KR20180099009A - 루테인을 함유하는 나노에멀전 약물전달 시스템 - Google Patents

Abstract

본 발명은 루테인을 함유하는 나노에멀전 약물전달 시스템을 이용한 안과용 조성물에 관한 것으로, 상기 나노에멀전은 10 내지 12 nm 입자크기로 수용액 상에서도 균일하게 분산되어 투명하고 안정한 액체 상태를 나타내었으며, 루테인 약물 방출이 144시간까지 유지되는 것이 확인됨에 따라, 상기 나노에멀전은 점안용 안과 조성물로 사용될 수 있으며, 본 발명에 따른 자가형성 나노에멀전은 안정성 및 루테인 용해도가 우수하였으며 이를 이용하여 제조된 루테인 고체 제형은 수용액 상에서 높은 재현성 및 지속적인 약물 방출 효과를 나타내는 것이 확인됨에 따라, 효과적인 경구용 안과 조성물로 사용될 수 있다.

Description

루테인을 함유하는 나노에멀전 약물전달 시스템{Nanoemulsion drug delivery system comprising lutein}

본 발명은 나노에멀전 약물전달 시스템을 이용한 안과용 조성물에 관한 것이다.

연령관련 황반변성(Age-related macular degeneration; AMD)은 망막상피세포, 망막 및 맥락막 모세혈관층의 점진적인 변성으로 인해 고령자들에게 돌이킬 수 없는 시력상실을 가져오는 질환이다. 지난 10년 동안 인구고령화에 의해 AMD 질환을 겪는 환자들의 수는 기하급수적으로 증가하였으며, 연령관련 황반변성을 치료하기 위해 항-혈관신생 치료 방법의 발전으로 인하여, 효과적인 실명 예방 및 시력 회복이 가능하나, 고가의 치료비용 때문에 많은 나라에서 적용되지 못하고 있다.

루테인은 자연 상태로 존재하는 카로티노이드로서, 녹황색 채소에 다량 함유되어 있다. 식품과 인간의 혈액 속에 가장 많이 존재하는 카로티노이드 중 하나인 루테인은 식물 체내에서는 항산화 효과 및 식물체를 자외선으로부터 보호하는 역할을 수행하는 것으로 알려져 있고, 인간에게는 눈의 황반 및 수정체의 주요 성분으로, 눈의 건강과 시력증진에 중요한 역할을 하는 성분으로 알려져 있다.

특히, 루테인과 그 입체 이성질체인 제아잔틴은 중심 시야를 담당하는 망막의 작은 부위인 황반에 집중되어 있으며, 시력에 가장 중요한 이 조직 내에 존재하는 유일한 카로티노이드 성분으로써, 루테인 섭취와 혈청 농도는 안구질환의 위험과 상반적인 관계가 있는 것으로 나타났다.

따라서, 루테인을 섭취하면 황반색소 광밀도가 증가하며, 기타 안구질환이 있는 환자들에게는 시각기능을 개선하는 효과가 있고, 유해 활성산소에 의해 손상된 시신경 세포의 노화 과정을 효과적으로 억제하는 것으로 인정받고 있으며, 백내장이나 연령관련 황반변성과 같은 안구질환의 발생율과도 직접적인 관계가 있다.

이러한 루테인은 체내에서 자연적으로 생성하지 못하기 때문에 음식물이나 보충제 등을 통해 외부로부터 섭취해야 하는 데, 난용성 물질인 루테인은 물에 잘 용해되지 않아 생체 이용도가 낮은 문제점이 있다.

루테인과 같은 난용성 약물의 체내 흡수율 증진을 위한 방법인 자가형성 나노에멀전 약물전달 시스템(self nanoemulsifying drug delivery system: SNEDDS)은 나노에멀전의 구성 성분 중에 수상이 제거된 액체 상태의 균일한 혼합물로서, 복용 후 위장관의 운동 하에 체액 등 수상과 만나면 기존 제형들보다 빠르게 자가 에멀전화되어 분산되므로 신속한 약물 용출을 기대할 수 있으며, 기존 나노에멀전의 단점으로 지적된 분산된 후 위장 내의 점막과 약의 접촉으로 인해 생기는 자극을 줄여줄뿐만 아니라 구성물 중에 수상이 제거된 상태로 투여되므로 제제의 부피를 줄일 수 있다는 장점이 있다.

