KR20180099839A - 인플루엔자 바이러스 감염에서 사용하기 위한 작용화된 펜탄산 - Google Patents

인플루엔자 바이러스 감염에서 사용하기 위한 작용화된 펜탄산 Download PDF

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제롬 에밀 조르쥬 길레몽
벤디 미아 알버트 발레만스
고완 데이비드 크레이그 맥
마갈리 매들린 시몬 모떼
다비드 프란시스 알라인 랑크와즈
에밀리 마리에 람베르트
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얀센 사이언시즈 아일랜드 유씨
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Abstract

본 발명은 인플루엔자 감염의 치료에 또는 인플루엔자 감염에 대비하여 사용될 수 있는 하기 화학식 I:
[화학식 I]

Description

인플루엔자 바이러스 감염에서 사용하기 위한 작용화된 펜탄산
인플루엔자는 인간 집단에서 높은 발병률을 갖는 심각한 공중 보건 문제로서, 이는 잦은 대규모 이환율 및 사망률을 초래한다. 이는 급성 열성 질환(acute febrile illness)을 야기하는 고도로 접촉전염성인 공기 매개 질병(highly contagious airborne disease)이다. 전신 증상은 중증도에 있어서 경미한 피로부터 호흡 부전 및 사망에 이르기까지 다양하다. WHO에 따르면, 매년 발생되는 유행병의 평균 전세계 부담은 약 10억 건 정도의 사례일 수 있으며, 3백만 내지 5백만 건의 사례는 심각한 병(severe illness)이고, 300,000 내지 500,000건의 사망건수가 해마다 발생되고 있다. 해마다, 인플루엔자 바이러스는 인간에서 순환하여, 전형적으로 모든 연령군에서 인구의 5 내지 20%에 영향을 주는데, 이 숫자는 대유행기에는 최대 30%까지 상승한다. 심각한 병 및 사망의 비율은 65세 초과의 사람, 2세 미만의 어린이, 및 인플루엔자 합병증에 대한 증가된 위험에 놓이게 하는 의학적 병태, 예컨대 만성 심장, 폐, 신장, 간 혈액 또는 대사성 질병, 또는 약화된 면역계를 갖는 임의의 연령의 사람 사이에서 최고이다. 사망이 어린이 사이에서 드물기는 하지만, 입원율은 동반이환(co-morbid) 상태의 존재 또는 부재에 따라 5세 미만의 어린이의 경우 100,000건당 대략 100 내지 500건의 범위이다. 24개월 미만의 어린이 사이에서의 입원율은 65세 초과의 사람 사이에서 보고된 입원율과 비견된다.
미국에서, 매년 발생되는 인플루엔자 유행병은 대략 3000만 외래환자 내원을 초래하며, 그 결과 해마다 100억 달러의 의료 비용이 들게 된다. 병 및 사망으로 인한 상실 수익액(lost earning)은 해마다 150억 달러를 초과하는 비용을 나타내고, 매년 발생되는 인플루엔자 유행병의 미국의 총 경제적 부담은 850억 달러를 초과하기에 이른다.
인플루엔자를 야기하는 병원체는, 오르토믹소바이러스과(family Orthomyxoviridae)에 속하는, 네거티브 센스 단일-가닥 RNA 바이러스이다. A형, B형 및 C형의 3가지 유형의 인플루엔자 바이러스가 있다. A형 인플루엔자 바이러스는 가장 일반적인 형태로, 이는 포유동물 및 조류에서 확산될 수 있다. A형 인플루엔자의 아형은 표면 단백질인 혈구응집소(H) 및 뉴라미니다아제(N)의 유형에 따라 명명된다. 18가지의 상이한 혈구응집소 및 11가지의 알려진 뉴라미니다아제가 있다. 인간에서 발견되는 현재의 계절성 인플루엔자 바이러스는 주로 H1N1 및 H3N2 아형이다. B형 인플루엔자 바이러스는 통상 단지 인간에게서 발견된다. 이것은 아형으로 세분되지 않지만, 상이한 바이러스주(strain)로 추가로 나누어질 수 있다. 순환성 인플루엔자 바이러스는 매년 고도로 가변성이며, A형 및 B형 인플루엔자 둘 다는 전 세계에서 계절성 유행병을 야기한다. C형 인플루엔자 바이러스는 훨씬 더 경미한 증상을 보이며, 이는 유행병을 야기하지 않는다.
3가지 모든 유형의 바이러스는 유사한 게놈 구조를 갖는다. 게놈은 유형에 따라 9 내지 11가지의 단백질을 코딩하는 8개의 절편을 포함한다. A형 인플루엔자는 11가지의 단백질을 코딩하는데, 이는 표면 단백질(혈구응집소(HA) 및 뉴라미니다아제(NA)), 폴리머라아제 복합체(PA, PB1 및 PB2), 핵단백질(NP), 막 단백질(M1 및 M2), 및 기타 단백질(NS1, NS2, NEP)이 포함한다. 3가지 인플루엔자 바이러스 유형 중에서, A형 인플루엔자가 최고의 돌연변이율을 갖는다. B형 인플루엔자는 A형보다는 더 느리게 그러나 C형보다는 더 빠르게 진화된다. 절편화된 게놈은 유전자가 상이한 바이러스주들 사이에서 교환되게 하며, 이는 인플루엔자 바이러스의 신종 변이체를 발생시킨다.
인플루엔자 바이러스는 감염된 개인 또는 바이러스-오염된 물질과의 직접 접촉에 의해 인간들 사이에서 전염될 수 있다. 사람들은 또한 공기 중에 떠다니는 바이러스 비말(droplet)의 흡입에 의해 감염될 수 있다. 상기 비말은 감염된 개체가 기침하거나, 재채기하거나, 말하는 것에 의해 발생된다. 계절성 인플루엔자는 고열, 기침(통상 마른 기침), 두통, 근육 및 관절 통증, 심각한 불쾌감(찌뿌둥한 느낌), 인후염 및 콧물의 갑작스러운 발생을 특징으로 한다. 기침은 심각할 수 있으며, 2주 이상 지속될 수 있다. 대부분의 사람들은 의학적 치료에 대한 필요 없이 1주 이내에 열 및 기타 증상으로부터 회복한다. 그러나, 인플루엔자는, 특히 상기 언급된 바와 같은 고위험에 처한 사람들에서 심각한 병 또는 사망을 야기할 수 있다. 잠복기(incubation period)로 알려진, 감염으로부터 병에 이르기까지의 시간은 약 2일이다.
병으로부터의 심각한 결과 및/또는 질병의 방지를 위한 가장 효과적인 방법은 백신 접종(vaccination)이다. 안전하고 효과적인 백신이 입수가능하고, 60년 넘게 사용되어 왔다. 건강한 성인들 사이에서, 인플루엔자 백신은 합리적인 보호를 제공할 수 있다. 그러나, 백신 접종에는 몇몇 제한이 따른다. 먼저, 인플루엔자 백신은 고령자들 사이에서 병을 예방하는 데 덜 효과적일 수 있고, 단지 질병의 중증도 및 합병증 및 사망의 발생률을 감소시킬 수 있을 뿐이다. 게다가, 인플루엔자 백신 접종은 순환성 바이러스가 백신 바이러스와 잘 매칭될 때 가장 효과적이며, 백신 접종의 성공은 그 계절의 가장 우세한 바이러스 유형의 우수한 예측에 대체로 좌우된다. 현재의 인플루엔자 백신에 대한 백신-유도 면역 반응의 단명 성질과 커플링된, 항원 소변이(antigenic drift)를 통한 인플루엔자 바이러스주의 신속하고 계속적인 진화는, 계절적으로 적절한 주를 이용한 백신 접종이 예방을 위해 해마다 필요함을 의미한다.
인플루엔자의 현재의 치료는 직접적 항바이러스 약물, 또는 인플루엔자-유도된 증상을 풀어주는 의약을 사용한다. 시판 중인 인플루엔자용 항바이러스 약물의 하기 두 부류가 있다: 뉴라미니다아제 억제제 및 M2 채널 억제제.뉴라미니다아제 억제제인 오셀타미비르(oseltamivir) 또는 자나미비르(zanamivir)는 인플루엔자의 예방 및 치료용으로 권장되는 1차 항바이러스제이다. 이들은 A형 및 B형 인플루엔자 바이러스 둘 다에 대해 효과적이다. 이들 항바이러스 약물에 대한 내성의 발생이 계절성 인플루엔자의 치료 동안에, 그리고 산발성 오셀타미비르-내성 2009 H1N1 바이러스에서 확인되었지만, 공중 보건 영향은 지금까지 제한되었었다. M2 채널 억제제, 예컨대 아만타딘 및 리만타딘(아만타단)은 A형 인플루엔자 주에 대해서는 활성을 갖지만, B형 인플루엔자 주에 대해서는 활성을 갖지 않는다. 순환성 A형 인플루엔자 바이러스 사이에서의 아다만탄 내성은 2003년 내지 2004년 동안 시작하여 전 세계적으로 빠르게 증가하였다. 따라서, 아만타딘 및 리만타딘은 현재의 순환성 A형 인플루엔자 바이러스주의 항바이러스적 치료 또는 화학적 예방용으로 권장되지 않는다.
2009년에, 신종 돼지(swine) H1N1 주는 인간, 피그(pig), 및 조류의 H1N1 바이러스로부터의 유전자의 재편성(reassortment)의 결과로서 예기치 않은 인플루엔자 범유행(pandemic)을 야기하였다. 고병원성 조류 H5N1 주의 계속 진행 중인 순환, 및 중국에 격리되어 있고 40% 사망률을 갖는 심각한 호흡기 질병과 관련된 조류 기원의 신종 재편성체인 H7N9 바이러스 - 이는 잠재적으로 인간-대-인간 전염을 위해 바뀔 수 있음 - 의 최근의 출현과 함께, 이러한 과거의 범유행은 신종 인플루엔자 주에 대한 전세계 인구의 취약성을 강조하였다. 백신 접종은 여전히 인플루엔자 감염을 제어하기 위한 주요한 예방적 전략이지만, 신종 백신이 입수가능하게 되기 전 그 기간을 이어주고 심각한 인플루엔자 사례를 치료할 뿐만 아니라 바이러스 내성의 문제에 대항하기 위해서도, 항-인플루엔자 약물의 더 넓은 선택이 요구되고 있다. 따라서, 신규한 인플루엔자 항바이러스제의 개발은 다시 고도한 우선 사항 및 충족되지 않은 의학적 필요성이 되었다.
