KR20180119864A

KR20180119864A - 약독화된 폐렴구균 균주를 포함하는 약제학적 조성물 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20180119864A
Application number: KR1020170053512A
Authority: KR
Inventors: 이동권; 선승한
Original assignee: 성균관대학교산학협력단
Priority date: 2017-04-26
Filing date: 2017-04-26
Publication date: 2018-11-05
Also published as: KR102040665B1

Abstract

본원은 약독화된 폐렴구균 균주를 포함하는 약제학적 조성물, 및 이의 염증성 질환, 호흡기 바이러스 감염 또는 세균 감염성 질환의 예방 또는 치료를 위한 용도에 관한 것이다.

Description

약독화된 폐렴구균 균주를 포함하는 약제학적 조성물 및 이의 용도{PHARMACEUTICAL COMPOSITION CONTAINING ATTENUATED STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE AND USES THEREOF}

항원을 경비(nasal) 또는 경구(oral) 투여하면 조절 T (regulatory T; Treg) 세포가 유도되며, 이로 인해 표적 장기에서 점막 면역관용이 유도된다는 사실이 알려져 있다 (Faria and Weiner, 2005). 생쥐에서 점막 면역관용이 유도되면 죽상 동맥경화증 (Maron et al, 2002)을 포함한 다양한 자가면역 질환이 억제된다고 보고되었다 (Faria and Weiner, 2005). 따라서, 점막 면역관용 원리는 동물 및 인간에게 적용될 수 있다. 항원을 여러 번 투여하여 점막을 자극하면 T 세포가 IL-10이나 TGF-β1과 같은 항 염증성 사이토카인 분비를 유도하여 조직을 방어하여 점막 면역 관용을 유도한다 (Faria and Weiner, 2005; Weiner, 2001). 점막 표면의 면역관용을 유지하기 위해 특정 유형의 Treg 세포가 우선적으로 유도되지만 유도 기전은 아직 명확히 알려져 있지 않다.

다만, 현재의 점막 백신은 면역증가제 없이는 충분한 점막 면역반응을 유도할 만큼 효능이 강하지 못한 실정이다. 점막 면역증가제 (Mucosal adjuvants)는 항원 투여만으로는 면역 관용 유도 효율이 낮은 경우 사용되며, 예를 들어 콜레라 독소 B 서브 유니트 (cholera toxin B subunit; CTB)가 그 예이다 (Faria and Weiner, 2005). 그러나 인후 접종 후 나타나는 콜레라 독소의 면역증가 효과는 세균을 인식하여 매개되어 (Kim et al., 2016a), 미생물계가 필수적인 역할을 한다는 것을 나타내므로, 필요시 약독화된 세균을 면역증가제로 사용하는 것이 바람직하다는 것을 나타낸다. 즉, 면역증가제 없는 점막 백신의 개념은 아직까지 입증되지 않았다.

또한, 점막 백신이 백신 제조에 사용된 항원과 직접적으로 관련된 질병 외의 다양한 질병에도 효과를 나타낼 수 있는지에 대해서도 아직 보고된 바 없으며, 현재 사용되는 면역 요법은 예방 접종에 사용되는 항원에 대해서만 방어된다. 특히, 폐렴구균 질병 예방을 위해서는 23 가 다당류 백신이나 13 가 접합백신이 사용되지만 23 가 다당류백신은 기억 반응이 없고, 13 가 접합백신은 90 가지 이상의 혈청형 중 13 가지 혈청형만 방어할 수 있다 (Kalin, 1998).

1. Aaberge IS, Eng J, Lermark G, Lovik M. Virulence of Streptococcus pneumoniae in mice: a standardized method for preparation and frozen storage of the experimental bacterial inoculum. Microb Pathog. 1995 Feb;18(2):141-52. 2. Avery OT, Macleod CM, McCarty M. Studies on the chemical nature of the substance inducing transformation of pneumococcal types: Induction of transformation by a desoxyribonucleic acid fraction isolated from pneumococcus type III. J Exp Med. 1944 Feb 1;79(2):137-58. 3. Bosch AA, Biesbroek G, Trzcinski K, Sanders EA, Bogaert D. Viral and bacterial interactions in the upper respiratory tract. PLoS Pathog 2013; 9:e1003057. 4. Briles DE, Forman C, Crain M. Mouse antibody to phosphocholine can protect mice from infection with mouse-virulent human isolates of Streptococcus pneumoniae. Infect Immun. 1992 May;60(5):1957-62. 5. Choi SY, Tran TD, Briles DE, Rhee DK. Inactivated pep27 mutant as an effective mucosal vaccine against a secondary lethal pneumococcal challenge in mice. Clin Exp Vaccine Res. 2013 Jan;2(1):58-65. 6. Cohen JM, Wilson R, Shah P, Baxendale HE, Brown JS. Lack of cross-protection against invasive pneumonia caused by heterologous strains following murine Streptococcus pneumoniae nasopharyngeal colonisation despite whole cell ELISAs showing significant cross-reactive IgG. Vaccine. 2013 May 1;31(19):2328-32. 7. Faria AM, Weiner HL. Oral tolerance. Immunol Rev. 2005 Aug; 206:232-59. 8. Geng S, Zhang H, Zhou X, He Y, Zhang X, Xie X, Li C, He Z, Yu Q, Zhong Y, Lowrie DB, Zheng G, Wang B. Diabetes tolerogenic vaccines targeting antigen-specific inflammation. Hum Vaccin Immunother. 2015;11(2):522-30. 9. Jawhara S, Poulain D. Saccharomyces boulardii decreases inflammation and intestinal colonization by Candida albicans in a mouse model of chemically-induced colitis. Med Mycol 2007, 45(8):691-700. 10. Kalin M. Pneumococcal serotypes and their clinical relevance. Thorax, 1998; 53: 159-62. 11. Kim D, Kim YG, Seo SU, Kim DJ, Kamada N, Prescott D, Philpott DJ, Rosenstiel P, Inohara N, Nunez G. Nod2-mediated recognition of the microbiota is critical for mucosal adjuvant activity of cholera toxin. Nat Med. 2016a May;22(5):524-30. 12. Kim GL, Choi SY, Seon SH, Lee S, Park SS, Song JY, Briles DE, Rhee DK. Pneumococcal pep27 mutant immunization stimulates cytokine secretion and confers long-term immunity with a wide range of protection, including against non-typeable strains. Vaccine. 2016b Dec 12;34(51):6481-6492. 13. Maron R, Sukhova G, Faria AM, Hoffmann E, Mach F, Libby P, Weiner HL. Mucosal administration of heat shock protein-65 decreases atherosclerosis and inflammation in aortic arch of low-density lipoprotein receptor-deficient mice. Circulation. 2002; 106: 1708-1715. 14. McDaniel LS, Scott G, Kearney JF, Briles DE. Monoclonal antibodies against protease-sensitive pneumococcal antigens can protect mice from fatal infection with Streptococcus pneumoniae. J Exp Med. 1984 Aug 1;160(2):386-97. 15. Metzger DW, Furuya Y, Salmon SL, Roberts S, Sun K. Limited efficacy of antibacterial vaccination against secondary serotype 3 pneumococcal pneumonia following influenza infection. J Infect Dis 2015; 212:445-52. 16. Mina MJ, Klugman KP. Pathogen replication, host inflammation, and disease in the upper respiratory tract. Infect Immun 2013; 81:625-8. 17. Pigny F, Lassus A, Terrettaz J, Tranquart F, Corthesy B, Bioley G. Intranasal vaccination with Salmonella-derived serodominant secreted effector protein B associated with gas-filled microbubbles partially protects against gut infection in mice. J Infect Dis. 2016 Aug 1;214(3):438-46. 18. Rizzo A, Losacco A, Carratelli CR, Domenico MD, Bevilacqua N. Lactobacillus plantarum reduces Streptococcus pyogenes virulence by modulating the IL-17, IL-23 and Toll-like receptor 2/4 expressions in human epithelial cells. Int Immunopharmacol. 2013 Oct;17(2):453-61. 19. Saint-Lu N, Tourdot S, Razafindratsita A, Mascarell L, Berjont N, Chabre H, Louise A, Van Overtvelt L, Moingeon P. Targeting the allergen to oral dendritic cells with mucoadhesive chitosan particles enhances tolerance induction. Allergy. 2009 Jul;64(7):1003-13. 20. Schnoeller C, Roux X, Sawant D, Raze D, Olszewska W, Locht C, Openshaw PJ. Attenuated Bordetella pertussis vaccine protects against respiratory syncytial virus disease via an IL-17-dependent mechanism. Am J Respir Crit Care Med. 2014 Jan 15;189(2):194-202. 21. Shak JR, Vidal JE, Klugman KP. Influence of bacterial interactions on pneumococcal colonization of the nasopharynx. Trends Microbiol 2013; 21:129-35. 22. Shim BS, Choi JA, Song HH, Park SM, Cheon IS, Jang JE, Woo SJ, Cho CH, Song MS, Kim H, Song KJ, Lee JM, Kim SW, Song DS, Choi YK, Kim JO, Nguyen HH, Kim DW, Bahk YY, Yun CH, Song MK. Sublingual administration of bacteria-expressed influenza virus hemagglutinin 1 (HA1) induces protection against infection with 2009 pandemic H1N1 influenza virus. J Microbiol. 2013 Feb;51(1):130-5. 23. Sun JB, Czerkinsky C, Holmgren J. Mucosally induced immunological tolerance, regulatory T cells and the adjuvant effect by cholera toxin B subunit. Scand J Immunol. 2010 Jan;71(1):1-11. 24. Takagi H, Hiroi T, Yang L, Takamura K, Ishimitsu R, Kawauchi H, Takaiwa F. Efficient induction of oral tolerance by fusing cholera toxin B subunit with allergen-specific T-cell epitopes accumulated in rice seed. Vaccine. 2008 Nov 11; 26(48):6027-30. 25. Weiner HL. Oral tolerance: immune mechanisms and the generation of Th3-type TGF-beta-secreting regulatory cells. Microbes Infect. 2001 Sep; 3(11):947-54. 26. Weiner HL. The mucosal milieu creates tolerogenic dendritic cells and T(R)1 and T(H)3 regulatory cells. Nat. Immunol. 2001;2:671. 27. Wirtz S, Neufert C, Weigmann B, Neurath MF: Chemically induced mouse models of intestinal inflammation. Nat Protoc 2007, 2(3):541-546. 28. Wu Y, Tu W, Lam KT, Chow KH, Ho PL, Guan Y, Peiris JS, Lau YL. Lethal coinfection of influenza virus and Streptococcus pneumoniae lowers antibody response to influenza virus in lung and reduces numbers of germinal center B cells, T follicular helper cells, and plasma cells in mediastinal lymph Node. J Virol. 2015 Feb;89(4):2013-23. 29. Xu Y, Hunt NH, Bao S. The correlation between proin flammatory cytokines, MAdCAM-1 and cellular infiltration in the inflamed colon from TNF-α gene knockout mice. Immunol Cell Biol 2007; 85:633-639. 30. Yamashita T, Sasaki N, Kasahara K, Hirata K. Anti-inflammatory and immune-modulatory therapies for preventing atherosclerotic cardiovascular disease. J Cardiol. 2015 Jul;66(1):1-8.