그러나 이러한 자가형성 나노에멀전 약물전달 시스템은 액체 상태로 주로 연질 캡슐에 충진되어 사용되므로, 제조시 단가 상승과 복용 및 보관의 불편함을 야기 시킨다.

한국공개특허 제2011-0019327호(2011.02.25 공개)

본 발명은 나노에멀전 약물 전달 시스템을 이용하여 루테인의 지속적인 방출을 유도하는 점안용 안과 조성물 및 난용성 약물인 루테인의 생체이용율을 증가시키기 위한 자가형성 나노에멀전 조성물을 이용한 경구용 안과 조성물을 제공하고자 한다.

본 발명은 이소프로필 미리스테이트(Isopropyl myristate)와 에틸알콜로 이루어진 오일상; 트윈 80(Tween 80; polysorbate 80)과 트리아세틴으로 이루어진 계면활성제상; 및 수상으로 이루어진 나노에멀전 및 활성 성분인 루테인을 유효성분으로 함유하는 점안용 안과 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 이소프로필 미리스테이트 (Isopropyl myristate)와 에틸알콜로 이루어진 오일상; 트윈 80(Tween 80; polysorbate 80)과 트리아세틴으로 이루어진 계면활성제상; 및 플루로닉 F127를 유효성분으로 함유하는 보조계면활성제상으로 이루어진 자가형성 나노에멀전 및 활성 성분인 루테인을 유효성분으로 함유하는 경구용 안과 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 나노에멀전은 10 내지 12 nm 입자크기로 수용액 상에서도 균일하게 분산되어 투명하고 안정한 액체 상태를 나타내었으며, 루테인 약물 방출이 144시간까지 유지되는 것이 확인됨에 따라, 상기 나노에멀전은 점안용 안과 조성물로 사용될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 자가형성 나노에멀전은 안정성 및 루테인 용해도가 우수하였으며 이를 이용하여 제조된 루테인 고체 제형은 수용액 상에서 높은 재현성 및 지속적인 약물 방출 효과를 나타내는 것이 확인됨에 따라, 효과적인 경구용 안과 조성물로 사용될 수 있다.

도 1은 다양한 오일(a) 및 계면활성제(b) 내 루테인 용해성을 확인한 결과이다(n = 3).
도 2는 나노에멀전의 슈도터너리 상평형도(Pseudo-ternary phase diagram)(a) 및 나노에멀전 제제의 광학이미지(b)로, 상태도 광 및 암 영역은 혼합물의 투명 및 불투명 부분을 각각 나타내며, 각 포인트는 선택된 제제를 나타낸 것이다.
도 3은 나노에멀전의 초분광 영상을 확인한 결과로, (a) NE-2, (b) NE-4, (c) NE-5 및 (d) NE-8 제제의 초분광 이미지이다.
도 4는 루테인이 함유된 나노에멀전의 특징을 확인한 결과로, 도 4(a)의 적색 그래프는 선택된 제제 내 루테인의 용해성을 확인한 결과이며, 회색 그래프는 루테인이 함유된 나노에멀전의 불투명성을 확인한 결과이며, 도 4(b)는 루테인이 함유된 나노에멀전의 광학이미지이다.
도 5는 루테인이 함유된 나노에멀전의 특징을 확인한 결과로, 도 5(a)는 루테인이 함유된 나노에멀전의 크기 분포를 확인한 DLS 결과이며, 도 5(b)는 일주일간 25℃에서 나노에멀전의 안정성을 확인한 결과이다.
도 6은 루테인이 함유된 NE-5 (□) 및 NE-8 (■) 나노에멀전과 대두유(●) 및 전분(○) 현탁액의 누적 방출 프로파일 결과이다(n=3).
도 7은 경구용 자가형성 나노에멀전 약물전달 시스템 제조를 위해 다양한 오일(a) 및 계면활성제(b) 내 루테인 용해성을 확인한 결과이다(n = 3).
도 8은 경구용 자가형성 나노에멀전 나노에멀전의 슈도터너리 상평형도(Pseudo-ternary phase diagram)(a) 및 나노에멀전 제제의 광학이미지(b)로, 상태도 광 및 암 영역은 혼합물의 투명 및 불투명 부분을 각각 나타내며, 각 포인트는 선택된 제제를 나타낸 것이다.
도 9는 루테인이 함유된 경구용 나노에멀전의 특징을 확인한 결과로, 적색 그래프는 선택된 제제 내 루테인의 용해성을 확인한 결과이며, 회색 그래프는 루테인이 함유된 나노에멀전의 불투명성을 나타낸 결과이다.
도 10은 루테인이 함유된 경구용 나노에멀전의 특징을 확인한 결과로, 도 10(a)는 루테인이 함유된 나노에멀전의 크기 분포를 확인한 DLS 결과이며, 도 10(b)는 일주일간 25℃에서 나노에멀전의 안정성을 확인한 결과이다.
도 11은 표 5와 같은 조성으로 제조된 에멀전을 고형화시켜 습식 과립으로 제조된 시료들로 좌측은 루테인이 포함되지 않은 Blank 에멀전, 20% 및 40% L-HPC (Low-Substituted Hydroxypropyl Cellulose)시료이며, 우측은 L-HPC 0%와 루테인 6.15mg, L-HPC와 루테인 20% 및 L-HPC 40%와 루테인 4.1mg을 포함시켜 제조한 습식 과립 조성물을 확인한 결과이다.
도 12는 다양한 혼합비로 구성된 부형제로 제조된 습식과립의 용출율을 패들(Paddle)법을 이용하여 시간 경과에 따라 확인한 결과이다.
도 13은 루테인이 함유된 경구용 나노에멀전의 크기 분포를 확인한 DLS 결과이다.

