KR20180104031A - 핵산 앱타머를 스크리닝하기 위한 방법 - Google Patents

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KR20180104031A
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dna
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aptamer
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게이타로 요시모토
고지 와쿠이
히토시 후루쇼
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도꾜 다이가꾸
닛산 가가쿠 가부시키가이샤
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Abstract

본 발명은, 하기 공정: (a) 고상 담체 상에 고정된 표적 분자를, 핵산 앱타머 후보와 접촉시키는 것, (b) 캐필러리 전기 영동에 의해, 표적 분자와 결합한 핵산 앱타머 후보를 분취하는 것, (c) PCR에 의해, 핵산 앱타머 후보를 증폭하는 것을 포함하는, 핵산 앱타머를 스크리닝하기 위한 방법에 관한 것이다.

Description

핵산 앱타머를 스크리닝하기 위한 방법
본 발명은 핵산 앱타머를 스크리닝하기 위한 방법에 관한 것이다.
핵산 앱타머란 분자 인식능을 갖는 외가닥 DNA 또는 RNA이며, 1990년에 Ellington 등과, Tuerk 등에 의해 처음으로 보고되었다. 핵산 앱타머는 Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment(지수증식에 의한 리간드의 계통적 진화)(SELEX)라고 불리는 진화 공학적인 방법에 의해 획득하는 것이 가능하고, 항체에 필적하는 결합능이나 특이성을 갖는 것도 다수 보고되고 있다. 또한, 단백질이나 세포를 비롯하여, 항체의 취득이 곤란한 저분자 화합물과 같은 다양한 표적에 대하여 앱타머를 취득할 수 있어, 치료약이나 진단약에 대한 응용이 기대되고 있다. 그러나, 항체의 획득 확률은 90% 이상으로 되어 있는 데 반해, 현재의 핵산 앱타머의 획득 확률은 30% 이하로 되어 있다. 즉, 핵산 앱타머의 획득 확률 기술의 향상은, 이후 핵산 앱타머가 널리 산업적으로 이용이 되기 위한 주요 과제라 할 수 있다.
핵산 앱타머는, 항체에 대체하는 새로운 분자 인식 소자로서 주목받고 있지만, 핵산 앱타머의 획득률은 30% 이하로 되어 있어, 고효율의 앱타머 획득법의 개발이 요망되고 있다. CE-SELEX는, 캐필러리 전기 영동의 우수한 분리능을 이용하는 신속한 핵산 앱타머의 스크리닝법이다. 그러나, 실험 조건 설정(분취 영역의 설정)의 어려움이나, 표적이 되는 분자는 ssDNA 라이브러리와의 결합 시에 큰 전기 영동 이동도가 변화하는 일정 이상의 크기가 아니면 안된다고 하는 제약으로부터, 범용성이 부족한 것은 부정할 수 없다.
CE-SELEX에 있어서, 분취 영역의 설정은, 앱타머 획득률을 좌우하는 중요한 요소이다. 표적에 대하여 결합능을 갖지 않는 ssDNA 라이브러리의 혼입이 없고, 표적과 복합체를 형성하고 있는 ssDNA 라이브러리를 확실하게 포함하는 영역을 분취할 필요가 있다. 이상적인 분취 영역은, ssDNA 라이브러리와 표적의 복합체 유래의 피크 범위이다. 그러나, 표적 분자가 MutS 단백질과 같이 ssDNA와 상호 작용하기 쉬운 것이며, 또한 고감도의 형광 검출기를 사용하지 않는 한, ssDNA 라이브러리와 표적의 복합체를 검출하는 것은 곤란하다. 지금까지, 표적 단백질을 형광 수식에 의해 가시화하거나, 리얼타임 PCR에 의해 표적·앱타머 복합체의 검출 위치를 예측하거나 하는 등, 분취 영역을 최적화하기 위해 다양한 고안이 이루어져 왔다. 그러나, 아직도 복합체의 검출은 어려워, 표적 분자의 검출 위치에서 ssDNA 라이브러리가 검출되기 직전까지를 분취 영역으로 하는 것이 일반적이었다. 이 분취 영역의 설정법에는, 도중에 해리한 결합능이 낮은 서열도 분취 영역에 포함되기 쉽다고 하는 문제점이 있다(도 1의 A).
또한, 저분자 화합물 등의 작은 분자를 표적으로 하는 경우, ssDNA 라이브러리와의 결합 시의 전기 영동 이동도 변화는 거의 기대할 수 없기 때문에, CE-SELEX의 적용은 곤란한 것으로 되어 있다. CE-SELEX에 의해 저분자 화합물에 대한 앱타머를 획득한 예는, 현재까지 단 하나밖에 없는 것으로부터도, 그 어려움을 판단할 수 있다(비특허문헌 1).
Yang, J. & Bowser, M. T. Capillary Electrophoresis-SELEX Selection of Catalytic DNA Aptamers for a Small-Molecule Porphyrin Target. Anal. Chem. 85, 1525-1530(2013).
