KR20180127029A - 조혈모세포의 항상성 유지에 관여하는 cotl1 단백질 및 이의 용도 - Google Patents

조혈모세포의 항상성 유지에 관여하는 cotl1 단백질 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 조혈모세포의 항상성 유지하고 조절하는 COTL1 유전자 또는 단백질에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 COTL1 유전자의 변이 또는 단백질 발현 감소에 따른 조혈모세포 항상성 이상과 관련된 혈액질환 진단 및 치료에 관한 것이다. 본 발명의 COTL1 유전자 또는 단백질은 미토콘드리아 형태조절에 중요한 역할을 하고 발현이 억제될 경우에는 조혈모세포의 수가 감소하므로, COTL1 유전자 또는 단백질을 이용한 조혈모세포 항상성 이상과 관련된 혈액질환의 진단 및 치료에 유용하다.

Description

조혈모세포의 항상성 유지에 관여하는 COTL1 단백질 및 이의 용도 {COTL1 Protein Involved in Maintaining Homeostasis of Hematopoietic Stem Cells and Use Thereof}
본 발명은 조혈모세포의 항상성 유지하고 조절하는 COTL1 유전자 또는 단백질에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 COTL1 유전자의 변이 또는 단백질 발현 감소에 따른 조혈모세포 항상성 이상과 관련된 혈액질환의 진단 및 치료에 관한 것이다.
모든 혈액세포들은 조혈모세포(HSC: hematopoietic stem cell)라고 불리는 다능성(multipotent) 세포에서 생성된다. 조혈줄기세포라고도 불리는 조혈모세포는 스스로 재생(self-renewal)이 가능하며, 다양한 종류의 세포로 증식(proliferation)과 분화(differentiation)를 할 수 있는 세포이다. 특히, 조혈 초기에 다능성 줄기세포는 림프전구세포(lymphoid progenitor)와 골수전구세포(myleoid progenitor) 중 한가지로 선택적으로 분화한다. 조혈모세포 내에서의 미세환경(microenviroment)이 분화와 성숙에 중요하며, 특히 20여종의 조혈모 성장인자의 종류와 양에 따라 조혈모세포의 분화와 증식이 크게 영향을 받는다.
림프구계 전구세포들은 B세포, T세포, NK세포(natural killer cell), 형질세포들을 생산하며, 골수구계 전구세포들은 적혈구(erythrocyte), 비만세포, 다양한 백혈구들(호염기구, 중성구, 호산구, 단핵구), 혈소판으로 분화된다. 조혈모세포로부터 분화된 세포들은 면역체계와 밀접한 관련이 있으며 몸에 침입하는 병원균을 포함한 광범위한 항원물질을 검출하고 이에 대해 반응할 뿐만 아니라 죽은 세포를 제거하고 상처를 치유하는 역할을 함 우리 몸의 방어체계를 형성한다.
조혈모세포는 골수(bone marrow)에 주로 존재하고 있으며, 말초혈액에서도 소수로 존재한다. 조혈성장인자로 자극하면 말초혈액내의 조혈모세포가 증가하는데 이는 골수조혈모세포가 이동하여 분화하고 증식한 결과이다. 조혈모세포는 자가 복제능력을 지녔기 때문에 조혈모세포에서 혈구가 생성되어 말초혈액으로 나간다 해도 정상인의 골수 세포의 수적변화 및 형태는 일정하게 항상성을 유지한다.
조혈모세포는 안정된 상태에서 한 시간에 1,010개의 적혈구와 108~109개의 백혈구를 만들어내는데 하루에 약 4×1011개의 혈액세포를 생성하는 것으로 알려져 있다. 또한, 조혈모세포는 골수를 찾아가는, 즉 귀향하는 본능이 있는데 이러한 특성이 때문에 조혈모세포의 이식을 가능하게 한다. 악성혈액질환, 중증재생불량성빈혈 등의 난치성 혈액질환을 대상으로 한 동종 조혈모세포 이식이 시행되고 있으며, 최근에는 유전성 대사질환, 선천 면역결핍증 등 다양한 질환에서도 효과적인 치료방법으로 사용되고 있다.
조혈모세포로부터 분화된 혈액세포들의 조혈 과정에서 각 단계별로 분화된 세포들은 에너지 항상성(homeostasis)에 의해 균형적인 증식과 성숙 및 세포의 손상과 사멸이 유지된다. 이러한 항상성이 깨지게 되면 조혈모세포로부터 혈액세포로의 조혈과정에서 분화가 정지되거나 비정상적인 증식을 초래하게 되어, 난치성혈액질환, 중증 재생불량성빈혈 등의 난치성 혈액질환이 발생한다. 이러한 증상들은 조혈모세포로부터 혈액세포로의 계통적인 발생단계에서 조혈과정의 증식/분화 항상성을 조절하는 집락자극인자(colony stimulating factor, CSF) 또는 세포내에서 증식/분화 신호를 조절하는 유전자 이상에 의한 것으로 볼 수 있다.
CSF는 세포막수용체에 작용하여 세포의 기능을 변형시킨다는 의미에서 보통 싸이토카인(cytokine)으로 불리며, 무절제한 생산이나 세포 내에서의 과잉반응은 혈액세포 항상성을 붕괴할 수 있다. 이러한, CSF 이상이 혈액세포의 비정상적인 증식에 상당한 영향이 있기는 하지만, 혈액암 발생을 직접적으로 설명하지 못한다. 따라서, 백혈병을 유발시키는 직접적이고 결정적인 원인은 조혈모세포의 과도한 증식과 세포내의 신호분자전달 불균형을 발생시키는 유전자 이상에 있음이 점차 밝혀지고 있다.
