KR20180124189A

KR20180124189A - 스쿠알렌 생산용 메탄자화균 변이주

Info

Publication number: KR20180124189A
Application number: KR1020170057991A
Authority: KR
Inventors: 이은열; 전영찬; 이옥경
Original assignee: 경희대학교 산학협력단
Priority date: 2017-05-10
Filing date: 2017-05-10
Publication date: 2018-11-21
Also published as: KR102030122B1

Abstract

본 발명은 야생형 균주에 비하여 스쿠알렌 호펜 사이클라아제(Squalene hopene cyclase, Shc) 단백질의 활성이 약화된 메탄자화균 변이주, 상기 메탄자화균 변이주를 포함하는 스쿠알렌 생산용 조성물, 상기 스쿠알렌 생산용 조성물을 포함하는 스쿠알렌 생산용 키트 및 상기 메탄자화균 변이주를 배양하는 단계를 포함하는 스쿠알렌을 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 메탄자화균 변이주는 내재적으로 생산한 스쿠알렌을 호펜으로 전환시킬 수 없어, 스쿠알렌의 생산성을 향상시킬 수 있으므로, 스쿠알렌을 이용한 다양한 제품의 개발에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Description

스쿠알렌 생산용 메탄자화균 변이주{Methanotroph mutant for producing squalene}

본 발명은 스쿠알렌 생산용 메탄자화균 변이주에 관한 것으로, 보다 구체적으로, 본 발명은 야생형 균주에 비하여 스쿠알렌 호펜 사이클라아제(Squalene hopene cyclase, Shc) 단백질의 활성이 약화된 메탄자화균 변이주, 상기 메탄자화균 변이주를 포함하는 스쿠알렌 생산용 조성물, 상기 스쿠알렌 생산용 조성물을 포함하는 스쿠알렌 생산용 키트 및 상기 메탄자화균 변이주를 배양하는 단계를 포함하는 스쿠알렌을 생산하는 방법에 관한 것이다.

메탄자화균은 메탄을 포함한 단일탄소 기질을 유일 탄소원 및 에너지원으로 사용할 수 있는 원핵생물이다. 메탄자화균은 메탄산화효소를 보유하고 있어 메탄을 메탄올로 산화시킬 수 있고 일련의 대사과정을 거쳐 바이오매스로 전환할 수 있는 능력을 가졌다. 메탄산화효소는 수용성 메탄산화효소(soluble methane monooxygenase; sMMO), 미립자메탄산화효소(particulate methane monooxygenase; pMMO)로 분류된다. pMMO는 sMMO와 비교하여 메탄에 대해 더 높은 친화력을 가지고 있어 메탄을 산화시켜 성장하는 세포내에서의 주요 생체 촉매로 생각되며, 상온 상압에서 메탄을 수산화하여 상온 상압에서의 메탄올 전환을 가능하게 한다. 구리가 존재하는 환경에서는 sMMO의 발현이 억제됨과 동시에 pMMO의 발현이 유도되며 pMMO는 막 단백질로서 세포막에 존재하여 메탄을 산화시킨다. 메탄이 산화되어 생성된 메탄올은 각종 화합물과 바이오연료로서의 사용이 가능한 고부가가치 산물이며, 이에 따라 메탄자화균을 이용한 메탄-메탄올 전환 연구가 국내외로 진행되고 있다.

한편, 상기 메탄자화균은 다양한 물질 대사과정(RuMP, Serine cycle, EMC, TCA etc.)을 통해 메탄을 메탄올 이외의 다른 물질로 전환시킬 수도 있다. 예를 들어, 탄소원으로서 메탄을 사용하여 균체 내부에서 다양한 생합성 경로를 통해 스쿠알렌, 호펜, 호페노이드 등을 생산할 수 있다고 알려져 있다.

상기 스쿠알렌은 건강에 미치는 유익한 효과에 대한 소비자의 인식 제고와 함께 화장품, 식품, 의약품 분야에서 널리 사용되고 있으며 특히, 뛰어난 보습 효과로 인해 화장품은 스쿠알렌이 가장 활발하게 사용되고 있는 분야로 손꼽힌다. 현재, 스쿠알렌은 주로 식물소재(올리브, 아마란스씨 등)와 동물소재(상어간유)에서 추출하고 있으나, 식물소재의 경우, 스쿠알렌의 함량이 낮아 생산성이 낮고, 동물소재의 경우 동물보호 차원에서 규제가 강화되고 있어, 새로운 스쿠알렌의 생산기술을 개발하여는 연구가 활발히 진행되고 있다. 예를 들어, 한국등록특허 제1137026호에는, HMG-CoA 리덕타제 (hydroxymethylglutaryl CoA reductase) 및 파네실 파이로포스페이트 신타제 (farnesyl pyrophosphate synthase)를 발현하는 벡터를 도입시켜 제조된 효모 변이주 및 상기 변이주를 이용한 스쿠알렌의 생산 방법이 개시되어 있다.

이러한 배경하에서, 본 발명자들은 새로운 스쿠알렌의 생산기술을 개발하고자 예의 연구노력한 결과, 메탄자화균에서 스쿠알렌 호펜 사이클라아제의 활성을 약화 또는 억제할 경우, 메탄자화균내에서 생합성된 스쿠알렌의 소모를 억제함으로써, 스쿠알렌의 생산성을 향상시킬 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 야생형 균주에 비하여 스쿠알렌 호펜 사이클라아제(Squalene hopene cyclase, Shc) 단백질의 활성이 약화된 메탄자화균 변이주를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 메탄자화균 변이주를 포함하는 스쿠알렌 생산용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 스쿠알렌 생산용 조성물을 포함하는 스쿠알렌 생산용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 메탄자화균 변이주를 배양하는 단계를 포함하는 스쿠알렌을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명자들은 새로운 스쿠알렌의 생산기술을 개발하고자 미생물을 이용하여 스쿠알렌을 생산하는 기술을 개발하기 위한 연구를 수행하였다. 미생물을 이용하여 스쿠알렌을 생산하는 기술로서 대표적인 것은 HMG-CoA 리덕타제(hydroxymethylglutaryl CoA reductase) 및 파네실 파이로포스페이트 신타제(farnesyl pyrophosphate synthase)를 도입한 형질전환 효모를 이용하여 스쿠알렌을 비교적 우수한 수율로 생산하는 기술이 개발되어 있다. 그러나, 상기 형질전환 효모를 사용할 경우, 스쿠알렌의 합성을 위한 탄소원으로서 글루코스를 사용하게 되는데, 스쿠알렌의 생산수율을 증가시키기 위하여는 대량의 글루코스가 요구되기 때문에, 생산단가가 비교적 높다는 단점이 있음을 확인하였다.

