KR20180129730A - 조산 및 질염 원인균에 대한 항균 활성, 성병 원인 바이러스에 대한 항바이러스 활성 및 질내 부착능이 우수한 락토바실러스 속 균주 및 이의 용도 - Google Patents
조산 및 질염 원인균에 대한 항균 활성, 성병 원인 바이러스에 대한 항바이러스 활성 및 질내 부착능이 우수한 락토바실러스 속 균주 및 이의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 조산 및 질염 원인균에 대한 항균 활성, 성병 원인 바이러스에 대한 항바이러스 활성 및 질내 부착능이 우수한 락토바실러스 속 균주 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명에 따른 락토바실러스 속 3종의 균주는 조산과 질염 원인균 및 성병 원인 바이러스에 강력한 항균/항바이러스 활성을 나타낼 뿐만 아니라 질내 상피세포 부착/정착성이 이미 알려진 특허 균주 및 표준 균주보다 우수한 것을 확인하였다. 따라서, 이들 균주 및 균주 혼합물은 향후 세균 및 바이러스에 의한 성병을 비롯하여, 조산/질염 및 각종 여성생식기 질환 바이러스에 대한 치료제/치료보조제/예방제 등으로 보다 효과적으로 사용 가능하여 관련 산업에 매우 유용하다.
Description
본 발명은 조산 및 질염 원인균에 대한 항균 활성, 성병 원인 바이러스에 대한 항바이러스 활성 및 질내 부착능이 우수한 락토바실러스 속 균주 및 이의 용도에 관한 것이다.
현재까지 조산의 치료를 위하여 조기진통의 산모에게 자궁수축 억제제 투여, 항생제 치료, 스테로이드제 및 프로게스테론 투여를 통해 진통을 억제하고 분만을 지연시켜왔다. 그러나, 조산의 증상이 나타난 이후에 치료를 수행하는 것보다는, 조산의 위험성을 미리 예측함으로써 조산위험 산모군을 선별하고, 이들에 대한 적절한 관리를 통하여 조산을 방지하거나 효과적인 치료방법을 개발하는 것이 필요하다. 또한, 조산의 시기가 빠를수록 신생아에게 후유증을 남길 가능성이 높고 후유증의 정도도 심하기 때문에 조산을 예측할 수 있다면 미숙아와 그로 인한 장애아의 발생률을 현저하게 줄일 수 있을 것으로 기대된다.
조산을 예측하기 위한 일반적인 접근 방법은, 산부인과학적으로, 인구통계학적으로 및 여러가지 증후군에 따라 특별한 주의를 기울여야 하는 여성군을 확인하는 것이었으나, 이러한 접근 방법은 그 방식이 민감하거나 특이적이지 않다는 문제가 있다. 이러한 문제점을 극복하기 위하여, 갑작스런 조산이나 양막파수를 예견하기 위한 여러가지 방법이 연구되고 있는 실정이다.
특히, 본 발명에서는 가임기 여성이 임신을 할 경우 태아보호 및 감염예방을 위해 질내 미생물이 더욱 단순화되고 강력한 항균활성으로 외부 병원성균에 대한 질내 감염을 억제하는 사실을 토대로 조산 원인균인 가르드네렐라 바기날리스(Gardnerella vaginalis) 또는 우레아플라스마 우레아리티쿰(Ureaplasma urealyticum) 균주의 임산부 질내 분포도 조사를 통해 조산을 예측할 수 있을 것으로 판단하였고, 이러한 조산 원인균에 의한 조산을 예방하고자 조산 원인균에 대해 강력한 항균 활성을 가지는 질내 균주를 분리하고자 시도하였다.
