JP2021092576A - 2個のリガンドと1個のレセプタとからなる高親和性錯体の特定方法と該方法を実行する装置及び該方法に用いられる自己集合型ケミカルライブラリ - Google Patents
2個のリガンドと1個のレセプタとからなる高親和性錯体の特定方法と該方法を実行する装置及び該方法に用いられる自己集合型ケミカルライブラリ Download PDFInfo
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Abstract
Description
a)ケミカルライブラリのリガンドと溶液中の少なくとも1個のレセプタとからなる多数の異なる錯体の相互作用。該ライブラリのリガンドは、当該リガンドと化学共有結合する長さ10ベース以上の一本鎖DNA又はRNAを有する。また、リガンドの第1部位における一本鎖DNA又はRNAのうちの10ベース以上が、リガンドの第2部位における一本鎖DNA又はRNAのベースを補完する。さらに、該リガンドは、前記DNA又はRNAのハイブリッド化を介してリガンド錯体を形成するために複合化される。
b)溶液を所定時間培養し、リガンド錯体とレセプタとからなる錯体を生成する。
c)遊離リガンドを形成するために該リガンド錯体を分離する。
d)更なるリガンド錯体を形成するために該リガンド錯体を再ハイブリッド化する。
e)溶液を所定時間培養し、更なるリガンド錯体とレセプタとからなる更なる錯体を生成する。
f)リガンド錯体とレセプタとからなる、結果物たる錯体の特定をする。
i)ケミカルライブラリのリガンドと、溶液中の少なくとも1個のレセプタとからなる多数の異なる錯体の相互作用。該ライブラリのリガンドは、当該リガンドと化学共有結合する長さ2ベース以上の一本鎖DNA又はRNAを有する。また、リガンドの第1部位における一本鎖DNA又はRNAのうちの2から10ベースのみが、リガンドの第2部位における一本鎖DNA又はRNAのベースを補完する。さらに、該リガンドは、前記DNA又はRNAのハイブリッド化を介してリガンド錯体を形成するために複合化される。
ii)溶液を所定時間培養し、リガンド錯体とレセプタとからなる錯体を生成する。
iii)リガンド錯体とレセプタとからなる、結果物たる錯体の特定をする。
i)アデニン、チミン、グアニン、及び/又はシトシンを含む。
また、本方法に用いられる一本鎖RNAは、
ii)アデニン、ウラシル、グアニン、シトシン、及び/又はイノシンを含む。
i)その5´端末にリガンドが結合され、当該5´端末において、リガンドの第2部位における一本鎖DNA又はRNAのベースを補完すると共に、リガンドの第2部位における一本鎖DNA又はRNAのベースを補完する更なる一本鎖DNA又はRNAの2〜10ベースが、当該更なる一本鎖DNA又はRNAの3´端末に配置される、又は、
ii)その3´端末にリガンドが結合されているとき、当該3´端末において、リガンドの第2部位における一本鎖DNA又はRNAのベースを補完すると共に、リガンドの第2部位における一本鎖DNA又はRNAのベースを補完する更なる一本鎖DNA又はRNAのうちの2から10ベースが、当該更なる一本鎖DNA又はRNAの5´端末に配置される。
b)容器の入口と出口に接続された流体パイプであって、1か所にバルブ付き排出口を有する流体パイプと、
c)流体パイプの第1領域に設けられた加熱装置と、
d)流体パイプの第1領域とは異なる第2領域に設けられた冷却領域と、
を備える。
i)DNAは、アデニン、チミン、グアニン、及び/又はシトシンを備え、
ii)RNAは、アデニン、ウラシル、グアニン、シトシン、及び/又はイノシンを備える。
i)リガンドの5´端末にリガンドを備え、当該5´端末にリガンドの第2部位における一本鎖DNA又はRNAのベースを補完するベースを有し、リガンドの第2部位における第2の一本鎖DNA又はRNAのベースを補完する更なる一本鎖DNA又はRNAの2〜10ベースが、当該更なる一本鎖DNA又はRNAの3´端末に配置される、又は、
ii)リガンドの3´端末にリガンドを備え、当該3´端末にリガンドの第2部位における一本鎖DNA又はRNAのベースを補完するベースを有し、リガンドの第2部位における一本鎖DNA又はRNAのベースを補完する更なる一本鎖DNA(9)又はRNAの2〜10ベースが、当該更なる一本鎖DNA又はRNAの5´端末に配置される。