이에 따라, 본 발명자들은 미생물을 이용하면서도 비교적 낮은 수준의 생산비용으로 스쿠알렌을 생산할 수 있는 기술을 개발하고자 다양한 연구를 수행한 결과, 스쿠알렌 호펜 사이클라아제(Squalene hopene cyclase, Shc) 단백질의 활성을 약화시킨 메탄자화균 변이주를 사용하여 스쿠알렌을 생산하는 방법을 개발하였다. 상기 메탄자화균에서 Shc 단백질의 활성을 약화 또는 불활성화시킬 경우에도, 메탄자화균의 성장에는 아무런 영향을 미치지 않고, 단지 스쿠알렌의 생산성을 향상시킬 수 있음을 확인하였다.

이처럼, 메탄자화균 변이주를 사용한 스쿠알렌의 생산방법은 지금까지 전혀 알려져 있지 않고, 본 발명자에 의하여 최초로 개발되었다.

상기 목적을 달성하기 위한 일 실시양태로서, 본 발명은 야생형 메탄자화균의 스쿠알렌 호펜 사이클라아제 ( Squalene hopene cyclase , Shc ) 단백질의 활성에 비하여, 상기 Shc 단백질의 활성이 약화된 , 스쿠알렌 생산능을 갖는 메탄자화균 변이주를 제공한다.

본 발명의 용어 "메탄자화균(Methanotroph)"이란, 메탄산화세균이라고도 호칭되며, 메탄을 유일탄소원으로 이용하여 생육하는 원핵생물을 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 메탄자화균은 스쿠알렌을 생산하는 균주로서 사용되는데, 스쿠알렌을 생산하는 효과를 나타내는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서, 메틸로모나스(Methylomonas) 속, 메틸로박터(Methylobacter) 속, 메틸로코커스(Methylococcus) 속, 메틸로마이크로븀(Methylomicrobium) 속, 메틸로스페라(Methylosphaera) 속, 메틸로칼덤(Methylocaldum) 속, 메틸로글로버스(Methyloglobus) 속, 메틸로사르시나(Methylosarcina) 속, 메틸로프로펀더스(Methyloprofundus) 속, 메틸로썰머스(Methylothermus) 속, 메틸로할로비우스(Methylohalobius) 속, 메틸로게아(Methylogaea) 속, 메틸로마리넘(Methylomarinum) 속, 메틸로벌럼(Methylovulum) 속, 메틸로마리노범(Methylomarinovum) 속, 메틸로러브럼(Methylorubrum) 속, 메틸로파라코커스(Methyloparacoccus) 속, 메틸로시너스(Methylosinus) 속, 메틸로시스티스(Methylocystis) 속, 메틸로셀라(Methylocella) 속, 메틸로캡사(Methylocapsa) 속, 메틸로퍼룰라(Methylofurula) 속, 메틸아시디필럼(Methylacidiphilum) 속, 메틸아시디마이크로븀(Methylacidimicrobium) 속 등에 속하는 균주가 될 수 있고, 다른 예로서, 메틸로모나스(Methylomonas) 속 균주가 될 수 있다.

본 발명의 용어 "스쿠알렌 호펜 사이클라아제(Squalene hopene cyclase, Shc)"란, 호판-22-올 히드로-라이아제(hopan-22-ol hydro-lyase)라고도 호칭되고, 스쿠알렌을 펜타사이클릭 트리테르펜 호펜(pentacyclic triterpenes hopene) 또는 호파놀(hopanol)로 전환시키는 반응을 촉매하는, 테르펜 사이클라제/뮤타제(terpene cyclase/mutase) 패밀리에 속하는 원핵생물의 효소를 의미한다. 상기 Shc 단백질 및 이를 코딩하는 유전자 정보는 미국 국립 보건원 GenBank와 같은 데이터베이스를 통하여 얻을 수 있다(ADV62863.1, ADY59752.1 등).

본 발명에 있어서, 상기 Shc 단백질 또는 유전자는 메탄자화균에서 발현되어 스쿠알렌을 호펜으로 전환시키는 활성을 나타내기 때문에, 메탄자화균에서 상기 Shc 단백질의 활성을 약화시키면, 메탄자화균 내에서 생성된 스쿠알렌 중에서 호펜으로 전환되는 비율이 낮아진다. 따라서, 메탄자화균에서 상기 Shc 단백질의 활성을 약화시키면 결과적으로 스쿠알렌의 생산성이 증가하게 된다. 이처럼, 상기 Shc는 메탄자화균에서 스쿠알렌을 호펜으로 전환시키는 활성을 나타내는 한, 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서, 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 Shc 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자가 될 수 있다.

또한, 상기 Shc 단백질은 서열번호 1으로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 단백질뿐만 아니라, 서열번호 1과 80% 이상, 구체적으로는 90% 이상, 보다 구체적으로는 95% 이상, 보다 더욱 구체적으로는 99% 이상의 상동성을 가지는 단백질로서, 실질적으로 Shc 단백질과 동일하거나 상응하는 생물학적 활성을 가지는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가되는 아미노산 서열을 갖는 경우도 본 발명의 범주에 포함하며, 이는 당업자에게 자명하다.

