KR20180129825A - 엑세나타이드 유사체의 연장된 방출 컨쥬게이트 - Google Patents

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브라이언 헤른
제프리 씨. 헤니스
개리 더블유. 애슐리
다니엘 브이. 산티
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프로린크스 엘엘시
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Abstract

1개월에 1회 또는 이보다 덜 빈번한 투약 스케쥴로 당뇨병 및 관련 질환을 치료하기 위해 장기 지속 투여를 제공하기 위한 방출 속도를 갖는, 안정화된 GLP-1 작용제 밸런스 안정성을 갖는 서방형 컨쥬게이트.

Description

엑세나타이드 유사체의 연장된 방출 컨쥬게이트
[0001] 본 발명은 약물-전달 및 서방성 제형 분야에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 GLP-1 작용제(GLP-1 agonists)의 안정화된 형태를 1개월 이상의 기간 동안 전달하는 서방성 조성물에 관한 것이다.
[0002] 엑세나타이드는 GLP-1 수용체의 강력한 작용제인 39-아미노산 펩타이드로서 혈당조절 효과를 갖는 인슐린 분비촉진제이다. 이것은 Byetta® (Astra-Zeneca)로서 시판되는 유리 펩타이드로서 2형 당뇨병 치료에 널리 사용되고 있는데, 이 펩타이드는 생체 내 반감기가 2.5 시간으로 짧기 때문에 1일 2회 주사된다. 엑세나타이드 및 관련 GLP-1 작용제 펩타이드의 효능을 개선시키고 부작용을 감소시키며 환자의 치료 부담을 경감시키기 위해 이들의 반감기를 연장시키는 것이 매우 요망되고 있다.
[0003] 펩타이드 반감기는 전통적으로 다음 몇가지 방법들 중 한 가지 또는 이들의 조합에 의해 연장된다: (i) 대사를 지연시키기 위한 펩타이드의 화학적 변형; (ii) 서방성 데포(depot) 제형의 제공을 위한 캡슐화; 및 (iii) 체내 소거를 둔화시키기 위한 마크로분자와의 컨쥬게이션. [참조: 예컨대, Cai,et al., Drug Design, Development, 및 Therapy(2013) 7:963-970].
[0004] 반감기를 증가시키기 위한 펩타이드의 화학적 변형은 예컨대 릭시세나타이드 (Lyxumia®) 및 리라글루타이드 (Victoza®)와 같은 1일-1회 GLP-1 작용제를 결과시켰다. Bydureon® (Astra-Zeneca)로서 시판되는 서방성 제형을 제조하는데 펩타이드를 PLGA (폴리 락틱-코글리콜산) 미립자 내로 캡슐화시키는 방법이 이용되었는데, 이에 의해 1주-1회 피하 주사하는 것이 가능해졌다. 트리글리세라이드 제형을 이용하여 Bydureon의 투약 기간을 1개월-1회로 연장시키려는 시도는 아직까지 성공하지 못하였다. GLP-1 펩타이드 작용제를 Fc 항체 도메인 또는 랜덤-서열 폴리펩타이드 (XTEN)와 컨쥬게이션시키는 것은 반감기를 단지 최대 5-6일 연장시킬 수 있을 뿐이었다.
[0005] 투약 요구 사항을 이해함에 있어, 혈장 반감기, 즉 시스템에서 약물의 절반을 잃는 데 필요한 시간을 고려하는 것이 편리하다. 투약 빈도는 약물 수준을 특정한 유효 수준 이상으로 유지해야 할 필요성에 따라 결정된다. 만일 투약이 반감기마다 한 번씩 이루어져야 하면, 투여량은 초기 약물 수준에 2배의 효능을 부여하는 양이어야 한다; 마찬가지로, 투약이 2 반감기마다 1번 이루어져야 할 경우 투여량은 초기 약물 수준에 4배의 효능을 부여하는 수준이어야 한다. 이론적으로, 투약 당 주어진 약물의 양을 단순히 늘림으로써 반감기와 상관없이 원하는 만큼 드물게 투약할 수 있다. 많은 약물들이 높은 초기 농도와 연관된 독성을 나타내지만, 반감기의 함수로서 투여 빈도에 실질적인 제한을 가하고 있다. 약 1-2 반감기의 투여 간격이 일반적이다. 한 달에 한 번의 투여를 위한 적절한 유효 반감기를 갖는 GLP-1 작용제 펩타이드의 여러 가지 제제들이 개시되었지만, 이들은 몇 가지 단점이 있다. 캡슐화 마이크로스피어 및 상-전이 지질 제형은 펩타이드의 초기 파열-상 방출을 겪을 수 있어, 환자를 초기의 바람직하지 않은 높은 약물 수준에 노출시킨다. 이식가능한 펌프는 이식 및 제거를 위한 외과 수술을 필요로 한다.
[0006] 약물 방출의 초기 파열은 공유결합된 컨쥬게이트의 사용을 통해 회피 될 수 있다. 가용성, 순환 컨쥬게이트는 전형적으로 월 1회의 약물 투여 (인간에서 폴리(에틸렌 글리콜)의 최대 반감기는 약 1 주일임)를 지원하기에 충분한 반감기를 갖지 않는 반면, 하이드로 겔과 같은 불용성 컨쥬게이트 임플란트가 적합하다. 엑세나타이드와 같은 약물이 제어가능한 약물 방출속도를 갖는 링커를 통해 다양한 매트릭스에 공유결합되어 있는 조성물들이 예컨대 미국특허 8,680,315;　8,754,190; 8,703,907에 개시된 바 있고, 여기에는 미국특허 8,946,405에 개시된 불용성 매트릭스 및 US2014/0288190　('190)에 개시된 하이드로겔이 포함된다. '190 공개문헌의 일 구체예에서, 엑세나타이드는 하이드로겔 매트릭스에 결합되어 있는데, 여기서 피하 공간 내로 주사될 경우, 하이드로겔은 액세나타이드가 링커의 베타-소거 분해에 의해 분해되어 방출되는 데포를 제공함으로 해서 약물의 장기간-작용 공급원을 제공한다. 이러한 하이드로겔은 정의상 주로 물로 구성되므로 엑세나타이드는 따라서 데포 기간 동안 수성 환경에 노출된다. 이러한 수성 환경은 단백질의 복잡한 구조를 유지하는데 유리한 것으로 여겨지지만, 특정한 펩타이드 서열은 이러한 장기간 조건 하에서 불안정화를 겪을 수도 있다.
[0007] 생리적 조건 하의 하이드로겔 중 엑세나타이드의 분해 속도는 그러한 제제의 1개월에 1회 또는 덜 빈번한 투여를 비실용적으로 만든다는 것이 밝혀졌다. 엑세나타이드는 스트레스 조건(pH　7.9, 40℃ 6일간) 하에서 화학 안정성을 나타내어 M14 및 W25에서의 산화 및 Q13 및 N28에서의 측쇄 아미드 가수분해를 결과시키는 것으로 보고되었다 (US 특허출원 2006/0194719; Zealand). 불안정성의 상세한 동력학은 개시되지 않았다. 펩타이드 내 Asn 잔기의 탈아미드화의 구체적인 모델이 설명된 바 있으나 (Geiger & Clarke, J. Biol . Chem . (1987) 262:785-794), 생리적 조건 하에서의 펩타이드와 단백질의 탈아미드화 속도는 고도로 가변적인 것으로 알려져 있다(Robinson & Robinson, Proc Natl Acad Sci(2010) 98:12409-12413). 엑세나타이드 자신은 1일-2회 투여(Byetta®) 및, PLGA 임플란트(Bydureon®)를 통한 1주-1회 투여에 충분히 안정적이다.
[0008] 엑세나타이드의 안정화 형태가 개시된 바 있다. 예를 들어 PCT 출원 WO2008/116294 (Matregen)에는 3가지 위치: Q13, M14 및 N28에서 변형된 안정화된 엑세나타이드 유사체가 개시되어 있다. 엑세나타이드 서열 내 복수의 아미노산 치환이 관용될 수 있지만, 현재로서는 보다 안정한 잔기로 N28을 치환하는 것은 pH 7.4, 37℃에서 펩타이드의 효과적인 안정화에 충분한 것으로 밝혀졌다. 예컨대 N28D 및 N28-isoD 등 엑세나타이드 탈아미드화의 몇몇 생성물이 전술한 미국 특허출원 2006/0194719 (Zealand)에 개시된 바 있으며 GLP-1 수용체 활성화를 위한 강도를 유지하는 것으로 밝혀졌다. 이들 생성물들은 그러나 내부전환(interconverting) 시스템을 형성하여, 생성물의 본래 혼합물에 대한 평형에 대해서는 불안정하다.
[0009] pH　7.4, 37℃(즉 생리적 pH 및 온도)의 수성 완충액에서의 엑세나타이드의 운명을 조사한 결과, 완충액에 따라 8 내지 14일의 반감기를 가지며 Asn28(N28)에서 탈아미드화를 수행하는 것으로 나타났다. 1월-1회 투여하도록 설계된 하이드로겔 컨쥬게이트는 따라서 8-14일 후 엑세나타이드의 분해 생성물을 주로 방출한다. 따라서 안정화된 GLP-1 작용제가 투여 기간 말기까지 방출된 분해된 형태의 양을 최소화하기 위해 화학 분해에 대해 충분한 내성을 갖는 것이 필수적이다. 이것은 GLP-1 작용체가 pH　7.4, 37℃에서 1개월 후 10% 미만의 분해 산물, 좋기로는 pH　7.4, 37℃에서 1개월 후 5% 미만의 분해 산물을 형성할 때 달성된다.
[0010] 본 발명은 GLP-1 작용제 펩타이드의 월 1 회 또는 심지어 덜 빈번한 투여를 지지하고 대사성 질환 및 대사성 증후군, 당뇨병 및 비만과 같은 증상의 치료에 유용한 안정화된 GLP-1 작용제 펩타이드의 연장된 방출을 제공하는 컨쥬게이트에 관한 것이다. 이 컨쥬게이트는 GLP-1 작용제의 연장된 안정성과 적절한 링커에 의해 제공되는 조절된 방출 시간을 적절한 링커에 의해 조합시켜 방출을 위한 데포 역할을 하는 저장소 매트릭스를 얻게 한다.
[0011] 일 측면에서, 본 발명은 공유적으로 결합된 링커-펩타이드를 복수개 갖는 불용성 매트릭스를 포함하는 연장된 방출 컨쥬게이트를 제공하며, 여기서 상기 링커는 생리적 조건의 pH 및 온도에서 분해하여 유리 펩타이드를 방출하며 상기 펩타이드는 pH　7.4, 37℃에서 1개월 이상 동안 10% 미만의 분해를 나타내는 안정화된 GLP-1 작용제이다. 본 발명의 컨쥬게이트는 하기 화학식 (1)로서 나타내질 수 잇다
M-(L-E)x (1)
식 중 M은 절단가능한 링커 L을 통해 복수개(x)의 GLP-1 작용제 펩타이드 E에 연결된 불용성 매트릭스이다. E는 1개월 동안 10% 미만의 분해를 나타내는 생리적 조건의 pH 및 온도 하에서 발생하는 분해와 관련하여 안정화된 GLP-1 작용제이다. x는 매트릭스의 부피에 적합한 농도를 산출하는 L-E 모이어티의 수를 나타내는 정수이다. 적절한 농도는 매트릭스 1 ml 당 펩타이드 1-1000 mg이다. 링커 L은 목적하는 투여 기간에 적합한 반감기로 유리 펩타이드를 방출한다.
[0012] 두 번째 측면에서, 본 발명은 화학식 (4)를 갖는 링커-펩타이드 L-E를 제공한다
Figure pct00001
식 중, 적어도 하나 또는 두 개 모두의 R1 및 R2는 독립적으로 CN; NO2;
선택적으로 치환된 아릴;
선택적으로 치환된 헤테로아릴;
선택적으로 치환된 알케닐;
선택적으로 치환된 알키닐;
COR3 또는 SOR3 또는 SO2R3
[여기서 R3는 H 또는 선택적으로 치환된 알킬;
각각 선택적으로 치환된 아릴 또는 아릴알킬;
각각 선택적으로 치환된 헤테로아릴 또는 헤테로아릴알킬; 또는 R3는
OR9 또는 NR9 2이고 여기서 각각의 R은 독립적으로 H 또는 선택적으로 치환된 알킬, 또는 두 개의 R9기는 이들이 결합한 질소와 함께 헤테로시클릭 고리를 형성함];
SR4
[여기서 R4는 선택적으로 치환된 알킬;
각각 선택적으로 치환된 아릴 또는 아릴알킬; 또는
각각 선택적으로 치환된 헤테로아릴 또는 헤테로아릴알킬임];
여기서 R1 및 R2는 결합하여 3-8원 고리를 형성할 수 있고; 및
여기서 R1 및 R2 중 오직 하나는 H 또는 알킬, 아릴알킬 또는 헤테로아릴알킬이고 이들 각각은 선택적으로 치환된 것이며; 및
여기서 R5 중 하나는 (CH2)yZ, (CH2CH2O)xCH2CH2Z 또는 (CH2)yNH-CO-(CH2CH2O)x CH2CH2Z이되 여기서 x는　1-100, y　=　1-6이고 또 다른 R5는 H, 알킬, 알케닐알킬, 알키닐알킬, 아릴, 아릴알킬, 헤테로아릴 또는 헤테로아릴알킬이며, 이들 각각은 선택적으로 치환된 것이고;
Z는 불용성 매트릭스에 대한 커플링을 매개하기 위한 관능기이고, NH는 GLP-1 작용제 E의 아미노기의 잔기이다.
[0013] 일 구체예에서, R1은 CN 또는 R3SO2이고 여기서 R3는 알킬 또는 R9 2N,이며, 여기서 각각의 R9은 H, 알킬 또는 치환된 알킬, 하나의 R5는 H이고 또 다른 R5 는 (CH2)nZ이며 여기서 n　=　1-6이고 Z는 그를 통해 링커-펩타이드가 메 결합할 수 있는 것인 관능기이다.
[0014] 일 구체예에서, E는 [N28Q]엑세나타이드 (SEQ　ID　NO:2)이다. 본 발명은 또한 이 펩타이드 및 약학적으로 허용가능한 임의의 염 및 그의 의약 조성물, 그리고 GLP-1 작용제에 의해 이로운 상태를 갖는 대상자에게 이 펩타이드를 그의 염으로 사용하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, GLP-1 작용제의 투여 프로토콜에 관한 것이다.
[0015] 세 번째 측면에서, 본 발명은 화학식 (1)의 컨쥬게이트를 투여하는 프로토콜에 관한다. 일 구체에에서, 컨쥬게이트는 좁은-게이지 바늘을 이용하는 피하 주사에 적합한 하이드로겔 마이크로스피어로서 제조된다. 본 발명의 컨쥬게이트는 인간과 동물 모두에서 대사 질환 및 대사 상태를 치료하는데 유용할 것으로 기대된다. 1-3개월의 연장된 투약이 달성된다.
[0016] 도 1-6은 본 발명의 서방형 컨쥬게이트의 다양한 구체예들을 개략적으로 나타낸 도면이다.
[0017] 도 1A 및 1B는 컨쥬게이트의 전체적인 외관을 개략적 형태로 나타낸 도면이다. 도 1A에서 이들 성분들 중 하나는 8-아암(arm) 마크로모노머이고 또 다른 하나는 4-아암 마크로모노머이며 여기서 GLP-1에 결합된 링커는 8-아암 마크로모노머의 아암에 커플링되어 있다. 도 1B에서, 구조는 링커-작용제의 가교제 자체에 대한 결합을 제공한다.
[0018] 도 2는 도 1A의 결합을 더욱 상세히 나타낸다.
[0019] 도 3은 상이한 마크로모노머들을 커플링하는 가교 모이어티가 링커-관련 작용제 부착을 위한 반응성 기를 갖는 구체예의 개략도이다.
[0020] 도 4는 링커 펩타이드가 부착되어 있는 도 3의 매트릭스를 나타낸다.
[0021] 도 5 및 6은 본 명세서의 실시예 4에 제시된 특정 구체예들을 나타낸다.