조혈모세포의 항상성은 분화/증식과 세포손상/사멸이 균형을 이루면서 혈액을 구성하는 세포들의 조화로운 균형에 의해 유지되고 있다. 조혈모세포가 분화가 될 때는 많은 양의 에너지가 필요하지만 휴지기에 있는 조혈모세포는 당분화대사(glycolytic metabolites)에 의해 적은 양의 에너지로 유지되고 있다. 따라서, 조혈모세포의 에너지 대사의 이상이나 활성산소(reactive oxygen species, ROS)는 조혈모세포의 분화와 밀접한 관련이 있으며, 조혈모세포의 항상성 유지는 에너지 대사의 항상성을 담당하고 있는 미토콘드리아의 기능과 밀접한 관련이 있다. 즉, 미토콘드리아 이상은 사람의 조혈모세포 분화와 관련된 질병과 매우 높은 관련성이 있을 것으로 예상된다.
이에, 본 발명자들은 조혈모세포 항상성 유지를 통한 혈액질환 진단 및 치료제를 개발하기 위해 예의 노력한 결과, COTL1 유전자가 미토콘드리아 형태조절에 중요한 역할을 하고 조혈모세포의 수와 같은 항상성 유지에 관여하는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 분리된 생물학적 시료로부터 COTL1 유전자 또는 단백질의 발현을 측정하고, 측정된 COTL1 유전자 또는 단백질의 발현양을 대조군 시료와 비교하여 혈액질환의 진단 또는 예측을 위한 정보제공 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 COTL1 단백질 또는 COTL1을 발현하는 전달체를 유효성분으로 함유하는 혈액질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 COTL1 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 혈액질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 세포에 시험물질을 처리하여 COTL1 유전자 또는 단백질의 발현을 측정하고, 측정된 COTL1 유전자 또는 단백질의 발현양이 시험물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 증가한 시험물질을 선별하는 것을 포함하는 혈액질환 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 분리된 생물학적 시료로부터 COTL1 유전자 또는 단백질의 발현을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 측정된 COTL1 유전자 또는 단백질의 발현양을 대조군 시료와 비교하는 단계를 포함하는 혈액질환의 진단 또는 예측을 위한 정보제공 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, COTL1 단백질 또는 COTL1을 발현하는 전달체를 유효성분으로 함유하는 혈액질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, COTL1 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 혈액질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 세포에 시험물질을 처리하는 단계; (b) 상기 세포에서 COTL1 유전자 또는 단백질의 발현을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 측정된 COTL1 유전자 또는 단백질의 발현양이 시험물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 증가한 시험물질을 선별하는 단계를 포함하는 혈액질환 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 COTL1 유전자 또는 단백질은 미토콘드리아 형태조절에 중요한 역할을 하고 발현이 억제될 경우에는 조혈모세포의 수가 감소하므로, COTL1 유전자 또는 단백질을 이용한 조혈모세포 항상성 이상과 관련된 혈액질환의 진단 및 치료에 유용하다.
도 1은 조혈모세포의 분화과정을 나타낸 것이다.
도 2는 조혈세포 기원에 따른 백혈병의 종류를 나타낸 것이다.
도 3은 미토콘드리아 다이나믹스와 항상성 유지 기전의 모식도를 나타낸 것이다.
도 4는 미토콘드리아 길이 신장에 따른 COTL1의 세포내 분포 변화로 인한 미토콘드리아로의 이동 증가를 나타낸 것이다.
도 5는 COTL1 발현억제나 변이에 따른 F-actin의 비정상적인 형태 변화와 미토콘드리아에서의 F-actin의 분포와 미토콘드리아의 형태 변화를 나타낸 것이다.
도 6은 zebra fish 발생단계(developmental stage)에서의 cotl1의 발현량과 분포를 나타낸 것이다.
도 7은 zebra fish에 morpholino RNA를 사용하여 cotl1 발현억제(knock down)를 나타낸 것이다.
도 8은 cotl1 발현억제 zebra fish에서 조혈모세포의 감소를 나타낸 것이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에서는 미토콘드리아 형태 이상 시에 발현량 변화를 나타내는 핵심 유전자/단백질인 COTL1이 에프-액틴(F-actin) 단백질을 조절함으로써 미토콘드리아 다이나믹스에 중요한 역할을 한다는 것을 확인하였다. 또한, 인간 COTL1의 상동유전자인 지브라피쉬 (zebra fish) cotl1 유전자 발현 억제에 따른 지브라피쉬 발생단계에서 조혈모세포의 숫자가 확연하게 감소하는 것도 확인하였다. 즉, COTL1이 조혈모세포의 분화 및 증식 등을 통한 항상성 유지에 관여하는 중요한 유전자/단백질임을 알 수 있었다.
미토콘드리아는 세포내에서 산화적 인산화 과정을 통하여 세포의 생명활동에 필요한 ATP의 생성을 담당하는 세포내의 에너지 발전소의 역할과 더불어 세포의 다양한 항상성 유지에 중추적인 역할을 하고 있다. 미토콘드리아는 항상 길이와 형태가 변하는 매우 역동적인 소기관이다. 미토콘드리아는 분열 (fission)을 하는 과정과 두개 이상의 미토콘드리아가 하나로 합쳐지는 융합 (fusion) 과정을 반복적으로 함으로써 형태 (morphology), 양 (amount), 수 (number)의 항상성을 유지하고 있다. 이러한 분열과 융합의 과정을 통해 세포 내의 에너지 대사의 항상성도 유지되고 있다. 이러한 미토콘드리아의 지속적인 분열과 융합의 역동적인 과정을 ‘미토콘드리아 다이나믹스’라고 한다 (도 3).