본 발명은 인플루엔자 바이러스 감염의 치료용으로 또는 인플루엔자 바이러스 감염에 대비하여 사용될 수 있는 하기 화학식 I의 화합물, 이의 입체이성질체 형태, 제약상 허용가능한 염, 용매화물 또는 다형체에 관한 것이다:
[화학식 I]
Figure pct00001
여기서,
Y는 N이며, X는 C이며, R1은 할로겐이며, R2는 CN이며, R3은 Het 또는 C2- 6알켄이거나;
또는
Y는 N이며, X는 N이며, R1은 할로겐이며, R2는 H이며, R3은 Het이거나;
또는
Y는 N이며, X는 C 또는 N이며, Z는 C 또는 N이며, R1은 할로겐 또는 H이며, R2는 H 또는 CN이며, R3은 Het, OCH3 또는 CH3이다.
바람직하게는 본 발명에 따른 화합물은 R1이 클로로 또는 플루오로이며, R3이 N, O 또는 S로부터 선택되는 하나 이상의 헤테로원자를 포함하는 복소환이고, 상기 복소환이 4, 5, 6 또는 7개의 고리 원자를 가질 수 있으며, C1-6 알킬로 선택적으로 치환될 수 있는 화학식 I의 화합물이다.
본 발명에 따른 가장 바람직한 화합물 중 하나는 하기 화학식 II를 갖는다:
[화학식 II]
Figure pct00002
본 발명에 따른 가장 바람직한 화합물은 하기 화학식 III을 갖는다:
[화학식 III]
Figure pct00003
또한, 본 발명의 일부는, 화학식 I, 화학식 II 또는 화학식 III의 화합물, 이의 입체이성질체 형태, 제약상 허용가능한 염, 용매화물 또는 다형체를 하나 이상의 제약상 허용가능한 부형제, 희석제 또는 담체와 함께 포함하는 제약 조성물이다.
본 제약 조성물은 또한 추가 치료제, 예컨대 또 다른 항바이러스제 또는 인플루엔자 백신, 또는 이들 둘 다를 포함할 수 있다.
또한, 약제로서 사용하기 위한, 화학식 I, 화학식 II 또는 화학식 III의 화합물, 이의 입체이성질체 형태, 제약상 허용가능한 염, 용매화물 또는 다형체, 또는 제약 조성물이 본 발명에 속한다.
추가적으로, 본 발명은 인플루엔자의 치료에 사용하기 위한, 화학식 I, 화학식 II 또는 화학식 III의 화합물, 이의 입체이성질체 형태, 제약상 허용가능한 염, 용매화물 또는 다형체, 또는 제약 조성물에 관한 것이다.
따라서 본 발명의 일부는 생물학적 샘플 또는 환자에서 인플루엔자 바이러스(들)의 복제를 억제함에 있어서의, 하기 화학식 I로 표시되는 화합물, 이의 입체이성질체 형태, 제약상 허용가능한 염, 용매화물 또는 다형체의 용도이다:
[화학식 I]
Figure pct00004
여기서,
Y는 N이며, X는 C이며, R1은 할로겐이며, R2는 CN이며, R3은 Het 또는 C2- 6알켄이거나;
또는
Y는 N이며, X는 N이며, R1은 할로겐이며, R2는 H이며, R3은 Het이거나;
또는
Y는 N이며, X는 C 또는 N이며, Z는 C 또는 N이며, R1은 할로겐 또는 H이며, R2는 H 또는 CN이며, R3은 Het, OCH3 또는 CH3이다.
상기 용도는 또한 추가 치료제의 공동 투여를 포함할 수 있으며, 여기서 상기 추가 치료제는 항바이러스제 또는 인플루엔자 백신, 또는 이들 둘 다로부터 선택된다.
"복소환" (Het)이라는 용어는 N, O 또는 S로부터, 특히 N 및 S로부터 선택되는 하나 이상의 헤테로원자를 포함하는 포화 또는 부분 포화된 분자를 나타낸다. 상기 복소환은 4, 5, 6 또는 7개의 고리 원자를 가질 수 있다. 특히, 상기 복소환은 5 또는 6개의 고리 원자를 가질 수 있다.
화학식 I의 화합물의 제약상 허용가능한 염은 이의 산 부가염 및 염기 염을 포함한다. 적합한 산 부가염은 비독성 염을 형성하는 산에 의해 형성된다. 적합한 염기 염은 비독성 염을 형성하는 염기에 의해 형성된다.
본 발명의 화합물은 또한 비용매화 형태 및 용매화 형태로 존재할 수 있다. 본원에서 "용매화물"이라는 용어는, 본 발명의 화합물과 하나 이상의 제약상 허용가능한 용매 분자, 예를 들어, 에탄올을 포함하는 분자 복합체를 기술하는 데 사용된다.
"다형체"라는 용어는, 하나 초과의 형태 또는 결정 구조로 존재하는 본 발명의 화합물의 능력을 나타낸다.
본 발명의 화합물은 결정성 또는 무정형 생성물로서 투여될 수 있다. 본 발명의 화합물은 침전, 결정화, 동결 건조, 분무 건조 또는 증발 건조와 같은 방법에 의해, 예를 들어 고체 플러그, 분말 또는 필름으로서 얻어질 수 있다. 본 발명의 화합물은 단독으로 투여될 수 있거나, 본 발명의 하나 이상의 다른 화합물과 조합되어 또는 하나 이상의 다른 약물과 조합되어 투여될 수 있다. 일반적으로 본 발명의 화합물은 하나 이상의 제약상 허용가능한 부형제와 결부되어 제형으로서 투여될 것이다. 본원에서 "부형제"란 용어는 본 발명의 화합물(들) 이외의 임의의 성분을 기술하는 데 사용된다. 부형제의 선택은 주로 특정 투여 방식, 용해도와 안정성에 대한 부형제의 영향, 및 투여 형태의 성질과 같은 요인에 의존한다.
본 발명의 화합물 또는 이의 임의의 하위군(subgroup)은 투여 목적에 따라 다양한 제약적 형태로 제형화될 수 있다. 적절한 조성물로는, 전신 투여 약물용으로 통상적으로 사용되는 모든 조성물이 언급될 수 있다. 본 발명의 제약 조성물을 제조하기 위하여, 활성 성분으로서의 특정 화합물 (선택적으로 부가염 형태)의 유효량이 제약상 허용가능한 담체와의 친밀한 혼합물로 조합되며, 이러한 담체는 투여에 요망되는 제제의 형태에 따라 매우 다양한 형태를 취할 수 있다. 이러한 제약 조성물은 바람직하게는 예를 들어 경구 투여, 직장 투여 또는 경피 투여에 적합한 일원화 투여 형태로 존재한다. 예를 들어, 조성물을 경구 투여 형태로 제조함에 있어서, 임의의 일반적인 제약 매질, 예를 들어 현탁액, 시럽, 엘릭서, 에멀젼 및 용액과 같은 경구용 액상 제제의 경우 물, 글리콜, 오일, 알코올 등; 또는 산제, 환제, 캡슐 및 정제의 경우, 전분, 당, 카올린, 희석제, 활택제, 결합제, 붕해제 등과 같은 고체 담체가 사용될 수 있다. 정제 및 캡슐은 투여의 용이함 때문에 가장 유리한 경구 단위 투여 형태를 대표하며, 이 경우에는 분명히 고체 제약 담체가 사용된다. 사용 직전에 액체 형태로 전환될 수 있는 고체 형태 제제도 포함된다. 경피 투여에 적합한 조성물에서, 담체는 선택적으로 침투 향상제 및/또는 적합한 습윤제를 포함하며, 이들은 선택적으로, 피부에 대한 유의한 유해 효과를 도입하지 않는 임의의 성질의, 작은 비율의 적합한 첨가제와 배합된다. 상기 첨가제는 피부로의 투여를 용이하게 할 수 있고/있거나 원하는 조성물을 제조하는 데 도움을 줄 수 있다. 이러한 조성물은 다양한 방식으로, 예를 들어 경피 패치로서, 스팟온(spot-on)으로서, 연고로서 투여될 수 있다. 본 발명의 화합물은 또한 흡입 또는 통기를 통한 투여에 대한 당업계에서 사용되는 방법 및 제형에 의해 흡입 또는 통기를 통해 투여될 수 있다. 따라서, 일반적으로 본 발명의 화합물은 용액, 현탁액 또는 건조 분말의 형태로 폐에 투여될 수 있다.
투여의 용이성 및 투여량의 균일성을 위해 상기 제약 조성물을 단위 투여 형태로 제형화하는 것이 특히 유리하다. 본원에서 사용되는 바와 같이 단위 투여 형태는 일원화 투여형으로 적합한 물리적으로 분리된 단위를 지칭하며, 각 단위는 필요한 제약 담체와 결부되어 원하는 치료 효과를 생성하도록 계산된 소정량의 활성 성분을 함유한다. 이러한 단위 투여 형태의 예로는 정제(분할(scored) 또는 코팅 정제를 포함), 캡슐, 환제, 산제 패킷, 웨이퍼, 좌제, 주사가능한 용액 또는 현탁액 등, 및 이들의 분리형 멀티플(segregated multiple)이 있다.