본 발명은, CE-SELEX의 장점을 살리면서도, 실험 조건 설정의 어려움이나 적용 가능한 표적 분자종이 적은 것과 같은 결점을 해결한 신규 CE-SELEX를 제공한다. 구체적으로는, 입자와 CE-SELEX를 조합한 핵산 앱타머를 스크리닝하기 위한 방법에 관한 것이다. 지금까지 입자와 캐필러리 전기 영동을 조합한 RNA나 항원의 정량 해석법은 보고되고 있지만, 입자와 CE-SELEX를 조합한 방법은, 아직 보고되어 있지 않다.
본 발명자들은, 예의 연구의 결과, 입자와 CE-SELEX를 조합함으로써, 종래의 과제를 해결할 수 있는 것을 알아내고, 본 발명을 완성시켰다.
본 발명은, 이하에 관한 것이다.
[1] 하기 공정:
(a) 고상 담체 상에 고정된 표적 분자를, 핵산 앱타머 후보와 접촉시키는 것,
(b) 캐필러리 전기 영동에 의해, 표적 분자와 결합한 핵산 앱타머 후보를 분취하는 것,
(c) PCR에 의해, 핵산 앱타머 후보를 증폭하는 것,
을 포함하는, 핵산 앱타머를 스크리닝하기 위한 방법;
[2] 또한 (d) 증폭된 PCR 산물을 외가닥화하는 것을 포함하는, [1]에 기재된 방법;
[3] 고상 담체가, 입자인, [1] 또는 [2]에 기재된 방법;
[4] 입자의 입경의 최솟값이 0.05㎛인, [1] 내지 [3] 중 어느 하나에 기재된 방법;
[5] 표적 분자가, 단백질 또는 저분자량 화합물인, [1] 내지 [4] 중 어느 하나에 기재된 방법;
[6] 핵산 앱타머 후보가, 외가닥 DNA 라이브러리인, [1] 내지 [5] 중 어느 하나에 기재된 방법;
[7] 공정 (a) 내지 (d)를 최대 3회 반복하는, [2] 내지 [6] 중 어느 하나에 기재된 방법.
고상 담체는, 그 표면 상에 표적 분자를 고정할 수 있는 임의의 것을 사용할 수 있다. 예를 들어, 층상의 그래핀, 카본 나노 튜브, 풀러렌 및 입자를 들 수 있다. 입자는, 종래 공지된 임의의 입자를 사용할 수 있다. 예를 들어, 실리카 비즈, 폴리스티렌 비즈, 라텍스 비즈, 금속 콜로이드를 들 수 있다. 본 발명의 입자는 자성 입자일 수 있다. 입자의 평균 입경의 최댓값은, 캐필러리의 내경에 따라서 결정할 수 있다. 바람직하게는 100㎛, 보다 바람직하게는 10㎛, 더욱더 보다 바람직하게는 1㎛이다. 입자의 평균 입경의 최솟값은, 바람직하게는 100㎚, 보다 바람직하게는 10㎚, 더욱더 보다 바람직하게는 1㎚이다. 입자의 평균 입경은, 공지된 임의의 방법을 사용해서 결정할 수 있다. 예를 들어, 체 분류법, 현미경법, 침강법, 레이저 회절 산란법, 전기 검지법을 들 수 있다. 바람직하게는, 현미경법이다.
고가의 형광 검출기를 사용하지 않고, 가시부의 흡광도 검출기를 사용하기 위해서는, 입자는 가시광의 산란에 의해 검출되기 때문에 충분한 입경일 필요가 있다. 이 경우의 입자의 평균 입경의 최솟값은, 바람직하게는 0.05㎛, 보다 바람직하게는 0.5㎛, 더욱더 보다 바람직하게는 5㎛이다.
본 발명에 있어서 표적 분자란, 핵산 앱타머를 이용한 검출 방법 등에 있어서, 검출의 표적이 되는 분자를 말한다. 표적 분자의 화학종은 특별히 제한되지 않고, 저분자 화합물, 고분자 화합물 및 생체 유래 물질 등 다양한 화학종을 포함할 수 있다. 또한, 표적 분자는, 고상 담체의 표면에 고정할 수 있다. 보다 구체적으로는, 예를 들어 당류, 지질류, 올리고펩티드, 단백질 및 핵산을 들 수 있다. 표적 분자 기능으로서는, 예를 들어 항원, 항체, 리간드, 리셉터, 상호 작용 단백질 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서 핵산 앱타머란, 핵산 분자이며, 소정의 표적 분자에 대한 친화성이 높아, 특이적으로 결합할 수 있는 분자를 말한다. 이러한 성질을 갖는 핵산 분자를 핵산 앱타머라 하며, 특별히 언급하지 않는 한, 염기 서열, 분자의 크기, 분자의 입체 구조 등에 의해 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는, 핵산 앱타머는, 외가닥의 RNA 또는 DNA이다.
본 발명에 있어서 고상 담체 상에 고정된 표적 분자란, 표적 분자가, 소수성상호 작용이나 정전 상호 작용, 공유 결합, 배위 결합, 비공유 결합성의 분자간 상호 작용(비오틴-스트렙트아비딘 등) 등으로 고상 담체 표면에 고정되어 있는 것을 말한다.