본 발명에서 사용된 용어, “상동성”은 두 개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩타이드 모이티 사이의 동일성의 퍼센트를 말한다. 하나의 모이티로부터 다른 하나의 모이티까지의 서열 간 상동성은 알려진 당해 기술에 의해 결정될 수 있다. 예를 들면, 상동성을 서열정보를 정렬하고 용이하게 입수 가능한 컴퓨터 프로그램을 이용하여 두 개의 폴리뉴클레오티드 분자 또는 두 개의 폴리펩타이드 분자 간의 서열 정보를 직접 정렬하여 결정될 수 있다. 상기 컴퓨터 프로그램은 BLAST(NCBI), CLC Main Workbench(CLC bio), MegAlignTM(DNASTAR Inc) 등일 수 있다. 또한, 폴리뉴클레오티드 간 상동성은 상동 영역 간의 안정된 이중가닥을 이루는 조건 하에서 폴리뉴클레오티드의 혼성화한 후, 단일-가닥-특이적 뉴클레아제로 분해시켜 분해된 단편의 크기를 결정함으로써 결정할 수 있다.

본 발명의 용어 "단백질의 활성 약화"란, 천연의 상태에서 가지고 있는 단백질의 활성과 비교하였을 때, 그 활성이 감소되거나, 활성이 없는 것을 모두 포함하는 개념으로서, 상기 약화는 단백질의 활성이 약화되도록 변이된 것에 의해 기인한 것일 수 있고, 상기 변이는 비자연적으로 발생된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 Shc 단백질의 활성 약화는 상기 Shc 단백질을 암호화하는 유전자의 전체 또는 일부를 결실시키는 방법; 상기 Shc 단백질의 활성이 감소되도록 돌연변이된 유전자로, 염색체상의 상기 Shc 단백질을 암호화하는 유전자를 치환시키는 방법; 상기 Shc 단백질을 암호화하는 유전자의 발현 조절 서열에 변이를 도입하는 방법; 상기 Shc 단백질을 암호화하는 유전자의 발현 조절 서열을 활성이 약하거나 없는 서열로 교체하는 방법; 상기 Shc 단백질을 암호화하는 유전자의 전사체에 상보적으로 결합하여 상기 mRNA로부터 단백질로의 번역을 저해하는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 도입하는 방법; 상기 Shc 단백질을 암호화하는 유전자의 SD 서열 앞단에 SD 서열과 상보적인 서열을 인위적으로 부가하여 2차 구조물을 형성시켜 리보솜(ribosome)의 부착이 불가능하게 만드는 방법; 상기 Shc 단백질을 암호화하는 유전자의 ORF(open reading frame)의 3' 말단에 역전사되도록 프로모터를 부가하는 RTE(Reverse transcription engineering) 방법으로 이루어지는 군에서 선택되는 방법 등을 단독으로 또는 조합함으로써 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 단백질 활성을 약화시키는 방법이라면 어떠한 것이라도 적용될 수 있음은 당업자에게 자명하다.

다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 메탄자화균 변이주 또는 상기 변이주의 배양산물을 포함하는 스쿠알렌 생산용 조성물을 제공한다.

상술한 바와 같이, 메탄자화균에서 상기 Shc 단백질의 활성을 약화시키면 스쿠알렌의 생산성이 증가하게 되므로, Shc 단백질의 활성이 약화된 메탄자화균 변이주 또는 이의 배양물을 이용하면 야생형 메탄자화균 또는 이의 변이주 보다도 스쿠알렌을 높은 수율로 생산할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 메탄자화균 변이주의 배양산물은 스쿠알렌을 높은 수율로 생산하는데 사용될 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서, 상기 메탄자화균 변이주의 배양물, 배양상등액, 파쇄물, 이들의 분획물 등이 될 수 있고, 다른 예로서, 메탄자화균 변이주의 배양물을 원심분리하여 수득한 배양상등액, 메탄자화균 변이주를 물리적으로 또는 초음파처리하여 수득한 파쇄물, 상기 배양물, 배양상등액, 파쇄물 등을 원심분리, 크로마토그래피 등의 방법에 적용하여 수득한 분획물 등이 될 수 있다.

또 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 메탄자화균의 Shc 유전자를 변이시킬 수 있는 재조합 벡터를 포함하는 스쿠알렌 생산용 조성물을 제공한다.

구체적으로, 상기 스쿠알렌 생산용 조성물은 메탄자화균의 게놈에 존재하는 Shc 유전자의 상류 염기서열, 상기 Shc 유전자 치환용 염기서열 및 상기 Shc 유전자의 하류 염기서열을 순차적으로 포함하는 재조합 벡터를 포함한다.

상술한 바와 같이, 메탄자화균에서 상기 Shc 단백질의 활성을 약화시키면 스쿠알렌의 생산성이 증가하게 되므로, 상기 Shc 단백질의 활성을 약화시키도록 Shc 단백질을 코딩하는 유전자를 변이시킬 수 있는 재조합 벡터 역시 스쿠알렌 생산용 조성물의 유효성분으로 사용될 수 있다. 즉, 본 발명에 있어서, 상기 재조합 벡터는 메탄자화균 변이주의 제조에 사용될 수 있다.

일 예로서, 상기 재조합 벡터는 Shc 유전자의 상류 염기서열, 상기 Shc 유전자 치환용 염기서열 및 상기 Shc 유전자의 하류 염기서열을 순차적으로 포함할 수 있는데, 상기 상류 염기서열 및 하류 염기서열에 의하여, 메탄자화균에서 상동재조합을 유발시킴으로써, 메탄자화균에 존재하는 Shc 유전자를 상기 치환용 염기서열로 치환시켜서, Shc 단백질을 코딩하는 유전자를 변이시킬 수 있다.

이때, 상기 치환용 염기서열은 메탄자화균의 Shc 유전자를 변이시켜서 이로부터 발현되는 단백질의 활성을 약화시킬 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 Shc 유전자의 염기서열과 동일하지는 않으나 일정 수준의 상동성을 나타내는 염기서열이 될 수도 있고, Shc 유전자의 염기서열과 전혀 상동성을 나타내지 않는 염기서열이 될 수도 있다. 상기 치환용 염기서열이 Shc 유전자의 염기서열과 상동성을 나타내는 염기서열이 될 경우, 이에 의하여 제조된 메탄자화균 변이주는 Shc 단백질의 활성이 감소될 수 있다. 이때, Shc 유전자의 염기서열과 상동성을 나타내는 경우, 상기 상동성은 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서, 60 내지 90%가 될 수 있고, 다른 예로서, 30 내지 60%가 될 수 있으며, 또 다른 예로서, 5 내지 30%가 될 수 있다.

