KR20180135481A - 흑색종 및 기타 암에 대한 면역요법 - Google Patents

흑색종 및 기타 암에 대한 면역요법 Download PDF

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토니 바인쉥크
안드레아 마르
올리버 슈르
옌스 프리체
하르프레트 싱
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Abstract

본 발명은 면역요법 방법에 사용하기 위한 펩티드, 핵산 및 세포에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 암의 면역요법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 단독 또는, 예를 들어 백신 조성물의 활성 약학 성분으로 역할가능한 기타 종양-연관 펩티드와 조합으로 항종양 면역 반응을 촉진하거나 세포를 생체외 촉진하여 환자로 이전하기 위한 종양-연관 T 세포 에피톱에 관한 것이다. 주조직적합 복합체(MHC)의 분자에 결합된 펩티드 또는 그러한 펩티드는 항체, 가용성 T 세포 수용체 및 기타 결합하는 분자의 표적이 될 수도 있다.

Description

흑색종 및 기타 암에 대한 면역요법
본 발명은 면역요법 방법에 사용하기 위한 펩티드, 단백질, 핵산 및 세포에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 암의 면역요법에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 예를 들어 항종양 면역 반응을 촉진시키거나 T 세포를 생체외 자극하여 환자로 이전시키는 백신 조성물의 활성 약학 성분으로 작용할 수 있는 종양 관련 T 세포 펩티드 에피톱 단독 또는 기타 종양 관련 펩티드와의 조합에 관한 것이다. 주조직적합 복합체(MHC)의 분자에 결합된 펩티드 또는 그러한 펩티드는 항체, 가용성 T 세포 수용체 및 기타 결합하는 분자의 표적이 될 수도 있다.
본 발명은 인간 종양 세포의 HLA 클래스 I 분자로부터 유래하는 여러가지 신규 펩티드 서열 및 이들의 변이체는 항종양 면역 반응을 이끌어내는 백신 조성물에서 또는 약학적/면역학적 활성 화합물 및 세포의 개발을 위한 표적으로 사용할 수 있다.
흑색종
세계적으로 이 암은 10만명 당 3.0명의 발생률로 진단되고, 모든 암의 1.7%를 차지한다. 2012년에는 232,000명의 여성이 흑색종 진단을 받았다. 10만명 여성 당 0.7명의 사망률은 발생률보다 상당히 낮다(Ferlay et al., 2013). 평생 동안 흑색종에 걸릴 위험은 백인에서 약 2.4%(40명 당 1명), 흑인에서 0.1%(1,000명 당 1명) 및 히스패닉인에서 0.5%(200명 당 1명)이다. 흑색종 진단의 평균 연령은 62세이지만 이것은 젊은 성인(특히 젊은 여성)에서 가장 흔한 암 중 하나이다(미국 암 협회, 2015).
국소 흑색종 환자의 경우, 충분한 수술적 절제 시 예후가 양호하며 이것은 비교적 낮은 흑색종의 사망률로 반영된다(World Cancer Report, 2014). 이와 일관적으로, I 기 및 II 기 병변의 5년 생존율은 각각 90% 및 80% 이상이다(Kaufman et al., 2013).
하지만, 전이성 흑색종은 현재 치료에 대해 대부분이 내성을 보인다(World Cancer Report, 2014). IIIA 내지 C 기 및 IV 기의 5년 생존율은 각각 78 내지 40% 및 15 내지 20%이다(미국 암 협회, 2015).
태양 노출 외에도, 흑색종 발병의 위험은 연령과 성별 및 해부학적 위치와 개인적 감수성과 같은 여러 환경적 인자에 의해 영향을 받는다. 적외선 방출 태닝 장치 또한 악성 흑색종의 위험을 증가시킨다. 흑색종 병력이 있는 가족의 20 내지 40%에서 CDKN2A 돌연변이가 발견되었다(World Cancer Report, 2014).
흑색종은 주로 피부에서 발생하지만(증례의 95% 이상에서), 입, 코, 항문 및 질의 점막, 및 더 적은 비율로는 장에서도 발견된다. 더욱이, 멜라닌 세포는 결막, 망막 및 수막에 존재한다. 흑색종은 표재 확장성 흑색종, 결절성 흑색종, 선단흑자성 흑색종 및 악성 흑자 흑색종의 아형으로 분류할 수 있다. 흑색종은 TNM 분류에 따라 분류된다. 미국 암 협회(AJCC) 병기설정 매뉴얼의 권장에 따라, 흑색종 환자는 세 가지 군으로 분류된다: 전이 증거가 없는 국소성 질병(I 및 II 기), 부위 질병(III 기) 및 원위 전이성 질병(IV 기)(World Cancer Report, 2014).
흑색종의 표준 치료는 주위의 건강한 조직이 포함되는 완전 수술적 절제이다. 절제가 완전하지 않거나 전혀 가능하지 않으면, 환자는 일차 방사선 요법을 받으며, 이것은 진행성 단계(IIB/C 및 IIIA 내지 C 기)에서 인터페론-알파 투여와 병용가능하다. 독일에서는 후기 및 전이성 흑색종 환자의 치료를 위한 표준 치료 요법이 존재하지 않는다. 따라서, 후기 및 전이성 흑색종을 앓는 환자는 임상 시험 환경에서 치료를 받아야 한다. 치료 방법에는 단독 화학요법, 복합 화학요법 및 특정 억제제를 사용하는 표적 요법이 포함된다. 다카르바진, 테모졸로마이드 및 포테무스틴이 단독 화학요법 시험에서 현재 사용되고 있다. 복합 화학요법 시험에서 여러 조합의 화학치료제들이 조사된다: CarboTax 요법(카보플라틴 + 파클리탁셀), GemTreo 요법(젬시타빈 + 트레오술판), DVP 요법(다카르바진 + 빈데신 + 시스플라틴), BHD 요법(카르무스틴 + 히록시우레아 + 다카르바진) 및 BOLD 요법(블레오마이신 + 빈크리스틴 + 로무스틴 + 다카르바진). 더욱이, 이필리무맙을 병용하는 화학요법의 사용 및 해당되는 유전자의 돌연변이가 있는 환자에 대한 특정 BRAF, c-KIT 및 N-RAS 억제제의 투여가 임상 시험들에서 현재 평가되고 있다(S3-Leitlinie Melanom, 2013).
항종양 면역 반응의 강화는 진행성 흑색종의 치료를 위한 유망한 전략으로 보인다. 미국의 경우 면역 체크포인트 억제제인 이필리무맙 및 BRAF 키나제 억제제인 베무라페닙 및 다브라페닙 및 MEK 억제제인 트라메티닙은 진행성 흑색종의 치료에 이미 승인되어 있다. 두 접근 방식 모두 환자의 항종양 면역성을 증가시키는데, 이필리무맙은 T 세포 억제의 감소에 의해 직접적으로 증가시키고, 키나제는 멜라닌세포 분화 항원의 강화에 의해 간접적으로 각각 증가시킨다(Srivastava and McDermott, 2014). 베무라페닙의 반응률은 40 내지 50%이며 기간 중간값은 약 5 내지 6개월이다(World Cancer Report, 2014). 더욱이, 키나제 MEK를 표적으로 하는 또 다른 MAPK 경로 억제제인 코비메티닙과 베무라페닙의 병용은 FDA의 승인을 받았다(National Cancer Institute, 2015).
진행성 흑색종 환자에서 여러 가지 다른 면역접종의 접근 방식이 이미 평가되었다. 지금까지 제3상 시험에서 꽤 실망스러운 결과가 드러났으며 면역접종 전략은 확실히 개선이 필요하다.
입양 T 세포 이전은 진행성 병기 흑색종의 치료에 대해 매우 유망하게 보인다. 시험관내 팽창된 자가조직 종양 침투 림프구 및 암-고환 항원 NY-ESO-1에 대한 고친화도 T 세포 수용체를 보유하는 T 세포가 흑색종 환자에게 이전 후 상당한 이익이 있고 독성이 낮은 효과가 있었다. 유감스럽게도, 멜라닌세포 특이적 항원인 MART1 및 gp100 및 암-고환 항원인 MAGEA3에 대한 고친화도 T 세포 수용체를 갖는 T 세포는 임상 시험에서 상당한 독성 효과를 유도했다. 따라서, 입양 T 세포 이전은 높은 치료 잠재성을 갖지만 이러한 치료의 안전성과 내약성이 더 증가되어야 할 필요가 있다(Phan and Rosenberg, 2013; Hinrichs and Restifo, 2013).
최근이 되어서야 FDA에서 최초의 종양 가용성 바이러스 요법인 탈리모겐 라허파렙백(T-VEC)을 승인했다. FDA는 수술로 제거할 수 없는 전이성 흑색종을 가진 일부 환자의 치료를 위해 T-VEC를 승인했다(미국 암 협회, 2015).
암 치료 관련 부작용 및 비용을 고려하면, 일반적으로 암, 특히 흑색종의 치료에 사용가능한 요인을 파악할 필요가 있다. 또한, 암의 보다 나은 진단, 예후의 평가 및 치료 성공의 예측을 유도하는 암 전반, 특히 흑색종을 위한 바이오마커를 표시하는 요인의 파악도 필요하다.
암의 면역요법은 부작용을 최소화시키는 반면, 암 세포에 대한 특이적 표적화의 옵션을 나타낸다. 암 면역요법은 종양 관련 항원의 존재를 이용한다.
종양 관련 항원(TAA)의 현재 분류는 다음과 같은 주요 군으로 분류할 수 있다:
a) 암-고환 항원: 제일 처음으로 식별되었으며, T 세포에 의해 인식가능한 TAA가 이 종류에 속하며, 이는 그 구성원들의 발현이 조직학적으로 인간 종양과 다르며, 정상 조직 중, 고환의 정모 세포/정원 세포에서만 있고, 때로는 태반에서도 있기 때문에 원래 암-고환(CT) 항원이라고 불려졌다. 고환의 세포들이 클래스 I 또는 II HLA 분자를 발현하지 않기 때문에, 이 항원들은 정상 세포에 있는 T 세포에 의해 인식될 수 없으며 면역학적으로 종양 특이적이라고 간주될 수 있다. CT 항원의 잘 알려진 예로는 MAGE 계열 구성원들 및 NY_ESO_1이 있다.
b) 분화 항원들: 이 TAA는 종양과 그 종양이 발생한 정상 조직 사이에 공유된다. 대부분의 알려진 분화 항원들은 흑색종과 정상 멜라닌 세포에서 발견된다. 이러한 멜라닌 세포 혈통 관련 단백질의 다수는 멜라닌의 생합성에 관련되어 있고, 따라서 종양 특이적이 아니지만 암 면역요법에 널리 사용된다. 예로는, 티로시나아제 및 흑색종을 위한 멜란-A/MART-1 또는 전립선암을 위한 PSA가 포함되지만 이로 국한되지 않는다.
c) 과발현된 TAA: 일반적으로 낮은 발현 수준이 있는 많은 정상 조직뿐만 아니라 조직학적으로 다른 유형의 종양에서 유전자 인코딩에서 널리 발현된 TAA가 발견된다. 정상 조직에 의해 처리되고 잠재적으로 제시되는 많은 에피톱이 T 세포 인식의 임계치 수준보다 낮을 수 있고, T 세포의 종양 세포에서의 과발현은 이전에 확립된 내성을 중단시켜 항암 반응을 개시할 수 있다. 이 클래스 TAA의 두드러진 예로는 Her-2/neu, 서바이빈, 텔로머라제 또는 WT1가 있다.
d) 종양 특이적 항원: 이러한 독특한 TAA는 정상 유전자의 변이로써 발생한다(β-카테닌, CDK4 등). 이러한 분자 변경의 일부는 종양 변이 및/또는 진행과 관련되어 있다. 종양 특이적 항원은 일반적으로 강한 면역 반응을 정상 조직에 대한 자기 면역 반응에 대한 위험성 없이 유도할 수 있다. 반면에, 대부분의 경우 TAA는 발견되어 일반적으로 많은 개별 종양에서 대개 공유되지 않은 해당 종양에만 적절하다. 종양 특이적(연관된) 아형을 갖는 단백질의 경우 펩티드가 종양(관련) 엑손으로부터 비롯된다면 펩티드의 종양 특이성(또는 연관성) 또한 발생할 수 있다.
e) 비정상 번역 후 변형에서 발생하는 TAA: 이러한 TAA는 특이적이 아니고 과발현되지도 않는 단백질에서 발생할 수 있지만 종양에서 주로 활동적인 번역 후 과정에 의해 종양과 관련된다. 이 클래스의 예는 종양 특이적일 수도 있고 아닐 수도 있는 분해 과정 동안 단백질 스플라이싱과 같은 이벤트 또는 MUC1의 경우 종양의 새로운 에피톱으로 이끄는 변화된 당화 패턴에서 발생한다.
f) 종양 바이러스 단백질: 이러한 TAA는 종양발생 과정에서 중요한 역할을 할 수 있는 바이러스 단백질이며, 그들이 이질적이기 때문에(인간 태생이 아닌), T 세포 반응을 일으킬 수 있다. 이런 단백질의 예로는 인간 유두종 타입 16 바이러스 단백질, 및 경부 암종에서 발현하는 E6와 E7이 있다.
T 세포 기반의 면역요법은 종양 관련 또는 종양특이 단백질로부터 유래된 펩티드 에피톱을 표적으로 하며, 이는 주조직적합 복합체(MHC)의 분자에 의해 제시된다. 종양특이적 세포 독성 T 림프구에 의해 인식되는 항원, 즉 그들의 에피톱은, 발현되고, 같은 원조의 변형없는 세포들에 비해서, 각각의 종양의 대개 상향조절된 세포인 효소, 수용체, 전사 인자 등과 같은 모든 단백질 클래스에서 유도된 분자일 수 있다.
MHC분자에는 두 클래스가 있고, MHC 클래스 I 및 MHC 클래스 II이다. MHC 클래스 I 분자는 알파 중쇄와 베타-2-마이크로글로불린으로 구성되어 있고, MHC 클래스 II 분자는 알파와 베타 쇄로 구성되어 있다. 이들의 3차원 형태는 결합 홈을 형성하며, 이는 펩티드와의 비공유결합에 사용된다. MHC 클래스 I 분자는 대부분의 유핵 세포에서 찾을 수 있다. 이는 대부분 내인성 단백질, 결손 리보솜 생성물(DRIP)과 보다 큰 펩티드의 단백질분해성 절단으로 인해 생성된 펩티드를 제시한다. 하지만, 엔도솜 구획이나 외생 출처로부터 유래된 펩티드 또한 MHC 클래스 I 분자에서 발견된다. 이러한 비고전적 방식의 클래스 I 제시를 문헌에서는 교차 제시라고 칭한다(Brossart and Bevan, 1997; Rock et al., 1990). MHC 클래스 II 분자는 대부분 전문적인 항원-제시 세포(APC)에서 찾아볼 수 있고, 이들은 주로 APC에 의해 섭취된 외인성 또는 막횡단 단백질의 펩티드를 제시하며(예컨대, 세포내 이입 동안), 이는 차후에 처리된다.
펩티드와 MHC 클래스 I 분자의 복합체는 적절한 T 세포 수용체(TCR)를 갖는 CD8 양성 T 세포에 의해서 인식되는 반면, 펩티드와 MHC 클래스 II 분자의 복합체는 적절한 TCR을 갖는 CD4 양성 조력 T 세포에 의해 인식된다. TCR, 펩티드 및 MHC가 이로써 1:1:1의 화학량론적 반응량으로 존재한다는 사실은 잘 알려져 있다.
CD4 양성 보조 T 세포는 CD8 양성 세포 독성 T 세포에 의한 효과적인 반응을 유도하고 지속하는데 중요한 역할을 한다. 종양-연관 항원(TAA)에서 유도된 CD4 양성 T 세포 에피톱의 동정은 항종양 면역 반응을 일으키기 위한 의약품의 개발에 아주 중요하다(Gnjatic et al., 2003). 종양 부위에서, 보조 T 세포는, 세포독성 T 세포(CTL) 친화적 시토카인 주위 환경을 지원하고(Mortara et al., 2006) 효과기 세포, 예를 들어 CTL, 자연 살해(NK) 세포, 대식 세포, 과립구를 유치한다(Hwang et al., 2007).
염증이 없는 경우, MHC 클래스 II 분자의 발현은 주로 면역계의 세포, 특히 전문적 항원-제시 세포(APC), 예를 들어, 단핵 세포, 단핵 세포로 유도된 세포, 대식 세포, 수지상 세포로 제한된다. 환자에서, 종양의 세포는 MHC 클래스 II를 발현하는 것으로 밝혀졌다(Dengjel et al., 2006).
본 발명의 연장된 펩티드는 MHC 클래스 II 활성 에피톱으로 작용할 수 있다.
MHC 클래스 II에 의해 활성화된 조력 T 세포는 항종양 면역에서 CTL 효과기 기능을 조절하는데 중요한 역할을 한다. CD8 양성 킬러 T 세포의 TH1 유형 지원 효과기 기능의 조력 T 세포 반응을 일으키는 조력 T 세포 에피톱은, 세포 표면에 종양 관련 펩티드/MHC 복합체를 보이는 종양 세포에 대한 세포 독성 기능을 포함한다. 이런 식으로 종양 관련 조력 T 세포 펩티드 에피톱은, 따로 또는 다른 종양 관련 펩티드와 함께, 항종양 면역 반응을 자극하는 백신 조성의 활성 약학 원료로 사용될 수 있다.
예를 들어, 생쥐 같은 포유류 동물 모델에서는 심지어 CD8 양성 T 림프구의 부재하에서도, CD4 양성 T 세포가 인터페론-감마(IFNγ)의 분비에 의한 혈관신생의 저해를 통해 종양 발현을 억제하는데 충분한 것으로 나타났다(Beatty and Paterson, 2001; Mumberg et al., 1999). CD4 T 세포가 직접적 항종양 효과기라는 증거가 있다(Braumuller et al., 2013; Tran et al., 2014).
이전에는 HLA 클래스 II 분자의 구성적 발현이 일반적으로 면역 세포로 제한되기 때문에, 클래스 II 펩티드를 원발성 종양에서 직접 분리하는 것은 가능하지 않다고 간주되었다. 하지만, 뎅젤(Dengjel) 등은 MHC 클래스 II 에피톱을 종양에서 직접적으로 식별하는데 성공했다(WO 2007/028574, EP 1 760 088 B1).
CD8 및 CD4에 의존하는 두 유형의 반응이 함께 상승작용에 의해 항종양 효과에 기여하므로, CD8+ T 세포(리간드:MHC 클래스 I 분자 + 펩티드 에피톱) 또는 CD4 양성 조력 T 세포(리간드:MHC 클래스 II 분자 + 펩티드 에피톱)에 의해 인식되는 종양 관련 항원의 식별 및 특성화가 종양 백신의 개발에 중요하다.
MHC 클래스 I 펩티드가 세포 면역 반응을 촉발(유도)하려면 MHC 분자에도 결합해야 한다. 이 과정은 MHC 분자의 대립형질 및 그 펩티드의 아미노산 서열의 특정적 다형성에 의존한다. MHC 클래스 I 결합 펩티드는 대개 길이가 8 내지 12개의 아미노산 잔기이며 또한 대개 그 서열 내에 MHC 분자의 상응하는 결합 홈과 상호작용하는 2개의 유지되는 잔기("고정부")를 포함하고 있다. 이렇게 함으로써 각 MHC 대립형질은 어떤 펩티드가 결합 홈에 특정적으로 결합할 수 있는지 결정하는 "결합 모티프"를 갖는다.
MHC 클래스 I 의존 면역 반응에서, 펩티드는 종양 세포에 의해 발현되는 특정 MHC 클래스 I 분자와 결합할 수 있어야 하며, 또한 추후 특정한 T 세포 수용체(TCR)를 갖는 T 세포에 의해 인식될 수 있어야 한다.
종양 특이 또는 연관 항원으로서 T 림프구에 의해 단백질이 인식되고, 치료에 사용되려면, 특정한 전제 조건이 충족되어야 한다. 항원은 주로 종양 세포에 의해 발현되어야 하며 비교적 소량일지라도 건강한 정상 조직에 의해서 발현되어서는 안 된다. 바람직한 구현에서, 펩티드는 건강한 정상 조직과 비교하여 종양 세포에 의해 과다-제시되어야 한다. 더욱이, 각각의 항원이 하나의 유형의 종양에서 뿐만 아니라 높은 농도로 나타나는 것이 바람직하다(즉, 세포마다 펩티드의 각각의 사본 번호). 종양 특이 및 종양 관련 항원은 흔히 기능(예컨대, 세포 주기 조절 또는 세포자멸사의 억제) 때문에 정상 세포를 종양 세포로 전환하는 것과 직접 관련된 단백질에서 유도된다. 또한, 변환을 직접적으로 일으키는 단백질의 하류 표적은 상향조절될 수 있고, 따라서 간접적으로 종양과 연관될 수 있다. 이러한 간접적 종양 관련 항원은 백신 접근법의 표적이 될 수도 있다(Singh-Jasuja et al., 2004). 종양 관련 항원에서 유도된 그러한 펩티드("면역성 펩티드")가 시험관내 또는 생체내 T 세포 반응을 유도하도록 하기 위해서 에피톱이 항원의 아미노산 서열에 나타나는 것이 필수적이다.
기본적으로, MHC 분자에 결합할 수 있는 모든 펩티드는 T 세포 에피톱으로서 기능할 수 있다. 시험관내 또는 생체내 T 세포 반응의 유도의 전제 조건은 상응하는 TCR이 있는 T 세포의 존재와 이 특정 에피톱에 대한 면역성 내성의 부재이다.
따라서, TAA는 종양 백신으로 제한되지 않지만 이를 포함하는 T 세포 기반 요법의 개발에 있어서 시작점이 된다. TAA의 식별과 특성화의 방법은 대개 환자 또는 건강한 대상에서 분리될 수 있는 CTL의 사용에 기반하거나, 다른 전송 프로파일 또는 종양과 정상 조직 사이의 차등 전사 프로파일이나 차등 펩티드 발현 패턴의 생성에 기반한다. 그러나, 종양 조직 또는 인간 종양 세포주에서 과발현되거나 그런 조직 또는 세포주에서 선택적으로 발현되는 유전자의 식별은 면역 요법에서 이런 유전자에서 전사된 항원의 이용에 대한 정밀한 정보를 제공하지 않는다. 이것은 상응하는 TCR이 있는 T 세포가 나타나야 하고 이 특정 에피톱에 대한 면역 내성이 없거나 최소화되어야 하므로 이러한 항원의 에피톱의 개개의 하위집단만이 그런 응용에 적합하기 때문이다. 따라서, 본원의 매우 바람직한 구현에서, 기능성 및/또는 증식성 T 세포가 발견될 수 있는, 과발현되거나 선택적으로 발현된 펩티드만 선택하는 것이 중요하다. 이러한 기능성 T 세포는 특정 항원에 의해 자극되었을 때 클론에 의해 확대되고 효과기 기능("효과기 T 세포")을 실행할 수 있는 T 세포로 정의된다.
본원에 따른 특정 TCR(예컨대, 가용성 TCR) 및 항체 또는 다른 결합 분자(골격)에 의해 펩티드-MHC를 표적화하는 경우, 기저 펩티드의 면역원성은 이차적인 것이다. 이러한 경우, 제시가 결정 요인이다.
본 발명의 한 양태에서, 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 237 또는 서열번호 1 내지 서열번호 237에 대해 77% 이상, 바람직하게는 88% 이상 상동성인(바람직하게는 77% 이상 또는 88% 이상 동일한) 이의 변이체 서열로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염에 관한 것으로서, 상기 변이체는 MHC에 결합하고/거나 상기 펩티드와 교차 반응하는 T 세포를 유도하며, 상기 펩티드는 기저의 전장 폴리펩티드가 아니다.
또한, 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 237로 구성되는 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 본원의 펩티드 또는 서열번호 1 내지 서열번호 237에 대해 77% 이상, 바람직하게는 88% 이상 상동성인(바람직하게는 77% 이상 또는 88% 이상 동일한) 이의 변이체(여기서 상기 펩티드 또는 이의 변이체는 8개 내지 100개, 바람직하게는 8개 내지 30개, 가장 바람직하게는 8개 내지 14개 아미노산의 전장을 가진다.
다음 표에는 본 발명에 따른 펩티드들과 각각의 서열번호 및 이 펩티드들의 장래의 출처(기저) 유전자들이 나와 있다. 표 1 및 표 2의 모든 펩티드는 HLA-A*02에 결합한다. 표 2의 펩티드는 고처리량의 스크리닝 및 높은 오류 비율의 결과로서 과거에 커다란 목록으로 공개되거나 알고리즘을 사용하여 계산되었지만, 과거에는 암과 연관된 점은 전혀 없었다. 표 3의 펩티드는 본 발명에 따른 펩티드와의 조합에서 유용할 수 있는 추가의 펩티드이다. 표 4의 펩티드는 또한 해당되는 기저 폴리펩티드의 과발현 또는 과다-제시에 관여하는 다양한 기타 악성 종양의 진단 및/또는 치료에 유용하다.
[표 1]
본 발명에 따른 펩티드
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
[표 2]
본 발명에 따른 추가의 펩티드
Figure pct00009
Figure pct00010
[표 3]
예를 들어, 개인화 암 요법에 유용한 펩티드
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
본 발명은 또한, 예를 들어, 급성 골수성 백혈병, 유방암, 담관암, 뇌암, 만성 림프구성 백혈병, 대장 암종, 식도암, 담낭암, 위암, 간세포암, 비호지킨 림프종, 비소세포 폐암, 난소암, 췌장암, 전립선암, 신세포암, 소세포 폐암, 방광암 및 자궁암과 같은 증식성 질병의 치료에 사용하기 위한 본 발명에 따른 펩티드와 일반적으로 관련이 있다.
특히 바람직하게는, 서열번호 1 내지 서열번호 237로 구성되는 군으로부터 선택되는 본 발명에 따른 단일 또는 조합의 펩티드들이다. 더 바람직하게는, 서열번호 1 내지 서열번호 34로 구성되는 군으로부터(표 1 참조) 선택되는 단일 또는 조합의 펩티드들, 및 흑색종, 급성 골수성 백혈병, 유방암, 담관암, 뇌암, 만성 림프구성 백혈병, 대장 암종, 식도암, 담낭암, 위암, 간세포암, 비호지킨 림프종, 비소세포 폐암, 난소암, 췌장암, 전립선암, 신세포암, 소세포 폐암, 방광암, 자궁암, 바람직하게는 흑색종의 면역요법에서의 이들의 사용이다.
다음 표 4A 및 4B에 제시된 바와 같이, 본 발명에 따른 많은 펩티드는 다른 종양 유형에서도 발견되고, 따라서 다른 적응증의 면역요법에도 사용될 수 있다. 또한, 도 1과 실시예 1도 참조한다.
표 4A는 본 발명에 따른 펩티드 및 다른 증식성 질병, 특히 다른 암 질병에서의 구체적인 사용을 나타낸다. 이 표는 펩티드가 발견된 추가의 종양 유형에서 선택되는 펩티드로서 측정된 종양 샘플에서 5% 넘게 과다-제시되거나 정상 조직 대 종양의 기하학적 평균 비율이 3보다 큰 측정된 종양 샘플에서 5% 넘게 제시된 펩티드를 도시한다. 과다-제시란 가장 높은 제시의 정상 샘플에 비해 종양 샘플에서의 더 높은 제시로서 정의된다. 과다-제시를 시험한 대상의 정상 조직은 다음과 같다: 지방 조직, 부신, 혈액 세포, 혈관, 골수, 뇌, 식도, 눈, 담낭, 심장, 신장, 대장, 간, 폐, 림프절, 신경, 췌장, 부갑상선, 복막, 뇌하수체, 흉막, 타액선, 골격근, 피부, 소장, 비장, 위, 흉선, 갑상선, 기관, 요관, 방광.
[표 4A]
Figure pct00016
Figure pct00017
Figure pct00018
Figure pct00019
Figure pct00020
Figure pct00021
NSCLC= 비소세포 폐암, SCLC= 소세포 폐암, RCC= 신장암, CRC= 결장암 또는 직장암, GC= 위암, HCC= 간암, PC= 췌장암, PrC= 전립선암, 백혈병, BRCA= 유방암, OC= 난소암, NHL= 비호지킨 림프종, AML= 급성 골수성 백혈병, CLL= 만성 림프구 백혈병.
표 4B는 본 발명에 따른 펩티드 및 다른 증식성 질병, 특히 다른 암 질병에서의 구체적인 사용을 나타낸다. 이 표는 펩티드가 발견된 추가의 종양 유형에서 선택되는 펩티드로서 측정된 종양 샘플에서 5% 넘게 과다-제시되거나 정상 조직 대 종양의 기하학적 평균 비율이 3보다 큰 측정된 종양 샘플에서 5% 넘게 제시된 펩티드를 도시한다. 과다-제시란 가장 높은 제시의 정상 샘플에 비해 종양 샘플에서의 더 높은 제시로서 정의된다. 과다-제시를 시험한 대상의 정상 조직은 다음과 같다: 지방 조직, 부신, 동맥, 골수, 뇌, 중추 신경, 결장, 식도, 눈, 담낭, 심장, 신장, 간, 폐, 림프절, 백혈구, 췌장, 부갑상선, 말초 신경, 복막, 뇌하수체, 흉막, 직장, 타액선, 골격근, 피부, 소장, 비장, 위, 흉선, 갑상선, 기관, 요관, 방광, 정맥.
[표 4B]
Figure pct00022
Figure pct00023
Figure pct00024
따라서, 본 발명의 또 다른 양태는, 하나의 조합된 바람직한 양태에서, RCC의 치료를 위한 서열번호 1, 19, 30, 126, 130, 136, 150, 164, 167, 168, 170, 175, 176, 177, 178, 182, 187, 191, 194, 198, 203, 206, 212, 214, 215 및 218 중 어느 하나에 따라 본 발명에 따른 하나 이상의 펩티드의 용도에 관한 것이다.
따라서, 본 발명의 또 다른 양태는, 하나의 조합된 바람직한 양태에서, HCC의 치료를 위한 서열번호 1, 8, 19, 37, 64, 68, 78, 100, 105, 116, 126, 129, 133, 135, 137, 146, 148, 151, 155, 161, 163, 164, 166, 168, 170, 182, 189, 192, 203, 205, 206, 210, 211, 212, 215, 218, 220, 221, 225, 226 및 232 중 어느 하나에 따라 본 발명에 따른 하나 이상의 펩티드의 용도에 관한 것이다.
따라서, 본 발명의 또 다른 양태는, 하나의 조합된 바람직한 양태에서, 자궁암의 치료를 위한 서열번호 1, 7, 8, 15, 18, 19, 20, 23, 27, 31, 123, 124, 125, 126, 127, 130, 133, 137, 139, 143, 151, 154, 155, 159, 160, 161, 163, 172, 174, 181, 183, 186, 189, 191, 194, 197, 211, 217, 219, 221, 223, 224, 225, 226, 229, 230, 234 및 235의 어느 하나에 따라 본 발명에 따른 하나 이상의 펩티드의 용도에 관한 것이다.
따라서, 본 발명의 또 다른 양태는, 하나의 조합된 바람직한 양태에서, 담낭암 및/또는 담관암의 치료를 위한 서열번호 1, 23, 24, 116, 136, 150, 159, 177, 191, 193, 194, 195, 208, 214, 217, 220, 221, 223 및 234의 어느 하나에 따라 본 발명에 따른 하나 이상의 펩티드의 용도에 관한 것이다.
따라서, 본 발명의 또 다른 양태는, 하나의 조합된 바람직한 양태에서, NHL의 치료를 위한 서열번호 2, 8, 11, 15, 17, 18, 23, 24, 27, 29, 31, 32, 57, 116, 120, 121, 124, 126, 127, 133, 135, 136, 137, 138, 139, 143, 144, 145, 146, 148, 151, 155, 159, 161, 163, 169, 170, 171, 172, 173, 176, 181, 182, 184, 186, 190, 191, 193, 194, 195, 197, 206, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 216, 219, 221, 222, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 233, 234, 236 및 237의 어느 하나에 따라 본 발명에 따른 하나 이상의 펩티드의 용도에 관한 것이다.
따라서, 본 발명의 또 다른 양태는, 하나의 조합된 바람직한 양태에서, BRCA의 치료를 위한 서열번호 2, 7, 16, 19, 22, 23, 116, 119, 124, 128, 130, 148, 151, 155, 159, 161, 164, 166, 171, 178, 180, 183, 189, 191, 194, 196, 199, 207, 214, 215, 217, 225, 226, 227, 234 및 236의 어느 하나에 따라 본 발명에 따른 하나 이상의 펩티드의 용도에 관한 것이다.
따라서, 본 발명의 또 다른 양태는, 하나의 조합된 바람직한 양태에서, PC의 치료를 위한 서열번호 7, 126, 128, 146, 161, 166, 176, 191, 218, 225 및 236의 어느 하나에 따라 본 발명에 따른 하나 이상의 펩티드의 용도에 관한 것이다.
따라서, 본 발명의 또 다른 양태는, 하나의 조합된 바람직한 양태에서, AML의 치료를 위한 서열번호 7, 15, 16, 17, 23, 27, 28, 36, 59, 62, 80, 84, 102, 104, 109, 114, 118, 121, 122, 125, 131, 133, 137, 138, 143, 145, 146, 158, 159, 164, 166, 168, 169, 171, 172, 175, 177, 183, 186, 191, 193, 194, 195, 204, 207, 208, 209, 211, 212, 213, 214, 219, 225, 230, 234, 236 및 237의 어느 하나에 따라 본 발명에 따른 하나 이상의 펩티드의 용도에 관한 것이다.
따라서, 본 발명의 또 다른 양태는, 하나의 조합된 바람직한 양태에서, 뇌암의 치료를 위한 서열번호 1, 10, 18, 20, 22, 116, 128, 130, 161, 167, 169, 176, 181, 184, 191, 194, 217, 221, 225, 232 및 235의 어느 하나에 따라 본 발명에 따른 하나 이상의 펩티드의 용도에 관한 것이다.
따라서, 본 발명의 또 다른 양태는, 하나의 조합된 바람직한 양태에서, 방광암의 치료를 위한 서열번호 17, 21, 23, 31, 116, 123, 127, 128, 131, 137, 146, 150, 154, 155, 157, 159, 163, 165, 166, 172, 180, 184, 186, 191, 193, 194, 206, 212, 213, 214, 215, 217, 219, 221, 225, 226, 229 및 232의 어느 하나에 따라 본 발명에 따른 하나 이상의 펩티드의 용도에 관한 것이다.
따라서, 본 발명의 또 다른 양태는, 하나의 조합된 바람직한 양태에서, SCLC의 치료를 위한 서열번호 19, 21, 135, 150, 159, 164, 166, 169, 179, 192, 194, 211, 214, 219, 221, 225 및 226의 어느 하나에 따라 본 발명에 따른 하나 이상의 펩티드의 용도에 관한 것이다.
이에 따라, 본 발명의 또 다른 양태는, 하나의 합쳐진 바람직한 양태에서, NSCLC의 치료를 위한 서열번호 22, 24, 31, 116, 118, 126, 130, 161, 184, 191, 194, 214 및 221의 어느 하나에 따라 본 발명에 따른 하나 이상의 펩티드의 용도에 관한 것이다.
따라서, 본 발명의 또 다른 양태는, 하나의 조합된 바람직한 양태에서, OC의 치료를 위한 서열번호 1, 22, 24, 31, 116, 118, 124, 125, 126, 135, 151, 163, 166, 169, 174, 178, 206, 211, 213, 227 및 234의 어느 하나에 따라 본 발명에 따른 하나 이상의 펩티드의 용도에 관한 것이다.
따라서, 본 발명의 또 다른 양태는, 하나의 조합된 바람직한 양태에서, 식도암의 치료를 위한 서열번호 20, 31, 37, 128, 130, 141, 155, 160, 168, 178, 179, 180, 184, 191, 206, 213, 221, 225, 226 및 227의 어느 하나에 따라 본 발명에 따른 하나 이상의 펩티드의 용도에 관한 것이다.
따라서, 본 발명의 또 다른 양태는, 하나의 조합된 바람직한 양태에서, GC의 치료를 위한 서열번호 28, 50, 52, 54, 56, 73, 76, 79, 82, 84, 88, 94, 114, 115, 122, 124, 128, 132, 134, 142, 153, 159, 160, 161, 165, 175, 182, 189, 198, 207, 212, 213, 215, 218, 219, 230 및 234의 어느 하나에 따라 본 발명에 따른 하나 이상의 펩티드의 용도에 관한 것이다.
따라서, 본 발명의 또 다른 양태는, 하나의 조합된 바람직한 양태에서, CRC의 치료를 위한 서열번호 22, 31, 128, 138, 161, 169, 189, 193, 194, 199, 214, 217 및 221의 어느 하나에 따라 본 발명에 따른 하나 이상의 펩티드의 용도에 관한 것이다.
따라서, 본 발명의 또 다른 양태는, 하나의 조합된 바람직한 양태에서, PrC의 치료를 위한 서열번호 128, 150, 176, 180, 184, 213, 221, 227 및 235의 어느 하나에 따라 본 발명에 따른 하나 이상의 펩티드의 용도에 관한 것이다.
따라서, 본 발명의 또 다른 양태는, 하나의 조합된 바람직한 양태에서, HNSCC의 치료를 위한 서열번호 7, 8, 13, 14, 15, 19, 20, 22, 23, 24, 27, 30, 31, 58, 91, 120, 123, 126, 135, 159, 161, 163, 164, 165, 169, 173, 178, 179, 180, 184, 206, 207, 211, 213, 214, 217, 221, 225, 226 및 227의 어느 하나에 따라 본 발명에 따른 하나 이상의 펩티드의 용도에 관한 것이다.
이에 따라, 본 발명의 또 다른 양태는, 하나의 합쳐진 바람직한 양태에서, CLL의 치료를 위한 서열번호 8, 16, 19, 137, 193, 210, 234, 236 및 237의 어느 하나에 따라 본 발명에 따른 하나 이상의 펩티드의 용도에 관한 것이다.
따라서, 본 발명의 또 다른 양태는 흑색종, 급성 골수성 백혈병, 유방암, 담관암, 뇌암, 만성 림프구성 백혈병, 대장 암종, 식도암, 담낭암, 위암, 간세포암, 비호지킨 림프종, 비소세포 폐암, 난소암, 췌장암, 전립선암, 신세포암, 소세포 폐암, 방광암 및 자궁암의 군으로부터 선택되는 증식성 질병의 바람직하게는 병용 치료를 위한 본 발명에 따른 펩티드의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한 인간 주조직적합 복합체(MHC) 클래스 I 또는 길이 변이체와 같은 연장된 형태의 MHC 클래스 II의 분자와 결합하는 능력을 가진 본 발명에 따른 펩티드에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 펩티드들에 관한 것으로서, 상기 펩티드들(각각)은 서열번호 1 내지 서열번호 237에 따른 아미노산 서열로 구성되거나 본질적으로 구성된다.
본 발명은 또한 본원에 따른 펩티드에 관한 것으로서, 상기 펩티드는 변형되고/거나 비펩티드 결합을 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 펩티드에 관한 것으로서, 상기 펩티드는 융합 단백질의 일부이며, 특히 HLA-DR 항원 연관된 불변 쇄(Ii)의 N-말단 아미노산에 융합되거나, 예를 들어 수지상 세포에 특이적인 항체와 같은 항체에(또는 그 서열 안으로) 융합된다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 펩티드를 인코딩하는 핵산에 관한 것이다. 본 발명은 또한 DNA, cDNA, PNA, RNA 또는 이들의 조합인 본 발명에 따른 핵산에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 핵산을 발현할 수 있고/거나 발현하는 발현 벡터에 관한 것이다.