본 발명에 있어서 핵산 앱타머 후보란, 복수의 RNA 및/또는 DNA로 구성되는 풀을 말한다. 바람직하게는, 외가닥의 핵산을 포함하는 외가닥 핵산 라이브러리, 보다 바람직하게는, 외가닥의 DNA를 포함하는 외가닥 DNA 라이브러리이다. 또한, 외가닥 핵산의 전부 또는 일부의 염기가 서로 접합함으로써 형성되는 이중가닥 핵산이 그 일부에 포함되어 있어도 된다.
본 발명에 있어서 캐필러리 전기 영동이란, 캐필러리 내에 수용액을 채우고, 목적물을 포함하는 수용액을 도입해서 전장 안에 둠으로써, 전하의 이동과 친화성이나 전기 침투류 등의 작용이 활동하여, 분리 정제가 가능해진다고 하는 것이다. 캐필러리의 내경은, 임의의 것을 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서는, 캐필러리 전기 영동에 의해, 표적 분자와 결합한 핵산 앱타머 후보를 분취한다. 캐필러리 전기 영동 시스템에, 미리 전처리를 행한 캐필러리관을 설치한다. 그 후, ssDNA 라이브러리와 표적 물질을 고정화한 입자를 혼합한 샘플을 인젝트한 후, 런닝 버퍼 중에서 전기 영동을 행한다. 영동 중에는, 예를 들어 다이오드 어레이 검출기에 의해 195, 260, 280, 550㎚ 등의 파장에 있어서의 흡광도를 경시적으로 측정하고, 얻어진 피크를 지표로 해서 자성 입자 부분의 회수를 행할 수 있다((a) 공정 및 (b) 공정).
본 발명에 있어서는, 분취된 핵산 앱타머 후보를 PCR에 의해 증폭한다. PCR이란, 폴리메라아제 연쇄 반응으로, DNA 합성 효소에 의한 DNA 합성 반응의 시험관 내에서의 반복에 의해, 그 특정한 DNA 영역을 수10만배로 증폭할 수 있다. 이때 사용하는 프라이머는, 사용하는 DNA 라이브러리의 고정 서열(프라이머 서열과 상보적인 서열)에 따라 다르지만, 예를 들어 AGCAGCACAGAGGTCAGATG(순방향 프라이머), TTCACGGTAGCACGCATAGG(역방향 프라이머) 등을 들 수 있다. DNA 폴리메라아제, Tris-HCl, KCl, MgCl2 및 dNTPs를 프라이머와 분취된 핵산 앱타머 후보를 혼합하고, 서멀 사이클러로 가열 온도, 시간을 조정하고, 그 사이클을 반복함으로써, DNA 영역을 증폭할 수 있다((c) 공정).
본 발명에 있어서는, 경우에 따라, 증폭된 PCR 산물을 외가닥화한다. 예를 들어, 비오틴화 프라이머를 사용해서 증폭한 PCR 산물에 스트렙트아비딘 고정화 자성 입자(예를 들어 magnosphere MS300/Streptavidin(Invitrogen) 등)를 혼합하여, 상청의 제거, 세정의 공정을 적절히 반복한다. 그 후, 적절한 농도의 NaOH를 첨가해서 목적으로 하는 ssDNA를 자성 입자 표면으로부터 용출시켜서, 회수한다((d) 공정).
본 발명에 있어서는, 상기 공정 (a) 내지 (d)를 임의로 반복할 수 있다. 바람직하게는, 상기 공정 (a) 내지 (d)를 최대 3회 반복한다.
본 발명은, 표적 분자를 입자 표면에 고정화하기만 하는 매우 심플한 방법이지만, 이론상으로는 지금까지 CE-SELEX가 지니고 있던 문제를 거의 해결할 수 있을 가능성이 있다. 먼저, 본 발명의 자성 입자를 사용하는 CE-SELEX(이하, MB-CE-SELEX라고 한다)에 있어서의 분취 영역의 설정은, 종래의 CE-SELEX와 비교해서 훨씬 용이하다. 입자를 광의 산란에 의해 흡광 검출기 고감도로 검출할 수 있기 때문에, 고가의 형광 검출기가 불필요하다. 어떤 표적 분자에서도 자성 입자 유래의 피크를 분취 영역으로 할 수 있다(도 2). 표적·앱타머 후보 복합체 피크를 핀포인트로 분취 영역으로 함으로써, 도중에 해리한 결합능이 낮은 ssDNA 라이브러리의 배제가 가능하여, 앱타머 획득률의 향상을 기대할 수 있다.
또한, 본 발명에서는, 종래의 CE-SELEX에 비하여, 우수한 획득률을 갖는다. 따라서, 보다 적은 라운드수로, 원하는 앱타머를 선택할 수 있다.
이하에, 종래의 SELEX와 본 발명의 상위점을 나타낸다.