장 질환, 감염, 죽상 동맥 경화증 및 상피 병변과 같은 염증성 인자를 포함하는 염증성 질환에 대한 예방 및 치료 방법이 개발된 바 있으나, 이는 여전히 염증을 일으키거나 질병을 유발하는 특정 마커를 이용하는 것으로 한정되어 왔다. 이와 관련하여, 점막면역은 점막 관련 질환 및 염증성 질환을 억제할 것으로 예상되었으므로, 본원에서는 폐렴구균 전균 백신의 점막면역을 이용한 다양한 질병에 대한 항염증 요법 및 기타 질환에 대한 방어방법을 새롭게 제시하고자 하였다. 또한, 점막면역의 면역관용 특성을 이용한 점막 투여 백신이 장 염증 및 감염 질환 등을 예방 또는 치료하는 새로운 방법이 될 수 있음을 입증하고자 하였다.

또한, 본원에서는 점막에 폐렴구균 전균 백신을 접종함으로써 광범위한 염증성 질환, 예를 들면 장의 염증, 호흡기 감염 및 염증으로 유발되는 병변은 물론, 호흡기 바이러스 및 세균 감염성 질환에 대해서도 보호할 수 있는 새로운 방법을 개발하고자 하였다.

그러나, 본원이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본원은, 약독화된 폐렴구균 균주를 포함하는, 염증성 질환, 호흡기 바이러스 감염 질환, 또는 폐렴구균을 제외한 세균 감염성 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하고자 한다.

상술한 과제 해결 수단은 단지 예시적인 것으로서, 본 발명을 제한하려는 의도로 해석되지 않아야 한다. 상술한 예시적인 구현예 외에도, 도면 및 발명의 상세한 설명에 기재된 추가적인 구현예 및 실시예가 존재할 수 있다.

본원발명에 따르면, 폐렴구균 전균 백신을 점막에 접종함으로써 폐 및 비장에서 면역화로 유도되는 유전자들에 의하여 염증 관련 질환을 예방 및/또는 치료할 수 있다.

특히, 기존의 백신은 특정 항원 성분에 대한 방어만을 제공할 수 있으나, 본원발명에 따라 폐렴구균 점막 백신을 사용하는 경우 바이러스 및 세균 감염성 질환뿐만 아니라 다른 장기의 염증질환의 방어능을 포함하는 광범위한 질병 예방 및/또는 치료 효과를 기대할 수 있다. 또한, 본원발명에 따른 폐렴구균 전균 백신은 점막에 투여시 기존 점막 백신과는 다르게 면역보조제(adjuvant)를 사용하지 않고도 다양한 질환에 대해 방어 효과를 제공할 수 있다.