본 발명은 또한 질병의 치료 및 의약, 특히 암의 치료에 사용하기 위한 본 발명에 따른 펩티드, 본 발명에 따른 핵산 또는 본 발명에 따른 발현 벡터에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 펩티드 또는 본 발명에 따른 상기 펩티드와 MHC의 복합체에 대해 특이적인 항체 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 T 세포 수용체(TCR), 특히 가용성 TCR(sTCR) 및 자가조직 또는 동종이형 T 세포 안으로 조작된 클론된 TCR, 및 이들은 물론 NK 세포나 상기 TCR을 포함하거나 상기 TCR과 교차반응하는 다른 세포들을 만드는 방법에 관한 것이다.
항체 및 TCR은 현재 본 발명에 따른 펩티드의 면역요법 사용에 대한 추가적 실시예이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 핵산 또는 상기 설명한 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다. 본 발명은 또한 항원-제시 세포, 바람직하게는 수지상 세포인 본 발명에 따른 숙주 세포에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 펩티드의 생산 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 본 발명에 따른 숙주 세포의 배양 및 상기 숙주 세포 또는 그 배양 배지로부터의 펩티드 단리를 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 상기 방법에 관한 것으로서, 충분한 수량의 항원을 항원-제시 세포와 접촉시킴으로써 항원이 적합한 항원-제시 세포 또는 인공 항원-제시 세포의 표면에 발현된 클래스 I 또는 II MHC 분자 위에 로딩된다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 방법에 관한 것으로서, 그 항원-제시 세포가 서열번호 1 내지 서열번호 237을 포함하는, 바람직하게는 서열번호 1 내지 서열번호 34를 포함하는 상기 펩티드 또는 변이체 아미노산 서열을 발현할 수 있고/거나 발현하는 발현 벡터를 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 방법에 의해 생산된 활성화된 T 세포에 관한 것으로서, 상기 T 세포가 본 발명에 따른 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 발현하는 세포를 선택적으로 인식한다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 일체의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 표적 세포가 이상 발현하는 환자에서 표적 세포를 살해하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 본 발명에 따라 생산된 효과적인 수의 T 세포를 환자에게 투여하는 것을 포함한다.
본 발명은 또한 약제로서 또는 약제의 제조에서 설명된 일체의 펩티드, 본 발명에 따른 핵산, 본 발명에 따른 발현 벡터, 본 발명에 따른 세포, 본 발명에 따른 활성화된 T 림프구, T 세포 수용체 또는 기타 펩티드 및/또는 펩티드 MHC 결합 분자의 사용에 관한 것이다. 바람직하게는, 상기 약제가 암에 대해 활성이다.
바람직하게는, 상기 약제가 세포 요법, 백신 또는 가용성 TCR 또는 항체에 근거한 단백질이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 용도에 관한 것으로, 상기 암 세포가 흑색종, 급성 골수성 백혈병, 유방암, 담관암, 뇌암, 만성 림프구성 백혈병, 대장 암종, 식도암, 담낭암, 위암, 간세포암, 비호지킨 림프종, 비소세포 폐암, 난소암, 췌장암, 전립선암, 신세포암, 소세포 폐암, 방광암 및 자궁암, 바람직하게는 흑색종 세포이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 펩티드에 근거한 바이오마커에 관한 것으로서, 여기서는 암, 바람직하게는 흑색종의 진단에 사용할 수 있는 "표적"이라고 부른다. 이 마커는 펩티드(들) 자체의 과다-제시 또는 상응하는 유전자(들)의 과발현일 수 있다. 이 마커는 또한 치료, 바람직하게는 면역요법, 가장 바람직하게는 바이오마커에 의해 확인된 동일한 표적을 표적화하는 면역요법의 성공의 확률을 예측하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 항체 또는 가용성 TCR은 관심 대상의 MHC와 복합체인 펩티드의 존재 검출을 위해 종양의 일부를 염색하는데 사용할 수 있다.
임의적으로, 항체는 면역 자극 도메인 또는 독소와 같은 추가의 효과기 기능을 보유한다.
본원은 또한 암 치료의 문맥상 이러한 새로운 표적들의 사용에 관한 것이다.
추가의 암 질환에 대한 치료 및 진단 사용 모두 본 발명에 따른 펩티드의 기저 발현 생성물(폴리펩티드)에 대한 다음의 상세한 설명에 공개된다.
ACOT7은 흑색종에서 상향조절되는 것으로 발견되었으며, 지질독성의 방지에 관여할 수 있다(Sumantran et al., 2015).
ACSL3은 아실-CoA 합성효소 장쇄 계열 구성원 3을 인코딩한다. ACSL3은 폐암에서 과발현되고 예비임상 조사에 근거하면 폐암에서 유망한 새로운 치료 표적이다(Pei et al., 2013). ACSL3의 상향조절된 발현은 에스트로겐 특이적 유방암 위험의 잠재적인 바이오마커로서의 역할을 할 수 있다(Wang et al., 2013b).
APOE는 콜레스테롤 운반에 관여하며 종양 세포가 높은 콜레스테롤 요건의 이행을 가능케 하는데 중요할 수 있다. 이것은 위암, 역형성 갑상선 암종, 전립선암 및 대장암과 같은 다양한 유형의 암에서 과발현되는 것으로 나타났다(Yasui et al., 2005; Ito et al., 2006; Sakashita et al., 2008; Shi et al., 2015b; Kang et al., 2016; Yencilek et al., 2016). 비소세포 폐암에서 혈청 APOE 수준 상승은 전이 및 불량한 예후와 관련있는 것으로 나타났다. 더욱이, 이는 유방암에서 예후 표지자로서 그리고 비소세포 폐암에서 화학요법의 효율을 추적하는 표지자로서 제안되었다(Shi et al., 2016; Xu et al., 2016b; Luo et al., 2016).
돌연변이의 비활성화를 통한 ARID2의 소실은 위암, 간세포 암종 및 비소세포 암종에서 종양 진행 및 재발과 관련이 있었다(Manceau et al., 2013; You et al., 2015; Aso et al., 2015).
ARNT2는 비소세포 폐암, 간세포 암종, 유방암 및 구강 편평세포 암종에서 과발현되는 것으로 나타났다. 과발현은 전체 생존 기간을 증가시키고 세포자멸사를 촉진시키는 것으로 판정되었기 때문에 이것은 암 진행 동안 종양 억제인자의 역할을 한다(Qin et al., 2011a; Li et al., 2015d; Yang et al., 2015; Kimura et al., 2016).
ATG2B는 자가포식소체 형성 및 지방 방울 용적 및 분포의 조절에 필수적인 단백질인 자가포식 관련 2B를 인코딩한다(Velikkakath et al., 2012). ATG2B 틀 이동 돌연변이(frameshift mutation)는 미세위성 불안정성이 높은 위암 및 대장 암종에서 흔하다(Kang et al., 2009).
ATM은 폐, 대장, 유방 및 조혈성 암 등을 포함하여 광범위한 인간 암에서 빈번히 돌연변이되는 종양 억제인자이다(Weber and Ryan, 2014). ATM의 손실은 유방, 대장, 전립선, 폐 및 췌장관 선암종 등을 포함하여 다양한 암의 위험 증가와 관련되었다(Swift et al., 1987; Geoffroy-Perez et al., 2001; Angele et al., 2004; Roberts et al., 2012; Grant et al., 2013; Russell et al., 2015). 연구들에 의하면 IL-8은 ATM 고갈된 세포에서 세포 이동 및 침윤 결함을 구조할 수 있는 것으로 나타났다(Chen et al., 2015b). ATM 단백질의 낮은 수준은 유방암 환자에서 불량한 무전이 생존 기간과 상관관계가 있었다. 또한, 이러한 환자에서 miR-203 및 miR-421의 과발현은 ATM 탈조절에 관여될 수 있다(Bueno et al., 2014; Rondeau et al., 2015).
BNC1은 대장 선종 및 암종에서 과메틸화된 10-유전자 메틸화 시그니처의 일부인 것으로 나타났다(Patai et al., 2015). BNC1은 전립선암 세포주에서 빈번히 메틸화되어 비활성화되었으므로 전립선암과 연관 있는 것으로 나타났다(Devaney et al., 2013). BNC1은 만성 림프구성 백혈병, 신세포 암종 및 T 세포와 B 세포 소아 급성 림프모구성 백혈병에서 이상 메틸화되었던 다수의 잠재적 표적 가운데 하나인 것으로 나타났다(Tong et al., 2010; Morris et al., 2010; Dunwell et al., 2009). BNC1은 원발성 뇌암에서 뇌암으로의 진행에 역할을 하는 것으로 나타났다. BNC1의 넉다운(knock-down)은 유방암 세포주의 이동 및 침윤의 잠재성의 증가를 초래했다. 따라서, BNC1은 예후 표지자와 새로운 치료 표적으로서 유용할 수 있다(Pangeni et al., 2015). BNC1은 TGF-β1 신호전달과 연관있는 것으로 나타났다(Feuerborn et al., 2015). BNC1은 투명세포 신세포 암종에서 더 불량한 생존 기간 그리고 신세포 암종에서 더 불량한 예후와 연관있는 것으로 나타났다(Morris et al., 2010; Ricketts et al., 2014). BNC1은 I 기 침윤성 췌장암에서 빈번히 메틸화되는 것으로 나타났다. 따라서, BNC1은 조기 췌장암을 검출하는 잠재적 바이오마커의 역할을 한다(Yi et al., 2013). BNC1은 두경부 편평세포 암종에서 상향조절되는 것으로 나타났다(Boldrup et al., 2012). BNC1은 두경부 편평세포 암종에서 p53 계열 구성원인 p63에 의해 전사적으로 조절되는 것으로 나타났다(Boldrup et al., 2012).
여러 연구의 결과에 의하면, BNC2는 식도 선암종, 난소암 및 교모세포종에서 종양 억제 유전자로서 기능한다. 이 유전자는 빈번하게 결손되고/거나 발현이 감소된다(Nord et al., 2009; Akagi et al., 2009; Cesaratto et al., 2016). BNC2는 간세포 암종에서 하향조절되는 것으로 나타났으며, 또한 빈번히 결손되었고, 이것은 더 낮은 발현 수준에 대한 중요한 이유 중 하나일 수 있다(Wu et al., 2016).
BOP1은 난소암 및 대장암과 관련이 있다(Wrzeszczynski et al., 2011; Killian et al., 2006). BOP1은 생쥐의 대장암에서 EMT, 세포 이동 및 실험적 전이를 유도한 Wnt/β-카테닌의 표적 유전자인 것으로 나타났다. 따라서, BOP1은 대장암 전이의 치료에서 치료 표적의 역할을 할 수 있다(Qi et al., 2015). BOP1은 간세포 암종의 침윤 및 전이와 관련이 있다(Chung et al., 2011). BOP1은 위암 세포주의 마이코페놀산 치료 후 세포주기 정지와 관련 있는 분자 경로의 구성원으로 기술되었으며, 이는 BOP1과 이 약물의 항암 활성도의 잠재적 연관성을 나타낸다(Dun et al., 2013a; Dun et al., 2013b). BOP1은 직장암에 대한 잠재적인 표지자일 수 있다(Lips et al., 2008). BOP1은 난소암에서 잠재적인 종양유전자로서 기술되었다(Wrzeszczynski et al., 2011). BOP1은 간세포 암종에서 상향조절되는 것으로 나타났다(Chung et al., 2011). BOP1은 간세포 암종에서 미세혈관 침윤, 더 짧은 무질병 생존 기간 및 전이와 관련 있는 것으로 나타났다(Chung et al., 2011). BOP1은 PeBoW 복합체의 아단위로서 기술되었으며, 이것은 세포 증식 및 대형 리보솜 아단위의 성숙에 필수적이다. BOP1의 과발현은 세포 증식을 억제하는 것으로 나타났다(Rohrmoser et al., 2007). BOP1의 아미노 말단 절단 형태의 발현은 G(1)-특이적 Cdk2 및 Cdk4 키나제 복합체, 망막모세포종 및 사이클린 A의 하향조절을 초래한 반면 Cdk 억제인자인 p21 및 p27은 상향조절되었다. 이것은 G(1) 기의 정지를 유도했다(Pestov et al., 2001).
CAPN3 발현은 고도로 침윤성 표현형의 획득에서 역할을 하는 흑색종 세포에서 하향조절되는 것으로 나타났다(Huynh et al., 2009; Ruffini et al., 2013; Moretti et al., 2015). CAPN3은 소화기관 팽창 인자(Dev)와 복합되어 종양 억제인자 p53의 분해를 함께 중재하는 것으로 나타났다(Zhu et al., 2014b).
CCT6A는 고환 생식세포 종양 및 악성 흑색종과 연관되어 있다(Tanic et al., 2006; Alagaratnam et al., 2011).
CCT8은 간세포 암종에서 상향조절되는 것으로 나타났다(Huang et al., 2014c). CCT8은 간세포 암종의 조직학적 등급, 종양 크기 및 불량한 예후와 관련이 있다(Huang et al., 2014c).
RPI-1 및 다사티닙 치료는 CD109를 표적으로 하여 암 세포의 증식을 억제한다(Caccia et al., 2011). CD109는 비인두 암종, 후두 편평세포 암종, 비소세포 폐암, 췌장암, 점액 섬유육종, 식도 편평세포 암종, 두경부암 및 (3중 음성) 유방암에서 과발현된다(Ni et al., 2012; Tao et al., 2014; Zhang et al., 2014a; Dong et al., 2015a; Emori et al., 2015; Haun et al., 2014; Hoover et al., 2015; Jia et al., 2016). CD109는 비인두 암종, 외음부 편평세포 암종, 3중 음성 유방암, 간세포 암종 및 담낭 편평세포/선편평 암종에서 예후 바이오마커로서 사용될 수 있다. 분비된 CD109는 혈청 예후 바이오마커로서 사용될 수 있다(Ye et al., 2016; Ozbay et al., 2013; Sakakura et al., 2014; Tao et al., 2014; Dong et al., 2015b; Jia et al., 2016). CD109는 교모세포종에서 예후 표지자로 사용될 수 있는 드문 군의 순환하는 내피 세포 상에 발현된다(Mancuso et al., 2014; Cuppini et al., 2013). CD109의 발현 감소는 종양 성장을 촉진시킨다. 이것은 자궁 암육종에서 하향조절되는 것으로 나타났다(Ye et al., 2016; Semczuk et al., 2013). CD109는 간세포 암종의 증식을 촉진하며 불량한 예후와 상관관계가 있다(Zong et al., 2016). CD109 과발현은 수술 상태, 불량한 예후 및 전이와 연관이 있다(Emori et al., 2013; Emori et al., 2015; Karhemo et al., 2012). CD109는 TGF-베타1 신호전달을 억제하고 EGF 신호전달 인간 교모세포종 세포를 촉진시킨다(Man et al., 2012; Zhang et al., 2015).
CSNK2A1은 유방암, 대장암 및 위암종에서 다른 단백질들을 인산화함으로써 종양형성에 관여하는 것으로 나타났다. CSNK2A1 발현은 위암종, 유방암 및 투명세포 신세포 암종의 독립적인 예후 지표인 것으로 나타났다(Kim et al., 2012; Bae et al., 2015; Kren et al., 2015; Rabjerg et al., 2016; Bae et al., 2016). CSNK2A1은 만성 골수성 백혈병 및 교모세포종에서 치료 표적으로서 제안되었다. 제안된 새로운 BCR-ABL/CK2/PTEN 경로의 일부로서 카세인 키나제 II의 억제는 PTEN 재활성화를 촉진시키며, 이것은 암 세포에서 세포자멸사의 유도를 촉진시킨다(Lee et al., 2013; Zheng et al., 2013; Morotti et al., 2015). CSNK2A1은 성인 T 세포 백혈병에서 빈번하게 돌연변이되는 것으로 나타났다(Kataoka et al., 2015).
DYNC2H1은 다형태 교모세포종에서 상향조절되는 것으로 나타났다(Yokota et al., 2006).
EIF3E는 구강 편평 세포 암종의 암 형성에서 역할을 할 수 있다(Yong et al., 2014). EIF3E는 교모세포종 세포의 증식 및 생존에 필수적이다(Sesen et al., 2014). EIF3E는 유방암 진행에서 종양유전자 역할을 한다. 감소된 EIF3E 발현은 유방 상피 세포에서 상피로부터 중간엽으로의 전이를 유발시킨다(Gillis and Lewis, 2013; Grzmil et al., 2010). EIF3E 발현 수준은 방광암에서 유의하게 증가된다(Chen et al., 2011). EIF3E는 비소세포 암종에 관여한다(Marchetti et al., 2001).
ERV3-1과 같은 인간 내인성 레트로바이러스(HERV) env 단백질의 발현은 원발성 유방암 환자의 혈액에서 유의하게 증가하는 것으로 나타났으며, 이것은 원발성 유방암에 대한 진단 표지자로서 HERV env 유전자의 사용가능성을 시사한다(Rhyu et al., 2014). ERV3-1은 덜 분화된 자궁내막 암종, 간 및 폐 종양 조직에서 유의하게 과발현되는 것으로 나타났다(Strissel et al., 2012; Ahn and Kim, 2009). ERV3-1 mRNA 발현의 융모막암종에 대한 감수성과 연관있는 것으로 기술되었다(Kato et al., 1988).
EXTL1의 후성적 비활성화는 백혈병과 비흑색종암의 세포에서 발견되었다. 반대로 EXTL1의 높은 발현은 다발성 골수종 환자에서 불량한 예후와 연관있는 것으로 보고되었다. EXTL1은 인간 공격성 유방암 세포주에서 변형된 N-글리코실화를 갖는 것으로 나타났다(Drake et al., 2012; Busse-Wicher et al., 2014). EXTL1의 결손은 여러 신경모세포종에서 검출되었으며, 이것은 종양 억제 유전자로서 제안되었으나 EXTL1의 신경모세포종의 인과관계 조사에 관여한다는 분명한 증거는 나타나지 않았다(Mathysen et al., 2004).
FCGR2B는 B 세포 상에서 우세한 Fc 수용체이므로 면역요법에 대한 표적이다. 단클론 항체인 리툭시맙은 FCGR2B의 비활성화를 통해 림프구의 증식과 세포자멸사의 조절에 있어서 중요한 역할을 하는 Kv1.3 채널을 억제하며, 또한 인간 B 림프종 세포에서 세포자멸사를 유도한다(Shah et al., 2013; Rankin et al., 2006; Wang et al., 2012). FCGR2B 다형태는 소포 림프종에서 리툭시맙과 같은 특정 면역요법 및 개별특이형 면역접종에 대한 임상적 반응과 상관관계가 있는 것으로 나타났다. 또한, FCGR2B에서의 다형태는 HER 양성 유방암의 치료에서 사용되는 항체인 트라스투주맙에 대한 자연살해 세포의 결합 친화도와 연관이 있었다(Musolino et al., 2008; Weng et al., 2009; Norton et al., 2014). FCGR2B 발현은 NK 세포-매개 항체-의존 세포의 세포 독성에 의해 인간 전이성 흑색종의 용해를 방지함으로써 인간 전이성 흑색종의 표지자 역할을 한다(Cassard et al., 2008).
FCGR2C의 다형태 및/또는 발현 수준과 일부 면역요법들에 대한 반응 사이의 상관관계가 유방암, 경부 편평세포 암종 및 전이성 신세포 암종에서 발견되었다(Petricevic et al., 2013; Trivedi et al., 2016; Erbe et al., 2016).
FMN1에서 단일 뉴클레오티드 다형태는 전립선암의 위험 증가와 연관이 있다(Lisitskaia et al., 2010).
FLCN/FNIP1/FNIP2 복합체는 신장세포의 증식률을 조절하고 유전성 과오종 증후군인 빌트-호그-두베(Birt-Hogg-Dube) 증후군에서 기능적으로 소실된다(Schmidt and Linehan, 2015b; Schmidt and Linehan, 2015a; Hasumi et al., 2016). FNIP1은 불변 자연 살해 T 세포의 발생에 관여한다(Park et al., 2014). FNIP1은 리소좀 모집과 종양 억제인자 FLCN의 Rag 상호작용을 촉진시킨다(Petit et al., 2013). FNIP1은 RagC/D를 통해 mTORC1 활성화에 관여한다(Linehan et al., 2010; Tsun et al., 2013). FNIP1은 신장 종양 억제에 관여하며 치료 표적으로 사용될 수 있다(Hasumi et al., 2015).
FOXD1은 유방암, 신장의 투명세포 육종, 위암 및 호지킨 림프종에서 과발현되는 것으로 나타났다. 이 과발현은 세포 증식을 증가시킬 수 있고 치료 표적으로서 제안되었다. 위암 및 간세포 암종에서 이것은 전사 조절망의 일부인 것으로 발견되었으며, 이 망의 하류 표적 유전자들은 발암에 관여한다(Nagel et al., 2014; Karlsson et al., 2014; Zhao et al., 2015b; Xu et al., 2016a; Chen et al., 2016). 상향조절된 FOXD1 발현 수준은 비소세포 폐암에서 불량한 결과의 예후 표지자로서 판정되었다(Nakayama et al., 2015).
FOXD2는 전립선암과 림프절 전이에서 고도로 발현되는 것으로 발견되었다(Heul-Nieuwenhuijsen et al., 2009). FOXD2는 다른 대장암의 유형에 비해 거치상 선암종에서 다르게 메틸화되는 것으로 나타났으며 이는 이 특정 유형의 대장암을 확인하는 바이오마커로서의 기능을 시사한다(Conesa-Zamora et al., 2015).
GBF1은 아데노바이러스 암 세포 괴사를 강화시키는 숙주 인자로서 확인되었다. 암 세포는 종양가용성 바이러스에 감수성이 있으므로 이러한 바이러스는 암 치료 옵션이 되고, GBF1 넉다운 또는 화학적 억제는 미접힘 단백질 반응을 유발시키는 아데노바이러스 감염에 의해 흑색종 또는 상피암 세포의 괴사를 강화시킨다(Prasad et al., 2014).
난소암 및 간세포 암종에서 GNAI2의 과발현이 관찰되었다. 더욱 구체적으로, GNAI2 발현은 조기의 난소암에서 감소했던 반면, 진행성 암에서는 증가되었으며, 이는 GNAI2가 난소암에서 종양형성의 중대한 조절인자이며 암 진행의 상류 구동인자임을 내포한다(Peters et al., 2005; Raymond, Jr. et al., 2014). GNAI2 발현은 설 편평세포 암종과 같은 다양한 암에서 빈번히 탈조절되는 microRNA-138에 의해 조절되고, 그에 따라 GNAI2가 상향조절된다. GNAI2는 또한 간세포 암종의 세포에서 miR-30d의 기능적 표적이다(Jiang et al., 2011; Yao et al., 2010).
위암에서 GOLGA2의 높은 발현 수준은 병리학적 분화 및 종양결절 전이 단계와 양의 상관관계가 있고 또한 더 짧은 전체 생존 기간을 예측하는 것으로 나타났다. 더욱이, GOLGA2는 SNAI1 발현의 상향조절에 의한 상피-중간엽 이행에 기여한다(Zhao et al., 2015a). GOLGA2 발현은 대장암에서 점진적으로 소실되고, 그러한 소실은 정상-기저부 극성과 전후 극성을 방해하며, 종양발생에 관련 있는 다른 과정에 영향을 미칠 수 있다(Baschieri and Farhan, 2015; Baschieri et al., 2015). GOLGA2는 폐암에서 혈관 신생 및 종양 발생에 대한 암 세포 침윤이 하향조절에 의해 감소되었기 때문에 치료 표적으로 제안되었다(Chang et al., 2012).
GOLGA6A는 뼈의 파제트병 환자에서 다형태가 유전되는 것으로 나타난 영역 중 하나에 위치한다(Chung and Van, 2012). GOLGA6A는 백혈병 유발에 있어서 조기의 작용자인 PAX5의 융합 파트너인 것으로 확인되었다(Coyaud et al., 2010).
염색체 15q13.1 상의 HERC2/OCA2 영역은 피부 흑색종에 취약하게 하는 여러 유전자 자리의 하나이다(Amos et al., 2011; Xiao et al., 2014). HERC2는 CHK1, p53, BRCA1 등 여러 DNA 복구 인자의 안정성을 조절한다(Bekker-Jensen et al., 2010; Cubillos-Rojas et al., 2014; Zhu et al., 2014a; Peng et al., 2015).
식도암에서 HLA-B의 발현 감소는 보다 불량한 생존 기간과 연관되었다. 하지만 위암 및 대장암에서 HLA-B의 예후적 가치는 여전히 상충적이며, 이는 상향조절과 하향조절 모두가 가능하다(Powell et al., 2012; Gallou et al., 2016).
HLA 클래스 I 분자는 NK 세포 및 T 세포를 음으로 조절하는 괴사 면역글로불린 유사 수용체(KIR)의 리간드이며, KIR-HLA 상호작용의 결여는 급성 골수성 백혈병에서 강한 NK 매개 항종양 효능 및 생존 기간의 증가와 연관지어졌다. 난소암과 비소세포 폐암에서 HLA-C의 일부 유전형은 암 발생에 영향을 준다(Romagne et al., 2009; Wisniewski et al., 2012; Giebel et al., 2014). 식도암에서 HLA-C의 발현 감소는 더 불량한 생존 기간과 연관되었다. 하지만 위암 및 대장암에서 HLA-C의 예후적 가치는 여전히 상충적이며, 이는 상향조절과 하향조절 모두가 가능하다. 대장암에서 대부분의 종양 세포는 정상 세포의 HLA 표현형을 흉내내어 NK 매개 면역감시를 회피한다(Gao et al., 2013; Powell et al., 2012; Doubrovina et al., 2003; Benevolo et al., 2007).
HMCN1은 인간 연조직 종양에서 상향조절되는 것으로 발견되었으며 새로운 후보 바이오마커 및 치료 표적을 대표할 수 있다(Sarver et al., 2015). HMCN1은 피부 발생과 상피 형태발생에 관여하는 것으로 발견되었으며, 복수의 약물내성 난소암 세포에서 하향조절된 발현을 나타냈다(Januchowski et al., 2014; Westcot et al., 2015). 더욱이, HMCN1은 위암과 대장암에서 세포 극성과 관련이 있고 체세포 돌연변이가 발생한다(Lee et al., 2015).
IDH3G는 위암에서 차등적으로 발현되는 것으로 발견되었으며 약물 내성과 연관이 있을 수 있다(Zhou et al., 2015).
IL4I1 단백질 발현은 종양에서 매우 빈번하다. IL4I1은 여러 종양 객체의 종양-연관 대식세포에서, 림프종의 종양 세포에서 및 드문 경우에 주로 고형 암 중피종에서 검출되었다(Carbonnelle-Puscian et al., 2009). 인간 Th17 세포에서 IL4I1 상향조절은 IL-2 촉진인자의 활성화에 관여하는 분자 경로의 차단에 의해 및 높은 수준의 Tob1 유지에 의해 T 세포 수용체(TCR) 매개 확장을 제한하며, 이것은 세포 주기로의 진입을 손상시킨다(Santarlasci et al., 2014).
IPO9는 단백질 임포틴(importin) 9를 인코딩하며, 이 단백질은 면역계 및 신경계 모두에서 Ras/Erk 경로와 같은 신호전달 경로의 활성화에 의해 또는 미토콘드리아 매개 세포자멸사의 강화에 의해 세포 기능의 조절에 중요하다(Murrin and Talbot, 2007; Wang et al., 2002).
ITGA10의 탈조절은 백혈병에서 ERG, 폐암에서 miR-375 또는 전립선암에서 EPHB4와 같은 다른 암 유전자의 탈조절에 대한 하류 영향인 것으로 나타났다(Mertens-Walker et al., 2015; Mochmann et al., 2014; Jin et al., 2015). ITGA10은 pRb 경로의 빈번한 비활성화를 초래하는 고형 골모세포에서 저발현되는 것으로 발견되었다(Engel et al., 2013).
ITPR2 유전자에서 단일 뉴클레오티드 다형태는 중국 모집단에서 신세포 암종의 위험과 상관관계가 있었다. 마찬가지로, ITPR2 유전자에서 연관 불평형의 두 공동 변이체인 rs718314 및 rs1049380이 신세포 암종에서 새로운 감수성 위치로 확인되었다. 더욱이, 건강한 개인에 비해 정상적인 급성 골수종 백혈병 환자에서 ITPR2의 과발현이 관찰되었다(Wu et al., 2012; Shi et al., 2015a; Zhang et al., 2016b). 정상적인 급성 골수종 백혈병에서, ITPR2 발현의 상승된 수준은 전체 생존 기간의 감소 및 무사건 생존 기간과 관련이 있었다(Shi et al., 2015a).
ITPR3은 대장암, 위암 및 유방암 등을 포함한 여러 암 유형에서 과발현되고 암 진행과 종양의 공격성과 직접 관련이 있다(Shibao et al., 2010; Mound et al., 2013; Sakakura et al., 2003). Akt는 소포체로부터의 Ca2 + 방출을 감소시킴으로써 ITPR3 의존 방식으로 세포를 세포자멸사로부터 보호한다(Marchi et al., 2012).
연구자들의 관찰에 의하면 KIFAP3 유전자에 대한 mRNA 발현의 수준은 비암성 신장피질 조직 샘플에 비해 암성 조직 샘플에서 유의하게 감소했다. 다른 이들은 유방암에서 KIFAP3 단백질의 과발현을 보고했다. 다른 군에서는 KIFAP3 유전자의 발현이 재조합 브로멜리인으로 처리한 유방암 세포와 대조군 세포 사이에 유의한 차이가 있음을 보여주었다(Gotoh et al., 2014; Fouz et al., 2014; Telikicherla et al., 2012).
MACROD2는 간암, 대장암, 위암 및 식도 편평세포 암종에서 체세포 변형(흔히 유전자내 결손)을 나타냈다(Briffa et al., 2015; Tada et al., 2010; van den Broek et al., 2015; Hu et al., 2016; Fujimoto et al., 2016). MACROD2는 에스트로겐 알파(ER) 조절 유전자들의 하위조합에서 에스트로겐 반응 요소들에 대한 p300 결합을 증가시키고, 원발성 유방 종양에서 발현의 증가를 보이며 악화된 전체 생존 기간과 연관이 있다(Mohseni et al., 2014). MACROD2 유전자는 다양한 암 유형에서 결손되는 것으로 나타났지만, MACROD2의 종양 억제인자 역할은 확립할 수 없었다(Rajaram et al., 2013). MACROD2는 MAR화에서 역할을 하며 표적 단백질에 대한 이 변형을 "읽고" "지울" 수 있다(Feijs et al., 2013).
MAGEC2의 과별현은 사이클린 E의 수준을 증가시키며 G1-S 전이 및 세포 증식을 촉진한다(Hao et al., 2015). MAGEC2는 다발성 골수종에서 증식 및 세포자멸사에 대한 저항을 촉진하는데 이는 MAGEC2-특이적 면역요법이 가장 악성인 세포를 박멸시킬 수 있음을 시사한다(Lajmi et al., 2015). MAGEC2는 상피중간엽 이행 유도제로서 유방암 전이와 연관이 있다. 다변량 분석에서 MAGEC2 발현이 환자의 전체 생존 기간 및 무전이 생존 기간에 대한 독립적 위험 요인이었다(Yang et al., 2014).
위에서 언급된 METAP2의 발현 증가 및 METAPA2 억제제의 항암 효과가 다양한 암에서 연구되었으며, 비소세포 폐암, 모양세포성 성상세포종, 결장 및 대장암 및 신경모세포종 등이다(Morowitz et al., 2005; Selvakumar et al., 2009; Ho et al., 2013; Shimizu et al., 2016).
MFI2의 정확한 생물학적 기능은 여전히 규정하기 어렵지만, 철분 운반/대사, 혈관신생, 증식, 세포 이동 및 종양형성 등 증가하는 수가 이 단백질의 역할로 간주되었다. MFI2를 과발현하는 종양들은 항체-약물 접합체에 민감한 표적으로 제안되었다(Dunn et al., 2006; Smith et al., 2006; Suryo et al., 2012). MIF2 수준은 대장암의 혈장 수준에서 유의하게 증가한 것으로 나타났으므로 혈청학적 표지자가 될 가능성이 있다. 이것은 양성 종양에서 음성 종양으로의 전환에도 관대할 수 있고 침윤성 종양 표현형의 표지자이다(Shin et al., 2014; Dus-Szachniewicz et al., 2015).
MTCH2가 유방암에서 상향조절되는 miR-135b에 의해 억제된다고 보고되었으며, miR-135b와 그 표적들인 MID1 및 MTCH2는 유선 종양 진행과 관련있는 조율인자인 것으로 보인다(Arigoni et al., 2013). MTCH2는 림프종과 원발성 백혈병의 세포에서 신속한 ABT-737 유도 세포자멸사에 관여하는 것으로 보인다. ABT-737은 MTCH2를 유도하며, 그에 따라 미토콘드리아 기질의 부풀기와 미토콘드리아 외막의 파열을 초래한다(Vogler et al., 2008).
폴리(A) 중합효소에 대한 항체는 백혈병, 진성 적혈구증가증 및 윌름즈 종양 환자의 혈청 샘플에서 관찰되었다(Stetler et al., 1981).
MYO5A는 Akt2/MYO5A 활성화를 통해 종양내성을 촉진시키는 흑색종에서의 새로운 이동 경로와 연관있는 것으로 나타났다(Fernandez-Perez et al., 2013). MYO5A는 침윤성 비기능 뇌하수체 선종에서 상향조절되고, 따라서 종양 침윤성의 유용한 표지자의 역할을 할 수 있다(Galland et al., 2010). MYO5A mRNA 발현은 다수의 고도 전이성 암 세포주와 전이성 대장암 조직에서 증가되었다. 더욱이, 이러한 암 세포에서 MYO5A의 억제는 시험관내 및 생체내 모두에서 이동 및 전이 능력을 방해한다(Lan et al., 2010). MYO5A는 구강 편평세포 암종에서 잠재 결절 전이 확인을 위한 4-유전자 모델에서 적용할 수 있는 것으로 나타났다(Mendez et al., 2011).
NAA30은 저산소증 반응(HIF1α), p-MTOR(Ser2448)의 수준 및 p53 경로의 조절에 의해 교모세포종 개시 세포의 성장과 생존에서 중요한 역할을 수행할 수 있다(Mughal et al., 2015). NAA30은 더 고등한 진핵생물의 발생 또는 암종에서 차등적으로 발현되므로 신속한 단백질 합성이 진행되는 세포에서 더 고도로 발현되는 것으로 제안된다(Polevoda and Sherman, 2003).
NAV2는 뉴론 네비게이터 유전자 계열의 구성원을 인코딩하며, 이것은 세포 성장 및 이동에서 역할을 수행할 수 있다. NAV2는 결장암군에서 특이적으로 발현되는 것으로 나타났으며 NAV2의 안티센스 올리고뉴클레오티드에 의한 결장암 세포의 치료는 세포자멸사를 유도했다(Ishiguro et al., 2002).
간암 세포에서 p53의 소실은 NES 발현에 대한 책임이 있는 것으로 나타났으며, 유방암에서 NES는 Wnt/베타-카테닌 활성화에 의해 암 발생에 기여한다(Zhao et al., 2014; Tschaharganeh et al., 2014). NES 발현 증가가 췌관 선암종, 악성 흑색종, 자궁암, 전립선암, 유방암 및 간암을 포함한 다양한 종양 세포에서 보고되었다. NES 발현은 공격성의 특징인 전이와 상관관계가 있고 불량한 예후의 바이오마커이다. 더욱이, NES는 새로 합성된 종양의 혈관에 대한 표지자일 수 있고, 또한 종양 혈관신생을 억제하는 치료 표적으로도 제안되었다(Ishiwata et al., 2011; Su et al., 2013; Matsuda et al., 2016; Hope et al., 2016).
NME5는 고환 및 췌장암 및 유방암과 같은 일부 인간 암의 유형에서 고도로 발현되고 췌장암 세포에서 젬시타빈에 대한 선천적 내성과 연관이 있다(Parris et al., 2010; Li et al., 2012a; Li et al., 2012b).
NUP160-SLC43A3은 혈관육종에서 재발 융합 종양유전자이며 종양 진행과 연관이 있다(Shimozono et al., 2015).
P2RX7 체계는 상피 세포에서 중요한 세포자멸사 유발(pro-apoptosis)의 조절인자이며 유두종 및 상피 암에서 화학예방의 역할을 한다. 콜레스테롤 저하 약물인 스타틴은 P2RX7을 통해 공격적 전립선암의 침윤성과 위험을 감소시킬 수 있다. 또한, P2X7 단일 뉴클레오티드 다형태는 맞춤형 요법의 개발을 위한 진단 바이오마커로서 이용될 수 있다(Fu et al., 2009; Gorodeski, 2009; Ghalali et al., 2014; Roger et al., 2015; De et al., 2016). P2RX7 발현 수준은 원발성 골 종양 및 다발성 골수종, 신경모세포종, 유방암 및 전립선암과 같은 다른 악성 종양에서 상승된다. 골모세포가 촉진하는 종양 발생에서 P2RX7이 NFATc1, PI3K/Akt, ROCK 및 VEGF 경로를 유발시킨다는 증거가 있다(Adinolfi et al., 2012). P2X7은 간세포 암종에서 잠재적인 예후 표지자이며, 이 암에서 높은 종양주위의 P2RX7 발현은 불리한 전체 생존 기간을 나타낸다(Liu et al., 2015a).
PARVA는 대장암에서 과발현되고, 이 암에서 종양 침윤, 림프절 전이 및 질병 병기 및 인테그린 연계 키나제, p-AKT 및 핵 β-카테닌의 과발현 및 E-카드헤린의 하향조절과 유의한 상관관계가 있다(Bravou et al., 2015). PARVA의 과발현은 ILK 신호전달에 영향을 미치고, 그에 따른 Akt 및 GSK3베타의 인산화에 의해 폐 선암종의 종양원성, 혈관신생 및 전이를 촉진시켰다(Huang et al., 2015). PARVA는 난소암, 비소세포 폐암종, 전립선암 및 인간 간세포 암종에서 빈번히 과발현되었으며, 이러한 암에서의 과발현은 서바이빈 단백질, β-카테닌 및 라파마이신 경로의 포유동물 표적에 대한 강화와 p53의 억제에 의해 종양의 크기, 병기 및 전이와 양적 상관관계가 있다(Orr et al., 2012; Davidson et al., 2013; Augustin et al., 2013; Ng et al., 2013; Seydi et al., 2015). 더욱이, 유방암 세포에서 PARVA는 인산화에 의해 빈번히 조절되어 Rho GTPase 신호전달의 조절을 통해 기질 분해 및 세포 침윤을 초래하는 것으로 나타났다(Pignatelli et al., 2012). PARVA는 인테그린 연계 키나제 및 인테그린에 대한 신호전달 플랫폼으로 기능하는 PINCH와 IPP 복합체를 형성할 수 있으므로 전립선암과 침윤성 소엽 암종에서 상향조절되는 것으로 나타났다(Kim et al., 2015b; Aakula et al., 2016; Ito et al., 2014).