Figure pct00001
도 1은 종래의 CE-SELEX와 본 발명의 상위점을 나타낸다.
도 2는 SPR 센서에 의한 트롬빈 앱타머 후보의 결합능 평가(종래의 CE-SELEX)를 나타낸다. 각 figure A 내지 J(계 10개)는, 표 3 상단에 나타낸 10개의 앱타머 후보 서열의 검토 결과를 나타낸다.
도 3은 SPR 센서에 의한 트롬빈 앱타머 후보의 결합능 평가(본 발명의 MB-CE-SELEX)를 나타낸다. 각 figure A 내지 J(계 10개)는, 표 3 중단에 나타낸 10개의 앱타머 후보 서열의 검토 결과를 나타낸다.
도 4는 SPR 센서에 의한 트롬빈 앱타머 후보의 결합능 평가(본 발명의 MB-CE-SELEX 개량판)를 나타낸다. 각 figure A 내지 J(계 10개)는, 표 3 하단에 나타낸 10개의 앱타머 후보 서열의 검토 결과를 나타낸다.
도 5는 T_beads_re_apt.1, T_beads_re_apt.5의 독특한 해리상을 나타낸다. (A) 200nM T_beads_re_apt.1의 리스펀스 커브와 확대도이다. (B) 200nM T_beads_re_apt.5의 리스펀스 커브와 확대도이다.
도 6은 각 선발법에 있어서의 트롬빈 앱타머의 획득률(상위 10 서열만으로부터 산출했다)을 나타낸다. 종래의 CE-SELEX: 23%, MB-CE-SELEX: 83%, MB-CE-SELEX(개량판): 91%
이하에 실시예에 의해 본 발명을 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 의해 하등 한정되는 것은 아니다.
실시예 1
자성 입자에 대한 표적 분자의 고정화
표면에 카르복시기를 갖는 자성 입자 Dynabeads MyOne(상표) Carboxylic Acid(카르복실산)(Invitrogen)를 담체로 하여, 제품에 부속하는 프로토콜에 따라서 분자의 고정화를 행하였다. 20mM Tris-HCl, 10mM NaCl, 1mM MgCl2 버퍼(pH7.4)를 100μl 첨가하고, 10㎎/ml의 자성 입자 스톡 용액으로 해서 4℃에서 보존했다.
CE-SELEX 조건 최적화
캐필러리 전기 영동 조건
캐필러리 전기 영동 시스템(Agilent 7100: 오츠카 덴시)을 사용했다. 캐필러리는 길이 80.6㎝, 유효 길이(검출창까지의 길이) 72.2㎝의 75㎛ 내경 버블 셀 퓨즈드 실리카 캐필러리(Agilent technologies)를 사용했다. 인렛측(주입구, 양 전극측)과 아울렛측(용출구, 음극측)의 전극 사이에서, 똑같은 길이의 캐필러리가 나오도록 캐필러리를 카세트에 세트했다. 전처리로서 약 1bar의 압력 적용에 의해 0.1M NaOH 수용액을 10 내지 20분간 흘렸다. 또한, 런닝 버퍼(100mM 붕산 버퍼, pH8.5)를 10 내지 20분간 흘림으로써 캐필러리 내를 평형화시켰다.
표적으로 결합하는 ssDNA의 분리와 분취
샘플의 조정
표적 단백질의 트롬빈이나 ssDNA 라이브러리는, 샘플 버퍼(20mM Tris-HCl, 10mM NaCl, 1mM MgCl2 버퍼, pH7.4)로 용해 또는 희석했다. ssDNA 라이브러리에는, 30mer의 랜덤 서열의 양단(5'측과 3'측)을 20mer의 고정 서열 사이에 끼운 계 70mer의 합성 올리고 DNA를 사용했다. 샘플 버퍼와 100μM ssDNA 라이브러리를 PCR 튜브에 넣고, 피펫팅에 의해 혼합했다. 서멀 사이클러(다카라 바이오)에 의해 ssDNA 라이브러리 용액을 95℃에서 2분간 가열한 후, 0.1℃ 매초의 속도로 25℃까지 냉각함으로써, 어닐링을 행하였다.
샘플의 주입
어닐링 후, 2μM의 트롬빈, 혹은 5 내지 10㎎/ml 트롬빈 고정화 자성 입자 용액을 1μl 첨가하고, 30분 이상 실온(25℃)에서 인큐베이트했다. 타깃·ssDNA 라이브러리 혼합 용액은, 100mbar의 압력을 6 내지 9초간 거는 것으로 캐필러리의 인렛측으로부터 주입했다. Hagen-poiseuille(하겐-푸아죄유)의 법칙에 기초하여 이하의 식으로부터 대략의 주입량을 예측할 수 있다. V는 주입량(nl), ΔP는 압력 변화(bar), d는 캐필러리 내경(m), π은 원주율, T는 주입 시간(s), η는 용액 점도, L은 캐필러리 전체 길이(m)를 나타낸다.