Claims (29)
- 2個のリガンド(2,3,4,5,6,7)と1個のレセプタ(1)とからなる高親和性錯体の特定方法であって、
a)ケミカルライブラリのリガンド(2,3,4,5,6,7)と、溶液中の少なくとも1個のレセプタ(1)とからなる多数の異なる錯体を相互作用させるステップであって、
前記ライブラリの該リガンド(2,3,4,5,6,7)が前記リガンドと化学共有結合する長さ10ベース以上の一本鎖DNA(8,9)又はRNAを有し、前記リガンド(2,6,7)の第1部位における前記一本鎖DNA(8)又はRNAのうちの10ベース以上が前記リガンド(3,4,5)の第2部位における前記一本鎖DNA(9)又はRNAのベースを補完すると共に、前記リガンドを、前記DNA(8,9)又はRNAのハイブリッド化を介してリガンド錯体を形成するために複合化し、
b)前記溶液を所定時間培養し、リガンド錯体と前記レセプタ(1)とからなる錯体を生成するステップと、
c)遊離リガンドを形成するために前記リガンド錯体を分離するステップと、
d)更なるリガンド錯体を形成するために前記遊離リガンドを再ハイブリッド化するステップと、
e)前記溶液を所定時間培養し、前記更なるリガンド錯体と前記レセプタ(1)とからなる更なる錯体を生成するステップと、
f)リガンド錯体とレセプタ(1)とからなる、結果物たる前記錯体を特定するステップと、を備え、
前記培養が、前記リガンド(2,6,7)の第1部位と前記リガンド(3,4,5)の第2の部位が前記溶液内でハイブリッド化されてリガンド錯体を形成する温度で実行されることを特徴とする、
又は、
i)ケミカルライブラリのリガンド(2,3,4,5,6,7)と、溶液中の少なくとも1個のレセプタ(1)とからなる多数の異なる錯体の相互作用させるステップであって、前記ライブラリの該リガンド(2,3,4,5,6,7)が前記リガンドと化学共有結合する長さ2ベース以上の一本鎖DNA(8,9)又はRNAを有し、前記リガンド(2,6,7)の第1部位における前記一本鎖DNA(8)又はRNAのうちの2から10ベースのみが前記リガンド(3,4,5)の第2部位における前記一本鎖DNA(9)又はRNAのベースを補完すると共に、前記リガンドが、前記DNA(8,9)又はRNAのハイブリッド化を介してリガンド錯体を形成するために複合化され、
ii)前記溶液を所定時間培養し、リガンド錯体と前記レセプタ(1)とからなる錯体を生成するステップと、
iii)リガンド錯体とレセプタ(1)とからなる、結果物たる前記錯体を特定するステップと、を備え、
前記溶液は、前記リガンド(2,6,7)の第1部位と前記リガンド(3,4,5)の第2部位との間において、リガンド錯体を形成するハイブリッド化と遊離リガンド(2,3,4,5,6,7)を形成する分離化との平衡を達成できる温度で培養されることを特徴とする。 - 前記リガンド(2,6,7)の第1部位における前記一本鎖DNA(8)又はRNAのうちの10ベース以上が前記リガンド(3,4,5)の第2部位における一本鎖DNA(9)又はRNAを補完する場合、前記溶液の温度を35℃から95℃、好ましくは50℃から95℃、より好ましくは70℃から95℃、具体的には80℃から95℃に上昇させることによって前記リガンド錯体を分離させることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記リガンド(2,6,7)の第1部位における前記一本鎖DNA(8)又はRNAのうちの10ベース以上が前記リガンド(3,4,5)の第2部位における一本鎖DNA(9)又はRNAを補完する場合、前記リガンド錯体の分離化を、前記レセプタから所定距離だけ、好ましくは前記分離化を誘起する状況によって前記レセプタの機能を損なうことのないように、離して配置した前記溶液の一部で実行することを特徴とする請求項1又は2に記載の方法。