감염성 질환의 치료 분야의 숙련자라면 이하에 제시되는 테스트 결과로부터 유효량을 결정할 수 있을 것이다. 일반적으로 일일 유효량은 체중 1 ㎏당 0.01 ㎎ 내지 50 ㎎, 더 바람직하게는 체중 1 ㎏당 0.1 ㎎ 내지 10 ㎎일 것으로 생각된다. 요구되는 용량을 하루 동안 2, 3, 또는 4회 또는 이보다 더 많은 횟수의 하위-용량(sub-dose)으로서 적절한 간격으로 투여하는 것이 적절할 수 있다. 상기 하위-용량은, 예를 들어 단위 투여 형태당 1 내지 1000 mg, 그리고 특히 5 내지 200 mg의 활성 성분을 함유하는 단위 투여 형태로서 제형화될 수 있다.
당업자에게 잘 알려진 바와 같이, 정확한 투여의 빈도 및 투여량은 사용되는 화학식 I의 특정 화합물, 치료되는 특정 병태, 치료되는 병태의 중증도, 특정 환자의 연령, 체중 및 종합적인 건강 상태와, 개체가 복약 중일 수 있는 다른 약에 의존한다. 더욱이, 유효량은 치료받는 대상체의 반응에 따라, 및/또는 본 발명의 화합물을 처방하는 의사의 평가에 따라 저하 또는 증가될 수 있음이 명백하다. 따라서, 위에 언급된 유효량 범위는 단지 지침일 뿐이고, 본 발명의 범주 또는 용도를 임의의 정도로 제한하고자 하는 것은 아니다.
본 발명은 또한 본 발명의 화합물에 존재하는 원자의 임의의 동위원소를 포함하도록 의도된다. 예를 들어, 수소의 동위원소는 삼중수소 및 중수소를 포함하고 탄소의 동위원소는 C-13 및 C-14를 포함한다.
본 발명에 사용되는 본 화합물은 또한, 동일한 결합의 순서에 의해 결합된 동일한 원자로 구성되지만 상호교환될 수 없는 상이한 3차원 구조를 갖는 모든 가능한 화합물로 정의되는, 이들의 입체화학적 이성질체 형태로 존재할 수 있다. 달리 언급되거나 표시되지 않는 한, 화합물의 화학적 명칭은, 상기 화합물이 보유할 수 있을 모든 가능한 입체화학적 이성질체 형태의 혼합물을 포괄한다.
상기 혼합물은 상기 화합물의 기본적인 분자 구조의 모든 부분입체 이성질체 및/또는 거울상 이성질체를 포함할 수 있다. 임의의 라세미 혼합물 또는 라세미체를 비롯하여 순수한 형태이거나 서로와의 혼합물 형태의 본 발명에 사용되는 화합물의 모든 입체화학적 이성질체 형태는 본 발명의 범주 내에 포함되는 것으로 의도된다.
본원에 언급되는 화합물 및 중간체의 순수 입체 이성질체 형태는, 상기 화합물 또는 중간체와 동일한 기본적 분자 구조의 다른 거울상 이성질체 또는 부분입체 이성질체 형태가 실질적으로 없는 이성질체로서 정의된다. 특히, '입체 이성질체로서 순수한'이라는 용어는 적어도 80%의 입체 이성질체 과잉률(즉, 최소 90%의 한 이성질체 및 최대 10%의 다른 가능한 이성질체) 내지 100%까지의 입체 이성질체 과잉률(즉, 한 이성질체가 100%이고 다른 것은 없음)을 갖는 화합물 또는 중간체, 더욱 특히는 90% 내지 100%까지의 입체 이성질체 과잉률을 갖는, 더욱 더 특히는 94% 내지 100%까지의 입체 이성질체 과잉률을 갖는, 그리고 가장 특히는 97% 내지 100%까지의 입체 이성질체 과잉률을 갖는 화합물 또는 중간체와 관련된다. '거울상 이성질체로서 순수한' 및 '부분입체 이성질체로서 순수한'이라는 용어는 유사한 방식으로, 그러나 각각 당해 혼합물의 거울상 이성질체 과잉률, 부분입체 이성질체 과잉률과 관련된 것으로 이해되어야 할 것이다.
본 발명에서 사용되는 화합물 및 중간체의 순수 입체 이성질체 형태는 본 기술 분야에 공지된 절차의 적용에 의해 얻어질 수 있다. 예를 들어, 거울상 이성질체는 광학 활성 산 또는 염기로 이들의 부분입체 이성질체 염을 선택적으로 결정화하는 것에 의해 서로 분리될 수 있다. 이의 예로는 타르타르산, 디벤조일타르타르산, 디톨루오일타르타르산 및 캄포술폰산이 있다. 대안적으로, 거울상 이성질체는 키랄 고정상을 사용하여 크로마토그래피 기법에 의해 분리될 수 있다. 상기 순수한 입체화학적 이성질체 형태는 또한, 반응이 입체특이적으로 일어난다면, 적절한 출발 물질의 상응하는 순수한 입체화학적 이성질체 형태로부터 유도될 수 있다. 바람직하게는, 특정 입체이성질체가 요망될 경우, 상기 화합물은 입체특이적 제조 방법에 의해 합성될 것이다. 이들 방법은 유리하게는 거울상 이성질체로서 순수한 출발 재료를 사용할 것이다.
본 발명에 따른 화합물의 제조 .
Figure pct00005
중간체 A1 의 제조
메탄술폰산 (1.3 mL, 20.4 mmol)을 실온에서 THF (150 mL) 중 활성화 Zn (17.4 g, 267 mmol)의 현탁물에 첨가하였다. 반응 혼합물을 환류에서 15분 동안 교반시키고, THF (50 mL) 중 2-메틸-2-(2-피리딜)프로판니트릴 [CA-81039-18-1] (7.8 g, 55.3 mmol)의 용액을 첨가하였다. 그 후, THF (50 mL) 중 에틸브로모아세테이트 (17.8 mL, 160 mmol)의 용액을 환류에서 45분에 걸쳐 첨가하였다. 반응 혼합물을 환류에서 1시간 동안 교반시켰다. NaHCO3의 포화 수용액을 첨가하고, EtOAc로 세척하였다. 합한 유기 층을 MgSO4로 건조시키고, 여과시키고, 농축시켰다. 잔사를 시클로헥산/EtOAc 구배를 이용하여 분취용 LC (불규칙 SiOH, 15 내지 40 ㎛, 그레이스리졸브 (GraceResolv), 이동상)에 의해 정제하였다. 순수한 분획을 수집하고, 증발시켜 12.8 g의 중간체 A1을 무색 액체 (정량적)로서 제공하였다.
중간체 A2 의 제조
NaBH3CN (1.9 g; 30.7 mmol)을 EtOH (300 mL) 및 AcOH (28 mL) 중 중간체 A1 (6 g; 25.6　mmol)의 용액에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 60℃에서 3시간 동안 가열하였다. NaHCO3의 포화 수용액 및 그 후 수성 층을 EtOAc로 추출하였다. 합한 유기 층을 MgSO4로 건조시키고, 여과시키고, 진공에서 농축시켜 3.6 g의 중간체 A2 (59%)를 황색 오일로서 제공하였다.
화합물 A3 의 제조
중간체 A2 (1.8 g, 7.62 mmol), 2,4-디클로로-5-플루오로-피리미딘 (31.15 g, 6.9 mmol) 및 디이소프로필아민 (7.6mL, 41.55 mmol)의 용액을 교반시키고 가열하였다 (70℃에서 17시간 동안). 물을 상기 반응 혼합물에 첨가하고, 그 후 수성 층을 EtOAc로 2회 추출하였다. 유기 층을 수집하고, MgSO4로 건조시키고, 여과시키고, 증발시켜 조 생성물을 수득하였다. 헵탄/EtOAc 구배를 이용하여 실리카 겔 크로마토그래피 (불규칙 SiOH, 15 내지 40 ㎛, 80 g 그레이브리졸브 (GraveREsolv))를 통하여 조 물질을 정제하였다. 분획을 모으고, 용매를 제거하여 A3, 2.08 g, 65%의 무색 오일을 생성하였다.
화합물 A5 의 제조
DME (3 mL) 중 중간체 A4 [CAS-934178-97-9](273 mg, 0.7 mmol), 중간체 A3 (275.9 mg, 0.8 mmol) 및 K2CO3 (1 mL, 2 M, 2.1 mmol)의 용액을 N2 유동을 이용하여 5분 동안 퍼지하고, 그 후 Pd(dppf)Cl2 (56 mg, 0.07 mmol)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 교반시키고 가열하였다 (0 내지 400 W의 범위의 전력 출력를 갖는 단일 모드 마이크로웨이브 (바이오테이지 이니시에이터60 (Biotage initiator60))를 이용하여 120℃에서 40분 동안). 상기 혼합물을 물 및 DCM에 붓고, 소수성 프릿을 이용하여 유기 층을 분리하고, 건조될 때까지 증발시켰다. 실리카 겔 (불규칙 SiOH, 15 내지 35 ㎛, 40 g, 헵탄/EtOAc: 100/0으로부터 80/20까지)에서 플래시 크로마토그래피에 의해 정제를 실시하였다. 순수한 분획을 수집하고, 증발시켜 중간체 A5를 무색 오일 (0.270 g, 65%)로서 얻었다.
화합물 A6 의 제조
KOH (248.4 mg, 4.4 mmol)를 MeOH/물의 혼합물 ([2:1], 0.75 mL] 중 A5 (270 mg, 0.4 mmol)의 용액에 첨가하였다. 생성된 용액을 교반시키고 가열하였다 (50℃에서 17시간 동안). 상기 용액을 실온까지 냉각시켰다. DCM (2 mL)을 첨가하고, 혼합물을 3 N HCl로 중화시켰다. 층들을 소수성 프릿을 통하여 분리하였다. 유기 층을 MgSO4로 건조시키고, 여과시키고, 증발시켰다. 분취용 역상 (고정상: 엑스-브리지 (X-Bridge)-C18 5 μm 30*150 mm, 이동상: 90% NH4HCO3 (0.5%), 10% ACN으로부터 50% NH4HCO3 (0.5%), 50% ACN까지의 구배)을 통하여 정제를 수행하였다. 순수한 분획을 수집하고 증발시켰다. 생성된 고형물을 감압 하에 40℃에서 5시간 동안 건조시켜 화합물 A6, 0.11 g, 4.6%를 제공하였다. mp℃: 158.