도 1a 및 1b는 본원의 일 실시예에 따른 폐 (도 1a) 및 비장 (도 1b)에서의 시스템 생물학 분석에 의한 폐렴구균 백신 기능 분석 결과의 개략도이다. 생쥐를 THpep27 돌연변이체 (Δpep27)로 2 주 간격으로 3 회 면역화하고 최종 면역화 2 주 후 폐 및 비장을 수확 한 다음, 총 RNA를 추출하여 고속 대량 시퀀싱을 실시하고, 그 다음 유전자 발현을 Ingenuity Pathway Analysis로 분석하였다. 도 1a에서 면역화된 폐 조직의 유전자는 위장염 및 대장의 이상을 억제함을 제시하며, 도 1b에서 비장의 유전자는 인플루엔자 바이러스 감염에 대한 보호 효과를 나타낸다.
도 2는 본원의 일 실시예에 따른 폐에서의 시스템 생물학 분석 결과의 개략도이다. 생쥐에 2 주 간격으로 Δpep27 변이주를 인후로 3 번 접종하고, 마지막 백신 접종 후 7 일째에, mRNA를 폐에서 분리하고 고속 대량 시퀀싱을 실시하였다. 폐의 서열 데이터에 대한 IPA 네트워크 분석을 나타낸 것이며, 녹색은 유전자 발현이 억제된 것을 나타내고 빨간색은 유전자가 유도된 것을 의미한다.
도 3a 내지 3c는 본원의 일 실시예에 따라 생쥐에 Δpep27를 접종하여 Treg 세포가 유도되는지 확인한 실험 결과이다. 도 3a는 생쥐 (n = 3)에 2 주 간격으로 Δpep27 를 인후로 3 번 접종하고, 마지막 백신 접종 후 7 일째에 비장 세포를 분리하고 Th1 (CD4, Tbet), Th2 (CD4, GATA3), Th17 (CD4, RORγt) 및 Treg (CD4, Foxp3)에 대한 형광 세포 마커로 표지한 것이다. 그 후, 마커를 유동 세포 계측법으로 검출하였다. 도 3b 및 3c는 마지막 백신 접종 후 7 일째에, 비장 세포 (도 3b) 또는 혈청 (도 3c)의 사이토카인을 ELISA로 측정한 결과이다. 통계적 유의성은 ANOVA로 분석하였다; *, P <0.05, **, P <0.01.
도 4a 및 4b는 본원의 일 실시예에 따라 생쥐에 Δpep27를 접종하여 IL-10 및 IL-17을 유도한 실험 결과이다. 생쥐 (n = 3)에 2 주 간격으로 Δpep27 을 인후에 3 회 백신 접종하고, 마지막 백신 접종 후 7 일째에 mRNA를 폐에서 분리하여 qPCR (도 4a)에 사용하거나 기관지 폐포 세척액 (BALF)을 사이토카인 수준 측정에 사용하였다 (도 4b). 통계적 유의성은 ANOVA로 분석하였다; *, P <0.05.
도 5는 본원의 일 실시예에 따라 생쥐에 Δpep27를 접종하여 비장에서 중앙 기억 T 세포와 메모리 Tfh 세포를 활성화한 실험 결과이다. 생쥐 (n = 3)에 2 주 간격으로 Δpep27 를 인후에 3 번 접종하고, 마지막 예방 접종 7 일 후 비장 세포를 분리하여 중심 기억 T 세포 (CD4, CCR7, CD62L) 및 기억 Tfh 세포 (CD4, CXCR5, CCR7)에 대한 형광 세포 마커로 표지하였다. 이후, 형광 마커를 유동 세포 계측법으로 검출하였다. 통계적 유의성은 ANOVA로 분석하였다; *, P <0.05.
도 6a 및 6b는 본원의 일 실시예에 따라 생쥐에 Δpep27를 접종하여 다양한 면역 글로불린 아형을 유도한 실험 결과이다. 생쥐 (n = 6)에 2 주 간격으로 Δpep27 을 인후에 3 회 접종하고, 마지막 백신 접종 후 7 일째에 혈청 (도 6a)과 기관지 폐포 세척액 (BALF)(도 6b)에서 항체 역가를 측정하였다. 통계적 유의성은 ANOVA로 분석하였다; * P <0.05, **, P <0.01.
도 7a 내지 7d는 본원의 일 실시예에 따라 Δpep27 접종이 인플루엔자 감염 후의 2 차 폐렴구균 감염을 방어할 수 있는지 확인한 실험 결과이다. 생쥐 (9-10 / 그룹)를 1 주 간격으로 Δpep27 로 3 회 인후 접종하고, 최종 면역화 1 주 후에 생쥐로부터 혈청을 수거 한 다음, 3 가지 유형의 폐렴 구균 전체 세포 (도 7a) 또는 특정 항원 (도 7b)에 대한 IgG 수준을 ELISA로 측정하였다. 두 군 간의 유의 한 차이는 unpaired t-test로 분석하였다; *** p <0.001. 인플루엔자 감염 10 일 후, 폐렴구균 D39를 비강 내 경로를 통해 감염시킨 다음 생존을 14 일 동안 모니터링하였다 (도 7c). 통계적 유의성은 Mentel-cox test로 분석하였다; ** p <0.005. 폐렴구균 D39 감염 24 시간 후, 폐 균질물을 혈청에서 배양하여 세균 수 (도 7d)를 측정하였다. 통계적 유의성은 One way ANOVA로 분석하였다.
도 8a 및 8b는 본원의 일 실시예에 따라 Δpep27 백신의 인플루엔자 바이러스 복제 억제에 의한 방어 효과를 실험한 것이다. 생쥐 (10 마리/군) 인후에 인플루엔자 바이러스를 감염시킨 다음, 생쥐의 체중을 11 일 동안 관찰하였다 (도 8a). 통계적 유의성은 one-way ANOVA로 분석하였다; *** p <0.001. 인플루엔자 감염 5 일 후 폐 균질물 상등액을 수확한 후, 각 군의 바이러스 역가를 TCID50 / ml로 측정하였다 (도 8b). 유의성은 one-way ANOVA로 분석하였다; *** p <0.001.
도 9는 본원의 일 실시예에 따라 Δpep27 접종이 그람 음성 세균 감염을 예방할 수 있는지를 실험한 결과이다. 생쥐 (3 마리/군) 비강 경로를 통해 Δpep27를 3 회 접종하고, 최종 면역화 10 일 후 생쥐에 폐렴간균 (K. pneumoniae)을 감염시켰다. 폐렴간균 감염 24 시간 후 각 장기의 균수는 혈액 한천에 도말 배양하여 결정하였다; ** P <0.01.
도 10은 본원의 일 실시예에 따라 Δpep27 접종이 그람 양성 세균 감염을 예방할 수 있는지를 실험한 결과이다. 생쥐 (3 마리/군) 비강으로 Δpep27을 3 회 면역화시키고, 최종 면역화 10 일 후 생쥐에 황색 포도상구균을 감염시켰다. 황색 포도상규군 감염 24 시간 후 각 장기의 균수를 혈액 한천에 도말, 배양하여 측정하였다; * P <0.05.
도 11a 및 11b는 본원의 일 실시예에 따라 Δpep27 접종이 덱스트란 설페이트 나트륨(DSS)으로 유도되는 염증성 장 질환에서 체중 감소를 억제하는지를 실험한 결과이다. Δpep27 변이체를 생쥐 (n = 5 마리/군) 비강에 3 회 접종한 후 경구 경로를 통해 식수에 5% DSS를 투여하여 유도되는 대장염 (염증성 장 질환)에서 체중 감소가 완화되었다 (도 11a). 기초 체중 감소 백분율의 시간 경과를 DSS로 처리 한 지 9 일 동안 관찰하였다. 통계적 유의성은 one way ANOVA 분석 후 Bonferroni’s test를 수행하였다. 임상 질병 활동 지수는 9 일째 치료가 중단될 때까지 매일 평가하였다 (도 11b). 대장염의 진행은 체중 감소, 대변의 일관성, 직장 출혈 및/또는 대변에서의 혈액량을 측정하여 평가하였다. 생쥐의 병적 상태 (선조 [piloerection], 혼수상태)에 대해서도 매일 관찰하였다.
도 12a 및 12b는 본원의 일 실시예에 따라 Δpep27 접종이 덱스트란 설페이트 나트륨(DSS)으로 유도되는 결장 염증을 예방할 수 있는지를 실험한 결과이다. Δpep27 변이체를 생쥐 (n = 5 마리/군) 비강으로 3 회 접종한 후 경구 경로를 통해 식수에 5% DSS를 첨가하여 투여함으로써 유도되는 대장염 (염증성 장 질환)에서 체중 감소가 완화되었다 (도 12a). DSS 처리 9 일째 결장을 검사하였다. DSS 처리9 일째에는 결장 무게 및 길이를 측정하였다 (도 12b).
도 13은 본원의 일 실시예에 따라 Δpep27 접종이 대장에서 염증성 사이토킨 유전자 발현을 억제하는지를 실험한 결과이다. Balb c 생쥐에 14 일 동안 식수에 5% DSS 를 첨가하여 염증성 장질환을 유도하였다. PBS + 물은 음성 대조군으로 사용하였다. IL-1β, IL-6, IL-17A 및 TNF-α의 mRNA 발현을 실시간 정량적 PCR을 사용하여 측정하였다. 실험값은 평균 ± SEM으로 표시되었고 P <0.05는 유의성이 있는 것으로 간주하였다.

아래에서는 첨부한 도면을 참조하여 본원이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본원의 실시예를 상세히 설명한다. 그러나 본원은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다. 그리고 도면에서 본원을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였다.

본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함" 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.

본원 명세서 전체에서 사용되는 정도의 용어 "약", "실질적으로" 등은 언급된 의미에 고유한 제조 및 물질 허용오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로 사용되고, 본원의 이해를 돕기 위해 정확하거나 절대적인 수치가 언급된 개시 내용을 비양심적인 침해자가 부당하게 이용하는 것을 방지하기 위해 사용된다. 본원 명세서 전체에서 사용되는 정도의 용어 "~(하는) 단계" 또는 "~의 단계"는 "~ 를 위한 단계"를 의미하지 않는다.

본원 명세서 전체에서, 마쿠시 형식의 표현에 포함된 "이들의 조합"의 용어는 마쿠시 형식의 표현에 기재된 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 혼합 또는 조합을 의미하는 것으로서, 상기 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 것을 의미한다.

본원 명세서 전체에서, "A 및/또는 B" 의 기재는, "A, B, 또는, A 및 B" 를 의미한다.

본원 명세서 전체에서, "폐렴구균"은 폐구균 또는 폐렴쌍구균(Streptococcus pneumoniae)이라고도 명명되는 그람양성(Gram-positive) 세균으로서, 시간이 지나 분열함에 따라 균들이 계속 이어져 사슬 모양이 되는 것이 관찰되어 연쇄상구균과로 분류되며, 폐렴의 주요 원인으로 알려져 있다.

본원 명세서 전체에서, "pep27" 은 27 개의 폴리펩타이드로 구성되어 있으며 vex 전달체(transporter)에 의해 분비되어 생장억제 및 세포 사멸(apoptosis)을 유도하는데, 구체적으로는 막-결합 히스티딘 단백질 카이네이즈(membrane-bound histidine protein kinase)인 vncS 및 세포질 효과기(cytoplasmic effector)인 반응 조절자(response regulator) vncR에 의해 발현이 조절되어 세포 사멸을 유도하는 것으로 알려져 있다(Novak et al., 1999). pep27 유전자 또는 그로부터 코딩되는 단백질은 폐렴구균의 혈청형 마다 다른 이름으로 명명되기도 하며, pep27의 유전자 서열 또는 이의 펩타이드 서열의 미차가 존재할 수 있으나, 상기 기술한 바와 같이 본 발명의 pep27 유전자는 실질적으로 pep27과 동일한 기능을 수행하는 유전자이면 혈청형에 제한되지 않고 이를 손상시킴으로서 본 발명의 약독화된 폐렴구균 균주를 제조할 수 있다. 바람직하게 상기 pep27 유전자와 실질적으로 동일한 기능을 수행하는 폐렴구균의 유전자를 모두 포함한다. 더욱 바람직하게 본 발명의 pep27 유전자는 서열번호 1로 표시되는 pep27 펩타이드의 아미노산을 코딩하는 유전자가 돌연변이됨으로써 손상될 수 있다.

본원 명세서 전체에서, "약독화"란 독성 있는 균주가 변형 전보다 덜 독성 있는 균주거나 약한 병원균이 되는 방식으로 변형되는 것을 의미하며, 이러한 균주는 숙주안에서 여전히 복제 분열될 수 있는 동안, 임상적 질병을 유발할 수 있는 능력이 현저히 감소된 것을 말한다. 바람직하게 본 발명의 약독화된 균주는, 독성 또는 병원성이 백신용으로 투여를 허용할 수 있을 정도로 감소된 균주이며, 더욱 바람직하게는 균주가 숙주 내에서 여전히 복제할 수 있으면서도 임상적 질병을 유발할 수 없는 정도까지 약독화시키는 것을 의미한다. 또한 약독화 돌연변이는 본 발명의 약독화 돌연변이를 제조하기 위한 다양한 방법, 예를 들어 점 돌연변이, 연관된 바이러스 사이의 서열 교환, 또는 뉴클레오티드 결실에 의해 달성될 수 있다.