한편, 한국등록특허 제0712286호에서는 '젖산균 복합제, 및 감염 및 염증 증상의 예방 및/또는 치료를 위한 그의 용도'이 개시되어 있고, 한국공개특허 제2001-0006273호에서는 '질의 락토바실러스 약제'가 개시되어 있으나, 본 발명에서와 같이, 조산 및 질염 원인균에 대한 항균 활성, 성병 원인 바이러스에 대한 항바이러스 활성 및 질내 부착능이 우수한 락토바실러스 속 균주 및 이의 용도에 대해서는 밝혀진 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자는 가임기 여성이 임신을 할 경우 태아보호 및 감염예방을 위해 질내 미생물이 더욱 단순화되고 강력한 항균활성으로 외부 병원성균에 대한 질내 감염을 억제할 것이라는 사실에 착안하여, 우선 건강한 임산부들의 질내 상피세포로부터 채취한 점액을 절대혐기적 조건에서 배양한 후 1차적으로 병원성 균주에 생육억제 활성을 보이는 158주를 분리하였다. 상기 158주는 총 14종의 락토바실러스 속으로 분류되었고, 이들 중 활성이 우수한 12주를 2차적으로 선정하여 상기 12주의 균주 배양액의 에틸 아세테이트 추출물을 대상으로 총 15종의 각종 병원성 균주에 대한 항균활성을 측정한 결과, 락토바실러스 크리스파터스(Lactobacillus crispatus) AB70, 락토바실러스 젠세니(Lactobacillus jensenni) AD1-1 및 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) AD2-3로 동정된 균주가 타 균주보다 우수한 항균활성을 나타내는 것을 확인하였다.
특히, 상기 3종의 균주는 조산과 질염 원인균 및 성병 원인 바이러스에 강력한 항균/항바이러스 활성을 나타낼 뿐만 아니라 질내 상피세포 부착/정착성이 이미 알려진 특허 균주 및 표준 균주보다 우수한 것을 확인함으로써, 조산, 질염 및 성병 원인균에 대한 항균 및 항바이러스용 약학 조성물로 매우 유용한 점을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 조산 및 질염 원인균에 대한 항균 활성, 성병 원인 바이러스에 대한 항바이러스 활성 및 질내 부착능이 우수한 락토바실러스 크리스파터스(Lactobacillus crispatus), 락토바실러스 젠세니(Lactobacillus jensenni) 및 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 락토바실러스 속 균주를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주의 추출물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주, 상기 균주 혼합물, 상기 균주 또는 균주 혼합물의 배양물, 상기 배양물의 농축액, 상기 배양물의 건조물 및 상기 배양물의 추출물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 함유하는 항균용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주, 상기 균주 혼합물, 상기 균주 또는 균주 혼합물의 배양물, 상기 배양물의 농축액, 상기 배양물의 건조물 및 상기 배양물의 추출물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 함유하는 성병 원인 바이러스에 대한 항바이러스용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주, 상기 균주 혼합물, 상기 균주 또는 균주 혼합물의 배양물, 상기 배양물의 농축액, 상기 배양물의 건조물 및 상기 배양물의 추출물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 함유하는 질염 및 성병의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주, 상기 균주 혼합물, 상기 균주 또는 균주 혼합물의 배양물, 상기 배양물의 농축액, 상기 배양물의 건조물 및 상기 배양물의 추출물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 함유하는 질염, 조산 및 성병의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주, 상기 균주 혼합물, 상기 균주 또는 균주 혼합물의 배양물, 상기 배양물의 농축액, 상기 배양물의 건조물 및 상기 배양물의 추출물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 함유하는 조산의 예방용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주를 배양하는 단계를 포함하는 조산 및 질염 원인균에 대한 항균용 미생물 제제를 제조하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주를 배양하는 단계를 포함하는 성병 원인 바이러스에 대한 항바이러스용 미생물 제제를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명은 건강한 한국인 임산부 질 내에서 절대혐기적으로 분리한 락토바실러스 크리스파터스(Lactobacillus crispatus) AB70, 락토바실러스 젠세니(Lactobacillus jensenni) AD1-1 및 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) AD2-3 균주에 관한 것으로, 상기 3종의 균주는 조산과 질염 원인균 및 성병 원인 바이러스에 강력한 항균/항바이러스 활성을 나타낼 뿐만 아니라 질내 상피세포 부착/정착성이 이미 알려진 특허 균주 및 표준 균주보다 우수한 것을 확인하였다. 따라서, 이들 균주 및 균주 혼합물은 향후 세균 및 바이러스에 의한 성병을 비롯하여, 조산/질염 및 각종 여성생식기 질환 바이러스에 대한 치료제/치료보조제/예방제 등으로 보다 효과적으로 사용 가능하여 관련 산업에 매우 유용하다.