1H NMR (500 MHz, DMSO-d 6) δ ppm 1.30 (s, 3 H) 1.38(s, 3 H) 2.01 (dd, J=15.4 Hz, 2.8 Hz, 1H) 2.38 (m, 2H) 5.65 (m, 1H) 7.23 (dd, J=7.9 Hz, 5.0 Hz, 1 H) 7.44 (d, J=7.9　Hz, 1 H) 7.73 (td, J=8.9 Hz 1.9 Hz, 1 H) 8.04 (br, d, J=8.2 Hz, 1 H) 8.13 (d, J=4.1 Hz, 1H) 8.16 (s, 1H) 8.76 (d, J=3.8 Hz, 1H) 8.85 (s, 1H) 10.2 (s, 1H)
Figure pct00006
중간체 B2 의 제조
질소 하에서, TEA (0.87 mL, 6.3 mmol)를 건조 DCM (27 mL) 중 B1 [1123787-64-3] (710 mg, 4.2 mmol) 및 N-벤질히드록실아민 히드로클로라이드 (0.87 g, 5.4　mmol)의 혼합물에 첨가하고, 실온에서 하룻밤 교반시켰다. 상기 혼합물을 농축시켜 잔사를 제공하고, 이를 분취용 LC (고정상: 인터킴 (Interchim), 30 ㎛, 24 g, 이동상 구배: 헵탄/EtOAc: 90/10으로부터 60/40까지)에 의해 정제하여 561 mg (46%)의 B2를 무색 오일로서 제공하였다.
중간체 B3 의 제조
스테인리스 봄 (stainless bomb)에서, EtOH (22 mL) 중 B2 (561 mg, 1.9 mmol) 및 펄맨 (Pearlman) 촉매 (537 mg; 38 ㎛ol)의 용액을 H2 (5 bar) 분위기 하에 하룻밤 교반시켰다. 상기 혼합물을 AcOEt로 희석시키고 셀라이트 (Celite)®의 패드를 통해 여과시켰다. 용매를 진공에서 제거하여 B3 (311 mg, 무색 오일, 87%)을 제공하였다.
중간체 B4 의 제조
THF (2.1 mL) 및 EtOH (2.1 mL) 중 2,4-디클로로-5-플루오로-피리미딘 (0.138 g; 0.828 mmol), DIPEA (0.71 mL; 4.1 mmol), B3 (0.155 g; 0.828 mmol)을 밀봉 튜브에서 90℃에서 18시간 동안 가열하였다. EtOAc를 첨가하고 염수로 2회 세척하였다. 유기 층을 MgSO4로 건조시키고, 여과시키고, 진공에서 증발시켜 무색 오일을 제공하고, 이를 분취용 LC (규칙 SiOH 30 ㎛, 24 g 인터킴, 이동상 구배: 헵탄/EtOAc: 80/20으로부터 50/50까지)에 의해 정제하여 170　mg의 B4를 백색 고형물로서 제공하였다 (65%).
중간체 B5 의 제조
N2 하에서, 밀봉 튜브에서, 1,4 디옥산 (2.3 mL) 및 물 (0.72 mL) 중 화합물 X(141 mg; 0.29 mmol, 90% 순도), B4 (85 mg; 0.27 mmol) 및 Cs2CO3 (0.31 g; 0.94 mmol)의 혼합물을 N2로 5분 동안 탈기시켰다. PdCl2(PPh3)2 (19 mg; 27 ㎛ol)를 첨가하고, 반응 혼합물을 다시 N2로 2분 동안 탈기시켰다. 반응 혼합물을 90℃에서 1시간 30분 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 실온까지 냉각시켰다. DCM 및 염수를 반응 혼합물에 첨가하였다. 수성 층을 DCM으로 추출하였다. 합한 유기 층을 세척하고, MgSO4로 건조시키고, 여과 제거하고, 건조될 때까지 농축시켜 잔사를 생성하고, 이를 분취용 LC (규칙 SiOH 30 ㎛, 12 g, 인터킴, 이동상 구배: 헵탄/EtOAc: 85/15로부터 60/40까지)에 의해 정제하여 89 mg의 B5를 백색 고형물로서 제공하였다 (57%).
화합물 B6 의 제조
LiOH 1수화물 (128 mg, 3.1 mmol)을 물 (0.29 mL) 및 THF (0.84 mL) 중 B5 (90 mg, 0.15　mmol)의 혼합물에 첨가하였다. 상기 혼합물을 60℃에서 18시간 동안 교반시켰다. 상기 용액을 3 N HCl로 중화시키고 (주의: 바람직하게는 염기성 pH, 기껏해야 대략 7 내지 8에서 유지), 용매를 진공에서 증발시켜 250 mg의 잔사를 제공하고, 이를 역상 (고정상: 엑스-브리지-C18 5 μm 30*150 mm, 이동상: 90% (수성 NH4HCO3 (0.5%)), 10% MeCN으로부터 50% (수성NH4HCO3 (0.5%)), 50% MeCN까지의 구배)을 통하여 정제하였다. 순수 화합물을 함유하는 분획을 증발시키고, 수득된 고형물을 MeCN/H2O에서 동결 건조시켜 B6 (18 mg, 백색 고형물, 29%)을 제공하였다. LC-MS 질량: 실측치 [M+H]+= 406.1. Rt(min)= 1.78 (방법 A)
1H NMR (500 MHz, DMSO-d 6) δ ppm 1.39 (s, 3H), 2.45-2.55 (m, 1H), 2.58 (dd, J=15.8, 10.4 Hz, 1 H), 4.10 (d, J=5.7 Hz, 1 H), 4.19 (d, J=6.0 Hz, 1 H), 4.51 (d, J=6.0 Hz, 1 H), 4.73 (d, J=5.7 Hz, 1 H), 5.18-5.30 (m, 1H), 7.77 (br s, 1H), 8.18(d J=4.1 Hz, 1 H), 8.19 (s, 1H), 8.28 (d, J=2.2 Hz, 1 H), 8.81 (d, 2.2 Hz, 1 H), 12.35 (br s, 2H)
Figure pct00007
중간체 C2 의 제조
메탄술폰산 (0.675 mL, 10.4 mmol)을 실온에서 THF (60 mL) 중 활성화 Zn (8.94 g, 137 mmol)의 현탁물에 첨가하였다. 반응 혼합물을 환류에서 15분 동안 교반시키고, THF (20 mL) 중 화합물 C1 (문헌[J. Org. Chem. 2013, 78, 762-769)] (4.00 g, 27.4 mmol)의 용액을 첨가하였다. 그 후, THF (40 mL) 중 에틸브로모아세테이트 (9.14 mL, 82.1 mmol)의 용액을 환류에서 적가하였다. 반응 혼합물을 환류에서 1시간 동안 교반시켰다. 포화 NaHCO3 수용액을 첨가하고, 혼합물을 셀라이트에서 여과시켰다. 여과액을 에틸 아세테이트 (2x15 mL)로 추출하고, Na2SO4로 건조시키고, 여과시키고, 감압 하에 농축시켰다. 잔사를 분취용 LC (불규칙 SiOH, 40 내지 63 ㎛, 플루카 (Fluka), 액체 로딩 (DCM), 이동상: DCM 100%)에 의해 정제하여 3.6 g의 중간체 C2를 황색 액체로서 제공하였다 (56%).
중간체 C3 의 제조
EtOH (50 mL) 중 중간체 C2 (2.3 g; 5.67 mmol)의 혼합물에 NH4OAc (2.19 g; 28.3 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 80℃에서 18시간 동안 교반시켰다. 상기 혼합물을 실온까지 냉각시키고, AcOH (6.17 mL; 108 mmol)와, 상업적인 THF 중 1 M NaBH3CN 용액 (85 mL; 85.0 mmol)을 첨가하고, 반응 혼합물을 60℃에서 4시간 동안 가열하였다. 포화 NaHCO3 수용액 및 EtOAc를 첨가하였다. 수성 층을 EtOAc (2회)로 추출하였다. 합한 유기 층을 MgSO4로 건조시키고, 여과시키고, 진공에서 증발시켰다. 잔사를 분취용 LC (불규칙 SiOH 15 내지 40 ㎛, 80 g 그레이스리졸브, 이동상 구배: DCM/MeOH/수성 NH3: 100/0/0에서 90/10/1까지)에 의해 정제하여 1.63 g의 중간체 C3 (정량적)을 제공하였다.
중간체 C4 의 제조
THF (50 mL) 및 EtOH (50 mL) 중 중간체 C3 (1.80 g; 7.62 mmol), 2,6-디클로로-3 시아노-5 플루오로피리딘 (1.46 g; 762 mmol), DIPEA (6.65 mL; 38.1 mmol)를 90℃에서 18시간 동안 가열하였다.
추가의 양의 2,6-디클로로-3 시아노-5 플루오로피리딘 (0.145 g; 0.762 mmol)을 첨가하고, 반응 혼합물을 90℃에서 4시간 동안 교반시켰다. 물 및 염수를 첨가하였다. 수성 층을 EtOAc (2회)로 추출하였다. 합한 유기층을 MgSO4로 건조시키고, 여과시키고, 진공에서 증발시키고, 분취용 LC (불규칙 SiOH 15 내지 40 ㎛, 120 g 그레이스리졸브, 액체 로딩 (DCM), 이동상 구배: 헵탄/EtOAc:90/10으로부터 60/40까지)에 의해 정제하여 1.76 g의 중간체 C4 (59%)를 제공하였다.