[0022] 도 7A-7B는 투여 빈도에 대한 컨쥬게이트 데포 (conjugate depot)로부터의 약물 방출 속도와 설정된 최종 농도 (Cmin)를 달성하는데 필요한 상대적인 투여량 사이의 관계를 나타낸다.
[0023] 도 8A-8C는 200　mM 포스페이트 완충액, pH　7.4, 37℃에서의 엑세나타이드 및 [N28Q]엑세나타이드 안정성을 나타낸다.
[0024] 도 9는 도 8A 및 8B에 도시된 56일 엑세나타이드 분해 반응으로부터 단리된 피크에서의 이소-아스파테이트(isoAsp) 함량에 대한 펩타이드 이소-아스파테이트 메틸 트랜스페라제 (PIMT) 분석의 결과를 나타낸다. t = 0 및 56일에서의 엑세나타이드 반응 혼합물의 IsoAsp 측정, 및 56일에서의 분해 믹스의 단리된 성분들. L-Asp- 및 D-isoAsp-함유 펩타이드의 값은 샘플에서 HPLC에 의해 검출된 소량의 L-isoAsp-펩타이드에 대해 조정되었다. RV 9.9 및 10.4에서 잔류 PIMT-양성 피크는 단리된 HPLC 분획에서 저급 [L-isoAsp28] 엑세나타이드 불순물에 기인한다. 오차 막대는 ±SD이다.
[0025] 도 10은 하이드로 겔-결합된 비변형 엑세나타이드 (R1　=　CN; R2　=　H)를 투여한 후 래트에서의 엑세나타이드의 약동학을 도시한다. 시험관내 방출 동력학 (t1/2　=　1400　시간) 및 엑세나타이드의 알려진 약동학 파라미터에 기초하여 예상 농도 대 시간 곡선을 생성하였다 (점선). 실험 데이터 (사각형)는 전체 t1/2　=　190　시간인 하이드로겔 (실선)에서 엑세나타이드의 분해를 설명하는 모델에 더 적합하다.
[0026] 도 11은 하이드로겔-결합된 [N28Q]엑세나타이드의 s.c. 투여 후 래트에서 [N28Q] 엑세나타이드의 약동학을 보여준다. 패널 A는 펩타이드가 R1　=　MeSO2인 L을 이용하여 펩타이드가 결합되어 t1/2　=　350　시간인 하이드로겔을 나타낸다. 패널 B는 펩타이드가 R1　=　CN인 L에 결합되고 t1/2　=　760　시간인 하이드로겔을 나타낸다. 따라서 [N28Q]엑세나타이드의 혈장 수준은 일회 투여 후 적어도 1개월 동안 유지될 수 있다.
[0027] 도 12는 경구 글루코스 내성 시험에서 엑세나타이드 및 [N28Q]엑세나타이드의 비교 결과를 나타낸다.
[0028] 도 13은 도 7에 도시된 경구 글루코스 내성 테스트 데이터에 대한 AUC 분석을 나타낸다.
[0029] 도 14A 내지 도 14E는 당뇨병성 ZDF 래트에서 [N28Q]엑세나타이드 ("PL-cmpd")를 포함하는 하이드로겔 마이크로스피어 제제의 한 달에 한 번 투여한 결과를 보여준다.
[0030] 도 15A 및 15B는 실시예 8A에 설명된 것과 같은 [N28Q]엑세나타이드를 포함하는 하이드로겔 마이크로스피어 제제를 s.c. 투약 후 래트 혈청에서의 [N28Q]엑세나타이드의 약동학을 나타낸다.
[0031] 도 16A-16B는 실시예 8B에 설명된 바와 같은 마이크로스피어 컨쥬게이트를 마우스에게 SC 주사한 후 혈청 [N28Q]엑세나타이드 수준을 나타낸다.
발명을 수행하기 위한 모드
[0032] 펩타이드의 월 1회 투여를 달성하기 위해, 펩타이드는 순환하지 않는 불용성 매트릭스의 형태로 공급되어야 하지만, 약물 방출을 위한 데포(depot)로서 작용하여야 한다. 약물의 순환 거대분자 컨쥬게이트는 컨쥬게이트 그 자체가 시스템, 예를 들어 혈장 자체로부터 제거됨에 따라 만족스럽지 않다. 따라서, 펩타이드는 거시적 규모의 매트릭스 내에 공급되어야 하며 여기서, 펩타이드 (또는 다른 약물)는 1-1000 mg 펩타이드/ml 매트릭스, 좋기로는 1-100 mg 펩타이드/ml 매트릭스 및 더욱 좋기로는 1-50 mg 펩타이드/ml 매트릭스의 농도로 매트릭스 부피 내에 존재한다. 따라서, 매트릭스는 식별 가능한 체적을 가지며, 편리하고 집합적으로 마이크로스피어 형태로 투여될 수 있다. ("매트릭스의 부피"는 그러나 마이크로스피어들의 투여량을 포함하여, 공급된 투여량의 총 부피이다.)
[0033] In order 본 발명과 연관된 구조들의 특성을 설명하기 위해 출원인은 본 발명의 범위에 속하는 전형적인 구체예들의 개관을 제공하는 도 1 내지 도 6을 제공한다.
[0034] 본 발명에 따른 결합된 펩타이드를 포함하는 전형적인 불용성 하이드로겔 매트릭스가 도 1A에 도시되어 있다. 이것은 P의 아암의 절반이 T의 아암과 가교되도록하는 화학량론으로 4-아암 마크로모노머 T와 8-아암 마크로모노머 Pfmf 가교시킴으로써 형성된 매트릭스의 이상적인 구조이다. P의 나머지 가교되지 않은 아암들은 링커-펩타이드에 연결된다. 이 유형의 하이드로겔의 제조는 PCT 공개공보 WO2013/036847에 기술되어 있으며, 하기 제조예 E에 설명되어 있다.
[0035] 도 1B는 방출가능한 링커-약물이 분해가능한 가교제에 커플링되어 있는 별도 사례를 나타낸다. 도 1B는 A의 각 아암이 직교(orthogonal)인 제1 및 제2 관능기를 포함하는 기에 의해 종결되는 4-아암 마크로모노머 A를, B의 각 아암이 마크로모노머 A의 제1 또는 제2 관능기들 중 오직 하나와 반응성인 관능기로 종결되는 제2의 4-아암 마크로모노머 B와 가교시킴으로써 형성되는, 매트릭스의 이상적인 구조를 나타낸 도면이다. 마크로모노머 A의 나머지 관능기는 마크로모노머의 나머지 관능기와 반응성인 관능기를 포함하는 링커-펩타이드와의 반응에 이용될 수 있다. 링커-펩타이드의 부착은, 마크로모노머 B와의 가교를 수반하는, 마크로모노머 A와 링커-펩타이드의 반응에 의한 겔 형성 전, 또는 마크로모노머 A와 B의 가교에 의한 겔 형성 후에 수행되어 하이드로겔 형성 후 링커-펩타이드와의 반응이 수반될 수 있다. 전술한 바와 같이, 불용성 하이드로겔 매트릭스를 형성하기 위한 가교 반응은 벌크 물질 또는 현탁액 또는 에멀젼 중 어느 한 방법으로 수행되어 미분 된 미립자 중합체, 예를 들어 본원의 실시예 2에 기재된 마이크로스피어를 형성할 수 있다.
[0036] 도 2는 도 1A에 개략적으로 나타낸 바와 같이, 각각의 P에 대해 n개의 링커-펩타이드를 추가로 포함하는 매트릭스에서 8-아암 마크로모노머 P와 4-아암 마크로모토머 T 사이의 가교결합의 일반적인 구조를 나타낸다. 링커-작용제가 하이드로겔의 가교제 모이어티에 커플링되어 있는 별법이 도 1B 및 하기 실시예 4에 기재되어 있다.
[0037] 이 대안의 일반적인 설명은 도 3 및 4에 제시되어 있다. 도 3은 접근가능한 아민기를 갖는 불용성 매트릭스를 시클로옥틴기를 도입하기 위한 시약으로 유도화시키는 예를 도시한다. 이 사례에서, 하기 제조예 D에 예시된 바와 같이 매트릭스의 제조에 사용된 마크로모노머 A는 리신 잔기를 포함한다. 마크로모노머 B와의 가교 결합에 의한 매트릭스의 형성시, 결과적인 매트릭스는 예를 들어 시클로옥틴기를 도입하는 시약과의 반응에 의해 추가의 관능화에 적합한 접근가능한 아민기를 갖는다.
[0038] 도 4는 방출가능한 링커-펩타이드를 포함하는 분해가능한 하이드로 겔의 일반적인 구조를 도시한다. 두 개의 마크로모노머 A 및 B (예를 들어, 하기 본원의 제조예 D에 예시된 바와 같이)는, 각 가교 결합이 방출가능한 링커-펩티드를 포함하도록, 가교 결합된다. 도면에서, 각각의 A 및 B는 도시된 가교 결합에 의해 결합되어 불용성 매트릭스를 형성한다. Y와 Z는 연결 관능기이다.
[0039] 도 5 및 6은 실시예 4에서 제조된 서방형 컨쥬게이트 내의 결합 구조를 나타낸다. 도 5에서, 하이드로겔 매트릭스는 조절제 비스(2-에톡시)아미노설포닐에 의해 제어된 분해를 갖는 가교 결합을 포함하는 반면, 하이드로겔로부터의 SEQ ID NO: 2의 펩타이드는 조절제 CN에 의해 조절된다. 연결 관능기는 아지드기를 시클로옥틴 MFCOdp 첨가함으로써 결과된 트리아졸이다.
[0040] 도 6은 하이드로겔 가교 및 하이드로겔로부터의 펩타이드의 방출 양자 모두가 조절제 CN에 의해 제어되고 연결 관능기들이 아지드기와 5-히드록시시클로옥틴의 반응에 기인하는 트리아졸인 것을 제외하고 도 5에 도시된 것과 동일한 구조를 나타낸다.
매트릭스 M:
[0041] 매트릭스 M은 링커-펩타이드 L-E가 부착되는 불용성 지지체로서, 처리 기간 동안 E가 방출되는 저장기 역할을 한다. M은 링커-펩타이드 L-E의 부착에 적합해야하며, 그렇지 않으면 이러한 결합을 허용하도록 유도화될 수 있는 관능기를 포함하여야 한다. M은 링커 L의 절단을 통해 일단 방출된 펩타이드 E의 자유 확산을 허용하여야 한다. M은 또한 가용성 제품으로 생분해될 수 있어야 하고 과량의 가용성 M-L-E 단편을 형성하지 않으면서도 E를 방출할 만큼 충분히 천천히, 분해되어야 하고, 이와 동시에 다중-투여 시나리오에서 E 방출 후 잔류하는 약물-유리 M-L의 부담을 최소화하는데 충분히 빨리 분해되어야 한다.
[0042] 일 구체에에서, M은 PCT 특허공보 WO2013/036847 및 US2014/0288190에 개시된 바와 같이 제조된 생분해성 하이드로겔로서 상기 두 문헌은 모두 이러한 하이드로겔의 설명에 관하여 본 발명에 참조 통합된다. 이러한 하이드로겔은 분해 속도를 제어할 수 있는 베타-제거 가교제를 포함한다. 따라서, 일부 구체예에서, 가교제는 하기와 같이 화학식 1 또는 2의 것이다.
Figure pct00002
식 중 m은 0 또는 1; 및
X 및 R1, R2 및 R5 중 어느 하나 각각은 폴리머에 대한 커플링을 위한 관능기를 포함하며,
단, R1 및 R2 중 적어도 하나는 CN; NO2;
선택적으로 치환된 아릴;
선택적으로 치환된 헤테로아릴;
선택적으로 치환된 알케닐;
선택적으로 치환된 알키닐;
COR3 또는 SOR3 또는 SO2R3 이거나 [여기서
R3는 H 또는 선택적으로 치환된 알킬;
각각 선택적으로 치환된 아릴 또는 아릴알킬;
각각 선택적으로 치환된 헤테로아릴 또는 헤테로아릴알킬;　또는
OR9 또는 NR9 2로서 여기서 각각의 R9는 독립적으로 H 또는 선택적으로 치환된 알킬이거나, 또는 두 개의 R9 기는 모두 이들이 결합한 질소와 함께 헤테로시클릭 고리를 형성함];
SR4 이고 [여기서
R4는 선택적으로 치환된 알킬;
각각 선택적으로 치환된 아릴 또는 아릴알킬; 또는
각각 선택적으로 치환된 헤테로아릴 또는 헤테로아릴알킬임];
여기서 R1 및 R2는 합쳐서 3-8원 고리를 형성하되; 및
여기서 임의의 나머지 R1 및 R2는 H이거나 또는 각각 선택적으로 치환된 알킬, 아릴알킬 또는 헤테로아릴알킬이고; 및
임의의 나머지 R5는 독립적으로 H이거나 또는 알킬, 알케닐알킬, 알키닐알킬, (OCH2CH2)p O-알킬(여기서 p=1-1000), 아릴, 아릴알킬, 헤테로아릴 또는 헤테로아릴알킬로서 이들 각각은 선택적으로 치환되거나; 또는
상기 가교제는 화학식 (2)를 갖는 것이고
Figure pct00003
(2)
식 중 R1, R2 및 R5 중 두 가지는 폴리머에 결합하기 위한 관능기를 포함하고;
m은 0-1;
n은 1-1000;
s는 0-2;
t는 2,4, 8, 16 또는 32;
Q는 원자가(valency) t를 갖는 코어 기이고;
W는 O(C=O)O, O(C=O)NH, O(C=O)S,
Figure pct00004
, 또는
Figure pct00005
이며;
여기서 R6는 H, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 아릴, 선택적으로 치환된 헤테로아릴, 선택적으로 치환된 아릴알킬, 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴알킬이고;
단 R1 및 R2 중 적어도 하나는 CN; NO2;
선택적으로 치환된 아릴;
선택적으로 치환된 헤테로아릴;
선택적으로 치환된 알케닐;
선택적으로 치환된 알키닐;
COR3 또는 SOR3 또는 SO2R3
여기서 R3는 H 또는 선택적으로 치환된 알킬;
각각 선택적으로 치환된 아릴 또는 아릴알킬;
각각 선택적으로 치환된 헤테로아릴 또는 헤테로아릴알킬;　또는
OR9 또는 NR9 2 로서 여기서 각각의 R9은 독립적으로 H 또는 선택적으로 치환된 알킬이거나, 또는 두 개의 R9 기는 양자 모두 이들이 결합한 질소와 함께 헤테로시클릭 고리를 형성하며;
SR4
여기서 R4는 선택적으로 치환된 알킬;
각각 선택적으로 치환된 아릴 또는 아릴알킬; 또는
각각 선택적으로 치환된 헤테로아릴 또는 헤테로아릴알킬;
여기서 R1 및 R2는 한데 합쳐서 3-8원 고리를 형성할 수 있고; 및
여기서 임의의 나머지 R1 및 R2는 H이거나 또는 각각 선택적으로 치환된 알킬, 아릴알킬 또는 헤테로아릴알킬이며; 및
임의의 나머지 R5는 독립적으로 H이거나 또는 알킬, 알케닐알킬, 알키닐알킬, (OCH2CH2)p O-알킬(여기서 p=1-1000), 아릴, 아릴알킬, 헤테로아릴 또는 헤테로아릴알킬이며, 이들 각각은 선택적으로 치환된다.
이들 가교제를 매트릭스에 커플링시키는데 사용된 관능기에는 N3, NH2, NH-CO2 tBu, SH, StBu, 말레이미드, CO2H, CO2 tBu, 1,3-디엔, 시클로펜타디엔, 퓨란, 알킨, 시클로옥틴, 아크릴레이트, 아미노옥시, 케토 및 아크릴아미드가 포함된다. 화학식 (1) 및 (2) 상의 2개의 관능기들은 서로 다르지만, 동족체는 아니다. 예를 들어, 하나가 아지드이면, 다른 하나는 시클로옥틴 또는 알킨이 아니다.