도 1은 본 발명에서 사용된 절대 혐기 임상시료 채취를 위한 모바일 시료 채취 장비를 나타낸다. (A, 가스 조절기; B, 가스발생 선; C, 알루미늄 가스 실린더 (혼합 가스, N2:H2:CO2=86:7:7); D, 가스 실린더 트롤리; E, 가압된 혐기적 자 (Oxoid); F, 팔라듐 (촉매제))
도 2는 본 발명을 통해 병원성 균주에 생육억제 활성을 보이는 1차 선정된 158주의 균종 분포도를 나타낸다.
도 3은 본 발명에서 분리한 AB70 균주를 포함한 분리 균주의 대장균(E. coli) 생육저해 활성환을 나타낸다.
도 4는 본 발명에서 2차 분리된 12주의 질내 균주의 15종의 병원성 세균에 대한 생육저해 활성을 나타낸다(숫자는 저해환의 지름(cm)을 나타냄).
도 5는 본 발명을 통해 분리된 3종 균주를 대상으로 아토포비움 바기내(Atopobium vaginae), 가르드네렐라 바기날리스(Gardnerella vaginalis), 칸디다 알비칸스(Candida albicans) 및 우레아플라스마 우레아리티쿰(Ureaplasma urealyticum)에 대한 항균활성을 나타낸다. AB70 : 본 발명의 락토바실러스 크리스파터스, AD1-1 : 본 발명의 락토바실러스 젠세니, AD2-3 : 본 발명의 락토바실러스 가세리, KLB46, GR-1, RC-14 : 이미 상품화된 특허균주
도 6은 본 발명을 통해 분리된 3종 균주를 대상으로 질 상피세포 부착/정착능을 조사한 결과이다. AB70 : 본 발명의 락토바실러스 크리스파터스, AD1-1 : 본 발명의 락토바실러스 젠세니, AD2-3 : 본 발명의 락토바실러스 가세리, KLB46, GR-1, RC-14 : 이미 상품화된 특허균주
도 7은 본 발명에서 분리한 AB70 균주의 HSV(herpes simplex virus)에 대한 항바이러스 활성 마우스 실험 결과이다.
도 2는 본 발명을 통해 병원성 균주에 생육억제 활성을 보이는 1차 선정된 158주의 균종 분포도를 나타낸다.
도 3은 본 발명에서 분리한 AB70 균주를 포함한 분리 균주의 대장균(E. coli) 생육저해 활성환을 나타낸다.
도 4는 본 발명에서 2차 분리된 12주의 질내 균주의 15종의 병원성 세균에 대한 생육저해 활성을 나타낸다(숫자는 저해환의 지름(cm)을 나타냄).
도 5는 본 발명을 통해 분리된 3종 균주를 대상으로 아토포비움 바기내(Atopobium vaginae), 가르드네렐라 바기날리스(Gardnerella vaginalis), 칸디다 알비칸스(Candida albicans) 및 우레아플라스마 우레아리티쿰(Ureaplasma urealyticum)에 대한 항균활성을 나타낸다. AB70 : 본 발명의 락토바실러스 크리스파터스, AD1-1 : 본 발명의 락토바실러스 젠세니, AD2-3 : 본 발명의 락토바실러스 가세리, KLB46, GR-1, RC-14 : 이미 상품화된 특허균주
도 6은 본 발명을 통해 분리된 3종 균주를 대상으로 질 상피세포 부착/정착능을 조사한 결과이다. AB70 : 본 발명의 락토바실러스 크리스파터스, AD1-1 : 본 발명의 락토바실러스 젠세니, AD2-3 : 본 발명의 락토바실러스 가세리, KLB46, GR-1, RC-14 : 이미 상품화된 특허균주
도 7은 본 발명에서 분리한 AB70 균주의 HSV(herpes simplex virus)에 대한 항바이러스 활성 마우스 실험 결과이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 조산 및 질염 원인균에 대한 항균 활성, 성병 원인 바이러스에 대한 항바이러스 활성 및 질내 부착능이 우수한 락토바실러스 크리스파터스(Lactobacillus crispatus), 락토바실러스 젠세니(Lactobacillus jensenni) 및 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 락토바실러스 속 균주를 제공한다.
본 발명에서는 가임기 여성이 임신을 할 경우 태아보호 및 감염예방을 위해 질내 미생물이 더욱 단순화되고 강력한 항균활성으로 외부 병원성균에 대한 질내 감염을 억제할 것이라는 사실로부터 건강한 임산부들의 질내 상피세포로부터 채취한 점액을 절대혐기적 조건에서 배양하여 분리하였고, 특히 조산 및 질염 원인균에 대한 항균 활성, 성병 원인 바이러스에 대한 항바이러스 활성 및 질내 부착능이 우수한 3종의 락토바실러스 속 균주를 분리하였다.