화합물 C5 의 제조
N2 하에서, 밀봉 튜브에서, 디옥산 (15 mL) 및 H2O (6 mL) 중 화합물 X[CA-866546-11-4] (1.22 g; 2.83　mmol), 중간체 C4 (0.850 g; 2.18 mmol) 및 Cs2CO3 (2.48 g; 7.61 mmol)의 혼합물을 N2로 5분 동안 탈기시켰다. PdCl2(PPh3)2 (153 mg; 0.217 mmol)를 첨가하고, 반응 혼합물을 다시 N2로 2분 동안 탈기시켰다. 반응 혼합물을 90℃에서 2시간 동안 가열하였다.
반응 혼합물을 실온까지 냉각시켰다. EtOAc 및 염수를 반응 혼합물에 첨가하였다. 수성 층을 EtOAc로 추출하였다. 합한 유기 층을 염수로 세척하고, MgSO4로 건조시키고, 여과 제거하고, 진공에서 증발시키고, 분취용 LC (불규칙 SiOH 15 내지 40 ㎛, 40 g 그레이스리졸브, SiOH에 건식 로딩, 이동상 구배: 헵탄/EtOAc: 90/10으로부터 50/50까지)에 의해 정제하여 230　mg의화합물 C5를 고형물로서 제공하였다 (14%).
화합물 C6 의 제조
밀봉 튜브에서, THF (2 mL) 및 H2O (0.7 mL) 중 화합물 X (300 mg; 0.227 mmol)의 용액에 LiOH 1수화물 (68 mg; 1.59 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 25℃에서 하룻밤 교반시켰다.
반응 혼합물을 증발시키고, 분취용 LC (불규칙 SiOH 15 내지 40 ㎛, 40 g 그레이스리졸브, 건식 로딩 (SiOH에), 이동상 구배: DCM/MeOH: 100/0으로부터 80/20까지)에 의해 정제하여 80 mg의 불순한 화합물을 제공하였다. DCM을 불순한 화합물에 첨가하고, 고형물을 여과시키고, DCM, 그 후 아세톤으로 헹구었다. 고형물을 다시 분취용 LC (불규칙 SiOH 15 내지 40 ㎛, 24 g 그레이스리졸브, SiOH에 건식 로딩, 이동상 구배: DCM/MeOH: 100/0으로부터 93/7까지)에 의해 정제하여 75 mg의 C6 (69%) (mp= 256.46℃)을 제공하였다.
1H NMR (500 MHz, DMSO-d 6) δ ppm 1.34 (s, 3 H) 1.37 (s, 3 H) 2.17 (br d, J=15.1 Hz, 1 H) 2.50 (m, 1 H) 5.58 (br t, J=9.5 Hz, 1 H) 7.18 (t, J=6.6 Hz, 1 H) 7.39 (br d, J=7.9 Hz, 1 H) 7.67 (t, J=7.6 Hz, 1 H) 7.64 - 7.81 (br s, 1 H) 7.85 (br d, J=11.4 Hz, 1　H) 8.32 (s, 1 H) 8.37 (s, 1 H) 8.47 (br d, J=3.8 Hz, 1 H) 9.13 (br s, 1 H) 12.08 (br s, 1 H) 12.47 (s, 1 H)
LC-MS 질량: 실측치 [M+H]+= 479.0. Rt(min)= 2.39 min (방법 A)
C6 의 순수 이성질체들의 분리
화합물 C6을 키랄 SFC (고정상: 키랄셀 (CHIRALCEL) AD (5.0　cm I.Dx 25 cm L), 이동상: 70% CO2, 30% EtOH)를 통하여 정제하였다. 그 후 각각의 이성질체를 키랄 HPLC (고정상: 키랄팩 (CHIRALPAK) AD, 이동상: 70% 헥산, 30% EtOH, 0.1% AcOH)에 의해 재정제하여 30 mg의 거울상 이성질체 1 ([(-)-C6]으로 칭해짐) (mp℃= 231.52, [α]25℃ 589nm = -37.1) 및 35 mg의 거울상 이성질체 2 ([(+)-C6]으로 칭해짐) (m=　35mg; mp℃= 229.28, [α]25℃ 589nm =　41.0)를 제공하였다.
Figure pct00008
화합물 D5
Figure pct00009
중간체 D2 의 제조
건조 THF (100 mL) 중 활성화 Zn (13 g; 198 mmol)의 현탁물을 환류 하에 가열하고, 그 후 1,2-디브로모에탄 (855 μL; 9.92 mmol) 및 몇 드롭의 에틸브로모아세테이트를 첨가하였다. 환류에서 20분 후, 건조 THF (100 mL) 중 화합물 D1 (5　g; 33.1 mmol)의 용액을 한꺼번에 첨가하였다. 에틸브로모아세테이트 (15 mL; 132 mmol)를 50분에 걸쳐 적가하였다. 상기 혼합물을 70℃에서 20분 동안 교반시키고, 그 후 실온까지 냉각시키고, 그 후 NaHCO3 수용액으로 처리하고, 셀라이트 패드를 통하여 여과시켰다. 여과액을 EtOAc (2회)로 추출하였다. 합한 유기 층을 MgSO4로 건조시키고, 여과시키고, 진공에서 농축시켜 10 g의 조 D2를 제공하였다.
조 물질을 분취용 LC (규칙 SiOH 30 ㎛, 200 g 인터킴, 액체 로딩 (DCM), 이동상 구배: 헵탄/EtOAc: 100:0으로부터 80:20까지)에 의해 정제하였다. 생성물을 함유하는 분획을 합하고, 용매를 진공에서 제거하여 5.7 g의 중간체 D2 (72%)를 무색 오일로서 제공하였다.
중간체 D3 의 제조
NaBH3CN (1.5 g; 23.9 mmol)을 MeOH (118 mL) 및 AcOH (12 mL) 중 중간체 D2 (4.7 g; 19.6　mmol)의 용액에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 하룻밤 교반시켰다. 상기 혼합물을 물의 첨가에 의해 켄칭하고, 용매를 진공에서 증발시켰다. 생성된 혼합물을 NaOH (1 N) 용액의 첨가에 의해 염기성화하고 (pH=10 내지 14), 그 후 DCM (2회)으로 추출하였다. 합한 유기 층을 염수로 세척하고, MgSO4로 건조시키고, 여과시키고, 진공에서 농축시켜 4.6 g의 중간체 D3 (97%)을 무색 오일로서 제공하였다.
중간체 D4 의 제조
THF (10　mL) 및 EtOH (10 mL) 중 2,6-디클로로-3 시아노-5 플루오로피리딘 (396 mg; 2.07 mmol), 중간체 D3 (500 mg; 2.07 mmol) 및 DIPEA (543 μL; 3.11 mmol)의 혼합물을 90℃에서 2시간 동안 교반시켰다. 상기 혼합물을 밀봉 튜브 내로 옮기고, 2,6-디클로로-3 시아노-5 플루오로피리딘 (396 mg; 2.07 mmol)을 첨가하고, 생성된 혼합물을 90℃에서 16시간 동안 교반시켰다. 2,6-디클로로-3 시아노-5 플루오로피리딘 (396 mg; 2.07 mmol) 및 DIPEA (543 μL; 3.11 mmol)를 첨가하고, 혼합물을 90℃에서 6시간 동안 교반시켰다. 상기 혼합물을 건조될 때까지 농축시키고, 분취용 LC (불규칙 SiOH 15 내지 40 ㎛, 50 g 머크 (Merck), 이동상 구배: 헵탄/DCM: 80:20으로부터 0:100까지)에 의해 정제하였다. 생성물을 함유하는 분획들을 합하고, 용매를 진공에서 제거하여 224 mg의 중간체 D4를 황색 고형물로서 제공하였다 (40%).
화합물 X 및 중간체 D4로부터 출발하여 라세미 화합물 C6과 동일한 방식으로 화합물 D5을 제조하였다.
Figure pct00010
1H NMR (500 MHz, DMSO-d 6) δ ppm 1.18 (s, 3 H) 1.37 (s, 3 H) 2.26 (br d, J=15.1 Hz, 1 H) 2.57 - 2.67 (m, 1 H) 5.35 (br t, J=9.9 Hz, 1 H) 6.90 - 6.95 (m, 2 H) 7.34 (dd, J=4.9, 1.4 Hz, 1 H) 7.67-7.86 (br s, 1 H)7.88 (d, J=11.4 Hz, 1 H) 8.31 (s, 1 H) 8.36 (d, J=2.5 Hz, 1 H) 9.03 (d, J=2.2 Hz, 1 H) 12.17 (br s, 1H) 12.48 (br s, 1 H). LC-MS 질량: 실측치 [M+H]+= 484.1. Rt(min)= 2.55 (방법 A), mp℃= 280.59.
화합물 E6
Figure pct00011
중간체 E2 의 제조
tBuOK (14.5 g; 130 mmol)를 0℃에서 THF (200　mL) 중 화합물 E1 [1142927-97-6](6.28 g; 51.8 mmol) 및 18-크라운-6 (2.1 g; 7.8 mmol)의 용액에 일부씩 첨가하였다. 상기 혼합물을 0℃에서 15분 동안 교반시킨 후 요오도메탄 (9.7 mL; 156 mmol)을 서서히 첨가하였다. 상기 혼합물을 0℃에서 15분 동안, 그 후 실온에서 16시간 동안 교반시켰다. 반응 혼합물을 NH4Cl 수용액으로 켄칭하고, EtOAc (2회)로 추출하였다. 합한 유기 층을 염수로 세척하고, MgSO4로 건조시키고, 여과시키고, 진공에서 증발시켜 8 g의 조 E2를 제공하였다.
조 물질을 분취용 LC (규칙 SiOH 30 ㎛, 300 g 인터킴, 건식 로딩 (실리카에), 이동상 구배: 헵탄/EtOAc: 80:20으로부터 0:100까지)에 의해 정제하여 6 g의 중간체 E2를 무색 오일 (78%)로서 제공하였다.