V=ΔPd4πT/128ηL×1012[nL]
샘플의 전기 영동
50μl의 런닝 버퍼가 들어간 바이알을 인렛측(주입구, +전극측)과 아울렛측(용출구, -전극측) 각각에 세트하고, 30㎸의 정전압을 인가해서 전기 영동을 행하였다. 전기 영동 중에는, 다이오드 어레이 검출기에 의해 195, 260, 280, 550㎚에 있어서의 흡광도를 경시적으로 측정했다. 영동 속도는 항상 일정하다고 가정하고, 이하의 식으로부터 용출 시간을 산출함으로써, 분취 시간을 설정했다. T 용출은 용출 시간, T 검출은 검출 시간, L 전체 길이는 캐필러리 전체 길이, L 유효 길이는 캐필러리 유효 길이를 나타낸다.
T용출=T검출×L전체 길이/L유효 길이
샘플의 회수
트롬빈 고정화 자성 입자를 사용한 분취 샘플은, 서멀 사이클러를 사용해서 95℃에서 10분간 가열함으로써 자성 입자 표면의 단백질을 변성시켜서, ssDNA를 유리시켰다. 마그네트 스탠드에 1분간 정치한 후, 상청을 회수했다.
PCR에 의한 분취 샘플의 증폭
캐필러리 전기 영동에 의해 분취한 ssDNA 샘플을 PCR에 의해 증폭했다. 1.5ml 튜브에 2×premix를 400μl, DEPC 처리수를 192μl, 4μM의 포워드 프라이머를 80μl, 4μM의 5'-비오틴화 리버스 프라이머를 80μl를 넣고 혼합하여, 8개의 200μl의 PCR 튜브에 94μl씩 분주했다. 6개의 튜브에 분취 샘플을 6μl씩 첨가하고, 나머지 2개의 튜브에는 포지티브·네거티브 컨트롤로서 1 내지 10pM ssDNA 라이브러리와 DEPC 처리수를 각각 6μl씩 첨가했다. 서멀 사이클러(다카라 바이오)를 사용해서 94℃에서 1분간 가열한 후, 「94℃에서 15초, 55℃에서 5초, 72℃에서 20초」라고 하는 조작을 23 내지 28회 반복했다. PCR 종료 후에는 폴리아크릴아미드겔 전기 영동(PAGE)에 의해 목적의 사이즈의 DNA가 증폭되어 있는지 여부를 조사했다. 전기 영동 후의 겔을 염색액에 침지하고, 10분간 진탕했다. UV 조사기에 의해, 염색 후의 DNA의 밴드를 검출했다.
PCR 산물의 정제와 외가닥화
PCR 산물을 외가닥화하고, 다음 라운드에서 사용하는 ssDNA 라이브러리로 했다. 스트렙트아비딘 고정화 자성 입자인 magnosphere MS300/Streptavidin (Invitrogen)을 사용하여, 첨부의 설명서와 같이 고정화, 세정 조작을 행하였다. 제조해 둔 0.1M NaOH를 50μl 첨가하고, 10 내지 15회 천천히 피펫팅해서 현탁한 후, 4분간 상온에서 정치함으로써 앱타머 후보를 유리·추출했다.
차세대 시퀀서에 의한 염기 서열 해석
샘플의 제조와 에멀션 PCR
에멀션 PCR용 샘플은 부속의 프로토콜에 따라서 제조하여, PAGE에 의해, 목적의 사이즈의 DNA가 증폭되어 있는지를 확인했다. 그 후, Fast Gene Gel/PCR Extraction Kit(닛폰 제네틱스)에 의해, PCR 산물의 칼럼 정제를 행하였다. 최종적으로, Ion OneTouchTM 2 system(Life Technologies)과 Ion PGM Template OT2 200 Kit(Life Technologies)을 사용해서 에멀션 PCR과 비즈 정제를 행하였다. 참조한 부속의 프로토콜은 Publication Number MAN0007220, Rev.5.0이다.
차세대 시퀀서에 의한 대규모 서열 해석
에멀션 PCR 후의 정제 비즈를 사용하여, Ion PGM system(Life technologies)과 반도체 칩 Ion 314 chip과 Ion 318 chip(Life technologies), Ion PGM Sequencing 200 Kit v2(Life technologies)에 의한 대규모 서열 해석을 행하였다. 조작은 부속의 프로토콜(Publication Number MAN0007273, Rev.3.0)에 따랐다. 시퀀스 데이터는 FASTAQ 파일로서 출력하고, CLC Genomics Workbench(CLC bio)에서 DNA 라이브러리의 primer 영역의 서열(고정 서열)을 제외하고, 28 내지 32 mer의 랜덤 서열만을 추출했다. 또한 중복 서열의 카운트수도 조사하고, 서열 정보를 excel 파일로서 출력했다. Excel(microsoft) 상에서 서열을 FASTA 형식으로 변환하고, 텍스트 파일로서 출력했다. Mafft에 의해 얼라인먼트를 행하여, 유사한 서열(패밀리 서열)을 추출했다. 또한 MEME suite 4.11.0을 사용해서 패밀리 서열을 조사했다.