이러한, 미토콘드리아 다이나믹스 이상은 사람의 조혈모세포 분화와 관련된 질병과 매우 높은 관련성이 있을 것으로 예상되며, 최근 미토콘드리아 형태 이상이 조혈세포의 비이상적인 분화 및 증식에 미치는 영향에 대한 연구가 크게 주목 받고 있다.
조혈모세포는 혈액에서 약 1% 정도만 존재하지만 모든 혈액 세포들을 만드는 다능세포이며, 조혈모세포로부터 분화된 세포들은 우리 몸은 아주 중요한 면역체계를 담당하고 있다. 조혈모세포의 분화된 혈액세포들의 조혈과정에서 각 단계별로 분화된 세포들은 에너지 항상성 (homeostasis)에 의해 균형적인 증식과 성숙 및 세포의 손상과 사멸이 유지되며, 조혈모세포의 항상성 유지는 에너지 대사의 항상성을 담당하고 있는 미토콘드리아의 기능과 밀접한 관련이 있다. 하지만, 조혈모세포의 항상성 이상은 조혈모세포의 비적상적인 분화와 증식을 유발하여 백혈병, 재생불량성빈혈, 혈액암과 같은 난치성 혈액질환을 비롯한 다양한 혈액질환과 연관되어 있다.
조혈모세포 이상증식에 의한 백혈병은 악화 속도 (분화와 증식)에 따라 급성과 만성으로 나뉘고, 세포의 기원에 따라 골수성과 림프구성으로 나뉘며, 흔히 다음의 네 가지 형태로 분류한다 (도 2).
1) 급성 골수성백혈병(acute myeloid leukemia): 골수에서 만들어지는 골수성 백혈구의 줄기세포에서 발생하는 악성종양.
2) 급성 림프구성백혈병 (acute lymphoblastic leukemia): 혈액 및 골수 내 림프구 계통 세포에서 발생하는 질환.
3) 만성 골수성백혈병(chronic myeloid leukemia): 필라델피아 염색체를 가진 조혈모세포의 골수 내 비정상적인 증식에 의한 질환.
4) 만성 림프구성백혈병(chronic lymphocytic leukemia): 혈액 속에서 성숙한 림프구가 현저하게 증가하는 질환.
본 발명에서는 에프-액틴(F-actin)과 결합하여 미토콘드리아 형태변화에 관여하는 COTL1이 조혈모세포의 항상성 유지에 중요한 역할을 한다는 사실을 발견하였다. 또한, cotl1 발현이 억제 (knock down)된 지브라피쉬(zebra fish)는 발생단계에서 조혈모세포 수가 현저하게 감소된 사실을 밝혔다. 따라서, COTL1 발현 이상 및 변이는 조혈모세포 항상성 유지와 밀접한 관련이 있으며, 조혈모세포 항상성 이상 관련의 다양한 혈액질환 (백혈병, 악성빈혈 등)의 진단 및 치료제 개발에 활용되어, 의학적, 산업적 이용 가능성이 매우 높을 것으로 기대된다.
따라서, 본 발명은 일관점에서 (a) 분리된 생물학적 시료로부터 COTL1 유전자 또는 단백질의 발현을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 측정된 COTL1 유전자 또는 단백질의 발현양을 대조군 시료와 비교하는 단계를 포함하는 혈액질환의 진단 또는 예측을 위한 정보제공 방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계는 대조군에 비해 COTL1 유전자 또는 단백질의 발현양이 감소하는 경우, 혈액질환으로 진단 또는 예측하는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 혈액질환은 재생불량성 빈혈, 악성 림프종, 급성 골수성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 만성 간장애, 신부전, 중증 감염증, 골수 장애성 혈소판 감소증, 특발성 혈소판 감소성 자반병(ITP), 혈소판 무력증, 림프구 감소증, 호중구 감소증, 단핵구 감소증, 과립구 감소증 및 골수 증식성 질환으로 구성된 군에서 선택되는 것이 바람직하나, 조혈모세포의 항상성 이상에 의해 유발되는 혈액질환이라면 한정되지 않으며, 상기 항상성은 세포의 분화 또는 증식과 손상 또는 사멸의 균형이 유지되는 것을 특징으로 할 수 있다. 또한, 상기 혈액질환은 미토콘드리아의 항상성 이상에 의해 유발될 수 있으며, 상기 항상성은 미토콘드리아가 분열 (fission)과 융합 (fusion)을 반복하여 형태 (morphology), 양 (amount) 및 수 (number)를 유지하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 시료는 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액, 땀, 뇨, 복수액 및 복막액으로 구성되는 군에서 선택되는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 COTL1 유전자의 발현을 측정하는 물질은 COTL1 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머 또는 COTL1 유전자에 특이적으로 결합하는 프로브이고, 상기 COTL1 단백질의 발현을 측정하는 물질은 COTL1 단백질에 특이적인 항체 또는 압타머인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 용어, "프라이머"는 짧은 자유 3 말단 수산화기(free 3` hydroxyl group)을 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형(template)와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형의 복사를 위한 시작지점으로는 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 본 발명에서는 본 발명 마커 폴리뉴클레오티드의 센스 및 안티센스 프라이머를 이용하여 PCR 증폭을 실시하여 원하는 생성물의 생성 여부를 통해 위암의 예후를 예측할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.
본 발명의 "프로브"란 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며, 라벨링되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클레오티드 프로브, 단쇄 DNA(single straned DNA) 프로브, 이중쇄 DNA (double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다.