[0043] L-E의 절단으로부터의 E 방출 속도보다 몇 배 느린 속도로 M 분해 및 가용화를 유도하는 베타-제거성 가교제를 선택함으로써, 가용성 M-L-E 단편의 형성이 최소화되는 한편 효과적인 가용화 및 매트릭스의 소거가 제공된다. 본 발명의 일 구체예에서, 이들 하이드로겔은 다중-아암 폴리(에틸렌 글리콜)을 가교시킴으로써 제조된다. 본 발명은 가교된 덱스트란 및 히알루론산을 비롯한 다른 유용한 매트릭스를 추가로 고려한다.
[0044] 이러한 매트릭스들은 좁은-게이지 바늘을 이용하여 주사하는데 용이한 마이크로스피어의 슬러리로서 유리하게 만들어질 수 있다. 이러한 슬러리들은 공지 방법, 예컨대 벌크-상 유화 또는 보다 정확하게는 프리폴리머 혼합물의 마이크로플루이드 액적 유화에 의한 공지 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 입도 분포는 필요하다면, 예컨대 체질(sieving)을 통하여 공지 방법을 통해 정제될 수 있다.
펩타이드 E:
[0045] 본 발명에 의해 전달되는 펩타이드 (E)는 GLP-1 작용제로서, 이는 GLP-1 수용체에 결합하여 활성화시킬 수 있는 펩타이드를 의미한다. GLP-1 작용제의 예로는 자연-발생적인 엑센딘, 예를 들어 엑세나타이드 (엑센딘-4; SEQ　ID　NO:1), 리라글루타이드 (SEQ ID NO:13), 릭시세나타이드 (SEQ ID NO:7), 타스포글루타이드(SEQ ID NO:12), 및 이의 서열 변이체를 들 수 있다. GLP-1 수용체에 결합하여 활성화시키는 합성 서열들 역시도 고려할 수 있으며 이의 예로는 시험관내 스크리닝 및/또는 선택에 의해 유도되는 서열을 들 수 있다 (Zhang,et al., Nature Commun.(2015) 6:8918).
SEQ ID NO:1HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-NH2
[엑세나타이드]
SEQ ID NO:2 HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKQGG PSSGAPPPS-NH2
[N28Q]엑세나타이드
SEQ ID NO:3 HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKAGG PSSGAPPPS-NH2
[N28A]엑세나타이드
SEQ ID NO:4 HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKKGG PSSGAPPPS-NH2
[N28K]엑세나타이드
SEQ ID NO:5 HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKDGG PSSGAPPPS-NH2
[N28D]엑세나타이드
SEQ ID NO:7 HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKΞGGPSSGAPPSKKKKKK-NH2
[릭시세나타이드]
SEQ ID NO:8 HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKQGGPSSGAPPSKKKKKK-NH2
[N28Q]릭시세나타이드
SEQ ID NO:9 HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKAGGPSSGAPPSKKKKKK-NH2
[N28A]릭시세나타이드
SEQ ID NO:10 HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKKGGPSSGAPPSKKKKKK-NH2
[N28K]릭시세나타이드
SEQ ID NO:11 ELVDNAVGGDL SKQMEEEAVR LFIEWLKQGG PSSGAPPPS-NH2
SEQ ID NO:12 HUEGTFTSDV SSYLEGQAAK EFIAWLVKUR-NH2
[타스포글루타이드] U　=　2-아미노이소부티르산
SEQ ID NO:13 HAEGTFTSDVSSYLEGQAAK*EFIAWLVRGRG-OH
K* 　=　Lys(y-Glu-팔미토일)
[0046] 펩타이드 작용제 E는 투여 기간 동안 생리적 조건 하에서 화학적으로 안정하여만 한다. 이것은 펩타이드의 직접 투여에 있어 이슈가 되지 않을 수 있지만 이들의 급속한 소거 및 빈번한 투여를 고려할 때, 서방형 제제들에 대해서는 펩타이드 안정성에 대해 보다 가혹한 요구사항이 부과된다. 예를 들어, 생리적 조건 하에서 14일의 반감기로 분해되는 펩타이드는 하루에 그 펩타이드의 오직 5%만이 분해될 것이므로 1일-1회 투여에 완전히 적합할 수 있다. 30일의 서방형 조건 (즉, 1개월-1회 투여) 하에서 동일한 펩타이드는 투여 기간 말기가 되면 80% 분해될 것이어서 적합치 않을 것이다.
[0047] 서열 Asn-Gly, 예컨대 엑세나타이드 내 N28-G29 디펩타이드를 함유하는 펩타이드의 분해 메카니즘을 하기에 나타내었다. 나타난 바와 같이, 초기 L-숙신이미드가 형성되며 이것은 아스파라긴 잔기를 아스파르트산 또는 이소아스파르트산으로 전환시킨다. 이들 변형된 아미노산의 D형 및 L형 양자 모두 수득된다.
Figure pct00006
[0048] 엑세나타이드 자체의 서열 변이체 시험 결과 N28을 다른 아미노산으로 대체하면 해당 펩타이드가 GLP-1 수용체에 밴딩 및 활성화하는 강도에 최소한도로 영향을 미치면서 서방형 컨쥬게이트를 통해 한달에 한번 투여하는데 충분한 안정성을 갖는 작용제를 제공할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 그러므로, SEQ　ID　NO:1의 N28이 각각 Q, A 또는 K로 대체된 SEQ　ID　NOS:2-4를 갖는 작용제들은, 1개월의 기간 동안 <10% 또는 <9%의 활성 감소를 보이면서 천연 엑세나타이드와 필적할만한 친화성과 강도로 GLP-1 수용체에 결합 및 이를 활성화시킬 수 있는 것으로 나타났다.
[0049] 본 발명은 또한 엑세나타이드 외의 다른 적당히 안정화된 GLP-1 작용제의 용도에 관한 것이기도 하다. 전술한 불안정성은 예컨대 릭시세나타이드 및 다른 합성 펩타이드 서열과 같이, Asn-Gly 디펩타이드 서열을 갖는 다른 GLP-1 작용제에서 일어나는 것으로 예상된다. 이들 펩타이드들은 전술한 바와 동일한 시퀀스의 분해 반응을 수행할 것으로 예상된다. 본 발명에 유용한 이들 GLP-1 작용제의 적절히 안정화된 형태에는 SEQ　ID　NOS:8-11이 포함된다. 타스포글루타이드 (SEQ　ID　NO:13) 및 리라글루타이드 (SEQ　ID　NO:14)는 불안정한 Asn-Gly 디펩타이드를 갖지 않으며 본 발명에 사용하기에 적합하다. 불안정성의 다른 원인들 역시도 교정될 수 있다. 본 발명의 작용제의 경우 안정화된 형태는 pH　7.4, 37℃에서 1개월 후 10% 미만의 분해 산물, 좋기로는 pH　7.4, 37℃에서 1개월 후 9% 미만의 분해 산물을 생산한다.
절단가능한 링커 L:
[0050] 절단가능한 링커는 GLP-1 작용제 E를 불용성 매트릭스 메 연결시키고 생리적 조건 하에 절단되어 유리 E를 방출시킨다. 링커 절단 속도는 펩타이드의 유효 반감기를 결정하고 소망되는 투여 빈도에 기초하여 선택된다. 또한 매트릭스의 분해 속도와 펩타이드의 방출 속도가 소망되는 투여 빈도와 조화를 이루는 것이 중요하다. 이전에는, 본 발명의 조성물을 1개월에 한번 또는 이보다 더 드물게 투여하는 것을 허용하는데 필요한, 이와 같은 균형잡힌 속성을 만족시키려는 시도가 이루어지지 않았었다. 이러한 균형을 달성시키는 링커이면 어느 것이든 만족스러울 것이다. 약물의 방출 속도와 매트릭스의 탈겔화(degelation) 속도 간의 관계에 대한 엄격하고도 빠른 규칙은 없지만, 편리한 경험 법칙은 탈겔화 속도가 유리 펩타이드의 방출 속도의 약 3배가 되어야 한다는 것이다. 만일 펩타이드가 탈겔화가 일어나기 전에 너무 빨리 방출되면, 이어지는 투약 시점에서 대상자 체내에 겔의 데포가 남아있게 된다. 만일 방출이 탈겔화 속도에 비해 너무 느리면, 펩타이드는 순환 내로 유리되는 겔의 일부에 결합된 채로 유지된다. 이들 중 어느 환경도 바람직하지 못하다. 이러한 관계는 문헌 [Reid, R., et al. Macromolecules (2015) 48:7359-7369]에 설명되어 있다. 다양한 매트릭스의 탈겔화 속도를 기술하는 구조적 특징은 가교 모이어티에 의존하며 구조적 관련성을 이용하여 매트릭스에 있어 적절한 탈겔화 속도를 제공할 수 있다.
[0051] 분해와 방출 속도 사이의 균형은 다음과 같이 시각화된다:
[0052] Release 공유 링커의 절단을 통해 데포로부터 비교적 신속히 소거되는 약물의 방출은 혈장내 약물 반감기에 링커 절단 반감기를 부여한다. 투여 빈도는 약물 혈장 반감기에 의존하므로, 링커 절단 속도와 투여 빈도 사이에도 관계가 있다. 과다하게 높은 약물 농도로부터 발생하는 독성 잠재력을 감소시키는 한편 투여와 투여 사이의 효능에 필요한 양을 유지시키기 위해, 약물에 노출되는 환자의 최대 약물 혈장 농도(Cmax)와 최소 약물 혈장 농도(Cmin) 간의 차이를 최소화시키는 것이 일반적으로 요망된다.
[0053] 예컨대, 투약 빈도와 약물의 혈장 반감기가 동일하게 설정된 경우, Cmax와 Cmin 사이는 2배 차이가 날 것이고, 약물이 매 2 혈장 반감기 당 1회 투여될 경우 그 차이는 4배로 늘어난다. 그러므로, Cmax를 최소화하기 위해 투약과 투약 사이의 약물 반감기 수를 최소화시키는 것이 일반적이다. 서방형 컨쥬게이트에 있어서, 이것은 방출 속도를 감소시킴으로써 달성된다.
[0054] 그러나, 연장-방출 컨쥬게이트에 있어서, 데포로부터 약물의 안정-상태(steady-state) 레벨은 방출 속도에 반비례한다. Cmax/Cmin 비는 컨쥬게이트로부터의 약물의 방출 속도를 둔화시킴에 따라 임의로 저감될 수 있지만, Cmin에 대해 특정 값을 유지하면서 허용가능한 투여량을 이용할 필요성으로 인해 이러한 접근법에는 제약이 따른다. 단회 투여에 있어, 투여량은 다음과 같이 계산된다
Figure pct00007
식 중 CL　= 약물 소거 속도, F =　생체이용성, k1　= 컨쥬게이트 데포로부터의 약물 방출 속도, 그리고 tmin　= Cmin에 도달하는데 걸리는 시간을 나타낸다. 이로부터 주어진 tmin에 대해 Cmin을 유지하는데 요구되는 최저 투여량은 k1　=　1/tmin일 경우 달성됨을 알 수 있다. 달리 말해서, 이것은 약물 방출 반감기 (=　ln(2)/k1) =　ln(2)*tmin인 경우이다. 특정 투여 빈도에 대한 선택적 약물 방출 반감기는 따라서 ln(2)*(투약 간격)으로서 주어진다. 방출 반감기가 최적값보다 짧은 경우, 요구되는 투여량은 tmin에 도달하기 전에 고갈되는 데포로 인해 증가된다.
[0055] 일반적으로 말해서, 최적값보다 느린 약물 방출 속도는 너무 빠른 것보다 더 관용성이 있다. 그러므로, 월 1회 투여를 뒷받침하는 약물 방출 속도를 갖는 컨쥬게이트는 주2회(biweekly) 또는 주1회 투여 스케쥴에 있어서도 유용할 수 있다. 또한, 약물 방출 속도와 Cmin을 유지하는데 요구되는 투여량 간의 관계는 이상적인 값으로부터의 어느 정도의 일탈은 관용된다. 전술한 파라미터 세트에 따라 이러한 관계를 도 7A 및 7B에 도시하였다. 도 7A에 도시된 바와 같이, 최적 투여량(1)은 방출 반감기 대 투여 빈도의 비가 ln(2) = 0.693인 때에 관찰된다. 도 7A의 이러한 설명은 투여량 수준에 따라 관용될 수 있는 방출 속도 범위를 나타낸다. 높은 투여량 수준은 고방출 속도(최소 요구량 이상의 농도가 여전히 유지되므로)와 저방출 속도(약물이 장기간 더 높은 수준으로 제공되므로) 두 가지 모두를 견딜 것이다. 구체적으로, 투여량이 최대 10% 증가하면, 투약 빈도의 0.45배 내지 1.1배 사이의 반감기가 허용된다. 만일 투여량이 최대 20%까지 증가될 수 있으면, 투약 빈도의 0.4배 내지 1.4배 사이의 반감기가 허용된다. 투여량이 최대 50%까지 증가될 수 있으면, 투약 빈도의 0.3배 내지 2배 사이의 반감기가 허용된다.
[0056] 구체적으로 도 7B에 도시된 바와 같이: 1회 투여로 1개월 지속의 경우 (tmin　=　720 시간), 최적 약물 방출속도는 500 시간이고, ~10% 투여량 증가와 함께 320 내지 800 시간, ~ 20% 투여량 증가와 함께 280 내지 1000 시간, 또는 ~50% 투여량 증가와 함께 220 내지 1440 시간의 방출 속도 역시도 이용가능하다. 마찬가지로 1회 투여로 3개월 지속되는 경우 (tmin　=　720 시간), 최적 약물 방출 속도는 1500 시간이고, ~10% 투여량 증가와 함께 320 내지 2400 시간, ~ 20% 투여량 증가와 함께 840 내지 3000 시간, 또는 ~50% 투여량 증가와 함께 660 내지 4350 시간의 방출 속도 역시도 이용가능하다. 1회 투여로 2주일 지속되는 경우 (tmin　=　336 시간), 최적 약물 방출 속도는 230 시간이고, ~10% 투여량 증가와 함께 150 내지 380 시간, ~ 20% 투여량 증가와 함께 130 내지 470 시간, 또는 ~50% 투여량 증가와 함께 100 내지 680 시간의 방출 속도 역시도 이용가능하다.
[0057] 마찬가지로, 반복-투약 시나리오에서 안정-상태에서 약물 농도를 Cmin 이상으로 유지하는데 요구되는 투여량은 다음과 같다:
Figure pct00008
[0058] 반복-투약 시나리오에서, 전술한 바와 같은 최적 투여량은 없지만, 요구되는 투여량이 방출 속도 감소와 함께 감소되는데 이는 이전의 투여로부터 약물이 더 높은 비율로 잔류함으로 해서, 존재하는 총 약물 데포에 첨가되기 때문이다.
[0059] 그러나, 생분해성 매트릭스로부터의 약물-산생 겔 단편의 방출을 최소화할 필요성, 혼자에 미치는 총 데포 부담을 최소화하려는 욕구, 그리고 안정-상태 약물 수준을 달성하는데 증가된 시간을 고려할 때, 투여량 감소를 위해 보다 느린 방출 속도를 사용하는데에는 실질적인 제한이 있다.