본원 명세서 전체에서, "돌연변이"는 유전자의 유전적 기능을 변화시키는 모든 행위를 의미하며, 구체적으로는 유전자의 돌연변이는 생물의 여러 가지 변이 중 유전자의 양적 또는 질적인 변화에 의해 생긴 변이를 말한다.

본원 명세서 전체에서, "예방"이란 조성물의 투여에 의해 질환의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본원 명세서 전체에서, "치료"란 조성물의 투여에 의해 이미 유발된 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위를 의미한다.

본원 명세서 전체에서, "백신"이란 감염 질환을 예방하기 위한 면역을 위하여 쓰이는 항원으로서, 약독화시킨 미생물 또는 바이러스로 제조되며, 특정 감염증에 대해 인공적으로 면역원성을 획득하기 위하여 약화시키거나 사멸시킨 병원 미생물을 개체 내에 투여하는 것을 의미한다. 백신에 의해 자극을 받으면 개체 내의 면역 시스템이 작동하여 항체를 생성하게 되고, 그 감수성을 유지하다가 재감염이 일어나는 경우, 빠른 시간 내에 항체를 효과적으로 생성함으로써 질환을 극복할 수 있게 된다. 다만 본원발명에 따른 약독화된 폐렴구균을 포함하는 백신은 면역관용 원리에 의하여 기존의 백신과 달리 특정 항원 성분에 대한 방어만이 아니라 바이러스 및 세균 감염성 질환을 포함하는 광범위한 질병의 예방 및 치료 효과를 가질 수 있다.

본원 명세서 전체에서, "ermB" 는 매크로라이드(macrolide)에 내성을 가질 수 있게 하는 유전자를 의미하며, 매크로라이드는 폐렴구균의 치료에 있어서 페니실린의 대체 약제로 사용되어져 온 것으로 에리스로마이신(erythromycin), 클라리스로마이신(clarithromycin), 아지스로마이신(azithromycin) 등이 여기에 속한다.

이하, 본원의 약독화된 폐렴구균 균주를 포함하는 약제학적 조성물, 및 이의 염증성 질환, 호흡기 바이러스 감염 또는 세균 감염성 질환의 예방 또는 치료를 위한 용도에 대하여 구현예 및 실시예와 도면을 참조하여 구체적으로 설명하도록 한다. 그러나, 본원이 이러한 구현예 및 실시예와 도면에 제한되는 것은 아니다.

본원의 제 1 측면은, 약독화된 폐렴구균 균주를 포함하는, 염증성 질환, 호흡기 바이러스 감염 질환, 또는 폐렴구균을 제외한 세균 감염성 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공할 수 있다. 예를 들어, 상기 약제학적 조성물은 백신 조성물을 포함할 수 있다.

본원의 일 구현예에 따르면, 상기 약독화된 폐렴구균 균주는 pep27 유전자의 일부 또는 전부가 결실된 것일 수 있고, 예를 들어, 서열번호 1로 표시되는 pep27 유전자 핵산서열의 1번 내지 53번이 결실된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본원의 일 구현예에 따르면, 상기 약독화된 폐렴구균 균주는 서열번호 1로 표시되는 pep27 유전자 핵산서열의 1번 내지 53번의 결실 및 ermB 카세트로 치환한 돌연변이를 포함하는 약독화된 폐렴구균 균주일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 약독화된 폐렴구균 균주는 대한민국 등록특허 제10-1252911호에 개시된 pep27 돌연변이를 포함하는 약독화된 폐렴구균 균주일 수 있다.

본원의 일 구현예에 따르면, 상기 염증성 질환은 천식, 기관지염, 비염, 염증성 장질환, 위장염, 대장염, 크론병, 췌장염, 죽상 동맥 경화증 및 관절염으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 염증성 질환의 예방 또는 치료는 대장염증 유전자와 같은 염증 관련 유전자의 발현 억제에 따른 효과일 수 있다. 예를 들어, 상기 염증성 질환은 장 및 호흡기 감염 질환과 관련된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

예를 들어, 상기 호흡기 바이러스는 메타뉴모바이러스, 코로나바이러스, 엔테로바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스, 아데노바이러스, 보카바이러스, 리노바이러스 및 인플루엔자 바이러스로부터 선택되는 것일 수 있다. 상기 호흡기 바이러스 감염 질환의 예방 또는 치료는 바이러스의 복제 억제에 따른 효과일 수 있다. 예를 들어, 상기 인플루엔자 바이러스는 인플루엔자 A 형, B 형 또는 C 형일 수 있으며, 구체적인 아형의 종류에 제한되지 않을 수 있다.

또한 본원의 약제학적 조성물은 바이러스 비특이적 방어 기능도 제공할 수 있는데, 이 경우 인플루엔자뿐만 아니라 다른 바이러스, 예를 들어, 이에 제한되지는 않으나, 호흡기 세포융합 바이러스 (Respiratory syncytial virus) 및 코감기 바이러스 (Rhinovirus)를 포함하는 바이러스에 대한 방어 기능도 제공할 수 있다.

본원의 일 구현예에 따르면, 상기 세균 감염성 질환은 그람 양성균 감염성 질환, 그람 음성균 감염성 질환 및 기타 감염성 세균 질환으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 세균 감염성 질환의 예방 또는 치료는 그람 양성균 및/또는 그람 음성균의 감염 억제에 따른 효과일 수 있다.

본원의 일 구현예에 따르면, 상기 그람 양성균은 포도상구균, 연쇄상구균, 파상풍균 및 탄저균으로부터 선택되고, 상기 그람 음성균은 살모넬라균, 이질균, 폐렴간균, 대장균 및 콜레라균으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 그람 양성균은 황색포도상구균일 수 있다.

본원의 일 구현예에 따르면, 상기 약제학적 조성물은 혈청형-비의존적으로 면역화시키는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 상기 혈청형-비의존적으로 면역화시키는 약제학적 조성물은 항원에 특이적으로 항체를 생산하는 것이 아니라, 항원에 무관하게 항체를 생산하여 면역반응을 일으키는 약제학적 조성물을 의미한다.

본원의 일 구현예에 따르면, 상기 약제학적 조성물은 폐, 비장, 혈액 또는 뇌에 비침습성일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 상기 "비침습성"이란 직접적으로 약제학적 조성물이 투여되는 기관, 조직, 및 세포 이외에 전신의 다른 영역으로 약제학적 조성물이 침투되지 않거나, 혹은 침투되더라도 빠르게 제거되는 것을 의미하며, 이는 약제학적 조성물이 투여되는 기관, 조직, 및 세포 이외에 전신의 다른 영역으로 침투되어 인체에 손상을 미치는 침투성과 반대되는 의미이다.

용어 "투여"란 어떠한 적절한 방법으로 대상에게 본원발명의 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 본원발명의 조성물의 투여경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 경구 투여, 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여, 강내 투여, 경막 내, 점막 내 투여가 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지는 않을 수 있다.

본원의 일 구현예에 따르면, 상기 약제학적 조성물은 복강내 또는 점막내로 투여하기 위한 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 상기 점막의 위치는 특별히 제한되지 않으며, 당업계에서 점막 투여를 위해 사용되는 신체 위치들 중에서 당업자가 적절히 선택하여 투여할 수 있다.

본원의 일 구현예에 따르면, 상기 약제학적 조성물은 인후 점막내로 투여하기 위한 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 인후 점막을 통한 백신화는 예를 들어 에어로졸 또는 점적 전달 시스템 형태를 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본원발명에 따른 약제학적 조성물을 이용하는 경우, 점막으로 투여하는 것으로도 개체 내에서 유효한 면역원성을 나타내므로, 기존에 주사제로 피하에 투여해야 하던 불편을 없앨 수 있을 뿐만 아니라, 주사제로의 투입에 특히 고통을 겪고 있는 영유아에게 투여하기에 유리할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 본원발명에 따른 약제학적 조성물을 투여할 수 있는 개체는 제한이 없으며, 랫트, 마우스, 가축, 인간 등의 포유동물을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 본원발명에 따른 조성물의 유효 투여량의 범위는 성별, 체표면적, 질환의 종류 및 중증도, 연령, 약물에 대한 민감도, 투여경로 및 배출비율, 투여시간, 치료기간, 표적세포, 발현 수준 등 기타 의학 분야에 잘 알려진 다양한 요인에 따라 달라질 수 있으며, 당 분야의 전문가들에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본원의 일 구현예에 따르면, 상기 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 면역 보조제를 추가적으로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본원발명의 약제학적 조성물에 포함될 수 있는 담체로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본원발명에서 사용될 수 있는 면역보조제로는 당업계에서 통상적으로 사용되는 면역보조제가 제한 없이 사용될 수 있으며, 상기 면역보조제는 cholera toxin binding unit, aluminum salts, lipid emulsion (MF-59), synthetic detergent (Tween), microspheres, liposomes, mucoadhesive polymers 등을 들 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 이 분야의 새로운 제형이 개발되고 있는바, 이들 또한 사용될 수 있다.