PBK는 c-Jun의 인산화 및 활성화에 의해 EGFR 티로신 키나제에 대한 폐암 내성을 촉진시킨다(Li et al., 2016b). PBK의 과발현은 전립선암에서 E2F1의 조절을 통해 악성 표현형을 부여한다(Chen et al., 2015a). PBK를 표적화하면 시험관 내에서 신경아교종 개시 세포의 성장과 생존이 감소되고, 생체 내에서 종양 성장이 약화된다(Joel et al., 2015). 인간 암의 이종이식 모델에서 PBK 억제는 세포질 분열의 억제를 통해 완전 종양 퇴행을 유도한다(Matsuo et al., 2014).
간세포 암종에서 정상 간 조직에 비해 PI4KA의 상승된 수준이 관찰되었다. 또한, PI4KA 유전자는 췌장암 세포주에서 검출되었다(Ishikawa et al., 2003; Ilboudo et al., 2014). PI4KA mRNA 농도가 보다 높은 간세포 암종을 앓는 환자는 종양 재발의 위험이 더 높고 질병특이적 생존 기간이 더 짧았다(Ilboudo et al., 2014). 최근에 PI4KA가 수모세포종 세포주에서 세포 증식 및 시스플라틴 치료에 대한 내성에 관여하는 것으로 확인되었다. 다른 이들은 PI4KA가 췌장암의 침윤 및 전이에서 중대한 역할을 한다는 것을 밝혔다(Ishikawa et al., 2003; Guerreiro et al., 2011).
대장암과 방광 암종에서 PLA2G4A 발현이 상향조절되고, 이는 COX-2에 아라키돈산을 제공하며, 이에 따라 프로스타글란딘 수준의 증가를 초래한다. 상향조절은 염증 상태의 연장으로 인해 발생할 수 있다(Osterstrom et al., 2002; Dong et al., 2005; Parhamifar et al., 2005; Shi et al., 2006). 위암에서 PLA2G4A 및 COX-2 발현의 증가는 모두 불리한 생존 기간과 연관이 있었으며, PLA2G4A는 COX-2 억제제와 병용하는 위암에 대한 미래의 치료 접근 방식에서 유망한 표적의 역할을 할 수 있다. 또한, PLA2G4A의 억제는 방사선 요법에 대해 종양을 민감하게 할 수 있다(Linkous et al., 2009; Zhang et al., 2013).
PLEC에 대한 유전자는 세포골격 및 유착 복합체의 교차결합과 조직에 관여하는 단백질인 플라킨(plakin) 계열 구성원 플렉틴(plectin)을 인코딩한다(Bouameur et al., 2014). PLEC는 대장 선암종, 두경부 편평세포 암종 및 췌장암에서 과발현된다(Lee et al., 2004; Katada et al., 2012; Bausch et al., 2011).
PMEL은 흑색종에서 항체 약물 복합체 요법에 대한 표적으로 기술되었다(Chen et al., 2012). PMEL은 흑색종에서 파클리탁셀과 시스플라틴과 연관된 것으로 나타났다(Hertzman et al., 2013). PMEL은 악성 흑색종의 진단에서 진전 가능성을 제공하는 표적이 있는 선택되는 반응 감시 분석에 적용되는 9가지 단백질 중 하나로서 기술되었다(Welinder et al., 2014a).
POLM은 템플릿/프라이머의 오정렬 및 오편입을 유도하기 쉬운, 오류 경향이 있는 DNA 복구 효소이다. 높은 발현 수준이 버킷 림프종 유래의 B 세포주에서 체세포 과다변이에 관여하는 것으로 사료된다(Ruiz et al., 2004; Fernandez and Albar, 2012).
일부 연구자들은 정상 갑상선 조직 및 분화된 갑상선 종양에 비해 미분화 갑상선 암종에서 PRKAR1A 발현의 유의한 증가를 관찰했다. 이와 대조적으로, 치원성 종양의 아집단에서 PRKAR1A 발현의 하향조절이 보고되었다. 다른 군이 밝힌 바에 의하면 PRKAR1A는 치원성 점액종 및 단발성 부신피질 선종에 관여할 수 있다(Bertherat et al., 2003; Perdigao et al., 2005; Ferrero et al., 2015; Sousa et al., 2015).
PSMA2는 다발성 골수종과 면역글로불린 경쇄 아밀로이드증의 혈장 세포에서 차등적으로 발현된다(Abraham et al., 2005). PSMA2는 메토트렉세이트 내성 유방암 MCF-7 세포에서 하향조절된다(Chen et al., 2014c).
PSMB7 발현은 다른 구조적 프로테아솜 유전자와 함께 대부분의 암 유형에서 증가된다. 유방암과 대장암에서 PSMB7의 높은 발현은 부정적인 예후 표지자로서 보고되었다. 간세포 암종 및 유방암에서 이것은 화학요법 내성에 기여할 수 있다(Rho et al., 2008; Munkacsy et al., 2010; Tan et al., 2014; Rouette et al., 2016).
PTPN14는 TGF-베타 신호전달을 유도하며, 내피-중간엽 이행 및 기관형성을 조절한다(Wyatt and Khew-Goodall, 2008). PTPN14는 담관암종에서 하향조절되고 임상-병리학적 특징 및 생존과 역 상관관계가 있다(Wang et al., 2015d; Wang et al., 2015c). PTPN14는 가용성 및 막-결합된 단백질의 교통을 억제함으로써 전이의 예방을 가져온다(Belle et al., 2015). PTPN14는 기관 크기 및 종양형성에 대한 책임이 있는 Hippo 경로에서의 주요 단백질인 종양단백질 Yes-연관 단백질(YAP)을 음으로 조절한다(Liu et al., 2013; Huang et al., 2013; Lin et al., 2013). PTPN14에서의 기능소실 돌연변이는 신경모세포종 재발, 유방암 및 대장암에 관여한다(Laczmanska and Sasiadek, 2011; Wang et al., 2004; Schramm et al., 2015; Wyatt and Khew-Goodall, 2008).
RAD21은 염색체 분리 및 DNA 복구에 중대한 코헤신 복합체의 성분이다. RAD21은 위장관 종양, 대장 암종, 진행성 자궁내막암, 전립선암 및 유방암에서 과발현된다(Atienza et al., 2005; Deb et al., 2014; Porkka et al., 2004; Supernat et al., 2012; Xu et al., 2014).
RAD50은 MRE11 및 NBS1과 MRN 복합체를 형성하며, 이 복합체는 DNA에 결합하며 DNA 말단의 비상동성 결합에 필요한 다수의 효소 활성을 나타내고, 이중가닥 절단 복구, 세포 주기 체크포인트 활성화, 텔로미어 유지 및 감수분열 재조합에 중요하다. 이 유전자에서의 돌연변이는 나이메헨(Nijmegen) 파손 증후군 유사 장애의 원인이다(RefSeq, 2002). RAD50 결손은 기저 유사 유방암 및 난소암에서 공통된 것으로 보이며, 유의하게 더 나은 전체 생존 기간과 연관이 있었다. 결손은 흔히 BRCA1, RB1, TP53, PTEN 및 INPP4B의 결손과 함께 발생하며, RAD50과 INPP4B의 발현 수준은 유방암의 생존 기간에 시너지 효과가 있는데 이는 치료 반응에 미치는 영향을 통해서일 것이다(Weigman et al., 2012; Dai et al., 2015; Zhang et al., 2016a). 대장암에서 RAD50의 과발현은 암 진행에 관여할 수 있다. 전사 인자 BTF3이 과발현되는 경우 RAD50이 고도로 발현되고, 원발성 종양에서 과발현은 종양의 조기 병기, 더 나은 분화, 높은 염증성 침윤 및 p53 과발현과 관련있는 것으로 보인다(Wang et al., 2013a; Gao et al., 2008). RAD50은 유전적 유방 및 난소 암, 대장암에서 빈번히 돌연변이되는 것으로 나타났으며, 전이성 비소세포 폐에서의 RAD50 돌연변이는 전신 병용 요법에 대한 치유 반응에 기인한다(Al-Ahmadie et al., 2014; Rajkumar et al., 2015).
RANBP2-ALK 유전자 융합은 백혈병과 림프종을 포함한 여러 암 객체에서 검출가능하다(Lim et al., 2014; Chen and Lee, 2008; Maesako et al., 2014; Lee et al., 2014). RANBP2는 유사분열에서 Topo II 알파를 수모화하며 이 변형은 내부 중심체에 대한 적합한 국소화에 필요하다. 이에 따라 RANBP2는 염색체 분리 오류의 방지에 있어서 중요한 역할을 한다(Navarro and Bachant, 2008; Dawlaty et al., 2008).
연구자들은 RAPGEF6을 폐암종 세포에서 유착 접합부의 성숙화에 요구되는 Rap1의 상류 활성인자로서 확인했다(Dube et al., 2008). 또 다른 군에서는 유방암 세포와 유방암 환자의 일차 배양액에서 JAM-A, AF-6 및 RAPGEF6 사이의 복합체 형성을 보여주었다(McSherry et al., 2011).
RBM4는 여러 객체에서 과발현되는 스플라이싱 인자로서 RGPD1을 대안적으로 스플라이싱한다(Markus et al., 2016). CG-1521은 항증식성 암 약물이며 RGPD1 발현을 상향조절한다(Chatterjee et al., 2013).
RBM4는 여러 객체에서 과발현되는 스플라이싱 인자로서 RGPD2를 대안적으로 스플라이싱한다(Markus et al., 2016). NEAT1-RGPD2, RGPD2-FASN 및 RGPD2-MALAT1은 원발성 유방암에서 검출되는 융합 전사물이다(Kim et al., 2015a). RGPD2는 급성 골수단구성 백혈병에서 ALK 융합 파트너일 수 있다(Lim et al., 2014). CG-1521은 항증식성 암 약물이며 RGPD2 발현을 상향조절한다(Chatterjee et al., 2013). RGPD3은 RANBP2 유사 및 영장류에서의 복제를 통해 발생한 염색체 2 상의 Ran 결합 단백질 관련 유전자들의 클러스터에 위치한 GRIP 도메인 함유 3을 인코딩한다. 인코딩된 단백질은 N-말단 TPR(테트라트리코 펩티드 반복) 도메인, 2개의 Ran-결합 도메인 및 C-말단 GRIP(golgin-97, RanBP2alpha, Imh1p 및 p230/golgin-245) 도메인을 포함한다(RefSeq, 2002). RGPD3은 췌장 선암종에서 3D HotMAPS 영역을 가진 암 유전자이다(Tokheim et al., 2016). RGPD3은 HOXB7의 표적 유전자일 수 있다(Heinonen et al., 2015). 디오스신(Dioscin)은 결장암 세포에서 RGPD3 발현을 변형시킨다(Chen et al., 2014a). ANAPC1과 RGPD3의 유전자 융합 전사물이 비인두 암종에서 보고되었다(Chung et al., 2013). CG-1521은 항증식성 암 약물이며 RGPD3 발현을 상향조절한다(Chatterjee et al., 2013). RGPD3은 위장관 기질 종양과 수막종에서 돌연변이된다(Brastianos et al., 2013).
RGPD8은 전립선암과 신경아교종에서 주로 변형된다(Meszaros et al., 2016). RGPD8은 갑상선암과 연관있는 동형적합성 계열의 일부이다(Thomsen et al., 2016). CG-1521은 항증식성 암 약물이며 RGPD8 발현을 상향조절한다(Chatterjee et al., 2013).
RICTOR은 mTOR과 상호작용할 수 있으므로, PI3K/AKt/mTOR 신호전달 경로에서 주요 역할을 수행하며, 소세포 폐암, 폐의 대세포 신경 내분비 암종, 유방암, 췌장암, 대장암과 같은 다양한 암 유형에서 상향조절되는 것으로 발견되었다(Suh et al., 2016; Morrison et al., 2016; Miyoshi et al., 2016; Visuttijai et al., 2016; Sticz et al., 2016; Driscoll et al., 2016; Sakre et al., 2016). RICTOR 다형태는 비소세포 폐암 및 유방암에서 발견되었으며 이러한 암의 진행 및 전이와 관련이 있었다(Zhou et al., 2016; Wang et al., 2016b). RICTOR은 PRICKLE1-MINK1-RICTOR 복합체의 형성에 참여하며, 이는 AKT의 활성화, 국소성 부착의 조절 및 암 세포 이동에 요구된다(Daulat et al., 2016). RICTOR 과발현은 대장암의 발암의 진행과 연관이 있고 대장암 환자의 예후 평가를 위한 독립적 지표가 될 수 있다(Wang et al., 2016a).
ROPN1은 전립선암, 급성 골수성 백혈병, 다발성 골수종 및 기저 유사 유방암에서 발현되는 암-고환 항원이며 전립선암의 잠재적인 혈청학적 바이오마커로 제안되었다. 이것은 암-고환 항체로서 종양 면역요법에 대해 매력적인 표적을 나타낸다(Chiriva-Internati et al., 2011; Atanackovic et al., 2011; Ivanov et al., 2013; Adeola et al., 2016).
S100A1은 구강암과 방광 종양에서 하향조절되는 것으로 발견되었으나 난소암에서는 상향조절되었으며, 위암에서 S100A1의 상향조절은 프리온 단백질 PRNP의 과발현에 의해 유발되었다(Hibbs et al., 2004; Liang et al., 2007; Yao et al., 2007; Tyszkiewicz et al., 2014). S100A1은 암의 아형을 분화하는 잠재적으로 강력한 표지자일 수 있다. 이것은 혐색소성 신세포 암종을 신장 호산성 과립세포종으로부터 구별하는데 도움이 될 수 있고 비기저 유방암에 비해 기저 유형 유방암에서 상향조절된다. S100A1은 자궁내막암 아형의 암에 대한 불량한 예후의 표지자로서도 역할을 할 수 있다(Li et al., 2007; DeRycke et al., 2009; McKiernan et al., 2011).
SERPINE2는 종양 미세환경에서 종양 촉진 상태를 생성하며 여러 방식에 의해 종양 기질 침착을 조절한다. 또한, 혈관 모방에도 관여한다(Smirnova et al., 2016). SERPINE2는 유방암, 전립선암 및 고환암에서 과발현되고 전이의 발생을 촉진시킨다. 위암에서 SERPINE2 상향조절은 공격적 표현형에 기여할 수 있고 새로운 예후 인자 및 항암 표적(예컨대, 단클론 항체를 통해)으로서 제안되었다(Smirnova et al., 2016; Nagahara et al., 2010; Kousted et al., 2014; Wang et al., 2015b; Wagenblast et al., 2015). 전립선암에서 SERPINE2 발현은 뚜렷한 암유전자 경로를 하향조절하며 헤지호그 신호전달 및 혈관신생을 억제하는 것으로 보인다(McKee et al., 2013; McKee et al., 2015).
SGK1 발현은 난소암에서 화학요법의 효과를 감소시킬 수 있는 글루코코르티코이드 투여에 의해 신속히 상향조절된다. 이에 따라, 이소플라비노이드 제니스타인은 SGK1 발현의 감소에 의해 대장암에 대해 억제 효과를 갖는 것으로 발견되었다(Melhem et al., 2009; Qin et al., 2015). 전립선 암종, 비소세포 폐암 및 간세포 암종을 포함한 여러 인간 종양에서 증가된 SGK1 발현이 발견되었다. SGK1은 항세포자멸사 성질을 갖고, MDM2의 인산화를 통해 세포의 생존, 증식 및 분화를 조절하고, 이것은 p53의 유비퀴틴화 및 프로테아좀 분해를 초래한다. 직접적 SGK1 억제는 간암 요법 단독 또는 방사선요법과의 병용 시 효과적일 수 있다(Lang et al., 2010; Abbruzzese et al., 2012; Isikbay et al., 2014; Talarico et al., 2015).
SGK3 기능은 결장암과 유방암에서 암 유전자의 구동인자 INPP4B와 연관 있는 것으로 나타났다(Gasser et al., 2014; Guo et al., 2015). SGK3은 유방암, 난소암, 간세포 암종을 포함한 다양한 암에서 암유전자 진행에 대한 중심적 역할을 매개하는 포스파티딜 이노시톨 3-키나제 암유전자 신호전달의 하류 매개인자로서 기술되었다(Hou et al., 2015). SGK3은 세포의 증식, 성장, 이동 및 종양 혈관신생에서 다수의 분자들과 상호작용하는 특징의 역할을 하는 것으로 기술되었다(Hou et al., 2015). SGK3은 각각 글리코겐 합성효소 키나제 3 베타 및 Bcl-2 연관 세포사 촉진인자를 통해 간세포 암종의 성장과 생존을 촉진시키는 것으로 나타났다(Liu et al., 2012). SGK3은 간세포 암종 환자에서 불량한 결과와 연관있는 것으로 나타났다(Liu et al., 2012). 따라서, SGK3은 간세포 암종의 결과 예측 및 새로운 치료 표적을 위한 예후 바이오마커를 제공할 수 있다(Liu et al., 2012). SGK3은 BRAF-변이체 흑색종의 성장에 기여하는 흑색종 세포에서 PDK1 활동의 중요한 매개인자로서 기술되었으며 잠재적 치료 표적일 수 있다(Scortegagna et al., 2015). SGK3은 p70 S6 키나제의 활성화 및 사이클린 D1의 상향조절을 통해 전립선암 증식을 촉진하는 안드로겐 수용체 전사 표적으로 기술되었다(Wang et al., 2014). SGK3의 넉다운은 세포 주기에서 G1 기로부터 S 기로의 진행을 억제함으로써 LNCaP 전립선암 세포의 증식을 감소시키는 것으로 나타났다(Wang et al., 2014). SGK3은 유방암에서 에스트로겐 수용체 발현과 연관이 있는 것으로 나타났으며 그 발현은 종양 예후와 양의 상관관계가 있는 것으로 나타났다(Xu et al., 2012).
SHC4는 EGFR-결합 파트너 및 Grb2 플랫폼을 대표하며 비표준적으로 행동하여 선택되는 EGFR 잔기의 인산화를 촉진하는 것으로 나타났다(Wills et al., 2014). SHC4는 막 수용체와 상호작용하며, MAPK 및 Akt 등 중추 케스케이드에 관여하고, 또한 산화적 스트레스 및 세포자멸사에 비전통적으로 기여한다(Wills and Jones, 2012).
SLC4A5의 전사 수준은 요법 내성인 난소 암종 세포에서 유의하게 더 높은 것으로 발견되었다(Pelzl et al., 2015). SLC4A5는 표현형 기질에 관여하는 색소침착 유전자를 대표하며, 이에는 흰 피부, 연한 눈 색깔 및 불량한 태닝 능력이 포함되고 이것들은 모두 흑색종 위험과 연결된다(Nan et al., 2009; Pho and Leachman, 2010).
SLC29A1은 화학요법에서 젬시타빈 및 5-플루오로우라실의 세포내 섭취에 관여하는 주요 수송체이며, 위암과 대장 암종에서 상향조절되는 것으로 발견되었다. 췌장암에서, 이것은 젬시타빈 요법의 이익에 대한 예측 표지자로서 검증되었으며 담관암종에서도 동일하게 제안되었다(Shimakata et al., 2016; Hagmann et al., 2010; North et al., 2014; Nordh et al., 2014; Brandi et al., 2016; Kunicka et al., 2016). SLC29A1은 투명세포 신세포 암종의 부신으로의 전이를 원발성 부신피질 종양 또는 정상 부신으로부터 구별하는 표지자로서 확인되었다(Li et al., 2015a).
SLC45A2는 흑색종 세포주에서 고도로 강화되는 것으로 나타났다(Bin et al., 2015). SLC45A2에서 단일 뉴클레오티드 다형태는 피부 혹색종 위험 및 피부 기저 세포 암종 및 편평 세포 암종과 연관이 있었다(Antonopoulou et al., 2015; Stacey et al., 2009).
SNCA는 수질모세포종, 신경모세포종, 송과체모세포종 및 신경절종과 같은 다양한 뇌 종양에서 널리 발현되고 또한 난소암과 유방암 등 말초암에서도 발현된다. 조직에서 SNCA 발현의 수준 결정은 전이성 흑색종을 검출하는 바이오마커일 수 있다(Fujita et al., 2007; Matsuo and Kamitani, 2010; Welinder et al., 2014b). SNCA 촉진인자는 대장암과 선암종에서 빈번히 과메틸화되고 조기의 비침윤성 검출을 위한 적절한 바이오마커일 수 있다(Lind et al., 2011; Li et al., 2015e).
다오이(Daoy) 인간 속질모세포종 세포주에서 SNRPN의 넉다운은 증식과 집락 형성 능력을 감소시키는 것으로 나타났으며, 이는 SNRPN이 인간 속질모세포종에서 약리적 치료의 개발을 위한 잠재적인 새로운 표적일 수 있음을 나타낸다(Jing et al., 2015). BxPC-3 췌장 선암종 세포주에서 SNRPN의 넉다운은 증식 능력과 손상된 세포 집락의 형성을 감소시키는 것으로 나타났다. 그 결핍은 또한 S 기 세포 주기 정지와 세포자멸사를 유도하는 것으로도 나타났다(Ma et al., 2015). BxPC-3 췌장 선암종 세포에서 SNRPN의 결핍은 S 기 세포 주기 정지와 세포자멸사를 유도하는 것으로도 나타났다(Ma et al., 2015). SNRPN의 넉다운은 구체적으로 백인의 전립선암 세포주에서 침윤과 증식의 유의한 감소를 초래하는 것으로 나타났다(Devaney et al., 2015).
SNX14는 생쥐 배아 섬유모세포의 rasV12/E1A 전환 시 하향조절되고 종양 발생과 연관이 있을 수 있다(Vasseur et al., 2005).
SOX5는 유방암 세포와 간세포 암종에서 상향조절된다. 또한 Twist1의 전사촉진에 의해 상피-중간엽 이행을 유도한다(Moon et al., 2014; Wang et al., 2015a). SOX5는 신경아교종 조직에서 발현되지만 고환을 제외한 정상의 성인 조직에서는 발현되지 않는다. 추가적으로, SOX5에 대한 항체는 27명의 신경아교종 환자 중 8명의 혈청에서 검출되었으며, SOX5에 대해 IgG 반응을 보인 환자들은 SOX5 항체가 없는 환자보다 훨씬 더 나은 생존 기간을 나타냈다(Ueda et al., 2007). 다른 새로운 과메틸화된 유전자들(AKR1B1, CHST10, ELOVL4, STK33, ZNF304)과 더불어, SOX5는 결장 직장 암종에서 잠재적인 메틸화 바이오마커 및 빈크리스틴의 치료 표적인 것으로 밝혀졌다(Pei et al., 2014).
SOX6은 보존된 DNA 결합 및 DNA의 좁은 홈에 결합하는 능력으로 특징지어지는 성 결정 부위의 y 관련 전사 인자들의 D 하위계열의 구성원이다. SOX6은 중추신경계의 정상 발육, 연골형성 및 심근과 골격근 세포의 유지에 요구되는 전사 활성인자이다. 이것은 다른 계열 구성원들과 상호작용하여 유전자 발현의 활성화에 협력한다(RefSeq, 2002). SOX6은 골수성 백혈병, 간세포 암종 및 식도 편평세포 암종(ESCC)에서 종양 억제 인자로 기능한다. SOX6은 ESCC에서 빈번히 하향조절되는 것으로 발견되었으며 하향조절은 불량한 생존 기간과 상관관계가 있다. SOX6의 종양 억제 기전은 p53 및 p21의 발현 상향조절 및 사이클린의 발현 하향조절에 의한 G1/S 세포 주기가 정지에서의 역할과 연관이 있었다(Qin et al., 2011b; Cantu et al., 2011; Guo et al., 2013). SOX-6은 암-고환 유전자로서 간주되고, 수막종과 교모세포종을 포함한 인간 중추신경계 종양의 높은 비율에서 발현되는 것으로 발견되었으며 중추신경계 종양에 대한 면역요법의 잠재적 표적일 수 있다(Lee et al., 2008).
SRGAP1은 세포주 U87-IM3 및 U251-IM3에서 다형성 교모세포종, 비수질성 갑상선 암종의 가족성 형태, 유두상 갑상선 암종 및 상피 난소암과 연관 있는 것으로 나타났다(He et al., 2013; Chen et al., 2014b; Pereira et al., 2015; Koo et al., 2015).
SRGAP2는 재발성 삼중음성 유방암의 분자적 특성의 조사에서 상향조절되는 것으로 발견되었으며 세포 유착 및 이동성과 연관이 있었다(Tsai et al., 2015).
SRGAP3 발현은 여러 유방암 세포주에서 하향조절되고 SRGAP3은 아마도 Rac1의 음성 조절인자로서의 활성을 통해 모든 유선 상피 세포에서 종양 억제인자 유사 활성도를 갖는다(Lahoz and Hall, 2013). 모양세포성 성상세포종에서 3p25에서의 종열 중복이 관찰되었으며, 이것은 SRGAP3 사이의 인-프레임 암유전자 융합을 생성하며 RAF1 hat는 종양 발생에 기여할 수 있다(Jones et al., 2009).
SSR4의 인간 오솔로그(ortholog)는 주머니쥐 흑색종 세포주인 TD6b 및 TD15L2에서 차등적으로 발현되고 진행성 단계의 종양에서 상향조절되는 것으로 나타났으며, SSR4를 자외선 유도 흑색종 생성 및 전이와 관련 있을 수 있는 잠재적 기능을 가진 후보 유전자로 연루시킨다(Wang and VandeBerg, 2004). SSR4의 mRNA 수준은 정상 골모세포에 비해 골육종 세포주인 OHS, SaOS-2 및 KPDXM에서 보강되는 것으로 나타났다(Olstad et al., 2003).
STAM은 국소적으로 진행된 자궁경부암에서 및 척수 뇌실막세포종이 있는 젊은 환자의 종양에서 과발현되는 것으로 발견되었다(Korshunov et al., 2003; Campos-Parra et al., 2016). STAM은 위암에서 하향조절된 다음 STAM의 하향조절 또한 유도하는 ZNF331의 하류 표적이다(Yu et al., 2013). STAM은 만성 림프구성 백혈병에서 부정적인 11q 소실과 연관이 있었다(Aalto et al., 2001).
STAT2는 IFN에 의해 유도되는 전사 활성화 반응에서 양성 조절인자로서 작동한다(Steen and Gamero, 2012). STAT2는 인터페론에 대한 종양 세포 반응을 조절할 수 있다(Shodeinde et al., 2013). STAT2와 종양형성 사이의 관련이 STAT2가 결여된 유전자삽입 생쥐에서 관찰되거나(Yue et al., 2015), 뇌에서 IFN-알파를 구조적으로 발현하는 것으로 관찰되었다(Wang et al., 2003).
TANC1은 손상된 근육의 재생에서 역할을 하는 것으로 발견되었으며 전립선암 환자에서 후기의 방사선 유도 손상 발생에 영향을 주는 것으로 제안된다(Fachal et al., 2014). 횡문근육종(RMS)에서 자궁외 TANC1 발현은 잘못 조절된 근육모세포 융합 단백질을 초래하며, 이것은 표적 대상의 RMS 요법을 위한 후보자를 대표할 수 있다(Avirneni-Vadlamudi et al., 2012).
입-얼굴-손발가락 증후군 모형 6(OFD6) 증상이 있는 가족은 섬모발생 결손을 초래하는 TMEM17에서 병원성 돌연변이를 가질 수 있다(Li et al., 2016a).
TMEM209는 폐암에서 널리 발현되고, 폐암 세포의 핵막, 골지체 및 세포질에 국소화된다. TMEM209의 자궁외 과발현은 세포 성장을 촉진시킨 반면, TMEM209의 약화는 성장을 차단하기에 충분했다(Fujitomo et al., 2012).
카스파제 의존 세포자멸사의 유도에 의한 항종양 활성을 소유하는 쿠마린 및 벤지미다졸 함유 화합물로 치료한 암 세포에서 TSPAN14가 유의하게 상향조절되는 것으로 나타났다(Liu et al., 2015b). TSPAN14는 1등급 폐 종양에서 상향조절되는 것으로 발견되었으며, 이는 이러한 유전자들의 구조적 변화가 암 촉진에서 역할을 할 수 있음을 시사한다(Bankovic et al., 2010).
UTP20 발현은 전이성 인간 유방 종양 세포주에서 감소된다(Schwirzke et al., 1998; Goodison et al., 2003). UTP20은 위암 조직 및 전암 병변에서 높은 수준으로 발현되어 세포 전환에서 UTP20의 관여를 연루시킨다(Xing et al., 2005).
VGLL4는 위암, 폐암 및 식도 편평세포 암종에서 YAP-TEAD 전사 복합체에 대한 음성 조절 및 YAP 유도된 종양 형성의 억제에 의해 종양 억제인자로 작용한다. VGLL4는 위암 및 식도 편평 암종의 진행 동안 하향조절되는 것으로 나타났다(Zhang et al., 2014c; Jiao et al., 2014; Jiang et al., 2015; Li et al., 2015c). VGLL4는 위암에서 Wnt/베타 신호전달 경로를 통해 상피-중간엽 이행을 억제시킬 수도 있다(Li et al., 2015b).
WDFY3은 대장암에서 하향조절되는 것으로 나타났다(Piepoli et al., 2012).
WDR35가 만성 골수성 백혈병의 진행에 있어서 주요 유전자 중 하나이고 급성 림프모구성 백혈병에서 차등적으로 메틸화되는 것으로 나타났다(Nordlund et al., 2012; Zhang et al., 2014b). WDR35는 명백한 카고의 수송을 임의적으로 조절하여 섬모 조립을 조절하고, 다수의 막 단백질의 섬모 진입에 필수적이며 여러 카고 수송 매개 질환에서 돌연변이된다(Fu et al., 2016). WDR35 발현은 CaMKK/AMPK/p38 MAPK 경로 및 NF-카파B에 의해 조절된다(Harato et al., 2012; Huang et al., 2014b; Huang et al., 2014a).
WDR6은 LKB1의 조절 및 p27 조절인자 활성도의 촉진을 통해 자궁경부암 세포의 집락 형성을 억제한다(Xie et al., 2007). WDR6은 간암종 발생에서 중요한 역할을 하며 간세포의 증식성 병변에 대한 검출 표지자로서 사용가능하다(Yafune et al., 2013).
WDR7 발현은 위암에서 복제 수의 변형에 의해 탈조절되고, 다수의 악성 세포주에서 발현의 상승을 도시한다(Junnila et al., 2010; Sanders et al., 2000).
ZBTB3은 인간 흑색종, 폐 암종 및 유방 암종에서 ROS 해독 체계를 통해 암 세포의 성장에서 중대한 역할을 할 수 있다(Lim, 2014). ZBTB3의 억제는 카스파제-9, -3 및 PARP를 포함한 카스파제 케스케이드를 활성화하여 세포자멸사를 유도하며, 따라서 선택적 암 치료의 잠재적 표적을 대표할 수 있다(Lim, 2014).
ZMYM1은 에스트로겐 신호전달 및 유방암 증식에서 작용하는 ZNF131의 주요 상호작용 인자이다(Oh and Chung, 2012; Kim et al., 2016).
면역 반응 자극은 숙주 면역계가 외부 물질로 인식하는 항원의 존재에 의존한다. 종양-연관 항원의 발견은 숙주의 면역계를 종양 성장에 개입하는데 사용할 가능성을 제기했다. 면역계의 체액성 및 세포성 지류를 이용하는 다양한 기전이 현재 암 면역 치료에서 탐색되고 있다.
세포 면역 반응의 특정 요소들은 종양 세포를 특이적으로 인식하고 파괴할 수 있다. T 세포의 종양 침투 세포 군락 또는 말초 혈액에서의 단리는 이러한 T 세포가 암에 대해 자연 면역 방어로써 중요한 역할을 할 수 있다는 것을 시사한다. 세포질에 자리잡은 단백질 또는 불완전 리보솜 생성물(DRIPS)에서 파생된 보통 8 내지 10개의 아미노산 잔기로 이루어진 주조직적합 복합체(MHC)를 가진 펩티드의 클래스 I 분자를 인식하는 CD8 양성 T 세포는 특히 이 반응에서 중요한 역할을 한다. 인간의 MHC 분자도 인간 백혈구-항원(HLA)으로 지정된다.
"T 세포 반응"이란 특이적 증식과 시험관 내 또는 생체 내에서 유도되는 효과기 기능의 활성화를 의미한다. MHC 클래스 I 제한 세포 독성 T 세포의 경우, 효과기 기능이 펩티드 펄스, 펩티드 전조 펄스 또는 자연적 펩티드 제시 표적 세포들의 용해, 시토카인의 분비, 바람직하게는 펩티드에서 유도되는 인터페론-감마, TNF-알파, 또는 IL-2, 효과기 분자의 분비, 바람직하게는 펩티드에서 유도되는 그랜자임 또는 퍼로린 또는 탈과립일 수 있다.
"펩티드"란 용어는 여기서 이웃 아미노산의 알파 아미노와 카보닐기 사이에 펩티드 결합으로 보통 서로 연결되는 일련의 아미노산 잔기를 지정하기 위해 사용한다. 펩티드는 아미노산 9개의 길이가 바람직하지만 짧게는 아미노산 8개일 수도 있고 길게는 10, 11, 12 또는 13개 이상일 수도 있고, MHC 클래스 II 펩티드의 경우(본 발명의 펩티드의 연장된 변이) 그 길이가 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개 이상의 아미노산일 수 있다.
더욱이 "펩티드"라는 용어는 알파 아미노기와 이웃 아미노산의 카보닐기 사이의 펩티드 결합으로 보통 서로 연결되는 아미노산 잔기의 서열에 의한 염을 포함한다. 바람직하게는 이 염은, 예를 들어 염화물 또는 아세트산염(트리플루오로아세테이트)과 같은 약학적으로 허용되는 펩티드의 염이다. 본 발명에 따른 펩티드의 염은 펩티드가 생체 내에서 염이 아니므로 생체내 상태의 펩티드와는 실질적으로 다르다는 점을 유의해야 한다.
"펩티드"라는 용어는 "올리고펩티드"를 포함한다. 여기에서 "올리고펩티드"라는 용어는 인접 아미노산의 알파 아미노기 및 카보닐기 사이에서 일반적으로 펩티드 결합으로 연결되는, 아미노산 잔기를 지정하는데 사용된다. 본 발명에서 올리고펩티드의 길이는 정확한 에피톱이 유지되는 이상 중요하지 않다. 올리고펩티드는 일반적으로 30개 아미노산보다 길이가 짧고, 15개 아미노산보다 길다.
"폴리펩티드"라는 용어는 인접 아미노산의 알파 아미노기와 카보닐기 사이에서 일반적으로 펩티드 결합으로 연결되는, 일련의 아미노산 잔기를 지정하는데 사용된다. 본 발명에서 폴리펩티드의 길이는 정확한 에피톱들이 유지되는 이상 중요하지 않다. 펩티드 또는 올리고 펩티드와 다르게, 폴리펩티드는 약 30개 아미노산 잔기 이상의 분자를 가지고 있는 것을 가리킨다.
이런 분자에 대한 펩티드, 올리고펩티드, 단백질 또는 폴리뉴클레오티드 코딩은 면역 반응을 유도할 수 있으면 "면역원성"(따라서, 본 발명에서의 "면역원")이다. 본 발명의 경우, 면역성은 T 세포 반응을 유도하는 능력으로 특정적으로 정의된다. 그러므로, "면역원"은 면역 반응을 유도할 수 있는 분자이고, 본 발명의 경우, T 세포 반응을 유도할 수 있는 분자이다. 다른 양태에서, 면역원은 펩티드, 펩티드와 MHC의 복합체, 올리고펩티드 및/또는 특정 항체, 또는 항체에 대한 TCR을 높이는데 사용되는 단백질일 수 있다.
클래스 I T 세포 "에피톱"은 적당한 친화도를 가진 MHC/펩티드 복합체에 결합하는 T 세포 수용체에 일치하는 T 세포에 의해 인식되는 삼성분(ternary) 복합체(MHC 클래스 I 알파 쇄, 베타-2-마이크로글로블린 및 펩티드)를 생성하는 클래스 I 또는 II MHC 수용체에 결합하는 짧은 펩티드를 필요로 한다. MHC 클래스 I 분자에 결합하는 펩티드는 일반적으로 길이가 8 내지 14개 아미노산이며, 가장 일반적으로 길이가 9개 아미노산이다.
인간에는 MHC 클래스 I 분자를 인코딩하는 세 개의 유전자 좌가 있다(인간의 MHC 분자도 인간 백혈구 항원(HLA)으로 지정된다): HLA-A, HLA-B 및 HLA-C. HLA-A*01, HLA-A*02 및 HLA-A*07은 유전자 좌에서 발현할 수 있는 다른 MHC 클래스 I 대립형질의 예이다.
표 5는 HLA-A*02 및 HLA-A*24 및 가장 빈번한 HLA-DR 혈청형의 발현 빈도 F이다. 빈도는 모리(Mori) 등(Mori et al., 1997)으로부터 조정된 미국 인구 내에서의 일배체형 빈도 Gf로부터 도출되며, 하디-와인버그 공식 F = 1 - (1-Gf)2를 사용한다. A*02 또는 A*24와 일부 HLA-DR 대립형질의 조합은 강화되거나 연관 불평형으로 인해 단일 빈도보다 덜 빈번할 수 있다. 자세한 내용은 카녹(Chanock) 등을 참조한다(Chanock et al., 2004).
[표 5]
Figure pct00025
Figure pct00026
Figure pct00027
본 발명의 펩티드는, 바람직하게는 본 발명의 백신에 포함되면, 본원에 기술된 바와 같이 A*02에 결합한다. 백신은 또한 범결합 MHC 클래스 II 펩티드를 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명의 백신은 A*02 양성인 환자에서 암의 치료에 사용할 수 있는 반면, 이러한 펩티드의 범결합 성격으로 인해 MHC 클래스 II 동종이형에 대한 선택이 필요하지 않다.
본 발명의 A*02 펩티드가 다른 대립유전자, 예를 들어 A*24에 결합하는 펩티드와 합쳐지면, MHC 클래스 I 대립자만을 해결하는 것에 비해 더 높은 비율의 환자 모집단을 치료할 수 있다. 하나의 대립 유전자로는 대부분의 모집단에서 50% 미만의 환자를 해결할 수 있는 반면, HLA-A*24 및 HLA-A*02 에피톱을 포함하는 백신은 모든 관련된 모집단에서 60% 이상의 환자를 치료할 수 있다. 구체적으로, 다양한 지역에서 이러한 대립유전자의 하나 이상에 양성인 환자의 비율은 다음과 같다: 미국 61%, 서유럽 62%, 중국 75%, 대한민국 77%, 일본 86%(www.allelefrequencies.net으로부터 계산했음).
바람직한 구현에서, "뉴클레오티드 서열"은 데옥시리보뉴클레오티드의 이종중합체를 말한다.
특정 펩티드, 올리고펩티드 또는 폴리펩티드에 대한 뉴클레오티드 서열 코딩은 자연적으로 발생하거나 합성 구축될 수도 있다. 일반적으로, 본 발명의 펩티드, 폴리펩티드 및 단백질을 인코딩하는 DNA 절편은 cDNA 단편들과 짧은 올리고뉴클레오티드 링커, 또는 일련의 올리고뉴클레오티드에서 미생물이나 바이러스 오페론에서 유도된 조절 요소를 구성하는 재조합 전사 단위에서 발현될 수 있는 합성 유전자를 제공하기 위해서 조립된다.
본원에 사용되는 용어 "펩티드를 코딩(또는 인코딩)하는 뉴클레오티드"는 예를 들어, 수지상 세포 또는 TCR 생산에 유용한 다른 세포계에 의해 서열이 발현되는 생물학적 체계와 호환가능한 인공(사람이 만든) 시작 및 정지 코돈을 포함하는 펩티드에 대한 뉴클레오티드 서열 코딩을 지칭한다.