- 前記リガンド(2,6,7)の第1部位における前記一本鎖DNA(8)又はRNAのうちの10ベース以上が前記リガンド(3,4,5)の第2部位における一本鎖DNA(9)又はRNAを補完する場合、前記溶液の温度を1℃から30℃、好ましくは5℃から28℃、より好ましくは10℃から25℃、具体的には15℃から20℃に低下させることによって前記遊離リガンドを再ハイブリッド化させることを特徴とする請求項1から3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記リガンド(2,6,7)の第1部位における前記一本鎖DNA(8)又はRNAのうちの10ベース以上が前記リガンド(3,4,5)の第2部位における一本鎖DNA(9)又はRNAを補完する場合、前記c)からe)のステップを、少なくとも1回又は2回、好ましくは少なくとも3回又は4回、より好ましくは少なくとも5回又は6回、具体的には少なくとも7回又は8回、繰り返すことを特徴とする請求項1から4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記リガンド(2,6,7)の第1部位における前記一本鎖DNA(8)又はRNAのうちの10ベース以上が前記リガンド(3,4,5)の第2部位における一本鎖DNA(9)又はRNAを補完する場合、前記リガンド(2,6,7)の第1部位における前記一本鎖DNA(8)又はRNAのうちの少なくとも20ベース、好ましくは40ベースより好ましくは少なくとも100ベース、具体的には少なくとも200ベースが、前記リガンド(3,4,5)の第2部位における一本鎖DNA(9)又はRNAを補完することを特徴とする請求項1から5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記リガンド(2,6,7)の第1部位における前記一本鎖DNA(8)又はRNAのうちの2から10ベースのみが前記リガンド(3,4,5)の第2部位における一本鎖DNA(9)又はRNAを補完する場合、前記リガンド(2,6,7)の第1部位における一本鎖DNA(8)又はRNAのうちの3から9ベースのみ、好ましくは5から9ベースのみ、より好ましくは6から8ベースのみが前記リガンド(3,4,5)の第2部位における一本鎖DNA(9)又はRNAを補完することを特徴とする請求項1から6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記リガンド(2,6,7)の前記第1部位における前記DNA(8)又はRNAの長さ及び/又は前記リガンド(3,4,5)の前記第2部位における前記DNA(9)又はRNAの長さが、少なくとも20ベース、好ましくは少なくとも40ベース、より好ましくは少なくとも100ベース、具体的には少なくとも200ベースであることを特徴とする請求項1から7のいずれか1項に記載の方法。
- 前記リガンド(2,6,7)の前記第1部位がL個の異なるリガンド(2,6,7)を有し、前記リガンド(3,4,5)の前記第2部位がM個の異なるリガンド(3,4,5)を有し、よってL・M個の異なるリガンド錯体が形成されることを特徴とする請求項1から8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記溶液が、少なくとも前記b)、e)、及びii)のステップにおいて、1℃から50℃、好ましくは5℃から37℃、より好ましくは10℃から25℃、具体的には15℃から20℃で培養されることを特徴とする請求項1から9のいずれか1項に記載の方法。
- 前記溶液が、少なくとも前記b)、e)、及びii)のステップにおいて、0.1から48時間、好ましくは0.2から24時間、より好ましくは0.5から12時間、具体的には1から6時間、培養されることを特徴とする請求項1から10のいずれか1項に記載の方法。
- 前記レセプタ(1)が、好ましくはガラス、セラミック、バイオポリマ、セファロース、合成ポリマ、及びハイドロゲルからなる一群から選択される基板上に固定されることを特徴とする請求項1から11のいずれか1項に記載の方法。
- 前記レセプタ(1)が、タンパク質、DNA、RNA、セル、及び/又は、分子量200kDa以下、好ましくは100kDa以下、より好ましくは10kDa以下、具体的には3kDa以下の有機分子を含む、又はこれらからなることを特徴とする請求項1から12のいずれか1項に記載の方法。
