를 사용하여 획득하였다. MRI 분석을 위해, 동물에게 조영제, Primovist를 주사하였다. 250mM Primovist 용액(Bayer Pharma, Berlin, Germany)을 염수(9mg/ml)를 사용하여 12.5mM로 되도록 희석시켰다. 체중 그램당 2ul의 농축괴를, 등중심(isocenter)에 위치시킨 채로, 보어 근처에 배치된 주입 펌프에 연결된 2m 폴리에틸렌(PE-20) 호스를 통해 연결된 카테터로 꼬리 정맥을 통해 마우스에 전달하였다. MRI 스캐닝의 경우, 지방-포화를 갖는 T1-강조 영상(고속 스핀 에코 데이터 etl 4, kzero=1 매트릭스 256x192, 에코까지의 유효 시간=7.01 ms, 1 mm 두께의 30개 인접 슬라이스, 시야 35.2x26.4 mm2. 15개 슬라이스를 각 만료 기간에 연속해서 자극하여, 호흡 기간의 두 배의 회복 시간을 초래하였다. 호흡 기간은 750-950 ms이었으며 이소플루란 수준 (1.6-2.5%)에 의해 조절되었다. 각 3d 데이터세트는 획득하는데 대략 1.5 min이 소요되었다. 볼러스(bolus) 전에 하나의 데이터세트를 획득한 다음 볼러스 이후 5개 연속 데이터세트를 획득하였다. 건강한 간의 강도는 조영제에 의해 3분내에 증가된 반면 종양으로부터의 강도는 조영제에 의해 강화되지 않았으며 종양은 조영 후 저강도(hypointense)를 보였다.
MRI 분석 후, 동물을 이소플루오란 마취제로 희생시키고, 간을 절개하고 칭량하며 심장 천자에 의해 전체 혈액을 제거하였다.
장기간 CD는 C57BL/6 마우스에서 간 비대, 저하된 간 기능 및 간세포 암종 발병을 초래하였다. 가돌리늄-강화 조영 스캔과 함께 MRI가 간 종양을 가시화하는데 사용될 수 있다. 간에서 종양 발병이 가장 풍부한 부위는 꼬리돌기 및 우측엽이었다. 12개월 CD 식이 후, 대조군 Ig-처리된 C57BL/6 마우스의 50%가 간세포 암종을 발병하였으며, 2H10 처리된 마우스에서는 종양이 검출되지 않았다. 게다가, 항-VEGF-B 요법은 비대를 예방하고 간 기능을 개선시켰으며, 이는 항-VEGF-B 요법이 간세포 암종의 발병을 예방하는데 사용될 수 있음을 시사한다.
도 23은 항-VEGF-B 처리가 간 기능을 개선시키고 간세포 암종의 발병을 개량하였음을 보여준다.
( 2H10을 사용한) 치료학적 항- VEGF -B 처리는 간 지질 축적을 감소시킨다
12개월 CD-공급 C57BL/6 마우스 및 연령과 성별 일치된 음식-공급 WT를 분석에 사용하였다. 동물에게 상기한 바와 같은 2H10 또는 이소형-일치된 대조 항체 처리를 제공하였다.
오일 레드 O(ORO) 분석을 단리된 간에서 수행하였다. 간략하게, 간을 절개하고 드라이 아이스 상에서 급속 냉동시키고 간 생검을 저온유지장치의 몰드 상에 직접 Tissue-Tek®(Sakura)에 매봉하였다. 동결절편(12μm)을 오일 레드 O 작동 용액(400ml 99% 이소프로판올에 용해시키고, H2O 중에서 6:10로 추가로 희석시키며, 22μm 필터(Corning)를 통해 여과시킨 2.5g 오일 레드 O(ORO: Sigma-Aldrich))에 5분간 담구었다. 그후, 절편을 헤마톡실린 용액에 3초간 침지시킨 다음 이들을 설치하기 전에 LiCO3에 침지시키고 흐르는 수돗물 하에 10분간 헹구었다. 염색된 절편을 명시야 현미경으로 검사하였다. 각 절편 내에 ORO 및 헤마톡실린에 대해 염색된 동물당 적어도 10개 프레임을 20x 배율로 Axio Vision 현미경(Carl Zeiss)으로 촬영하였다. 지방 소립의 양을 간 ORO 염색(화소2/μm2)에 대해 Axio Vision Run wizard 프로그램을 사용하여 정량하였다.