본원발명에 따른 약제학적 조성물은 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 상세하게는, 제형화할 경우 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

예를 들어, 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되고, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있으며, 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있으나 이에 제한되지 않을 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함될 수 있으며, 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있으나 이에 제한되지 않을 수 있다.

이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 하나, 하기의 실시예는 단지 설명의 목적을 위한 것이며 본원의 범위를 한정하고자 하는 것은 아니다.

[실시예]

1. 재료 및 방법

약독화된 폐렴구균 균주 THpep27의 제조

본원의 실시예에서 사용된 폐렴구균 균주인 THpep27 변이주는 Choi SY 등 (Inactivated pep27 mutant as an effective mucosal vaccine against a secondary lethal pneumococcal challenge in mice. Clin Exp Vaccine Res. 2013)의 문헌에서 보고된 균주이며, 대한민국 등록특허 제10-1252911호에 개시된 pep27 돌연변이 폐렴구균 균주에서 선별을 위한 에리스로마이신 내성 마커(ermAM)를 가지지 않는다는 것을 제외하고는 동일한 균주이다.

선택을 위한 일시적 마커로 사용할 수 있는 에리스로마이신 내성 마커 (ermAM)를 갖는 Cheshire 카세트 (Genbank accession No. FJ981645)를 Donald Morrison 박사 (University of Illinois of Chicago)로부터 얻은 프라이머 (5'-TGG CTT ACC GTT CGT ATA G-3' (서열번호 2)과 5'-TCG ATA CCG TTC GTA TAA TGT-3' (서열번호 3))를 이용하여, 상류 및 하류 서열을 증폭하는 프라이머 (5'-TCT CTA TCG GCC TCA AGC AG-3' (서열번호 4)과 5'-CTA TAC GAA CGG TAA GCC A GAT TTT CAC CAC TGC TTT CG-3' (서열번호 5) 및 5'-ACA TTA TAC GAA CGG TAT CGA AAG GCC AGC AAG AGA CTA-3' (서열번호 6)과 5'-CTG CGA GGC TTG CAC TGT AG-3' (서열번호 7)) 로 D39 게놈 DNA를 주형으로 이용하여 PCR에 의한 중합효소 연쇄반응 (PCR)으로 연결하였다. 이어서, 연결된 생성물을 D39로 형질전환시켜 pep27 돌연변이체를 생성시켰다.

체셔 (Cheshire) 카세트 절단은 1% L-후코스(fucose) (Sigma, St. Louis, MO, USA)를 첨가하여 유도하였다. 후코스-처리된 배양물을 THY 혈액 한천배지에 도말하여 단일 콜로니를 얻었다. 각 콜로니에서 체셔 카세트의 존재는 다음 프라이머를 사용하여 PCR로 확인하였다: 5´-TCT CTA TCG GCC TCA AGC AG-3´ (서열번호 8) 과 5´-CTG CGA GGC TTG CAC TGT AG-3´ (서열번호 9). 돌연변이체 (THpep27) 서열은 Pep27 항체로 면역 블롯 분석뿐만 아니라 뉴클레오타이드 시퀀싱 (Cosmo, Seoul, Korea)으로도 확인하였다 (미도시).

RNA 수준에서 THpep27 돌연변이체를 확인하기 위해, 초기 대수기에 있는 세균으로 부터 RNA를 이전에 기술된 뜨거운 페놀 방법을 사용하여 분리하였다. DNA를 DNase I (Takara, Tokyo, Japan)으로 제거한 후, 무작위 프라이머 (Takara)를 사용하여 1 마이크로그램의 세균 RNA를 cDNA로 역전사 시켰다. 역전사 PCR은 권장 프라이머를 사용하여 제조자의 지침 (Super Bio, American Building Restoration Products Inc., Franklin, WI, USA)에 따라 수행하였다.

기타 세균 균주의 준비

본원에서 시험된 폐렴구균 균주는 아래의 표 1 에 제시되어 있다.

폐렴구균 (S. pneumoniae) 혈청형 2번 (D39) 야생형 균주, 혈청형 3번 (A66.1), 혈청형 6B (BG7322) 및 THpep27 변이주 (D39 Δpep27)를 실험실에서 사용하던 방법으로 배양하여 사용하였다 (Kim et al, 2012). 폐렴구균은 37℃에서 혈액 한천 평판에서 하룻밤 동안 배양 한 다음, 0.5 % 효모 추출물 (THY; Difco Laboratories)을 첨가한 Todd-Hewitt 브로스에서 37℃에서 3 시간 동안 배양하였다. 각 세균 배양액을 적절하게 희석하고, CD1 생쥐에 10 ㎕의 폐렴구균 균주를 인후 (i.n.) 감염시켰다.

황색포도상구균 (S. aureus ATCC 25923)와 폐렴간균(K. pneumoniae, ATCC 9997)는 한국 미생물 보존 센터 (KCCM, 서울)에서 구입하여 탈섬유소 양 혈액을 첨가한 뇌 심장 추출 (brain heart infusion; BHI) 배지에서 37℃에서 하룻밤 동안 배양한 후, BHI 배양액에 접종하여 OD₅₅₀ = 0.5가 될 때까지 37℃에서 배양하였다.

인플루엔자 바이러스 A / California / 04 / 2009 (H1N1) 균주는 이전에 사용된 방법으로 계란에서 배양하였다 (Shim et al, 2013).

생체 내 감염 연구

4 주 된 수컷 CD1, BALB/c 생쥐 (오리엔트, 한국)를 감염 실험에 사용하였다. 본 실시예에서 동물 사용은 성균관대학교 동물 윤리위원회에서 한국 동물보호법의 지침에 따라 승인되었다.

백신 유효성 평가에서 생존 일수 측정실험에는 생쥐에 1 x 10⁷ 내지 1 x 10⁸ 개의 Δpep27 균주를 2 주 마다 인후 (i.n.) 에 3 번 접종하였다. 최종 면역화 1 내지 2 주 후에, 생쥐 인후에 1 x 10⁷ 내지 1 x 10⁸ 개의 독성 균주 D39 또는 6B로 감염시켰다. 이렇게 감염된 생쥐의 생존은 처음 5 일 동안은 매일 4 회, 그 이후 5 일 동안은 1 일 2 회, 그 후에는 매일 관찰하여 감염 후 14 일까지 모니터링하였다.

집락 형성 억제능을 평가하기 위해서 생쥐에 약 1 x 10⁷ ~ 1 x 10⁸ 개의 Δpep27 를 2 주 마다 3 회 인후 접종하고, 최종 접종 1 내지 2 주 후에, 생쥐에게 약 5 x 10⁶ ~ 1 x 10⁷ 개의 폐렴구균을 감염시켰다. 생쥐를 지시된 시간에 희생시키고, 인후부를 무균적으로 제거한 후, 호모지나이저 (PRO Scientific Inc., Oxford, CT, USA, Model 200 Double insulated)를 사용하여 1 ml의 PBS (혈액을 제외하고)에서 얼음 위에서 최대 속도로 균질화시키고 멸균 PBS로 연속 희석하여 5 ~ 10 μg /ml의 겐타마이신 (gentamycin)을 함유한 혈액 한천배지에 접종하여 폐렴구균을 선별하였다. 이어서, 플레이트를 37℃, 95 % 공기 - 5 % CO₂를 함유하는 상태에서 약 18 시간 동안 배양하여 집락수를 세는 실험을 2 회 반복하여 평균치를 사용하였다.

Δpep27 백신에 의해 황색포도상구균 및 폐렴간균(K. pneumoniae ) 감염을 방어할 수 있는지 조사하기 위해, 생쥐에 Δpep27를 3 회 인후 접종하고 최종 Δpep27 접종 10 일 후, 황색포도상구균 또는 폐렴간균을 각각 1 x 10⁸ 개 또는 2 x 10⁶ 개를 PBS 50 ㎕ 에 현탁하여 인후로 감염시켰다. 이어서, 감염 24 시간 및 48 시간 후에 폐 및 비강 세척물을 수집하고 균질화하여 적절히 연속 희석한 후 BHI 혈액 한천배지에 도말하여 37℃에서 밤새 배양하여 균 수를 세었다.

바이러스 및 폐렴구균 감염 실험

생쥐 (BALB/c 암컷, 6-8 주령, Koatech, Korea)에 약 1 x 10⁸ 개의 Δpep27 를 50 ㎕ PBS에 현탁하여 1 주 간격으로 3 회 접종하고, 마지막 접종 10 일 후에, 50 ㎕ PBS에 0.02 치사량 (LD)이 되도록 H1N1 인플루엔자 바이러스를 준비하여 인후로 감염시켜 매일 체중을 모니터링 하였다. 인플루엔자 감염 후 10-12 일 후에, 1 x 10⁸ 개의 D39를 50 ㎕ PBS에 현탁하여 생쥐 인후에 감염시킨 다음, 생존율을 측정하였다.