본 발명에서 용어, "항체"란 당해 분야에서 공지된 용어로서 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 본 발명의 마커에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 이러한 항체는 각 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현벡터에 클로닝하여 상기 마커 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 얻고, 얻어진 단백질로부터 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 여기에는 상기 단백질에서 만들어질 수 있는 부분 펩티드도 포함한다.
본 발명의 "항체"는 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체 등을 모두 포함하며 항체란 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다.
본 발명에서 용어 "압타머(Aptamer)"는 그 자체로 안정된 삼차구조를 가지면서 표적분자에 높은 친화성과 특이성으로 결합할 수 있는 특징을 가진 단일가닥 핵산(DNA, RNA 또는 변형핵산)이다. 압타머는 고유의 높은 친화성(보통 pM 수준)과 특이성으로 표적분자에 결합할 수 있다는 특성 때문에 단일 항체와 비교가 되고, 특히 "화학 항체"라고 할 만큼 대체 항체로서의 높은 가능성이 있다. 본 발명에 있어서, 상기 앱타머(aptamer)는 단일 사슬 DNA 또는 RNA 분자로서, SELEX(systematic evolution of ligands by exponential enrichment)라 불리는 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide) 라이브러리를 이용한 진화적인 방법에 의해 특정 화학 분자나 생물학적 분자에 높은 친화력과 선별력을 갖고 결합하는 올리고머를 분리하여 수득할 수 있다(C. Tuerand L. Gold, Science 249, 505 - 510, 2005; A. D. Ellington and J. W. Szostak, Nature 346, 818 - 822, 1990; M. Famulok, et. al., Acc. Chem. Res. 33, 591 - 599, 2000; D. S. Wilson and Szostak, Annu. Rev. Biochem. 68, 611 - 647, 1999). 앱타머는 표적에 특이적으로 결합하고 표적의 활성을 조정할 수 있는데, 예컨대, 결합을 통하여 표적이 기능하는 능력을 차단할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 측정은 역전사중합효소반응 (RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응 (Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응 (Realtime RT-PCR), RNase 보호 분석법 (RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅 (Northern blotting), DNA 칩, 면역블롯, ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석 (RIA: Radioimmunoassay), 방사선 면역 확산법, 오우크테로니 (Ouchterlony) 면역확산법, 로케트 (rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정분석법 (Complement fixation assay), 유세포분석 (FACS: Fluorescence activated cell sorter) 및 단백질 칩으로 구성되는 군에서 선택된 어느 하나를 이용하는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 다른 관점에서, COTL1 단백질 또는 COTL1을 발현하는 전달체를 유효성분으로 함유하는 혈액질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 혈액질환은 재생불량성 빈혈, 악성 림프종, 만성 간장애, 신부전, 중증 감염증, 골수 장애성 혈소판 감소증, 특발성 혈소판 감소성 자반병(ITP), 혈소판 무력증, 림프구 감소증, 호중구 감소증, 단핵구 감소증, 과립구 감소증 및 골수 증식성 질환으로 구성된 군에서 선택되는 것이 바람직하나, 조혈모세포의 항상성 이상에 의해 유발되는 혈액질환 또는 정상 조혈모세포 수가 감소하는 것을 특징으로 하는 혈액질환이라면 한정되지 않는다.
또한, 상기 항상성은 세포의 분화 또는 증식과 손상 또는 사멸의 균형이 유지되는 것을 특징으로 할 수 있으며, COTL1 단백질 또는 유전자의 발현은 정상 조혈모세포 수를 증가시켜 상기 조혈모세포 수가 감소하는 혈액질환을 치료할 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, COTL1 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 혈액질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 혈액질환은 급성 골수성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병 및 급성 골수성 백혈병으로 구성된 군에서 선택되는 것이 바람직하나, 조혈모세포의 항상성 이상에 의해 유발되는 혈액질환 또는 조혈모세포의 이상증식이 증가하는 것을 특징으로 하는 혈액질환이라면 한정되지 않는다.
또한, 상기 항상성은 세포의 분화 또는 증식과 손상 또는 사멸의 균형이 유지되는 것을 특징으로 할 수 있으며, 조혈모세포의 항상성 이상은 조혈모세포의 비정상적인 분화와 증식을 일으켜 백혈병과 같은 난치성 혈액질환을 유발시킬 수 있다. 따라서, COTL1 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 이용하여 비정상적인 조혈모세포의 이상증식을 억제시킬 수 있으므로, 백혈병에서 COTL1 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 이용하여 비정상적인 조혈모세포 수를 감소시키고, 조혈모세포의 이상증식을 억제할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 억제제는 COTL1 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, 작은 간섭 RNA(short interfering RNA) 및 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA) 및 COTL1 단백질에 상보적으로 결합하는 앱타머, 항체 및 소분자 (small molecule)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명에서, 상기 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는 데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 약학 조성물에 포함된 상기 제제의 함량은 특별히 이에 제한되지 않으나, 최종 조성물 총중량을 기준으로 0.0001 내지 50 중량%, 보다 바람직하게는 0.01 내지 10 중량%의 함량으로 포함할 수 있다.
상기 본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있는데, 본 발명의 용어 "약제학적으로 유효한 양"이란 의학적 치료 또는 예방에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료 또는 예방하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 질환의 중증도, 약물의 활성, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 사용된 본 발명 조성물의 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율 치료기간, 사용된 본 발명의 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하다.