중간체 E3 의 제조
THF (65 mL) 중 활성화 Zn (10.5 g; 161 mmol) 및 메탄술폰산 (800 μL; 12.3 mmol)의 현탁물을 환류 하에 15분 동안 가열하고, 그 후 THF (15 mL) 중 중간체 E2 (4.8 g; 32.2 mmol)를 첨가하였다. 그 후, THF (50 mL) 중 에틸브로모아세테이트 (10.7 mL; 96.7 mmol)를 45분에 걸쳐 적가하였다. 상기 혼합물을 환류에서 1시간 동안 교반시키고, 그 후 실온까지 냉각시키고, 그 후 NaHCO3 포화 수용액으로 처리하고, 셀라이트의 패드를 통해 여과시키고, EtOAc로 세척하였다. 층들을 분리하였다. 유기 층을 염수로 세척하고, MgSO4로 건조시키고, 여과시키고, 진공에서 농축시키고, 분취용 LC (규칙 SiOH 30 ㎛, 300 g, 인터킴, 건식 로딩 (실리카에), 이동상 구배: 헵탄/EtOAc: 80/20으로부터 50/50까지)에 의해 정제하여 6.37 g의 중간체 E3을 무색 오일 (83%)로서 제공하였다.
중간체 E4 의 제조
NaBH3CN (1.86 g; 29.6 mmol)을 MeOH (80 mL) 및 AcOH (15 mL) 중 중간체 E3 (2.94 g; 12.4 mmol)의 용액에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 56시간 동안 교반시켰다. 상기 혼합물을 물의 첨가에 의해 켄칭하고, 용매를 진공에서 증발시켰다. 생성된 혼합물을 pH=10 내지 14가 될 때까지 NaOH (1 N) 용액의 첨가에 의해 염기성화하고, 그 후 DCM (2회)으로 추출하였다. 합한 유기 층을 염수로 세척하고, MgSO4로 건조시키고, 여과시키고, 진공에서 농축시켜 2.9 g의 조 E4를 제공하였다.
조 물질을 분취용 LC (규칙 SiOH 15 내지 30 ㎛, 80 g 인터킴, 이동상 구배: DCM/MeOH: 100/0으로부터 90/10까지)에 의해 정제하여 2.09 g의 중간체 E4를 무색 오일로서 제공하였다 (70%).
중간체 E5 의 제조
THF (10 mL) 및 EtOH (10 mL) 중 2,6-디클로로-3 시아노-5 플루오로피리딘 (851 mg; 4.46 mmol), DIPEA (3.9 mL; 22.3　mmol), 중간체 E4 (1 g; 4.18 mmol)를 밀봉 튜브에서 90℃에서 16시간 동안 가열하였다. 용매들을 증발시켰다. 물을 첨가하였다. 수성 층을 DCM (3회)으로 추출하였다. 유기 층을 MgSO4로 건조시키고, 여과시키고, 진공에서 증발시키고, 분취용 LC (불규칙 SiOH 15 내지 40 ㎛, 50 g 머크, 건식 로딩 (SiOH에), 이동상 구배: 헵탄/EtOAc: 90/10으로부터 50/50까지)에 의해 정제하여 843 mg의 중간체 E5를 검으로서 제공하였다 (48%).
화합물 E6
화합물 X 및 중간체 E5로부터 출발하여 라세미 화합물 C6과 동일한 방식으로 화합물 E6을 제조하였다.
Figure pct00012
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ ppm 1.16 (s, 3 H) 1.26 (s, 3 H) 2.35- 2.56 (m, 2 H) 3.73 (s, 3 H) 5.24 (br t, J=9.4 Hz, 1 H) 6.06 (d, J=2.0 Hz, 1 H) 7.46-7.60 (m, 1 H) 7.53 (d, J=1.5 Hz, 1 H) 7.85 (d, J=11.1 Hz, 1 H) 8.31 (br s, 1 H) 8.34 (d, J=2.5 Hz, 1 H) 9.03 (d, J=2.5 Hz, 1 H) 12.07 (br s, 1 H) 12.45 (br s, 1 H). LC-MS 질량: 실측치 [M+H]+= 484.1. Rt(min)= 2.55 (방법 A), mp℃= 288.09.
화합물 F6
Figure pct00013
중간체 F2 의 제조
건조 THF (10 mL) 중 활성화 Zn (1.41 g; 21.6 mmol) 및 메탄술폰산 (107 μL; 1.65 mmol)의 현탁물을 환류 하에 15분 동안 가열하고, 그 후 건조 THF (5 mL) 중 중간체 F1 [856659-63-7] (930 mg; 4.32 mmol)을 첨가하였다. 그 후, 건조 THF (5 mL) 중 에틸브로모아세테이트 (1.4 mL; 13.0 mmol)를 10분에 걸쳐 적가하였다. 상기 혼합물을 환류에서 1시간 동안 교반시키고, 그 후 실온까지 냉각시키고, 그 후 NaHCO3 포화 수용액으로 처리하고, 셀라이트의 패드를 통해 여과시키고, EtOAc로 세척하였다. 층들을 분리하였다. 유기 층을 염수로 세척하고, MgSO4로 건조시키고, 여과시키고, 진공에서 농축시키고, 분취용 LC (불규칙 SiOH 15 내지 40 μm, 40 g, 그레이스, 건식 로딩 (SiOH에), 이동상 구배: 헵탄/EtOAc: 90/10으로부터 50/50까지)에 의해 정제하여 672 mg의 중간체 F2를 무색 오일로서 제공하였다 (51%).
중간체 F3/F3' 의 제조
MeOH (20 mL) 중 CPME (2.2 mL; 6.62 mmol) 중 HCl [3 M] 및 중간체 F2 (670 mg; 2.21 mmol)의 혼합물을 실온에서 56시간 동안 교반시켰다. 상기 혼합물을 건조될 때까지 증발시켜 잔사를 제공하고, 이를 Et2O 및 펜탄으로 녹이고, 용매들을 증발시켜 무색 오일로서의 중간체 F3 및 F3'의 혼합물 (70/30) 510 mg을 제공하였다 (98%).
중간체 F4/F4' 의 제조
THF (6.4 mL) 및 EtOH (6.4 mL) 중 2,6-디클로로-3 시아노-5 플루오로피리딘 (457 mg; 2.39 mmol), DIPEA (2.1 mL; 12.0　mmol), 중간체 F3/ F3' (510 mg; 2.56 mmol)를 밀봉 튜브에서 90℃에서 2시간 동안 가열하였다. 용매들을 증발시켰다. EtOAc를 첨가하고, 생성된 용액을 물로 2회 세척하였다. 유기 층을 MgSO4로 건조시키고, 여과시키고, 증발시키고, 분취용 LC (규칙 SiOH 30 ㎛, 25 g 인터킴, 이동상 구배: 헵탄/EtOAc: 90/10으로부터 50/50까지)에 의해 정제하여 304 mg의 중간체 F4를 황색 고형물로서 제공하고 (36%) 76 mg의 중간체 F4'를 황색 오일로서 제공하였다 (9%).
화합물 F5
화합물 X 및 중간체 F4/F4'의 혼합물로부터 출발하여 라세미 화합물 C6과 동일한 방식으로 화합물 F5를 제조하였다.
Figure pct00014
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ ppm 0.84 (s, 3 H) 0.89 (s, 3 H) 2.05 (br d, J=7.6 Hz, 2 H) 2.56 - 2.74 (m, 2 H) 4.88 - 4.99 (m, 3 H) 5.82 (m, 1 H) 7.52 (br d, J=7.6 Hz, 1 H) 7.84 (d, J=11.1 Hz, 1 H) 8.32 (d, J=3.0 Hz, 1H) 8.33 (t, J=3.0 Hz, 1 H) 8.97 (d, J=2.0　Hz, 1 H) 12.09 (br s, 1 H) 12.45 (br s, 1 H). LC-MS 질량: 실측치 [M+H]+= 442.1. Rt(min)= 2.60 (방법 A), mp℃= 257.3 및 263.62.
화합물 G6
Figure pct00015
중간체 G2 의 제조
tBuOK (4.74 g, 42.3 mmol)를 0℃에서 THF (65 mL) 중 화합물 G1 [101010-74-6] (2.10 g, 16.9 mmol)의 용액에 첨가하였다. 18-크라운-6 (0.670 g, 2.50 mmol)을 상기 혼합물에 첨가하였다. 상기 혼합물을 0℃에서 15분 동안 교반시키고, 요오도메탄 (2.57 mL, 50.7 mmol)을 0℃에서 적가하였다. 반응 혼합물을 0℃에서 15분 동안, 그 후 실온에서 하룻밤 교반시켰다. NH4Cl의 포화 수용액을 첨가하였다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트 (2x150 mL)로 추출하고, Na2SO4로 건조시키고, 여과시키고, 감압 하에 농축시켰다. 잔사를 분취용 LC (불규칙 SiOH, 40 내지 63 ㎛, 플루카, 액체 로딩 (DCM), 이동상: 시클로헥산/EtOAc 구배: 90/10으로부터 70/30까지)에 의해 정제하여 1.64 g의 중간체 G2를 황색 액체로서 제공하였다 (64%).
중간체 G3 의 제조
메탄술폰산 (0.260 mL, 4.00 mmol)을 실온에서 THF (24 mL) 중 활성화 Zn (3.43 g, 52.5 mmol)의 현탁물에 첨가하였다. 반응 혼합물을 환류에서 15분 동안 교반시키고, THF (8　mL) 중 중간체 G2 (1.60 g, 10.5 mmol)의 용액을 첨가하였다. 그 후, THF (16 mL) 중 에틸브로모아세테이트 (3.50 mL, 31.5 mmol)의 용액을 환류에서 적가하였다. 반응 혼합물을 환류에서 1시간 동안 교반시켰다. 포화 NaHCO3 수용액을 첨가하고, 혼합물을 셀라이트에서 여과시켰다. 여과액을 에틸 아세테이트 (2x15 mL)로 추출하고, Na2SO4로 건조시키고, 여과시키고, 감압 하에 농축시키고, 잔사를 분취용 LC (불규칙 SiOH, 40 내지 63 ㎛, 플루카, 액체 로딩 (DCM), 이동상: 시클로헥산/EtOAc (8/2))에 의해 정제하여 1.90 g의 중간체 G3을 무색 액체로서 제공하였다 (75%).