또한, 상기 치환용 염기서열이 Shc 유전자의 염기서열과 상동성을 나타내지 않는 염기서열이 될 경우, 이에 의하여 제조된 메탄자화균 변이주는 Shc 단백질의 활성을 나타내지 않을 수 있다.

또 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 스쿠알렌 생산용 조성물을 포함하는 스쿠알렌 생산용 키트를 제공한다.

본 발명의 스쿠알렌 생산용 키트는 상기 스쿠알렌 생산용 조성물을 포함하여 스쿠알렌을 생산하는데 사용될 수 있는데, 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 반응에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있고, 구체적인 예로 상기 스쿠알렌 생산에 사용되는 완충액, 상기 스쿠알렌 생산을 수행하기 위한 반응용기, 상기 스쿠알렌 생산을 수행하기 위한 진탕배양기, 상기 스쿠알렌 생산 반응을 수행하기 위한 타이머 등을 포함할 수 있다.

또 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 메탄자화균 변이주를 이용하여 스쿠알렌을 생산하는 방법을 제공한다.

구체적으로, 본 발명의 스쿠알렌 생산방법은 (a) 상기 메탄자화균 변이주를 배양하는 단계; 및 (b) 상기 배양된 메탄자화균 변주로부터 생산된 스쿠알렌을 회수하는 단계를 포함한다.

상기 방법에서 사용되는 메탄자화균 변이주는 상술한 바와 동일하다

상기 메탄자화균 변이주는 야생형 메탄자화균에서 Shc 단백질의 활성이 약화되었다는 점에서 차이가 있을 뿐, 나머지 특성은 야생형 메탄자화균과 동등하므로, 상기 메탄자화균 변이주의 배양은 탄소원으로 사용되는 메탄을 가하는 조건에서 수행할 수 있다.

본 발명의 용어 "배양"이란, 미생물을 적당히 인공적으로 조절한 환경조건에서 생육시키는 방법을 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 메탄자화균 변이주를 배양하는 방법은 당업계에 널리 알려져 있는 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 구체적으로 상기 배양은 상기 메탄자화균 변이주로부터 스쿠알렌을 생산할 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 배치 공정 또는 주입 배치 또는 반복 주입 배치 공정(fed batch or repeated fed batch process)에서 연속식으로 배양할 수 있다.

배양에 사용되는 배지는 적당한 탄소원, 질소원, 아미노산, 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 적절한 방식으로 특정 균주의 요건을 충족해야 한다. 사용될 수 있는 탄소원으로는 메탄자화균의 특성상 주로 메탄을 사용하지만, 이외에도 글루코즈, 자일로즈, 수크로즈, 락토즈, 프락토즈, 말토즈, 전분, 셀룰로즈와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산 등을 부가적으로 사용할 수 있는데, 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 질소원으로는 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 초산암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 및 질산 암모늄과 같은 무기질소원; 글루탐산, 메티오닌, 글루타민과 같은 아미노산 및 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크 또는 그의 분해생성물 등 유기질소원이 사용될 수 있다. 이들 질소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 상기 배지에는 인원으로서 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨 및 대응되는 소듐-함유 염이 포함될 수 있다. 사용될 수 있는 인원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 포함된다. 또한, 무기화합물로는 염화나트륨, 염화칼슘, 염화철, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간 및 탄산칼슘 등이 사용될 수 있다. 마지막으로, 상기 물질에 더하여 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 물질이 사용될 수 있다.

또한, 배양 배지에 적절한 전구체들이 사용될 수 있다. 상기된 원료들은 배양과정에서 배양물에 적절한 방식에 의해 회분식, 유가식 또는 연속식으로 첨가될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다. 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아와 같은 기초 화합물 또는 인산 또는 황산과 같은 산 화합물을 적절한 방식으로 사용하여 배양물의 pH를 조절할 수 있다.

또한, 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 호기 상태를 유지하기 위해 배양물 내로 산소 또는 산소-함유 기체(예, 공기)를 주입한다. 배양물의 온도는 보통 27℃ 내지 37℃, 바람직하게는 30℃ 내지 35℃이다. 배양은 상기 펩타이드의 생성량이 최대로 얻어질 때까지 계속한다. 이러한 목적으로 보통 10 내지 100 시간에서 달성된다.

아울러, 배양물로부터 상기 스쿠알렌을 회수하는 단계는 당업계에 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다. 구체적으로, 상기 회수 방법은 생산된 상기 스쿠알렌의 회수에 사용될 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 원심분리, 여과, 추출, 분무, 건조, 증방, 침전, 결정화, 전기영동, 분별용해, 크로마토그래피 등의 방법을 단독으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.

본 발명의 메탄자화균 변이주는 내재적으로 생산한 스쿠알렌을 호펜으로 전환시킬 수 없어, 스쿠알렌의 생산성을 향상시킬 수 있으므로, 스쿠알렌을 이용한 다양한 제품의 개발에 널리 활용될 수 있을 것이다.

도 1은 본 발명에서 제공하는 Shc 유전자가 결실된 메탄자화균 변이주의 제작방법의 개요를 나타내는 개략도이다.
도 2는 야생형 메탄자화균과 Shc 유전자가 결실된 메탄자화균 변이주의 Shc 유전자 영역을 증폭시킨 산물의 크기를 나타내는 전기영동사진이다.
도 3은 야생형 메탄자화균과 Shc 유전자가 결실된 메탄자화균 변이주의 성장속도를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4는 야생형 메탄자화균과 Shc 유전자가 결실된 메탄자화균 변이주에서 생산된 스쿠알렌을 정량분석한 결과를 나타내는 HPLC 그래프로서, (A)는 표준물질인 합성된 스쿠알렌을 나타내고, (B)는 야생형 메탄자화균에서 생산된 스쿠알렌을 나타내며, (C)는 메탄자화균 변이주에서 생산된 스쿠알렌을 나타낸다.
도 5는 상기 도 3의 HPLC 분석을 통해 정량분석한 스쿠알렌의 함량을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: Shc ( Squalene hopene cyclase ) 유전자가 결실된 메탄자화균 변이주의 제작

공지된 메탄자화균의 하나인 Methylomonas sp. DH-1 균주로부터 Shc 유전자를 결실시킨 변이주를 제작하였다.