장기 CD 식이 중인 마우스에서 2H10을 사용하여 VEGF-B 수준을 감소시킴으로써 간 지방증이 감소될 수 있고 지방 소립이 수 및 크기 둘 다에서 감소되었다. CD 식이 중인 마우스에서 간 지질 함량은 2H10 요법에 의해 50% 초과까지 감소되었다.
도 24는 간 지질 축적이 ORO 염색에 의해 측정되는 바와 같이 장기 CD 식이 중인 마우스에서 (2H10을 사용한) 항-VEGF-B 처리 후 감소되었음을 보여준다.
( 2H10을 사용한) 치료학적 항- VEGF -B 처리는 간 염증의 발병을 예방한다
12개월 CD-공급 C57BL/6 마우스 및 연령과 성별 일치된 음식-공급 WT를 분석에 사용하였다. 동물에게 상기한 바와 같은 2H10 또는 이소형-일치된 대조 항체 처리를 제공하였다.
CD45 및 F4/80에 대한 면역염색을 단리된 간에 대해 실시하였다. 간략하게, 간을 절개하고 드라이 아이스 상에 급속 냉동시켰다. 간 생검을 저온유지장치의 몰드 상에 직접 Tissue-Tek®(Sakura)에 매봉하였다. 매봉 후, 12-μm 절편을 제조하고, 빙냉 4% PFA에 10분간 후-고정시킨 다음 CD45 또는 F4/80에 대해 면역염색하였다. 간략하게, 절편을 일차 래트 항-CD45(BD bioscience) 및 래트 항-F4/80(Serotec) 항체와 함께 4℃에서 12 h 동안 항온처리하였다. 적합한 형광 표지된 이차 항체(Invitrogen, Alexa fluor)를 적용하고 절편을 RT에서 1 h 동안 추가로 항온처리한 후 이들을 현미경 검사를 위해 준비시켰다. 각 절편 내에 CD45 또는 F4/80에 대해 염색된 동물당 적어도 10개 프레임을 20x 배율로 Axio Vision 현미경(Carl Zeiss)으로 촬영하였다. 각 염색의 양을 간 i) CD45 염색(화소2/μm2) 또는 ii) F4/80 염색(화소2/μm2)에 대해 Axio Vision Run wizard 프로그램을 사용하여 정량하였다.
장기 CD는 C57BL/6 마우스에서 증가된 간 염증을 야기하였다. 염증 반응은 음식-공급 마우스에 비해 CD 식이 중인 대조 처리된 마우스에서 종양의 존재 및 부재 둘 다에서 각각 대략 2배 및 5배 증가되었다. CD 식이 중인 마우스에서 2H10을 사용하여 VEGF-B 수준을 감소시키면 간 염증 세포의 양이 정상화되었다. 따라서, 데이터는 (2H10 처리를 사용하여) VEGF-B 신호전달을 감소시키는 것이 NASH/ 간세포 암종의 발병에서 염증 단계를 효율적으로 표적화함을 시사한다.
도 25는 장기 CD 식이 중인 마우스에서 항-VEGF-B 처리가 CD45 및 F4/80 발현의 감소에 의해 나타내어지는 바와 같이 간 염증의 발병을 예방함을 보여준다.