본원에 사용되는 핵산 서열에 대한 언급에는 단일 가닥 및 이중 가닥 핵산 모두가 포함된다. 그러므로, 예를 들어 DNA의 경우 특정 서열이란 문맥에서 달리 나타내지 않는 한, 이러한 서열의 단일 가닥 DNA, 이 서열의 보체와의 두 가닥(이중 가닥 DNA) 및 이러한 서열의 보체를 가리킨다.
용어 "코딩 영역"은 자연적인 게놈 환경에서 유전자의 발현 생성물에 대해 자연스럽게 또는 정상적으로 코딩하는 유전자의 부분을 가리킨다(즉, 유전자의 자연(native) 발현 생성물에 대한 생체내 영역 코딩).
코딩 영역은 비변이("정상")이거나 변이 또는 개조된 유전자로부터 유래할 수 있거나, 심지어 DNA 서열, 또는 실험실에서 DNA 합성의 당업자에게 잘 알려진 방법을 사용해서 실험실에서 전적으로 합성된 유전자로부터 유래할 수 있다.
용어 "발현 생성물"은 유전자의 자연 번역 생성물인 폴리펩티드 또는 단백질, 및 유전적 코딩 퇴화 및 이에 따른 동일 아미노산 코딩으로 인해 초래된 어떤 핵산 서열 코딩 생성물을 의미한다.
코딩 서열을 말할 때, 용어 "단편"은 발현 제품이 완전한 코딩 영역의 발현 생성물과 같은 생물학적 기능이나 활동을 유지하는 완전한 코딩 영역보다 적은 부분의 DNA를 가리킨다.
용어 "DNA 분절"을 최소한 한번 이상의 상당히 순수한 형태로 분리된 DNA에서 유도된 단편의 형태, 또는 큰 DNA 구조의 구성 요소로서 DNA 중합체를 가리킨다. 여기서, 순수한 형태는 내인성 오염 물질이 없고 분절 및 표준 생화학 방법, 예를 들어, 복제 벡터에 따른 그 구성 요소 뉴클레오티드 서열의 식별, 조작 및 복구를 가능하게 하는 양 또는 농도를 가리킨다. 이러한 분절은 일반적으로 진핵 생물 유전자에 존재하는 내부 비번역 서열, 또는 인트론에 의해 방해되지 않는 오픈 리딩 프레임의 형태로 제공된다. 비번역 DNA 서열은 동일 서열이 코딩 영역의 조작 또는 발현을 방해하지 않는 오픈 리딩 프레임의 하단에 나타날 수 있다.
용어 "프라이머"는 한 가닥의 표준 DNA와 짝을 이룰 수 있는 짧은 핵산 서열을 의미하며 DNA 폴리머라아제가 데옥시리보 뉴클레오티드 쇄 합성을 시작하는 자유 3'-OH 말단을 제공한다.
용어 "프로모터"는 모사를 시작하기 위한 RNA 폴리머라아제의 결합에 관여하는 DNA 영역을 뜻한다.
용어 "단리"는 그 물질이 원래의 환경(예를 들어, 자연적으로 발생하는 경우에는 자연 환경)에서 제거되는 것을 뜻한다. 예를 들어, 자연 발생하는 살아 있는 동물에 존재하는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 단리되지 않지만, 자연계에서 공존하는 물질의 부분 또는 전체에서 단리되는 같은 뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 제거된다. 이러한 폴리뉴클레오티드는 담체 및/또는 이러한 폴리뉴클레오티드의 부분이거나 폴리펩티드는 구성의 일부일 수 있고, 이러한 벡터 또는 구성이 자연 환경의 일부가 아닐 때 여전히 단리될 수 있다.
본 발명에 따라 밝혀지는 폴리뉴클레오티드 및 재조합 또는 면역성의 폴리펩티드는 "정제" 형태일 수도 있다. 용어 "정제"는 절대적인 순도를 필요로 하지 않는다. 오히려, 그것은 상대적인 정의를 의도하며, 관련된 당업자들이 이해하는 용어로써 상당히 정제된 제조 또는 부분적으로 정제된 제조를 포함할 수 있다. 예를 들어, cDNA 라이브러리에서 단리된 각각의 클론은 전기 영동 동일성으로 통상적으로 정제된다. 시작 물질 또는 자연 물질의 최소한 하나 이상의 순서, 바람직하게 2 또는 3개 순서, 더 바람직하게는 4 또는 5개 순서의 크기로 정제가 명시적으로 심사숙고된다. 또한, 바람직하게는, 중량으로 99.999%, 또는 최소한 99.99% 또는 99.9%, 심지어는 바람직하게 99%보다 큰 순도를 가진 특허청구범위에 기재된 폴리펩티드가 명시적으로 포함된다.
본 발명에서 따라 개시된 핵산과 폴리펩티드 발현 생성물은, 이러한 핵산 및/또는 이러한 폴리펩티드를 가진 발현 벡터뿐만 아니라, "강화된 형태"일 수 있다. 본원에 사용된 용어 "강화"는 물질의 농도가 최소한 그것의 자연적 농도(예를 들어)의 최소한 2, 5, 10, 100 또는 1000배 정도이고, 유리하게는 0.01 중량%, 바람직하게는 약 0.1 중량% 이상 정도임을 의미한다. 중량으로 약 0.5%, 1%, 5%, 10% 및 20% 강화된 제조도 고찰된다. 서열, 구성, 벡터, 클론 및 본 발명의 다른 물질들은 유리하게 강화된 또는 단리된 형태가 될 수 있다. 용어 "활성 단편"은, 예를 들어 토끼 또는 쥐 및 인간을 포함한 포유류와 같은 동물에게 따로 또는 임의적으로 적당한 보조제와 함께 또는 매개체로서 투여했을 때 면역 반응(즉, 면역성 활동이 있는)을 생성하고 인간과 같은 수용 동물 내에서 T 세포 반응을 자극하는 형태로 면역 반응을 나타내는 펩티드, 폴리펩티드 또는 핵산 서열의 단편을 의미한다. 그렇지 않으면, "활성 단편"은 또한 시험관 내 T 세포 반응을 유도하기 위해서 사용될 수도 있다.
본원에 사용된 "부분", "분절" 및 "단편"이라는 용어는, 폴리펩티드와 관련하여 사용될 때, 서열이 더 큰 서열의 하위 집합을 형성하는 경우 아미노산 잔기와 같은 잔기의 지속적인 서열을 가리킨다. 예를 들어, 만약에 폴리펩티드가 트립신 또는 키모트립신과 같은 일반적인 엔도펩티다아제 치료를 받는다면, 그런 치료로 인해 생기는 올리고펩티드는 폴리펩티드의 시작 부분, 분절 또는 단편을 나타낼 것이다. 폴리뉴클레오티드와 관련해서 사용될 때, 이러한 용어들은 일반적인 엔도뉴클레아제 중 어떤 것과 함께 상기 폴리뉴클레오티드의 치료에 의해 생성된 생성물을 가리킨다.
본 발명에 따라, 서열을 언급할 때 용어 "백분율 동일성" 또는 "백분율 동일"은 설명되거나 명시된 서열("기준 서열")에 비교될 서열의 정렬 후("비교 서열") 서열이 명시된 또는 설명된 서열에 비교되는 것을 가리킨다. 백분율 동일성은 하기 공식에 따라서 결정된다:
백분율 동일성 = 100 [1 -(C/R)]
여기서, C는 기준 서열과 비교 서열의 정렬의 길이에 비해 기준 서열과 비교 서열의 차이의 개수이고, 이때 (i) 비교 서열에서 상응하는 정렬된 염기 또는 아미노산이 없는 기준 서열에 각 염기 또는 아미노산, (ii) 기준 서열의 각 차이, 및 (iii) 비교 서열의 정렬된 염기 또는 아미노산과 다른 기준 서열의 각 정렬된 염기 또는 아미노산은 차이를 구성하며, (iv) 정렬은 정렬된 서열의 위치 1에서 시작해야 하고; R은 비교 서열과의 정렬의 길이에 대한 기준 서열 염기 또는 아미노산의 수이고 기준 서열에 생긴 공백도 염기 또는 아미노산 개수로 계산된다.
만약에 위에서와 같이 계산된 비교 서열과 기준 서열 사이의 백분율 동일성이 특정 최소 백분율과 같거나 더 크면 위에서 계산된 백분율 동일성이 특정 백분율 동일성보다 작은 경우에 정렬이 있을 수 있더라도 비교 서열은 기준 서열에 대해 특정한 최소 백분율 동일성이 있다.
위에서 언급된 바와 같이, 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 237로 구성된 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 팹티드 또는 서열번호 1 내지 서열번호 237에 대해 88% 상동성인 그 변이체 또는 상기 펩티드와 교차 반응하는 T 세포를 유도하는 그 변이체를 제공한다. 본 발명의 펩티드는 인간 주조직적합 복합체(MHC) 클래스 I의 분자에 결합하는 능력 또는 연장된 버전의 상기 펩티드가 클래스 II에 결합하는 능력을 갖는다.
본 발명에서, "상동"이라는 용어는 2개의 아미노산 서열, 즉, 펩티드 또는 폴리펩티드 서열 사이의 일치 정도(위의 백분율 동일성 참조)를 일컫는다. 전술한 "상동"은 비교될 2개의 서열을 최적 상태에서 나란히 정렬하여 비교하여 결정된다. 이러한 서열 상동 관계는, 예를 들어 ClustalW 알고리즘을 이용하여 정렬을 만들어 계산할 수 있다. 일반적으로 사용가능한 서열 분석 소프트웨어, 더 구체적으로 벡터 NTI, GENETYX 또는 다른 도구들은 공용 데이터베이스에서 제공된다.
이 분야의 당업자는 특정 펩티드의 변이체에 의해서 유도된 T 세포가 그 펩티드 자체와 교차 반응할 수 있을지를 평가할 수 있을 것이다(Appay et al., 2006; Colombetti et al., 2006; Fong et al., 2001; Zaremba et al., 1997).
주어진 아미노산 서열의 "변이체"에 의해, 발명자들은, 예를 들어, 하나 또는 2개의 아미노산 잔기의 측쇄가 변경되어 그 펩티드가 여전히 서열번호 1 내지 서열번호 237의 아미노산 서열로 구성된 펩티드와 실질적으로 같은 방법으로 HLA 분자와 결합할 수 있음을 의미한다(예를 들어, 그들을 자연적으로 발생하는 다른 아미노산 잔기 또는 다른 측쇄로 펩티드로 구성된다). 예를 들어, 펩티드 변형에 의해 HLA-A*02 또는 -DR과 같은 적합한 MHC 분자의 결합 홈과 상호 작용하여 결합하는 능력을 향상시키지는 않더라도 적어도 유지할 수 있고, 이에 따라 활성화된 T 세포의 TCR과 결합할 수 있는 능력을 향상시키지 않더라도 적어도 유지한다.
이 T 세포는 그 결과로 본 발명의 한 양태에서 정의된 동족의 펩티드의 자연 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 발현하는 세포와 교차 반응하고 이러한 세포를 죽일 수 있다. 과학 문헌 및 데이터 베이스(Rammensee et al., 1999; Godkin et al., 1997)에서 얻을 수 있듯이, HLA 결합 펩티드의 특정 위치는 전형적으로 HLA 수용기의 결합 모티프에 일치하는 핵심 고정 잔기이며 이는 결합 홈을 이루고 있는 폴리펩티드의 극성, 전기 물리성, 소수성 및 공간적 특성에 의해 정의된다. 따라서, 이 분야의 당업자는 알려진 고정 잔기를 유지함으로써 서열번호 1 내지 서열번호 237에 정해진 아미노산을 변형할 수 있을 것이며 이러한 변이체들이 MHC 클래스 I 또는 II 분자와 결합할 수 있는 능력을 유지할 수 있는지를 결정할 수 있어야 한다. 본 발명의 변이체는 이어서 본 발명의 양태에 정의된 동족 펩티드의 자연 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 발현하는 세포와 교차 반응하고 이 세포를 죽일 수 있는 활성호된 T 세포의 TCR에 결합하는 능력을 유지한다.
본원에 개시된 본래 (변형되지 않은) 펩티드는 달리 언급되지 않는 이상 아마도 선택적인 다른 부위에서 펩티드 쇄의 부위의 하나 이상의 잔기의 치환에 의해 변형될 수 있다. 바람직하게, 이러한 치환은 아미노산 쇄의 말단에 위치한다. 그런 치환은, 예를 들어, 소수성의 아미노산이 다른 소수성의 아미노산으로 치환되는 것처럼, 한 아미노산이 구조 및 특성이 유사한 아미노산에 의해 치환됨으로써 그 성격이 보수적일 수 있다. 심지어 더 보수적인 것은 류신이 이소류신으로 치환되는 것 같이, 같거나 비슷한 크기와 화학적 특성을 가진 아미노산으로 치환되는 것이다. 자연적으로 발생하는 동종 단백질의 종족에서의 서열 변화의 연구에서, 특정 아미노산의 치환은 다른 것들보다 더 자주 용인되고 있고, 이들은 본래의 아미노산과 치환 사이에서 크기, 전하, 극성 및 소수성이 비슷한 상관관계를 보이며, 이것은 "보존적 치환"을 정의하는데 기본이 된다.
여기서 보존적 치환은 아래의 다섯 개 군 중 하나의 교환으로 정의된다: 군 1 - 작은 지방족, 무극성 또는 약간 극성의 잔기(Ala, Ser, Thr, Pro, Gly); 군 2 - 극성, 음전하를 가진 잔기와 그 아미드(Asp, Asn, Glu, Gln); 군 3 - 극성, 양전하를 가진 잔기(His, Arg, Lys); 군 4 - 큰 지방족, 무극성 잔기(Met, Leu, Ile, Val, Cys); 및 군 5 - 큰, 방향족 잔기(Phe, Tyr, Trp).
덜 보존적 치환은 알라닌을 이소류신 잔기로 치환하는 것처럼, 비슷한 성질이지만 크기가 어느 정도 다른 아미노산으로 치환하는 것을 포함한다. 아주 비보수적인 치환은 산성 아미노산을 극성, 또는 심지어 염기성 아미노산으로 치환하는 것을 포함할 수도 있다. 그러나, 이러한 "급진적" 치환은 화학적 작용이 완전히 예측 불가능하고 급진적 치환은 단순한 화학 원리에서 예측가능하지 않은 뜻밖의 발생이 있을 수 있기 때문에 효과가 없다고 기각할 수는 없다.
물론, 이런 치환은 일반적인 L-아미노산 외 다른 구조를 포함할 수 있다. 그러므로, D-아미노산을 본 발명의 항원 펩티드에서 흔히 발견되는 L-아미노산으로 교체할 수 있고 본원에서 계속 포함될 수 있다. 또한, 비표준 아미노산(즉, 흔히 자연적으로 발생하는 단백질 생성 아미노산이 아닌) 역시 본 발명에 따라 면역성과 면역성 폴리펩티드를 생산하기 위해서 치환될 수 있다.
아래에서 정의된 것과 상당히 동일하거나 더 큰 항원 활성이 있는 펩티드의 하나 이상의 위치에서 치환이 발견되면, 이러한 치환의 조합은 조합된 치환이 펩티드의 항원성에 추가적 효과 또는 시너지 효과의 결과를 내는지 결정하기 위해 시험된다. 최대한으로, 펩티드에서 네 곳 이하의 위치에서 동시에 치환될 것이다.
본원에 명시한 바와 같이 아미노산 서열로 본질적으로 구성된 펩티드는, 인간 주조직적합 복합체(MHC) 클래스 I 또는 클래스 II의 분자에 결합하는 능력이 비변형 펩티드에 비하여 상당히 변경되거나 부정적으로 영향받지 않고, 1 또는 2개의 비앵커 아미노산(앵커 모티프에 대해서는 아래 참조)이 교환될 수 있다. 또 다른 구현에서는, 본 문서에서 명시된 바와 같이 아미노산 서열로 본질적으로 구성된 펩티드에 있어서, 인간 주조직적합 복합체(MHC) 클래스 I 또는 클래스 II의 분자에 결합하는 능력이 비변형 펩티드에 비하여 상당히 변경되거나 부정적으로 영향받지 않고 하나 또는 2개의 아미노산이 그에 대한 보존적 교환 파트너(다음을 참조)와 교환될 수 있다.
T 세포 수용체와 상호작용하는데 상당히 기여를 하지 않는 아미노산 잔기들은 이와 결합됨으로써 T 세포의 반응성에 상당한 영향을 주지 않고 관련된 MHC와의 결합을 제거하지 않는 다른 아미노산과의 교체에 의해 변형될 수 있다. 따라서, 주어진 조건 외에도, 본 발명의 펩티드는 아미노산 서열 또는 그 한 부분 또는 주어진 변이체를 포함하는(발명자들이 올리고펩티드 또는 폴리펩티드를 포함한다고 일컫는) 어떠한 펩티드가 될 수도 있다.
[표 6]
서열번호 1, 10 및 20에 따른 펩티드의 변이체 및 모티프
Figure pct00028
Figure pct00029
Figure pct00030
더 긴(연장된) 펩티드도 적합할 수 있다. 또한, 대개 길이가 8 내지 11개의 아미노산이지만, MHC 클래스 I 에피톱이 더 긴 펩티드로부터 처리되는 펩티드 또는 실제 에피톱을 포함하는 단백질에 의해 생성될 가능성도 있다. 실제 에피톱이 양측에 있는 장기는 처리 동안 실제 에피톱을 노출하는데 필요한 단백질 분해에 의한 분할에 상당한 영향을 주지 못하는 잔기이다.
본 발명의 펩티드는 1, 2, 3 및 4개의 아미노산이 4:0 내지 0:4의 임의의 조합으로 양쪽 어디로든 추가될 수 있는 4개 이하의 아미노산만큼 연장될 수 있다. 본원에 따른 연장의 조합은 표 7에서 찾아볼 수 있다.
[표 7]
본 발명의 펩티드 연장의 조합
Figure pct00031
연장/확장을 위한 아미노산은 해당 단백질의 원래 서열의 펩티드 또는 기타 모든 아미노산일 수 있다. 연장/신장을 위한 아미노산은 해당 단백질의 원래 서열의 펩티드 또는 기타 모든 아미노산일 수 있다. 연장은 펩티드의 안정성 또는 용해도 강화를 위해 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 에피톱은 자연적으로 발생하는 종양 관련 또는 종양 특이 에피톱과 동일할 수 있거나 실질상 동등한 항원 활성을 가지고 있는 한, 참조 펩티드와 비교 시 4개 이하의 다른 잔기를 가지고 있는 에피톱을 포함할 수 있다.
대체의 구현에서, 펩티드는 한쪽 또는 양쪽으로 4개 이상의 아미노산, 바람직하게는 총 30개의 아미노산 길이만큼 연장된다. 이는 MHC 클래스 II 결합 펩티드로 이어질 수 있다. MHC 클래스 II에 대한 결합은 당업계에서 알려진 방법으로 시험할 수 있다.
따라서, 본 발명은 MHC 클래스 I 에피톱의 펩티드와 변이체를 제공하며, 여기서 펩티드 또는 변이체는 전체 길이가 8 내지 100이며, 바람직하게는 8 내지 30이며, 가장 바람직하게는 8 내지 14이며, 이는 즉 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14개의 아미노산이다. 연장된 클래스 II 결합 펩티드의 경우 그 길이는 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 또는 22개의 아미노산일 수도 있다.
물론, 본 발명에 따른 펩티드 또는 변이체는 인간 주조직적합 복합체(MHC) 클래스 I 또는 II의 분자에 결합하는 능력을 갖게 된다. 펩티드 또는 변이체의 MHC 복합체에 대한 결합은 당업계의 방법에 의해 시험할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 특이적 펩티드의 T 세포가 치환 펩티드에 대해 시험될 때, 치환 펩티드가 배경에 상대적으로 세포 용해의 최대 증가의 절반을 달성할 때의 펩티드 농도는 약 1 mM 이하, 바람직하게 약 1 μM 이하, 더 바람직하게 약 1 nM 이하, 여전히 더 바람직하게 약 100 pM 이하, 가장 바람직하게는 약 10 pM 이하이다. 치환 펩티드가 하나 이상, 최소 2개, 보다 바람직하게 3개의 개별 T 세포에 의해 인식되는 것 또한 바람직하다.
본 발명의 특히 바람직한 구현에서 그 펩티드는 서열번호 1 내지 서열번호 237에 따른 아미노산 서열로 구성되거나 본질적으로 구성된다.
"본질적으로 구성되는"이란 본 발명에 따른 펩티드가, 서열번호 1 내지 서열번호 237 중 어느 하나 또는 이의 변이체 이외에, MHC 분자 에피톱에 대한 에피톱으로서 기능하는 펩티드의 부분을 필수적으로 형성하지 않는 추가적인 아미노산의 N- 및/또는 C-말단 위치의 신장을 포함함을 의미한다.
그럼에도 불구하고, 이 길이의 아미노산은 본 발명에 따르면 세포 안으로의 효율적인 펩티드의 도입에 중요한 역할을 할 수 있다. 본 발명의 하나의 구현에서, 펩티드는, 예를 들어 NCBI, GenBank Accession-number X00497에서 유도된 것처럼 HLA-DR 항원-결합 불변 쇄(p33, 다음의 "Ii")의 80개 N-말단 아미노산을 포함하는 융합 단백질의 일부이다. 다른 융합에서는, 본 발명의 펩티드는 항체에 의해 특이적으로 표적이 될 수 있도록 본원에 기술된 상기 항체 또는 그 기능적 일부, 특히 항체의 서열에 대해, 또는, 예를 들어 수지상 세포에 특이적인 항체에 대해 또는 그 안으로 융합될 수 있다.
추가적으로, 펩티드 또는 변이체는 안정성 및/또는 MHC 분자와의 결합성을 높여 더 강한 면역 반응을 일으킬 수 있도록 변형될 수 있다. 펩티드 서열의 최적화를 위한 방법은 이 분야에서 잘 알려져 있고, 예를 들어 반대 펩티드 결합 또는 비-펩티드 결합을 도입하는 것이 있다.
반대 펩티드 결합에서는 아미노산 잔기가 펩티드(-CO-NH-) 연결로 결합되어 있지 않으나 펩티드 결합이 반대로 되어있다. 이러한 역-인버스 펩티드 모방형 물질은 이 분야에서 잘 알려진 방법으로 생성될 수 있고, 이 방법의 예는 이 문헌의 참조문헌으로 포함된 메지레 등(1997)의 문헌(Meziere et al., 1997)이다. 이 방법은 백본의 변경을 포함하지만, 측쇄의 방향을 바꾸지 않는 유사펩티드를 만드는 것을 포함한다. 메지레 등(Meziere et al., 1997)은 MHC 결합과 T 조력 세포 반응에서 이 유사 펩티드가 유용하다는 것을 도시한다. CO-NH 대신에 NH-CO 결합을 포함하는 역-인버스 펩티드는 단백질 가수분해에 대한 저항력이 훨씬 높다.
비-펩티드 결합의 예는 -CH2-NH, -CH2S-, -CH2CH2-, -CH=CH-, -COCH2-, -CH(OH)CH2- 및 -CH2SO-이다. 미국 특허공보 제4,897,445호는 기본 과정을 거쳐 합성된 폴리펩티드와 아미노 알데히드와 아미노산을 NaCNBH3 존재 하에 반응시켜 생성된 비-펩티드 결합을 포함한 폴리펩티드 쇄의 비-펩티드 결합(-CH2-NH) 고체상 합성의 방법을 제공한다.
상기 기술된 서열을 가지고 있는 펩티드는 안정성, 생물가용성 및/또는 펩티드의 결합을 증가시키기 위해 추가적인 화학 기를 아미노 및 또는 카복시 말단에 결합할 수도 있다. 예를 들어, 카보벤족실, 단실 또는 t- 부틸옥시카보닐 기 등의 소수성 기가 펩티드의 아미노 말단에 추가될 수 있다. 비슷하게, 아세틸 기 또는 9-플루오레닐메톡시-카보닐-기가 펩티드의 아미노 말단에 위치할 수도 있다. 또한, 소수성 기, t-부틸옥시카보닐, 또는 아미도 기 또한 펩티드의 카복시 말단에 추가될 수 있다.
또한, 이 발명의 펩티드는 그들의 입체 배치를 변화시키기 위해 생성될 수도 있다. 예를 들어, 펩티드의 하나 이상의 아미노산 잔기의 D-이성질체가 보통의 L-이성질체 대신에 사용될 수도 있다. 더 나아가서, 발명의 펩티드의 하나 이상의 아미노산 잔기가 비-자연적으로 일어나는 아미노산 잔기와 치환될 수도 있다. 이와 같은 변화는 안정성, 생물가용성, 및/또는 본 발명의 펩티드의 결합을 증가시킬 수 있다.
유사하게, 이 발명의 펩티드 또는 변이체는 특정한 아미노산을 펩티드 생성 전 또는 후에 반응시킴으로써 화학적으로 변형될 수 있다. 이러한 변형의 예는 이 분야에서 잘 알려져 있고, 예를 들어 본원에 참조로 혼입된 문헌(R. Lundblad, Chemical Reagents for Protein Modification, 3rd ed. CRC Press, 2004)(Lundblad, 2004)에 잘 기술되어 있다. 아미노산의 화학 변형은 아실화, 아미딘화, 리신의 피리독실화, 환원성 알킬화 반응, 아미노산의 2,4,6-트리니트로벤젠 설폰화(TNBS)에 의한 트라이 니트로 벤질화, 카복실 기의 아미드 변형 및 퍼포민산에 의한 설피드릴 변형, 시스틴의 시스테릭산으로의 산화, 머큐리얼 유도체 생성, 다른 티올 합성의 다이설피드 생성, 말레이미드와의 반응, 요오드화 아세트산 또는 요오드 아세트아미드에 의한 카복시메틸화 및 사이안산 염에 알칼리성 산도에서의 의한 카바밀화를 포함하지만 이에 국한되지 않은 변형을 말한다. 이에 관해서, 당업자는 더 광대한 단백질의 화학 변형에 대한 방법론에 대해서는 문헌(Current Protocols In Protein Science, Eds. Coligan et al. (John Wiley and Sons NY 1995-2000))(Coligan et al., 1995)의 15장을 참조하길 바란다.
간단히 말하면, 예를 들어 단백질의 아르기닌 잔기는 흔히 페닐글리옥산, 2,3-부탄디온 및 1,2-사이클로헥산디온과 같은 근접한 디카보닐 화합물과의 반응에 근거하여 부가물을 형성한다. 다른 예는 메틸글로옥살과 아르기닌 잔기와의 반응이다. 시스테인은 리신 및 히스티딘과 같은 다른 친핵성 부위의 동시 변형 없이 변형시킬 수 있다. 그 결과, 다수의 시약들이 시스테인 변형에 사용가능하다. Sigma-Aldrich(http://www.sigma-aldrich.com)와 같은 회사들의 웹사이트에서는 특정한 시약에 관한 정보를 제공하고 있다.
단백질에서 이황화 결합의 선택적 환원 또한 흔하다. 단백질에서 이황화 결합은 생물약제의 열 처리 동안 형성되어 산화될 수 있다. 우드워드의 시약 K는 특정 글루탐산 잔기의 변형에 사용될 수 있다. N-(3-(디메틸아미노)프로필)-N'-에틸카보디이미드를 사용하여 리신 잔기와 글루탐산 잔기 사이의 분자내 가교를 형성할 수 있다. 예를 들어, 디메틸카보네이트는 단백질에서 히스티딘 잔기의 변형을 위한 시약이다. 히스티딘은 4-히드록시-2-노네날을 사용하여 변형시킬 수 있다. 리신 잔기와 다른 α-아미노기의 작용은, 예를 들어, 펩티드의 표현 결합 또는 단백질/펩티드들의 가교에 유용하다. 리신은 폴리(에틸렌)글리콜의 부착의 부위이며 단백질의 당화에서 중요 변형 부위이다. 단백질에서 메티오닌 잔기는, 예를 들어 요오도아세트아미드, 브로모에틸아민 및 클로르아민 T를 사용하여 변형시킬 수 있다.
테트라니트로메탄 및 N-아세틸이미다졸은 티로신 잔기의 변형에 사용할 수 있다. 디티로신의 형성을 통한 가교 형성은 과산화 수소/구리 이온으로써 성취할 수 있다.
트립토판의 변형에 대한 최근의 연구에서는 N-브로모숙신이미드, 브롬화 2-히드록시-5-니트로벤질 또는 3-브로모-3-메틸-2-(2-니트로페닐메르캅토)-3H-인돌(BPNS-스카톨)이 사용된 바 있다.
PEG를 이용한 치료용 단백질과 펩티드의 성공적인 변형은 흔히 동시 순환 반감기를 증가시키는 것과 연관되어 있는 반면, 단백질과 글루타르알데히드, 폴리에틸렌글리콜 디아크릴레이트 및 포름알데히드와 교차 결합이 히드로겔의 제조에 사용된다. 면역 치료를 위한 알레르겐의 화학적 변형은 종종 칼륨 시안산염의 카바밀화와 관련이 있다.
펩티드가 변형되거나 비-펩티드 결합을 포함하는 펩티드 또는 변이체가 본 발명의 구현에서 바람직하다.
본 발명의 또 다른 구현은 비자연적으로 발생하는 펩티드에 관한 것으로 상기 펩티드는 서열번호 1 내지 서열번호 237에 따른 아미노산 서열로 구성되거나 본질적으로 구성되고 약학적으로 허용가능한 염으로 합성적으로 생산되었다(예컨대, 합성되었다). 펩티드를 합성적으로 생성하는 방법들은 당업계에서 잘 알려져 있다. 본 발명에 따른 펩티드의 염은 생체내 상태(들)에서의 펩티드와 실질적으로 다르며, 이는 생체 내에서 생성된 펩티드가 염이 아니기 때문이다. 펩티드의 비자연적 염 형태는 특히, 예를 들어 여기서 공개된 펩티드 백신과 같이 펩티드를 포함하는 약학 조성물의 맥락에서 상기 펩티드의 용해도를 매개한다. 치료할 대상에게 펩티드를 효율적으로 제공하기 위해서는 충분하며 적어도 실질적인 펩티드(들)의 용해도가 요구된다. 바람직하게, 상기 염은 펩티드의 약학적으로 허용가능한 염이다. 본 발명에 따른 이러한 염에는 음이온으로 PO4 3-, SO4 2-, CH3COO-, Cl-, Br-, NO3 -, ClO4 -, I-, SCN-, 및 양이온으로 NH4 +, Rb+, K+, Na+, Cs+, Li+, Zn2+, Mg2+, Ca2+, Mn2+, Cu2+ 및 Ba2+를 포함하는 계열의 염과 같은 알칼리 금속 및 알칼리 토금속 염이 포함된다. 특히, 염은 (NH4)3PO4, (NH4)2HPO4, (NH4)H2PO4, (NH4)2SO4, NH4CH3COO, NH4Cl, NH4Br, NH4NO3, NH4CIO4, NH4I, NH4SCN, Rb3PO4, Rb2HPO4, RbH2PO4, Rb2SO4, Rb4CH3COO, Rb4Cl, Rb4Br, Rb4NO3, Rb4CIO4, Rb4I, Rb4SCN, K3PO4, K2HPO4, KH2PO4, K2SO4, KCH3COO, KCl, KBr, KNO3, KClO4, KI, KSCN, Na3PO4, Na2HPO4, NaH2PO4, Na2SO4, NaCH3COO, NaCl, NaBr, NaNO3, NaCIO4, NaI, NaSCN, ZnCI2 Cs3PO4, Cs2HPO4, CsH2PO4, Cs2SO4, CsCH3COO, CsCl, CsBr, CsNO3, CsCIO4, CsI, CsSCN, Li3PO4, Li2HPO4, LiH2PO4, Li2SO4, LiCH3COO, LiCl, LiBr, LiNO3, LiClO4, LiI, LiSCN, Cu2SO4, Mg3(PO4)2, Mg2HPO4, Mg(H2PO4)2, Mg2SO4, Mg(CH3COO)2, MgCl2, MgBr2, Mg(NO3)2, Mg(ClO4)2, MgI2, Mg(SCN)2, MnCl2, Ca3(PO4), Ca2HPO4, Ca(H2PO4)2, CaSO4, Ca(CH3COO)2, CaCl2, CaBr2, Ca(NO3)2, Ca(ClO4)2, CaI2, Ca(SCN)2, Ba3(PO4)2, Ba2HPO4, Ba(H2PO4)2, BaSO4, Ba(CH3COO)2, BaCl2, BaBr2, Ba(NO3)2, Ba(ClO4)2, BaI2 및 Ba(SCN)2로부터 선택된다. 특히, 바람직하게는, 예를 들어 염화물 또는 아세트산(트리플루오로아세트산) 염과 같은 NH 아세테이트, MgCl2, KH2PO4, Na2SO4, KCl, NaCl 및 CaCl2이다.
보통, 펩티드와 변이체(적어도 펩티드 연결기를 아미노산 잔기 사이에 포함하는 것들)는 본원에 참조로 혼입된 루카스(Lukas) 등의 문헌(Lukas et al., 1981) 및 이에 인용된 문헌에 개시된 고체상 펩티드 합성의 Fmoc-폴리아미드 모드에 의해 합성될 수 있다. 일시적인 N-말단기 보호는 9-플루오레닐메틸옥시카보닐(Fmoc)에 의해 제공된다. 이렇게 염기 불안정한 보호기의 반복적인 절단은 N,N-디메틸포름아미드의 20% 피페리딘을 이용하여 이루어진다. 측쇄 작용기는 부틸 에터(세린, 트레오닌 및 티로신의 경우), 뷰틸 에스터(글루탐산 및 아스파르트산의 경우), 부틸옥시카보닐 변이체(리신과 히스티딘의 경우), 트라이틸 변이체(아르기닌의 경우) 및 4-메톡시-2,3,6-트리메틸벤젠술포닐 유도체(아르기닌의 경우)로서 보호될 수 있다. 글루타민 또는 아스파라긴이 C-말단의 잔기인 경우, 4,4'-디메톡시벤즈히드릴이 사용되어 측쇄 아미도 작용기를 보호한다. 고체상 지지체는는 폴리디메틸아크릴아미드(백본-단량체), 비스아크릴로일에틸렌 디아민(가교 결합) 및 아크릴로일사르코신 메틸 에스터(작용제)의 3개의 단량체로 만들어진 폴리디메틸-아크릴아미드 중합체에 기반을 둔다. 펩티드-대-레진 절단가능 연결 작용제로 사용되는 것은 산-불안정 4-히드록시메틸-페녹시아세트산 유도체이다. 모든 아미노산 유도체는 역 N,N-디사이클로헥실-카보다이이미드/1-히드록시벤조트리아졸에 의한 커플링 과정에 의해 추가되는 아스파라진과 글루타민을 제외하여 미리 생성된 대칭의 무수물 유도체로서 추가된다. 모든 커플링과 탈보호 반응은 닌히드린, 트리니트로벤젠 술폰산 또는 이소틴 실험 과정에 의해 모니터링된다. 합성 완성 시에, 펩티드는 레진 기반에서 50% 스캐빈저 믹스를 포함한 95% 트리플루오로아세트산에 의한 측쇄 보호기 제거와 동시에 절단된다. 일반적으로 사용되는 스캐빈저는 에탄디티올, 페놀, 아니솔 및 물을 포함하고, 정확한 선택은 합성되는 펩티드를 구성하는 아미노산에 따라 달라진다. 또한, 펩티드의 합성에서 고체상 및 용액상의 조합 방식도 가능하다(예를 들어, 문헌(Bruckdorfer et al., 2004) 및 이에 인용된 참조문헌 참고).
트리플루오로아세트산은 진공하 증발에 의해 제거되고 그 이후 디에틸 에터에 의한 분쇄로 조 펩티드를 얻는다. 존재하는 일체의 스캐빈저는 수성상의 냉동건조로써 스캐빈저가 없는 조 펩티드를 생성하는 간단한 추출 과정에 의해 제거된다. 펩티드 합성 시약들은 일반적으로, 예를 들어 Calbiochem-Novabiochem(영국 노팅햄)으로부터 얻을 수 있다.
정제는 재결정화, 크기 배제 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 및, 예를 들어 아세토니트릴/물 구배 분리를 사용하는 (대개) 액상 고성능 액체 크로마토그래피와 같은 기법의 하나 또는 그 조합에 의해 수행할 수 있다.
펩티드의 분석은 박막 크로마토그래피, 전기 이동, 특히 모세관 전기 이동, 고체상 추출(CSPE), 역상 고성능 액체 크로마토그래피, 산 가수분해 후 아미노산 분석 및 고속 원자 폭격 질량 분광분석, 및 MALDI와 ESI-QTOF 질량 분광분석 등에 의해 이루어진다.
과다-제시된 펩티드를 선택하기 위해, 중간값 샘플 제시는 물론 복제 변이를 나타내는 제시 프로필이 계산된다. 이 프로필은 관심 대상의 종양 객체 샘플을 정상 조직 샘플의 기준에 병치된다. 다음은 선형 혼합 효과 모형(Pinheiro et al., 2015)의 P 값을 계산하되 위발견율(Benjamini and Hochberg, 1995)에 의해 다중 검증에 대해 조절함으로써 이러한 프로필을 하나씩 과다-제시 점수로 강화시킬 수 있다(실시예 1, 도 1a 내지 1d 참고).
질량 분석에 의한 HLA 리간드의 동정 및 상대적 정량화를 위해, 충격동결된 조직 샘플에서 얻어진 HLA를 정제하고 HLA-연관 펩티드를 단리했다. 단리된 펩티드는 분리하여 그 서열을 온라인 나노-전기분무-이온화(nanoESI) 액체 크로마토그래피-질량 분석(LC-MS) 실험에 의해 식별했다. 흑색종 샘플(N = 18 A*02-양성 샘플)로부터 기록된 자연적 종양 관련 펩티드(TUMAP)의 파편 패턴을 동등한 서열을 가진 상응하는 합성 참조 펩티드의 파편 패턴과 비교하여, 얻어진 펩티드 서열을 확인했다. 펩티드는 원발성 종양의 HLA 분자의 리간드로서 직접 식별되었기 때문에, 그 결과는 18명의 흑색종 환자에서 얻어진 원발 종양 조직에 대해 식별된 펩티드의 자연적 처리와 제시에 대한 직접적 증거를 제공한다.
발견 파이프라인 XPRESIDENT(등록상표) v2.1(예를 들어, 전체내용이 본원에 혼입되는 US 2013/0096016을 참고)은 몇 가지 다른 비암성 조직 및 기관에 비해 암 조직에 대한 HLA-제한 펩티드 수준의 직접적인 상대적 정량화를 기준으로 관련 있는 과다-제시된 펩티드 백신 후보의 식별과 선택을 허용한다. 이는 서열 식별, 스펙트럼 집락화, 전화 이온 계수화, 정체 시간 정렬, 상태 디컨볼루션 및 정상화에 필요한 알고리즘을 조합시킨 독점 데이터 분석 파이프라인에 의해 처리하여 획득한 LC-MS 데이터를 사용한 표지-부재 차등 정량화의 개발에 의해 성취되었다.
펩티드와 샘플 각각에 대한 오류 측정치 등 제시 수준이 확립되었다. 종양 조직에 배타적으로 제시된 펩티드 및 종양에서 과다-제시된 펩티드 대비 비암성 조직 및 기관이 식별된 바 있다.
흑색종 조직 샘플에서 얻은 HLA-펩티드 복합체를 정제하고 HLA-연관 펩티드를 LC-MS로 분리하여 분석했다. 원발성 흑색종 샘플에 대한 이러한 접근 방식을 통해 본원에 포함된 모든 TUMAP를 식별했으며, 원발성 흑색종에 대한 제시가 확인되었다.