[0060] 일 구체예에서, 절단가능한 링커 L은 다음 화학식 (3)을 갖는다:
Figure pct00009
식 중 R1 및 R2 중 적어도 하나 또는 양자 모두는 독립적으로 CN; NO2;
선택적으로 치환된 아릴;
선택적으로 치환된 헤테로아릴;
선택적으로 치환된 알케닐;
선택적으로 치환된 알키닐;
COR3 또는 SOR3 또는 SO2R3
[여기서 R3는 H 또는 선택적으로 치환된 알킬;
각각 선택적으로 치환된 아릴 또는 아릴알킬;
각각 선택적으로 치환된 헤테로아릴 또는 헤테로아릴알킬이거나; 또는 R3는 OR9 또는 NR9 2 로서, 여기서 각각의 R은 독립적으로 H 또는 선택적 으로 치환된 알킬, 또는 두 개의 R9기는 모두 이들이 결합한 질소와 ㅎ 함께 헤테로시클릭 고리를 형성함]
SR4이고
[여기서 R4는 선택적으로로 치환된 알킬;
각각 선택적으로 치환된 아릴 또는 아릴알킬; 또는
각각 선택적으로 치환된 헤테로아릴 또는 헤테로아릴알킬임];
R1 및 R2는 함께 3-8원 고리를 형성할 수 있고; 및
R1 및 R2 중 오직 하나만이 H 또는 각각 선택적으로 치환된 알킬, 아릴알킬 또는 헤테로아릴알킬일 수있고;　및
R5 중 하나는 (CH2)yZ, (CH2CH2O)xCH2CH2Z 또는 (CH2)yNH-CO-(CH2CH2O)x CH2CH2Z이고 여기서 x는　1-100, y　=　1-6, 및 또 다른 R5는 H, 알킬, 알케닐알킬, 알키닐알킬, 아릴, 아릴알킬, 헤테로아릴 또는 헤테로아릴알킬이고, 이들 각각은 선택적으로 치환되며; 및
Z는 매트릭스에 대한 커플링을 매개하는 관능기이다.
[0061] 이러한 링커는 베타-제거에 의해 절단된다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, R1은 CN 또는 R3SO2이고 여기서 R3는 치환 또는 치환되지 않은 알킬 또는 (R9)2N이며 여기서 각각의 R9은 독립적으로 치환 도는 비치환된 알킬; R2는 H; 하나의 R5는 (CH2)yZ이고 또 다른 R5는 H. Z는 N3, SH, NH-C(=O)CH2ONH2, 또는 O-NH2이다. 특히 바람직한 구체에에서, R1은 CN 또는 CH3SO2이고 및/또는 Z는　N3이다.
[0062] 절단가능한 링커의 또 다른 유형, 예컨대 본 명세서에 참조 통합된 PCT 공개 WO2006/136586에 개시된 것들과 같은 효소적 또는 비효소적 가수분해에 의해 절단가능한 링커들을 사용할 수도 있다. 유일한 요구사항은 링커 절단 속도가 전술한 바와 같이 요구되는 투여 스케쥴에 적합해야 한다는 것이다.
[0063] 본 발명의 일 구체예에서, 링커는 1월 1회 투여를 지지하는데 적합한 반감기를 가지고 생리적 조건 하에서 E를 절단 및 방출한ㄷ. 즉, 링커는 220 내지 1440 시간의 반감기로 E를 절단 및 방출한다. 더욱 바람직한 일 구체에에서, 링커는 280 내지 1000 시간의 반감기, 더욱 좋기로는 320 내지 800 시간의 반감기로 E를 절단 및 방출한다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 링커는 3개월에 한번 또는 2주 1회 투여를 지지하는데 적합한 반감기로 생리적 조건 하에서 E를 절단 및 방출한다.
[0064] 본 발명의 특정 구체예에서, 링커 L은 화학식 (5)를 가지며 여기서 R1은 CN이다. 실시예 5에서 입증되는 바와 같이, 이 링커는 래트에서 하이드로겔로부터 펩타이드를 760 시간의 반감기로 방출시킨다.
[0065] 또 다른 특정 구체예에서, 링커 L은 화학식 (5)를 가지며 여기서 R1은 CH3SO2이다. 실시예 5에서 입증되는 바와 같이, 이 링커는 래트에서 하이드로겔로부터 펩타이드를 350 시간의 반감기로 방출시킨다.
[0066] 링커 L은 L의 C=O 기와 펩타이드 E의 아미노기 사이 카르바메이트 결합 형성을 통해 펩타이드 E에 연결된다. 아미노기는 라이신 측쇄의 엡실론-아미노기 또는 N-말단 알파-아미노기일 수 있다. 이들 두 가지의 제조방법은 기술분야에 공지이다. 일 구체에에서, L은 펩타이드의 고체상 합성 동안 E의 알파-아미노기에 결합된다.
[0067] 링커 L은 또한 펩타이드 E의 관능기 존재 하에 상용가능(compatible)하고 선택적인 화학을 이용하여 링커-펩타이드 L-E를 매트릭스에 결합시키는 Z 기를 더 포함한다. Z는 아지드일 수 있으며 이 경우 L-E는 1,2,3-트리아졸 결합을 형성하는데 1,3-양극성 고리부가(cycloaddition) 반응을 이용하거나, 또는 아미드 형성을 위해 포스핀-매개된 슈타우딩어(Staudinger) 접합을 이용하여 매트릭스에 연결되는데; 이들 두 반응은 모두 기술분야에 잘 문서화되어 있다. 고리부가 반응은 알킨-유도화된 매트릭스에 대한 구리-촉매 부가반응이거나 또는 시클로옥탄- 또는 바이시클로노닌-유도화된 매트릭스에 대한 스트레인-촉진된(strain-promoted) 부가반응일 수 있다. Z는 또한 아미노옥시 또는 아미노옥시-아세트아미도기일 수 있으며 이 경우 L-E는 옥심화 반응을 이용하여 케토-유도화된 매트릭스에 연결된다. 또는 Z는 그 자체로 매트릭스 상의 아미노옥시기에 연결되는 케토기일 수도 있다. Z는 또한 티올기일수도 있는데 이 경우 L-E는 티오에테르 형성을 통해 할로아세틸-유도화되거나, 말레이미드-유도화되거나, 또는 에폭시-유도화된 매트릭스에 연결된다.
[0068] 그러므로, L을 매트릭스에 커플링하는데 사용되는 관능기에는 N3, NH2, NH-CO2 tBu, SH, StBu, 말레이미드, CO2H, CO2 tBu, 1,3-디엔, 시클로펜타디엔, 퓨란, 알킨, 시클로옥틴, 아크릴레이트, 아미노옥시, 케토 또는 아크릴아미드가 포함된다.
컨쥬게이트의 제조:
[0069] 컨쥬게이트는 펩타이드 E, 절단가능한 링커 L, 및 매트릭스　M을 연결함으로서 제조된다. 일 구체에에서, 연결은 유연한 연결 순서로 쌍으로 이루어진다. 그러므로, 펩타이드 E는 먼저 링커 L에 연결되고, 결과적인 L-E가 매트릭스 메연결될 수 있다. 별법으로, 링커 L을 매트릭스 메 연결하고 이어서 E를 M-L에 연결할 수도 있다. M이 모노머 유닛의 중합에 의해 제조된 매트릭스인 경우, M-L 또는 M-L-E는 반응 중 가교가능한 모노머-L 또는 모노머-L-E 유닛을 이용하는 것에 의한 중합 프로세스의 결과일 수 있다.
[0070] 생물학적 사용을 위해, 컨쥬게이트는 멸균성 및 내독소 오염과 관련한 엄격한 기준을 만족하여야 한다. 특정한 경우 터미널 멸균 공정을 이용할 수 있지만, 일반적으로 본 발명의 컨쥬게이트에는 이 공정이 바람직하지 않다. 그러므로, 본 발명의 컨쥬게이트는 무균 조건 하에 제조되는 것이 요구될 수 있다. 컨쥬게이트는 주사가능한 마이크로스피어 현탁액으로서 제조될 수 있고 또는 모노머 유닛의 동시주입(coinjection)에 의해 현장(in situ) 형성될 수도 있다.
제형:
[0071] 컨쥬게이트는 주입성 및 보관 안정성 향상을 위해 표준 제약학적으로 허용가능한 완충제와 부형제를 이용하여 제형화될 수도 있다. 전형적인 제형은 pH를 4 내지 7, 좋기로는 5 내지 6으로 유지시키기 위한 완충제를 포함한다. 펩타이드 약물, 예컨대 항균제 및/또는 메타-크레졸과 같은 항산화제, 폴리올 유사 만니톨과 같은 등장성-조절제, 및 점도 조절제 예컨대 타우린, 테아닌, 사르코신, 시트룰린 및 베타인에 대해 제제를 안정화시키는 부형제가 포함될 수 있다.
사용 방법:
[0072] 본 발명의 컨쥬게이트는 비제한적인 예로서 2형 당뇨병, 대사 증후군 및 비만을 비롯하여 GLP-1 작용제의 투여가 효과적인 것으로 알려진 동물과 인간 양자 모두의 대사 상태 및 질환을 치료하는데 유용하다. 대폭 증가한 유효 반감기는 월 1회 투약을 가능케 하므로 환자 편의성이 개선되고(투약을 잊어버리는 경우가 없어짐) 환자의 삶의 질이 개선된다. 투약은 좋기로는 피하 주사에 의하는 것이 바람직하고 자동주사기를 이용하여 수행될 수 있다.
[0073] 다음에 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세히 설명하나 본 발명의 범위가 이들 실시예로 한정되는 것은 아니다.
제조예 A
엑세나타이드의 시험관내 분해
[0074] 200　mM NaPi, pH　7.4 중 2.4　mM 엑세나타이드 (1　mL), 0.1% NaN3 및 내부 표준으로서 200　uM Lys(DNP)OH의 용액을 37℃에서 유지하였다. 간격을 두고, 50　uL 분주액을 제거하고 분석 전까지 -20℃에서 보관하였다. 다양한 샘플들을 해동하고 a) HPLC, b) GLP1R 작용제 활성, 및 c) 단백질 이소아스파테이트 메틸 트랜스퍼라제 활성에 대해 분석하였다. 56일간 인큐베이션된 샘플을 HPLC 처리하고 RV　9.9, 10.4 및 10.8의 샘플을 수집하여 분석 RP-HPLC에 의해 개별적으로 순도, GLP1R 작용제 및 PIMT 활성에 대해 분석하였다.
[0075] (a) 엑세나타이드의 탈아미드화 vs. 시간의 HPLC 프로파일을 도 8A-8C에 나타내었다. 제56일의 반응으로부터의 각각의 피크를 RP-HPLC에 의해 정제하였다. 패널 A는 제0일　(톱), 7일, 28일, 및 56일(보텀)에 천연 엑세나타이드에 대해 얻어진 HPLC 트레이스를 나타낸다. 엑세나타이드에 대한 초기 단일 피크는 점차 여러 개의 분해 산물에 대한 피크에 의해 대체된다. 패널 B는 패널 A의 데이터로부터 유래된 엑세나타이드 분해의 시간 경과를 나타낸다. 엑세나타이드 (사각형)의 감소 및 주요 분해 산물의 증가는 t1/ 2이 약 10일임을 보여준다. 패널 C는 패널 A에서 엑세나타이드에 대한 것과 대응하는 [N28Q]엑세나타이드에 대해 얻어진 HPLC 트레이스를 나타낸다. 단리된 분해 산물의 분석 HPLC 결과는 L-Asp 및 D-isoAsp 피크가 각각 IsoAsp를 오염시키는 ~ 7 및 12%를 포함한다는 것을 보여 주었고; 분리된 IsoAsp는 단일 피크를 보였다.
[0076] (b) GLP1R cAMP HunterTM 바이오어세이 (DiscoverX)에 의해 GLP-1 수용체 활성화에 대해 시점들을 분석하였다. EC50 값을 하기 표 1에 요약하였다.
Figure pct00010
[0077] 탈아미드화 혼합물로부터 단리된 Asp 펩타이드는 잠재적으로 간섭적인 isoAsp 펩타이드를 소량 하유하였으나, 합성 [Asp28]엑세나타이드는 엑세나타이드에 필적할만한 작용제 활성을 나타내었다. 제56일에 탈아미드화 반응에서 형성된 D-isoAsp의 양은 너무 소량이어서 (~12%) 혼합물의 작용제 활성에 유의적으로 기여하지 못한다.
[0078] (c) 이소아스파테이트의 존재 여부를 검사하기 위해, 공급자(Promega)의 추천에 따라 ISOQUANT® 이소아스파테이트 검사 키트를 이용하여 단백질 이소아스파테이트 메틸 트랜스퍼라제(PIMT: protein isoaspartate 메틸 transferase) 분석을 실시하였다. t　=　0 및 t　=　56일에서의 샘플 혼합물 뿐만 아니라 t= 56일 혼합물로부터 정제된 개별적인 샘플들을 isoAsp 펩타이드에 대해 분석하였다. 도 9는 a) 총 혼합물 및 b) b) RV　10.8의 피크로부터 소량의 isoAsp 오염에 대해 교정된 단리된 피크 RV　9.9 및 RV　10.4에서 형성된 AdoHCys/펩타이드 특이 활성을 보여준다.
제조예 B
엑세나타이드 유사체의 제조
[0079] 엑세나타이드의 Asn28을 SPPS를 이용하여 Ala, Asp, Gln 및 Lys로 치환하였다. GLP-1RA 어세이에서 모든 [Xaa28]엑세나타이드는 EC50 값이 (17- 내지 41 pM) 였는데 이는 엑세나타이드 (17 pM)에 필적하는 것이다. 이들 [Xaa28]엑세나타이드를 200 mM Pi, pH 7.4, 37℃에서 장기 인큐베이션 (~3개월)하자, [isoAsp28]엑세나타이드로 서서히 이성질체화된 [Asp28]엑세나타이드를 제외하고 이렇다할 새로운 주요 피크는 관찰되지 않았다. 낮은 펩타이드 농도(~0.2 mM)에서, 용기 표면에 비특이적 흡착과 일치하는 A280에서 작은 손실이 관찰되었다. 2 mM [Gln28] 엑세나타이드에서, 펩타이드 소실에 대한 t1/ 2은 >/= 30주 (즉, 30주 이상)으로 추정되었다. 그러므로, [Gln28] 엑세나타이드는 생리 조건 하에서 매우 안정하다. 30주의 t1/ 2은 1개월에 < 9%의 손실을 일으킬 것이다.
제조예 C
엑센딘 유사체의 시험관내 수용체 결합 및 활성
[0080] GLP-1 수용체를 활성화시키는 다양한 엑세나타이드 유사체의 능력을 cAMP 분석법 (GLP1R cAMP HunterTM 바이오어세이(DiscoverX))을 이용하여 분석하였다. N28D, N28A, N28K, 및 N28Q 유사체들은 엑세나타이드에 필적할만한 능력을 갖는 것으로 밝혀졌다.
Figure pct00011
[0081] 분해 산물의 혼합물(도 8A, 56일)을 cAMP 분석법으로 시험하자, 출발 엑세나타이드(도 8A, 0일)에 동등한 EC50을 가졌다. 마찬가지로, 상기 혼합물로부터 정제된 추정 [IsoAsp]28- 및 [Asp]28엑세나타이드와 합성 [Asp]28엑세나타이드는 엑세나타이드와 유사한 EC50 값을 나타내었다. 그러나, ELISA 분석(Peninsula Lab)으로 시험하자, 단리된 탈아미드화 생성물과 합성 [N28D]-엑세나타이드는 크게 감소된 친화성을 나타내었다(EC50 엑세나타이드, 0.2　nM; N28A　=　6　nM; N28Q　=　10　nM; N28D　>　100　nM; N28K　>　100　nM). 따라서, 주요 분해 산물은 엑세나타이드와 동등한 작용제 활성을 가졌으나 혈청 엑세나타이드에 사용된 LC-MS/MS 또는 ELISA 분석으로는 측정되지 않을 것이다.
제조예 D
분해가능한 마이크로스피어의 제조
마크로모노머 A의 제조
[0082] (a) 아세토니트릴 5 mL 중 1-(비스-(2-메톡시에틸)아미노설포닐)-7-아지도-2-헵틸 숙신이미딜 카르보네이트 (WO2013/036847에 설명된 방법을 이용하여 제조됨: 1.12　mmol)의 용액을 10 mL의 물 및 5 mL의 아세토니트릴 중 H-Lys(Boc)-OH (300　mg, 1.22　mmol) 및 NaHCO3 (420　mg, 5.0　mmol)의 용액에 첨가하였다. 0.5 시간 후, 용액을 진공 농축하여 아세토니트릴을 제거하고, 1　N HCl로 산성화시킨 다음, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 추출물을 물과 식염수로 세척한 다음 MgSO4로 건조, 여과 및 증발시켜 조질의 Na-[1-(비스-(2-메톡시에틸)아미노설포닐)-7-아지도-2-헵틸옥시)카르보닐]-Ne-(BOC)-라이신 ("아지도-링커[mod]-Lys(Boc)-OH")을 얻었다.