상기 3종의 락토바실러스 속 균주는 락토바실러스 크리스파터스(Lactobacillus crispatus), 락토바실러스 젠세니(Lactobacillus jensenni) 및 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) 균주로, 상기 락토바실러스 크리스파터스 균주와 락토바실러스 크리스파터스 균주, 락토바실러스 젠세니 균주 및 락토바실러스 가세리 균주의 3종 균주 혼합물을 각각 한국생명공학연구원에 2016년 2월 12일자로 기탁하였다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 균주에서, 상기 락토바실러스 크리스파터스(Lactobacillus crispatus) 균주는 기탁번호가 KCTC 12976BP일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 균주에서, 상기 락토바실러스 크리스파터스(Lactobacillus crispatus) 균주, 락토바실러스 젠세니(Lactobacillus jensenni) 균주 및 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) 균주가 혼합된 혼합균주는 기탁번호가 KCTC 12977BP인 것으로, 기탁증에는 "Vaginal Probiome"로 기재하였다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 균주에서, 상기 조산 원인균은 바람직하게는 가르드네렐라 바기날리스(Gardnerella vaginalis) 또는 우레아플라스마 우레아리티쿰(Ureaplasma urealyticum)일 수 있고, 상기 질염 원인균은 바람직하게는 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 아토포비움 바기내(Atopobium vaginae), 가르드네렐라 바기날리스(Gardnerella vaginalis) 또는 우레아플라스마 우레아리티쿰(Ureaplasma urealyticum)일 수 있고, 상기 성병 원인 바이러스는 바람직하게는 HSV(herpes simplex virus)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 균주에서, 상기 균주는 추가로 슈도모나스 애루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococus aureus), 비브리오 파라해모리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 예르시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica), 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens), 리스테리아 모노시토게네스(Listeria monocytogenes), 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis), 대장균(Escherichia coli), 프로피오니박테리움 에크니(Propionibacterium acnes) 및 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans) 균주에 대한 항균 활성을 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 균주의 추출물을 제공한다. 상기 균주의 추출물은 물, 유기용매 등을 이용하여 추출할 수 있으며, 예를 들면, 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올, 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트 또는 이들의 혼합용매 등을 이용하여 추출할 수 있으며, 바람직하게는 에틸 아세테이트(ethyl acetate)로 추출할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 균주, 상기 균주 혼합물, 상기 균주 또는 균주 혼합물의 배양물, 상기 배양물의 농축액, 상기 배양물의 건조물 및 상기 배양물의 추출물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 함유하는 항균용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 항균용 조성물에서, 상기 균주 배양물의 추출물은 바람직하게는 에틸 아세테이트(ethyl acetate) 추출물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 배양물은 본 발명의 균주를 배양 배지 또는 배양액에서 배양한 것을 의미하며, 상기 배양물은 본 발명의 균주를 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 상기 배양물은 그 제형이 액체 또는 고체일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 "항균 (antimicrobial)"의 의미는 특정 농도에서 미생물의 성장 또는 생존을 감소, 방지, 억제, 또는 제거하는 능력을 의미한다. 항균용 조성물이란 항미생물제를 총칭하는 의미인 항생제와 같은 의미일 수 있고, 항균제, 살균제, 방부제, 보존제 또는 제균제와 같은 의미일 수 있으며, 바람직하게는 그람양성균, 그람음성균, 진균 (효모 및 곰팡이)으로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상의 미생물의 발육과 생활 기능을 저지 또는 억제할 수 있는 물질 즉, 항세균 및 항진균 효력이 있는 물질을 의미한다.
본 발명의 항균용 조성물은 질염 또는 조산 원인균 또는 기타 상기 유해 미생물에 감염된 부분에 직접 투여하거나 적절한 형태의 조성물로 제조하여 투여할 수 있다. 본 발명의 항균용 조성물의 투여량은 투여 대상에서 질염 또는 조산 원인균 또는 기타 상기 유해 미생물을 사멸시키는 효과를 발휘하기 위해 요구되는 정도의 양을 의미하는데, 제형의 종류 및 투여 대상의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 경로, 투여 시간 및 기간을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 항균용 조성물에서, 상기 조성물은 바람직하게는 식품, 식품 첨가제, 사료 첨가제 또는 의약품 형태일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 균주, 상기 균주 혼합물, 상기 균주 또는 균주 혼합물의 배양물, 상기 배양물의 농축액, 상기 배양물의 건조물 및 상기 배양물의 추출물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 함유하는 성병 원인 바이러스에 대한 항바이러스용 조성물을 제공한다.