대략적으로, 야생형 Methylomonas sp. DH-1 균주의 게놈 DNA에 포함된 Shc 유전자의 상류(upstream) 및 하류(downstream)의 염기서열을 포함하고, 상기 각 염기서열 사이에 카나마이신 저항 유전자(Kan)이 포함되도록 구성한 발현카세트를 포함하는 Shc 유전자 결실용 벡터를 제작하고, 상기 제작된 Shc 유전자 결실용 벡터를 야생형 Methylomonas sp. DH-1 균주에 도입한 후, 상동재조합에 의하여, 야생형 Methylomonas sp. DH-1 균주의 게놈에 존재하는 Shc 유전자를 Kan 유전자로 치환시킴으로써, Shc 유전자가 결실된 메탄자화균 변이주를 제작하고자 하였다(도 1). 도 1은 본 발명에서 제공하는 Shc 유전자가 결실된 메탄자화균 변이주의 제작방법의 개요를 나타내는 개략도이다.

실시예 1-1: 야생형 메탄자화균의 배양

야생형 Methylomonas sp. DH-1 균주를 trace elements solution(1000X), phosphate stock solution(100X) 및 vitamin stock(100X)이 포함된 NMS(nitrate mineral salts) 배지에 접종하고, 30% (v/v) 메탄을 포함하는 대기조건 하에서, 30℃에서 230 rpm으로 교반하면서 배양하였다. 이때, 상기 trace elements solution (1000X)의 조성은 500 mg/ℓ FeSO₄·7H₂O, 400 mg/ℓ ZnSO₄·7H₂O, 20 mg/ℓ MnCl₂·7H₂O, 50 mg/ℓ CoCl₂·6H₂O, 10 mg/ℓ NiCl₂·6H₂O, 15 mg/ℓ H₃BO₃ 및 250 mg/ℓ EDTA 이고; 상기 phosphate stock solution (100X)의 조성은 26 g/ℓ KH₂PO₄ 및 62 g/ℓ Na₂HPO₄·7H₂O 이며; 상기 vitamin stock (100X)의 조성은 2 mg/ℓ Biotin, 2 mg/ℓ Folic acid, 5 mg/ℓ Thimine HCl, 5 mg/ℓ Ca pantothenate, 0.1 mg/ℓ Vitamin B12, 5 mg/ℓ Riboflavin 및 5 mg/ℓ Nicotinamide 이고; 상기 NMS 배지의 조성은 1 g/ℓ MgSO₄·7H₂O, 1 g/ℓ KNO₃, 0.2 g/ℓ CaCl₂·H₂O, 0.0038 g/ℓ Fe-EDTA 및 0.0005 g/ℓ NaMo·4H₂O 로 설정하였다.

실시예 1-2: Shc 유전자 결실용 벡터의 제작

야생형 Methylomonas sp. DH-1 균주에서 발현되는 Shc 단백질(서열번호 1)을 코딩하는 유전자를 상기 균주로부터 제거하기 위하여, cre-lox system을 이용하였다.

대략적으로, pCM184 벡터의 lox 좌위에 존재하는 제한효소 EcoR I 및 Kpn I의 사이에 하기 프라이머를 사용하여, Shc 유전자의 상류(upstream)의 염기서열(서열번호 4)을 클로닝하였다.

DH-1_upstream_EcoRI(Forward): 5'-ACGTCTAGATCTGAATTCCATCTCGGCCGGGTCGGCAATAGC-3'(서열번호 2)

DH-1_upstream_KpnI(Reverse): 5'-ATATGCATCCATGGTACCCGTGAGTTGCGGAATCGTCG-3'(서열번호 3)

또한, 상기 pCM184 벡터의 lox 좌위에 존재하는 제한효소 Mlu I 및 Sac I의 사이에 하기 프라이머를 사용하여 Shc 유전자의 하류(downstream)의 염기서열(서열번호 7)을 클로닝하여, Shc 유전자 결실용 벡터를 제작하였다.

DH-1_downstream_MluI (Forward): 5'-GGCCCTACGTACGCGTGGCGATTCCTTATGGTCCAG-3'(서열번호 5)

DH-1_downstream_SacI (Reverse): 5'-CTGTCCTCTAGTGAGCTCTGTTGAAGTTATCGGTATCG-3'(서열번호 6)

실시예 1-3: Shc 유전자 결실용 벡터의 도입을 통한 형질전환체의 제작

Gene Pulser XcellTM Electropotation system(Bio-rad)을 이용하여, 상기 실시예 1-1에서 배양한 야생형 Methylomonas sp. DH-1 균주에 상기 실시예 1-2에서 제작한 Shc 유전자 결실용 벡터를 도입하여 형질전환체를 제작하였다. 상기 제작된 형질전환체를 10㎖ NMS 배지에 접종하고, 메탄 공급하에 16시간 동안 배양하여 안정화시켰다.

실시예 1-4: Shc 유전자가 결실된 메탄자화균 변이주의 선별

상기 실시예 1-3에서 안정화시킨 형질전환체를 카나마이신이 포함된 NMS 고체배지에 도말하고, 일주일 동안 배양하여, 콜로니를 형성시켰다.

대략적으로, 상기 콜로니의 균주를 실시예 1-1의 방법으로 배양하고, 배양된 균주로부터 유전자를 추출하였다. 상기 추출된 유전자를 주형으로 하고, 상기 서열번호 2 및 6의 프라이머를 사용한 PCR을 수행하여, 약 2,500bp의 PCR 산물이 증폭된 균주가, Shc 유전자가 결실된 메탄자화균 변이주임을 확인하였다.

상기 확인된 메탄자화군 변이주에서 Shc 유전자가 결실되었는지를 확인하고자 하기 프라이머를 사용하여, 야생형 메탄자화균의 게놈 유전자와 메탄자화균 변이주의 게놈 유전자를 증폭시킨 후, 증폭산물의 크기를 비교하였다(도 2).