선발된 앱타머의 결합능 평가
표적 단백질의 센서 칩에 대한 고정화
Biacore X100(GE healthcare)에 의해, 첨부의 매뉴얼에 따라, 표적 단백질의 센서 표면에 대한 고정화, 및 앱타머와의 상호 작용 해석을 행하였다.
런닝 버퍼에는 HBS-EP(HEPES, 150mM NaCl, pH 7.0)를 사용했다. 카르복시메틸덱스트란 수식된 CM5 sensor chip (GE healthcare)을 유로에 세트하고, 10μl/min의 유속으로 EDC/NHS 용액을 7분간 흘리고, 센서 칩 상의 카르복시기를 활성화했다. 10mM 아세트산/아세트산 나트륨 버퍼, pH6.0으로 희석한 10 내지 20μg/ml 트롬빈 용액을 7분간 흘렸다. 마지막으로 에탄올아민을 7분간 흘려서 블로킹을 해서 커플링 반응을 완료시켰다.
상호 작용 해석에 의한 해리 상수의 산출
앱타머 후보 샘플을, 런닝 버퍼에 의해 2 내지 4μM에 희석했다. 서멀 사이클러를 사용해서 95℃에서 2분간 가열한 후, 0.1℃ 매초의 속도로 25℃까지 냉각함으로써, 어닐링을 행하였다. 어닐링 후, 런닝 버퍼로 추가로 50 내지 200nM로 희석했다. 트롬빈 고정화 칩을 유로에 세트하고, 30μl/min의 유속으로 희석한 앱타머 후보를 흘렸을 때, 특이적인 리스펀스를 나타내는지 여부를 조사했다. 재생 용액으로서, 1M NaCl 용액을 사용했다. 특이적인 리스펀스가 얻어진 앱타머 후보에 대해서는, 6.25 내지 400nM의 범위에서 복수의 희석 샘플을 조정하고, 멀티 카이네틱스 해석을 행하였다. 단, 1M NaCl 용액으로 재생할 수 없었던 앱타머 후보에 대해서는, 싱글 카이네틱스 해석(도중에 재생의 공정을 두지 않는다)을 행하였다. Evaluation software를 사용하여, 해리 상수를 산출했다.
차세대 시퀀서에 의한 트롬빈 앱타머 후보 서열의 동정
차세대 시퀀서를 사용해서 트롬빈 앱타머 후보 서열을 결정한 수순·결과를 이하에 나타낸다.
대규모 서열 해석
종래의 CE-SELEX, MB-CE-SELEX(1회째), MB-CE-SELEX(개량판)의 각 라운드(1 내지 3라운드)에서 얻어진 앱타머 후보 서열을, 차세대 시퀀서(Ion PGM system)에 의해 해석했다. 라운드마다의 총 리드 서열수는, 90000 내지 800000이었다(표 2). 각 선발법으로 얻어진 3라운드째의 서열 중, 주로 카운트수가 많았던 10개의 서열에 대해서 해석을 진행시키기로 하였다. 서열명을, T_apt.1 내지 10(종래의 CE-SELEX), T_beads_apt.1 내지 10(MB-CE-SELEX), T_beads_re_apt.1 내지 10(MB-CE-SELEX 개량판)로 하였다.
표 2 각 라운드에서 선발된 앱타머 후보 서열의 총 리드수
Figure pct00002
상위 염기 서열의 농축 효율의 산출
먼저, 상위 서열의 존재율 「(각 서열의 카운트수/총 리드 서열수)×100(%)」를 조사한바, 각 선발법에서 가장 농축되어 있던 서열의 존재율은, 종래의 CE-SELEX에서는 0.16%, MB-CE-SELEX에서는 12%, MB-CE-SELEX(개량판)에서는 5.1%였다(표 3). Bowser 등에 의해 보고된 CE-SELEX를 사용한 VEGF 앱타머의 취득에 관한 논문에 따르면, CE-SELEX에서 획득되는 앱타머는 다양성이 풍부하여, 특정한 서열의 농축은 되기 어렵다고 하는 가정이 이루어지고 있고, 실제로 4라운드째 종료 시점에서 가장 농축이 된 서열의 존재율이 0.8% 정도였다. 본 연구의 결과와 비교하면, 종래의 CE-SELEX에서 얻어진 상위 서열의 존재율에 관해서는, 선행 연구와 마찬가지 경향이 보여졌다. 한편, MB-CE-SELEX에 의한 선발에서 얻어진 상위 서열의 존재율에 관해서는, 종래의 CE-SELEX에서 얻어진 것과 비교해서 50 내지 100배 정도 높은 존재율을 나타내고 있고, 선행 연구와 비교해서 상당히 높은 농축 효과를 나타내고 있는 것이 명확해졌다. MB-CE-SELEX에서는 특정한 결합능을 갖는 ssDNA가 농축되기 쉬운 조건이라고 생각된다.
표 3 각 선발법의 3라운드째에 있어서의 상위 서열의 라운드마다의 카운트수·존재율
Figure pct00003
앱타머 후보 서열의 결합능
표면 플라즈몬 공명(SPR) 센서를 사용해서 산출된 각 후보 서열의 트롬빈에 대한 결합능을 표 4에 나타낸다.