본 발명의 추출물이 상기와 같은 항바이러스용으로 이용되기 위해서는, 식품학 또는 약제학적 분야에서 공지된 다양한 방법에 의해 제조될 수 있으며 그 자체 또는 식품학적으로 허용되는 담체, 부형제, 희석제 등과 혼합하여 경구로 섭취할 수 있는 어떤 식품 형태로도 제조될 수 있다. 바람직하게는 음료, 환, 과립, 정제 또는 캅셀 형태이다.
또한, 본 발명은 상기 균주, 상기 균주 혼합물, 상기 균주 또는 균주 혼합물의 배양물, 상기 배양물의 농축액, 상기 배양물의 건조물 및 상기 배양물의 추출물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 함유하는 질염 및 성병의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 상기 약학조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 상기 약학조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 상기 약학조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 포함한 다양한 화합물 혹은 혼합물을 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 균주, 상기 균주 혼합물, 상기 균주 또는 균주 혼합물의 배양물, 상기 배양물의 농축액, 상기 배양물의 건조물 및 상기 배양물의 추출물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 함유하는 질염, 조산 및 성병의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
상기에서 언급한 본 발명의 상기 균주 또는 이의 배양액 등을 건강기능식품 조성물로 사용할 경우, 상기 균주 또는 이의 배양액을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용할 수 있으며, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 그 사용 목적 (예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
본 발명의 식품(또는 건강기능식품)은, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되고 식품학적으로 허용되는 성분을 더 포함할 수 있다. 예컨대, 음료수로 제조되는 경우에는 본 발명의 혼합 추출물 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙 등에서 하나 이상의 성분을 추가로 포함시킬 수 있다.
본 발명에 따른 식품(또는 건강기능식품)의 유효성분으로 포함될 수 있는 양은 항균 또는 항바이러스용 식품을 원하는 사람의 연령, 성별, 체중, 상태, 질병의 증상에 따라 적절히 선택될 수 있으며, 바람직하게는 성인기준 1일 0.01 g 내지 10.0 g 정도로 포함되는 것이 좋으며, 이러한 함량을 갖는 식품을 섭취함으로써 항바이러스 효과를 얻을 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 균주, 상기 균주 혼합물, 상기 균주 또는 균주 혼합물의 배양물, 상기 배양물의 농축액, 상기 배양물의 건조물 및 상기 배양물의 추출물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 함유하는 조산의 예방용 조성물을 제공한다.
상기에서 언급한 본 발명의 상기 균주 또는 이의 배양액 등으로 조산을 예방하는 방법은 본 발명의 락토바실러스 크리스파터스(Lactobacillus crispatus), 락토바실러스 젠세니(Lactobacillus jensenni) 및 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) 균주가 조산 원인균인 가르드네렐라 바기날리스(Gardnerella vaginalis) 또는 우레아플라스마 우레아리티쿰(Ureaplasma urealyticum) 균주에 대해 강력한 항균 활성을 나타내므로, 본 발명의 락토바실러스 크리스파터스, 락토바실러스 젠세니 또는 락토바실러스 가세리 균주 또는 이들의 혼합 균주를 임산부의 질 내부에 처리함으로 인해 가능한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 균주를 배양하는 단계를 포함하는 조산 및 질염 원인균에 대한 항균용 미생물 제제를 제조하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주를 배양하는 단계를 포함하는 성병 원인 바이러스에 대한 항바이러스용 미생물 제제를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 균주를 배양하는 방법은 당업계에 통상적으로 이용되는 방법에 따라 배양할 수 있다.