DH-1_ΔShc (Forward): 5'-ACGTCTAGATCTGAATTCCATCTCGGCCGGGTCGGCAATAGC-3'(서열번호 8)

DH-1_ΔShc (Reverse): 5'-CTGTCCTCTAGTGAGCTCTGTTGAAGTTATCGGTATCG-3'(서열번호 9)

도 2는 야생형 메탄자화균과 Shc 유전자가 결실된 메탄자화균 변이주의 Shc 유전자 영역을 증폭시킨 산물의 크기를 나타내는 전기영동사진이다. 도 2에서 보듯이, 야생형 메탄자화균의 게놈 유전자를 증폭시킨 경우에는 약 3,000bp의 증폭산물이 검출되었고, 메탄자화균 변이주의 게놈 유전자를 증폭시킨 경우에는 약 2,500bp의 증폭산물이 검출됨을 확인하였다.

실시예 2: Shc 유전자가 결실된 메탄자화균 변이주의 성장속도 분석

상기 실시예 1-4에서 선별된 메탄자화균의 변이주가 Shc 유전자의 결실로 인하여 성장속도가 변화되는지를 확인하고자 하였다.

대략적으로, 야생형 메탄자화균과 메탄자화균 변이주를 실시예 1-1의 방법으로 배양하면서, 배양시간의 경과에 따른 균체 증식수준의 변화를 OD600의 흡광도를 이용하여 측정한 후, 비교하였다(도 3).

도 3은 야생형 메탄자화균과 Shc 유전자가 결실된 메탄자화균 변이주의 성장속도를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 3에서 보듯이, Shc 유전자가 결실되어도 균체의 성장속도는 변화되지 않음을 확인하였다.

실시예 3: 메탄자화균 변이주에서 생산된 스쿠알렌 생산량의 분석

상기 메탄자화균 변이주에서 결실된 Shc 유전자에 의해 발현되는 단백질은 스쿠알렌을 호펜으로 전환시키는 반응을 수행한다고 알려져 있는 바, 야생형 메탄자화균과 메탄자화균 변이주에서 생산된 스쿠알렌의 생산량을 비교하여, 상기 Shc 유전자의 결실이 스쿠알렌의 생산량에 직접적으로 영향을 미치는지 확인하고자 하였다.

대략적으로, 야생형 메탄자화균과 메탄자화균 변이주를 실시예 1-1의 방법으로 16 또는 28시간 동안 배양한 후, 배양된 각 균주에서 스쿠알렌을 포함하는 추출물을 수득하고, 상기 추출물에 포함된 스쿠알렌을 정량분석하였다(도 4 및 5).

이때, 스쿠알렌을 포함하는 추출물은 다음과 같이 수득하였다:

먼저, 클로로포름과 메탄올을 1:2(v/v)로 혼합한 추출용매를 준비하고, 상기 추출용매에 동결건조된 균체를 현탁시킨 후, 원심분리하여 상층액을 수득하였다. 상기 수득한 상층액, 아세토니트릴 및 헵탄을 1:1:2(v/v/v)의 비율로 혼합하고, 격렬히 교반한 후, 최상층의 헵탄층을 수득하였다. 상기 수득한 헵탄층에 질소를 가하여 용매를 증발시켜서 잔사를 수득하여, 스쿠알렌을 포함하는 추출물을 수득하였다.

이어, 상기 추출물에 포함된 스쿠알렌을 정량분석하기 위하여, 상기 수득한 잔사를 HPLC 분석용매(헵탄:아세토니트릴 = 5:95, v/v)에 용해시키고, 0.2㎛의 필터로 여과한 다음, HPLC를 이용하여 스쿠알렌을 정량분석하였다. 이때, 표준물질로는 합성된 스쿠알렌을 사용하고, 이동상으로는 아세토니트릴을 사용하고, 이동상의 속도는 분당 1.5㎖로 설정하였다.

도 4는 야생형 메탄자화균과 Shc 유전자가 결실된 메탄자화균 변이주에서 생산된 스쿠알렌을 정량분석한 결과를 나타내는 HPLC 그래프로서, (A)는 표준물질인 합성된 스쿠알렌을 나타내고, (B)는 야생형 메탄자화균에서 생산된 스쿠알렌을 나타내며, (C)는 메탄자화균 변이주에서 생산된 스쿠알렌을 나타내고, 도 5는 상기 HPLC 분석을 통해 정량분석된 스쿠알렌의 함량을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 4 및 5에서 보듯이, 야생형 메탄자화균에서는 스쿠알렌의 함량이 1.0 mg/g DCW로 측정되었으나. 메탄자화균 변이주에서는 스쿠알렌의 함량이 1.4 mg/g DCW로 측정되었다.