종래의 CE-SELEX와 MB-CE-SELEX의 앱타머 획득률의 비교
상위 서열 중, 트롬빈에 대하여 높은 결합능을 갖는 서열의 비율을 비교함으로써, 신규 MB-CE-SELEX의 성능을 평가했다. 먼저, 종래의 CE-SELEX에서 얻어진 상위 서열(계 10 서열)의 결합능의 유무를 조사했다(도 2). 예비 실험에서, ssDNA 라이브러리에서는 특이적인 리스펀스의 상승이 관측되지 않은 점에서, 트롬빈은 ssDNA와 비특이적으로 상호 작용하지 않는다고 하는 것이 명백해졌다(도 2의 A). T_apt.1 내지 10 중, T_apt.3, T_apt.4, T_apt.6의 3개의 앱타머 후보에 있어서 특이적인 리스펀스가 얻어졌다(도 2의 B 내지 K). T_apt.1, T_apt.10에 관해서는, 약간 리스펀스의 상승이 관측되기는 했지만, 피크의 형상이 상자형, 즉 해리가 매우 빠른 점에서, 결합능은 낮다고 생각되었다(도 2의 B, K). 컨트롤로서, TBA 15와 완전히 동일한 서열을 갖는 TBA_like_apt.1에 대해서도 결합 실험을 행한바, 특이적인 리스펀스가 얻어졌다(도 2의 L).
마찬가지로 하여, MB-CE-SELEX에서 얻어진 상위 서열(계 10 서열)의 결합능의 유무를 조사한 결과, T_beads_apt.1, T_beads_apt.3, T_beads_apt.7, T_beads_apt.8의 4개의 앱타머 후보에 있어서 특이적인 리스펀스가 얻어졌다(도 3).
마지막으로, MB-CE-SELEX(개량판)에서 얻어진 상위 서열(계 10 서열)의 결합능의 유무를 조사한 결과, T_beads_re_apt.6, T_beads_apt.9 이외의 8개의 앱타머 후보에 있어서, 특이적인 리스펀스가 얻어졌다(도 4). 특히, T_beads_re_apt.1과 T_beads_re_apt.5에 관해서는, 다른 앱타머에서는 보이지 않는 독특한 리스펀스 커브가 얻어졌다. 이들 2개의 앱타머는, 비교적 빠른 해리 곡선을 그린 후에 일정한 높이의 리스펀스를 유지하고 있었다(도 5). 즉, 일정수의 앱타머가 견고하게 트롬빈과 결합해서 이격되지 않는 상태에 있다고 생각되었다.
각 선발법의 상위 서열 중, 높은 결합능을 나타냈기는 하지만 비율은, 종래의 CE-SELEX가 3/10, MB-CE-SELEX가 4/10, MB-CE-SELEX(개량판)가 8/10이었다. 10개의 각 상위 서열의 카운트수(존재율)로부터 앱타머 획득 확률(높은 결합능을 갖는 서열의 카운트수의 합/결합능을 조사한 서열의 카운트수의 합)을 산출하면, 종래의 CE-SELEX가 23%, MB-CE-SELEX가 83%, MB-CE-SELEX(개량판)가 91%였다(도 6). MB-CE-SELEX에서는, 종래의 CE-SELEX보다 고확률로 트롬빈 앱타머를 취득 가능한 것이 명백해졌다.
트롬빈 앱타머의 해리 상수의 산출
특이적인 리스펀스 커브가 얻어진 서열에 관해서, 멀티 카이네틱스 해석 혹은 싱글 카이네틱스 해석에 의해 결합 속도 상수(ka), 해리 속도 상수(kd), 해리 상수KD를 산출했다(도 7, 표 4). T_beads_re_apt.10에 관해서는, 해리가 매우 늦은 데다가 고농도의 NaCl으로도 트롬빈으로부터 해리하지 않았기 때문에, 싱글 카이네틱스 해석에 의해 해리 상수를 산출했다(도 7J). T_beads_re_apt.1과 T_beads_re_apt.5는 높은 결합능을 갖고 있을 가능성이 높지만, 해리 곡선의 기울기가 없기 때문에 해리 속도(kd)의 산출이 곤란하여(도 A와 E), SPR 센서에서 해리 상수(KD)의 산출할 수는 없었다.
각 선발법의 3라운드째에 있어서의 상위 서열과 결합 속도 상수, 해리 속도 상수, 해리 상수
Figure pct00004
MB-CE-SELEX(개량판)에서는, 앱타머 획득 확률(높은 결합능을 갖는 서열의 카운트수의 합/결합능을 조사한 서열의 카운트수의 합)이 높아지면 주로, 해리 속도 상수가 작은(해리하기 어려운) 핵산 앱타머가 얻어졌다. 예를 들어, 해리 곡선의 기울기가 얻어지지 않을 만큼의 결합능을 갖고 있었던 T_beads_re_apt.1과 T_beads_re_apt.5나, 유일하게 싱글 카이네틱스 해석에 의해 해리 상수의 산출이 가능한 T_beads_re_apt.10이 얻어졌다. 분취 윈도우를 의도적으로 확장한 1회째의 MB-CE-SELEX와, 분취 윈도우를 좁힌 MB-CE-SELEX(개량판)에 있어서의 분취 영역의 단 18초 정도의 차가, 앱타머 획득률이나 해리 속도 상수에 기여한다고 하는 것이 명백해졌다. 분취 윈도우의 최적화나 자성 입자 유래의 피크가 보다 샤프해지는 고안을 함으로써, 본 계가 더욱더 개선될 가능성이 있다.