복수의 흑색종 및 정상 조직에 대해 식별된 TUMAP를 표주-부재 LC-MS 데이터에 대한 이온-계수화를 사용하여 정량화했다. 이 방법은 펩티드의 LC-MS 신호 영역이 샘플에 존재하는 풍부함과 상관관계가 있음을 가정한다. 다양한 LC-MS 실험에서 펩티드의 모든 정량적 신호들을, 샘플에 대해 평균화되고 제시 프로필로 지칭되는 막대 도표에 통합된 중심 경향에 근거하여 정규화시켰다. 이 제시 프로필은 단백질 데이터베이스 검색, 스펙트럼 군락화, 충전 상태 디컨벌루션(방전) 및 시간 성격 및 정체 정상화와 같은 다른 분석 방법들을 통합시킨다.
펩티드의 과다-제시 이외에, 기저 유전자의 mRNA 발현을 시험했다. 정상 조직 및 암 조직의 RNASeq 분석을 통해 mRNA 데이터를 획득했다(실시예 2, 도 2 참고). 정상 조직 데이터의 추가 출처는 약 3000개 정상 조직 샘플로부터 공개적으로 이용가능한 RNA 발현 데이터의 데이터베이스였다(Lonsdale, 2013). 코딩 mRNA가 암 조직에서 고도로 발현되지만 필수 정상 조직에서는 매우 낮거나 부재하는 단백질들로부터 유래된 펩티드는 본 발명에 바람직하게 포함되었다.
본 발명은 본 발명의 펩티드를 과다 또는 배타적으로 제시하는 암/종양, 바람직하게는 흑색종의 치료에 유용한 펩티드를 제공한다. 이 펩티드는 질량 분석법에 의해 원발성 인간 흑색종 샘플 상에서 HLA 분자에 의해 자연적으로 제시되는 것으로 나타났다.
이 펩티드들이 유래된 다수의 출처 유전자/단백질("전장 단백질" 또는 "기저 단백질"로도 지정됨)을 정상 조직에 비해 암에서 고도로 과발현되는 것으로 나타났다(본 발명과 관련하여 "정상 조직"은 출처 유전자의 종양-연관 정도가 높은 것을 나타내는 건강한 피부 세포 또는 기타 정상 조직 세포를 의미한다)(실시예 2 참조). 더욱이, 펩티드 자체는 종양 조직(본 발명과 관련하여 "종양 조직"이란 흑색종을 앓는 환자의 샘플을 의미한다) 상에서 강력히 과다-제시되지만 정상 조직 상에서는 그렇지 않다(실시예 1 참조).
HLA-결합된 펩티드는 면역계, 특히 T 림프구에 의해서 인식될 수 있다. T 세포는 인식되는 HLA/펩티드 복합물을 제시하는 세포들을 파괴하며, 예를 들어, 유도된 펩티드를 제시하는 흑색종 세포이다.
본 발명의 펩티드는 T 세포 반응을 자극할 수 있고/거나 과다-제시되는 것으로 나타났으므로, 본 발명에 따른 항체 및/또는 TCR 특히 sTCR의 생산에 사용될 수 있다(실시예 3 및 4 참고). 더욱이, 해당되는 MHC와 복합된 펩티드는 본 발명에 따른 항체 및/또는 TCR 특히 sTCR의 생산에도 사용될 수 있다. 해당 방법들은 당업자에게 잘 알려져 있고 해당 문헌에서도 찾을 수 있다. 따라서, 본 발명의 펩티드는 환자의 종양 세포를 파괴할 수 있는 면역 반응을 생성하는데 유용하다. 환자의 면역 반응은 설명된 펩티드의 직접적인 투여 또는 면역성을 강화할 수 있는 제제(즉, 보조제)와 섞인 적당한 전조 물질(예를 들어, 연장된 펩티드, 단백질, 또는 이러한 펩티드를 인코딩하는 핵산)을 환자에게 투여하는 것으로 유도될 수 있다. 이런 치료적 백신에서 생긴 면역 반응은 본 발명의 목적 펩티드가 비교가능한 복사수로 정상 조직에서는 나타나지 않고, 환자의 정상 세포에 대한 기피되는 자기 면역 반응의 위험을 배제하기 때문에 종양 세포에 아주 특정할 수 있다.
본 발명은 알파 쇄 및 베타 쇄("알파/베타 TCR")를 포함하는 T 세포 수용체(TCR)에 관한 것이다. 또한, MHC 분자에 의해 제시되는 경우 TCR 및 항체에 결합할 수 있는 펩티드가 제공된다. 본 발명은 또한 본 발명의 TCR 및 펩티드를 발현하는 핵산, 벡터 및 숙주 세포; 및 이를 사용하는 방법에 관한 것이다.
용어 "T 세포 수용체"(약자로 TCR)는 알파 폴리펩티드 쇄(알파 쇄) 및 베타 폴리펩티드 쇄(베타 쇄)를 포함하는 이질이합체 분자를 지칭하며, 여기서 이질이합체 수용체는 HLA 분자에 의해 제시된 펩티드 항원에 결합하는 능력이 있다. 이 용어는 소위 감마/델타 TCR 또한 포함한다.
한 구현에서, 본 발명은 본원에 기술된 대로 TCR의 생산 방법을 제공하며, 이 방법은 TCR의 발현 촉진에 적합한 조건 하에서 TCR을 발현시킬 수 있는 숙주 세포의 배양을 포함한다.
본 발명은 다른 양태에서, 본 발명에 따른 방법에 관한 것으로서, 충분한 수량의 항원을 항원-제시 세포와 접촉시킴으로써 그 항원이 적합한 항원-제시 세포 또는 인공 항원-제시 세포의 표면에 발현된 클래스 I 또는 II MHC 분자 위에 로딩되거나 항원/클래스 I 또는 II MHC 복합체 단량체의 사량체화에 의해 그 항원이 클래스 I 또는 II MHC 사합체 위에 로딩된다.
알파/베타 TCR의 알파 및 베타 쇄 및 감마/델타 TCR의 감마 및 델타 쇄는 일반적으로 각각 2개의 "도메인", 즉, 가변 및 불변 도메인을 갖는 것으로 간주된다. 가변 도메인은 가변 영역(V) 및 결합 영역(J)의 연쇄로 구성된다. 가변 도메인은 리더 영역(L) 또한 포함할 수 있다. 베타 및 델타 쇄 또한 다양성 영역(D)을 포함할 수 있다. 알파 및 베타 불변 도메인은 또한 알파 및 베타 쇄를 세포막에 고정시키는 C-말단 막횡단(TM) 도메인을 포함할 수 있다.
감마/델타 TCR에 대하여, 본원에 사용된 용어 "TCR 감마 가변 도메인"은 리더 영역(L)이 없는 TCR 감마 V(TRGV) 영역과 TCR 감마 J(TRGJ) 영역의 연계를 지칭하며, 또한, 용어 TCR 감마 불변 도메인은 세포외 TRGC 영역 또는 C-말단 절단된 TRGC 서열을 지칭한다. 마찬가지로, 용어 "TCR 델타 가변 도메인"은 리더 영역(L)이 없는 TCR 델타 V(TRDV) 영역과 TCR 델타 D/J(TRDD/TRDJ) 영역의 연계를 지칭하며, 용어 "TCR 델타 불변 도메인"은 세포외 TRDC 영역 또는 C-말단 절단된 TRDC 서열을 지칭한다.
본 발명의 TCR은 바람직하게는 결합 친화도(KD)가 약 100 μM 이하, 약 50 μM 이하, 약 25 μM 이하 또는 약 10 μM 이하인 펩티드-HLA 분자 복합체에 결합한다. 더욱 바람직하게는, 결합 친화도가 약 1 μM 이하, 약 100 nM 이하, 약 50 nM 이하, 약 25 nM 이하를 갖는 고친화도 TCR이다. 본 발명의 TCR에 대한 바람직한 결합 친화도 범위의 비제한적인 예는 약 1 nM 내지 약 10 nM, 약 10 nM 내지 약 20 nM, 약 20 nM 내지 약 30 nM, 약 30 nM 내지 약 40 nM, 약 40 nM 내지 약 50 nM, 약 50 nM 내지 약 60 nM, 약 60 nM 내지 약 70 nM, 약 70 nM 내지 약 80 nM, 약 80 nM 내지 약 90 nM, 및 약 90 nM 내지 약 100 nM을 포함한다.
본 발명의 TCR와 관련하여 본원에 사용되는 "특이적 결합" 및 그 문법적 변형어는 100 μM 이하의 펩티드-HLA 분자 복합체에 대한 결합 친화도(KD)를 갖는 TCR을 의미하는 것으로 사용된다.
본 발명의 알파/베타 이질이합체 TCR은 그 불변 도메인 사이에 도입된 이황화 결합을 가질 수 있다. 이러한 유형의 바람직한 TCR에는 TRAC 불변 도메인 서열 및 TRBC1 또는 TRBC2 불변 도메인 서열을 갖는 것들이 포함되는데, TRAC의 Thr 48 및 TRBC1 또는 TRBC2의 Ser 57이 시스테인 잔기로 교체는 경우는 예외로, 상기 시스테인은 TCR의 TRAC 불변 도메인 서열과 TRBC1 또는 TRBC2 불변 도메인 사이에 이황화 결합을 형성한다.
위에서 언급한 도입된 쇄간 결합의 유무에 관계 없이, 본 발명의 알파/베타 이질이합체 TCR은 TRAC 불변 도메인 서열 및 TRBC1 또는 TRBC2 불변 도메인 서열을 가질 수 있고, TCR의 TRAC 불변 도메인 서열 및 TRBC1 또는 TRBC2 불변 도메인 서열은 TRAC의 엑손 2의 Cys4와 TRBC1 또는 TRBC2의 엑손 2의 Cys2 사이에 있는 자연 이황화 결합에 의해 연계될 수 있다.
본 발명의 TCR은 방사성핵종, 형광단 및 비오틴으로 구성되는 군으로부터 선택되는 검출가능한 라벨을 포함할 수 있다. 본 발명의 TCR은 방사성핵종, 화학요법제, 독소와 같은 활성 치료제에 접합될 수 있다.
한 구현에서, 알파 쇄에 1개 이상의 돌연변이를 갖고/갖거나 베타 쇄에 1개 이상의 돌연변이를 갖는 본 발명의 TCR은 돌연변이되지 않은 TCR에 비해 변형된 당화를 갖는다.
한 구현에서, TCR 알파 쇄에 1개 이상의 돌연변이를 갖고/갖거나 TCR 베타 쇄에 1개 이상의 돌연변이를 갖는 TCR은 펩티드-HLA 분자 복합체에 대해 결합 친화도 및/또는 결합 반감기를 갖고, 이는 비돌연변이 TCR 알파 쇄 및/또는 비돌연변이 TCR 베타 쇄를 포함하는 TCR의 그것에 대해 2배 이상이다. 종양 특이적 TCR의 친화도 강화 및 그 이용은 최적의 TCR 친화도에 대한 범위의 존재에 의존한다. 그러한 범위의 존재는, HLA-A2 제한 병원체에 특이적인 TCR의 KD 값이 HLA-A2 제한 종양 관련 자가 항원에 특이적인 TCR에 대해 일반적으로 약 10배 낮다는 관찰에 근거한다. 현재 종양은 개인 자체의 세포로부터 발생하기 때문에 종양 항원이 면역성일 수 있음에도 불구하고, 돌연변이된 단백질, 또는 변형된 번역 처리를 가진 단백질만이 면역계에 의해 이물질로 보이게 된다. 상향조절되거나 과발현되는 항원(소위 자가 항원)이 반드시 종양에 대한 기능적 면역 반응을 유도하지는 않을 것이다: 이러한 항원에 고도로 반응성인 TCR을 발현하는 T 세포는 중추 관용이라고 알려진 과정에서 흉선 내부로부터 음으로 선택되었을 것이며, 이것은 자가 항원에 대해 낮은 친화도 TCR을 가진 T 세포만 남는다는 것을 의미한다. 따라서, 본원의 TCR 또는 TCF의 본 발명에 따른 펩티드에 대한 친화도는 당업계에서 잘 알려진 방법들로 강화되어 왔다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 TCR의 식별 및 단리 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 HLA-A*02 음성의 건강한 공여자로부터의 PBMC를 A2/펩티드 단량체와 함께 배양하는 단계, PBMC를 사합체-피코에리트린(PE)으로 배양하는 단계, 및 형광 활성화 세포 분류(FACS)-캘리버 분석에 의해 고결합성 T 세포를 단리하는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 TCR의 식별 및 단리 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 T 세포가 마우스 TCR 결핍을 보상하는 방대한 TCR 레퍼토리를 발현하는 전체 인간 TCRαβ 유전자 자리(1.1 및 0.7 Mb)를 이용한 유전자이식 마우스의 획득, 펩티드에 의한 마우스의 면역접종, 유전자전이 마우스로부터 얻어진 PBMC의 사합체-피코에리트린(PE)으로의 배양, 및 형광 활성화 세포 분류(FACS)-캘리버 분석에 의한 고결합성 T 세포의 단리를 포함한다.
한 양태에서, 본 발명의 TCR을 발현하는 T 세포를 얻기 위해, 본 발명의 TCR-알파 및/또는 TCR-베타 쇄를 인코딩하는 핵산을 감마 레트로바이러스 또는 렌티바이러스와 같은 발현 벡터로 클로닝한다. 재조합 바이러스를 생성한 다음 항원 특이성 및 기능적 결합성과 같은 기능성에 대해 시험했다. 다음에는 최종 생성물의 분취물을 사용하여 표적 T 세포 모집단(일반적으로 환자 PBMC로부터 정제된)을 형질도입하며, 모집단은 환자에 주입하기 전에 팽창시킨다. 또 다른 양태에서, 본 발명의 TCR을 발현하는 T 세포를 얻기 위해, 당업계에서 알려진 기법(예컨대, 시험관내 전사 시스템)으로 TCR RNA를 합성한다. 다음에는 시험관 내에서 합성된 TCR RNA를 종양 특이적 TCR-알파 및/또는 TCR-베타 쇄의 재발현을 위하여, 전기천공에 의해 건강한 공여자로부터 얻은 일차 CD8+ T 세포 내로 도입시킨다.
이러한 발현을 증가시키려면, 본 발명의 TCR을 인코딩하는 핵산을 레트로바이러스 긴 말단 반복(LTR), 거대세포바이러스(CMV), 쥐 줄기세포 바이러스(MSCV) U3, 포스포글리세레이트 키나제(PGK), β-액틴, 유비퀴틴 및 원숭이 바이러스 40 (SV40)/CD43 복합 프로모터, 연장 인자(EF)-1a, 비장 포커스-형성 바이러스(SFFV) 프로모터와 같은 강력한 프로모터에 작동하도록 연계시킬 수 있다. 바람직한 한 구현에서, 이 프로모터는 발현되고 있는 핵산에 대해 이종이다. 강력한 프로모터 외에도, 본 발명의 TCR 발현 카세트가 도입 유전자 발현을 강화시킬 수 있는 추가의 요소를 포함할 수 있고, 여기에는 렌티바이러스 구성(Follenzi et al., 2000)의 핵 전위를 촉진시키는 중추 폴리퓨린 관(cPPT), 및 RNA 안정성의 증가로 도입 유전자 발현을 증가시키는 우드척 간염 바이러스 전사후 조절요소(wPRE)(Zufferey et al., 1999)가 포함된다.
본 발명의 TCR의 알파 및 베타 쇄는 별개의 벡터에 위치한 핵산에 의해 인코딩될 수 있거나 동일한 벡터에 위치한 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩될 수 있다.
높은 수준의 TCR 표면 발현을 성취하려면 도입된 TCR의 TCR-알파 및 TCR-베타 쇄가 높은 수준으로 전사되는 것이 요구된다. 이를 위해서, 본 발명의 TCR-알파 및 TCR-베타 쇄를 단일 벡터에서 바이시스트로닉(bicistronic) 구성으로 클로닝할 수 있고, 이는 이러한 장애를 극복할 수 있는 것으로 나타났다. TCR-알파 TCR-베타 쇄 사이의 바이러스성 내재 리보솜 진입 부위(IRES)의 사용은 두 쇄의 조율된 발현을 초래하며, 이는 TCR-알파 및 TCR-베타 쇄가 번역 도중 단일 전사체로부터 생성되어 TCR-알파 및 TCR-베타 쇄의 동등한 몰비의 생산을 보장하기 때문이다(Schmitt et al., 2009).
본 발명의 TCR을 인코딩하는 핵산은 코돈 최적화에 의해 숙주 세균의 발현을 증가시킬 수 있다. 유전자 코드의 반복성은 하나를 초과하는 코돈에 의해 일부의 아미노산 인코딩을 허용하지만, 일부 코돈은 다른 코돈에 비해 "최적" 미만이며 이것은 일치하는 tRNA 및 다른 요인들의 상대적 가용성 때문이다(Gustafsson et al., 2004). 각 아미노산이 포유류 유전자 발현을 위한 최적의 코돈에 의해 인코딩되도록 TCR-알파 및 TCR-베타 유전자 서열의 변경 및 mRNA 불안정성 또는 잠재 스플라이스 부위의 제거는 TCR-알파 및 TCR-베타 유전자 발현을 유의하게 강화시키는 것으로 나타났다(Scholten et al., 2006).
더욱이, 도입된 TCR 및 내생 TCR 사이의 틀린 짝짓기는 자가면역성에 대해 유의한 위험을 제기하는 특이성의 획득을 초래할 수 있다. 예를 들어, 혼합된 TCR 이합체의 형성은 적절하게 짝지어진 TCR 복합체의 형성에 이용할 수 있는 CD3 분자의 숫자를 감소시킬 수 있으므로, 도입된 TCR을 발현하는 세포의 기능적 결합성을 유의하게 감소시킬 수 있다(Kuball et al., 2007).
틀린 짝짓기를 감소하기 위해 도입된 쇄의 내생 TCR과의 짝짓기 능력은 감소시키면서 쇄간 친화도를 촉진시키기 위해 본 발명의 도입된 TCR 쇄의 C-말단 도메인을 변형시킬 수 있다. 이러한 전략에는 인간 TCR-알파 및 TCR-베타 C-말단 도메인을 이의 쥐 상대물(쥐 C-말단 도메인)로 교체, 두 번째 시스틴 잔기를 도입된 TCR의 TCR-알파 및 TCR-베타 쇄로 도입하여(시스틴 변형) C-말단 도메인의 두 번째 쇄간 이황화 결합의 생성, TCR-쇄 및 TCR-베타 쇄의 C-말단 도메인("놉-인-홀(knob-in-hole)")에서 상호작용하는 잔기의 교환, 및 TCR-알파 및 TCR-베타 쇄의 가변 도메인을 CD3ζ에 직접 융합(CD3ζ 융합) 등이 포함될 수 있다(Schmitt et al., 2009).
한 구현에서, 숙주 세포는 본 발명의 TCR을 발현하도록 유전자조작된다. 바람직한 한 구현에서, 숙주 세포는 인간 T 세포나 T 세포 전구세포이다. 일부 구현에서, 이 T 세포나 T 세포 전구세포는 암 환자로부터 얻는다. 다른 구현에서, 이 T 세포나 T 세포 전구세포는 건강한 공여자로부터 얻는다. 본 발명의 숙주 세포는 치료할 환자에 대해 동종 또는 자가 세포이다. 한 구현에서, 숙주는 알파/베타 TCR을 발현하도록 형질전환된 감마/델타 T 세포이다.
"약학 조성물"이란 의학적 환경에서 인간에서 투여하기에 적합한 조성물이다. 바람직하게, 약학 조성물은 무균 상태이며 GMP 지침에 따라 생산된다.
약학 조성물은 유리 형태 또는 약학적으로 허용가능한 염의 형태로 된 펩티드를 포함한다(위의 내용 참조). 본원에 사용된 바와 같이, "약학적으로 허용가능한 염"은 펩티드가 산 또는 제제의 염기 염을 만들며 변형되는 공개된 펩티드의 유도체를 말한다. 예를 들어, 산성 염은 적당한 산과의 반응을 가진 자유 염기(일반적으로 중성 NH2 기가 있는 약물의 중성 형태)로부터 제조된다. 산성 염을 제조할 때 적당한 산은, 예를 들어, 염산, 브롬산, 황산, 질산, 인산과 같은 무기산뿐만 아니라 초산, 프로피온산, 글리콜산, 피루브산, 수산, 말산, 말론산, 호박산, 말레산, 푸마르산, 주석산, 구연산, 벤조산, 계피산, 만델산, 메탄술폰산, 에탄술폰산, p-톨루엔술폰산, 살리실산과 같은 유기산을 포함한다. 반대로, 펩티드에서 나타날 수 있는 산성 모이어티의 염기 염의 제조는 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화암모늄, 수산화칼슘, 트리메틸아민과 같은 약학적으로 허용가능한 염기를 사용한다.
특별히 바람직한 구현에서, 약학 조성물의 구현은 아세트산(아세테이트), 트리플루오로아세테이트 또는 염산(염화물)의 염으로 펩티드를 포함한다.
바람직하게는, 본 발명의 약제는 백신과 같은 면역치료제이다. 이는 환자의 영향을 받은 기관에 직접적으로 투여될 수 있거나 i.d., i.m., s.c., i.p. 및 i.v.로서 전신에 투여되거나 환자에게서 또는 나중에 환자에게 투여될 인간 세포주에 생체외 적용될 수도 있거나 나중에 환자에게 다시 투여될 환자로부터 유래하는 면역 세포의 부분 집단에 시험관내 사용될 수도 있다. 만약 핵산이 시험관 내에서 세포에 투여되면, 인터루킨-2와 같은 면역 유도 사이토카인과 함께 발현되는 것이 유용할 수도 있다. 펩티드는 상당히 순도가 높을 수도 있거나, 면역-유도 보조제(아래 참조)와 합성되어 있거나 면역-유도 사이토카인과 함께 복합체로 사용되거나, 리포좀과 같은 적당한 전달 체계와 함께 투여될 수도 있다. 펩티드는 또한 keyhole limpet haemocyanin(KLH) 또는 mannan(WO 95/18145 및 문헌(Longenecker et al(1993)) 참조)과 같은 적당한 담체와 함께 복합될 수도 있다. 펩티드는 또한 꼬리표를 달거나 융합 단백질이거나 혼성 분자일 수도 있다. 본 발명에 서열이 주어진 이 펩티드들은 CD4 또는 CD8 T 세포를 자극할 것으로 기대한다. 하지만, CD8 T 세포의 자극은 CD4 T 조력 세포에 의해 제공되는 조력의 존재에 더 효율적이다. 따라서, CD8 CTL을 자극하는 MHC 클래스 I 에피톱의 경우, 융합 짝 또는 하이브리드 분자의 섹션은 CD4-양성 T 세포를 자극한다. CD4- 및 CD8-자극유도 에피톱은 이 분야에서 잘 알려졌고 본 발명에서 식별된 것들을 포함한다.
한 양태에서, 이 백신은 서열번호 1 내지 서열번호 237을 명시하는 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 펩티드 및 하나 이상의 추가적인 펩티드, 바람직하게는 2개 내지 50개, 더 바람직하게는 2개 내지 25개, 보다 더 바람직하게는 2개 내지 20개, 가장 바람직하게는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 또는 18개의 펩티드를 포함한다. 펩티드(들)는 하나 이상의 특정한 TAA에서 유도되었고 이는 MHC 클래스 I 및/또는 클래스 II 분자에 결합할 수 있다.
본 발명의 다른 양태는 본 발명의 펩티드 또는 펩티드 변이체를 인코딩하는 핵산(예를 들어, 폴리뉴클레오티드)을 제공한다. 폴리뉴클레오티드는, 예를 들어, DNA, cDNA, PNA, CNA, RNA 또는 이들의 조합일 수 있고, 단일 가닥 및/또는 이중 가닥으로 되어 있을 수 있고, 또는 폴리뉴클레오티드의 자연(native) 또는 안정화 형태(예를 들어, 포스포로티오에이트 주골격을 가지고 있는 폴리뉴클레오티드)일 수 있고, 펩티드를 코딩하는 한, 인트론을 포함할 수도 또는 그렇지 않을 수도 있다. 물론, 자연적으로 발생하는 펩티드 결합에 의해 결합이 된 자연적으로 발생하는 아미노산 잔기를 포함하는 펩티드만이 폴리뉴클레오티드에 의해서 인코딩될 수 있다. 본 발명의 또 다른 양태는 본 발명에 따른 폴리펩티드를 발현할 수 있는 발현 벡터를 제공한다.
특히, DNA와 같은 폴리뉴클레오티드를, 예를 들어 보완 응집성 말단을 이용하여 연결하는 여러 가지 방법이 개발되었다. 예를 들어, 보완 동종중합체 트랙트가 벡터 DNA에 삽입될 DNA 분절에 추가될 수 있다. 벡터와 DNA 분절은 이후 보완 동종중합체 꼬리와 함께 수소 결합을 이용하여 재조합 DNA 분자를 형성할 수 있다.
하나 이상의 제한 부위를 포함하는 합성된 링커는 DNA 분절과 벡터를 결합하는 다른 방법을 제시한다. 여러 가지의 제한 엔도뉴클레아제 부위를 포함하는 합성 링커는 상업적으로 인터내셔날 바이오테크놀로지스 인코포레이티드(International Biotechnologies Inc, 미국 코네티컷주 뉴 헤이븐 소재)를 비롯한 곳에서 구입이 가능하다.
본 발명의 폴리펩티드를 인코딩하는 DNA를 변형시키는 바람직한 방법은 사이키(Saiki) 등에 의해 공개된 바 있는 폴리머라아제 연쇄 반응을 이용한다(Saiki et al., 1988). 이 방법은, 예를 들어 적당한 제한 부위를 만들어 적당한 벡터로의 DNA 도입 또는 이 분야에서 알려져 있는 DNA를 다른 용도를 위해 변환하는데 사용될 수도 있다. 만약 바이러스 벡터가 사용된다면, 수두- 또는 아데노바이러스 벡터가 바람직하다.
DNA(또는 레트로바이러스 벡터일 경우 RNA)는 그 후 적당한 숙주에서 발현되어 본 발명의 펩티드 또는 변이체를 포함하는 폴리펩티드를 생성할 수 있다. 따라서, 본 발명의 펩티드 또는 변이체를 인코딩하는 DNA는 여기에 포함된 배울 수 있는 내용에 따라 적절히 수정된 알려진 기법에 의거하여 사용할 수 있고, 이는 본 발명의 폴리펩티드의 발현과 생성을 위해 적절한 숙주 세포의 형질전환을 시키는데 사용된다. 이러한 기법은, 예를 들어 다음에 공개되어 있다: 미국 특허공보 제4,440,859호, 제4,530,901호, 제4,582,800호, 제4,677,063호, 제4,678,751호, 제4,704,362호, 제4,710,463호, 제4,757,006호, 제4,766,075호 및 제4,810,648호.
본 발명의 화합물을 구성하는 폴리펩티드를 인코딩하는 DNA(또는 레트로바이러스 벡터일 경우, RNA)는 많은 종류의 다른 DNA 서열과 결합되어, 적당한 숙주로의 도입을 유도할 수 있다. 동반 DNA는 숙주의 특성, DNA를 숙주로 도입하는 방법, 및 에피소말 유지 또는 통합이 필요한 지에 따라 결정될 것이다.
보통, DNA는 발현을 위한 올바른 방향 및 올바른 리딩 프레임에 맞추어 플라스미드와 같은 발현 벡터로 삽입된다. 필요할 경우, DNA는 바람직한 숙주에 의해 인식되는 적당한 전사 조절 제어 뉴클레오티드 서열(하지만, 이 제어는 대부분의 경우 발현 벡터 내에 이미 존재한다)에 연결될 수도 있다. 벡터는 그 후 숙주로 기본적인 기술을 통해 도입된다. 보통, 모든 숙주가 벡터에 의해 형질전환되지 않는다. 따라서, 형질전환된 세포를 선택하는 것이 필요할 것이다. 하나의 선택 기술은 형질전환된 세포에서 선택가능한 특성(예컨대, 항생제 내성)을 코딩하는 DNA 서열을 필요한 제어 요소와 함께 발현 벡터에 통합시키는 것이다.
다른 방법으로는, 이러한 선택가능한 특성이 다른 벡터에 있을 수도 있고, 이는 바람직한 숙주 세포를 동시-형질전환하는데 사용된다.
본 발명의 재조합 DNA에 의해 형질전환된 숙주 세포는 본 문서에서 기술된 내용을 고려하여 당업자가 이미 알고 있는 적절한 상태에서 충분한 시간 동안 배양되어 폴리펩티드의 발현을 가능하게 하며, 이는 후에 회복된다.
박테리아(예를 들어, 대장균(Escherichia coli)과 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)), 효모(예를 들어, 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)), 사상균류(예를 들어, 아스페르길스 스피시즈(Aspergillus species)), 식물 세포, 동물 세포 및 곤충 세포 등의 많은 발현 체계가 알려져 있다. 바람직하게는, 그 체계는 ATCC 셀 바이올로지 콜렉션(Cell Biology Collection)에서 구할 수 있는 CHO 세포 등의 포유류 세포로 구성될 수 있다.
구조성 발현을 위한 전형적인 포유류 세포 벡터 플라스미드는 CMV 또는 SV40 촉진제와 적당한 폴리 A 꼬리 및 네오마이신과 같은 저항 마커를 포함한다. 하나의 예는, 파마시아(Pharmacia, 미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재)에서 구할 수 있는 pSVL이다. 유도가능 포유류 발현 벡터의 예는 pMSG이며 이 또한 파마시아에서 구할 수 있다. 유용한 효소 플라스미드 벡터는 pRS403-406과 pRS413-416이며 이는 대부분 스트라타젠 클로닝 시스템즈(Stratagene Cloning Systems, 미국 캘리포니아주 92037 라 졸라 소재)에서 구할 수 있다. 플라스미드 pRS403, pRS404, pRS405 및 pRS406은 효소 통합 플라스미드(YIps)이며 이는 효소 선택 마커 HIS3, TRP1, LEU2와 URA3을 통합한다. 플라스미드 pRS413-416은 효소 동원체 플라스미드(Ycps)이다. (예를 들어, 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)로부터 입수한) CMV 프로모터 기반 벡터는 일시적인 또는 안정된 발현, 세포질 발현 또는 분비, 및 FLAG, 3xFLAG, c-myc 또는 MAT 등의 다양한 조합으로 N-말단 또는 C-말단 표지 등을 제공한다. 이러한 융합 단백질은 재조합 단백질의 감지, 정제와 분석을 가능하게 한다. 이중 표지 융합은 감지 시 유연성을 제공한다.
강한 인간 사이토메갈로 바이러스(CMV) 프로모터 규제 지역은 구성 단백질 발현 수준을 높게는 COS 세포에서 1mg/L까지 작동한다. 좀 더 효능이 약한 세포주에서는, 단백질 수준이 전형적으로 약 0.1mg/L 정도이다. SV40 복제 원점이 있음으로써 SV40, 복제를 가능하게 하는 COS 세포 DNA 복제의 수준이 높은 결과를 낳는다. CMV 벡터는, 예를 들어 박테리아 세포에서의 복제를 위한 pMB1 원점, 박테리아에서 암피실린 저항 선택을 위한 b-락타마아제 유전자, hGH poly A, 및 f1 원점을 포함할 수 있다. 프리-프로-트립신 리더(PPT) 서열을 포함하는 벡터는 FLAG 융합 단백질을 ANTI-FLAG 항체, 수지 및 플레이트를 사용하여 정제하기 위한 배양 배지로 분비하도록 방향을 정할 수가 있다. 다른 벡터와 발현 체계는 여러 가지의 숙주 세포 사용에 대해 널리 알려져 있다.
다른 구현에서는 본 발명의 2개 이상 펩티드 또는 펩티드 변이체가 인코딩됨으로써 연속적인 순서로 발현된다("염주 모양" 구조와 유사). 그렇게 함으로써 펩티드 또는 펩티드 변이체는, 예를 들어 LLLLLL과 같은 링커 아미노산의 퍼짐에 의해 함께 연결 또는 융합될 수 있고, 또한 그 사이에 추가의 펩티드 없이 연결될 수 있다. 이러한 구조들은 암 요법에서도 사용할 수 있고 MHC I 및 MHC II 모두가 연관되는 면역 반응을 유도할 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 폴리뉴클레오티드 벡터 구성에 의해 형질전환된 숙주 세포에 관한 것이다. 숙주 세포는 원핵 세포 또는 진핵 세포일 수 있다. 박테리아 세포가 일부 상황에서 바람직한 원핵 숙주 세포일 수 있고, 보통 예를 들어 베데스다 리서치 래보러토리스 인코포레이티드(Bethesda Research Laboratories Inc., 미국 메릴랜드주 베데스다 소재)에서 구할 수 있는 대장균 균주 DH5, 및 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection, ATCC)(미국 메릴랜드주 록빌 소재, ATCC 31343)에서 구할 수 있는 RR1과 같은 대장균이다. 바람직한 진핵 숙주 세포는 효소, 곤충, 포유류 세포를 포함하고, 생쥐, 쥐, 원숭이 또는 인간 섬유아세포와 대장 세포주 등의 척추 동물이 바람직하다. 효모 숙주 세포는 YPH499, YPH500 및 YPH501를 포함하며, 이는 대부분 스트라타젠 클로닝 시스템즈(미국 캘리포니아주 92037 라 졸라 소재)에서 구입가능하다. 바람직한 포유류 숙주 세포는 ATCC에서 구입가능한 CCL61로 알려져 있는 중국 햄스터 난소 세포, CRL 1658로 알려져 있는 스위스 생쥐 배아 세포 NIH/3T3, CRL 1650 세포로 알려져 있는 원숭이 신장 유도 COS-1 세포와 293 세포로 알려져 있는 인간 배아 신장 세포를 들 수 있다. 바람직한 곤충 세포는 Sf9 세포이며 이는 배큘로바이러스 발현 벡터에 의해 세포로 감염될 수 있다. 발현을 위한 적당한 숙주 세포의 선택에 대한 개관은 예를 들어 문헌[Paulina Balbas and Argelia Lorence "Methods in Molecular Biology Recombinant Gene Expression, Reviews and Protocols," Part One, Second Edition, ISBN 978-1-58829-262-9] 및 당업자에게 알려진 다른 문헌에서 찾을 수 있다.
적당한 세포 숙주를 본 발명의 DNA 구성으로 형질전환하는 것은 보통 사용되는 벡터의 유형이 따라 결정되는 잘 알려진 방법으로 완성된다. 원핵 숙주 세포의 형질전환에 대해서는, 예를 들어 코헨(Cohen) 등(Cohen et al., 1972) 및 문헌[Green and Sambrook, 2012]을 참고한다. 효모 세포의 형질 전환은 셔만(Sherman) 등에 기술되어 있다(Sherman et al., 1986). 벡스(Beggs)의 방법 또한 유용하다(Beggs, 1978). 척추 동물 세포와 관련하여 이러한 세포를 감염시키는 시약, 예를 들어 칼슘 인산염과 DEAE-덱스트란 또는 리포솜 제제는 스트라타젠 클로닝 시스템즈 또는 라이프 테크놀로지스 인코포레이티드(Life Technologies Inc., 미국 메릴랜드주 20877 게이터스버그 소재)에서 입수할 수 있다. 전기 천공법 역시 형질전환 및/또는 세포를 감염시키는데 유용하며 이는 효모 세포, 박테리아 세포, 곤충 세포 및 척추동물 세포의 형질전환에 잘 알려져 있다.
성공적으로 형질전환된 세포, 즉 본 발명의 DNA 구조를 가지고 있는 세포는 잘 알려진 PCR과 같은 기술로 식별된다. 다른 방법으로는, 상층액에 존재하는 단백질은 항생제를 사용함으로써 감지될 수 있다.
본 발명의 특정한 숙주 세포, 예를 들어 박테리아, 효모 및 곤충 세포와 같은 세포는 본 발명의 펩티드의 제조에 유용하다는 것을 알 수 있을 것이다. 하지만, 다른 숙주 세포 또한 특정한 치료 방법에 유용할 수도 있다. 예를 들어, 수지상 세포와 같은 항원-제시 세포는 적당한 MHC 분자에 로딩되도록 하는 본 발명의 펩티드를 발현하는데 유용하게 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 발명에 따른 핵산 또는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
바람직한 구현에서, 숙주 세포는 항원-제시 세포이며, 특히 수지상 세포 또는 항원-제시 세포이다. 전립선산 인산효소(PAP)를 함유하는 재조합 융합 단백질로 로딩된 APC는 무증상 또는 최소한의 증상성인 전이성 HRPC(Sipuleucel-T)의 치료에 대해 미국 식품안전청(FDA)에서 2010년 4월 29일에 승인되었다(Small EJ, et al.(Rini et al., 2006; Small et al., 2006).
본 발명의 다른 양태는 펩티드 또는 이의 변이체를 생산하는 방법, 숙주 세포를 배양하고 펩티드를 숙주 세포 또는 배지에서 단리하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.
펩티드의 다른 구현에 있어서, 본 발명의 핵산 또는 발현 벡터는 의학에서 사용된다. 예를 들어, 펩티드 또는 이의 변이체는 정맥내(i.v.) 주사, 피하(s.c.) 주사, 피내(i.d.) 주사, 복강내(i.p.) 주사, 근육내(i.m.) 주사용으로 제조될 수 있다. 펩티드 투여의 바람직한 방법은 s.c., i.d., i.p., i.m. 및 i.v. 투여를 포함한다. DNA 투여의 바람직한 방법은 i.d., i.m., s.c., i.p. 및 i.v. 투여를 포함한다. 예를 들어, 50 μg 내지 1.5 mg, 바람직하게는 125 μg 내지 500 μg의 용량의 펩티드 또는 DNA는 각각의 펩티드 또는 DNA에 따라서 투여될 수 있다. 이러한 범위의 용량이 이전의 임상시험에서 성공적으로 사용된 바 있다(Walter et al., 2012).
면역 접종에 사용된 폴리뉴클레오티드는 상당히 순도가 높거나 적당한 벡터 또는 전달 체계에 포함되어 있을 수 있다. 핵산은 DNA, cDNA, PNA, CNA, RNA 또는 이들의 조합일 수 있다. 이러한 핵산을 설계하고 도입하는 방법은 이 업계에 잘 알려져 있다. 개요는, 예를 들어 튜펠(Teufel) 등에 제공되어 있다(Teufel et al., 2005). 폴리뉴클레오티드 백신은 만들기가 쉽지만, 이들 벡터의 면역 반응을 유도하는 동작 모드는 완전히 이해가 되지 않았다. 적당한 벡터와 전달 체계는 아데노바이러스, 백시니아 바이러스, 레트로바이러스, 헤르페스 바이러스, 아데노 연관 바이러스 또는 하나 이상의 바이러스를 포함하는 혼성체 등의 바이러스 DNA 및/또는 RNA를 포함한다. 비-바이러스 전달 체계는 양이온 지질과 양이온 중합체를 포함하고 있고 DNA 전달 분야에서 잘 알려져 있다. "유전자 총(gene-gun)"을 통한 것과 같은 물리적 전달 또한 사용될 수 있다. 펩티드 또는 핵산에 의해 인코딩된 펩티드는 융합 단백질이 될 수도 있고, 예로서는 위에서 언급한 각각의 반대 CDR을 위한 T 세포를 유도하는 에피톱을 들 수 있다.