[0083] 이 방법에 따라 아지도-링커[mod]-Lys(Boc)-OH를 제조하였으며 여기서 조절제는 비스(2-메톡시에틸)아미노설포닐, 디메틸아미노설포닐, 시아노, 메틸설포닐, 4-메틸피페리디닐설포닐, 모르폴리노설포닐 또는 페닐설포닐이다.
[0084] (b) 전술한 조질의 아지도-링커[mod]-Lys(Boc)-OH를 25 mL의 CH2Cl2에 용해시키고 N-히드록시숙신이미드 (138　mg, 1.2　mmol) 및 디시클로헥실카르보디이미드 (자일렌 중 60 중량% 용액 0.5 mL)로 2 시간 동안 처리하였다. 혼합물을 여과하고 헥산 중 아세톤 구배를 이용하여 SiO2 상에서 크로마토그래피 처리하여 숙신이미딜 에스테르 아지도-링커[mod]-Lys(Boc)-OSu를 얻었다.
[0085] 이 방법에 의하여 아지도-링커[mod]-Lys(Boc)-OSu가 얻어졌으며 여기서 조절제는 비스(2-메톡시에틸)아미노설포닐, 디메틸아미노설포닐, 시아노, 메틸설포닐, 4-메틸피페리디닐설포닐, 모르폴리노설포닐 또는 페닐설포닐이다.
[0086] (c) N,N-디이소프로필에틸아민 (80　mM, 0.8　mmol, 2　당량)을 함유하는 아세트니트릴 (10　mL, 200　mg/mL, 40　mM 아민, 0.4　mmol, 1 당량) 중 20-kDa 4-아암 PEG-테트라아민 용액을, 아세토니트릴 (3.3　mL, 145.5　mM, 0.48　mmol, 1.2　당량) 중 아지도-링커[mod]-Lys(Boc)-OSu 용액으로 처리하였다. 얻어진 혼합물을 실온에서 1 시간 유지한 다음, 이어서 표품으로서 PEG-테트라아민을 이용하여 TNBS 분석법에 의해 아민 함량에 대해 0.010　mL 샘플을 평가하였다; 일반적으로 출발 아민의 <1%가 잔류한다. 이어서 반응물을 무수 아세트산(40.8　mg, 0.0378　mL, 0.4　mmol, 1　당량)으로 15분간 처리한 다음 진공 농축시켜 점성 시럽 (~4　mL)을 얻고 이것을 MTBE (350　mL)에 서서히 첨가하였다. 얻어진 현탁액을 1 시간 교반한 다음, 침전물을 여과에 의해 회수하고, MTBE (150　mL)로 세척한 다음 진공 건조시켜 마크로모노머　A를 백색 고체로서 수득하였다.
[0087] 이 방법에 따라 마크로모노머　A가 제조되었으며 여기서 조절제는 비스(2-메톡시에틸)아미노설포닐, 디메틸아미노설포닐, 시아노, 메틸설포닐, 4-메틸피페리디닐설포닐, 모르폴리노설포닐 또는 페닐설포닐이다.
마크로모노머 B의 제조
[0088] 4-mL, 스크류 톱 바이얼에 PEG20kDa-[NH2]4 (SunBright PTE-200PA; 150　mg, 7.6　μmol PEG, 30.2　μmol NH2, 1.0 당량, 20　mM 최종 아민 농도), MeCN (1.5　mL), 및 iPr2NEt (7　μL, 40　μmol, 1.3　당량, 27　mM 최종 농도)를 채웠다. 활성화된 에스테르 시클로옥틴 (39　μmol, 1.3　당량, 27　mM 최종 농도) 용액을 첨가하고 반응 혼합물을 주변 온도에서 교반하였다. ELSD에 의해 C18 HPLC (20-80%B 11분간)에 의해 반응을 모니터링하였다. 완결시, Ac2O (3　μL, 30　μmol, 출발 NH2 당 1 당량)를 반응 혼합물에 첨가하고 이 혼합물을 30분간 교반하였다. 이어서 반응 혼합물을 진한 오일이 되도록 농축하고 MTBE (20　mL)에 현탁시켰다. 얻어진 현탁액을 10분간 격렬히 교반하였다. 얻어진 고체를 격렬한 혼합에 의해 MTBE (20　mL)와 함께 3회 분쇄하고, 원심분리(2800　rpm, 4℃, 10분)로 펠릿화한 다음 피펫팅에 의해 상등액을 제거하였다. 얻어진 고체를 주변 온도에서 30분 이하의 기간 동안 진공 건조시켰다. 표적 아민 농도 20 mM의 스톡 용액이 20　mM NaOAc (pH　5)에서 제조되었다. 이어서 시클로옥틴 농도를 PEG7-N3 (2　당량) 및 미반응 PEG7-N3의 DBCO-CO2H를 이용한 백-분쇄(back-titration) 처리에 의해 검정하였다.
[0089] 이 공정을 이용하여 제조된 마크로모노머에는 시크로옥틴기가 MFCO, 5-히드록시시클로옥틴, 3-히드록시시클로옥틴, BCN, DIBO, 3-(카르복시메톡시)시클로옥틴, 및 MFCO 펜타플루오로페닐 에스테르를 이용하여 제조된 3-(2-히드록시에톡시)시클로옥틴, 5-((4-니트로페녹시-카르보닐)옥시)시클로옥틴, 3-(4-니트로페녹시카르보닐)옥시시클로옥틴, BCN 히드록시숙신이미딜 카르보네이트, DIBO 4-니트로페닐 카르보네이트, 3-(카르복시메톡시)시클로옥틴 숙신이미딜 에스테르 또는 3-(히드록시에톡시)시클로옥틴 4-니트로페닐 카르보네이트가 포함된다.
제조예 E
도 1A의 설명적 하이드로겔의 제조
[0090] 유도화된 8-아암 마크로모노머 P는 다음과 같이 제조한다: 마크로모노머 P는 각각의 아암이 시클로옥틴으로 종결된 8-아암 PEG이다. 2 mL의 DMF 중 200 mg의 40-kDa 8-아암 PEG-아민*HCl (JenKem Technologies; 40 umol NH2), 20 mg의 BCN p-니트로페닐 카르보네이트 (SynAffix; 63 umol), 및 20 uL의 N,N-디이소프로필에틸아민 (115 umol) 용액을 주변 온도에서 16 시간 굡나하였다. 0.1 M KPi 중 100 mM 타우린 0.5 mL로 pH 7.5 에서 1 시간 켄칭한 후, 혼합물을 물, 1:1 메탄올/물 및 메탄올에 대해 순차적으로 12-kDa 막을 이용하여 투석하였다. 증발 후, 잔사를 2 mL의 THF에 용해시키고 10 mL의 메틸 t-부틸 에테르로 침전시켰다. 생성물을 수집 및 건조(190 mg)시켰다. 다른 시클로옥틴을 함유하는 마크로모노머 P는 적절한 활성화 시클로옥틴을 이용함으로써 유사하게 제조할 수 있다.
[0091] 유도화된 4-아암 마크로모노머 T는 다음과 같이 제조한다: T는 4-아암 PEG를 포함하되 이들 각 아암은 방출가능한 링커-아지드로 종결되어 있다. 1 mL의 ACN 중 아지도-링커-숙신이미딜 카르보네이트 (WO2013/036847에 설명된 방법을 이용하여 제조됨) 25 umol 용액을 40 uL의 1.0 M NaHCO3 (40 umol) 및 1 mL의 물 중 20-kDa 4-아암 PEG-아민 염산염 (펜타에리쓰리톨 코어, JenKem Technologies) 5 umol (100 mg)의 믹스에 첨가하였다. 주변 온도에서 1 시간 후 용액을 1 L의 50% 메탄올 이어서 1 L의 메탄올에 대해 투석하였다(12-14 k MWCO). 증발 후, 잔사(109 mg)를 2.12 mL의 멸균-여과된 10 mM NaOAc, pH 5.0에 용해시키고 -20℃에서 보관하였다. DBCO와의 반응에 의해 구해진 아지드 농도는 9.5 mM였다. 별도 조절제를 갖는 링커-아지드를 포함하는 마크로모노머 T는 적절한 아지드-링커-숙신이미딜 카르보네이트를 이용함으로써 유사하게 제조할 수 있다.
[0092] 펩타이드-방출 하이드로겔은 유도화된 마크로모노머로부터 적어도 2 가지 다른 방식으로 제조될 수 있다.
[0093] (a) 일 구체에에서, 링커-펩타이드는 불용성 하이드로겔 매트릭스의 형성에 앞서 마크로모노머 P에 부착된다. 본 명세서의 실시예 1에 설명된 것과 같은 화학식 (4)의 아지도-링커-펩타이드를 화학양론적 양으로 마크로모노머 P와 혼합하여 P의 아암들의 일부 분획이 링커-펩타이드로 유도화되도록 한다. 이어서 결과적인 물질을 충분한 마크로모노머 T를 이용하여 가교시켜 P의 나머지 아암들을 T의 아암들과 반응시킴으로써 불용성 매트릭스를 형성시킨다. 적절한 용매, 일반적으로 완충된 수성 매질에서 화학식 (4)의 아지도-링커-펩타이드 n 몰을 n/(8f) 몰의 마크로모노머 P와 혼합한다 [여기서 f = 아암의 소망되는 링커-펩타이드 분획 로딩율이다. (즉, 아암 로딩율이 50%인 경우, f = 0.5임)]. 아지도-링커-펩타이드가 충분한 시간 동안 반응하도록 한 후, 결과적인 용액을 n(1/f - 1)/4 몰의 마크로모노머 T와 반응시켜 불용성 하이드로겔 매트릭스를 형성시킨다. 일반적으로, f는 하이드로겔 매트릭스 내 각 P 잔기에 대해 > 3개의 가교된 아암이 존재하도록 선택된다 (f < 0.625). 불용성 하이드로겔 매트릭스를 형성하기 위한 가교 반응은 벌크 재료로서 또는 현탁액이나 에멀젼으로서 수행되어 미세-분할된 미립자상 폴리머, 예컨대 본 명세서 실시예 2에 설명된 바와 같은 마이크로스피어를 형성하도록 할 수 있다.
[0094] (b) 별법으로, 불용성 하이드로겔 매트릭스는 링커-펩타이드의 부착 전에 제조될 수 있다. 매트릭스 내 각 P 마이크로모노머 잔기 당 8f 단량의 링커-펩타이드를 포함하는 최종 하이드로겔의 경우, 불용성 하이드로겔 매트릭스는 n/(8f) 몰의 마크로모노머 P와 n(1/f - 1)/4 몰의 마크로모노머 T와의 반응에 의해 형성된다. 불용성 하이드로겔 매트릭스를 형성하기 위한 가교 반응은 벌크 재료로서 또는 현탁액이나 에멀젼으로서 수행되어 미세-분할된 미립자상 폴리머, 예컨대 본 명세서 실시예 2에 설명된 바와 같은 마이크로스피어를 형성하도록 할 수 있다. 이어서 중합된 매트릭스를 적어도 n 몰의 화학식 (4)의 아지도-링커-펩타이드 용액과 반응시켜, 링커-펩타이드가 매트릭스에 공유결합되도록 한다. 미반응 아지도-링커-펩타이드는 매트릭스로부터 씻껴나가 펩타이드-방출 하이드로겔이 제공된다.
실시예 1
화학식 ( 4)의 아지도 -링커-[ N28Q ] 엑세나타이드의 제조
여기서 R1　=　CN 또는 MeSO2; R2　=　H; 하나의 R5= H이고 다른 R5　=　(CH2)5N3; P　=　N α -[N28Q]엑세나타이드임
[0095] Symphony® 펩타이드 합서기 상에서 Chemmatrix® Rink 아미드 수지(0.5　meq/g)를 이용하여 표준 고상 방법론에 따라 펩타이드를 합성하였다. 주변 온도에서 DMF 중 HCTU (커플링 당 4.9　당량) 및 N,N-디이소프로필에틸아민 (커플링 당 10　당량)을 이용하여 Fmoc-아미노산 (커플링 당 5 당량)을 펩타이드 사슬의 N-말단에 이중-커플링시켰다. DMF 중 20% 4-메틸피페리딘을 이용하여 Fmoc 기를 제거하였다. [N28Q]엑세나타이드를 탈보호시키고 95:2.5:2.5 트리플루오로아세트산/트리이소프로필실란/디티오트레이톨을 이용하여 수지로부터 분리시켰다.
[0096] 물(0.1% TFA) 중 30%-60% MeCN (0.1% TFA)의 선형 구배로 용리하는 Peak Scientific HiQ® 5　μ C18 컬럼 (50　x　20　mm ID)이 구비된 ShimadzuTM LC-20AD 시스템을 이용하여 조질의 [N28Q]엑세나타이드 (22 mg)를 반-제조 규모(semi-preparative scale)로 정제하였다. 분석 C18 HPLC에 의해 판단시 가장 순수한 분획을 한데 조합하여 ~40%로 농축하여 MeCN을 제거하고 동결건조시켜 [N28Q]엑세나타이드 (6.4　mg, 1.4　mmol)를 솜털같은 흰색 고체로서 얻었다. 280　nm에서 측정된 C18 HPLC 순도: 86%　순도 (RV　=　9.4 min); [N28Q]엑세나타이드; m/z　=　4200.
[0097] 앞서 설명한 방법(Schneider, E. L. et al, Biocong . Chem (2016) 1 March 온라인 사전공개)을 약간 변형시킴으로써 펩타이드의 온-레진 N-말단 카르바모일화를 수행하였으며 이를 다음에 예시하였다
[0098] N α -(7- 아지도 -1- 시아노 -2- 헵틸옥시카르보닐 )-[ Gln 28 ] 엑세나타이드.
N2 하 주변 온도에서, 중격막이 있는 125 mL 어얼렌마이어 플라스크에서, NH2[N28Q]엑세나타이드 (유리 α-아민) Chemmatrix®Rink 아미드 수지 (0.5　meq/g 치환, 0.48　mmol 펩타이드/g 펩타이드-수지, 4.00　g 펩타이드-수지, 0.48　mmol 펩타이드)를 40 mL의 DMF 내에서 가볍게 교반하였다. 이어서 팽창된 수지를 8　mL의 O-(7-아지도-1-시아노-2-헵틸)-O'-숙신이미딜 카르보네이트 (DMF, 1.44　mmol 중 18　M, 최종 30　mM) 및 4-메틸-모르폴린 (158　μL, 1.44　mmol)로 처리하였다. 반응 혼합물을 N2 하에서 가볍게 교반한 다음 진공 여과하였다. 수지를 DMF (3　x　30　mL) 및 CH2Cl2 (4　x　50　mL)로 연속 세척한 다음 고진공 하에 건조시켰다. 중간 링커-변형된 수지에서 유리 아민에 대한 카이저 테스트(Kaiser test)는 음성이었다 (3.84　g). 이어서 N2 하에 40 mL의 90:5:5 TFA:TIPS:H2O로 처리하였다. 2.5 시간 후, 수지를 진공 여과하고 TFA (2　x　10　mL)로 세척하였다. 여액을 ~20　mL로 농축하였다. TFA 농축액을 4 개의 50 mL Falcon 튜브에서 빙냉시킨 Et2O:헥산 (2:1, 160 mL)에 적가함으로써 조질의 링커-펩타이드를 침전시켰다. 얼음과 함께 30분간 인큐베이션한 후 조질의 링커-펩타이드를 원심분리 (2000 x g에서 3분)함으로써 펠릿화하고, 상등액을 따라내었다. 전술한 바와 같이 펠릿을 빙냉 Et2O:헥산 (2:1, 160　mL)으로 진탕/분쇄하고 얼음과 함께 인큐베이션하고 원심분한 다음 따라내었다. 고진공 하에서 건조시킨 후, 조질의 링커-펩타이드를 회백색 고체(1.76 g)으로서 분리한 다음 5% AcOH에 용해시켰다. 40℃에서 1 시간 가열 후, 조질의 물질을 예비 HPLC에 의해 정제하였다. MS: m/z = 4408.