본 발명은 핵산 앱타머를 스크리닝하기 위해서 유용하다.
SEQUENCE LISTING <110> The University of Tokyo <120> Method for screening a nucleic acid aptamar <130> KP-15834 <160> 33 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA Library <400> 1 agcagcacag aggtcagatg gtttgggtgg ttaggtgttg acctgggatg cctatgcgtg 60 ctaccgtgaa 70 <210> 2 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA Library <400> 2 agcagcacag aggtcagatg gagtcgggtg gctattgggt atggaccgtg cctatgcgtg 60 ctaccgtgaa 70 <210> 3 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA Library <400> 3 agcagcacag aggtcagatg gatggtgtag gttgggagag gctcagtgcc cctatgcgtg 60 ctaccgtgaa 70 <210> 4 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA Library <400> 4 agcagcacag aggtcagatg ttggtggggt ggctttgggt atttacttgg cctatgcgtg 60 ctaccgtgaa 70 <210> 5 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA Library <400> 5 agcagcacag aggtcagatg gtggatttgg gtggattggt atgaactgac cctatgcgtg 60 ctaccgtgaa 70 <210> 6 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Claims (7)

  1. 하기 공정:
    (a) 고상 담체 상에 고정된 표적 분자를, 핵산 앱타머 후보와 접촉시키는 것,
    (b) 캐필러리 전기 영동에 의해, 표적 분자와 결합한 핵산 앱타머 후보를 분취하는 것,
    (c) PCR에 의해, 핵산 앱타머 후보를 증폭하는 것
    을 포함하는, 핵산 앱타머를 스크리닝하기 위한 방법.
  2. 제1항에 있어서, 또한 (d) 증폭된 PCR 산물을 외가닥화하는 것을 포함하는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 고상 담체가 입자인 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 입자의 입경의 최솟값이 0.05㎛인 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 분자가 단백질 또는 저분자량 화합물인 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 앱타머 후보가 외가닥 DNA 라이브러리인 방법.
  7. 제2항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 공정 (a) 내지 (d)를 최대 3회 반복하는 방법.
KR1020187023677A 2016-01-22 2017-01-20 핵산 앱타머를 스크리닝하기 위한 방법 KR20180104031A (ko)

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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021010534A1 (ko) * 2019-07-18 2021-01-21 국립암센터 신규한 dna 앱타머 및 이의 용도

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2021052590A (ja) * 2018-01-25 2021-04-08 日産化学株式会社 核酸アプタマー
CN110577979B (zh) * 2018-06-08 2022-09-27 首都师范大学 一种基于交联反应的核酸适配体的快速筛选方法及筛选获得的结构开关型核酸适配体
CN109371031A (zh) * 2018-11-23 2019-02-22 北京化工大学 一种特异性结合牛血清白蛋白核酸适配体的筛选方法
CN110305868B (zh) * 2019-07-03 2022-08-02 合肥工业大学 凝血酶环状核酸适配体及其应用
CN110982821B (zh) * 2019-12-27 2023-07-07 广东石油化工学院 一种具有黄嘌呤氧化酶抑制活性的核酸适配体及其应用
WO2023148646A1 (en) * 2022-02-03 2023-08-10 Tsinghua University Mirror-image selection of l-nucleic acid aptamers

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2012295913A1 (en) * 2011-08-12 2014-03-13 Tagcyx Biotechnologies Production method for nucleic acid aptamer
CN103937781A (zh) * 2013-03-15 2014-07-23 河南省农业科学院 一种可实时监测的固相指数富集的配体系统进化技术
US20150119285A1 (en) * 2013-10-28 2015-04-30 Chin-Yih Hong Magnetic-assisted rapid aptamer selection method for generating high affinity dna aptamer
CN105018461B (zh) * 2014-04-29 2018-05-01 中国科学技术大学 一种核酸适配体的快速筛选方法
CN104297325B (zh) * 2014-09-29 2017-06-27 北京理工大学 毛细管电泳在线反应分离蛋白质‑寡核酸复合物的方法
JP6781883B2 (ja) * 2015-03-16 2020-11-11 株式会社シノテスト アプタマーの選抜方法

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021010534A1 (ko) * 2019-07-18 2021-01-21 국립암센터 신규한 dna 앱타머 및 이의 용도
CN114207132A (zh) * 2019-07-18 2022-03-18 国立癌中心 新型dna适体及其用途

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