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Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Ser Leu Thr 85 90 95 Phe Gly Ala Gly Ala Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 11 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence of 2H10 VL CDR1 <400> 11 agggcaagtc aggacattag caatttttta aac 33 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence of 2H10 VL CDR2 <400> 12 tacacatcaa cattacactc a 21 <210> 13 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence of 2H10 VL CDR3 <400> 13 caacagggta aaacgcttcc tcccacg 27 <210> 14 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence of 2H10 VH CDR1 <400> 14 ggctacactt tcactggctt ctggatacac 30 <210> 15 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence of 2H10 VH CDR2 <400> 15 catattaatc ctggcaatgg tggcactaac tacaatgaga agttcaagag a 51 <210> 16 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence of 2H10 VH CDR3 <400> 16 tcctatagta actacgtgcg ggctatggac tac 33 <210> 17 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of 2H10 VL CDR1 <400> 17 Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Phe Leu Asn 1 5 10 <210> 18 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of 2H10 VL CDR2 <400> 18 Tyr Thr Ser Thr Leu His Ser 1 5 <210> 19 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of 2H10 VL CDR3 <400> 19 Gln Gln Gly Lys Thr Leu Pro Pro Thr 1 5 <210> 20 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of 2H10 VH CDR1 <400> 20 Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Phe Trp Ile His 1 5 10 <210> 21 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of 2H10 VH CDR2 <400> 21 His Ile Asn Pro Gly Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys 1 5 10 15 Arg <210> 22 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of 2H10 VH CDR3 <400> 22 Ser Tyr Ser Asn Tyr Val Arg Ala Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 23 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of 2F5 VL CDR1 <400> 23 aaggccagtc aggatgtggg tactgctgta gcc 33 <210> 24 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of 2F5 VL CDR2 <400> 24 tgggcatcca cccggcacac t 21 <210> 25 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of 2F5 VL CDR3 <400> 25 caacaatata gcagctctct cacg 24 <210> 26 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of 2F5 VH CDR1 <400> 26 ggctacacct tcacaacctt ctatatacac 30 <210> 27 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of 2F5 VH CDR2 <400> 27 tggttttatc ctggaaatgt taataccaac tacaatgaga agctcaaggg c 51 <210> 28 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of 2F5 VH CDR3 <400> 28 tccccttact acggctacgt ttttgactac 30 <210> 29 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of 2F5 VL CDR1 <400> 29 Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ala Val Ala 1 5 10 <210> 30 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of 2F5 VL CDR2 <400> 30 Trp Ala Ser Thr Arg His Thr 1 5 <210> 31 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of 2F5 VL CDR3 <400> 31 Gln Gln Tyr Ser Ser Ser Leu Thr 1 5 <210> 32 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of 2F5 VH CDR1 <400> 32 Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Phe Tyr Ile His 1 5 10 <210> 33 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of 2F5 VH CDR2 <400> 33 Trp Phe Tyr Pro Gly Asn Val Asn Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Leu Lys 1 5 10 15 Gly <210> 34 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of 2F5 VH CDR3 <400> 34 Ser Pro Tyr Tyr Gly Tyr Val Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 35 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of 4E12 VL CDR1 <400> 35 aaggccagtc agaatgtgaa cactaatgta gcc 33 <210> 36 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of 4E12 VL CDR2 <400> 36 tcggcatcct cccggtgcag t 21 <210> 37 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of 4E12 VL CDR3 <400> 37 cagcaatatc acagctttcc gctcacg 27 <210> 38 