중간체 G4 의 제조
MeOH (73 mL) 및 AcOH (20.5 mL) 중 중간체 G3 (1.89 g; 7.86 mmol)의 용액에 상업적인 THF 중 1 M NaBH3CN 용액 (18.9 mL; 18.9　mmol)을 적가하였다 (실온에서).반응 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반시켰다. 상기 혼합물을 건조될 때까지 증발시키고, 잔사를 톨루엔과 함께 공동 증발시켜 백색 검을 제공하였다. 그 후, 잔사를 물에 녹이고, NaOH (1 M) 수용액을 첨가하고, 수성 층을 DCM (3x)으로 추출하였다. 합한 유기 층을 MgSO4로 건조시키고, 농축시켜 1.7 g의 조 G4를 제공하였다.
오일을 분취용 LC (불규칙 SiOH 15 내지 40 ㎛, 50 g 머크, 이동상 구배: DCM/MeOH:100/0으로부터 90/10까지)에 의해 정제하여 583 mg의 중간체 G4를 무색 오일로서 제공하였다 (31%).
중간체 G5 의 제조
THF (6 mL) 및 EtOH (6 mL) 중 2,6-디클로로-3 시아노-5 플루오로피리딘 (429 mg; 2.24 mmol), DIPEA (2 mL; 11.4　mmol), 중간체 G4 (582 mg; 2.40 mmol)를 밀봉 튜브에서 90℃에서 2시간 동안 가열하였다. 용매들을 증발시켰다. EtOAc를 첨가하고, 생성된 혼합물을 물로 2회 세척하였다. 유기 층을 MgSO4로 건조시키고, 여과시키고, 진공에서 증발시키고, 분취용 LC (규칙 SiOH 30 ㎛, 40 g 인터킴, 이동상 구배: 헵탄/EtOAc:90/10으로부터 50/50까지)에 의해 정제하여 500 mg의 중간체 G5를 베이지색 고형물로서 제공하였다 (56%).
화합물 G6
화합물 X 및 중간체 G5로부터 출발하여 라세미 화합물 C6과 동일한 방식으로 화합물 G6을 제조하였다.
Figure pct00016
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ ppm 1.33 (s, 3 H) 1.45 (s, 3 H) 2.42 (br d, J=14.7　Hz, 1 H) 2.62 (dd, J=15.7, 11.1 Hz, 1 H) 5.45 (br t, J=9.9 Hz, 1 H) 7.58 (d, J=3.0 Hz, 1 H) 7.60 - 7.71 (m, 1 H) 7.67 (d, J=3.0 Hz, 1 H) 7.88 (d, J=11.6 Hz, 1 H) 8.31 (d, J=2.5 Hz, 1 H) 8.34 (d, J=2.0 Hz, 1 H) 9.02 (d, J=2.5 Hz, 1 H) 12.11 (br s, 1　H) 12.45 (br s, 1 H). LC-MS 질량: 실측치 [M+H]+= 485. Rt(min)= 2.24 (방법 A), mp℃= 263.9.
화합물 H2
Figure pct00017
중간체 H1의 제조
밀봉 튜브에서, THF (10 mL) 및 EtOH (10 mL) 중 2,4-디클로로-5-플루오로-피리미딘 (318 mg; 1.91 mmol), 중간체 D3 (460 mg; 1.91 mmol) 및 DIPEA (1.6 mL; 9.53 mmol)의 용액을 80℃에서 하룻밤 교반시켰다. 상기 혼합물을 건조될 때까지 증발시키고, 잔사를 EtOAc에 용해시키고, 그 후 물을 첨가하고, 층들을 분리하였다. 유기 층을 염수로 세척하고 (1회), MgSO4로 건조시키고, 여과시키고, 진공에서 농축시키고, 분취용 LC (불규칙 SiOH 15 내지 40 ㎛, 30 g 머크, 액체 로딩, 이동상 구배: 헵탄/DCM: 50:50으로부터 80:20까지)에 의해 정제하였다. 생성물을 함유하는 분획들을 합하고, 용매를 진공에서 제거하여 338 mg의 중간체 H1을 황색 고형물로서 제공하였다 (48%).
화합물 H2
최종 비누화를 실온에서 EtOH/H2O 혼합물 중 KOH (10 당량)를 이용하여 수행한 것을 제외하고는, 화합물 X 및 중간체 H1로부터 출발하여 라세미 화합물 C6과 동일한 방식으로 화합물 H2를 제조하였다.
Figure pct00018
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ ppm 1.31 (s, 3 H) 1.41 (s, 3 H) 2.25 (br d, J=16.7　Hz, 1 H) 2.50 (m, 1 H) 5.12 - 5.32 (m, 1 H) 6.97 (m, 1 H) 7.04 (m, 1 H) 7.30-7.96 (m, 1 H)7.39 (d, J=5.1 Hz, 1 H) 8.16 (d, J=3.5 Hz 1 H) 8.19 (s, 1H) 8.30 (d, J=2.5 Hz, 1 H) 8.93 (s, 1 H) 12.04 (br s, 1 H) 12.31 (br s, 1 H). LC-MS 질량: 실측치 [M+H]+= 460. Rt(min)= 2.36 (방법 A), mp℃= 175.6 및 228.74.
화합물 I3의 합성
Figure pct00019
중간체 I1 의 제조
THF (3.0 mL) 및 EtOH (3.0 mL) 중 2,6-디클로로-3 시아노-5 플루오로피리딘 (0.23 g; 1.2 mmol), 디이소프로필에틸아민 (1.1 mL; 6.1 mmol), 에틸 3-아미노-4-메톡시-4-메틸펜타노에이트 (CAS [1878209-66-5], 0.23 g; 1.2 mmol)를 밀봉 튜브에서 90℃에서 18시간 동안 가열하였다. EtOAc를 첨가하고 염수로 2회 세척하였다. 유기 층을 MgSO4로 건조시키고, 여과시키고, 진공에서 증발시켜 무색 오일을 제공하였다.
이것을 분취용 LC (규칙 SiOH 30 ㎛, 24 g, 이동상 구배: 헵탄/AcOEt: 80/20으로부터 70/30까지)에 의해 정제하여 0.195 g의 중간체 I1을 백색 고형물로서 제공하였다 (47%).
중간체 I2 의 제조
N2 하에서, 밀봉 튜브에서, 1,4-디옥산 (2.4 mL) 및 물 (0.75 mL) 중 X (144 mg; 0.33 mmol), I1 (95 mg; 0.28 mmol) 및 탄산세슘 (0.32 g; 0.97 mmol)의 혼합물을 N2로 5분 동안 탈기시켰다. PdCl2(PPh3)2 (19 mg; 28 ㎛ol)를 첨가하고, 반응 혼합물을 다시 N2로 2분 동안 탈기시켰다. 반응 혼합물을 90℃에서 2시간 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 실온까지 냉각시켰다. DCM 및 염수를 반응 혼합물에 첨가하였다. 수성 층을 DCM으로 추출하였다. 합한 유기 층을 세척하고, MgSO4로 건조시키고, 여과 제거하고, 건조될 때까지 농축시켜 조 화합물을 생성하였다. 이것을 분취용 LC (규칙 SiOH 30 ㎛, 12 g, 건식 로딩, 이동상 구배: 헵탄/EtOAc: 90/10으로부터 70/30까지)에 의해 정제하여 81 mg의 중간체 I2를 백색 고형물로서 제공하였다 (48%).
화합물 I3 의 제조
물 (0.25 mL) 중 수산화리튬 1수화물 (28 mg, 0.66 mmol)의 용액을 THF (0.73 mL) 중 I2 (81 mg, 0.13 mmol)의 혼합물에 첨가하였다. 상기 혼합물을 60℃에서 18시간 동안 교반시켰다.
상기 용액을 진공에서 증발시키고, 분취용 LC (규칙 SiOH 30 ㎛, 12 g, 이동상 구배: DCM/MeOH/아세트산: 99/1/0.1로부터 95/5/0.5까지)에 의해 정제하여, 증발 후 분획을 제공하고, 이를 MeCN/H2O에서 동결 건조시켜 37 mg의 화합물 I3을 백색 고형물로서 제공하였다 (65%, m.p.=275℃).
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 1.07 (s, 3 H) 1.12 (s, 3 H) 2.61 - 2.72 (m, 2 H) 3.15 (s, 3 H) 5.14 (dt, J=9.6; 2.0 Hz, 1 H) 7.57 (br d, J=8.6 Hz, 1 H) 7.86 (d, J=11.1 Hz, 1 H) 8.31 (s, 1H) 8.32 (s, 1 H) 8.97 (d, J=2.0 Hz, 1 H) 11.7-12.4 (m, 1 H) 12.45 (br s, 1 H)
화합물 J3의 합성
Figure pct00020
중간체 J1 의 제조
THF (13 mL) 및 EtOH (13 mL) 중 2,6-디클로로-3 시아노-5 플루오로피리딘 (1 g; 5.24 mmol), 디이소프로필에틸아민 (4.5 mL; 26.2 mmol), 에틸 3-아미노-4,4-디메틸펜타노에이트 (CAS [197904-09-9], 1.09 g; 6.28 mmol)를 밀봉 튜브에서 90℃에서 18시간 동안 가열하였다. EtOAc를 첨가하고 염수로 2회 세척하였다. 유기 층을 MgSO4로 건조시키고, 여과시키고, 진공에서 증발시켜 2.4 g을 황색 오일로서 제공하였다. 이것을 분취용 LC (불규칙 SiOH 15 내지 40 ㎛, 80 g 그레이스, 건식 로딩 (SiOH에), 이동상 구배: 헵탄/EtOAc: 95/5으로부터 50/50까지)에 의해 정제하여 1.33 g의 중간체 J1을 황색 고형물로서 제공하였다 (77%).