본 발명의 조산 및 질염 원인균에 대한 항균용 미생물 제제 또는 성병 원인 바이러스에 대한 항바이러스용 미생물 제제는 유효성분으로서 락토바실러스 크리스파터스, 락토바실러스 젠세니 및 락토바실러스 가세리 균주를 이용하여 제조될 수 있다. 본 발명에 따른 항균용 또는 항바이러스 미생물 제제는 용액, 분말, 현탁액, 분산액, 에멀젼, 유성 분산액, 페이스트, 분진, 분사제 또는 과립제로 제조할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이하 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
실시예
1. 건강한 한국인 임산부
질내
시료 채취
건양대병원 산부인과에 정기검진을 받기 위해 내원한 건강한 한국인 임산부들의 동의를 받아 이들 임산부들의 질내 시료를 채취하였다. 시료를 채취하는 방법은 다음과 같다. 병원에서 질내 시료 채취에 사용하는 자궁내 경부도말 브러쉬(endocervical brush)를 사용하여 임산부 질내 상피세포에 있는 점액을 채취한 후 브러쉬를 살균된 50 mL 튜브에 넣고 뚜껑을 닫지 않은 채로 바로 가압형 혐기 자(jar) (3.5 L HP0011A, Oxoid, UK) 안에 넣고 혐기 자(jar)의 뚜껑을 닫는다. 그리고 질소:수소:이산화탄소 86:7:7의 비율로 섞인 혼합가스를 15분간 주입하여 혐기 자(jar) 내의 공기를 산소가 포함되지 않은 혼합가스로 대체하였다. 혐기 자(jar) 내에 남아 있는 미량의 산소는 혐기 자(jar) 내의 팔라디움 촉매와 수소가 반응하여 물로 환원되어 제거하였다. 이와 같은 장비의 구성은 도 1에 나타내었으며, 이는 본 발명자의 연구실에서 자체 제작하였고, 이를 채취한 임상시료의 절대혐기적 보관 및 운반을 위한 모바일 시료 채취장비라 명명하였다(도 1).
실시예
2. 건강한 한국인 임산부
질내
시료에서 혐기성 미생물 분리
상기 실시예 1에서 설명한 방법으로 채취한 시료는 시료 채취 직후 바로 한국생명공학연구원 실험실로 전달되어 시료가 들어있는 혐기 자(jar)를 혼합가스 (질소:수소:이산화탄소 = 86:7:7)로 채워져 있는 절대혐기챔버 (Coy Laboratory Product, USA) 안에 넣고 미리 준비한 절대혐기적으로 제조된 DSM 104 아가 플레이트 (1.5% w/V) 상에 질내 시료를 도말하여 37℃에서 48시간 배양 후 형성된 콜로니를 선발였다. DSM 104 배지의 조성은 아래 그림과 같다.
Haemin solution : 1ml 1N NaOH에 50㎎ Haemin을 녹임
Vitamin K1 solution : 20ml 95% 에탄올에 0.1ml Vitamin K1을 녹임
총 300여 개의 콜로니를 한국인 임산부로부터 단일 콜로니 분리 방법을 통해 순수 분리하였으며, 콜로니 PCR을 통해 이들 분리된 균주의 분자생물학적 동정을 실시하였다. 동정된 균주는 총 29종으로 이 중 유산균 15종, 비유산균 14종으로 확인되었다. 이들 분리된 300주의 한국인 임산부 질내 미생물에 대하여 1차적으로 바실러스 서틸리스 및 병원성 대장균 균주를 시험균주로 사용하여 이들 시험균주의 생육을 억제하는 질내 미생물 균주를 고체배지에서의 페이퍼 디스크 분석을 이용한 생육억제환의 생성여부를 측정하여 총 158주를 선정하였다.
선정된 158주(선정된 158주는 총 14종의 락토바실러스 속으로 분류됨, 도 2) 중 활성이 우수한 12주를 2차 선정하고 이들 선정된 균주에 대해서는 총 15종의 병원성 세균의 생육억제 정도를 정량적으로 세밀히 측정하게 되었다. 선정된 질내 미생물 12주는 100 mL씩 5일간 액체배양하여 배양액의 동량의 에틸 아세테이트를 처리하여 1시간 반응시킨 후 유기용매층을 분리하여 건조하였다. 유기용매를 모두 제거한 후 메탄올 125㎕에 용해시키고, 용해된 추출액 중 25㎕를 15종의 각종 병원성 균주에 대한 생육억제환의 지름을 측정하여(도 3) 생육억제 정도가 가장 우수한 AB70 균주를 3차로 선정하게 되었다.