비장 세포 분리

생쥐 인후에 Δpep27 (THpep27 변이주)를 1 x 10⁷ 내지 1 x 10⁸ 개로 2 주마다 3 회 접종하였다. 최종 접종 1 주일 후 비장을 꺼내고 T 림프구를 자극하기 위해 분리된 비장세포에 항-CD3e (5 ㎕ / ml; eBioscience) 및 항-CD28 (3 ㎕ / ml; eBioscience) 항체 처리하였다 (Bashour 등, 2014). 24 시간 배양 후 수확하여, 배양 배지의 사이토카인 수준을 측정하였다.

사이토카인 측정

기관지 폐포 세척액 (bronchoalveolar lavage; BAL), 혈청 및 비장 세포에서 인터루킨 (Interleukin: IL)-17, 종양 괴사 인자 (TNF)-α, 인터페론 (IFN)-γ, IL-4 및 IL-10의 농도는 시판중인 효소 결합 면역 흡착 분석 (enzyme-linked immunosorbent assay; ELISA) 킷 (BD Biosciences, San Diego, CA, USA)를 사용하여 제조사의 지시대로 측정하였다.

IgG 항체역가 및 Ig 서브타입 결정

생쥐 인후에 1 x 10⁷내지 1 x 10⁸ 개의 Δpep27를 2 주마다 3 회 접종하였다. 최종 접종 7 일 후 안와 채혈로 혈청을 얻어 -80℃에서 ELISA 할 때까지 보관하였다. 이전에 기술된 바와 같이 항체를 적정하였고 (Roche et al., 2007; Kim et al., 2012; Cohen et al. 2013) Ig 아형은 생쥐 Ig 이소타이핑 ELISA 킷 (eBioscience, USA)을 이용하여 측정하였다.

동시 감염 연구에서 혈청에서의 IgG 역가는 폐렴구균 균 용해물 (D39, A66.1, BG7322), 또는 혈청형 2 번 캡슐로 코팅된 96 웰 면역 플레이트 또는 PBS 용액 중 정제된 PspA 단백질 (1 μg/ml)을 사용하여 ELISA 방법으로 측정하였다 (Kim et al., 2012; Cohen et al., 2013).

폐에서 바이러스 및 균 수 측정

생쥐 (BALB/c 4 마리/그룹)를 Δpep27으로 인후접종하고, 상기한 바와 같이 H1N1 또는 H3N2 인플루엔자 바이러스로 감염시킨 다음 폐 샘플을 수집하고 이미 보고된 방법대로 분석하였다 (Shim et al, 2013).

인플루엔자 바이러스 감염 5 일 후 생쥐 폐를 70 μm 스트레이너 (strainer)에 통과시키고 원심 분리하여 상청액을 역가 측정 때까지 -80℃에서 보관하였다. 바이러스 역가 (titer) 측정을 위해 MDCK 세포 (2 x 10⁴ 세포/웰)를 MEM (1 % IgG가 없는 BSA, 1X 페니실린 - 스트렙토 마이신) 배지로 96 웰 플레이트에 파종한 다음, 플레이트를 37℃에서 4 시간 동안 배양하였다. 그 다음, 배양된 세포에 연속적으로 2 배 희석된 폐 균질화물 상등액으로 감염시키고, 밤새 배양하였다. 이어서, 상등액을 버리고 항 인플루엔자 A 항체를 이용하여 TCID₅₀/ml 를 이용하여 측정하였다 (Wu et al, 2015).

Real-time PCR

복강 대식세포를 분리하여 배양한 후 RNAiso plus (TAKARA, Japan)를 사용하여 총 RNA를 추출하였다. RT-PCR은 원-스텝 RT qPCR 킷 (Enzynomics, Korea)를 사용하여 수행하였다. 유전자 특이 프라이머 서열은 다음과 같다: IL-10 유전자 (Forward [F]: 5'- AGC CAC CTC ATG CTA GAG C (서열번호 10), Reverse [R]: 5'- GCC TGG TCT GGC ATC ACT AC (서열번호 11)); IL-1β의 유전자 (F: 5'- CTG GTG TGT GAC GTT CCC AT (서열번호 12) ; R: 5'- TGT CGT TGC TTG GTT CTC CT (서열번호 13)); TNF-a 유전자 (F : 5'- CAC AAG ATG CTG GGA CAG TGA (서열번호 14); R: 5'- TCC TTG ATG GTG GTG CAT GA (서열번호 15)). GAPDH 유전자 (프라이머 F : 5'- TGC ATC CTG CAC CAC CAA (서열번호 16); R: 5'- TCC ACG ATG CCA AAG TTG TC (서열번호 17))를 대조군으로 하였다.

PCR 프로그램은 다음과 같이 수행하였다: 유지 (Holding; 95℃ 10 분); 40 사이클 동안 매 사이클 (95℃ 15 초, 55℃ 30 초, 72℃ 30 초); 멜트 커브 (95℃ 15 초, 60℃ 1 분, 95℃ 15 초).

High Throughput Sequencing

Δpep27 접종 후 폐 및 비장에서 유도되는 유전자 발현을 측정하기 위해 생쥐 (Balb/c 4 주령)에 1 x 10⁷-1 x 10⁸ 개의 폐렴구균 Δpep27 (THpep27: Choi et al., 2013)를 마취하지 않고 2 주 간격으로 3 회 인후에 접종하였다 (i. n.). 폐 및 비장에서 Trizol 시약 (Invitrogen)을 사용하여 RNA를 추출하고, 500 ng의 총 RNA를 이용하여 시퀀싱 라이브러리를 구축하였다. 이후 시퀀싱을 위해 LEXOGEN Quant-Seq 라이브러리 준비 키트 (Cat # 001.24)를 이용하여 표준 프로토콜에 따라 RNA 라이브러리를 구축하였다. 유전자 발현은 Illumina NextSeq 500을 사용한 고속 대량(high-throughput) 시퀀싱으로 측정하였다.

DNA 처리 단계

베이스 호출에 Illumina Casava1.8 소프트웨어를 사용하였다. 서열 판독은 어댑터 서열을 위해 정돈되었으며, fastx_trimmer를 사용하여 저 복잡성 또는 저 품질 서열에 대해서는 더 이상 처리하지 않도록 한 다음 Bowtie2를 사용하여 mm10 전체 게놈에 매핑되었다. 읽기 횟수 추출 및 정규화는 edgeR을 사용하여 수행되었다. Ingenuity Pathway Analysis를 이용한 실험 및 시스템 생물학 분석은 e-biogen (Seoul, Korea)에서 수행하였다.

유전자 발현 분석 데이터는 NCBI [GEO accession number GSE93718] (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)에 기탁되었다.

장 염증성 질환으로부터의 방어능 측정

생쥐 (C57BL/6 수컷, 4 주령)에 케타민 100 ㎕을 복강 내 주입하여 마취한 후 1 x 10⁷에서 1 x 10⁸ 개의 △pep27를 1 주일 간격으로 3 회 인후 접종하였다. 생쥐의 체중을 측정하고 무작위로 실험군당 2 마리를 사용하여 4 실험군으로 나누었다. 각각의 일련의 실험에서 사용된 생쥐 실험군은 다음과 같다: 덱스트란 설페이트 나트륨(DSS) 처리를 하지 않은 대조군, 5 % DSS만을 투여 한 실험 대조군, Pep27 접종만 한 실험군, 및 Pep27 + 5 % DSS를 투여 한 그룹. 생쥐에게 평균 분자량 5000 (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, USA)의 DSS (5 %, w/v)를 연속 14 일 동안 마시도록 하여 대장염을 유도하였다 (Wirtz et al, 2007). DSS 용액은 매일 새롭게 준비하였다. 대조군 생쥐는 수돗물만 마시도록 하였다.

모든 대조군 및 실험 대조군은 연구기간 동안 DSS 투여군과 동일한 방식으로 투여된 등량의 비히클 (vehicle; 식염수)을 투여하였다.

<△Pep27 백신 접종에 의한 생쥐에서의 DSS 유도 장염 억제 실험>

장 질환 (IBD) 시료 채취

5 % DSS 투여 14 일 후, 실험동물을 CO₂ 질식으로 희생시키고 사후 개복술을 시행하였다. 맹장에서 항문까지 전체 대장을 제거하고 근위부, 중간부 및 말단부로 나누고 선택된 조직을 분리하여 인산염 완충 식염수 (PBS)로 세척한 후 분석 할 때까지 -80 ℃에 보관하였다.

결장 절편의 정량 조직학 (질병 활성 지수 Disease activity index: DAI)

대장염의 진행은 음용량과 체중 감소, 대변의 일관성, 직장 출혈 및 대변에서의 총 혈액의 존재를 측정하여 매일 평가하고 임상 증세도 평가하였다. 생쥐의 병적 상태 (지루함, 무기력)도 매일 모니터링하였다.

이 매개 변수는 아래에 제시된 기준에 따라 점수를 매겼으며, 이는 이미 보고된 논문에서 제시된 대로 각 동물의 평균 일일 질병 활성지수 (DAI)를 계산하였다 (Wirtz et al, 2007; Jawhara and Poulain, 2007).

또한, 대장 염증은 원래 상태의 당기지 않은 회전형 접합부에서 항문 경계까지 결장의 길이를 육안으로 측정하여 평가하였다. 병리학적 소견을 각 그룹별로 상세히 기록하였으며, 가장 염증이 심한 장기에서 변화가 나타난 시기와 그 정도를 평가하기 위해 조직을 시각적으로 0 에서 5 점까지 점수를 매기는 체계를 사용하였다.