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of 4E12 VH CDR1 <400> 38 ggcgacacct tcaccaactc ctggataggc 30 <210> 39 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of 4E12 VH CDR2 <400> 39 gatatttttc ctgggagtgg tcatactaac tacaatgaga agttcaagaa c 51 <210> 40 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of 4E12 VH CDR3 <400> 40 gagaattatg cctggtttgc ttat 24 <210> 41 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of 4E12 VL CDR1 <400> 41 Lys Ala Ser Gln Asn Val Asn Thr Asn Val Ala 1 5 10 <210> 42 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of 4E12 VL CDR2 <400> 42 Ser Ala Ser Ser Arg Cys Ser 1 5 <210> 43 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of 4E12 VL CDR3 <400> 43 Gln Gln Tyr His Ser Phe Pro Leu Thr 1 5 <210> 44 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of 4E12 VH CDR1 <400> 44 Gly Asp Thr Phe Thr Asn Ser Trp Ile Gly 1 5 10 <210> 45 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of 4E12 VH CDR2 <400> 45 Asp Ile Phe Pro Gly Ser Gly His Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys 1 5 10 15 Asn <210> 46 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of 4E12 VH CDR3 <400> 46 Glu Asn Tyr Ala Trp Phe Ala Tyr 1 5

Claims (22)

  1. 대상체에게 VEGF-B 신호전달을 억제하는 화합물을 투여함을 포함하여, 대상체에서 비알콜성 지방간 질환(NAFLD) 또는 이의 합병증을 치료하거나 예방하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 NAFLD가 간 지방증 또는 비알콜성 지방간염(NASH) 또는 간경변 또는 간 섬유증인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 NAFLD의 합병증이 간세포 암종인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 대상체가 NAFLD를 앓고 있고 상기 방법이 NAFLD를 치료하거나 NAFLD의 진행을 예방하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 NAFLD를 앓고 있는 대상체가 추가로 과체중 또는 비만이고/이거나 당뇨병을 앓고/앓거나 대사 증후군을 앓고 있는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 대상체가 NAFLD를 앓고 있고 상기 방법이 NAFLD의 합병증 발병 위험을 예방하거나 감소시키는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 대상체가 NAFLD를 발병할 위험이 있거나 NAFLD의 동반이환을 앓고 있는 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 화합물이 다음의 효과들 중의 하나 이상을 갖는데 효과적인 양으로 투여되는 방법:
    · 대상체의 간에서 지질, 예를 들어, 중성 지질 축적을 감소시키거나 예방하는 효과;
    · 대상체의 간에서 염증을 감소시키거나 예방하는 효과;
    · 대상체의 간에서 NAFLD의 병리학적 변화의 발병을 감소시키거나 예방하는 효과;
    · 간 섬유증 및/또는 간경변을 감소시키거나 예방하는 효과;
    · 간세포 암종의 형성을 감소시키거나 예방하는 효과.
  9. 대상체에게 VEGF-B 신호전달을 억제하는 화합물을 투여함을 포함하여, NAFLD를 앓고 있는 대상체의 간에서 지질의 수준을 감소시키는 방법.
  10. 대상체에게 VEGF-B 신호전달을 억제하는 화합물을 투여함을 포함하여, NAFLD를 앓고 있는 대상체의 수준에서 염증을 감소시키는 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 VEGF-B 신호전달을 억제하는 화합물이 VEGF-B에 결합하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 화합물이 항체 모방체(antibody mimetic)인 방법.
  13. 제11항에 있어서, 상기 화합물이 VEGF-B에 결합하거나 특이적으로 결합하고 VEGF-B 신호전달을 중화시키는 항체 가변 영역을 포함하는 단백질인 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 화합물이 Fv를 포함하는 단백질인 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 단백질이 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법:
    (i) 단일 쇄 Fv 단편(scFv);
    (ii) 이량체성 scFv(di-scFv); 또는
    (iv) 디아바디;
    (v) 트리아바디;
    (vi) 테트라바디;
    (vii) Fab;
    (viii) F(ab')2;
    (ix) Fv; 또는
    (x) 항체의 불변 영역, Fc 또는 중쇄 불변 도메인(CH) 2 및/또는 CH3에 결합된 (i) 내지 (ix) 중의 하나.
  16. 제14항에 있어서, 상기 단백질이 항체인 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물이 VEGF-B에의 항체 2H10(서열 번호 3에 제시된 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 서열 번호 4에 제시된 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함함)의 결합을 경쟁적으로 억제하는 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물이 항체 2H10의 인간화 가변 영역을 포함하는 단백질인 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 단백질이 항체 2H10의 VH 및/또는 VL의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 가변 영역을 포함하는 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 단백질이 다음을 포함하는 방법:
    (i) 다음을 포함하는 VH:
    (a) 서열 번호 3의 아미노산 25-34에 제시된 서열을 포함하는 CDR1;
    (b) 서열 번호 3의 아미노산 49-65에 제시된 서열을 포함하는 CDR2; 및
    (c) 서열 번호 3의 아미노산 98-108에 제시된 서열을 포함하는 CDR3; 및
    (ii) 다음을 포함하는 VL:
    (a) 서열 번호 4의 아미노산 23-33에 제시된 서열을 포함하는 CDR1;
    (b) 서열 번호 4의 아미노산 49-55에 제시된 서열을 포함하는 CDR2; 및
    (c) 서열 번호 4의 아미노산 88-96에 제시된 서열을 포함하는 CDR3.