본 발명의 약제는 하나 이상의 보조제를 포함할 수도 있다. 보조제는 면역 반응을 비특이적으로 향상시키거나 강력하게 하는 물질이다(예컨대, 항원에 대한 CD8 양성 T 세포 및 조력 T(TH) 세포에 의해서 중재된 면역 반응). 따라서, 본 발명에서 보조제는 유용한 약제 구성이라고 간주할 수 있다. 적당한 보조제는 다음을 포함하지만 이에 국한되지 않는다: 1018 ISS, 알루미늄 염, 암플리박스(등록상표), AS15, BCG, CP-870,893, CpG7909, CyaA, dSLIM, 플라젤린 또는 플라젤린에서 유도된 TLR5 리간드, FLT3 리간드, GM-CSF, IC30, IC31, 이미퀴모드(ALDARA, 등록상표), 레스퀴미드, ImuFact IMP321, IL-2, IL-13, IL-21과 같은 인터루킨, 인터페론 알파 또는 베타, 또는 이들의 페길화된 유도체, IS 패치, ISS, ISCOMATRIX, ISCOMs, 주브이뮨(JuvImmune), LipoVac, MALP2, MF59, 모노포스포릴 지질 A, 몬타나이드 IMS 1312, 몬타나이드 ISA 206, 몬타나이드 ISA 50V, 몬타나이드 ISA-51, 유중수형과 수중유형 에멀전, OK-432, OM-174, OM-197-MP-EC, ONTAK, OspA, PepTel(등록상표) 벡터 시스템, PLG와 덱스트란 극미립자, 탈락토페린, SRL172, 비로솜(Virosomes) 및 다른 바이러스-유사 입자, YF-17D, VEGF 트랩, R848, 베타글루칸, Pam3Cys, 사포닌에서 유도된 아퀼라스 QS21 스틸물론, 마이코박테리아 추출물과 합성 세균의 세포 벽 모방제, 및 다른 리비의 데톡스(Ribi's Detox), 쿠일(Quil), 또는 수퍼포스(Superfos)와 같은 독점 보조제 등이 있다. 프로인트(Freund's) 또는 GM-CSF와 같은 보조제가 바람직하다. 여러 면역적 보조제(예컨대, MF59)는 수지상 세포에 특이적이고, 그 제조 방법은 이전에 설명된 바 있다(Allison and Krummel, 1995). 또한, 시토카인도 사용될 수 있다. 여러 시토카인은 수지상 세포의 림프 조직으로의 이동에 영향을 주는데 직접적으로 연관된 바 있고(예컨대, TNF-), 이는 수지상 세포의 더 효율적인 T 림프구에 대한 항원-제시 세포로의 성장을 가속시키고(예컨대, GM-CSF, IL-1 및 IL-4)(US 5,849,589, 여기에 그 전문이 참조문헌으로 포함됨) 면역보조제의 역학을 한다(예컨대, IL-12, IL-15, IL-23, IL-7, IFN-알파. IFN-베타)(Gabrilovichet al., 1996).
CpG 면역자극 올리고뉴클레오티드는 백신 환경에서 보조제의 효율성을 높이는 것으로 나타났다. 이 이론에 국한하지 않고, CpG 올리고뉴클레오티드는 톨-유사 수용체(TLR), 특히 TLR9를 통해 천성(비-적응) 면역 체계를 활성화시킨다. CpG에 의해 유도된 TLR9의 활성화는 펩티드 또는 단백질 항원, 살아 있거나 죽은 바이러스, 수지상 세포 백신, 자가 세포 백신 및 예방적 및 치료적 백신의 다당류 접합체를 포함한 넓은 종류의 항원에 대한 항원 특이적 체액성 및 세포성 반응을 향상시킨다. 더 중요하게, 이는 수지상 세포의 성숙 및 차별화를 향상시키고 이는 TH1 세포의 활성화를 향상시키며 강한 세포독성 T 림프구(CTL) 생성을 CD4 T 세포의 도움이 없을 때에도 향상시킨다. TLR9 자극에 의해 일어난 TH1 바이러스는 보통 TH2 바이러스를 촉진시키는 alum 또는 비완성된 프로인트 보조제(IFA)와 같은 백신 보조제가 존재할 때도 유지된다. CpG 올리고뉴클레오티드는 다른 보조제와 함께 제조되거나 함께 투여될 시 또는 특히 항원이 상대적으로 약할 때 강한 반응을 얻어 내기 위해 필요한 미세입자, 나노입자, 지질 에멀전 또는 비슷한 제약으로 되어 있을 경우 더 큰 보조제 활동을 보인다. 그들은 또한 면역 반응을 가속화시키고, 몇몇의 연구에서 보여진 바 있듯이 CpG가 없을 때 백신 전체 용량이 일으키는 항체 반응 수준으로 항원의 용량을 약 두 배 정도 줄일 수 있도록 한다(Krieg, 2006). US 6,406,705 B1은 CpG 올리고뉴클레오티드, 비핵산 보조제 및 항원 특정 면역 반응을 일으키는 항원의 병용에 대해 설명한다. CpG TLR9 길항제는 몰로젠(Mologen, 독일 베를린 소재)에 의해 만들어진 dSLIM(이중 줄기 루프 면역조절제)이며 이는 본 발명의 제약 조성의 바람직한 성분이다. RNA 결합 TLR 7, TLR 8 및/또는 TLR 9 등의 다른 TLR 결합 분자 또한 사용이 가능하다.
다른 유용한 보조제의 예는 다음을 포함하지만 이에 국한되지 않는다: 화학적으로 변형된 CpGs(예컨대, CpR, Idera), Poly(I:C)와 같은 dsRNA 유사체 및 그 유도체(예컨대, 앰프리젠(AmpliGen, 등록상표), 힐토놀(Hiltonol, 등록상표), poly-(ICLC), poly(IC-R), poly(I:C12U), 비-CpG 박테리아 DNA 또는 RNA 및 사이클로포스아미드, 수니티닙, 베바시주맙(Bevacizumab, 등록상표), 셀레브렉스, NCX-4016, 실데나필, 타달라필, 바르데나필, 소라페닙, 테모졸로마이드, 템시롤리무스, XL-999, CP-547632, 파조파닙, VEGF 트랩, ZD2171, AZD2171, 안티-CTLA4와 같은 면역활성인 소분자 및 항체, 면역계의 주요 구조를 표적화하는 다른 항체(예컨대, 항-CD-40, 항-TGF베타, 항-TNF알파 수용체) 및 SC58175가 있고 이는 치료적으로 및/또는 보조제의 역할을 할 수 있다. 본 발명에서 사용되는 보조제와 첨가제의 양과 농도는 특별히 다른 실험할 필요 없이 숙련된 기술자에 의해서 쉽게 결정될 수 있다.
바람직한 보조제들은 항-CD40, 이미퀴모드, 레시퀴모드, GM-CSF, 사이클로포스파마이드, 수리티닙, 베바시주맙, 인터페론-알파, CpG, 올리고뉴클레오티드 및 유도체, poly-(I:C) 및 유도체, RNA, 실데나필, 및 PLG 또는 비로솜 미립자 제제이다.
본 발명에 따른 약학 조성물의 바람직한 구현에서, 보조제는 과립구 대식세포 집락 자극 인자(GMCSF, 사르가라모스팀), 사이클로포스파미드, 이미퀴모드, 레시퀴모드 및 인터페론 알파와 같은 집락 자극 인자로 구성된 군에서 선택된다.
본 발명에 따른 약학 조성물의 바람직한 구현에서, 보조제는 과립구 대식세포 집락 자극 인자(GMCSF, 사르가라모스팀), 사이클로포스파미드, 이미퀴모드 및 레시퀴모드와 같은 집락-자극 인자로 구성된 군에서 선택된다. 본 발명에 따른 약학 조성물의 바람직한 구현에서, 보조제는 사이클로포스파미드, 이미퀴모드 또는 레시퀴모드이다. 훨씬 더 바람직한 보조제는 몬타나이드(Montanide) IMS 1312, 몬타나이드 ISA 206, 몬타나이드 ISA 50V, 몬타나이드 ISA-51, poly-ICLC(힐토놀(등록상표)) 및 anti-CD40 mAB 또는 이들의 조합들이다.
이 조성물은 피하, 피부내, 근육내와 같은 비경구 투약 또는 경구 투약에 사용된다. 이를 위해, 펩티드 및 임의적으로 다른 분자들을 약학적으로 허용되는 담체, 바람직하게는 수용성 담체에 용해 또는 현탁한다. 추가로, 이 조성물은 완충제, 결합제, 발파제, 희석제, 향미료, 윤활제 등의 부형제를 함유할 수 있다. 또한 펩티드는 시토카인과 같은 면역 자극 물질과 함께 투여될 수 있다. 이러한 성분에 사용될 수 있는 방대한 부형제 목록은, 예를 들어 문헌[A. Kibbe, 약학적 부형제 핸드북](Kibbe, 2000)에서 확인할 수 있다. 이러한 조성물은 선종성 또는 암성 질병의 방지, 예방 및/또는 치료에 사용될 수 있다. 예시적 제제는, 예를 들어 EP 2112253에서 찾아볼 수 있다.
본 발명에 따른 백신에 의해 일어나는 면역 반응이 다른 세포 단계 및 다른 개발 단계에서는 암을 공격한다는 것을 인지하는 것이 중요하다. 더욱이, 암과 연관된 다른 신호전달 경로가 공격을 받는다. 이것은 단 하나 또는 몇몇 표적만을 다루는 백신에 비해 이점이며, 이로 인해 종양이 공격에 쉽게 적응(종양 탈출)하도록 유발할 수 있다. 더욱이, 모든 개별 종양들이 같은 패턴의 항원을 발현하는 것은 아니다. 따라서, 종양-연관된 여러 펩티드들의 조합은 모든 개별 종양이 적어도 표적의 일부를 갖도록 보장한다. 이 조성물은 각 종양이 여러 항원을 발현하도록 예상되며, 또한 종양 성장 및 유지에 필요한 여러 독립적 경로를 다루도록 설계되었다. 이에 따라, 백신은 보다 큰 환자 모집단을 위해 "기성품으로" 쉽게 사용이 가능하다. 이는 백신으로 치료할 환자의 사전 선택을 HLA 형결정으로 제한할 수 있고, 항원 발현을 위해 어떠한 추가의 바이오마커 평가를 요구하지 않음을 의미하지만, 효능에 중요한 여러 표적들이 유도된 면역 반응에 의해 동시적으로 공격됨을 여전히 보장한다(Banchereau et al., 2001; Walter et al., 2012).
본원에 사용된 "골격"이란 용어는(예컨대, 항원성) 결정인자에 특이적으로 결합하는 분자를 말한다. 한 구현에서, 골격은 그것이 부착되는 객체(예컨대, (두 번째) 항원 결합 모이어티)를 표적 부위, 예를 들어 특정 유형의 종양 세포 또는 항원성 결정인자를 갖는 종양 기질(예컨대, 현재 용도에 따른 MHC와 펩티드의 복합체)로 향하도록 지시할 수 있다. 또 다른 구현에서, 골격은 그 표적 항원, 예를 들어 T 세포 수용체 복합체 항원을 통해 신호전달을 활성화할 수 있다. 골격은 항체 및 그 단편, 항체 중쇄 가변 영역 및 항체 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체의 도메인에 결합하는 항원, 하나 이상의 안키린 반복 모티프 및 단일 도메인 항원 결합(SDAB) 분자를 포함하는 결합 단백질, 압타머, (가용성) TCR 및 동종 또는 자가 T 세포와 같은 (변형된) 세포를 포함하지만 이로써 제한되지는 않는다. 어떤 분자가 표적에 결합하는 골격인지 평가하기 위해, 결합 분석을 수행할 수 있다.
"특이적" 결합이란 그 골격이 다른 자연적으로 발생하는 펩티드-MHC 복합체보다 관심 대상의 펩티드-MHC 복합체에 더 잘 결합하며, 그 정도는 특정 표적이 포함된 세포를 줄일 수 있는 활성 분자로 무장한 골격이 특정 표적이 없는 다른 세포는 죽일 수 없으며 다른 펩티드-MHC 복합체를 제시하는 것을 의미한다. 교차반응성 펩티드-MHC의 펩티드가 자연적으로 발생하지 않는다면, 즉, 인간 HLA-펩티돔으로부터 유래되지 않는다면, 다른 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합은 관련이 없다. 표적 세포 괴사를 평가하는 검사는 당업계에 잘 알려져 있다. 이 검사는 변경되지 않는 펩티드-MHC 제시를 가진 표적 세포(일차 세포 또는 세포주) 또는 자연적으로 발생되는 펩티드-MHC 수준이 도달되는 정도로 펩티드가 포함된 세포를 사용하여 수행해야 한다.
각 골격은 라벨이 제공하는 신호의 존재 또는 부재를 판단함으로써 결합된 골격이 검출가능하도록 제공하는 라벨링을 포함할 수 있다. 예를 들어, 이 골격은 형광 염료 또는 임의의 다른 해당되는 세포 마커 분자를 사용하여 라벨링이 가능하다. 그러한 마커 분자는 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 형광 라벨링(예를 들어, 형광 염료에 의해 제공되는)은 형광 또는 레이저 스캐닝 현미경 또는 유세포 분석에 의해 결합된 압타머의 가시화를 제공할 수 있다.
각 골격은 IL-21, 항-CD3, 항-CD28과 같은 두 번째 활성 분자와 접합될 수 있다.
폴리펩티드 골격에 대한 추가 정보는, 예를 들어 WO 2014/071978A1의 배경기술 부분과 거기에 인용된 참조문헌을 참고한다.
본 발명은 또한 압타머에 관한 것이다. 압타머(예는 WO 2014/191359 및 본원에 인용된 문헌을 참조)는 정의된 삼차원적 구조로 접힐 수 있고 특정 표적 구조를 인식할 수 있는 짧은 단일 핵산 분자이다. 이것은 표적 요법의 개발에 필요한 적합한 대안인 것으로 보여진 바 있다. 압타머는 높은 친화도 및 특이성으로 다양한 복합체 표적에 임의적으로 결합하는 것으로 나타난 바 있다.
세포 표면에 위치한 분자를 인식하는 압타머들이 지난 십 년 동안 식별되었으며 진단 및 치료 접근 방식을 개발하기 위한 수단을 제공한다. 압타머가 독성 및 면역원성을 거의 보유하지 않는 것으로 나타났으므로, 생의학적 용도를 위한 유력한 후보이다. 정말로 압타머, 예를 들어 전립선 특이적 막-항원을 인식하는 압타머는 표적 대상의 요법을 위해 성공적으로 사용되어 왔으며, 또한 생체 모델에서의 이종이식에 기능적인 것으로 나타난 바 있다. 더욱이, 특이적 종양 세포주를 인식하는 압타머가 식별된 바 있다.
DNA 압타머는 다양한 암 세포, 특히 고형 종양으로부터 유래하는 것들을 위한 광범위 인식 성질을 밝히기 위해 선택가능한 반면에, 비종양형성 및 원발성의 건강한 세포는 인식되지 않는다. 식별된 압타머가 특이적 종양 아형을 인식할 뿐만 아니라 일련의 종양과 상호작용한다면, 이로 인해 압타머는 소위 광범위 진단 및 치료에 적용될 수 있다.
더욱이, 유세포 분석을 사용한 세포 결합 거동의 조사에 의하면 압타머는 나노몰 범위에서 매우 양호하고 뚜렷한 친화성을 드러내는 것으로 나타났다.
압타머는 진단 및 치료 목적으로 유용하다. 또한, 일부 압타머가 종양 세포가 취하며, 이에 따라 종양 세포 안으로의 siRNA와 같은 항암제의 표적 인도를 위한 분자 부형제로서 기능할 수 있는 것으로 나타났다.
압타머는 세포 및 조직과 같은 복합체 표적 및 MHC를 사용한 현재 본 발명에 따른 서열번호 1 내지 서열번호 237 중 어느 한 서열을 포함하거나, 바람직하게는 이러한 서열로 구성되는 펩티드의 복합체에 대하여, 세포-SELEX(Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment, 지수적 증식에 의한 리간드의 체계적 진화) 기법을 사용하여 선택가능하다.
본 발명의 펩티드는 MHC/펩티드 복합체에 대한 특정 항체를 생성하고 개발하는데 사용될 수 있다. 이들은 병변 조직에 치료, 독성 물질 표적화 또는 방사능 물질로 사용될 수 있다. 이런 항체의 또 다른 사용은 PET 같은 이미지 목적을 위해 병변 조직의 방사성 핵종을 표적화할 수도 있다. 이 사용은 작은 전이를 감지하거나 병변 조직의 크기와 정확한 위치를 결정하는데 도움이 될 수 있다.
따라서, 본 발명의 다른 양태는 HLA 제한 항원과 복합되는 인간 주조직적합 복합체(MHC) 클래스 I 또는 II와 특이적으로 결합하는 재조합 항체의 생산 방법을 제공하는 것으로서, 이 방법은 상기 HLA 제한 항원과 복합되는 가용성 형태의 MHC 클래스 I 또는 II 분자로써 상기 인간 주조직적합 복합체(MHC) 클래스 I 또는 II를 발현하는 세포를 포함하는 유전자 조작된 비인간 포유동물의 면역화; 상기 비인간 포유동물의 세포를 생산하는 항체로부터 mRNA 분자의 단리; 상기 mRNA 분자에 의해 인코딩된 단백질 분자를 표시하는 파지 디스플레이 라이브러리의 생산; 및 상기 파지 디스플레이 라이브러리로부터 하나 이상의 파지의 단리를 포함하며, 상기 하나 이상의 파지는 상기 HLA 제한 항원과 복합되는 상기 인간 주조직적합 복합체(MHC) 클래스 I 또는 클래스 II와 특이적으로 결합하는 상기 항체를 나타낸다.
본 발명의 다른 양태는 HLA 제한 항원과 복합되는 인간 주조직적합 복합체(MHC) 클래스 I 또는 II에 특이적으로 결합하는 항체를 제공하는 것으로서, 이 항체는 바람직하게는 다클론 항체, 단클론 항체, 양특이성 항체 및/또는 키메라 항체이다.
그러한 항체 및 단일 쇄 클래스 I 주조직적합 복합체의 생산을 위한 해당 방법들 및 이러한 항체의 생산을 위한 다른 도구들은 WO 03/068201, WO 2004/084798, WO 01/72768, WO 03/070752 및 출판물(Cohen et al., 2003a; Cohen et al., 2003b; Denkberg et al., 2003)에 공개되어 있고, 이들은 본 발명의 목적을 위해 그 전문이 참조문헌에 명백히 포함되어 있다.
바람직하게, 항체는 20 나노몰 미만, 바람직하게는 10 나노몰 미만의 결합 친화도로 복합체와 결합하는데, 이는 본 발명의 문맥상 "특이적"으로 간주된다.
본 발명은 또한 서열번호 1 내지 서열번호 237로 구성되는 군으로부터 선택되는 서열 또는 서열번호 1 내지 서열번호 237에 대해 88% 이상의 상동성을 갖는(바람직하게는 동등한) 이의 변이체 또는 상기 펩티드와 T 세포 교차반응을 유도하는 이의 변이체를 포함하는 펩티드에 관한 것으로서, 상기 펩티드는 전장 폴리펩티드가 아니다.
본 발명은 또한 서열번호 1 내지 서열번호 237로 구성되는 군으로부터 선택되는 서열 또는 서열번호 1 내지 서열번호 237에 대해 88% 이상의 상동성을 갖는(바람직하게는 동등한) 이의 변이체에 관한 것으로서, 상기 펩티드 또는 변이체가 갖는 전체 길이는 8 내지 100개, 바람직하게는 8 내지 30개, 가장 바람직하게는 8 내지 14개의 아미노산이다.
본 발명은 또한 인간 주조직적합 복합체(MHC) 클래스-I 또는 -II의 분자에 결합하는 능력을 갖는 본 발명에 따른 펩티드에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 펩티드에 관한 것으로서, 상기 펩티드는 서열번호 1 내지 서열번호 237에 따른 아미노산으로 구성되거나 본질적으로 구성된다.
본 발명은 또한 본 발명에 의한 펩티드에 관한 것으로서, 상기 펩티드는 (화학적으로) 변형되거나/고 비펩티드 결합을 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명에 의한 펩티드에 관한 것으로서, 상기 펩티드는 특히 HLA-DR 항원-연관된 불변 쇄(Ii)의 N-말단을 포함하는 융합 단백질의 일부이거나, 예를 들어 수지상 세포에 특이적인 항체와 같은 항체에(또는 안으로) 융합된다.
본 발명은 또한 본 발명이 따른 펩티드를 인코딩하는 핵산에 관한 것으로서, 펩티드는 완전한(전체) 인간 단백질이 아니다.
본 발명은 또한 DNA, cDNA, PNA, RNA 또는 이들의 조합인 본 발명에 따른 핵산에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 핵산을 발현할 수 있는 발현 벡터에 관한 것이다.
본 발명은 또한 특히 흑색종의 치료에 사용하기 위한 의약에서 본 발명에 따른 펩티드, 본 발명에 따른 핵산 또는 본 발명에 따른 발현 벡터에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 핵산을 또는 전에 설명한 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다.
본 발명은 또한 항원-제시 세포, 바람직하게는 수지상 세포인 본 발명에 따른 숙주 세포에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 펩티드를 생산하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 본 발명에 따른 숙주 세포의 배양 및 상기 숙주 세포 또는 그 배양 배지로부터 펩티드의 단리를 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 방법에 관한 것으로서, 충분한 수량의 항원을 항원-제시 세포와 접촉시킴으로써 항원이 적합한 항원-제시 세포의 표면에 발현된 클래스 I 또는 II MHC 분자 위에 로딩된다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 방법에 관한 것으로서, 항원-제시 세포가 서열번호 1 내지 서열번호 237을 포함하는 상기 펩티드 또는 상기 변이체 아미노산 서열을 발현할 수 있는 발현 벡터를 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 이상 발현하는 세포를 선택적으로 인식하는, 본 발명에 따른 방법에 의해 생산된 활성화된 T 세포에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 일체의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 표적 세포가 이상 발현하는 환자에서 표적 세포를 괴사하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 본 발명에 따른 효과적인 수의 T 세포를 환자에게 투여하는 것을 포함한다.
본 발명은 또한 설명한 일체의 펩티드, 본 발명에 따른 핵산, 본 발명에 따른 발현 벡터, 본 발명에 따른 세포, 또는 본 발명에 따른 활성화된 세포 독성 T 림프구의 약제로서 또는 약제의 제조에서의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 본 발명에 따른 용도에 관한 것으로서, 상기 약제는 암에 대해 활성을 갖는다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 용도에 관한 것으로서, 상기 약제는 백신이다. 본 발명은 또한 본 발명에 따른 용도에 관한 것으로서, 상기 약제는 암에 대해 활성을 갖는다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 용도에 관한 것으로서, 상기 암 세포는 흑색종 세포 또는 급성 골수성 백혈병, 유방암, 담관암, 뇌암, 만성 림프구성 백혈병, 대장 암종, 식도암, 담낭암, 위암, 간세포암, 비호지킨 림프종, 비소세포 폐암, 난소암, 췌장암, 전립선암, 신세포암, 소세포 폐암, 방광암 및 자궁암과 같은 기타 고형 또는 혈액 종양 세포이다.
본 발명은 또한 흑색종의 진단 및/또는 예후에 사용될 수 있는, 본 발명에서 "표적"이라 부르는, 본원에 따른 펩티드에 근거하는 특정 표지자 단백질 및 바이오마커에 관한 것이다. 본 발명은 또한 암 치료를 위한 이러한 새로운 표적의 바람직한 용도에 관한 것이다.
용어 "항체"는 본원에서 광범위한 의미로 사용되며, 다클론 및 단클론 항체를 둘 다 포함한다. 무손상 또는 "온전한" 면역글로불린 항체 분자뿐만 아니라, 용어 "항체"에 포함되어 있는 것은 그런 면역글로불린 분자와 인간화된 버전의 면역글로불린 버전의 단편(예컨대, CDR, Fv, Fab 및 Fc 단편) 또는 중합체이며, 이 단편은 본 발명에 따른 바람직한 특성(예를 들어, 흑색종 마커 (폴리)펩티드의 특정 결합, 높아진 수준의 흑색종 마커 유전자를 발현하는 암 세포에 독소 전달, 및/또는 흑색종 마커 폴리펩티드의 활성 억제)을 나타낸다.
가능한 한, 본 발명의 항체는 상용 공급원으로부터 구입할 수 있다. 본 발명의 항체는 잘 알려진 방법을 통해서 생성될 수도 있다. 이 분야의 기술자는 전장 흑색종 마커 폴리펩티드 또는 그 단편이 본 발명의 항체를 만드는데 사용될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 본 발명의 항체를 생성하는데 사용될 폴리펩티드는 자연적인 원천에서 부분적으로 또는 완전히 정제될 수 있거나, 재조합 DNA 기술을 이용하여 생성될 수도 있다.
예를 들어, 서열번호 1 내지 서열번호 237에 따른 폴리펩티드 또는 이의 변이체 또는 단편에 따른 펩티드와 같은 본 발명에 따른 펩티드를 인코딩하는 cDNA는 원핵 세포(예컨대, 세균) 또는 진핵 세포(예컨대, 효모, 곤충 또는 포유동물 세포)에서 발현될 수 있고, 그 다음 그 재조합 단백질을 정화시켜, 본 발명에 따른 항체의 생성에 사용되는 흑색종 표지 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 단클론성 또는 다클론성 항체 제제를 생성하는데 사용할 수 있다.
당업자는 2개 이상의 다른 단클론 또는 다클론 항체의 조합의 생성을 의도하는 사용(예컨대, ELISA, 면역조직화학, 생체내 이미징, 면역독소 요법)에 요구되는 특이성 및 친화도를 갖는 항체의 획득가능성을 최대화함을 인식할 것이다. 이 항체들은 그 항체들이 사용되는 목적에 의거하여 알려진 방법에 의해 바람직한 활성도에 대해 시험되고(예컨대, ELISA, 면역조직화학, 면역요법 등; 항체의 생성과 시험에 관한 추가 지침은, 예를 들어 문헌[Greenfield, 2014]을 참고한다), 예를 들어, 항체는 포르말린 고정 폐암 또는 동결된 조직 절편의 ELISA 분석법, 웨스턴 블롯, 면역조직화학 염색으로 시험할 수 있다. 치료 또는 생체내 진단을 위한 항체는 초기의 시험관내 특성화 이후, 알려진 임상 시험 방법에 따라 시험된다.
"단클론 항체"라는 용어는 본원에서 치환으로 균등질 항체 개체군에서 획득된 것을 가리킨다. 즉, 이 개체군이 포함하는 각각의 항체는 자연적으로 일어날 수 있는 소수의 돌연변이체를 제외하고는 동일하다. 단클론 항체는 본원에서, 특히 중쇄 및/또는 경쇄의 한 부분이 특정한 종 또는 특정한 항체 클래스 또는 서브클래스에서 유도된 항체의 서열과 상응하거나 일치하고, 쇄의 나머지 부분은 다른 종 또는 다른 항체 클래스 또는 서브클래스에서 유도된 항체, 및 이러한 항체의 단편의 서열과 상응하거나 일치하고, 희망하는 상반되는 활동성을 나타내는 "키메라(chimeric)" 항체를 포함한다(US 4,816,567, 여기에 그 전문이 참조문헌으로 포함됨).
본 발명의 단클론 항체는 하이브리도마 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 하이브리도마 방법에서는, 생쥐 또는 다른 적당한 숙주 동물이 보통 면역성을 주는 작용제에 의해 면역되어, 면역성을 주는 작용제에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하거나 이를 생산할 수 있는 능력을 가지고 있는 림프구를 유도해 낸다. 다른 방법으로는, 림프구는 시험관 내에서 면역될 수도 있다.
단클론 항체는 또한 US 4,816,567에서 설명된 바와 같은 재조합 DNA 방법에 의해 만들어질 수 있다. 본 발명의 단클론 항체를 인코딩하는 DNA는 손쉽게 분리되고 전통적인 방법을 사용하여 염기 서열 분석이 가능하다(예컨대, 마우스 유래 항체의 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 능력이 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용).
시험관내 방법 또한 1가(monovalent)의 항체를 제조하는데 적당하다. 이 분야에서 잘 알려진 방법을 사용하여 항체를 절편화시켜 항체의 단편, 특히 본원에서는 Fab 단편을 생산할 수 있다. 예를 들어, 파파인을 사용하여 소화가 이루어질 수 있다. 파파인 소화의 예는 WO 94/29348 및 US 4,342,566에 설명되어 있다. 항체의 파파인 소화는 보통 각각 하나의 항원 결합 위치 및 남은 Fe 단편을 포함한 Fab 단편이라 부르는 동등한 2개의 항원 결합 단편을 생산한다. 펩신 처리는 하나의 F(ab')2 단편과 하나의 pFc' 단편을 제공한다.
항체 단편(다른 서열과 붙어 있든 그렇지 않든 간에)은, 이 단편의 활동력이 변경되지 않은 항체 또는 항체 단편에 비교할 시, 현저하게 바뀌거나 손상이 되지 않는 한, 삽입, 삭제, 치환, 또는 특정한 위치 또는 특정한 아미노산 잔기의 다른 선택된 변경을 포함할 수 있다. 이러한 변경은 이황화물 결합의 능력이 있는 아미노산의 제거/추가, 생체물 수명의 증가, 분비 특징의 변화 등의 추가적인 특성을 제공할 수 있다. 어떤 경우에도, 항체 단편은 결합 활성, 결합 도메인에서의 결합 조절 등의 생활성물 성질을 소유하고 있어야 한다. 항체의 기능 또는 활동 범위는 단백질의 특정한 지역의 돌연변이 생성, 발현 및 발현된 폴리펩티드의 실험에 의해 확인될 수 있다. 이러한 방법은 이 분야의 기술자가 손쉽게 알 수 있는 기술이며 이는 항체 단편을 인코딩하는 핵산의 위치 특이적 돌연변이 생성을 포함할 수 있다.
본 발명의 항체는 인간화된 항체 또는 인간 항체를 추가로 포함할 수 있다. 인간화된 형태의 비인간(예, 쥐과 동물) 항체는 최소의 비인간 면역글로불린 항체에서 유도된 서열을 포함하는 키메라 면역글로불린항체, 면역글로불린 쇄 또는 이들의 단편(Fv, Fab, Fab' 또는 다른 항체의 항원 결합의 결과)이다. 인간화된 항체는 상보성 결정 영역(complementary determining region(CDR))의 잔기가 생쥐, 쥐 또는 토끼와 같은 비인간 종(공여 항체)의 CDR의 잔유물로 바뀐 요구되는 특이성, 친화도 및 수용력을 가진 인간 면역글로불린(수납 항체)이다. 몇몇의 예에서는, 인간 면역글로불린의 Fv 구조(FR) 잔기가 상응하는 비인간 잔기로 교체된다. 인간화된 항체는 수납 항체 또는 수입된 CDR 또는 구조 서열의 어디에서도 찾을 수 없는 서열을 포함하기도 한다. 보통, 인간 항체는 변이성 도메인을 하나 이상 또는 거의 대부분 2개를 포함하며, 모든 또는 실질상 모든 CDR 범위는 비-인간 면역글로불린에 상응하고, 모든 또는 실질상 모든 구조 범위는 인간 면역글로불린 일치 서열이다. 인간화된 항체는 이상적으로 적어도 보통 인간 면역글로불린의 면역글로불린 불변 범위(Fc)의 한 부분 또한 포함할 것이다.
이 분야에서 비인간 항체를 인간화하는 방법은 잘 알려져 있다. 보통, 인간화된 항체는 하나 이상의 아미노산 잔기가 비인간 근원에서 이에 도입된다. 이 비인간 아미노산 잔류들은 종종 "수입" 잔기라고 일컬어지며, 이는 대개 "수입" 가변 도메인에서 출처한다. 인간화는 본질적으로 설치류의 CDR 또는 상응하는 인간 항체 서열의 CDR 서열을 인간의 것으로 교체하는 것으로 실행될 수 있다. 따라서, 그러한 "인간화" 항체는 키메라 항체(US 4,816,567)이며, 이때 상당히 온전하지 않은 인간 가변 도메인이 비인간 종의 해당 서열로 치환되었다. 실제적으로, 인간화된 항체는 보통 몇몇의 CDR 잔기 및 가능하게는 몇몇의 구조 잔기가 이 설치류의 유사한 영역의 잔기와 치환된 인간 항체이다.
면역되었을 때, 내생의 면역글로불린 생성이 없는 중에 전체 인간 항체를 생산할 수 있는 유전자이식 동물(예, 생쥐)이 사용될 수 있다. 예를 들어, 키메라 배선 돌연변이 생쥐의 항체의 중쇄 결합 영역 유전자 동형 삭제는 내생 항체 생산의 완전한 억제 결과를 가져온다. 이러한 배선 돌연변이 생쥐로의 인간 배선 면역글로불린 유전자 정렬 이입은 항원이 존재할 때 인간 항체 생산의 결과를 낳을 것이다. 인간 항체는 파지 디스플레이 라이브러리에서도 생산될 수 있다.
본 발명의 항체는 바람직하게는 약학적으로 허용가능한 담체에 의해서 대상에게 투여된다. 보통, 적당한 약학적으로 허용가능한 염이 제형을 등장 상태로 만들기 위해 제형에 사용된다. 약학적으로 허용가능한 담체의 예로는, 링거 용액(Ringer's solution) 및 포도당 용액이 있다. 이 용액의 pH는 바람직하게는 약 5 내지 약 8이이며, 더 바람직하게는 약 7 내지 약 7.5이다. 더 많은 담체는 항체를 포함하는 세포간질이, 예를 들어 막, 리포솜 또는 미세입자와 같은 형태로 되어 있는 고체 소수성 중합체 반투성의 세포간질과 같은 지속적인 방출 준비를 포함한다. 예를 들어, 투여 방법 및 투여되는 항체의 농도에 따라 어떤 담체가 더 바람직한지는 이 분야의 당업자에게는 명백할 것이다.
항체는 대상, 환자 또는 세포에 주사(예, 정맥내, 복강내, 피하, 근육내), 또는 주입과 같은 혈액으로의 전달이 효율적으로 이루어질 수 있는 다른 방법으로 투여될 수 있다. 항체는 국소뿐만이 아니라 전신의 치료 효과를 얻기 위해 종양내 또는 종양 주위 방법으로도 투여될 수도 있다. 국소 또는 정맥내 주사가 바람직하다.
항체 투여의 효율적인 용량과 일정은 경험적으로 결정될 수 있고, 이러한 결정을 내리는 것은 이 분야의 기술 중의 하나이다. 이 분야의 당업자는 투여되는 항체의 용량이, 예를 들어 항체를 받는 대상, 투여 방법, 사용되는 특정한 항체의 종류 및 투여되는 다른 약들에 따라 달라진다는 것을 이해할 것이다. 단독으로 사용될 시 전형적인 항체의 일일 용량은 1 μg/kg 내지 100 mg/kg로 변할 수 있고, 위에 언급된 요인을 고려할 때 이보다 더 높을 수도 있다. 바람직하게는 흑색종의 치료를 위한 항체의 투여 후, 이 분야의 기술자들에게 알려진 다양한 방법으로 이 항체의 치료적 효율성을 평가할 수 있다. 예를 들어, 치료를 받고 있는 대상에서 암의 크기, 숫자, 및/또는 분포 등이 종양 영상 기술을 이용하여 모니터링될 수 있다. 항체의 투여가 없을 경우 발생할 질병 경과와 비교하여, 종양의 성장의 정지하고, 종양 수축의 야기 및/또는 새로운 종양 발생의 예방을 야기하는 치료의 목적으로 투여된 항체는 효과있는 폐암의 치료라고 할 수 있다.
본 발명의 다른 양태는 특이적 펩티드-MHC 복합체를 인식하는 가용성 T 세포 수용체(sTCR)의 생산 방법을 제공하는 것이다. 이러한 가용성 T 세포 수용체는 특이적 T 세포 클론으로부터 생성가능하며, 그 친화도는 상보성 결정 부위를 표적으로 하는 돌연변이유발성에 의해 증가시킬 수 있다. T 세포 수용체 선택을 위하여, 파지 디스플레이를 사용할 수 있다(US 2010/0113300, 문헌[Liddy et al., 2012]). 파지 디스플레이 동안 T 세포 수용체의 안정화 및 약물로서의 실용적인 사용을 위하여, 알파 및 베타 쇄가 연결될 수 있고, 예를 들어 비자연적(non-native) 이황화 결합, 기타 공유 결합(단일 쇄 T 세포 수용체) 또는 이합체화 도메인에 의해 연결된다(Boulter et al., 2003; Card et al., 2004; Willcox et al., 1999). T 세포 수용체는 표적 세포에 대한 특정 기능의 실행을 목적으로 독소, 약물, 시토카인(예를 들어, US 2013/0115191 참고), 및 항-CD3 도메인 등과 같은 효과기 세포를 모집하는 도메인과 연결될 수 있다. 더욱이, 이것은 입양 전달에 사용되는 T 세포에서 발견될 수 있다. 추가 정보는 WO 2004/033685A1 및 WO 2004/074322A1에서 찾을 수 있다. sTCR의 조합은 WO 2012/056407A1에 설명되어 있다. 이 생산에 관한 추가 방법들은 WO 2013/057586A1에 공개되어 있다.
그 밖에, 본 발명의 펩티드 및/또는 TCR 또는 항체 또는 다른 결합하는 분자는 생검 샘플에 근거한 병리학자의 암 진단을 확인하는 데 사용이 가능하다.
항체 또는 TCR은 생체 내의 진단 분석에 사용될 수도 있다. 일반적으로, 항체는 방사성핵종으로 라벨링되고(예, 111In, 99Tc, 14C, 131I, 3H, 32P 또는 35S) 면역섬광계수법(immunoscintiography)을 사용하여 종양의 위치가 결정될 수 있다. 하나의 구현에서는, 항체 또는 그 단편은 상기 언급된 단백질로 구성된 군으로부터 선택한 2개 이상의 표적의 세포외 도메인에 결합을 하고 친화도 값(Kd)은 1x10 μM 미만이다.
진단의 용도로 사용되는 항체는 여러 가지 영상 방법으로 감지될 수 있는 적당한 프로브로 라벨링될 수 있다. 프로브의 감지 방법은 형광, 광학, 공초점 및 전자 현미경, 자기 공명 단층 촬영 영상 및 분광기 형광 투시법, 전산화 단층 촬영과 양전자 방사 단층 촬영기를 포함하지만 이에 국한되지 않는 방법을 들 수 있다. 적당한 프로브는 플루오레세인, 로다민, 에오신과 다른 형광체, 방사성 동위 원소, 금, 가돌리늄과 다른 란탄계열 원소, 상자성체의 이온, 플루오르-18 및 다른 양전자 방출 방사성 핵종 등을 포함하지만, 이에 국한되지 않는 것을 들 수 있다. 또한, 프로브는 2개 이상의 기능을 가지고 있을 수 있고, 본원에 나열된 하나 이상의 방법으로 감지될 수 있다. 이러한 항체는 직접적으로 또는 간접적으로 본원에 나열된 프로브로 라벨링될 수 있다. 이렇게 항체와 프로브를 연결하는 것으로는 이 분야에서 잘 알려진 것들 중에 프로브의 공유원자 연결, 프로브의 항체로의 편입, 및 프로브의 결합을 위한 킬레이트 화합물의 공유원자 연결 등을 들 수 있다. 면역조직 화학을 위해서, 질병 조직 샘플은 신선하거나 냉동되었거나 파라핀에 포매되어 포르말린과 같은 방부제로 고정되어 있을 수 있다. 고정되었거나 포매되어 있는 샘플을 포함하고 있는 조직 절편은 라벨링된 1차 항체 및 2차 항체와 접촉되며, 이때 제자리 단백질 발현 감지를 위한 항체가 사용된다.