이전에 검증 된 병리학적 점수 등급 시스템 (Jawhara and Poulain, 2007; Xu et al, 2007)을 변형하여 대장염의 정도를 평가하는 방법을 사용하였다. 모든 실험을 적어도 두 번 반복하여 모든 그룹에서 다음과 같이 산출하였다.

1) 체중 감소, 변화 없음, 0; <5 %, 1; 6-10 %, 2; 11-20 %, 3; > 20 %, 4;

2) 대변의 일관성 (Stool consistency), 정상 또는 잘 형성된 펠릿 = 0; 항문에 달라붙지 않는 반죽 모양의 반창고 = 1; 항문에 붙은 상태로 남아있는 액체 변 2; 약간의 피로 끈적거림, 3; 완전한 액체이거나, 피가 있거나, 또는 10 분 후에도 배설되지 않는 것; 4;

3) 직장 출혈, 혈구 혈액 없음, 0; 항문에 혈액이 보임, 1; 털에 혈액이 보임, 2; 직장에서 심한 출혈, 4 점.

4) 일반적인 외관, 정상, 0; 점액질, 1; 무기력하고 선조 (piloerect), 2; 무기력하고 구부린. 3; 움직이지 않고, 아픈, 4.

통계 분석

모든 데이터는 두 번의 독립적인 실험치의 평균 ± 표준 편차로 나타내었다. 통계학적 비교는 일원 분산 분석법을 사용하여 Bonferroni 's test를 사용하여 수행되었다. 0.05 미만의 P 값은 통계적으로 유의하다고 간주되었다.

2. 결과

2-1. 사례 # 1 : HTS와 시스템 생물학 분석은 주요 병변으로부터의 방어기능을 제시하였다

2-1-1. Δpep27 접종은 다양한 병변으로부터 생쥐를 방어하였다

폐에서의 시스템 생물학 분석은 Δpep27 인후 접종이 위장염 및 대장이 비정상으로 변화되는 것을 방어한다는 것을 제시한다 (도 1a). 또한 비장에서의 시스템 생물학 분석은 Δpep27 접종으로 인해 인플루엔자 바이러스 감염으로부터 방어됨을 나타낸다 (도 1B).

2-1-2. Δpep27 접종은 Treg 세포를 유도하였다

폐에서의 시스템 생물학 분석은 또한 Δpep27의 접종으로 인해 폐에서 TGF-β가 유도됨을 나타낸다 (도 2). 도 2에서 녹색은 유전자 발현이 억제된 것을 나타내며 빨간색은 유전자가 유도된 것을 의미한다. Δpep27 접종에 의해 Treg가 유도되는 것을 확인하기 위해, 접종한 생쥐의 비장세포를 FACS 분석하였다. 그 결과 Δpep27 접종을 하는 경우 Th2, Th17 및 Treg 세포 집단이 증가되었지만 Th1 세포는 증가하지 않았고 (도 3a), 이렇게 유도된 Treg 세포는 면역관용에서 어떤 역할을 할 수 있음을 시사한다. Treg가 유도되는 것을 뒷받침하기 위해 비장세포 및 혈청의 사이토카인 수준을 측정하였다. 일관성 있게 비장에서 인터페론 (IFN)-γ, IL-4, IL-17 및 IL-10이 유의하게 유도되었다 (도 3b). 또한 혈청에서도 IFN-γ, IL-17 및 IL-10이 유의하게 유도되었으나 IL-4 수준은 유의하게 변화되지 않았다 (도 3c). 이러한 결과는 Treg 세포 유도로 항 염증성 사이토카인 IL-10의 생산이 유도되어 면역관용을 강화시킴을 제시한다.

2-1-3. Δpep27 접종에 의한 IL-10 유도

면역관용 반응을 뒷받침하기 위해 폐 및 기관지 폐포 세척액 (BAL)에서 IL-10 및 IL-17 수준을 측정했다. 일관되게, Δpep27 접종으로 인해 폐에서 IL-10과 IL-17 수준과 BAL의 IL-17 수준이 모두 유의하게 증가되었으나 (도 4a) BAL의 IL-10 수준은 크게 증가되지 않았다 (그림 4b).

2-1-4. Δpep27 접종에 의한 기억 반응 유도

인후 접종이 기억 반응을 일으킬 수 있는지를 확인하기 위해, 접종한 생쥐로부터의 비장세포를 수확하고 기억반응을 측정하였다. 실험 결과, Δpep27 접종으로 인해 비장에서 중앙 기억 T 세포 (CD4, CCR7, CD62L)와 기억 Tfh 세포 (CD4, CXCR5, CCR7)가 증가되었다 (도 5).

기억 반응을 다시 확인하기 위해 다양한 혈청 면역 글로불린 아형의 항체역가를 측정하였다. 예상대로 Δpep27 백신 접종은 IgG1, IgG2a, IgG2b 및 IgG3과 같은 다양한 면역글로불린 아형을 유도하였다 (도 6a). 또한, 기관지 폐포 세척액 (Bronchoalveolar Lavage, BAL)의 분비성 IgA 수준도 백신 접종으로 유의하게 증가되었다 (도 6b). 따라서, 인후백신 접종은 기억 반응을 유도함을 확인하였다.

2-2. 사례 2 : 인플루엔자 바이러스의 동시 감염 방어

폐렴구균 (Streptococcus pneumoniae)과 인플루엔자 A 바이러스 (IAV)는 호흡기 감염의 주요 원인균이다 (Bosch et al, 2013, Shak et al, 2013). 폐렴구균 또는 IAV 자체가 호흡기 질환을 일으키지만 인플루엔자 바이러스 감염 후 이차감염이 일어나 사망률이 증가된다 (Mina and Klugman, 2013). 그러나 현재 이용가능한 폐렴구균 다당류 접합백신 PCV 13은 2 차 폐렴구균 감염을 효과적으로 방어하지 못했다 (Metzger et al, 2015).

2-2-1. Δpep27 접종에 의한 2 차 폐렴구균 감염을 방어

이전의 연구에서, 생쥐에 Δpep27을 인후 접종하면 IgG가 유도되고, 이종 폐렴구균 감염으로부터 방어됨을 확인하였다 (Kim et al, 2012). 본원에서는 Δpep27 접종이 전균 (whole bacterial cells) 뿐만 아니라 특정 항원에 대한 항체 역가를 증가시킬 수 있는지 확인하였다. 실험 결과 Δpep27 인후 접종으로 혈청형 2 번 (D39) 전균 뿐만 아니라 혈청형 3 번 및 6B에 대해서도 IgG 역가를 증가시켜 (도 7a) 동종 및 이종형 폐렴구균 모두 비 면역화 대조군보다 유의하게 높은 체액면역이 유도되었음을 나타내었다. 특정 항원, PspA 단백질 및 혈청형 2 번 다당류 협막에 대한 IgG 역가를 측정하였을 때, Δpep27 접종은 PspA 역가를 증가시켰으나 다당류 협막에 대한 역가는 증가시키지 않았다 (도 7b).

Δpep27 인후접종으로 2 차 폐렴구균 감염으로부터 방어가 되는지 조사하기 위해, 생쥐에게 H1N1 인플루엔자 바이러스를 0.02 치사량 (lethal dose, LD) 으로 감염시켰다. 인플루엔자 바이러스 감염 10 일 후, 독성 폐렴구균 D39 균주를 생쥐에 감염시키고, 생존율을 측정하였다. D39 감염 후 백신을 접종하지 않은 생쥐 (PBS / H1N1)는 폐렴에 걸린 반면 인후접종한 대부분의 생쥐 (THpep27 / H1N1)는 성공적으로 살아 남았으며 (도 7c), 이런 결과는 생쥐에 Δpep27를 인후접종하면 인플루엔자 바이러스 감염으로부터 방어될 뿐만 아니라 2 차 폐렴구균 감염으로 부터도 방어될 수 있음을 제시한다.

또한 인후접종 후 폐렴구균을 감염시킨 후 균 수를 측정한 결과 백신접종을 받은 모든 생쥐 폐에서는 접종하지 않은 대조군보다 훨씬 적은 수의 균이 검출되었으며 (도 7d), 이는 Δpep27 인후접종으로 인해 생쥐가 인플루엔자 감염 후 2 차 폐렴구균 감염으로부터도 성공적으로 방어되었음을 나타낸다.