AB70 균주는 특히 조산/질염과 관계가 있는 질내 병원성 균주인 아토포비움 바기내(Atopobium vaginae, 질염균), 가르드네렐라 바기날리스(Gardnerella vaginalis, 조산/질염)에 대해 가장 우수한 생육저해능을 보였으며(도 4), 질염균 이외에도 슈도모나스 애루기노사(Pseudomonas aeruginosa, 녹농균), 리스테리아 모노시토게네스(Listeria monocytogenes, 수막염/뇌막염균), 프로피오니박테리움 에크니(Propionibacterium acnes, 여드름균), 병원성 대장균 및 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans, 충치균)에 대하여 가장 우수한 생육억제 활성을 나타냈다(도 4).
여성은 질내 미생물의 분포에 따라 크게 5가지 그룹으로 나누어지는데, 이들 그룹은 다음과 같다; 제 1 그룹 락토바실러스 크리스파터스(Lactobacillus crispatus) 우점 그룹, 제 2 그룹 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri), 제 3 그룹 락토바실러스 이너스(Lactobacillus iners) 우점 그룹, 제 4 그룹 다양성 그룹 (특정 유산균이 지배하지 않고 각종 혐기성 세균이 지배하는 그룹), 제 5 그룹 락토바실러스 젠세니(Lactobacillus jensenni) 우점 그룹. 한국인 여성 150명의 질내 미생물 분포를 NGS로 조사한 본 발명자의 결과에서도 유사한 결과를 보였는데, 특히 락토바실러스 크리스파터스가 지배하는 그룹이 가장 많았으며, 그 다음으로 락토바실러스 이너스 그룹, 락토바실러스 가세리 그룹, 그리고 락토바실러스 젠세니 그룹 순으로 많았으며, 건강한 여성의 경우에는 다양성 그룹이 관찰되지 않았으나, 질염 증상이 있거나 고위험 임신 경험이 있는 여성의 경우 다양성 그룹이 관찰되었다.
락토바실러스 이너스 그룹의 경우, 락토바실러스 이너스 균주의 항균활성이 다른 그룹의 균주에 비해 현저히 떨어지며, 이들 그룹의 경우에도 고위험임신 가능성이 높은 것으로 알려져 있다.
본 연구그룹의 실험결과에서도 최종 선정된 12주에 락토바실러스 이너스 균주는 선정되지 않았으며, 락토바실러스 크리스파터스 AB70 균주가 각종 병원성 세균에 대해 가장 우수한 항균활성을 나타냈다. 그러나 조산의 주원인 균주로 추정되는 우레아플라스마 우레아리티쿰(Ureaplasma urealyticum, 조산/질염균) 균주와 진균인 칸디다 알비칸스(Candida albicans, 질염균)에 대해서는 락토바실러스 젠세니 그룹인 AD1-1 균주와 락토바실러스 가세리 그룹인 AD2-3 균주가 우수한 항균활성을 보였으며, 따라서 이들 세 균주 AB70, AD1-1 및 AD2-3 균주 각각 또는 이들 균주배양물/추출물의 혼합체를 여성의 조산/질염 예방/치료제로 사용가능할 것으로 예상된다.
선정된 3주와 기존에 질염치료로 보고된 특허 및 상품화된 균주인 락토바실러스 크리스파터스(Lactobacillus crispatus) KLB46, 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) GR-1, 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri) RC-14 균주에 대해 특히 조산/질염 원인균주에 대한 항균활성을 비교실험하였다. 실험결과 AB70 균주가 조산/질염 원인균에 대해 가장 우수한 항균활성능을 보였다 (도 5). 이는 건강한 임산부의 경우 임신 전보다 질내 미생물분포가 더욱 단순해지면서 강력한 항균활성으로 외부 병원성균에 대한 질내 감염을 억제할 것으로 추정한 기존 보고와 일치하는 내용이다.