따라서, 상기 Shc 유전자의 결실을 통해, 메탄자화균에서 스쿠알렌의 생산성을 약 40% 증가시킬 수 있음을 알 수 있었다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> University-Industry Cooperation Group of Kyung Hee University <120> Methanotroph mutant for producing squalene <130> KPA161705-KR <160> 9 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 652 <212> PRT <213> Methylomonas sp. DH-1 <400> 1 Met Phe Thr Glu Ala Pro Val Glu Thr Ser Asn His Asp Phe Ser His 1 5 10 15 His Ser Ser Ala Ala Ala Ile Ser Pro Gly Lys Ile Gln Ala Ala Ile 20 25 30 Asp Arg Ala Gln Ala Lys Leu Leu Ser Leu Gln His Pro Ala Gly Tyr 35 40 45 Trp Val Phe Glu Leu Glu Ala Asp Cys Thr Ile Pro Ser Glu Tyr Ile 50 55 60 Met Met Met His Tyr Leu Asp Asp Ile Asn Glu Glu Leu Gln Ala Lys 65 70 75 80 Ile Ala Val Tyr Leu Arg Ser Arg Gln Ser Glu Asp Gly Ser Tyr Pro 85 90 95 Leu Phe Thr Gly Gly Pro Gly Asp Ile Ser Gly Ser Val Lys Ala Tyr 100 105 110 Tyr Ala Leu Lys Met Ala Gly Asp Ala Val Asp Ala Pro His Met Lys 115 120 125 Lys Leu Arg Asp Trp Ile Leu Ser Gln Gly Gly Ala Ala Arg Ala Asn 130 135 140 Val Phe Thr Arg Ile Ala Leu Ala Ile Phe Asp Gln Leu Pro Trp Arg 145 150 155 160 Gly Val Pro Tyr Ile Pro Val Glu Ile Met Leu Leu Pro Lys Trp Phe 165 170 175 Pro Phe His Leu Asp Lys Val Ser Tyr Trp Ser Arg Thr Val Met Val 180 185 190 Pro Leu Phe Ile Leu Cys Thr Leu Lys Ala Lys Ala Lys Asn Pro His 195 200 205 Asn Val Asp Ile Leu Glu Leu Phe Val Val His Pro Asp Glu Glu Lys 210 215 220 His Tyr Phe Pro Glu Arg Thr Phe Leu Asn Lys Cys Phe Leu Ala Leu 225 230 235 240 Asp Lys Leu Gly Arg Val Ala Glu Pro Leu Ile Pro Lys Ser Met Arg 245 250 255 Lys Arg Ala Ile Asp Lys Ala Val Ser Trp Phe Thr Glu Arg Leu Asn 260 265 270 Gly Glu Asp Gly Leu Gly Gly Ile Phe Pro Ala Met Val Asn Ala Tyr 275 280 285 Gln Ala Met Leu Leu Leu Gly Phe Pro Glu Asp His Pro Asn Val Val 290 295 300 Ile Ser Arg Lys Ala Ile Asp Lys Leu Leu Val Val Lys Asp Asp Tyr 305 310 315 320 Ala Tyr Cys Gln Pro Cys Leu Ser Pro Val Trp Asp Thr Ala Leu Ala 325 330 335 Ser Met Ala Leu Ile Glu Ala Asp Lys Arg Gly Asn Thr Pro Gln Leu 340 345 350 Ala Lys Ala Asn Asp Trp Leu Lys Ser Val Gln Leu Ser Asp Glu Pro 355 360 365 Gly Asp Trp Arg Val Ser Lys Pro Asp Leu Ala Gly Gly Gly Trp Ala 370 375 380 Phe Gln Phe Ala Asn Pro His Tyr Pro Asp Val Asp Asp Thr Ala Ile 385 390 395 400 Val Gly Phe Ala Met Ala Glu Ser Glu Gln Asp Gly Leu Asp Glu Ser 405 410 415 Ile His Arg Ala Thr Arg Trp Ile Val Gly Met Gln Ser Lys Asn Gly 420 425 430 Gly Tyr Gly Ala Phe Asp Val Asp Asn Thr Tyr Tyr Tyr Leu Asn Glu 435 440 445 Ile Pro Phe Ala Asp His Gly Ala Leu Leu Asp Pro Pro Thr Val Asp 450 455 460 Val Ser Ala Arg Cys Ala Met Leu Met Ala Arg Val Ala Lys Gly His 465 470 475 480 Asp Glu Tyr Arg Pro Ala Leu Gln Arg Thr Ile Asp Tyr Ile Arg Ser 485 490 495 Glu Gln Glu Ala Asp Gly Ser Trp Phe Gly Arg Trp Gly Thr Asn Phe 500 505 510 Ile Tyr Gly Thr Trp Ser Ala Leu Leu Gly Leu Glu Gln Thr Asp Leu 515 520 525 Pro Lys Thr Asp Pro Met Tyr Val Lys Ala Ala Ala Trp Leu Lys Ser 530 535 540 Val Gln Arg Glu Asp Gly Gly Trp Gly Glu Asp Asn Leu Ser Tyr His 545 550 555 560 Asp Asp Val Lys Tyr Arg Gly Arg Tyr His Phe Ser Thr Ala Phe Gln 565 570 575 Thr Ala Trp Ala Ile Leu Gly Leu Ile Ala Ala Gly Glu Val His Ser 580 585 590 Lys Glu Val Lys Ala Gly Ile Glu Phe Leu Leu Arg Ser Gln Gln Ala 595 600 605 Asp Gly Val Trp Asn Asp Pro Cys Phe Thr Ala Pro Gly Phe Pro Arg 610 615 620 Val Phe Tyr Leu Lys Tyr His Gly Tyr Asp Lys Phe Phe Pro Leu Trp 625 630 635 640 Ala Leu Ala Arg Tyr Arg Asn Glu Leu Ser Lys His 645 650 <210> 2 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 acgtctagat ctgaattcca tctcggccgg gtcggcaata gc 42 <210> 3 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 atatgcatcc atggtacccg tgagttgcgg aatcgtcg 38 <210> 4 <211> 517 <212> DNA <213> Methylomonas sp. DH-1 <400> 4 catctcggcc gggtcggcaa tagcgcggac cactaaaaac ggcaactggg cattcgcggc 60 ggttcggccg accgccgcgc tttccatgtc gagggcgacg gcgccggtct gttcgaacaa 120 ttgccgcttt tcctcgcgtt gcccgacgat ccggccactt tccagtaaag tgccggagcc 180 gacggcttgg tggtccgcca gcaggtttgc caaacgttgc cgccaagacg gatcggtagc 240 caaactatgc cgatcctggg tgaggacgcg ttccggcaag accaaatccc ccggtcgccg 300 atcttgagcc aatgccgcgg cgcagcccca gctgattagc cgattcgcac cccggtcgat 360 taacccggcg gcggcttttt cggcgttggc cgggccggcg ccggagtaac tgagcagtac 420 gccgccaccg atggcatggc actcgcccag cgcaaatttg cgcttggtca gcgtgctaag 480 ctcttcgggt agggcgacga cgattccgca actcacg 517 <210> 5 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 ggccctacgt acgcgtggcg attccttatg gtccag 36 <210> 6 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 ctgtcctcta gtgagctctg ttgaagttat cggtatcg 38 <210> 7 <211> 515 <212> DNA <213> Methylomonas sp. DH-1 <400> 7 ggcgattcct tatggtccag tgtgagatac gggtgaatac tgccagtcag gggtttttag 60 gccgctgctg gtgagattga aaagcagtga caacagccag ttgctgcgcg ccgataattt 120 gctggcgata atcgtggcct tgacgctgtt gcggctgatc ttgacctggt tggattcgtt 180 gaaatccaga tgctgtttga tttttttcaa ggtcaacacc gccatgccca gtgcccacag 240 gcagaaattg cggatgccgg tttcatggct gggcagcaac tgggtgtagg tcagcgcgtt 300 ttgcaagtgg ccgtgagcga tgccgatcaa gcgttccagg cctttgcgga agcgttcgtc 360 gttggtggtc ggcgtcagat cggccaaatc gaagccggtt tcgtcgaaaa tatcttgcgg 420 cagccagcat acgccgcgtt tggcgtcgtc ccagatgtct ttcagaatgt tggtcatctg 480 caaaccctgg ccgaacgata ccgataactt caaca 515 <210> 8 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 acgtctagat ctgaattcca tctcggccgg gtcggcaata gc 42 <210> 9 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 ctgtcctcta gtgagctctg ttgaagttat cggtatcg 38