본 발명의 약학조성물의 투여량은 사용목적, 질환의 중독도, 환자의 연령, 체중, 성별, 기왕력, 또는 유효성분으로서 사용되는 물질의 종류 등을 고려하여 당업자가 결정할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 약학 조성물을 사람을 포함하는 포유동물에 하루 동안 10 내지 100 ㎎/㎏, 보다 바람직하게는 10 내지 30 ㎎/㎏으로 투여할 수 있고, 본 발명의 조성물의 투여빈도는 특별히 이에 제한되지 않으나, 1일 1회 내지 3회 투여하거나 또는 용량을 분할하여 수회 투여할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "예방"이란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 혈액 종양을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "치료"란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 혈액 종양에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 용어 "투여"란, 어떠한 적절한 방법으로 대상에게 본 발명의 약학 조성물을 도입하는 행위를 의미하며, 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여도 투여될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 특별히 이에 제한되지 않으나, 목적하는 바에 따라 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여될 수 있다. 또한, 상기 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, (a) 세포에 시험물질을 처리하는 단계; (b) 상기 세포에서 COTL1 유전자 또는 단백질의 발현을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 측정된 COTL1 유전자 또는 단백질의 발현양이 시험물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 증가한 시험물질을 선별하는 단계를 포함하는 혈액질환 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 세포는 COTL1 유전자가 도입된 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 스크리닝 방법을 언급하면서 사용되는 용어 "시험물질"은 유전자의 발현량에 영향을 미치거나, 단백질의 발현 또는 활성에 영향을 미치는지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 미지의 후보 물질을 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 혈액질환은 재생불량성 빈혈, 악성 림프종, 급성 골수성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 만성 간장애, 신부전, 중증 감염증, 골수 장애성 혈소판 감소증, 특발성 혈소판 감소성 자반병(ITP), 혈소판 무력증, 림프구 감소증, 호중구 감소증, 단핵구 감소증, 과립구 감소증 및 골수 증식성 질환으로 구성된 군에서 선택되는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 측정은 역전사중합효소반응 (RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응 (Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응 (Realtime RT-PCR), RNase 보호 분석법 (RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅 (Northern blotting), DNA 칩, 면역블롯, ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석 (RIA: Radioimmunoassay), 방사선 면역 확산법, 오우크테로니 (Ouchterlony) 면역확산법, 로케트 (rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정분석법 (Complement fixation assay), 유세포분석 (FACS: Fluorescence activated cell sorter) 및 단백질 칩으로 구성되는 군에서 선택된 어느 하나를 이용하는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
항체
항-Cot11 (Abcam, T3481), 항-F-actin (Abcam, ab205), 항-Drp1 (BD Transduction Laboratories, 611112), 항-CoxIV (Abcam.Ab135711), 항-베타 액틴 (Santa Cruz, sc-1616), 항-GAPDH (Santa Cruz, sc-365062), 항-Lamin B1 (Abcam 6581-1), anti-Opa1 (BD Transduction Laboratories, 612607)
실시예 1: 미토콘드리아 길이가 다른 3종의 HeLa 세포 제작
Human full length Cotl1을 제조사의 지시에 따라 pEGFP-N1, paGFP-N1, pmCherry-N1, pcDNA3.1, pCMV-Mcy-Tag 3에 클로닝한 다음, QuickChange 돌연변이 키트 (Stratagene, Santa Clara, CA)를 사용하여 점 돌연변이를 유발시킨 플라스미드를 제작하였다. Mito-GFP, DsRed2-Mito 플라스미드는 Richard Youle (National Institute Health, Bethesda, MD)로부터 받았으며, GFP-UtrCH (Plasmid # 26737)는 Addgene으로부터 구입하였다.
Hela 세포주를 10% FBS, 페니실린 (100U/mL) 및 스트렙토마이신 (100㎍/mL)이 첨가된 DMEM 배지에서 배양한 다음, Lipofectamine 2000 (Invitrogen)을 이용하여 상기 제작한 플라스미드로 OPTi-MEM 배지 (Invitrogen)의 6-웰 디쉬(2x105 세포/웰)에서 제조사의 지시에 따라 하룻밤 동안 형질감염시켰다.
상기 방법으로, 유전자 조작에 의해 인위적으로 미토콘드리아 길이가 다른 3종의 HeLa 세포 (shDrp1, shRNA control, shOpa1)를 제작한 후, 미토콘드리아 형태를 confocal 현미경으로 확인하였다(도 4a). 적색 채널 (Mitotracker 또는 DsRed2-Mito)의 경우 최대 강도 투영을 조합했으며, 명확하게 세포 당 25-40 개의 미토콘드리아를 선택하고 길이 분석을 Nikon Elements 또는 Metamorph 소프트웨어를 사용하여 측정하였다.
실시예 2: COTL1의 세포내 분포 변화로 인한 미토콘드리아 길이
2-1: 미토콘드리아 길이가 다른 세포내 COTL1의 분포
실시예 1에서 제작한 세포 (2.5 x 106 세포)를 두 개의 100 mm 접시에서 배양한 후, 제조사의 지시에 따라 세포 분획 키트 (Abcam, ab109719)을 사용하여 세포질, 핵 및 미토콘드리아 분획물을 분리하였다. Cox IV (Abcam), Lamin-B1 (Abcam), GAPDH (Santa Cruz)를 미토콘드리아, 핵 및 세포질 로딩 콘트롤로로 각각 사용하였다.
미토콘드리아 길이가 다른 3종류의 세포에서 COTL1의 세포내 분포를 핵, 세포질 및 미토콘드리아 분획에서 분석한 결과, 미토콘드리아 길이가 신장된 shDrp1 세포에서 COTL1 단백질이 세포질에서 미토콘드리아로 많이 이동하였음을 확인하였다 (도 4b).