[0099] O-(7-아지도-1-(메틸설포닐)-2-헵틸)-O'-숙신이미딜 카르보네이트를 이용하여 유사한 방식으로 Nα-[1-(메틸설포닐)-7-아지도-2-헵틸옥시카르보닐]-엑세나타이드를 제조하였다. MS: m/z = 4461.
Example 실시예 2
PEG 하이드로겔 마이크로스피어의 제조
[00100] 7개의 평행한 50㎛ 드롭 형성 채널을 갖는 2-시약 Telos® 소수성 유동-포커싱 마이크로유체 칩(돌로마이트)이 사용되었다. 유체 흐름은 Dolomite Microfluidics사가 제조한 Mitos 압력 펌프와 비슷한 기능의 가스-압력 구동 펌프에 의해 제어하였다. 이 펌프는 가압 가스를 사용하여 마이크로유체 칩을 통해 액체의 흐름을 유도한다. 구동 압력은 액체 유량 센서 (Sensirion, SLI-0430)의 피드백 루프를 사용하여 안정된 유속을 유지하기 위해 비례 압력 조절기 (Proportion Air, MPV 시리즈)를 사용하여 컴퓨터 제어된다. 이 유형의 유량 제어는 멀티-리터 저수조로부터 액체를 공급할 수 있도록 확장 가능하며 ~ 1% 표준 편차의 유속을 제공하고 종종 유속이 최대 20% 변동하는 시린지 펌프보다 우수하다. 이 시스템은 두 개의 하이드로겔 프리폴리머 용액과 연속상을 전달하는데 사용되었다. 전형적인 유속은 각 프리폴리머 용액에 대해 2.1 ml/h 및 연속상에 대해 14 ml/h이었다. 연속상은 1%　w/v Abil®　EM90 (Evonik) 및 1%　w/v PGPR (Danisco)을 함유하는 데칸으로 구성되었다. 장치의 아울렛 튜브를 분획 수집기 (Gilson FC203B)에 연결하고 분획을 10분 간격으로 수집하였다. 품질 관리는 칩의 7개 채널을 시각화하기 위한 자동화 스테이지가 장착된 현미경 (Nikon™, EQ-51436)에 부착된 고속 카메라 (UniBrain®, Fire I 580b)로 칩을 5배 확대 촬영하여 수행하였다. 각 채널의 이미지를 5분마다 수집하였다. 장치 고장으로 인해 큰 입자를 포함하는 분획들은 배치로부터 제거될 수 있다.
[0100] 마이크로스피어 세척은 50 mL의 Teflon® (FEP) 원심분리 튜브 (Oak Ridge, 3114 0050)에서 수행하였다. 세척 후, 마이크로스피어를 원심분리에 의해 회수하였다. 원심분리는 3000 g에서 5분간 유기상을 분리하고, 20분간 수성 상을 분리하도록 수행한다. 모든 용액과 세척 용매는 0.2um 나일론-66 필터 (Tisch, SPEC17984)를 통해 여과하였다.
[0101] 데칸 함유 계면활성제 중 마이크로유체 구동으로부터의 마이크로스피어 현탁액(30 mL)을 실온에서 24 시간 동안 경화시켰다. 데칸 층을 제거하고, 마이크로스피어를 0.1% (w/v) NaN3 수용액 (15 mL)과 펜탄 사이에 분배시켰다. 혼합물을 30분 동안 교반한 후, 원심분리에 의해 펜탄 상을 분리하였다. 그 다음, 마이크로 스피어 현탁액을 물(30 mL)로 처리하고 5회 연속 (39 mL) 분량의 펜탄으로 세척하였다. 원심분리 후, 과량의 수성상을 제거하고 멸균을 위해 마이크로스피어 슬러리를 동 부피의 50　%　w/v TFA로 30분간 처리하였다. 마이크로스피어를 1000　g에서 원심분리에 의해 회수하였다 (주: 스피어들이 TFA에서 수축되어 콤팩트한 펠릿을 형성하므로 과도한 힘은 피하여야 한다). 펠릿을 0.125　M Na2HPO4(150　mL)로 처리하여 pH　~6.5의 현탁액을 얻었다. 18 시간 팽창 후 스피어들을 원심분리하여 회수한 다음 100 mL 물로 5회, 마지막으로 100 mL의 70% 에탄올로 5회 세척하였다. 최종 농도까지 3000 g에서 30분간 슬러리를 펠릿화하였다. 상등액 흡입 후, 마이크로스피어 슬러리를 60 mL의 또 다른 시린지에 Luer 커플링에 의해 연결되어 있는 60　mL 시린지 (BD No.　309653)로 옮긴 다음 수 개의 전후 통로에 의해 균질화하여 작은 응집체들(clumps)을 분산시켰다. 슬러리가 들어있는 시린지를 사용하여 Luer 커플 링을 통해 개별 10 mL 시린지를 로딩하고 4℃에서 사용할 때까지 보관한다.
[0102] 아세토니트릴 중 0.100 mL의 아미노-마이크로스피어 슬러리를 각각의 밀도 (0.79 ± 0.2 g / mL)를 측정하기 위해 칭량한 후, 각 부분을 0.900 mL의 50 mM NaOH로 실온에서 18시간 동안 처리하여 교차결합을 절단하여 [H2N-Lys(NH2)-NH]4-PEG20kDa 모노머를 형성한다. 마이크로타이터 플레이트에서 각 샘플을 붕산 완충액 (100 mM, pH 9.3)으로 0.030 mL에서 0.120 mL로 희석하고 0.04% w/v 소듐 2,4,6 트리니트로 벤젠설포네이트를 포함하는 0.150 mL의 붕산 완충액으로 처리하여 TNBS 분석에 의해 총 아민 농도를 분석하였다. 420 nm에서의 TNBS 반응의 흡광도의 변화를 플레이트 판독기를 이용하여 25℃에서 3 시간 동안 모니터링 한 후 420 nM에서의 최종 흡광도를 기록하였다. 백그라운드 뺄셈을 위해 TNBS만을 포함하는 동등한 반응을 사용하였고 아민 농도 기준으로 40, 20 또는 10μM 리신을 포함하는 반응을 이용하였다. 마이크로스피어 다이제스트의 총 아민 농도/2는 겔의 유리-아민 함량을 제공한다.
실시예 3
시클로옥틴 - 마이크로스피어의 제조
[0103] 다음과 같이 시린지 반응 용기에서 반응을 수행한다. 2μmol 아민/mL 겔 슬러리를 함유하는 MeCN 중의 아미노-마이크로스피어의 패킹된(packed) 현탁액 각 4 mL에 MeCN 1 ㎖ 중 32 μmolDIPEA (4 당량) 및 1 mL MeCN 중 1-플루오로-2-시클로옥틴-1-카르복실레이트 펜타플루오로페닐 에스테르 (MFCO-PFP) 9.6μmol (1.2 당량)을 첨가하였다. 주변 온도에서 1시간 동안 흔들어 주면 소량(~ 50 uL)의 마이크로스피어가 시린지 아울렛으로부터 배출되고 pH ~9.3의 0.1 M 붕산나트륨 중 0.04 % w/v TNBS 0.5 mL로 (1) 30 분간 처리하였다; 강렬한 오렌지색의 출발 아미노-마이크로스피어와 비교하여 TNBS 용액과 일치하는 마이크로스피어 색상인 경우 완전한 반응을 나타낸다. 반응 후, 1 mL MeCH에 8　μmol (1 당량)의 Ac2O를 10분간 첨가함으로서 마이크로스피어를 캡핑한다. 상등액 제거 후, ~2　mL의 마이크로스피어를 제2의 10 mL 시린지로 옮기고 각 슬러리를 패킹된 슬러리 부피 당 4　x　3 볼륨 MeCN으로 세척하고 슬러리들을 한데 모았다.
실시예 4
펩타이드 -방출 PEG 하이드로겔 마이크로스피어의 제조
[0104] 실시예 1에서 제조된 아지도-링커-[N28Q]엑세나타이드의 커플링을 문헌 [Schneider, 외, 상기]에 설명된 시린지 반응 용기에서 수행하였다. 10 mL 시린지에서 30% MeCN 중 실시예 3의 MFCO-유도화된 마이크로스피어 슬러리 2.4 g(11.2　μmolMFCO)의 현탁액에 2　mL 30% MeCN 중 Nα-[1-(메틸설포닐)-7-아지도-2-헵틸옥시카르보닐]-[N28Q]엑세나타이드 46　mg (10.4　μmol)의 용액을 첨가하였다. 분주액의 OD280이 ~ 24 시간 동안 일정해질 때 까지 이 혼합물을 서서히 회전시켰다. 슬러리의 약 50%를 제2 시린지로 옮기고 두 가지 샘플 모두를 4　x　2　mL의 30% MeCN 및 이어서 5　x　5　mL의 10　mM NaPi 0.04% Tween®　20, pH　6.2으로 세척하였다. 이어서 [N28Q]엑세나타이드-로딩된 마이크로스피어를 시린지-투-시린지 방식으로 수개의 1.0mL 투약 시린지로 옮겼다. 마이크로스피어의 총 로딩량은 pH 8.4에서 방출된 총 펩타이드에 의해 결정된 바와 같이 1.9 μmol 펩타이드/gm 슬러리였다.
[0105] 마이크로스피어로부터 유리 [N28Q] 엑세나타이드의 방출은 37℃에서 OD280의 증가에 의한 가용화 후 컨쥬게이트 샘플을 pH 9.4의 0.1 M 붕산염에 현탁시킴으로서 시험관내 측정하였다 (도 5). pH 9.4에서 반감기 = 6.7 시간을 나타내는 1차 방출이 관찰되었다. 이것은 pH 7.4에서 670 시간으로 추정된다. Nα-[1-시아노-7-아지도-2-헵틸옥시카르보닐]-[N28Q]엑세나타이드가 로딩된 마이크로스피어를 유사한 방식으로 제조하였다. 이들 마이크로스피어로부터 유리 [N28Q] 엑세나타이드의 방출은 37℃에서 OD280의 증가에 의한 가용화 후 컨쥬게이트 샘플을 pH 9.4의 0.1 M 붕산염에 현탁시킴으로서 시험관내 측정하였다. pH 9.4에서 반감기 = 16.5 시간을 나타내는 1차 방출이 관찰되었다. 이것은 pH 7.4에서 1650 시간으로 추정된다.
[0106] Nα-[1-시아노-7-아지도-2-헵틸옥시카르보닐]-[N28Q]엑세나타이드 (실시예 1)을 이용하여 링커(R1　=　CN 및 R2　=　H)를 통해 [N28Q]엑세나타이드가 부착된 마이크로스피어를 유사한 방식으로 제조하였다. 최종 제제는 0.05 % Tween® 20을 함유한 등장성 아세테이트 완충액 (10 mM 아세테이트, 120 mM NaCl, pH 5.0) 중 2.2 μmol 펩타이드 gm-1을 포함하였다.
실시예 5
래트 약동학
[0107] 실시예 4에서 제조된 마이크로스피어 슬러리를 함유하는 미미한 1 mL 투약 시린지 주사기의 내용물을 27 게이지 바늘을 통해 ~350 g의 삽관된 수컷 Sprague Dawley종 래트의 옆구리에 피하 주사하였다. 각 시린지는 1.9 μmol 펩타이드 g-1 슬러리에서 0.45 또는 0.98μmol 펩타이드를 함유하였다. 투약 전후에 시린지를 칭량하여 각각의 래트에 전달된 질량을 확인하였다. 혈액 샘플 (300 μL)을 채취하고 혈청을 분석전까지 80℃에서 동결시켰다.
[0108] 엑세나타이드 농도는 제조자의 프로토콜 (Peninsula Laboratories Inc., # S-1311)에 따라 ELISA에 의해 측정하였다. 냉동 혈청 샘플을 얼음 위에서 녹여 제공된 래트 혈청에서 5배에서 20배로 희석시켰다. 표준 엑세나타이드는 EC50　=　0.22 nM (보고된 0.19　nM)을 나타내었다. 데이터 복제물을 평균내고 적절한 약물 동력학 모델에 피팅시켰다. 혈청 내 [N28Q] 엑세나타이티드 농도를 LC-MS/MS로 측정하였다.
[0109] 결과를 도 10 및 11에 도시하였다.
[0110] 도 10은 하이드로겔-결합된 것 (천연 형태의 엑세나타이드를 사용하고 R1　=　MeSO2인 것을 제외하고 실시예 4의 것과 동일함)을 투약한 후 래트에서의 엑세나타이드의 약동학을 나타낸다. 시험관내 방출 동역학 (t1/2　=　1400　h) 및 엑세나타이드의 알려진 약동학 파라미터에 기초하여 예상 농도 대 시간 곡선을 생성하였다 (점선). 실험 데이터 (사각형)는 전체 t1/2　=　190　h인 하이드로겔 (실선) 상의 엑세나타이드 분해를 설명하는 모델에 더 잘 들어맞음을 보여준다.
[0111] 도 11은 피하 투여 후 래트에서 실시예 4의 [N28Q] 엑세나타이드의 약동학을 나타낸다. 패널 A는 펩타이드가 L(R1　=　MeSO2)을 사용하여 연결되고 t1/2　=　350　h인 하이드로겔을 나타낸다. 패널 B는 펩타이드가 L(R1　=　CN)을 사용하여 연결되고 t1/2　=　 760 시간인 하이드로겔을 나타낸다. 따라서 [N28Q] 엑세나타이드의 혈장 수준은 단회 투여 후 최소한 1 개월 동안 유지 될 수 있지만 도 11의 데이터는 훨씬 짧은 t1/2를 나타낸다.
실시예 6
경구 글루코스 내성(경구 내당능 ) 시험
[0112] 엑세나타이드에 상대적으로 경구 글루코스의 볼루스에 대한 내성을 제공하는 [N28Q]엑세나타이드의 능력을 마우스에서 시험하였다. 총 54마리의 수컷 8주령 C57BL/6J 마우스들 (JanVier France)을 2주 동안 순응시킨 후 9 그룹 (n = 6)으로 계층화하였다. 제0일에, 마우스를 4 시간 동안 단식시킨 다음 t = 15 분에 피하 주사에 의해 시험 물품을 투여하고 제0분에 글루코스를 투여하였다. 혈당은 -60, -15, 0, 15, 30, 60 및 120 분에 측정되었다. 인슐린 측정을 위한 혈액 샘플을 제0분 및 제15분에 채취하였다. 결과를 도 12 및 13에 나타내었다. 엑세나타이드 및 [N28Q] 엑 세나 타이드는 경구 글루코스 내성 시험에서 유사한 활성을 보였다.
[0113] 도 12는 경구 글루코스 내성 시험에서 엑세나타이드와 [N28Q]엑세나타이드의 비교 시험 결과를 보여준다. 5가지 상이한 농도로 엑센딘-4 및 [N28Q]엑세나타이드가 -30분에 투여된 C57BL/J 마우스들에서의 경구 글루코스 내성 시험에서 엑세나타이드 및 [N28Q]엑세나타이드는 명확하고 유사한 투여량 반응을 나타내었다. 각각의 선은 비히클과의 유의차를 나타낸다. 이원 반복된 측정 ANOVA를 비히클과 대조하였다. P<0.05 Bonferroni post hoc 시험. 글루코스 볼러스는 구강 당 10ml 당 2g/kg이었다.
[0114] 도 13은 도 7에 도시된 경구 글루코스 내성 시험 데이터에 대한 AUC 분석을 나타낸다. 경구 글루코스 내성 시험 (OGTT) 후 곡선 하 면적 데이터에서 엑 세나 티드 및 [N28Q] 엑세나타이드에 대해 명확하고 유사한 투여량 반응이 관찰되었다. 일원 ANOVA, Bonferroni post hoc 시험 vs. 비히클. *** p <0.001.