  21. 제19항에 있어서, 상기 단백질이 서열 번호 5에 제시된 서열을 포함하는 VH 및 서열 번호 6에 제시된 서열을 포함하는 VL을 포함하는 항체인 방법.
  22. 제1항 내지 제10항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물이 VEGF-B의 발현을 억제하거나 방지하는 방법.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20210009187A (ko) * 2019-07-16 2021-01-26 이화여자대학교 산학협력단 대사체 분석을 이용한 간질환의 진단 방법

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK2718326T3 (da) 2011-06-13 2020-10-26 Csl Ltd Antistoffer mod g-csfr og anvendelser deraf
CN107661492A (zh) * 2017-08-31 2018-02-06 中山大学中山眼科中心 Vegf‑b的新用途
BR112020010514A2 (pt) * 2017-11-29 2020-11-24 Csl Limited método para tratar ou prevenir lesão por isquemia-reperfusão
AU2019344410A1 (en) * 2018-09-18 2021-04-15 B-Creative Sweden Ab Method of treating wasting disorders
IT201900005700A1 (it) * 2019-04-12 2020-10-12 Metadeq Ltd Nuovo marcatore di patologia e suoi usi
CN112010971A (zh) * 2019-05-30 2020-12-01 义慧科技(深圳)有限公司 抗vegf抗体在制备预防和/或治疗脂肪肝的药物中的应用
CN114470000A (zh) * 2020-11-11 2022-05-13 上海萨美细胞技术有限公司 无细胞脂肪提取液对非酒精性脂肪肝炎的治疗用途

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007136679A2 (en) * 2006-05-17 2007-11-29 Ludwig Institute For Cancer Research Targeting vegf-b regulation of fatty acid transporters to modulate human diseases
WO2009126698A2 (en) * 2008-04-09 2009-10-15 Ludwig Institute For Cancer Research Regulation of fatty acid transporters
WO2015077845A1 (en) * 2013-11-28 2015-06-04 Csl Limited Method of treating nephropathy

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PL1781321T3 (pl) 2004-08-02 2014-07-31 Zenyth Operations Pty Ltd Sposób leczenia raka zawierający antagonistę VEGF-B
AU2013224763B2 (en) * 2006-05-17 2016-06-30 Ludwig Institute For Cancer Research Targeting VEGF-B regulation of fatty acid transporters to modulate human diseases
US20080194575A1 (en) * 2006-10-04 2008-08-14 Naiara Beraza Treatment for non-alcoholic-steatohepatitis
US20100216865A1 (en) 2007-09-12 2010-08-26 Elias Jack A MicroRNA COMPOSITIONS IN THE TREATMENT OF VEGF-MEDIATED DISORDERS
JP6553618B2 (ja) 2013-12-18 2019-07-31 シーエスエル リミティド 創傷を治療する方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007136679A2 (en) * 2006-05-17 2007-11-29 Ludwig Institute For Cancer Research Targeting vegf-b regulation of fatty acid transporters to modulate human diseases
WO2009126698A2 (en) * 2008-04-09 2009-10-15 Ludwig Institute For Cancer Research Regulation of fatty acid transporters
WO2015077845A1 (en) * 2013-11-28 2015-06-04 Csl Limited Method of treating nephropathy

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20210009187A (ko) * 2019-07-16 2021-01-26 이화여자대학교 산학협력단 대사체 분석을 이용한 간질환의 진단 방법

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