선정된 질내 미생물이 아무리 항균활성이 우수하다고 하더라도 실제 질내에 부착하고 정착하지 못한다면, 그 조산/질염 치료/예방효과는 기대하기 어렵다. 선정된 질내 미생물의 질내 정착성을 실험하기 위하여 사람의 질 상피세포인 세포주 (vagina epithelial cell, VK2/E6E7)를 미국 ATCC로부터 구입하여 세포 배양을 하였으며, 상기 설명한 다른 특허 및 상품 균주에 대해서도 질내 부착/정착성 실험을 하고 이를 비교하였다. 부착실험은 37℃에서 24시간 배양된 시험균주를 400 rpm에서 10분간 원심분리하고 균체를 RPM1640 배지로 세척한 후 사람의 질 상피세포가 배양된 6웰 플레이트에 각각 100㎕씩 접종하였다. 1시간 동안 CO2 배양기에서 배양 후 RPM1640 배지로 3회 세척하고 남은 균주수를 10X trypsin-EDTA 150㎕로 부착된 균주를 탈착하고 2 ml의 RPM1640 배지로 균주를 회수하여 회수된 균주의 cfu/ml 값을 측정하였다. 실험결과 본 발명을 통해 확보된 균주들은 모두 비교균주에 비해 월등한 질내 부착/정착성을 나타내었으며(도 6), 이는 건강한 임산부의 질내에서 분리한 질내 미생물이 일반 미생물에 비해 탁월한 질내 부착/정착성을 지니게 됨을 나타낸다.
최종 선정된 3주의 HSV에 대한 항바이러스 활성을 확인하기 위한 마우스 질내에서의 인 비보(in vivo) 실험을 행하였다. 실험에 사용된 쥐는 암컷 C57BL/6 J 마우스이며, 이들 쥐를 항생제 처리를 통해 질내 미생물을 제거한 후 HSV에 감염시킬 경우 항생제 처리를 하지 않은 쥐에 비해 바이러스 감염에 취약하여 일찍 죽는 것을 관찰하였다(참고문헌: Dysbiosis-induced IL-33 contributes to impaired antiviral immunity in the genital mucosa. 2016. PNAS on line published). 항생제 처리를 통해 HSV 감염에 취약해진 마우스에 본 발명을 통해 개발된 AB70 균주 100㎕ (1010 cfu/ml)를 처리할 경우 HSV 감염에 대해 저항성을 나타냄을 확인하였다 (도 7).
실시예
3. 본 발명에서 최종 선발한
AB70
,
AD1
-1 및
AD2
-3의 3종 균주의 동정 방법 및 결과
최종 선정된 3주의 분자생물학적 동정을 위하여 16S rRNA 유전자를 타겟으로 하는 유니버셜 프라이머인 27F (5'-AGA GTT TGA TCM TGG CTC A-3': 서열번호 1)와 1492R (5'-TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3': 서열번호 2)을 사용하였고, 직접 콜로니 PCR 법으로 PCR 산물을 얻은 후 BIOFACT 사(BIOFACT, Korea)에 의뢰하여 16S rRNA 유전자의 염기서열 분석을 수행하였다. 분석하여 얻은 염기 서열들은 EZbiocloud (http://www.ezbiocloud.net/)에서 동정검색을 통해 염기서열을 확인하였다. 그 결과 AB70 균주는 락토바실러스 크리스파터스(Lactobacillus crispatus) DSM 20584T와 100%, AD1-1 균주는 락토바실러스 젠세니(Lactobacillus jensenni) ATCC 25258T와 99.85% 그리고 AD2-3 균주는 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri) ATCC 33323T와 99.72%의 상동성을 나타내었다.
<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology
<120> Lactobacillus sp. strain having antimicrobial activity against
microorganisms causing premature birth and vaginosis, antiviral
activity againt HSV and improved vagina adhesion ability and uses
thereof
<130> PN18525
<160> 2
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 1
agagtttgat cmtggctca 19
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 2
tacggytacc ttgttacgac tt 22
Claims (4)
- 기탁번호가 KCTC 12976BP이며, 가르드네렐라 바기날리스(Gardnerella vaginalis), 우레아플라스마 우레아리티쿰(Ureaplasma urealyticum), 칸디다 알비칸스(Candida albicans) 및 아토포비움 바기내(Atopobium vaginae)에 대한 항균 활성, HSV(herpes simplex virus)에 대한 항바이러스 활성 및 질내 부착능이 우수한 락토바실러스 크리스파터스(Lactobacillus crispatus) 균주.
- 제1항의 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축액, 상기 배양물의 건조물 및 상기 배양물의 추출물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 함유하는 질염의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 제1항의 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축액, 상기 배양물의 건조물 및 상기 배양물의 추출물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 함유하는 질염 및 조산의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
- 제1항의 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축액, 상기 배양물의 건조물 및 상기 배양물의 추출물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 함유하는 조산의 예방용 조성물.
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