실시예 7
하이드로겔 마이크로스피어 - 컨쥬게이트된 [ N28Q ] 엑세나타이드 Q4Wk 주사 vs. 엑세나타이드 연속 주입의 만성 혈당조절 효과
[0115] 6 주령의 180-200 그램짜리 수컷 Zucker 당뇨병성 지방성 쥐 (ZDF-Leprfa/Crl) 55 마리 (Charles River, USA)을 한 우리에 넣고 혈당 및 체중을 2-4주일 동안 격주로 모니터링 하였다. 아침-급식 혈당을 기준으로 이상치를 제외하고 40 마리의 당뇨병 래트 (평균 체중 340g, 혈당 9.7 내지 22.5mM, 평균 16.2mM)를 n = 10의 4 그룹으로 계층화하였다.
t = 0에서 :
그룹 I는 Alzet® 펌프 (2ML4)로 비히클을 받았다.
그룹 II는 엑세나타이드 Alzet® 펌프를 받았다 (30 μg/kg/1일, AcOH, pH 4.5).
그룹 III는 실시예 4에 설명된 약물 방출 조절제 (R1=CN)를 갖는 [N28Q]엑세나타이드, 0.37 mg 펩타이드)-하이드로겔 마이크로스피어 플러스 비히클 펌프를 피하투여 받았다;
그룹 IV는 하이드로겔 마이크로스피어-[N28Q] 엑세나타이드 (3.7mg 펩티드) 플러스 비히클 펌프를 피하투여 받았다.
[0116] 제29일, 즉 4주 OGTT로부터 2일 후, 펌프를 교체하고 하이드로겔 마이크로스피어-[N28Q] 엑세나타이드를 동일 수준으로 다시 피하투여하였다. 제56일에 펌프를 제거하고 동물을 4 주 동안 회복시켰다. 나중에 당뇨병에 걸리게 된 6 마리의 쥐에게는 제28일에 삼투압 펌프 (30　μg/kg/일, AcOH 내, pH　4.5)로 [N28Q] 엑세나타이드를 투여하고 제56일에 중단하였으며, 그 후에는 동물들을 4 주간 회복시켰다.
[0117] 체중을 -3일부터 연구 기간 내내 모니터링하였다. 식이 및 물 섭취량은 -3일에 그리고 최초 투약 후 최초 11일 동안 매일, 이어서 나머지 연구 기간 동안에는 격주로 모니터링하였다. 약동학 연구를 위해 최초 투여로부터 2일 후 이어서 주1회 채혈하였다. 최초 1회 투여로부터 2일 후 그리고 1 주일에 1 회씩 약동학 시험을 실시하였다. HbA1c는 -3일 그리고 OGTT 26 및 55전에 측정되었고, 공복 시험은 제26일에 수행되었다. OGTT를 위해, 래트를 하룻밤 반쯤(60%) 금식시킨 후 PO 글루코스 (10 mL 중 2 g/kg)을 t = 0에서 투여하였다. 글루코스 챌린지로부터 t = -60, -15, 0, 15, 30, 60 및 120분에 혈당 및 인슐린을 측정하였다. 위 배출(gastric emptying)은 OGTT와 함께 제26일에 아세트아미노펜 (100 mg/kg)을 투여하여 측정하였고, 혈중 농도는 15, 30, 60 및 120 분에 측정하였다.
[0118] 결과를 도 14A-14E에 나타내었다. 이들 도면에서, 비히클 대조군(흑색), 엑센딘-4는 30　ug/kg/일에서 피하 펌프를 이용하여 연속 주입에 의해 전달되고(분홍색), 220　nmol 펩타이드/kg로 투여되는 PL-화합물 (회색), 2200　nmol 펩타이드/kg로 투여되는 PL-화합물(청색) 및 [N28Q]엑세나타이드 유리 펩타이드는 30　ug/kg/일로 피하 펌프를 이용하여 연속 주입에 의해 전달하였다 (녹색).
[0119] 도 14A는 체중을 나타낸다.
[0120] 도 14B는 mmol/L 단위로 나타낸 혈당이다.
[0121] 도 14C는 제4주 및 제8주에 실시된 경구 글루코스 내성 시험 결과를 나타낸 것이다.
[0122] 도 14D는 제4주 및 제8주에서의 글리코실화된 헤모글로빈 HbA1c의 수준을 나타낸 것이다.
[0123] 도 14E는 시간에 대한 함수로서의 혈장 내 펩타이드 수준을 나타낸다.
[0124] [N28Q]엑세나타이드를 포함하는 하이드로겔 마이크로스피어 제제의 단회 투여는 적어도 1개월 동안 혈당을 제어하는데 효과적이었다.
실시예 8
래트 및 마우스에 있어서 하이드로겔 - 마이크로스피어 컨쥬게이트의 약동학
[0125] A. 등장성 아세테이트 (10 mM 아세트산나트륨, 143　mM NaCl) pH 5.0 0.05% Tween®20 중 실시예 4에서 제조한 [N28Q]엑세나타이드-마이크로스피어 슬러리를 멸균 조건 하에 시린지 (고정된 29　g　x　½" 바늘을 갖는 0.5 mL U-100 인슐린 시린지, BD)에 충전시켰다. 약물 방출 조절제 R1 = MeSO2를 사용하는 마이크로스피어는 1.3 μmol 펩타이드/g 슬러리를 함유하고 약물 방출 조절제 R1 = CN을 사용하는 마이크로스피어는 구는 1.4 μmol 펩타이드/g 슬러리를 함유하였다. 각 주사기의 내용물을 6 마리의 삽관된 수컷 Sprague Dawley 래트(평균 체중 270g)의 측면에 SC 투여 하였다. 각 시린지의 내용물을 6마리의 삽관된 Sprague Dawley 래트 (평균 체중 270 g)의 측면에 SC 투여하였다.
[0126] 바늘 어셈블리를 공기로 정화하고 투약 전후에 칭량하여 각 래트에 전달된 슬러리의 질량을 구하였다: MeSO2 조절제의 경우 0.7　mg 펩타이드 (170　nmol)를 함유하는 130　mg 슬러리를 각 래트에 투여하고, CN 조절제의 ㄱ경우 2.5　mg 펩타이드 (580　nmol)를 함유하는 400　mg 슬러리를 투여하였다.
[0127] 두 가지 링커 모두에 있어서 혈액 샘플 (300　μL)을　0, 1, 2, 4, 8, 24, 48, 72, 120, 168, 240, 336, 432, 504, 600, 672시간에 채혈하고 CN 조절제가 있는 링커의 경우 부가적인 샘플을 840, 1008, 1176, 1344, 1512, 1680, 1848, 및 2016　시간에 얻었다. 혈청을 준비하여 분석 전까지 -80℃에서 보관하였다. 혈청 [N28Q]엑세나타이드를 LC/MS/MS에 의해 분석하였다.
[0128] 결과를 도 15A 및 15B에 도시하였다. 도 15A는 약물 방출 조절제 R1　=　MeSO2 (170　nmol [N28Q]엑세나타이드/래트 또는 2.6　mg/kg)가 있는 하이드로겔-[N28Q]엑세나타이드 마이크로스피어를 주사한 후의 결과를 나타낸다; t1/ 2,β은 310　시간이었다. 도 15B는 약물 방출 조절제 R1　=　CN (600　nmol [N28Q]엑세나타이드/래트 또는 8.9　mg/kg)가 있는 하이드로겔-[N28Q]엑세나타이드 마이크로스피어를 주사한 후의 결과를 나타낸다; t1/2,β은 880　시간이었다. 오차막대는 ±SEM이다.
[0129] B. 마우스에 필요한 소량의 마이크로스피어는 정확한 투약을 위해 희석제를 필요로 한다. 이중 시린지-기반 반응 용기 {Schneider, 2016 #24}를 이용하여, [N28Q]엑세나타이드-마이크로스피어 슬러리 (약물-방출 조절제 R1　=　MeSO2의 경우 ~ 1 mL, R1　=　CN의 경우 4　mL)의 완충액을 등장성 아세테이트 pH　5.0 (10　mM NaOAc, 143　mM NaCl), 25% 글리세롤 및 0.05% Tween®　20 용액으로 무균적으로 교체하였다. 이 희석제는 투약 전 및 투약 동안 마이크로스피어를 균질한 현탁액으로 유지시키는 역할을 하며 간편한 부피로 투약하게 해준다. 이어서 슬러리를 동일한 혼합물로 희석하여 264　nmol 펩타이드/mg 슬러리 (R1　=　MeSO2) 또는 720　nmol 펩타이드/mg 슬러리 [R1　=　CN)를 얻었다. 무균 조건 하에 현탁 마이크로스피어를 시린지 (고정형 29　g　x ½" 바늘을 갖는 0.5　mL U-100 인슐린 시린지, BD)에 충전하였다. 각 시린지의 바늘 어셈블리를 공기로 정화하고 투약 전후에 칭량하여 각 마우스에 전달된 슬러리의 평균 질량을 구하였다.
[0130] R1　=　MeSO2의 경우, 130　ug 펩타이드 (30　nmol)를 함유하는 120　mg의 슬러리를 각각의 18 CD-1 마우스 (평균 중량 30　g) 옆구리에 SC 투여하였다. 혈액 샘플 (100　μL)을 8, 24, 48, 72, 96, 120, 168, 240, 336, 408, 504, 576 및 672 시간에 안와 부비동으로부터 엇갈린 일정으로 채취하여 각 시점에서 6개의 복제물을 만들고, 각 혈청을 준비하였다. R1　=　CN의 경우, 605 μg의 펩타이드 (144 nmol)를 함유하는 200 mg의 슬러리를 마찬가지로 24마리의 CD-1 마우스에 SC 투여하였다. 혈액 샘플 (100 μL)을 상기와 같은 시간에 안와 부비동으로부터 그리고 840, 1008, 1176, 1344, 1512, 1680, 1848, 및 2016 시간에 엇갈린 일정으로 채취하여 각 시점에서 6개의 복제물을 만들었다. 혈청을 준비하고 분석할 때까지 -80℃에서 동결시켰다. 혈청 [N28Q]엑세나타이드를 LC/MS/MS로 분석하였다.
[0131] 혈청 샘플을 3 vol의 ACN으로 처리하고 원심분리하였다. 상등액을 건조, 재조성하여 HPLC MS/MS 시스템에 적용하였다. 샘플을 0.1% 포름산을 함유하는 물/ACN 구배에 의해 용리시켰다. [N28Q]엑세나타이드에 대한 보정 곡선은 0.25-100 ng/mL 범위에서 선형이었다. HPLC-MS/MS 분석은 Shimadzu HPLC 시스템과 결합된 Sciex 5500 QTrap® 질량 분석기에서 수행하였다. Shimadzu HPLC 시스템은 두 개의 LC-30AD HPLC 펌프와 100 μL 루프가 설치된 SIL-30AC 자동 샘플러로 구성된다. 크로마토그래피 분리는 이동상 구배를 갖는 3 μm C18, 2.1 x 50 mm HPLC 컬럼 상에서 달성되었다. 질량 분광계는 양의 전기 분무 이온화 모드에서 작동되었으며 사용 된 분해능 설정은 Q1 및 Q3 모두에 대한 단위였다. 다중-반응 모니터링 (MRM) 전이는 [N28Q] 엑세나타이드의 경우 m/z = 841.1> 396.3이었다. Sciex의 Analyst 소프트웨어 (버전 1.5.2)를 사용하여 피크-면적 통합을 수행하였다.
[0132] 그 결과를 도 16A 및 16B에 나타내었다. 도 16A는 약물 방출 조절제 R1　=　MeSO2 (30 nmol [N28Q]엑세나타이드/마우스 또는 4.2 mg/kg)를 갖는 하이드로겔-[N28Q]엑세나타이드 마이크로스피어를 주입한 후의 결과를 나타낸다. 도 16B는 약물 방출 조절제 R1　=　CN (144　nmol [N28Q]엑세나타이드/마우스 또는 20.2　mg/kg)를 갖는 하이드로겔-[N28Q]엑세나타이드 마이크로스피어를 주입한 후의 결과를 나타낸다. 초기 포인트는 흡수상 동력학을 계산하기에 불충분했으며, β-상을 맞추는데 사용되지 않았다. 오차 막대는 ± SEM이다.
[0133] 1/SD2에 의한 가중치를 갖는 eq X (텍스트)의 비선형 회귀에 의해 GraphPad Prism을 사용하여 C 대 t 곡선 (텍스트)을 분석하였다; ka　>>k1 이래 본 발명자들은 처음 며칠 이후에 데이터 포인트를 사용하여 터미널 반감기의 단일 지수 위상을 모델링하였다.
Figure pct00012
SEQUENCE LISTING <110> PROLYNX LLC SCHNEIDER, Eric L. HEARN, Brian HENISE, Jeffrey C. ASHLEY, Gary W. SANTI, Daniel V. <120> EXTENDED RELEASE CONJUGATES OF EXENATIDE ANALOGS <130> 670572001640 <140> PCT/US2017/022791 <141> 2017-03-16 <150> US 62/416,058 <151> 2016-11-01 <150> US 62/309,330 <151> 2016-03-16 <160> 12 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> AMIDATION <222> 39 <223> modified to have NH2 <400> 1 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 2 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> AMIDATION <222> 39 <223> modified to have NH2 <400> 2 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Gln Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 3 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> AMIDATION <222> 39 <223> modified to have NH2 <400> 3 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Ala Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 4 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> AMIDATION <222> 39 <223> modified to have NH2 <400> 4 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Lys Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 5 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> AMIDATION <222> 39 <223> modified to have NH2 <400> 5 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asp Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 6 <211> 43 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> AMIDATION <222> 43 <223> modified to have NH2 <400> 6 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Gly Gly Pro Ser Ser 20 25 30 Gly Ala Pro Pro Ser Lys Lys Lys Lys Lys Lys 35 40 <210> 7 <211> 44 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> AMIDATION <222> 44 <223> modified to have NH2 <400> 7 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Gln Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Ser Lys Lys Lys Lys Lys Lys 35 40 <210> 8 <211> 44 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> AMIDATION <222> 44 <223> modified to have NH2 <400> 8 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Ala Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Ser Lys Lys Lys Lys Lys Lys 35 40 <210> 9 <211> 44 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> AMIDATION <222> 44 <223> modified to have NH2 <400> 9 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Lys Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Ser Lys Lys Lys Lys Lys Lys 35 40 <210> 10 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> AMIDATION <222> 40 <223> modified to have NH2 <400> 10 Glu Leu Val Asp Asn Ala Val Gly Gly Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu 1 5 10 15 Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Gln Gly Gly Pro 20 25 30 Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 40 <210> 11 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> AMIDATION <222> 30 <223> modified to have NH2 <220> <221> VARIANT <222> 2, 29 <223> Xaa = Aib <400> 11 His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Xaa Arg 20 25 30 <210> 12 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 12 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly 20 25 30

Claims (25)

  1. 복수개의 공유결합된 링커-작용제 펩타이드와 함께 불용성 매트릭스를 포함하는 GLP-1 작용제의 서방형 컨쥬게이트로서, 링커는 생리적 조건의 pH 및 온도에서 절단되어 유리 펩타이드 작용제를 방출하고 상기 링커-작용제 펩타이드의 작용제 펩타이드는 생리적 조건의 pH 및 온도에서 1개월 이상 동안 10% 미만의 분해를 나타내는 상기 GLP-1 작용제인 것인 서방형 컨쥬게이트.
  2. 제1항에 있어서, 다음 식을 갖는 것인 서방형 컨쥬게이트:
    M-(L-E)x
    식 중 M은 불용성 매트릭스이고; L은 37℃, pH　7.4에서 절단 반감기가 320 내지 2400 시간인 절단가능한 링커이며; 및 E는 pH　7.4,　37℃에서 1개월 후 10% 미만의 화학적 분해를 나타내는 GLP-1 작용제이고 x는 매트릭스가 차지하는 부피 1 ml 당 1-1000 mg 펩타이드 농도를 제공하는데 필요한 L-E 유닛의 개수를 나타내는 정수이다.
  3. 제1항에 있어서, GLP-1 작용제는 천연 엑센딘 서열의 N28에 대응하는 위치에서 아미노산 치환을 포함하는 안정화된 엑센딘으로서 상기 천연 엑센딘은 SEQ　ID　NO:1 또는 SEQ　ID　NO:7로 구성되는 것인 서방형 컨쥬게이트.