본 발명의 다른 양태는 T 세포를 적절한 항원-제시 세포의 표면에 발현된 항원-로딩된 인간 MHC 분자와 상기 T 세포를 항원 특이적 방식으로 활성화하는데 충분한 시간 동안 시험관 내에서 접촉시키는 단계를 포함하되, 상기 항원이 본 발명에 따른 펩티드인, 활성화된 T 세포의 시험관내 생산 방법을 포한한다. 바람직하게는, 충분한 양의 항원이 항원-제시 세포와 함께 사용된다.
바람직하게는, 포유류 세포는 TAP 펩티드 트랜스포터가 결핍되어 있거나, 감소된 수준 또는 기능을 가지고 있다. TAP 펩티드 트랜스포터가 결핍되어 있는 적당한 세포로는 T2, RMA-S 및 초파리 세포를 들 수 있다. TAP는 항원 처리에 관련된 트랜스포터이다.
인간 펩티드 적재 결핍 세포주 T2는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(미국 메릴랜드주 록빌 파크론 드라이브 12301 소재, 카탈로그 번호 CRL 1992)에서 구입가능하고, 초파리 세포주 Schneider 2는 ATCC의 카탈로그 번호 CRL 19863로 구입가능하며, 생쥐 RMA-S 세포주는 륭그렌 등의 문헌(Ljunggren and Karre, 1985)에서 기술된 바 있다.
바람직하게는, 숙주 세포는 감염전에 대부분 MHC 클래스 I 분자를 발현하지 않는다. 또한, 프로모터 세포가 B7.1, B7.2, ICAM-1 및 LFA 3과 같은 T 세포에 대한 공동자극 신호를 제공하는데 중요한 분자를 발현하는 것이 바람직하다. 다수의 MHC 클래스 II 분자의 핵산 서열 및 동시자극 분자의 서열은 GenBank와 EMBL 데이터베이스에서 공개적으로 제공된다.
MHC 클래스 I 에피톱이 항원으로 사용되는 경우, T 세포는 CD8-양성 T 세포이다.
만약 항원-제시 세포가 전달감염되어 그리한 에피톱을 발현한다면, 바람직하게는 그 세포는 서열번호 1 내지 서열번호 237을 포함하는 펩티드 또는 이의 변이체 아미노산 서열을 발현할 수 있는 발현 벡터를 포함한다.
T 세포를 시험관 내에서 생성하는 몇몇의 다른 방법도 사용될 수 있다. 예를 들어, 자가 조직 종양-침윤 림프구는 CTL의 생성에 사용가능하다. 플레반스키 등의 문헌(Plebanski et al., 1995)은 자가 조직 말초의 혈액(PLB)을 T 세포의 제조 시 사용한다. 더욱이, 수지상 세포를 펩티드 또는 폴리펩티드로 펄스화시키거나, 재조합 바이러스에 의한 감염에 의해 자가조직 T 세포의 생산도 가능하다. 또한, 자가조직 T 세포의 생산에서 B 세포도 사용할 수 있다. 또한, 펩티드 또는 폴리펩티드로 펄스화된 또는 재조합된 바이러스에 의해 감염된 대식세포가 자가조직 T 세포의 제조 시 사용될 수 있다. 왈터 등의 문헌(Walter et al., 2003)은 인공 항원-제시 세포(aAPC)를 사용하는 시험관내 T 세포의 프라이밍을 기술하며, 이는 역시 선택되는 펩티드에 대한 펩티드에 대해 T 세포를 생성하는데 사용될 수 있다. 본 발명에서, aAPC는 미리 생성된 MHC:펩티드 복합체를 포리스티렌 입자(마이크로 비드)의 표면과 커플링시키고 바이오틴-스트렙트아비딘 생화학을 이용함으로써 생성되었다. 이 체계는 aAPC 상의 MHC 밀도를 정확히 제어할 수 있도록 허용하며, 이는 항원-특이적 T 세포 반응을 혈액 샘플로부터 높은 효율성으로 고- 또는 저-결합도로 선택적으로 유도해낼 수 있게 한다. MHC:펩티드 복합체를 제외하고, aAPC는 그들의 표면에 커플된 항-CD28 항원과 같은 동시-자극 활동을 가지고 다른 단백질을 운반해야 한다. 더욱이, 이러한 aAPC-기반 체계는 종종, 예를 들어, 인터루킨-12와 같은 사이토카인 등 적당한 용해 요소의 추가를 요구한다.
동종이계 세포는 T 세포의 제조에 역시 사용될 수 있고, 방법은 WO 97/26328에 더 자세하게 기술되어 있고, 여기에 참조문헌으로 포함되어 있다. 예를 들어, 초파리 세포와 T2 세포에 추가적으로, CHO 세포, 배큘로바이러스-감염 곤충 세포, 박테리아, 효소, 백시니아-감염된 표적 세포 등과 같은 다른 세포들도 항원을 제시하는데 사용될 수 있다. 또한, 식물성 마이러스를 사용할 수 있다(예를 들어, 포르타 등의 문헌(Porta et al., 1994) 참조). 이는 외부 펩티드의 제시를 위한 카우피 모자이크 바이러스의 높은 수확 체계로서의 개발을 기술한다.
이 실험의 펩티드에 대해 활성화된 T 세포는 치료에서 유용하다. 따라서, 본 발명의 더 나아간 양태는 상기 발명의 방법으로 획득할 수 있는 활성화된 T 세포에 대한 내용을 제공한다.
상기 방법으로 생성된 활성화된 T 세포는, 서열번호 1 내지 서열번호 237의 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드를 이상 발현하는 세포를 선택적으로 인식한다.
바람직하게는, T 세포는 그의 TCR을 HLA/펩티드-복합체(예컨대, 결합)와 상호작용함으로써 이런 세포를 인식한다. 이 T 세포는 효율적인 수의 활성화된 T 세포가 투여되었을 때, 본 발명의 아미노산 서열을 가지고 있는 폴리펩티드를 비정상적으로 발현하는 환자의 표적 세포를 괴사시키는데 유용하다. 환자에게 투여된 T 세포는 상기 기술된 바와 같이 환자에게 유도되고 활성화된다(즉, 이는 자가 조직 T 세포이다). 다른 방법으로는, T 세포는 환자에게 유도가 안 되고, 다른 개인에서 유도된다. 물론, 이 개인이 건강한 개인인 것이 바람직하다. 발명자들이 말하는 "건강한 개인"이라고 함은 개인이 전체적으로 좋은 건강을 가지고 있고, 바람직하게는 충분한 면역 체계를 가지고 있고, 더 바람직하게는, 손쉽게 실험되고 감지될 수 있는 어떤 질병도 겪고 있지 않다는 것이다.
생체 내에서, 본 발명에 따른 CD8-양성 T 세포는 종양 세포(이들은 가끔 MHC 클래스 II를 발현하기도 한다)이거나 종양을 감싸고 있는 간질성 세포(종양 세포)(이는 가끔 MHC 클래스 II를 또한 발현하기도 한다(Dengjel et al., 2006)).
본 발명의 T 세포는 활성적인 치료 구성의 성분으로 사용될 수도 있다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 아미노산 서열을 가지고 있는 폴리펩티드를 비정상적으로 발현하는 환자의 표적 세포를 죽이고 환자에게 위에 정의된 바와 같이 효율적인 수의 T 세포를 투여하는 방법을 제공한다.
본 발명자는 "비정상적으로 발현되는"이라는 구절에 의해, 폴리펩티드가 정상 수준에 비교했을 때 과발현되거나 유전자가 종양이 유도된 조직에서는 침묵하지만(silent) 종양에서는 발현되는 것 또한 의미한다. 본 발명자들은 "과발현"이라는 구절에 의해, 폴리펩티드가 정상 조직에서 존재하는 수준의 1.2배 이상으로 존재하는 것을 말하고, 바람직하게는 2배 이상, 더 바람직하게는 5배 또는 10배 이상으로 존재하는 것을 의미한다.
T 세포는, 예를 들어 상기 기술된 바와 같은 방법으로 얻어질 수 있다.
흔히 T 세포의 입양 전송이라고 불리우는 것에 대한 프로토콜은 이 업계에서 잘 알려져 있다. 그 리뷰는 다음에서 찾을 수 있다: 카티오니 등 및 모르간 등의 문헌(Gattinoni et al., 2006; Morgan et al., 2006).
본 발명의 다른 양태는 핵산이 클로닝되고 숙주 세포, 바람직하게는 T 세포에 개입되는 T 세포 수용체를 생성하는데 있어서, MHC와 복합된 펩티드의 용도이다. 이어서, 이러한 유전자조작된 T 세포는 암의 요법을 위해 환자로 전달될 수 있다.
본 발명의 모든 분자(즉, 펩티드, 핵산, 항체, 발현 벡터, 세포, 활성화된 T 세포, T 세포, T 세포 수용체 또는 이를 인코딩하는 핵산)가 병을 고치는데 있어서 면역 반응을 피할 수 있는 성질을 가진 세포에 포함되어 있는 것이 중요하다. 따라서, 본 발명에 포함되어 있는 어떤 분자든지 약제로 사용되거나 약제를 만드는데 사용될 수 있다. 이 분자는 단독으로 사용될 수도 있고, 어떤 알려진 분자와 함께 결합하여 사용될 수도 있다.
본 발명은 다음을 포함한 키트(kit)를 포함한다:
(a) 상기 기술된 약학 조성물을 용액 또는 동결건조된 형태로 포함하는 용기;
(b) 임의적으로, 희석제 또는 동결건조된 배합을 위한 재구성 용액을 포함하는 제2 용기; 및
(c) 임의적으로, (i) 용액의 사용, 또는(ii) 동결건조된 배합의 재구성 및/또는 사용을 위한 설명서.
상기 키트는 (iii) 완충액, (iv) 희석제, (v) 필터, (vi) 주사바늘, 또는 (vii) 주사기 중 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다. 용기는, 바람직하게는 병, 바이알, 주사기 또는 시험관이며, 또한 반복사용 용기일 수 있다. 약학 조성물은 바람직하게는 동결건조된다.
본 발명에 사용되는 키트는 바람직하게는 동결건조되어 있는 약제를 적당한 용기와 이들의 재구성 및/또는 사용을 위한 설명서를 함께 포함한다. 적당한 용기는, 예를 들어, 병, 바이알(예컨대, 듀얼 챔버 바이알), 주사기(듀얼 챔버 주사기 등) 및 시험관을 포함한다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 물질로 형성될 수 있다. 바람직하게는, 키트 및/또는 용기에는 재구성 및/또는 사용을 위한 지시사항을 나타내는 설명서가 포함된다. 예를 들어, 라벨 상에서 동결건조된 배합을 상기 펩티드 농도로 재구성해야 한다고 지시할 수 있다. 라벨은 또한 약제가 피하투여가 가능한지 아니면 유용한지를 보여줄 수도 있다.
배합을 포함한 용기는 재구성되는 약제의 반복된 투여를 가능하게 하는 다용도 바이알일 수 있다(예컨대, 약 2 내지 6회의 투여). 키트는 또한 적당한 희석제(예컨대, 중탄산 용액)를 포함하는 제2 용기를 포함할 수도 있다.
희석제와 동결건조된 약제를 섞을 때는, 재구성되는 약제의 최종 펩티드 농도가 바람직하게는 0.15 mg/mL/펩티드(=75μg) 이상이고, 바람직하게는 3 mg/mL/펩티드(=1500μg) 이하이어야 한다. 키트는 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘, 주사기, 및 패키지 삽입 및 사용 설명서 등의 사용자의 입장에서 필요한 것을 더 추가로 포함할 수도 있다.
본 발명의 키트는 본 발명에 따른 약학 조성물을 포함하는 하나의 용기를 다른 제품과 함께 또는 단독으로 포함하거나(예컨대, 다른 화합물들 또는 이 다른 화합물들의 약학 조성물), 각각의 조성물을 각자 다른 용기에 포함할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 키트는 다음과 같은 두 번째의 화합물 또는 그들의 조성물과 함께 투여될 수 있는 약학 조성물을 포함한다. 보조제(예컨대, GM-CSF), 화학요법제, 자연 생산품, 호르몬 또는 길항제, 항-혈관신생 제제 또는 억제제, 괴사유도제 또는 킬레이터. 키트의 조성물은 미리 혼합되어 있을 수도 있거나, 각각의 조성물이 각각 따로 용기에 담겨 있을 수도 있다. 키트의 조성물은 하나 이상의 액체 용액에 제공될 수도 있고, 바람직하게는 수용액, 더욱 바람직하게는 무균 수용액에 제공된다. 키트의 조성물은 적당한 용해제를 첨가함으로써, 액체로 바뀔 수 있는 고체로 제공될 수도 있고, 바람직하게는 이는 다른 용기에 담겨 제공된다.
치료 키트의 용기는 바이알, 실험관, 플라스크, 병, 주사기 또는 고체나 액체를 담을 수 있는 임의의 다른 용기일 수 있다. 보통, 하나 이상의 구성물이 있을 경우, 키트는 두 번째의 물약병 또는 다른 용기를 포함하고, 이는 각각의 복용을 가능하게 한다. 키트는 약학적으로 허용가능한 액체를 포함하는 용기를 포함할 수도 있다. 바람직하게는, 치료 키트는 현재 키트의 조성물인 발명의 제제를 투여할 수 있는 기구를 포함한다(예컨대, 하나 이상의 바늘, 주사기, 안약 투입제, 피펫 등).
본 배합은 구강(경구), 비강, 안약 형태의, 피하의, 피내, 근육내, 혈관내 또는 경피 등 어떠한 투여 형태로든 펩티드 투여에 적당한 약제이다. 바람직하게는, 투여는 피하(s.c.)이며, 가장 바람직하게는 주입 펌프에 의한 피내(i.d.)일 수 있다.
본 발명의 펩티드가 흑색종으로부터 단리되었기 때문에, 본 발명의 약제는 바람직하게는 흑색종의 치료에 사용된다.
본 발명은 또한 사전선별된 TUMAP의 창고로부터 선택되는 하나 이상의 펩티드가 포함된 약학 조성물의 제조를 포함하는 개별 환자의 개인화된 약학 조성물의 생산 방법을 포함하며, 여기서 약학 조성물에 사용되는 하나 이상의 펩티드는 개별 환자의 적합성을 위해 선택된다. 한 구현에서, 약학 성분은 백신이다. 이 방법은 TCR 단리 또는 가용성 항체 및 다른 치료 옵션과 같은 하류 용도를 위해 T 세포 클론의 생산에도 적응시킬 수 있다.
"개인화된 약학"이란, 활성적으로 개인화된 암 백신 및 자가 환자 조직을 사용하는 적응적 세포 세포 요법을 포함하는 한 명의 개별 환자의 치료를 위해서만 사용되는 그러한 개별 환자를 위해 구체적으로 맞춤화된 요법을 의미해야 한다.
본원에 사용되는 용어 "창고"란 특정한 종양 유형에서 면역원성 및/또는 과다-제시에 대해 사전선별된 펩티드의 군을 지칭해야 한다. "창고"란 용어는 백신에 포함된 특정한 펩티드가 물리적 시설에서 사전제조되어 보관되는 백신에 포함된다는 것을 내포함을 의도하지 않지만 그 가능성은 심사숙고된다. 이 펩티드는 생산된 개인화 백신마다 새로 제조될 수 있거나 사전제조되어 보관될 수 있음이 명시적으로 심사숙고된다. 창고(예컨대, 데이터베이스의 형태)는 다양한 HLA-A, HLA-B 및 HLA-C 대립유전자를 가진 흑색종 환자의 분석된 종양 조직에서 고도로 과발현된 종양-연관 펩티드들로 구성된다. 창고는 MHC 클래스 I 및 MHC 클래스 II 펩티드 또는 연장된 MHC 클래스 I 펩티드를 조합할 수 있다. 창고는 몇몇 흑색종 조직들로부터 수집된 종양-연관 펩티드 외에도, HLA-A*02 및 HLA-A*24 표지자 펩티드를 포함할 수 있다. 이 펩티드들은 TUMAPS에 의해 유도된 T 세포 면역성의 크기 비교를 허용하며 그에 따라 항종양 반응을 유발하는 백신의 용량에 대해 중요한 결정을 내리도록 허용한다. 둘째로, 이들은 환자에서 "자가" 항원으로부터 유래된 TUMAP에 대한 일체의 백신 유도된 T 세포 반응이 관찰되지 않는 경우 "비자가" 항원으로부터 유래된 중요한 양성 대조군 펩티드로 기능한다. 그리고, 세째로, 환자의 면역적격의 상태에 대한 결론을 내리도록 허용할 수 있다.
창고용 TUMAP는 유전자 발현 분석, 질량 분석 및 T 세포 면역학(XPresident (등록상표))이 조합된 통합 기능적 게놈 접근방식을 사용하여 동정된다. 이 접근 방식은 정상 조직에서는 발현되지 않거나 최소한으로만 발현되지만 고비율의 종양에서는 진정하게 존재하는 TUMAP만을 추가 분석을 위해 선택하도록 보증한다. 펩티드 선택을 위하여, 환자로부터의 흑색종 샘플 및 건강한 공여자의 혈액을 단계적 접근 방식으로 분석했다:
1. 악성 종양 물질로부터의 HLA 리간드는 질량 분석에 의해 파악되었다.
2. 마이크로어레이에 의한 게놈-전체의 전령 리보헥산(mRNA) 발현 분석을 사용하여, 정상 기관과 조직들의 범위와 비교하여 악성 조직(흑색종)에서 과발현된 유전자들을 동정했다.
3. 확인된 HLA 리간드를 유전자 발현 데이터와 비교했다. 종양 조직 상에서 과다-제시되거나 임의적으로 제시된 펩티드들, 바람직하게는 2단계에서 검출된 선택적으로 발현되거나 과발현된 유전자에 의해 인코딩된 펩티드들은 다중-펩티드 백신용으로 적절한 TUMAP 후보로 간주했다.
4. TUMAP로서 동정된 펩티드의 관련성을 지지하는 추가의 증거를 파악하기 위해 문헌 연구를 수행했다.
5. mRNA 수준에서의 과발현의 타당성은 3단계에서 종양 조직으로부터 선택되는 TUMAP의 재검출 및 건강한 조직에 대한 검출의 부재(또는 낮은 빈도)에 의해 확인되었다.
6. 선택되는 펩티드에 의한 생체내 T 세포 반응의 유도가 가능한지 여부를 평가하기 위해, 건강한 공여자는 물론 흑색종 환자의 인간 T 세포를 사용하여 시험관내 면역원성 검사를 수행했다.
한 양태에서, 펩티드를 창고에 포함시키기 전에 면역원성에 대해 사전 스크리닝이 수행된다. 제한이 아니라 한 예로서, 펩티드/MHC 복합체와 항-CD28 항체가 적재된 인공 항원-제시 세포를 가진 건강한 공여자의 CD8+ T 세포를 반복적으로 자극하는 시험관내 T 세포 초기 감작을 포함하는 방법을 사용하여 창고에 포함된 펩티드의 면역원성을 결정한다.
이 방법은 희귀한 암과 드문 발현 프로필을 가진 환자에서 바람직하다. 현재 개발되고 있는 고정 성분을 가진 다중펩티드 칵테일과는 대조적으로, 창고는 종양의 항원이 실제 발현과 백신과 유의하게 더 높은 일치를 허용한다. 다중표적 접근 방식에서는 단일 펩티드 또는 "재고" 펩티드들의 조합을 각 환자에 대해 사용한다. 이론상으로, 예를 들어 50개 라이브러리로부터 선택되는 5개의 다른 항원 펩티드에 근거한 접근방법은 이미 약 17백만 가지의 가능한 약품(DP) 성분을 초래할 것이다.
한 양태에서, 본원에 기술되거나 다음과 같은 본 발명에 따른 방법에 근거하여, 이 펩티드들은 개별 환자를 위한 적합성에 근거하여 백신에 포함되도록 선택된다.
HLA 표현형, 전사체학 및 펩티도믹스 데이터는 환자의 종양 물질과 혈액 샘플로부터 수집하여 창고(데이터베이스)와 환자 고유의(즉, 돌연변이된) TUMAP를 포함하는 각 환자에 대해 가장 적절한 펩티드를 동정한다. 환자 종양에서 선택적으로 발현되거나 과발현되는 펩티드를 선택하게 되고, 이는 가능한 경우 환자의 개별 PBMC로써 시험했을 때 강한 시험관내 면역원성을 나타냈다.
바람직하게는, 백신에 포함되는 펩티드는 다음으로 구성되는 방법에 의해 확인된다: (a) 개별 환자의 종양 샘플에 의해 제시된 종양-연관 펩티드들(TUMAP)의 동정; (b) (a)에서 동정된 펩티드를 위에 설명된 펩티드들의 창고(데이터베이스)와 비교; 및 (c) 그 환자에서 동정된 종양-연관 펩티드와 상관관계가 있는 창고(데이터베이스)로부터 하나 이상의 펩티드 선택을 포함하는 방법에 의해 확인된다. 예를 들어, 종양 샘플에 의해 제시되는 TUMAP는 다음에 의해 확인된다: (a1) 종양 샘플에서 과발현되거나 이상 발현된 단백질의 파악을 위해 종양 샘플의 발현 데이터를 모양 샘플의 조직 유형에 상응하는 정상 조직의 샘플에서 얻은 발현 데이터와 비교; 및 (a2) 종양에 의해 과발현되거나 이상 발현된 단백질로부터 유래한 MHC 리간드를 파악하기 위해, 발현 데이터를 MHC 클래스 I 및/또는 클래스 II 분자에 결합된 MHC 리간드의 서열과 상관관계 결정. 바람직하게는, MHC 리간드의 서열은 종양 샘플로부터 분리된 MHC 분자로부터 결합된 펩티드를 용출시키고 용출된 리간드의 서열결정에 의해 확인된다. 바람직하게는, 종양 샘플과 정상 조직을 같은 환자로부터 얻는다.
창고(데이터베이스) 모델을 사용한 펩티드의 선택 외에도 또는 이에 대한 대안으로, TUMAP가 환자에서 새로 확인된 다음 백신에 포함될 수 있다. 한 예로서, 후보 TUMAP 환자에서, (a1) 종양 샘플에서 과발현되거나 이상 발현된 단백질의 파악을 위해 종양 샘플의 발현 데이터를 모양 샘플의 조직 유형에 상응하는 정상 조직의 샘플에서 얻은 발현 데이터와 비교; 및 (a2) 종양에 의해 과발현되거나 이상 발현된 단백질로부터 유래한 MHC 리간드를 파악하기 위해, 발현 데이터를 MHC 클래스 I 및/또는 클래스 II 분자에 결합된 MHC 리간드의 서열과 상관관계의 결정에 의해 동정할 수 있다. 다른 예로서, 개별 환자로부터의 정상의 상응하는 조직과 비교해서 종양 샘플에 대해 고유한 돌연변이를 포함하는 단백질을 확인할 수 있고, 그 돌연변이를 특이적으로 표적화하는 TUMAP를 파악가능하다. 예를 들어, 종양 및 상응하는 정상 조직의 게놈은 전체 게놈의 서열결정에 의해 서열을 결정할 수 있다: 유전자의 단백질 코딩 영역에서 비동의 돌연변이 발견을 위해, 종양 조직으로부터 게놈의 DNA 및 RNA를 추출하고, 정상적인 비돌연변이 게놈 생식계열 DNA는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)로부터 추출한다. 응용 NGS 접근방식은 단백질 코딩 영역의 재배열결정으로 제약된다(엑손 재배열결정). 이 목적을 위해, 인간 샘플로부터 엑손 DNA를 업체가 공급한 표적 강화 키트를 사용한 다음, 예를 들어 HiSeq2000(Illumina)으로 서열을 결정하여 포획한다. 추가적으로, 유전자 발현의 직접적 정량화 및 돌연변이된 유전자가 환자의 종양에서 발현된다는 검증을 위해 종양 mRNA의 서열을 결정한다. 그에 따른 수백만의 서열 리드는 소프트웨어 알고리즘을 통해 처리된다. 출력 목록에는 돌연변이와 유전자 발현이 포함된다. 종양 특이적 체세포 돌연변이는 PBMC 유래된 생식계열 변이와 비교하여 결정한 다음 우선순위화한다. 다음에는 새로 동정된 펩티드를 상기 창고의 면역원성에 대해 시험할 수 있고, 적절한 면역원성을 소유하는 후보 TUMAP를 선택하여 백신에 포함시킨다.
한 예시적 구현에서, 백신에 포함된 펩티드는 다음에 의해 확인된다: (a) 개별 환자의 종양 샘플에 의해 제시된 종양-연관 펩티드들(TUMAP)을 위에 설명한 방법으로 동정하는 단계; (b) 상응하는 정상 조직과 비교하여 종양에서 면역원성과 과다-제시에 대해 사전선별된 펩티드들의 창고를 이용하여 (a)에서 동정된 펩티드와 비교하는 단계; (c) 환자에서 동정된 종양-연관 펩티드와 상관관계가 있는 하나 이상의 펩티드를 창고(데이터베이스)에서 선택하는 단계; 및 (d) 임의적으로, (a)에서 새로 동정된 하나 이상의 펩티드를 선택하고 그 면역원성을 확인하는 단계.
한 예시적 구현에서, 백신에 포함된 펩티드는 다음에 의해 확인된다: (a) 개인 환자의 종양 샘플에 의해 제시된 종양-연관 펩티드(TUMAP)를 동정하는 단계; 및 (b) (a)에서 새로 동정된 하나 이상의 펩티드를 선택하고 그 면역원성을 확인하는 단계.
개인화 펩티드 기반 백신에 대한 펩티드를 선택하면, 백신이 생산된다. 백신은 바람직하게는 20 내지 40% DMSO, 바람직하게는 약 30 내지 35% DMSO(약 33% DMSO 등)에 용해된 개별 펩티드들로 구성되는 액체 제형이다.
제품에 포함되어야 할 펩티드를 각각 DMSO에 용해한다. 단일 펩티드 용액의 농도는 제품에 포함시킬 펩티드의 수에 의존하여 선택해야 한다. 단일 펩티드-DMSO 용액은 동등하게 혼합하여 제품에 포함되는 모든 펩티드를 포함하는 용액이 펩티드 당 약 2.5 mg/ml의 농도를 갖도록 한다. 다음 혼합된 용액을 주사용 수와 1:3의 비율로 희석하여 33% DMSO에서 펩티드 당 0.826 mg/ml의 농도를 달성한다. 희석된 용액을 0.22 μm 무균 필터를 통해 여과시킨다. 최종 벌크 용액을 얻는다.
최종 벌크 용액을 바이알에 채운 다음 사용 때까지 -20℃에서 보관한다. 바이알 하나에는 700 μL의 용액을 함유하고 각 펩티드를 0.578 mg씩 함유한다. 이 가운데 500 μL(펩티드 당 약 400 μg)는 피내 주사에 응용한다.
암 치료에 유용함에 덧붙여, 본 발명의 펩티드는 진단제로도 유용하다. 펩티드가 흑색종 세포에서 생성되고 이런 펩티드가 정상 조직에서는 나타나지 않는다는 것이 결정되었기 때문에 이런 펩티드는 암의 존재의 진단에 사용될 수 있다.
혈액 세포에서 주장되는 펩티드의 조직 생체 검사에서의 존재는 암의 진단 시 병리학자를 도울 수 있다. 항체, 질량 분석, 또는 이 분야에 알려진 다른 방법을 통한 특정 펩티드의 탐지는 그 조직 샘플이 악성 또는 염증이 있는지 또는 일반적으로 병들어 있는지 또는 흑색종의 바이오마커로서 사용가능한지 병리학자에게 알려줄 수 있다. 펩티드의 군의 존재는 병든 조직의 분류 또는 하위 분류를 가능하게 한다.
병든 조직 표본의 펩티드의 탐지는 특히 만약 T 림프구가 작용 기전에 참여하는 것으로 알려져 있거나 기대할 때, 면역계를 포함한 치료의 이익에 대한 결정을 내릴 수 있게 한다. MHC 발현의 손실은 감염된 악성 세포가 면역 감시를 탈출하는데서 잘 설명되는 기전이다. 펩티드의 존재는 이 기전이 분석된 세포에서 악용되지 않는 것을 도시한다.
본 발명의 펩티드는 펩티드 또는 MHC 분자에 합성된 펩티드에 대한 T 세포 반응 또는 항체 반응 같은 펩티드에 대한 림프구 반응을 분석하는데 사용될 수 있다. 이런 림프구 반응은 추가 치료 단계에서 결정을 내릴 때 전조 표지자로 사용될 수 있다. 이런 반응은 또한 림프구 반응을 여러 방법으로, 예를 들어, 단백질 백신, 핵산, 자가 조직 물질, 림프구의 양자 전송을 유도하는 것을 목표로 하는 면역치료 접근방식의 대리 반응 표지자로 사용될 수 있다. 유전자 치료 설정에서, 펩티드에 대한 림프구 반응은 부작용의 평가에서 고려할 수 있다. 림프구 반응의 모니터링은 이식 요법의 후속 시험을 위한 중요한 도구가 될 수도 있다, 예를 들어, 융합의 감지 대 숙주 및 숙주 대 융합 질병.
본 발명을 이의 바람직한 구현을 기술하는 하기 실시예에 첨부된 도면을 참조하여 기술되지만, 이로 제한되지 않는다. 본 발명의 목적을 위하여, 본원에 인용된 모든 참조문헌은 그 전문이 참조로 혼입된다.
도 1a 내지 도 1d는 정상 조직(흰색 막대) 및 흑색종(검은색 막대)에서 다양한 펩티드의 과다-제시를 도시한다. 도 1a) 유전자 부호: S100A1, 펩티드: FLDVKELML(서열번호 1) - 왼쪽부터 오른쪽으로 조직들: 4개 지방 조직, 5개 부신, 24개 혈액 세포, 15개 혈관, 10개 골수, 14개 뇌, 7개 유방, 7개 식도, 2개 눈, 3개 담낭, 16개 심장, 17개 신장, 20개 대장, 23개 간, 49개 폐, 7개 림프절, 12개 신경, 2개 난소, 8개 췌장, 6개 부갑상선, 1개 복막, 5개 뇌하수체, 7개 태반, 1개 흉막, 3개 전립선, 7개 타액선, 5개 골격근, 3개 소장, 12개 비장, 5개 위, 5개 고환, 2개 흉선, 2개 갑상선, 11개 기관, 7개 요관, 8개 방광, 6개 자궁, 12개 피부, 18개 흑색종. 도 1b) 유전자 부호: EXTL1, 펩티드: VLFKDPVSV(서열번호 3), 왼쪽부터 오른쪽으로 조직들: 4개 지방 조직, 5개 부신, 24개 혈액 세포, 15개 혈관, 10개 골수, 14개 뇌, 7개 유방, 7개 식도, 2개 눈, 3개 담낭, 16개 심장, 17개 신장, 20개 대장, 23개 간, 49개 폐, 7개 림프절, 12개 신경, 2개 난소, 8개 췌장, 6개 부갑상선, 1개 복막, 5개 뇌하수체, 7개 태반, 1개 흉막, 3개 전립선, 7개 타액선, 5개 골격근, 3개 소장, 12개 비장, 5개 위, 5개 고환, 2개 흉선, 2개 갑상선, 11개 기관, 7개 요관, 8개 방광, 6개 자궁, 12개 피부, 18개 흑색종. 도 1c) 유전자 부호: HMCN1, 펩티드: IQSETTVTV(서열번호 13) - 왼쪽부터 오른쪽으로 조직들: 4개 지방 조직, 5개 부신, 24개 혈액 세포, 15개 혈관, 10개 골수, 14개 뇌, 7개 유방, 7개 식도, 2개 눈, 3개 담낭, 16개 심장, 17개 신장, 20개 대장, 23개 간, 49개 폐, 7개 림프절, 12개 신경, 2개 난소, 8개 췌장, 6개 부갑상선, 1개 복막, 5개 뇌하수체, 7개 태반, 1개 흉막, 3개 전립선, 7개 타액선, 5개 골격근, 3개 소장, 12개 비장, 5개 위, 5개 고환, 2개 흉선, 2개 갑상선, 11개 기관, 7개 요관, 8개 방광, 6개 자궁, 12개 피부, 18개 흑색종. 도 1d) 유전자 부호: TMEM17, 펩티드: NLQEKVPEL(서열번호 7), 왼쪽부터 오른쪽으로 샘플들: 14개 암 조직(1개 뇌암, 1개 유방암, 1개 두경부암, 3개 폐암, 1개 골수 세포 암, 1개 난소암, 1개 췌장암, 4개 흑색종, 1개 자궁암). 도 1e 내지 1j는 상이한 암 조직(검은 점)에서 다양한 펩티드의 과다-제시를 도시한다. 상부: 기술적인 반복 측정치의 MS 신호 강도 중간값이 단일 HLA-A*02 양성 정상(회색 점) 및 펩티드가 검출된 종양 샘플(검은 점)에 대해 점으로 표시되어 있다. 종양과 정상 샘플은 출처 기관에 따라 분류되고, 상자 수염 도표는 복수 샘플의 정규화 신호 강도에 대한 중간값, 25번째 백분위수 및 75번째 백분위수(상자) 및 최저치 및 최대치(수염)를 나타낸다. 정상 기관은 위험 범주에 따라 순서가 매겨진다(혈액 세포, 혈관, 뇌, 간, 폐: 고위험, 회색 점; 생식 기관, 유방, 전립선: 저위험, 회색 점; 다른 모든 기관들: 중간 위험; 회색 점). 하부: 각 기관에서 상대적 펩티드 검출 빈도가 막대 도표로서 표시되어 있다. 패널 아래의 숫자는 각 기관에 대해 분석한 샘플의 합계 가운데 펩티드가 검출된 샘플의 수를 나타낸다(정상 샘플 N = 526, 종양 샘플 N = 562). 한 샘플에서 펩티드가 검출되었지만 기술적인 이유로 정량화할 수 없었다면, 그 샘플은 검출 빈도의 제시에 포함되지만 도면의 상부에는 점으로 표시되지 않는다. 조직(왼쪽부터 오른쪽으로)들: 정상 샘플: 혈액 세포; 혈관; 뇌; 심장; 간; 폐; 지방 조직; 부신; 담관; 방광; 골수; 연골; 식도; 눈; 담낭; 두경부; 신장; 대장; 림프절; 신경; 췌장; 부갑상선; 복막; 뇌하수체; 흉막; 골격근; 피부; 소장; 비장; 위; 갑상선; 기관; 요관; 유방; 난소; 태반; 전립선; 고환; 흉선; 자궁. 종양 샘플: AML: 급성 골수성 백혈병; BRCA: 유방암; CCC: 담관세포 암종; CLL: 만성 림프구성 백혈병; CRC: 대장암; GBC: 담낭암; GBM: 교모세포종; GC: 위암; GEJC: 위 분문 식도 암; HCC: 간세포 암종; HNSCC: 두경부암; MEL: 흑색종; NHL: 비호지킨 림프종; NSCLC: 비소세포 폐암; OC: 난소암; OSCAR: 식도암; PACA: 췌장암; PRCA: 전립선암; RCC: 신세포 암종; SCLC: 소세포 폐암; UBC: 방광 암종; UEC: 자궁 및 자궁내막암. 도 1e) 유전자 부호(들): HLA-B, HLA-C, 펩티드: VLAVLGAVVAV(서열번호 19), 도 1f) 유전자 부호: PARVA, 펩티드: SLVAILHLL(서열번호 24), 도 1g) 유전자 부호: METAP2, 펩티드: TMIEICEKL(서열번호 118), 도 1h) 유전자 부호: UTP20, 펩티드: QLMEGKVVL(서열번호 120), 도 1i) 유전자 부호: SNRPN, 펩티드: FLGEPASYLYL(서열번호 151), 도 1j) 유전자 부호: IPO9, 펩티드: SILDGLIHL(서열번호 209).
도 2a 내지 도 2c는 정상 조직(흰색 막대) 및 11개 흑색종 샘플(검은색 막대)의 패널에서 흑색종에서 고도로 과발현되거나 배타적으로 발현된 본 발명의 근원 유전자들의 예시적 발현 프로파일을 도시한다. 왼쪽부터 오른쪽으로 조직들: 6개 동맥, 2개 혈액 세포, 2개 뇌, 1개 심장, 2개 간, 3개 폐, 2개 정맥, 1개 지방 조직, 1개 부신, 5개 골수, 1개 연골, 1개 결장, 1개 식도, 2개 눈, 2개 담낭, 2개 두경부 및 타액선, 1개 신장, 6개 림프절, 4개 췌장, 2개 말초 신경, 2개 뇌하수체, 1개 직장, 2개 골격근, 1개 피부, 1개 소장, 1개 비장, 1개 위, 1개 갑상선, 7개 기관, 1개 방광, 1개 유방, 5개 난소, 5개 태반, 1개 전립선, 1개 고환, 1개 흉선, 1개 자궁, 10개 흑색종. 도 2a) 유전자 부호: SLC24A5, 도 2b) 유전자 부호: SLC45A2, 도 2c) 유전자 부호: FMN1.
도 3은 펩티드-특이적 다합체 염색 이후 예시적 면역원성 데이터: 유세포 측정 결과를 도시한다.
도 4는 건강한 HLA-A*02+ 공여자에서 펩티드 특이적 시험관내 CD8+ T 세포 반응의 예시적 결과를 도시한다. 서열번호 8 펩티드(4a, 왼쪽 패널), 서열번호 12 펩티드(4b, 왼쪽 패널), 및 서열번호 155 펩티드(4c, 왼쪽 패널)와의 각 복합체에서 항-CD28 mAb 및 HLA-A*02로써 코팅된 인공 APC를 사용하여 CD8+ T 세포를 초회감작시켰다. 3주기의 자극 후, A*02/서열번호 8(4a), A*02/서열번호 12(4b), 또는 A*02/서열번호 155(4c)로써 염색되는 2D 다합체를 사용하여 펩티드-반응성 세포의 검출을 수행했다. 오른쪽 패널들(4a, 4b 및 4c)은 관련이 없는 A*02/펩티드 복합체로써 자극한 세포의 대조군 염색을 도시한다. 생존가능한 단일 유리(singlet) 세포를 CD8+ 림프구에 대해 가두었다. 불리언 게이트는 다른 펩티드에 대해 특이적인 다합체로 검출된 허위 양성 사건의 배제에 도움이 되었다. CD8+ 림프구 가운데 특이적 다합체+ 세포의 빈도가 표시되어 있다.
실시예
실시예 1
세포 표면에 제시된 종양-연관 펩티드의 동정 및 정량화
조직 샘플
환자의 종양 조직은 다음으로부터 얻었다: Asterand(미국 미시간주 디트로이트 소재, 및 영국 헤르츠 로이스톤 소재); ProteoGenex Inc.(미국 캘리포니아주 컬버 시티 소재); Tissue Solutions Ltd(영국 글라스고우 소재); University Hospital Heidelberg(독일 하이델베르크 소재); 및 University Hospital Tuebingen(독일 튀빙겐 소재).
정상 조직은 다음으로부터 얻었다: Asterand(미국 미시간주 디트로이트 소재, 및 영국 헤르츠 로이스톤 소재); Bio-Options Inc.(미국 캘리포니아주 브레아 소재); BioServe(미국 메릴랜드주 벨츠빌 소재); Capital BioScience Inc.(미국 메릴랜드주 록빌 소재); Geneticist Inc.(미국 캘리포니아주 글렌데일 소재); Kyoto Prefectural University of Medicine(KPUM)(일본 쿄토 소재); ProteoGenex Inc.(미국 캘리포니아주 컬버 시티 소재); Tissue Solutions Ltd.(영국 글라스고우 소재); University Hospital Geneva(스위스 제네바 소재); University Hospital Heidelberg(독일 하이델베르크 소재); University Hospital Munich(독일 뮌헨 소재); 및 University Hospital Tuebingen(독일 튀빙겐 소재).