Claims

야생형 메탄자화균의 스쿠알렌 호펜 사이클라아제(Squalene hopene cyclase, Shc) 단백질의 활성에 비하여, 상기 Shc 단백질의 활성이 약화된, 스쿠알렌 생산능을 갖는 메탄자화균 변이주.
제1항에 있어서,
상기 메탄자화균은 메탄을 사용하여 스쿠알렌을 생산하는 균주인 것인, 메탄자화균 변이주.
제1항에 있어서,
상기 메탄자화균은 메틸로모나스(Methylomonas) 속, 메틸로박터(Methylobacter) 속, 메틸로코커스(Methylococcus) 속, 메틸로마이크로븀(Methylomicrobium) 속, 메틸로스페라(Methylosphaera) 속, 메틸로칼덤(Methylocaldum) 속, 메틸로글로버스(Methyloglobus) 속, 메틸로사르시나(Methylosarcina) 속, 메틸로프로펀더스(Methyloprofundus) 속, 메틸로썰머스(Methylothermus) 속, 메틸로할로비우스(Methylohalobius) 속, 메틸로게아(Methylogaea) 속, 메틸로마리넘(Methylomarinum) 속, 메틸로벌럼(Methylovulum) 속, 메틸로마리노범(Methylomarinovum) 속, 메틸로러브럼(Methylorubrum) 속, 메틸로파라코커스(Methyloparacoccus) 속, 메틸로시너스(Methylosinus) 속, 메틸로시스티스(Methylocystis) 속, 메틸로셀라(Methylocella) 속, 메틸로캡사(Methylocapsa) 속, 메틸로퍼룰라(Methylofurula) 속, 메틸아시디필럼(Methylacidiphilum) 속 또는 메틸아시디마이크로븀(Methylacidimicrobium) 속 균주인 것인, 메탄자화균 변이주.
제1항에 있어서,
상기 메탄자화균은 메틸로모나스 속(Methylomonas) 균주인 것인, 메탄자화균 변이주.
제1항에 있어서,
상기 Shc 단백질의 활성의 약화는 상기 Shc 단백질을 암호화하는 유전자의 전체 또는 일부를 결실시키는 방법; 상기 Shc 단백질의 활성이 감소되도록 돌연변이된 유전자로, 염색체상의 상기 Shc 단백질을 암호화하는 유전자를 치환시키는 방법; 상기 Shc 단백질을 암호화하는 유전자의 발현 조절 서열에 변이를 도입하는 방법; 상기 Shc 단백질을 암호화하는 유전자의 발현 조절 서열을 활성이 약하거나 없는 서열로 교체하는 방법; 상기 Shc 단백질을 암호화하는 유전자의 전사체에 상보적으로 결합하여 상기 mRNA로부터 단백질로의 번역을 저해하는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 도입하는 방법; 상기 Shc 단백질을 암호화하는 유전자의 SD 서열 앞단에 SD 서열과 상보적인 서열을 인위적으로 부가하여 2차 구조물을 형성시켜 리보솜(ribosome)의 부착이 불가능하게 만드는 방법; 및 상기 Shc 단백질을 암호화하는 유전자의 ORF(open reading frame)의 3' 말단에 역전사되도록 프로모터를 부가하는 RTE(Reverse transcription engineering) 방법으로 이루어지는 군에서 선택되는 방법으로 수행되는 것인, 메탄자화균 변이주.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 메탄자화균 변이주 또는 상기 변이주의 배양산물을 포함하는, 스쿠알렌 생산용 조성물.
제6항에 있어서,
상기 배양산물은 균주의 배양물, 배양상등액, 파쇄물 및 이들의 분획물로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 스쿠알렌 생산용 조성물.
제6항의 조성물을 포함하는, 스쿠알렌 생산용 키트.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 메탄자화균 변이주를 배양하는 단계를 포함하는, 스쿠알렌의 생산방법.
제9항에 있어서,
상기 배양은 메탄을 가하는 조건에서 수행되는 것인, 스쿠알렌의 생산방법.
제9항에 있어서,
상기 배양된 메탄자화균 변주로부터 생산된 스쿠알렌을 회수하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 스쿠알렌의 생산방법.
메탄자화균의 게놈에 존재하는 Shc 유전자의 상류 염기서열, 상기 Shc 유전자 치환용 염기서열 및 상기 Shc 유전자의 하류 염기서열을 순차적으로 포함하는 재조합 벡터를 포함하는, 스쿠알렌 생산용 조성물.
제12항에 있어서,
상기 재조합 벡터는 메탄자화균 내에 도입될 경우. 상기 메탄자화균의 게놈에 존재하는 Shc 유전자를 상동재조합에 의해 상기 치환용 염기서열로 치환시킴으로써, 상기 메탄자화균의 게놈에 존재하는 Shc 유전자를 변이시키는 것인, 스쿠알렌 생산용 조성물.
제12항에 있어서,
메탄자화균을 추가로 포함하는 것인, 스쿠알렌 생산용 조성물.