2-2: 면역형광현미경에 의한 세포내 COTL1의 분포 관찰
세포를 면역형광현미경으로 관찰하기 위해, 인산염 완충 식염수 (PBS)로 세척하고 실온에서 20분 동안 4% 포름알데히드 (Electron Microscopy Sciences)로 고정시켰다. 0.1 % Triton X-100으로 30분간 투과 처리하고, 10% FBS를 함유하는 블로킹 완충액으로 1시간 동안 인큐베이션 하였다. 샘플을 실온에서 2시간 동안 블로킹 완충액 중에서 anti-Cotl1 1차 항체 (Abcam, T3481)로 배양한 후, PBS로 세척하여 2차 항체를 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 2차 항체 반응 후, 필요한 경우 500 nM Alex Fluor 568 Phallaoidin (Invitrogen), Alex Fluor 350 Phalloidin (Invitrogen) 또는 MitoTracker Red CMXRos (Invitrogen)를 사용하였으며, DAPI (Invitrogen)로 염색을 하거나 하지 않고 VECTASHIELD에 마운팅하였다.
Confocal 현미경 이미지 분석 결과, 미토콘드리아 길이가 신장된 shDrp1 세포에서 COTL1 단백질이 세포질에서 미토콘드리아로 많이 이동하였음을 확인하였다 (도 4c).
실시예 3: COTL1과 결합하는 F-actin에 의한 미토콘드리아 형태
3-1: COTL1 발현 억제에 의한 F-actin
COTL1은 세포골격을 조절하는 다양한 형태의 액틴(actin) 단백질과 결합하는데, 특히 F-actin과 주로 결합한다고 보고되어 있다. 또한, 이러한 세포 골격을 형성하는 actin 단백질은 미토콘드리아 융합과 분열의 균형을 조절하는데 관여하고 있다. 따라서, COTL1의 이상에 의한 F-actin이 미토콘드리아 형태에 미치는 영향을 분석하였다.
먼저, short hairpin RNA (shRNA)가 삽입된 렌티바이러스를 이용하여 COTL1의 유전자 발현억제(knock down)를 유도하고, 이를 웨스턴블로팅(Western blotting)으로 확인하였다 (도 5a).
Cotl1을 하향조절하기 위한 Mission shRNAi 벡터 (RNAi #1; TRCN0000072549, RNAi #2; TRCN0000072550, RNAi #3; TRCN0000291958, RNAi #4; TRCN0000292021, RNAi #5; TRCN0000310158)는 Sigma-Aldrich로부터 구입하였고, pCDH-CMV-MCS-T2A-puro 렌티 바이러스 발현 벡터는 System Bionsciences로부터 구입하였다. Human total Opa1 및 Drp1에 대한 올리고뉴클레오타이드는 표적서열 5'-GAUGAAGUUAUCAGUCUGAGCCAGGUUAC-3' (Opa1: 서열번호 1) 및 5'-UUCAAUCCGUGAUGAGUAUGCUUUUCUUC-3' (Dpr1: 서열번호 2)에 대해 IDT Oligo로 합성하였다.
세포를 SDS-PAGE 완충액에 재현탁하고 100℃에서 5분간 끓인 후, 단백질을 8-12% 폴리아크릴아미드 겔에서 분석하여 PVDF 멤브레인 (polyvinylidine difluoride membrane,Millipore)으로 이동시켜 SDS-PAGE를 수행하였다. 멤브레인을 5% (w/v) 무지방 건조밀크 또는 BSA로 1시간 동안 블로킹 한 다음 4℃에서 1차 항체로 밤새 배양하고, PBS/0.1% Tween-20으로 세척한 후 실온에서 1시간 동안 2차 항체로 배양한 다음, WEST-ZOL plus ECL 웨스턴 블럿 검출 시스템 (iNtRON BioTechnology)으로 시각화하였다.
3-2: COTL1 변이에 의한 F-actin
F-actin에 결합하지 않는 COTL1 R75E 변이를 제작하여 면역침강법(immunoprecipitation, IP)으로 확인하였다 (도 5b).
면역침강 (IP)을 위해 세포를 RIPA 완충액 (150 mM NaCl, 1% Nonidet P-40, 0.5% sodium deoxycholate, 0.1% SDS 및 50mM Tris 완충액, pH 8.0)에서 4℃로 용해시킨 후, 용해물을 4℃에서 13000 rpm으로 20분간 원심분리 하였다. 상청액을 수집하고, 4℃에서 2시간 동안 Protein A Sepharose beads (GE Biosciences)를 사용하여 사전제거를 하였다. 2ug의 적절한 항체를 첨가하고 콜드룸에서 밤새 배양하여, Protein A sepharose beads와 결합한 면역 복합체를 포획하였다.
그 결과, COTL1 발현억제 및 COTL1 R75E 변이 과발현시에 F-actin의 비정상적인 형태가 나타났으며, 미토콘드리아에서의 F-actin의 분포가 증가하고 미토콘드리아 길이 또한 신장되는 것을 확인하였다 (도 5c). 이를 통해 COTL1은 F-actin의 형태를 조절함으로써 미토콘드리아 다이나믹스에 영향을 미친다는 것을 알 수 있었다.
실시예 4: 지브라피쉬(zebra fish)에서 cotl1의 발현량과 분포
인간 COTL1과 zebrafish cotl1의 아미노산 서열을 비교하면, 81%의 높은 유사성이 있었기 때문에 COTL1 유전자/단백질은 생물종간에 서열이 잘 보존되고 있음을 알 수 있다. 따라서, 동물실험을 통해 COTL1 유전자 발현억제 시에 나타나는 현상을 관찰하였다.