- 前記リガンド(2,3,4,5,6,7)が、タンパク質、ペプチド、リピド、炭水化物、dsDNA、ssDNA、dsRNA、及びssRNAからなる一群から選択された分子と、アプタマーと、分子量200kDa以下、好ましくは100kDa以下、より好ましくは10kDa以下、具体的には3kDa以下の有機分子と、を含む、又はこれらからなることを特徴とする請求項1から13のいずれか1項に記載の方法。
- リガンド錯体と前記レセプタ(1)とからなる前記錯体が、質量分光、HPLC、ガスクロマトグラフィ、赤外線分光、及びDNA配列、好ましくはDNA又はRNAバーコードのDNA配列、からなる一群から選択される分析手法によって特定されることを特徴とする請求項1から14のいずれか1項に記載の方法。
- 前記リガンド(2,6,7)の前記第1部位における前記一本鎖DNA(8)又はRNA及び/又は前記リガンド(3,4,5)の前記第2部位における前記一本鎖DNA(9)又はRNAが、前記化学共有結合されたリガンドをコード化する塩基配列を備え、 前記塩基配列を、好ましくは、少なくとも部分的にハイブリッド化して、更なる一本鎖DNA又はRNAの相補的塩基配列を形成することを特徴とする請求項1から15のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ライブラリのリガンド(2,3,4,5,6,7)の前記一本鎖DNA(8,9)又はRNAが、更なる一本鎖DNA又はRNAの相補的塩基配列を形成するために部分的にハイブリッド化され、
前記リガンド(2,6,7)の第1部位における前記更なる一本鎖DNA又はRNAのうちの2から10ベースが、前記リガンド(3,4,5)の第2部位における前記一本鎖DNA(9)又はRNAのベースを補完すると共に、前記相補的ベースと連結し、
前記方法において、好ましくはY型を形成し、
リガーゼを添加して、前記リガンド(2,6,7)の前記第1部位における前記更なる一本鎖DNA又はRNAと、前記リガンド(3,4,5)の前記第2部位における前記更なる一本鎖DNA又はRNAとを化学共有結合することを特徴とする請求項1から16のいずれか1項に記載の方法。 - 前記リガンド(2,6,7)の第1部位における一本鎖DNA(8)又はRNAが、
i)5´端末に前記リガンド(2,6,7)を有しているとき、該5´端末において、前記リガンド(3,4,5)の第2部位における前記一本鎖DNA(9)又はRNAのベースを補完すると共に、前記リガンド(3,4,5)の第2部位における前記一本鎖DNA(9)又はRNAのベースを補完する前記更なる一本鎖DNA(10)又はRNAのうちの2から10ベースが、前記更なる一本鎖DNA(1)又はRNAの3´端末に配置される、又は
ii)3´端末に前記リガンド(2,6,7)を有しているとき、該3´端末において、前記リガンド(3,4,5)の第2位部位における前記一本鎖DNA(9)又はRNAのベースと補完するベースを有すると共に、前記リガンド(3,4,5)の第2部位における前記一本鎖DNA(9)又はRNAのベースを補完する前記更なる一本鎖DNA(10)又はRNAのうちの2から10ベースが、前記更なる一本鎖DNA(10)又はRNAの5´端末に配置される、
ことを特徴とする請求項17に記載の方法。 - 請求項1から18のいずれか1項に記載の方法を実行する微小流体装置であって、
a)固定レセプタ(1)を容器(14)であって、ライブラリのリガンド(2,3,4,5,6,7)の注入とリガンド-レセプタ錯体の隔離とを実現するバルブへのアクセス(15)を有し、流体パイプの流入口及び流出口とを備える容器(14)と、
b)前記容器(14)の入口と出口に接続された流体パイプであって、1か所にバルブつき排出口(16)を有する流体パイプと、
c)前記流体パイプの第1領域に設けられた加熱装置(13)と、
d)前記流体パイプの第1領域とは異なる第2領域に設けられた冷却領域(17)と、
を備えることを特徴とする装置。 - 前記冷却領域(17)が冷却装置を有する、及び/又は、前記冷却領域(17)が前記バルブ付き排出口(16)の設けられた領域に配置されることを特徴とする請求項19に記載の微小流体装置。