수술 또는 부검 전에 모든 환자의 동의서가 제출되었다. 조직은 절제 후 즉시 충격동결한 다음 TUMAP의 분리까지 -70℃ 이하에서 보관했다.
조직 샘플에서 HLA 펩티드의 분리
약간 변형된 프로토콜(Falk et al., 1991; Seeger et al., 1999)에 따르면, 충격 냉동된 조직 샘플의 HLA 펩티드 풀은 단단한 조직의 면역 촉진에 의해 HLA-A*02-특이 항체 BB7.2 또는 HLA-A, -B, -C-특이 항체 W6/32, CNBr-활성화된 세파로오스, 산성치료와 한외 여과를 이용해 취득되었다.
질량분광 분석
얻어진 HLA 펩티드 풀은 그들의 소수성에 의해 역상 크로마토그래피를 이용하여 분리되었고(nanoAcquity UPLC system, Waters) 녹여서 분리하는 펩티드는 ESI 소스를 갖춘 LTQ-velos 및 융합 하이브리드 질량 분석기(ThermoElectron)에 의해 분석되었다. 펩티드 풀은 분당 400nL의 유량을 적용하여 1.7 μm C18 역상 물질(Waters)로 충전된 합성-실리카 마이크로-모세관 칼럼(75 μm i.d. x 250 mm)에 바로 로딩된다. 이어서, 펩티드는 두-단계 180분-10% 내지 33%의 이진 구배를 이용하여 분리되고, 여기서 유량은 분당 300nL이다. 구배는 용매 A(물의 0.1% 포름산)와 용매 B(아세토니트릴의 0.1% 포름산)로 이루어져 있다. 금이 입혀진 유리 모세관(PicoTip, New Objective)이 미세-ESI 소스로의 도입에 사용되었다. LTQ-Orbitrap 질량 분석기가 TOP5 전략을 이용한 데이터-의존 모드에서 작동되었다. 간략하게, 스캔 사이클은 오비트랩(orbitrap)의 높은 질량 정확도(R = 30,000)의 전스캔으로 시작되고, 이후 5개의 가장 많은 이전에 선택한 이온의 동적 배제에 의한 전조 이온에 대한 오비트랩(R = 7500)의 MS/MS 스캔이 이어진다. 탠덤 질량 스펙트럼은 SEQUEST와 추가적인 수동 컨트롤에 의해 해석된다. 동정된 펩티드 서열은 생성된 자연 펩티드 분절 패턴과 합성을 서열-일치 참고 펩티드와의 비교를 통해 보증되었다.
비표지 상대적 LC-MS 정량화는 이온 계측, 즉, LC-MS 특징의 추출 및 분석에 의해 수행했다(Mueller et al., 2007). 이 방법은 펩티드의 LC-MS 신호 영역이 샘플 내의 풍부함과 상관관계가 있음을 가정으로 한다. 추출된 특징은 전하 상태 디컨볼루션 및 정체 시간 정렬에 의해 더욱 처리되었다(Mueller et al., 2008; Sturm et al., 2008). 마지막으로, 모든 LC-MS 특징은 서열 확인 결과와 상호 참조하여 다른 샘플과 조직의 정량 데이터를 펩티드 제시 프로필에 합쳤다. 이 정량 데이터를 중심 경향성에 따라 2단 형태로 정상화함으로써 기술적인 생물학적 복제 내에서의 변동을 고려했다. 이에 따라 동정된 펩티드는 하나씩 정량 데이터와 연관시키며 샘플과 조직 사이의 상대적 정량화를 허용할 수 있다. 그 밖에 펩티드 후보로부터 얻어진 모든 정량 데이터를 수동으로 검사하여 데이터 일관성을 보증하고 자동화 분석의 정확성을 확인했다. 펩티드마다 평균 샘플 제시는 물론 복사 변이를 나타내는 제시 프로필을 계산했다. 이 프로필은 흑색종 샘플을 정상 조직 샘플의 기준선에 병치한다. 예시적인 과다-제시된 펩티드의 제시 프로필이 도 1에 도시된다. 예시적 펩티드의 제시 점수는 표 8에 제시된다.
표 8은 제시 점수를 나타낸다. 이 표는 정상 조직의 패널에 비해 매우 고도로 과다-제시되거나(+++), 정상 조직의 패널에 비해 고도로 과다-제시되거나(++), 정상 조직의 패널에 비해 과다-제시되는(+) 펩티드들을 나열한다. 종양과의 비교에 대해 적합하다고 간주되는 정상 조직의 패널은 다음으로 구성된다: 지방 조직, 부신, 혈액 세포, 혈관, 골수, 뇌, 식도, 눈, 담낭, 심장, 신장, 대장, 간, 폐, 림프절, 신경, 췌장, 부갑상선, 복막, 뇌하수체, 흉막, 타액선, 골격근, 피부, 소장, 비장, 위, 흉선, 갑상선, 기관, 요관, 방광.
[표 8]
Figure pct00032
Figure pct00033
Figure pct00034
Figure pct00035
Figure pct00036
Figure pct00037
Figure pct00038
실시예 2
본 발명의 펩티드를 인코딩하는 유전자의 발현 프로필
정상 세포와 비교한 종양 세포 상의 펩티드의 과다-제시 또는 특이적 제시는 면역요법에서의 그 유용성에 대해 충분하며 일부 펩티드는 정상 조직에서도 발생하는 그 근원 단백질에도 불구하고 종양 특이적이다. 여전히 mRNA 발현 양상 분석은 면역요법을 위한 펩티드 표적의 선택에서 추가적 안정성 수준을 추가한다. 특히 친화도 성숙 TCR과 같은 안정성 위험이 높은 치료적 옵션의 경우에는, 이상적 표적 펩티드는 종양에 고유하며 정상 조직에는 없는 단백질로부터 유래될 것이다.
RNA 원천 및 제조
수술로 제거된 조직 검체는 위에서 나타낸 바와 같이(실시예 1 참조), 각각의 환자로부터 동의서를 얻은 다음 제공되었다. 종양 조직 검체는 수술 직후 스냅-냉동되었고 절구와 유봉을 이용하여 액체 질소 대기 하에 균질화되었다. 총 RNA는 TRI 시약(Invitrogen, 독일 칼스루에 소재)을 이용하여 샘플로부터 만들었으며, 이는 RNeasy(QIAGEN, 독일 힐덴 소재)에 의해 청소되었다; 이 두 가지 방법은 모두 제조업체의 설명서에 따라 실행되었다.
RNASeq 실험을 위한 건강한 인체 조직의 총 RNA는 다음으로부터 얻었다. Asterand(미국 미시간주 디트로이트 소재, 및 영국 헤르츠 로이스톤 소재); BioCat GmbH(독일 하이델베르크 소재); BioServe(미국 메릴랜드주 벨츠빌 소재); Capital BioScience Inc.(미국 메릴랜드주 록빌 소재); Geneticist Inc.(미국 캘리포니아주 글렌데일 소재); Istituto Nazionale Tumori "Pascale"(이탈리아 나폴리 소재); ProteoGenex Inc.(미국 캘리포니아주 컬버 시티 소재); 및 University Hospital Heidelberg(독일 하이델베르크 소재).
RNASeq 실험을 위한 종양 조직의 총 RNA는 다음으로부터 얻었다: Asterand (미국 미시간주 디트로이트 소재, 및 영국 헤르츠 로이스톤 소재); ProteoGenex Inc.(미국 캘리포니아주 컬버 시티 소재); Tissue Solutions Ltd(영국 글라스고우 소재); University Hospital Bonn(독일 본 소재).
RNA 샘플의 양과 질은 Agilent 2100 Bioanalyzer(Agilent, 독일 발트브론 소재) 상에서 RNA 6000 Pico LabChip Kit(Agilent)를 사용하여 분석되었다.
RNAseq 실험
종양 및 정상 조직 RNA 샘플의 유전자 발현 분석은 CeGaT(독일 튀빙겐 소재)의 차세대 서열결정(RNAseq)으로 수행하였다. 간단히 말하면, 서열결정 라이브러리는 제공사의 프로토콜(Illumina Inc., 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재)에 따라 Illumina HiSeq v4 시약 키트를 사용하여 제조하며, 여기에는 RNA 분절, cDNA 변환 및 서열결정 어댑터의 첨가가 포함된다. 복수의 샘플에서 유래한 라이브러리들은 동일한 몰로 혼합한 다음, Illumina HiSeq 2500 시퀀서에서 그 제조사의 설명에 따라 서열을 결정함으로써 50 bp의 싱글 엔드 리드(single end read)를 생성한다. 처리된 리드는 STAR 소프트웨어를 사용하여 인간 게놈(GRCh38)에 대해 매핑한다. 발현 데이터는 RPKM(백만개 매핑된 리드당 킬로베이스당 리드, Cufflinks 소프트웨어에 의해 생성)으로 전사물 수준 상 및 엑손 수준 상(총 리드, Bedtools 소프트웨어에 의해 생성)에서 제공되고, 앙상블 서열 데이터베이스(Ensembl77)의 주석에 기반한다. 엑손 리드는 엑손 길이 및 정렬 크기에 대해 정규화하여 RPKM 수치를 얻는다.
본 발명의 흑색종에서 고도로 과발현 또는 배타적으로 발현되는 출처 유전자의 예시적 발현 프로필이 도 2에 도시된다. 추가의 예시적 유전자의 발현 점수가 표 9에 제시된다.
표 9는 발현 점수를 나타낸다. 이 표는 정상 조직의 패널에 비해 종양에서 매우 고도로 과발현되거나(+++), 정상 조직의 패널에 비해 종양에서 고도로 과발현되거나(++), 정상 조직의 패널에 비해 종양에서 과발현되는(+) 유전자의 펩티드를 나열하고 있다. 이 점수의 베이스라인은 다음의 적절한 정상 조직에 대한 측정치로부터 계산했다: 지방 조직, 부신, 동맥, 혈액 세포, 골수, 뇌, 연골, 결장, 식도, 눈, 담낭, 두경부 및 타액선, 심장, 신장, 간, 폐, 림프절, 췌장, 말초신경, 뇌하수체, 직장, 골격근, 피부, 소장, 비장, 위, 갑상선, 기관, 방광 및 정맥. 동일한 조직 유형에 대해 여러 샘플의 발현 데이터가 있는 경우, 모든 해당 샘플의 산술 평균을 그 계산에 사용했다.
[표 9]
Figure pct00039
Figure pct00040
실시예 3
MHC 클래스 I 제시 펩티드의 시험관내 면역원성
본 발명의 TUMAP의 면역원성에 대한 정보를 얻기 위해, 본 발명자는 펩티드/MHC 복합체 및 항-CD28 항체가 적재된 인공 항원-제시 세포(aAPC)를 갖는 CD8+ T 세포의 반복된 자극을 근거로 시험관내 T 세포 초회 감작을 사용하여 조사를 수행했다. 이 방법으로 본 발명자들은 지금까지 HLA-A*0201 제한된 TUMAP의 면역원성을 보여줄 수 있었으며, 이것은 이 펩티드들이 인간에 존재하는 CD8+ 전조 T 세포에 대한 T 세포 에피톱이라는 것을 보여주었다(표 10).
CD8+ T 세포의 시험관내 감작
펩티드-MHC 복합체(pMHC) 및 항-CD28 항체가 적재된 인공 항원-제시 세포에 의한 시험관내 자극을 수행하기 위해, 본 발명자는 독일 소재 University clinics Mannheim에서 동의서를 받은 건강한 공여자로부터의 CD8 마이크로비드(Miltenyi Biotec, 독일 베르기쉬-글라트바크 소재)를 사용한 양성 선택을 통해 신선한 HLA-A*02 백혈구 성분 채집 산물로부터 CD8+ T 세포를 먼저 단리했다.
PBMC 및 분리된 CD8+ 림프구는 10% 열 비활성화된 인간 AB 혈청(PAN-Biotech, 독일 아이덴바크 소재), 100 U/ml 페니실린/100 μg/ml 스트렙토마이신(Cambrex, 독일 쾰른 소재), 1 mM 피루브산 나트륨(CC Pro, Oberdorla, 독일 오베르도를라 소재), 20 μg/ml 젠타마이신(Cambrex)으로 보충된 RPMI-Glutamax(Invitrogen, 독일 칼스루에 소재)를 포함하는 T 세포 배지(TCM)에서 사용할 때까지 배양했다. 이 단계에서 2.5 ng/ml IL-7(PromoCell, 독일 하이델베르크 소재) 및 10 U/ml IL-2(Novartis Pharma, 독일 뉘른베르크 소재) 또한 TCM에 추가했다.
pMHC/항-CD28 코팅된 비드의 생성, T 세포 자극 및 판독은 고도로 정의된 시험관내 체계에서 수행했으며, 자극 조건 당 8가지 다른 pMHC 분자 및 판독 조건 당 8가지 다른 pMHC 분자를 각각 사용했다.
정화된 공동-자극 쥐 IgG2a 항인체 CD28 Ab 9.3(Jung et al., 1987)은 제조사가 권장하는 술폰-N-히드록시숙신이미도비오틴을 사용하여 화학적으로 비오틴닐화했다(Perbio, 독일 본 소재). 사용된 비드는 스트렙티비딘으로 코팅된 직경 5.6 μm의 폴리스티렌 입자였다(Bangs Laboratories, 미국 일리노이주 소재).
양성과 음성 대조군 자극으로 사용되는 pMHC는 각각 A*0201/MLA-001(변형된 Melan-A/MART-1의 펩티드 ELAGIGILTV(서열번호 339))과 A*0201/DDX5-001(DDX5의 YLLPAIVHI, 서열번호 340)였다.
800.000 비드/200 μl는 4 x 12.5ng 비오틴-pMHC 존재 하에 96-웰 플레이트에서 코팅하고 세척한 다음 600ng 비오틴 항-CD28을 첨가하여 200μl의 부피로 만들었다. 자극은 1x106 CD8+ T 세포를 5 ng/ml IL-12(PromoCell)로 보충된 200μl TCM에서 37℃ 및 3일 동안 세척하고 코팅된 2x105 비드와 함께 96-웰 플레이트에서 공동배양함으로써 개시했다. 매질의 반은 80 U/ml IL-2로 추가된 새로운 TCM에 의해 교환되고 배양은 37℃에서 4일간 계속되었다. 이 자극 주기는 총 세 번 수행되었다. 조건 당 8가지 다른 pMHC 분자를 사용하는 pMHC 멀티머의 판독을 위해, 이미 설명된 바와 같이(Andersen et al., 2012) 2차원 조합대수적 코팅 접근 방식을 사용했으며, 5가지 다른 형광색소와의 결합을 허용하는 약간의 변형이 있었다. 마지막으로, 다합체 분석은 Live/dead 근 IR 염료(Invitrogen, 독일 칼스루에 소재), CD8-FITC 항체 클론 SK1(BD, 독일 하이델베르크 소재) 및 형광 pMHC 다합체로써 세포를 염색하여 수행했다. 분석에는 적절한 레이저 및 필터가 장착된 BD LSRII SORP 세포측정기를 사용했다. 펩티드 특이 세포는 총 CD8+ T 세포의 백분율로 계산되었다. 다합체 분석의 평가는 FCS Express 소프트웨어를(De Novo Software) 사용하여 수행되었다. 특정 다합체 + CD8+ 림프구의 시험관내 초기 감작은 음성 대조군 자극과 비교함으로써 감지되었다. 제공된 항원의 면역원성은 건강한 공여자의 하나 이상의 시험관내 자극된 평가가능한 웰이 시험관내 자극 후 특이적인 CD8+ T 세포주를 함유하는 것으로 밝혀졌다(즉, 이러한 웰은 CD8+ T 세포 중 1% 이상의 특이적인 다합체+를 함유하였고, 특이적인 다합체+ 세포의 백분율은 음성 대조군 자극의 중간값의 10배 이상이었다).
흑색종 펩티드의 시험관내 면역원성
실험된 HLA 클래스 I 펩티드에서, 시험관내 면역원성은 펩티드 특이적 T 세포주의 형성에 의해 입증될 수 있었다. 도 3은 본 발명의 2개 펩티드에 대한 TUMAP 특이적 다합체 염색 후 얻은 예시적 유세포 측정 결과 및 상응하는 음성 대조군이 나타났다. 도 4는 본 발명의 3개 펩티드에 대한 TUMAP 특이적 다합체 염색 후 얻은 예시적 유세포 측정 결과 및 상응하는 음성 대조군이 나타났다. 본 발명의 33개의 펩티드에 대한 결과는 표 10A에 요약되어 있다. 본 발명의 29개 펩티드에 대한 결과가 표 10B에 요약되어 있다.
표 10A는 본 발명의 HLA 클래스 I 펩티드의 시험관내 면역원성을 나타낸다. 본 발명의 펩티드에 대해 본 발명자들에 의해 수행된 시험관내 면역원성 실험의 예시적 결과가 제시된다. <20 % = +; 20 % 내지 49 % = ++; 50 % 내지 69 %= +++; >= 70 % = ++++.
[표 10A]
Figure pct00041
Figure pct00042
표 10B는 본 발명의 HLA 클래스 I 펩티드의 시험관내 면역원성을 나타낸다. 본 발명자들이 본 발명의 HLA-A*02 제한 펩티드에 대해 실행한 시험관내 면역원성 실험의 예시적 결과가 제시된다. 시험관내 면역원성 실험의 결과가 표시되어 있다. 양성 웰 및 공여자의 백분율은(평가가능한 것 가운데) 다음의 표시로 요약된다: <20 % = +; 20 % 내지 49 % = ++; 50 % 내지 69 %= +++; >= 70 %= ++++.
[표 10B]
Figure pct00043
실시예 4
펩티드의 합성
모든 펩티드는 Fmoc-전략을 사용하여 표준 및 확립된 고체상 펩티드 합성으로써 합성되었다. 각 개별 펩티드의 정체와 순도로 질량 분석법과 분석 RP-HPLC에 의해 결정했다. 펩티드는 순도가 50% 초과인 흰색에서 황백색의 동결건조물(삼불화 초산염)로 얻어졌다. 모든 TUMAP는 바람직하게는 삼불화아세트산 염 또는 아세트산 염으로 투여되지만, 다른 염의 형태 또한 가능하다.
실시예 5
MHC 결합 검정
본 발명에 따른 T 세포 기반 요법의 후보 펩티드를 MHC 결합 능력(친화도)에 대해 더 실험했다. 개별 펩티드-MHC 복합체는 UV-리간드 교환에 의해 만들었으며, UV에 민감한 펩티드가 UV 조사 후 분할된 다음 분석된 관심 대상의 펩티드로 교환되었다. 펩티드 수용성 MHC 분자를 효과적으로 결합하고 안정화시킬 수 있는 펩티드 후보만이 MHC 복합체의 해리를 막는다. 이 교환작용의 수율을 결정하기 위해, 안정화된 MHC 복합체의 경쇄(β2m) 검출에 근거하여 ELISA를 수행했다. 이 검정은 로덴코 등의 문헌(Rodenko et al., 2006)에서 일반적으로 설명된 대로 수행했다.
96 웰 MAXISorp 플레이트(NUNC)를 실온 및 PBS에서 2ug/ml 스트렙타비딘으로 밤새 코팅하고 4회 세척한 다음 블로킹 완충역을 함유하는 2% BSA와 37℃에서 1시간 동안 블로킹을 진행했다. 되접기된 HLA-A*02:01/MLA-001 단량체가 표준의 역할을 했으며, 그 범위는 15 내지 500ng/ml였다. UV-교환 반응을 위한 펩티드-MHC 단량체는 블로킹 완충액으로 100배 희석되었다. 샘플은 37℃에서 1시간 배양 후 4회 세축하고 2ug/ml HRP 접합된 항-β2m으로 37℃에서 1시간 배양한 다음 NH2SO4로 정지시킨 TMB 용액으로 검출했다. 흡광은 450nm에서 측정했다. 높은 교환 수율(바람직하게는 50% 초과, 가장 바람직하게는 75% 초과)을 보이는 후보 펩티드가 일반적으로 항체 또는 그 단편 및/또는 T 세포 수용체 또는 그 단편의 생성 및 생산을 위해 선호되는데, 이는 MHC 분자에 대한 충분한 결합성을 보이며 MHC 복합체의 해리를 막기 때문이다.
표 11은 MHC 클래스 I 결합 점수를 나타낸다. HLA 클래스 I 제한 펩티드의 HLA-A*02:01에 대한 결합 범위는 펩티드 교환 수율에 의해 정해졌다: >10% = +; >20% = ++; >50 = +++; > 75% = ++++.
[표 11]
Figure pct00044
Figure pct00045
Figure pct00046
Figure pct00047
Figure pct00048
Figure pct00049
Figure pct00050
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Gly Asp Val Gln Leu 1 5 <210> 284 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 284 Thr Ile Gly Ile Pro Phe Pro Asn Val 1 5 <210> 285 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 285 Tyr Leu Met Asp Asp Phe Ser Ser Leu 1 5 <210> 286 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 286 Gly Leu Asn Gly Phe Asn Val Leu Leu 1 5 <210> 287 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 287 Lys Ile Ser Asp Phe Gly Leu Ala Thr Val 1 5 10 <210> 288 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 288 Ala Leu Leu Glu Gln Thr Gly Asp Met Ser Leu 1 5 10 <210> 289 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 289 Ile Leu Ala Gln Asp Val Ala Gln Leu 1 5 <210> 290 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 290 Asn Val Ala Glu Ile Val Ile His Ile 1 5 <210> 291 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 291 Leu Leu Asp Asp Ile Phe Ile Arg Leu 1 5 <210> 292 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 292 Ala Leu Gly Asp Lys Phe Leu Leu Arg Val 1 5 10 <210> 293 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 293 Phe Leu Asp Gly Arg Pro Leu Thr Leu 1 5 <210> 294 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 294 Phe Leu Leu Ala Glu Asp Thr Lys Val 1 5 <210> 295 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 295 Phe Leu Pro Gln Pro Val Pro Leu Ser Val 1 5 10 <210> 296 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 296 Phe Thr Ala Glu Phe Leu Glu Lys Val 1 5 <210> 297 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 297 Gly Val Asp Asp Ala Phe Tyr Thr Leu 1 5 <210> 298 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 298 Lys Leu Gln Glu Glu Ile Pro Val Leu 1 5 <210> 299 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 299 Asn Leu Leu Ile Asp Asp Lys Gly Thr Ile Lys Leu 1 5 10 <210> 300 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 300 Gln Ile Asp Asp Val Thr Ile Lys Ile 1 5 <210> 301 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 301 Arg Val Ile Asp Asp Ser Leu Val Val Gly Val 1 5 10 <210> 302 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 302 Thr Val Leu Gln Glu Leu Ile Asn Val 1 5 <210> 303 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 303 Lys Leu Gly Asp Phe Gly Leu Leu Val Glu Leu 1 5 10 <210> 304 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 304 Val Leu Leu Ala Gln Ile Ile Gln Val 1 5 <210> 305 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 305 Thr Leu Leu Lys Thr Ile Ile Lys Val 1 5 <210> 306 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 306 Lys Met Leu Asp Glu Ile Leu Leu Gln Leu 1 5 10 <210> 307 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 307 Ala Leu Ala Gly Gly Ile Thr Met Val 1 5 <210> 308 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 308 Lys Leu Leu Ser Asp Pro Asn Tyr Gly Val 1 5 10 <210> 309 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 309 Met Gln Lys Glu Ile Thr Ala Leu 1 5 <210> 310 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 310 Ala Leu Ala Ser Val Ile Lys Glu Leu 1 5 <210> 311 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 311 Lys Leu Met Asp Tyr Ile Asp Glu Leu 1 5 <210> 312 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 312 Thr Ala Val Gly His Ala Leu Val Leu 1 5 <210> 313 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 313 Leu Leu Leu Asp Thr Val Thr Met Gln Val 1 5 10 <210> 314 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 314 Ser Leu Phe Glu Trp Phe His Pro Leu 1 5 <210> 315 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 315 Lys Leu Ser Trp Asp Leu Ile Tyr Leu 1 5 <210> 316 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 316 Ala Leu Ala Glu Leu Leu His Gly Ala 1 5 <210> 317 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 317 Asn Leu Ala Glu Glu Leu Glu Gly Val 1 5 <210> 318 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 318 Ser Ile Ile Glu Tyr Leu Pro Thr Leu 1 5 <210> 319 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 319 Ala Leu Ser Ser Ser Gln Ala Glu Val 1 5 <210> 320 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 320 Lys Ile Ile Gly Ile Met Glu Glu Val 1 5 <210> 321 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 321 Tyr Leu Pro Thr Phe Phe Leu Thr Val 1 5 <210> 322 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 322 Ser Leu His Phe Leu Ile Leu Tyr Val 1 5 <210> 323 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 323 Val Val Asp Lys Thr Leu Leu Leu Val 1 5 <210> 324 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 324 Ser Leu Ala Asn Asn Val Thr Ser Val 1 5 <210> 325 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 325 Val Leu Val Asp Asp Asp Gly Ile Lys Val Val 1 5 10 <210> 326 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 326 Ala Leu Ser Gly Thr Leu Ser Gly Val 1 5 <210> 327 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 327 Ala Leu Ala Asp Lys Glu Leu Leu Pro Ser Val 1 5 10 <210> 328 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 328 Ser Leu Ser Gln Glu Leu Val Gly Val 1 5 <210> 329 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 329 Val Leu Ala Pro Arg Val Leu Arg Ala 1 5 <210> 330 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 330 Lys Met Phe Phe Leu Ile Asp Lys Val 1 5 <210> 331 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 331 Ala Leu Ser Gln Val Thr Leu Leu Leu 1 5 <210> 332 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 332 Ala Val Val Glu Phe Leu Thr Ser Val 1 5 <210> 333 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 333 Arg Ile Pro Ala Tyr Phe Val Thr Val 1 5 <210> 334 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 334 Val Leu Leu Asp Lys Ile Lys Asn Leu Gln Val 1 5 10 <210> 335 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 335 Lys Leu Ala Ser Met Leu Glu Thr Leu 1 5 <210> 336 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 336 Tyr Val Asp Pro Val Ile Thr Ser Ile 1 5 <210> 337 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 337 Phe Leu Val Asp Gly Ser Ser Ala Leu 1 5 <210> 338 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 338 Ser Leu Asn Lys Trp Ile Phe Thr Val 1 5 <210> 339 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 339 Glu Leu Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val 1 5 10 <210> 340 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 340 Tyr Leu Leu Pro Ala Ile Val His Ile 1 5

Claims (32)

  1. 서열번호 1 내지 서열번호 237로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열, 또는 서열번호 1 내지 서열번호 237에 대해 88% 이상의 상동성을 갖는 이의 변이체 서열을 포함하되, 상기 변이체가 주조직적합 복합체(MHC) 분자에 결합하고/거나 변이체 펩티드와 교차 반응하는 T 세포를 유도하는, 전장 폴리펩티드가 아닌 펩티드 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
  2. 제1항에 있어서,
    클래스 I 또는 II MHC 분자에 결합하는 능력을 갖고, MHC와 결합할 때 CD4 및/또는 CD8 T 세포에 의해 인식될 수 있는 펩티드.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    아미노산 서열이 서열번호 1 내지 서열번호 237 중 어느 하나에 따른 아미노산의 연속적인 신장을 포함하는, 펩티드 또는 이의 변이체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    8 내지 100개, 바람직하게는 8 내지 30개, 더욱 바람직하게는 8 내지 16개의 아미노산의 전체 길이를 갖고, 가장 바람직하게는 서열번호 1 내지 서열번호 237 중 어느 하나에 따른 아미노산 서열로 구성되거나 본질적으로 구성되는 펩티드 또는 이의 변이체.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    변형되고/거나 비펩티드 결합을 포함하는 펩티드 또는 이의 변이체.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    융합 단백질의 일부이고, 특히 HLA-DR 항원-연관 불변 쇄(Ii)의 N-말단 아미노산을 포함하는 펩티드 또는 이의 변이체.
  7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 펩티드 또는 이의 변이체, 바람직하게는 MHC 분자에 결합할 때 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 펩티드 또는 이의 변이체를 특이적으로 인식하는 항체, 특히 가용성 또는 막-결합된 항체, 바람직하게는 단클론 항체 또는 이의 단편.
  8. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 펩티드 또는 이의 변이체, 바람직하게는 MHC 분자에 결합할 때 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 펩티드 또는 이의 변이체인 HLA 리간드와 반응성인 T 세포 수용체, 바람직하게는 가용성 또는 막-결합된 T 세포 수용체 또는 이의 단편.
  9. 제8항에 있어서,
    리간드의 아미노산 서열이 서열번호 1 내지 서열번호 237 중 어느 하나에 대해 88% 이상의 동일성을 갖거나, 리간드의 아미노산 서열이 서열번호 1 내지 서열번호 237 중 어느 하나로 구성되는, T 세포 수용체.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서,
    가용성 분자로서 제공되고, 임의적으로 면역 자극 도메인 또는 독소와 같은 추가 효과기 기능을 갖는 T 세포 수용체.
  11. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 펩티드 또는 이의 변이체, 바람직하게는 MHC 분자에 결합하는 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 펩티드 또는 이의 변이체를 특이적으로 인식하는 압타머.
  12. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 펩티드 또는 이의 변이체, 제7항에 따른 항체 또는 이의 단편, 제8항 또는 제9항에 따른 T 세포 수용체 또는 이의 단편을 인코딩하고, 임의적으로 이종 프로모터 서열에 연계된 핵산, 또는 상기 핵산을 발현하는 발현 벡터.
  13. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 펩티드, 제7항에 따른 항체 또는 이의 단편, 제8항 또는 제9항에 따른 T 세포 수용체 또는 이의 단편, 또는 제12항에 따른 핵산 또는 발현 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포로서, 바람직하게는 수지상 세포, T 세포 또는 NK 세포와 같은 항원-제시 세포로부터 선택되는 재조합 숙주 세포.
  14. T 세포를 적절한 항원-제시 세포 또는 항원-제시 세포를 모방하는 인공 구축물의 표면에 발현된 항원-로딩된 인간 클래스 I 또는 II MHC 분자와 상기 T 세포를 항원 특이적 방식으로 활성화하는데 충분한 시간 동안 시험관 내에서 접촉시키는 단계
    를 포함하되, 상기 항원이 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 펩티드인, 활성화된 T 림프구의 시험관내 생산 방법.
  15. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 정의된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 제시하는 세포를 선택적으로 인식하는, 제14항에 따른 시험관내 생산 방법에 의해 생산되는 활성화된 T 림프구.
  16. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 펩티드, 제7항에 따른 항체 또는 이의 단편, 제8항 또는 제9항에 따른 T 세포 수용체 또는 이의 단편, 제11항에 따른 압타머, 제12항에 따른 핵산 또는 발현 벡터, 제13항에 따른 숙주 세포, 및 제15항에 따른 활성화된 T 림프구로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 활성 성분, 또는 접합되거나 표지된 활성 성분, 및 약학적으로 허용가능한 담체, 및 임의적으로 약학적으로 허용가능한 부형제 및/또는 안정화제를 포함하는 약학 조성물.
  17. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 펩티드 또는 이의 변이체, 제7항에 따른 항체 또는 이의 단편, 또는 제8항 또는 제9항에 따른 T 세포 수용체 또는 이의 단편의 생산 방법으로서,
    제13항에 따른 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
    상기 펩티드 또는 이의 변이체, 상기 항체 또는 이의 단편, 또는 상기 T 세포 수용체 또는 이의 단편을 상기 숙주 세포 및/또는 이의 배양 배지로부터 단리하는 단계
    를 포함하는 생산 방법.
  18. 의약에 사용하기 위한, 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 펩티드, 제7항에 따른 항체 또는 이의 단편, 제8항 또는 제9항에 따른 T 세포 수용체 또는 이의 단편, 제11항에 따른 압타머, 제12항에 따른 핵산 또는 발현 벡터, 제13항에 따른 숙주 세포, 또는 제15항에 따른 활성화된 T 림프구.
  19. 표적 세포가 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 정의된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 제시하는 환자에서 표적 세포를 괴사시키는 방법으로서,
    효과적인 수의 제15항에 따른 활성화된 T 림프구를 상기 환자에게 투여함을 포함하는 방법.
  20. 암의 진단 및/또는 치료에 사용하기 위한 또는 암에 대한 약제의 제조에 사용하기 위한, 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 펩티드, 제7항에 따른 항체 또는 이의 단편, 제8항 또는 제9항에 따른 T 세포 수용체 또는 이의 단편, 제11항에 따른 압타머, 제12항에 따른 핵산 또는 발현 벡터, 제13항에 따른 숙주 세포, 또는 제15항에 따른 활성화된 T 림프구.
  21. 암이 흑색종, 급성 골수성 백혈병, 유방암, 담관암, 뇌암, 만성 림프구성 백혈병, 대장 암종, 식도암, 담낭암, 위암, 간세포암, 비호지킨 림프종, 비소세포 폐암, 난소암, 췌장암, 전립선암, 신세포암, 소세포 폐암, 방광암, 자궁암, 및 서열번호 1 내지 서열번호 237에 따른 펩티드가 유래되는 단백질의 과발현을 나타내는 기타 종양으로 구성되는 군으로부터 선택되는, 제20항에 정의된 용도.
  22. a) 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 펩티드 또는 이의 변이체, 제7항에 따른 항체 또는 이의 단편, 제8항 또는 제9항에 따른 T 세포 수용체 또는 이의 단편, 제11항에 따른 압타머, 제12항에 따른 핵산 또는 발현 벡터, 제13항에 따른 숙주 세포, 또는 제15항에 따른 활성화된 T 림프구를 용액 또는 동결건조된 형태로 함유하는 약학 조성물을 포함하는 용기;
    b) 임의적으로, 희석제, 또는 동결건조된 제형을 위한 재구성 용액을 함유하는 제2 용기;
    c) 임의적으로, 서열번호 1 내지 서열번호 237로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 펩티드; 및
    d) 임의적으로, (i) 용액의 사용, 또는 (ii) 동결건조된 제형의 재구성 및/또는 사용을 위한 설명서
    를 포함하는 키트.
  23. 제22항에 있어서,
    (iii) 완충액, (iv) 희석제, (v) 필터, (vi) 주사바늘, 및 (vii) 주사기 중 하나 이상을 추가로 포함하는 키트.
  24. a) 개별 환자로부터의 종양 샘플에 의해 제시된 종양-연관 펩티드(TUMAP)를 동정하는 단계;
    b) 단계 a)에서 동정된 펩티드를 정상 조직과 비교하여 종양에서 면역원성 및/또는 과다-제시에 대해 사전선별된 펩티드의 창고(warehouse)와 비교하는 단계;
    c) 개별 환자에서 동정된 TUMAP와 일치하는 하나 이상의 펩티드를 상기 창고로부터 선택하는 단계; 및
    d) 단계 c)에 근거하여 개인화된 백신, 또는 화합물-기반 또는 세포 치료제를 생산하고/거나 제형화하는 단계
    를 포함하는, 개별 환자를 위한 개인화된 항암 백신, 또는 화합물-기반 및/또는 세포 치료제의 생산 방법.
  25. 제24항에 있어서,
    a1) 종양 샘플로부터의 발현 데이터를 종양 샘플의 조직 유형에 상응하는 정상 조직의 샘플로부터의 발현 데이터와 비교하여 종양 샘플에서 과발현되거나 이상 발현된 단백질을 동정하는 단계; 및
    a2) 상기 발현 데이터와 종양 샘플의 클래스 I 및/또는 클래스 II MHC 분자에 결합된 MHC 리간드의 서열의 상관관계를 결정하여 종양에 의해 과발현되거나 이상 발현된 단백질로부터 유래하는 MHC 리간드를 동정하는 단계
    에 의해 TUMAP가 동정되는, 생산 방법.
  26. 제24항 또는 제25항에 있어서,
    종양 샘플로부터 단리된 MHC 분자로부터 결합된 펩티드를 용출시키고, 용출된 리간드를 서열결정(sequencing)함으로써, MHC 리간드의 서열이 동정되는, 생산 방법.
  27. 제24항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서,
    종양 샘플의 조직 유형에 상응하는 정상 조직이 동일한 환자로부터 수득되는, 생산 방법.
  28. 제24항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서,
    창고에 포함된 펩티드가 다음 단계에 근거하여 동정되는, 생산 방법:
    aa) 정상 조직과 비교하여 악성 조직에서 과발현된 유전자의 동정을 포함하는, 마이크로어레이 또는 서열결정-기반의 발현 프로파일링(profiling)과 같은 고도의 병렬 방법(parallel method)에 의한 게놈-전체 전령 리보핵산(mRNA) 발현 분석을 수행하는 단계;
    ab) 단계 aa)에서 검출된 선택적으로 발현되거나 과발현된 유전자에 의해 인코딩된 펩티드를 선택하는 단계; 및
    ac) 건강한 공여자 또는 환자로부터의 인간 T 세포를 사용하는 시험관내 면역원성 검정을 포함하는, 선택되는 펩티드에 의한 생체내 T 세포 반응의 유도를 결정하는 단계; 또는
    ba) 질량 분광분석법을 사용하여 종양 샘플로부터 HLA 리간드를 동정하는 단계;
    bb) 정상 조직과 비교하여 악성 조직에서 과발현된 유전자의 동정을 포함하는, 마이크로어레이 또는 서열결정-기반의 발현 프로파일링과 같은 고도의 병렬 방법에 의한 게놈-전체 전령 리보핵산(mRNA) 발현 분석을 수행하는 단계;
    bc) 동정된 HLA 리간드를 유전자 발현 데이터와 비교하는 단계;
    bd) 단계 bc)에서 검출된 선택적으로 발현되거나 과발현된 유전자에 의해 인코딩된 펩티드를 선택하는 단계;
    be) 종양 조직 상에 존재하고 건강한 조직에서 결여되거나 드물게 검출되는, 단게 bd)로부터 선택되는 TUMAP를 재검출하고, mRNA 수준에서 과발현의 관련성을 확인하는 단계; 및
    bf) 건강한 공여자 또는 환자의 인간 T 세포를 사용하는 시험관내 면역원성 검정을 포함하는, 선택되는 펩티드에 의한 생체내 T 세포 반응의 유도를 결정하는 단계.
  29. 제24항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서,
    창고에 포함된 펩티드의 면역원성이 시험관내 면역원성 검정, 개별 HLA 결합에 대한 환자 면역모니터링, MHC 멀티머 염색, ELISPOT 검정 및/또는 세포내 시토카인 염색을 포함하는 방법에 의해 결정되는, 생산 방법.
  30. 제24항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서,
    창고가 서열번호 1 내지 서열번호 338로 구성되는 군으로부터 선택되는 복수의 펩티드를 포함하는, 생산 방법.
  31. 제24항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서,
    개별 환자로부터의 상응하는 정상 조직과 비교하여 종양 샘플에 고유한 하나 이상의 돌연변이를 동정하고, 상기 돌연변이와 상관관계가 있는 펩티드를 백신에 포함시키거나 세포 치료제를 생성하기 위해 선택하는 단계를 추가로 포함하는 생산 방법.
  32. 제31항에 있어서,
    하나 이상의 돌연변이가 전체 게놈 서열결정에 의해 동정되는, 생산 방법.
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