지브라피쉬(zebra fish)에서 인간 COTL1의 상동유전자인 cotl1의 발현량과 분포를 관찰하기 위해, Zebrafish 국제 자원 센터 (Eugene, OR)에서 야생형 (WT) 제브라 피쉬 (AB strain)를 얻은 후, 표준절차 (Westerfield M. THE ZEBRAFISH BOOK: A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). 5 ed: University of Oregon Press, 2007)에 따라 관리되고, 표준 기준 (Kimmel CB et al., Dev Dyn 203:253-310, 1995)에 따라 수정 후 시간 (hpf; hours post-fertilization) 또는 수정 후 일 (dpf; days post-fertilization)로 단계화 되었다. 멜라닌 합성을 억제하기 위해 배아를 1-phenyl-2-thiourea (Sigma-Aldrich, MO)로 처리하였다. 지브라피쉬 발생단계(developmental stage)에서 in situ hybridization을 통해 cotl1의 발현을 확인하였다.
먼저, 지브라피쉬 총 RNA를 Trizol (Thermo Fisher, MA)을 사용하여 2 dpf WT 유충에서 추출하고, SuperScript III First-Strand Synthesis System (Thermo Fisher)을 사용하여 cDNA로 전환시켰다 (Lim HS et al., Chonnam Med J 52:45-52, 2016). cDNA와 프라이머 (서열번호 3: 5'-TCG GCG GAT CCA CCA TGG CAA CAC GAA TTG AC-3' 및 서열번호 4: 5'-TAG TC C TCG AGT TAT TCA GCC TGG GCA TC-3')를 사용한 PCRdp 의해 지브라피쉬 cotl1을 증폭하였다. 증폭된 PCR 산물을 pCS4 + 플라스미드 (Chang-Yeol Yeo 제공; Jin YH et al., J Biol Chem 279:29409-17, 2004)의 BamHI / XhoI 사이트에 클로닝하고, 제작된 플라스미드를 DNA sequencing (Macrogen, Korea)으로 확인하였다. cotl1 riboprobes를 생성하기 위해, 상기 제작한 cotl1 또는 c- myb를 암호화하는 pCS4 + 플라스미드를 BamHI로 선형화한 다음 T7 RNA 중합효소 (Thermo Fisher) 및 DIG RNA Labeing Kit (Roche, Switzerland)를 사용하여 RNA로 시험관 내 전사하였다. In situ hybridization은 cotl1 또는 c- myb riboprobes를 사용하여 이전에 기술된 방법 (Kim KH et al., Aquat Toxicol 134-135:57-65, 2013)으로 수행하였으며, 이미지는 V20 stereomicroscope (Zeiss, Germany)으로 찍은 다음 Adobe Photoshop CS6 (San Jose, CA)을 사용하여 조립하였다.
그 결과, cotl1은 수정 40시간 후 (40 hpf)와 수정 3, 4일 후에 조혈계, 위장관쪽 및 뇌에서 많이 발현되는 것을 확인하였다 (도 6).
실시예 5: 지브라피쉬에서 cotl1 발현 억제
5-1: cotl1 발현 억제를 위한 morpholino (MO) RNA
지브라피쉬에서 cotl1 발현을 억제하기 위해, morpholino(MO) RNA를 사용하였다.
cotl1 morpholino 올리고 뉴클레오티드 (cotl1 MO) (서열번호 5: 5'-CAA GAC AGG TAA ACA GCA CTC ACC T-3')는 cotl1의 엑손 2- 인트론 2 연결 부위를 표적으로 하고 Gene Tools (OR)에서 구입하였다. 1 세포 단계 배아에 대조군 MO (6 ng; 서열번호 6: 5'-CCT CTT ACC TCT GTT ACA ATT TAT A-3') 또는 cotl1 MO (6 ng)를 주사하였고, 지시된 단계로 고정될 때까지 28.5℃의 배아 배지에서 배양하였다. cotl1 mRNA를 합성하기 위해, cotl1을 암호화하는 pCS4 + 플라스미드를 XhoI로 선형화시킨 다음, SP6 mMESSAGE mMACHINE 키트 (Thermo Fisher)를 사용하여 제조사의 지시에 따라 RNA로 시험관 내 전사하였다. 이어서, cotl1 MO (6 ng)와 cotl1 mRNA (70 pg)를 1 세포 단계 배아에 순차적으로 주입하고, 주입한 배아를 2 dpf까지 배양 한 다음 c-myb riboprobes로 탐침하였다.
도 7에 모폴리노(MO) RNA의 위치와 모폴리노 RNA의 발현을 확인한 결과를 나타내었다.
5-2: cotl1 발현 억제에 의한 조혈모세포 수 감소
형질변환 지브라피쉬에서 cotl1 발현이 억제를 확인하기 위해, 역전사 PCR을 수행하였다 (도8a).
대조군 MO 또는 cotl1 MO가 주입된 24 hpf 유충에서 총 RNA를 추출하고, SuperScript III First-Strand Synthesis System (Thermo Fisher)을 사용하여 cDNA로 역전사 하였다. 엑손 1-4를 포함하는 cDNA 단편을 프라이머 (서열번호 7: 5'-GAC AAA GAG GCT TGC AGA GA-3' 및 서열번호 8: 5'-TGG GGT CGC TGA TCA TAA AC-3')로 PCR 증폭시켜, RT-PCR을 수행하였다.