- 前記装置が前記流体パイプを介して液体を排出可能なポンプを備える、及び/又は、前記装置の前記容器(14)が固体レセプタの前記流体パイプへの流入を防ぐフィルタを備えることを特徴とする請求項19又は19に記載の微小流体装置。
- ベース長さ2ベース以上の一本鎖DNA(8,9)又はRNAと化学共有結合したリガンド(2,3,4,5,6,7)を備えるケミカルライブラリであって、
前記リガンド(2,6,7)の第1部位における前記一本鎖DNA(8)のうちの2から10ベースのみが前記リガンド(3,4,5)の第2部位における前記一本鎖DNA(9)のベースを補完することを特徴とする。 - 前記リガンド(2,6,7)の第1部位における前記一本鎖DNA(8)又はRNAのうちの3から9ベースのみ、好ましくは5から9ベースのみ、より好ましくは6から8ベースのみが前記リガンド(3,4,5)の第2部位における前記一本鎖DNA(9)又はRNAを補完することを特徴とする請求項22に記載のライブラリ。
- 前記リガンド(2,6,7)の前記第1部位における前記DNA(8)の長さ及び/又は前記リガンド(3,4,5)の前記第2部位における前記一本鎖DNA(8)又はRNAの長さが、少なくとも20ベース、好ましくは少なくとも40ベース、より好ましくは少なくとも100ベース、具体的には少なくとも200ベースであることを特徴とする請求項22又は23に記載のライブラリ。
- 前記リガンド(2,6,7)の前記第1部位がL個の異なるリガンド(2,6,7)を有すると共に、前記リガンド(3,4,5)の前記第2部位がM個の異なるリガンド(3,4,5)を有し、よって前記ライブラリがL・M個の異なるリガンド錯体を有することを特徴とする請求項22から24のいずれか1項に記載のライブラリ。
- 前記リガンド(2,3,4,5,6,7)が、タンパク質、ペプチド、リピド、炭水化物、dsDNA、ssDNA、dsRNA、及びssRNAからなる一群から選択された分子と、アプタマーと、分子量200kDa以下、好ましくは100kDa以下、より好ましくは10kDa以下、具体的には3kDa以下の有機分子と、を含む、又はこれらからなることを特徴とする請求項22から25のいずれか1項に記載のライブラリ。
- 前記ライブラリのリガンドの前記一本鎖DNA(8,9)又はRNAが、更なる一本鎖DNA(10,11)又はRNAの相補的塩基配列を形成するためにそれぞれ部分的にハイブリッド化され、
前記リガンド(2,6,7)の第1部位における第1の更なる一本鎖DNA(10)又はRNAのうちの2から10ベースが、前記リガンド(3,4,5)の第2部位における前記第2の一本鎖DNA(9)のベースを補完することを特徴とする請求項22から26のいずれか1項に記載のライブラリ。 - 前記リガンド(2,6,7)の第1部位における前記一本鎖DNA(8)又はRNAが、
i)5´端末に前記リガンド(2,6,7)を有しているとき、該5´端末において、前記リガンド(3,4,5)の第2部位における前記一本鎖DNA(9)又はRNAのベースを補完すると共に、前記リガンド(3,4,5)の第2部位における前記第2の一本鎖DNA(9)又はRNAのベースを補完する前記更なる一本鎖DNA(10)又はRNAのうちの2から10ベースが、前記更なる一本鎖DNA(10)又はRNAの3´端末に配置される、又は
ii)3´端末に前記リガンド(2,6,7)を有しているとき、該3´端末において、前記リガンド(3,4,5)の第2位部位における前記一本鎖DNA(9)又はRNAのベースと補完するベースを有すると共に、前記リガンド(3,4,5)の第2部位における前記一本鎖DNA(9)又はRNAのベースを補完する前記更なる一本鎖DNA(10)又はRNAのうちの2から10ベースが、前記更なる一本鎖DNA(10)又はRNAの5´端末に配置される、
ことを特徴とする請求項27に記載のライブラリ。 - 高親和性三元リガンド‐レセプタ錯体の選択的で高感度な特定のための、請求項22から28のいずれか1項に記載のライブラリの用途。
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