  4. 제3항에 있어서, GLP-1 작용제는 N29D, N28A, N28K 또는 N28Q 치환된 SEQ　ID　NO:1 또는 SEQ　ID　NO:7인 것인 서방형 컨쥬게이트.
  5. 제4항에 있어서, GLP-1 작용제는 SEQ　ID　NO:2 또는 SEQ ID NO:8인 것인 서방형 컨쥬게이트.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 하나의 항에 있어서, 불용성 매트릭스는 가교제에 의해 커플링된 생분해성의 가교된 하이드로겔 포함 폴리머인 것인 서방형 컨쥬게이트.
  7. 제6항에 있어서, 하이드로겔은 생분해성의 가교된 폴리(에틸렌 글리콜)인 것인 서방형 컨쥬게이트.
  8. 제6항에 있어서, 하이드로겔은 마이크로스피어의 형태인 것인 서방형 컨쥬게이트.
  9. 제6항에 있어서 하이드로겔을 포함하는 폴리머는 베타 제거에 의해 절단되는 가교제에 의해 가교되는 것인 서방형 컨쥬게이트.
  10. 제9항에 있어서, 하이드로겔에 포함된 상기 가교제는 다음 화학식 (1)을 갖는 것인 서방형 컨쥬게이트:
    Figure pct00013

    식 중 m은 0 또는 1; 및
    X 및 R1, R2 및 R5 중 어느 하나 각각은 하이드로겔에 함유된 폴리머에 커플링되며,
    단, R1 및 R2 중 적어도 하나는 CN; NO2;
    선택적으로 치환된 아릴;
    선택적으로 치환된 헤테로아릴;
    선택적으로 치환된 알케닐;
    선택적으로 치환된 알키닐;
    COR3 또는 SOR3 또는 SO2R3
    [여기서 R3는 H 또는 선택적으로 치환된 알킬;
    각각 선택적으로 치환된 아릴 또는 아릴알킬;
    각각 선택적으로 치환된 헤테로아릴 또는 헤테로아릴알킬;　또는
    OR9 또는 NR9 2로서 여기서 각각의 R9는 독립적으로 H 또는 선택적으로 치환된 알킬이거나, 또는 두 개의 R9 기는 모두 이들이 결합한 질소와 함께 헤테로시클릭 고리를 형성함];
    SR4
    [여기서 R4는 선택적으로 치환된 알킬;
    각각 선택적으로 치환된 아릴 또는 아릴알킬; 또는
    각각 선택적으로 치환된 헤테로아릴 또는 헤테로아릴알킬임];
    R1 및 R2는 합쳐서 3-8원 고리를 형성하고; 및
    여기서 임의의 나머지 R1 및 R2는 H이거나 또는 각각 선택적으로 치환된 알킬, 아릴알킬 또는 헤테로아릴알킬이고; 및
    임의의 나머지 R5는 독립적으로 H이거나 또는 각각 선택적으로 치환된 알킬, 알케닐알킬, 알키닐알킬, (OCH2CH2)p O-알킬(여기서 p=1-1000), 아릴, 아릴알킬, 헤테로아릴 또는 헤테로아릴알킬; 또는
    상기 가교제는 하이드로겔에 함유된 경우 화학식 (2)를 갖는 것이고
    Figure pct00014

    식 중 R1, R2 및 R5 중 두 가지는 하이드로겔에 함유된 폴리머에 커플링되고;
    m은 0-1;
    n은 1-1000;
    s는 0-2;
    t는 2,4, 8, 16 또는 32;
    Q는 원자가(valency) t를 갖는 코어 기이고;
    W는 O(C=O)O, O(C=O)NH, O(C=O)S,
    Figure pct00015
    , 또는
    Figure pct00016
    이며;
    여기서 R6는 H, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 아릴, 선택적으로 치환된 헤테로아릴, 선택적으로 치환된 아릴알킬, 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴알킬이고;
    단 R1 및 R2 중 적어도 하나는 CN; NO2;
    선택적으로 치환된 아릴;
    선택적으로 치환된 헤테로아릴;
    선택적으로 치환된 알케닐;
    선택적으로 치환된 알키닐;
    COR3 또는 SOR3 또는 SO2R3
    [여기서 R3는 H 또는 선택적으로 치환된 알킬;
    각각 선택적으로 치환된 아릴 또는 아릴알킬;
    각각 선택적으로 치환된 헤테로아릴 또는 헤테로아릴알킬;　또는
    OR9 또는 NR9 2로서 여기서 각각의 R9은 독립적으로 H 또는 선택적으로 치환된 알킬이거나, 또는 두 개의 R9 기는 양자 모두 이들이 결합한 질소와 함께 헤테로시클릭 고리를 형성함];
    SR4
    [여기서 R4는 선택적으로 치환된 알킬;
    각각 선택적으로 치환된 아릴 또는 아릴알킬; 또는
    각각 선택적으로 치환된 헤테로아릴 또는 헤테로아릴알킬임;
    R1 및 R2는 한데 합쳐서 3-8원 고리를 형성할 수 있고; 및
    여기서 임의의 나머지 R1 및 R2는 H이거나 또는 각각 선택적으로 치환된 알킬, 아릴알킬 또는 헤테로아릴알킬이며; 및
    임의의 나머지 R5는 독립적으로 H이거나 또는 각각 선택적으로 치환된 알킬, 알케닐알킬, 알키닐알킬, (OCH2CH2)p O-알킬(여기서 p=1-1000), 아릴, 아릴알킬, 헤테로아릴 또는 헤테로아릴알킬이다.
  11. 제2항에 있어서, L은 다음 화학식 (3)을 갖는 링커인 것인 서방형 컨쥬게이트:
    Figure pct00017

    식 중 R1 및 R2 중 적어도 하나 또는 양자 모두는 독립적으로 CN; NO2;
    선택적으로 치환된 아릴;
    선택적으로 치환된 헤테로아릴;
    선택적으로 치환된 알케닐;
    선택적으로 치환된 알키닐;
    COR3 또는 SOR3 또는 SO2R3
    [여기서 R3는 H 또는 선택적으로 치환된 알킬;
    각각 선택적으로 치환된 아릴 또는 아릴알킬;
    각각 선택적으로 치환된 헤테로아릴 또는 헤테로아릴알킬이거나; 또는 R3는 OR9 또는 NR9 2로서, 여기서 각각의 R은 독립적으로 H 또는 선택적 으로 치환된 알킬, 또는 두 개의 R9기는 모두 이들이 결합한 질소와 함 께 헤테로시클릭 고리를 형성함]
    SR4
    [여기서 R4는 선택적으로 치환된 알킬;
    각각 선택적으로 치환된 아릴 또는 아릴알킬; 또는
    각각 선택적으로 치환된 헤테로아릴 또는 헤테로아릴알킬임];
    R1 및 R2는 함께 3-8원 고리를 형성할 수 있고; 및
    R1 및 R2 중 오직 하나만이 H 또는 각각 선택적으로 치환된 알킬, 아릴알킬 또는 헤테로아릴알킬일 수 있고;　및
    R5 중 하나는 (CH2)yZ, (CH2CH2O)xCH2CH2Z 또는 (CH2)yNH-CO-(CH2CH2O)x CH2CH2Z이고 [여기서 x는　1-100, y　=　1-6임] 또 다른 R5는 H, 각각 선택적으로 치환된 알킬, 알케닐알킬, 알키닐알킬, 아릴, 아릴알킬, 헤테로아릴 또는 헤테로아릴알킬이며; 및
    Z*는 불용성 매트릭스에 대한 커플링을 나타낸다.
  12. 제11항에 있어서, R1은 CN 또는 R3SO2이고, 여기서 R3은 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 아릴, 선택적으로 치환된 헤테로아릴, 또는 (R9)2N이며 여기서 각 R9은 독립적으로 H 또는 선택적으로 치환된 알킬이며;
    R5 중 하나는 (CH2)yZ*, (CH2CH2O)xCH2CH2Z* 또는 (CH2)yNH-CO-(CH2CH2O)x CH2CH2Z*이고 (여기서 x는　1-100, y　=　1-6임), 또 다른 R5는 H 또는 비치환 알킬인 것인 서방형 컨쥬게이트.
  13. 제12항에 있어서, R1은 CN 또는 CH3SO2; R2는 H; R5 중 하나는 (CH2)nZ* (여기서 y는　5임); 또 다른　R5는 H인 것인 서방형 컨쥬게이트.
  14. 제6항에 있어서, 링커-작용제 펩타이드는 가교제에 공유적으로 커플링되는 것인 서방형 컨쥬게이트.
  15. 다음 화학식 (4)의 화합물
    Figure pct00018

    식 중 E는 37℃, pH 7.4에서 1개월 후 10% 미만의 화학적 분해를 나타내는 GLP-1 작용제이고,
    식 중, R1 및 R2 중 적어도 하나 또는 두 개 모두는 독립적으로 CN; NO2;
    선택적으로 치환된 아릴;
    선택적으로 치환된 헤테로아릴;
    선택적으로 치환된 알케닐;
    선택적으로 치환된 알키닐;
    COR3 또는 SOR3 또는 SO2R3
    [여기서 R3는 H 또는 선택적으로 치환된 알킬;
    각각 선택적으로 치환된 아릴 또는 아릴알킬;
    각각 선택적으로 치환된 헤테로아릴 또는 헤테로아릴알킬; 또는 R3는
    OR9 또는 NR9 2이고 여기서 각각의 R은 독립적으로 H 또는 선택적으로 치환된 알킬, 또는 두 개의 R9기는 이들이 결합한 질소와 함께 헤테로시클릭 고리를 형성함];
    SR4
    [여기서 R4는 선택적으로 치환된 알킬;
    각각 선택적으로 치환된 아릴 또는 아릴알킬; 또는
    각각 선택적으로 치환된 헤테로아릴 또는 헤테로아릴알킬임];
    여기서 R1 및 R2는 결합하여 3-8원 고리를 형성할 수 있고; 및
    여기서 R1 및 R2 중 오직 하나는 H 또는 각각 선택적으로 치환된 알킬, 아릴알킬 또는 헤테로아릴알킬이며; 및
    여기서 R5 중 하나는 (CH2)yZ, (CH2CH2O)xCH2CH2Z 또는 (CH2)yNH-CO-(CH2CH2O)x CH2CH2Z이고(여기서 x는　1-100, y　=　1-6임) 또 다른 R5는 H, 각각 선택적으로 치환된알킬, 알케닐알킬, 알키닐알킬, 아릴, 아릴알킬, 헤테로아릴 또는 헤테로아릴알킬이며;
    Z는 상기 불용성 매트릭스에 대한 커플링을 위한 관능기이다.
  16. 제15항에 있어서, 상기 관능기는 N3, NH2, NH-CO2 tBu, SH, StBu, 말레이미드, CO2H, CO2 tBu, 1,3-디엔, 시클로펜타디엔, 퓨란, 알킨, 시클로옥틴, 아크릴레이트, 아미노옥시, 케토 또는 아크릴아미드인 것인 화합물.
  17. 제15항에 있어서, R1은 CN 또는 R3SO2이고 여기서 R3은 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 아릴, 선택적으로 치환된 헤테로아릴, 또는 (R9)2N이며, 각각의 R9은 독립적으로 H 또는 선택적으로 치환된 알킬이고;
    R5 중 하나는 (CH2)yZ, (CH2CH2O)xCH2CH2Z 또는 (CH2)yNH-CO-(CH2CH2O)x CH2CH2Z (여기서 x는　1-100, y　=　1-6임)이고, 또 다른 R5는 H 또는 비치환 알킬인 것인 화합물.
  18. 제17항에 있어서, R1은 CN 또는 CH3SO2; R2는 H; 하나의 R5는 (CH2)yZ (여기서 y는　5임)이고; 또 다른　R5는 H인 것인 화합물.
  19. 제15항 내지 제18항 중 어느 하나의 항에 있어서, E는 천연 엑센딘 서열의 N28에 대응하는 위치에 아미노산 치환을 포함하는 안정화된 엑센딘으로서, 여기서 천연 엑센딘은 SEQ　ID　NO:1 또는 SEQ　ID　NO:7로 구성된 것인 화합물.
  20. 제19항에 있어서, E는 N29D, N28A, N28K 또는 N28Q 치환된 SEQ　ID　NO:1 또는 SEQ　ID　NO:7인 것인 화합물.
  21. 제20항에 있어서, E는 SEQ　ID　NO:2인 것인 화합물.
  22. GLP-1 작용제가 이롭게 작용하는 병태를 갖는 대상자에게 제1항 내지 제5항 중 어느 하나의 항에 기재된 컨쥬게이트를 1 내지 3개월에 1회 투여하는 것을 포함하는, GLP-1 작용제를 투여하기 위한 프로토콜.
  23. 다음 구조:
    HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKQGG PSSGAPPPS-NH2 (SEQ　ID　NO:2) ([N28Q]엑세나타이드)를 갖는 펩타이드 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염.
  24. 활성성분으로서 제23항에 기재된 펩타이드 또는 염을 포함하는 의약 조성물.
  25. GLP-1 작용제가 이롭게 작용하는 병태를 갖는 대상자에게 제23항에 기재된 펩타이드 또는 염 또는 제24항에 기재된 의약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, GLP-1 작용제를 투여하기 위한 프로토콜.
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Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107847543A (zh) * 2015-04-01 2018-03-27 斯克利普斯研究院 与gpcr激动剂多肽相关的方法和组合物
JOP20190245A1 (ar) 2017-04-20 2019-10-15 Novartis Ag أنظمة توصيل إطلاق مستدام تتضمن روابط بلا أثر لنقطة الربط
TW202027794A (zh) 2018-10-03 2020-08-01 瑞士商諾華公司 血管生成素樣３多肽之持續遞送
US20220265873A1 (en) * 2019-08-07 2022-08-25 Prolynx Llc Steam sterilization of hydrogels crosslinked by beta-eliminative linkers

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1658856B1 (en) * 1999-01-14 2010-03-17 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Exendins for glucagon suppression
CA2497794A1 (en) * 2002-09-06 2004-03-18 Bayer Pharmaceuticals Corporation Modified glp-1 receptor agonists and their pharmacological methods of use
US7544657B2 (en) 2002-10-02 2009-06-09 Zealand Pharma A/S Stabilized Exendin-4 compounds
EP1845105A4 (en) * 2005-01-14 2009-02-18 Wuxi Grandchamp Pharmaceutical MODIFIED EXENDINES AND CORRESPONDING USES
GB2427360A (en) 2005-06-22 2006-12-27 Complex Biosystems Gmbh Aliphatic prodrug linker
CN102827284B (zh) * 2006-11-14 2015-07-29 上海仁会生物制药股份有限公司 带有聚乙二醇基团的Exendin或其类似物及其制剂和用途
WO2008116294A1 (en) 2007-03-23 2008-10-02 Matregen Corp. Exendin analogs
EP2306986B1 (en) 2008-06-26 2018-03-21 Prolynx Llc Prodrugs and drug-macromolecule conjugates having controlled drug release rates
WO2010017215A2 (en) * 2008-08-04 2010-02-11 The Regents Of The University Of California Biodegradable microspheres and methods of use thereof
DK2498801T3 (en) * 2009-11-13 2018-05-07 Sanofi Aventis Deutschland PHARMACEUTICAL COMPOSITION INCLUDING desPro36Exendin-4 (1-39) -Lys6-NH2 AND METHIONIN
US8703907B2 (en) 2010-05-05 2014-04-22 Prolynx Llc Controlled drug release from dendrimers
JP5977229B2 (ja) 2010-05-05 2016-08-24 プロリンクス リミテッド ライアビリティ カンパニー 巨大分子共役体からの徐放
US8946405B2 (en) * 2010-05-05 2015-02-03 Prolynx Llc Controlled release from solid supports
WO2011156407A2 (en) * 2010-06-09 2011-12-15 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Glp-1 receptor agonists to treat pancre-atitis
CA2848142C (en) 2011-09-07 2021-05-18 Prolynx Llc Hydrogels with biodegradable crosslinking
US20140256626A1 (en) * 2011-10-18 2014-09-11 Prolynx Llc Peg conjugates of exenatide

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