2-2-2. Δpep27 접종으로 인한 폐의 바이러스 및 세균 수의 감소

Δpep27 접종으로 인플루엔자 바이러스 수가 감소되는지 조사하기 위해, 인플루엔자 바이러스 감염 후 체중이 감소되는지 측정하였다. 흥미롭게도, Δpep27백신을 접종한 모든 생쥐는 인플루엔자 감염 후에도 체중이 감소되지 않았지만, 백신을 접종하지 않은 생쥐는 체중이 현저히 감소되었다 (도 8a). Δpep27 백신 접종에 의해 인플루엔자 바이러스 감염으로 인한 체중 감소가 억제되기 때문에, 추가로 Δpep27 백신접종에 의해 폐에서 인플루엔자 바이러스 복제가 어떤 영향을 받는지 확인하기 위해, 인플루엔자 감염된 생쥐 폐에서의 바이러스 수를 TCID₅₀로 측정하였다. 놀랍게도, 백신을 접종한 생쥐는 백신을 접종하지 않은 대조군보다 유의하게 낮은 바이러스 수를 나타내었다 (도 8b). 이 결과는 Δpep27 인후백신 접종에 의해 폐렴구균 감염뿐만 아니라 인플루엔자 바이러스 감염도 현저히 감소된다는 것을 의미한다.

2-3. 사례 3: Δpep27 접종에 의한 다른 세균 감염 방어

2-3-1. Δpep27 접종에 의한 그람 음성 세균 감염 방어

Δpep27 백신 접종으로 다른 세균 감염의 정착을 막을 수 있을지 확인하기 위해, 생쥐에 Δpep27 백신을 접종한 다음 그람 음성균인 폐렴간균(Klebsiella pneumoniae)을 감염시켜 조직 내 균수를 측정하였다. 백신 접종군은 감염 24 시간 후 폐 및 혈액 내 폐렴간균의 수가 백신을 접종하지 않은 대조군보다 유의하게 감소되었으므로 (도 9), Δpep27 백신 접종에 의해 그람 음성 세균 감염을 예방할 수 있음이 입증되었다.

2-3-2. Δpep27 접종에 의한 그람 양성 세균 감염 방어

Δpep27 백신 접종이 다른 세균 감염의 정착을 막을 수 있는지 재확인하기 위해, 생쥐에 Δpep27 백신을 접종한 다음 그람 양성균인 황색포도상구균 (Staphylococcus aureus)을 감염시켜 조직 내 생존 세균 수를 측정했다. 흥미롭게도, Δpep27 백신 접종군은 생쥐의 폐 및 코 세정액에서 세균 집락수가 백신을 접종하지 않은 대조군에 비해 현저히 감소되었다 (도 10). 이 결과는 Δpep27 백신 접종이 그람 양성 세균과 같은 다른 세균 감염을 예방할 수 있음을 입증한 것이다.

2-4. 사례 4: 장 염증성 질환 방어

경구 면역관용 현상은 사람에서 류마티스 성 관절염 (RA), 알레르기 성 질환, 당뇨병, 동맥경화증, 대장염 질환 등에서 연구되어 왔다 (Faria and Weiner, 2005). 살모넬라 유래 분비 단백질 (SseB)을 인후 접종하여 내장 및 전신 IgA, Th1 및 Th17 반응이 유도되었고, 경구로 치명적인 감염을 시켜도 장 조직 및 비장에서의 세균 수가 감소되었다 (Pigny et al., 2016). 그러나 장내 염증성 질환을 방어하는 인후 백신은 보고된 바 없다.

2-4-1. Δpep27 백신 접종에 의한 장 염증성 질환 방어

Δpep27 백신 접종이 장 염증성 질환을 억제할 수 있는지 확인하기 위해, 생쥐의 인후에 백신을 접종하고 DSS로 대장염을 유도하였다. 실험 결과 5% DSS 를 식수에 첨가한 후 9 일째부터 질병 지수가 악화되고 체중도 현저히 감소하였다. 5% DSS만 단독으로 처리한 생쥐에서는 체중이 현저히 감소했으나 Δpep27를 접종하고 5% DSS 처리한 실험군은 DSS 단독 처리군보다 유의하게 체중이 덜 감소되었다 (도 11a).

전반적인 임상질환 활동지수 점수 (p <0.05, 일원 분산 분석 후 Bonferroni 검사, DSS 처리 6-9 일)를 비교했을 때, 5% DSS 단독 처리군은 Δpep27 + 5% DSS 실험군보다 대변 일관성 점수가 유의하게 높았다 (도 11b). 즉, DSS로 유도된 대장염증이 악화되어 DSS 단독처리군은 임상활동지수가 높지만 백신 투여군은 대장염증이 정상군과 유사하게 낮았음을 제시한다.

결장길이가 짧아지는 것은 DSS 유발 대장염 모델에서 염증 마커로 사용되는데, 실제로 DSS 투여군에서 결장의 길이가 유의하게 짧아졌다 (도 12a). 따라서 DSS 그룹은 결장 무게/결장 길이의 비율이 유의하게 증가되었지만, Δpep27 백신 접종 그룹은 DSS 그룹에 비해 거의 정상에 가까운 비율을 나타내었다 (도 12b).

2-4-2. Δpep27 백신 접종에 의한 염증성 사이토카인 수준 억제

Δpep27 백신 접종이 장 염증을 감소시킨다는 것을 확증하기 위해, 대장에서의 사이토카인 mRNA 수준을 측정하였다. 실험 결과 Δpep27 백신 접종군은 호염성 IL-1β mRNA 수준이 비면역화된 대조군에 비해 유의하게 감소되었다 (도 13). 또한, 인후백신 접종에 의해 IL-17A, TNF-α 및 IL-6의 mRNA 수준 또한 비면역화된 대조군보다 억제되었으므로 (도 13), 인후점막 백신접종이 사이토카인 발현을 억제한다는 사실이 입증되었다.

전술한 본원의 설명은 예시를 위한 것이며, 본원이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본원의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며, 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.

본원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> SUNGKYUNKWAN UNIVERSITY Foundation for Corporate Collaboration <120> PHARMACEUTICAL COMPOSITION CONTAINING ATTENUATED STREPTOCOCCUS PNEUMOCOCCUS AND USES THEREOF <130> 1 <160> 17 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 84 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pep27 of Streptococcus pneumoniae D39 <400> 1 atgagaaagg aatttcacaa cgttttatct agtgatcagt tacttacaga caaaaggcca 60 gcaagagact ataatagaaa atag 84 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 1 <400> 2 tggcttaccg ttcgtatag 19 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 2 <400> 3 tcgataccgt tcgtataatg t 21 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 3 <400> 4 tctctatcgg cctcaagcag 20 <210> 5 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 4 <400> 5 ctatacgaac ggtaagccag attttcacca ctgctttcg 39 <210> 6 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 5 <400> 6 acattatacg aacggtatcg aaaggccagc aagagacta 39 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 6 <400> 7 ctgcgaggct tgcactgtag 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 7 <400> 8 tctctatcgg cctcaagcag 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 8 <400> 9 ctgcgaggct tgcactgtag 20 <210> 10 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-10 primer F <400> 10 agccacctca tgctagagc 19 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-10 primer R <400> 11 gcctggtctg gcatcactac 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-1b primer F <400> 12 ctggtgtgtg acgttcccat 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-1b primer R <400> 13 tgtcgttgct tggttctcct 20 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNF-a primer F <400> 14 cacaagatgc tgggacagtg a 21 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNF-a primer R <400> 15 tccttgatgg tggtgcatga 20 <210> 16 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH primer F <400> 16 tgcatcctgc accaccaa 18 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH primer R <400> 17 tccacgatgc caaagttgtc 20

Claims

약독화된 폐렴구균 균주를 포함하는, 염증성 질환, 호흡기 바이러스 감염 질환, 또는 폐렴구균을 제외한 세균 감염성 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 약독화된 폐렴구균 균주는 pep27 유전자의 일부 또는 전부가 결실된 것인, 약제학적 조성물.
제 2 항에 있어서,
상기 약독화된 폐렴구균 균주는 서열번호 1로 표시되는 pep27 유전자 핵산서열의 1번 내지 53번이 결실된 것인, 약제학적 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 염증성 질환은 천식, 기관지염, 비염, 염증성 장질환, 위장염, 대장염, 크론병, 췌장염, 죽상 동맥 경화증 및 관절염으로부터 선택되는 것인, 약제학적 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 호흡기 바이러스는 메타뉴모바이러스, 코로나바이러스, 엔테로바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스, 아데노바이러스, 보카바이러스, 리노바이러스 및 인플루엔자 바이러스로부터 선택되는 것인, 약제학적 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 세균 감염성 질환은 그람 양성균 감염성 질환 및 그람 음성균 감염성 질환으로부터 선택되는 것인, 약제학적 조성물.
제 6 항에 있어서,
상기 그람 양성균은 포도상구균, 연쇄상구균, 파상풍균 및 탄저균으로부터 선택되고, 상기 그람 음성균은 살모넬라균, 이질균, 폐렴간균, 대장균 및 콜레라균으로부터 선택되는 것인, 약제학적 조성물.
제 1 항에 있어서,
혈청형-비의존적으로 면역화시키는 것인, 약제학적 조성물.
제 1 항에 있어서,
폐, 비장, 혈액 또는 뇌에 비침습성인, 약제학적 조성물.
제 1 항에 있어서,
복강내 또는 점막내로 투여하기 위한, 약제학적 조성물.
제 10 항에 있어서,
인후 점막내로 투여하기 위한, 약제학적 조성물.
제 1 항에 있어서,
약제학적으로 허용가능한 담체 또는 면역 보조제를 추가적으로 포함하는, 약제학적 조성물.