또한, 실시예 4의 in situ hybridization 방법을 사용하여 조혈모세포 검출 마커인 c- myb의 발현을 통해 cotl1 MO RNA를 처리한 수정후 2일째(2dpf) 지브라피쉬에서 조혈모세포가 현저히 감소한 것을 확인하였으며, cotl1 RNA를 함께 주입한 지브라피쉬는 대조군에 비해 큰 차이가 없었다 (도8a). 아울러, 조혈모세포에서만 GFP(green florescence protein)를 발현하는 형질변환 지브라피쉬에서도 cotl1 발현이 억제되면 조혈모세포 숫자가 확연히 감소하는 것을 확인하였다 (도 8b).
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> AJOU UNIVERSITY INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> COTL1 Protein Involved in Maintaining Homeostasis of Hematopoietic Stem Cells and Use Thereof <130> P17-B030 <160> 8 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Opa1 <400> 1 gaugaaguua ucagucugag ccagguuac 29 <210> 2 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dpr1 <400> 2 uucaauccgu gaugaguaug cuuuucuuc 29 <210> 3 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer1 <400> 3 tcggcggatc caccatggca acacgaattg ac 32 <210> 4 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer2 <400> 4 tagtcctcga gttattcagc ctgggcatc 29 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cotl1 MO <400> 5 caagacaggt aaacagcact cacct 25 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> control MO <400> 6 cctcttacct ctgttacaat ttata 25 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer3 <400> 7 gacaaagagg cttgcagaga 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer4 <400> 8 tggggtcgct gatcataaac 20

Claims (17)

  1. 다음 단계를 포함하는 혈액질환의 진단 또는 예측을 위한 정보제공 방법:
    (a) 분리된 생물학적 시료로부터 COTL1 유전자 또는 단백질의 발현을 측정하는 단계; 및
    (b) 상기 측정된 COTL1 유전자 또는 단백질의 발현양을 대조군 시료와 비교하는 단계.
  2. 제1항에 있어서, (b) 단계는 대조군에 비해 COTL1 유전자 또는 단백질의 발현양이 감소하는 경우, 혈액질환으로 진단 또는 예측하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 혈액질환은 재생불량성 빈혈, 악성 림프종, 급성 골수성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 골수 장애성 혈소판 감소증, 특발성 혈소판 감소성 자반병(ITP), 혈소판 무력증, 림프구 감소증, 호중구 감소증, 단핵구 감소증, 과립구 감소증 및 골수 증식성 질환으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 혈액질환은 i) 조혈모세포의 항상성 이상, ii) 조혈모세포의 분화 또는 증식과 손상 또는 사멸의 균형 이상, 또는 iii) 미토콘드리아의 항상성 이상에 의해 유발되는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 시료는 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액, 땀, 뇨, 복수액 및 복막액으로 구성되는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 COTL1 유전자의 발현을 측정하는 물질은 COTL1 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머 또는 COTL1 유전자에 특이적으로 결합하는 프로브이고, 상기 COTL1 단백질의 발현을 측정하는 물질은 COTL1 단백질에 특이적인 항체 또는 압타머인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. COTL1 단백질 또는 COTL1을 발현하는 전달체를 유효성분으로 함유하는 혈액질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 혈액질환은 재생불량성 빈혈, 악성 림프종, 골수 장애성 혈소판 감소증, 특발성 혈소판 감소성 자반병(ITP), 혈소판 무력증, 림프구 감소증, 호중구 감소증, 단핵구 감소증, 과립구 감소증 및 골수 증식성 질환으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  9. 제7항에 있어서, 상기 혈액질환은 정상 조혈모세포 수가 감소하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  10. COTL1 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 혈액질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 상기 혈액질환은 급성 골수성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병 및 급성 골수성 백혈병으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  12. 제10항에 있어서, 상기 혈액질환은 조혈모세포의 이상증식이 증가하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  13. 제10항에 있어서, 상기 억제제는 COTL1 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, 작은 간섭 RNA(short interfering RNA) 및 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA) 및 COTL1 단백질에 상보적으로 결합하는 앱타머, 항체 및 소분자 (small molecule)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 조성물.
  14. 다음 단계를 포함하는 혈액질환 치료제의 스크리닝 방법:
    (a) 세포에 시험물질을 처리하는 단계;
    (b) 상기 세포에서 COTL1 유전자 또는 단백질의 발현을 측정하는 단계; 및
    (c) 상기 측정된 COTL1 유전자 또는 단백질의 발현양이 시험물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 증가한 시험물질을 선별하는 단계.
  15. 제14항에 있어서, 상기 세포는 COTL1 유전자가 도입된 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제14항에 있어서, 상기 혈액질환은 재생불량성 빈혈, 악성 림프종, 급성 골수성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 만성 간장애, 신부전, 중증 감염증, 골수 장애성 혈소판 감소증, 특발성 혈소판 감소성 자반병(ITP), 혈소판 무력증, 림프구 감소증, 호중구 감소증, 단핵구 감소증, 과립구 감소증 및 골수 증식성 질환으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제14항에 있어서, 상기 측정은 역전사중합효소반응 (RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응 (Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응 (Realtime RT-PCR), RNase 보호 분석법 (RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅 (Northern blotting), DNA 칩, 면역블롯, ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석 (RIA: Radioimmunoassay), 방사선 면역 확산법, 오우크테로니 (Ouchterlony) 면역확산법, 로케트 (rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정분석법 (Complement fixation assay), 유세포분석 (FACS: Fluorescence activated cell sorter) 및 단백질 칩으로 구성되는 군에서 선택된 어느 하나를 이용하는 것을 특징으로 하는 방법.
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