중간체 J2 의 제조
N2 하에서, 밀봉 튜브에서, 1,4-디옥산 (11 mL) 및 물 (3 mL) 중 X (250 mg; 0.578 mmol), J1 (246 mg; 0.751 mmol) 및 탄산세슘 (0.659 g; 2.02 mmol)의 혼합물을 N2로 5분 동안 탈기시켰다. PdCl2(PPh3)2 (41 mg; 58 ㎛ol)를 첨가하고, 반응 혼합물을 다시 N2로 2분 동안 탈기시켰다. 반응 혼합물을 90℃에서 1시간 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 실온까지 냉각시켰다. DCM 및 염수를 반응 혼합물에 첨가하였다. 수성 층을 DCM으로 추출하였다. 합한 유기 층을 세척하고, MgSO4로 건조시키고, 여과 제거하고, 건조될 때까지 농축시켜 조 화합물을 생성하였다. 이것을 분취용 LC (불규칙 SiOH 15 내지 40 ㎛, 10 g, 건식 로딩 (SiOH에), 이동상 구배: 헵탄/EtOAc: 95/5으로부터 70/30까지)에 의해 정제하여 142 mg의 중간체 J2를 옅은 녹색의 고형물로서 제공하였다 (41%).
화합물 J3 의 제조
물 (3.7 mL) 중 J2 (142 mg; 237 ㎛ol)의 용액에 H2O 중 3 M 수산화나트륨 (475 μL; 1.42 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반시켰다. 용매를 진공에서 증발시키고, 잔사를 물에 녹였다. HCl (1 N) 수성 용액을 pH=1이 될 때까지 첨가하였다. 형성된 침전물을 여과 제거하고, 물로 세척하고, 진공 하에 건조시켜 69 mg의 베이지색 고형물을 생성하였다.
이것을 MeOH/H2O/DMSO (5/2/3 mL)로 미분화하고, 초음파 처리하였다. 침전물을 여과시켜 43 mg의 화합물 J3을 제공하였다 (44%, ).
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ ppm 0.93 (s, 9 H) 2.53 - 2.71 (m, 2 H) 4.84 (br t, J=9.5 Hz, 1 H) 7.59 (br s, 1 H) 7.83 (d, J=11.4 Hz, 1 H) 8.33 (s, 1H) 8.36 (s, 1 H) 8.99 (s, 1 H) 12.07 (br s, 1 H) 12.47 (br s, 1 H)
일반적 절차
고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 측정은 LC 펌프, 다이오드-어레이(DAD) 또는 UV 검출기 및 각각의 방법에 명시된 컬럼을 사용하여 수행하였다. 필요할 경우, 추가의 검출기를 포함시켰다(하기의 방법에 대한 표를 참조).
컬럼으로부터의 유동물을 대기압 이온 공급원과 함께 구성된 질량 분광계(MS)로 가져왔다. 화합물의 명목상 단일 동위 원소 분자량(MW)의 확인을 허용하는 이온을 얻기 위하여 조정 파라미터(예를 들어, 스캐닝 범위, 드웰(dwell) 시간...)을 설정하는 것은 당업자의 지식 이내이다. 적절한 소프트웨어를 사용하여 데이터 획득을 수행하였다.
화합물은 그의 실험적 체류 시간(Rt) 및 이온에 의해 기술된다. 데이터의 표에 상이하게 명시되어 있지 않다면, 보고된 분자 이온은 [M+H]+(양성자화된 분자) 및/또는 [M-H]-(탈양성자화된 분자)에 상응한다. 화합물이 직접적으로 이온화 가능하지 않은 경우, 부가물의 유형이 명시된다(즉, [M+NH4]+, [M+HCOO]- 등). 다수의 동위원소 패턴을 갖는 분자(Br, Cl..)에 있어서, 보고된 값은 최저 동위원소 질량에 대하여 얻어진 것이다. 모든 결과는 사용된 방법과 일반적으로 연관되어 있는 실험적 불확실성을 가지고서 얻어졌다.
이하에서, "SQD"는 단일 사중극자 검출기(Single Quadrupole Detector), "RT"는 실온, "BEH"는 가교된 에틸실록산/실리카 하이브리드(bridged ethylsiloxane/silica hybrid), "HSS"는 고강도 실리카, "DAD"는 다이오드 어레이 검출기를 의미한다.
[표]
Figure pct00021
화학식 I의 화합물의 생물학적 활성
세포-기반 항바이러스 분석을 사용하여 화합물의 시험관 내(in vitro) 항바이러스 활성을 결정하였다. 이 분석에서는, A형 인플루엔자 바이러스/타이완(Taiwan)/1/86(H1N1)에 의해 감염된 마딘-다비 개 신장(Madin-Darby canine kidney, MDCK) 세포에서의 세포변성 효과(cytopathic effect, CPE)를 화합물의 존재 또는 부재 하에서 모니터링하였다. 백색의 384웰 마이크로타이터(microtiter) 분석 플레이트(그라이너(Greiner))를 에코 액체 핸들러(echo liquid handler)(미국 캘리포니아주 서니베일 소재의 랩사이트(Labcyte))를 사용하여 음향 액적 분사(acoustic drop ejection)를 통해 충전하였다. 200 나노리터의 화합물 스톡 용액(100% DMSO)을 분석 플레이트로 옮겼다. MDCK 세포를 25,000 또는 6,000개의 세포/웰의 최종 밀도로 플레이트에 분배하였다. 그 후, A형 인플루엔자/타이완/1/86(H1N1) 바이러스를 각각 0.001 또는 0.01의 감염 다중도로 첨가하였다. 웰은 부피당 0.5% DMSO를 포함한다. 바이러스- 및 모의(mock)-감염된 대조구를 각각의 테스트에 포함시켰다. 플레이트를 5% CO2에서 37℃에서 인큐베이션하였다. 바이러스 노출 3일 후, ATPlite™ 키트(벨기에 자벤템 소재의 퍼킨엘머(PerkinElmer))를 제조업체의 사용설명서에 따라 사용하여 ATP 수준의 감소를 측정함으로써 세포변성 효과를 정량화하였다. IC50을 50% 억제 농도로 정의하였다. 이와 동시에, 백색 384웰 마이크로타이터 플레이트에서 3일 동안 화합물을 인큐베이션하고, MDCK 세포에서의 화합물의 시험관 내 세포독성을, ATPlite™ 키트(벨기에 자벤템 소재의 퍼킨엘머)를 제조업체의 사용설명서에 따라 사용하여 세포의 ATP 함량을 측정함으로써 결정하였다. 세포독성은 세포 생존력의 50% 감소를 야기하는 농도인 CC50으로 기록하였다.
Figure pct00022
Figure pct00023

Claims (9)

  1. 하기 화학식 I의 화합물, 이의 입체이성질체 형태, 제약상 허용가능한 염, 용매화물 또는 다형체:
    [화학식 I]
    Figure pct00024

    (여기서,
    Y는 N이며, X는 C이며, R1은 할로겐이며, R2는 CN이며, R3은 Het 또는 C2- 6알켄이거나;
    또는
    Y는 N이며, X는 N이며, R1은 할로겐이며, R2는 H이며, R3은 Het이거나;
    또는
    Y는 N이며, X는 C 또는 N이며, Z는 C 또는 N이며, R1은 할로겐 또는 H이며, R2는 H 또는 CN이며, R3은 Het, OCH3 또는 CH3임).
  2. 제1항에 있어서, R1은 클로로 또는 플루오로이며, R3은 N, O 또는 S로부터 선택되는 하나 이상의 헤테로원자를 포함하는 복소환 (상기 복소환은 4, 5, 6 또는 7개의 고리 원자를 가질 수 있으며, C1-6 알킬로 선택적으로 치환될 수 있음)인 화합물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 하기 화학식 II 또는 화학식 III을 갖는 화합물:
    [화학식 II]
    Figure pct00025

    [화학식 III]
    Figure pct00026
    .
  4. 제1항에 따른 화학식 I, 화학식 II, 화학식 III의 화합물 또는 이의 입체이성질체 형태, 제약상 허용가능한 염, 용매화물 또는 다형체를 하나 이상의 제약상 허용가능한 부형제, 희석제 또는 담체와 함께 포함하는 제약 조성물.
  5. 약제로서 사용하기 위한, 제1항에 따른 화학식 I의 화합물 또는 이의 입체 이성질체 형태, 제약상 허용가능한 염, 용매화물 또는 다형체 또는 제4항에 따른 제약 조성물.
  6. 인플루엔자의 치료에 사용하기 위한, 제1항에 따른 화학식 I의 화합물 또는 이의 입체이성질체 형태, 제약상 허용가능한 염, 용매화물 또는 다형체, 또는 제4항에 따른 제약 조성물.
  7. 생물학적 샘플 또는 환자에서 인플루엔자 바이러스(들)의 복제를 억제하는 데 있어서의, 하기 화학식 I로 표시되는 화합물, 이의 입체이성질체 형태, 제약상 허용가능한 염, 용매화물 또는 다형체의 용도:
    [화학식 I]
    Figure pct00027

    (여기서,
    Y는 N이며, X는 C이며, R1은 할로겐이며, R2는 CN이며, R3은 Het 또는 C2- 6알켄이거나;
    또는
    Y는 N이며, X는 N이며, R1은 할로겐이며, R2는 H이며, R3은 Het이거나;
    또는
    Y는 N이며, X는 C 또는 N이며, Z는 C 또는 N이며, R1은 할로겐 또는 H이며, R2는 H 또는 CN이며, R3은 Het, OCH3 또는 CH3임).
  8. 제7항에 있어서, 추가 치료제를 공동 투여하는 것을 추가로 포함하는 용도.
  9. 제8항에 있어서, 추가 치료제가 항바이러스제 또는 인플루엔자 백신, 또는 이들 둘 다로부터 선택되는 용도.
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