본 발명은 이소프로필 미리스테이트(Isopropyl myristate)와 에틸알콜로 이루어진 오일상; 트윈 80(Tween 80; polysorbate 80)과 트리아세틴으로 이루어진 계면활성제상; 및 수상으로 이루어진 나노에멀전 및 활성 성분인 루테인을 유효성분으로 함유하는 점안용 안과 조성물을 제공할 수 있다.

보다 상세하게 상기 오일상은 이소프로필 미리스테이트 (Isopropyl myristate) 오일과 에틸알콜이 1:4 부피비로 혼합된 것일 수 있다.

또한, 상기 계면활성제상은 트윈 80(Tween 80; polysorbate 80)과 트리아세틴이 3:1 중량비로 혼합된 것일 수 있다.

상기 나노에멀전은 나노에멀전 총 100 중량부에 대하여, 오일상 1 내지 10 중량부, 계면활성제상 10 내지 20 중량부 및 수상 70 내지 90 중량부로 포함될 수 있다.

보다 상세하게 나노에멀전의 오일상이 상기 함량 범위 이하일 경우 약물의 봉입률이 저하되는 문제점이 야기될 수 있으며, 상기 함량 범위 이상일 경우 투여 후 제형의 안정성이 감소되고 염증반응 및 시야 방해와 같은 문제점이 야기될 수 있며, 나노에멀전의 계면활성제상이 상기 함량 범위 이하일 경우 제형의 안정성 저하 및 상 분리 문제점이 야기될 수 있으며, 상기 함량 범위 이상일 경우 염증 반응 및 시야 방해 문제점이 야기될 수 있다.

또한, 상기 안구 점안용 조성물은 조성물 총 100 중량부에 대하여, 나노에멀전 99.99 내지 99.9 중량부 및 루테인 0.01 내지 0.1 중량부를 포함할 수 있다.

각막 내에서 약물의 지속적인 방출은 눈 속 깊은 층까지 효과적인 약물 투과를 가능하게 하므로, 나노에멀전의 우수한 용해 활성 및 약물의 지속적인 방출은 적은 용량으로 전신 및 눈에 부작용 없이 치료 효과를 높일 수 있다.

이에 따라 본 발명의 나노에멀전 제제, 대조군인 대두유 및 전분 현탁액으로부터 루테인의 in vitro 누적 방출 프로필을 확인하였다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 도 6과 같이 오일상을 2%로 고정시킨 NE-5 제제와 오일상을 1%로 최소화시킨 NE-8 제제에 함유된 루테인의 40%가 처음 24시간 내에 지속적으로 방출되어 144시간째 약물의 방출량 백분율은 각각 66.3 ± 13.2 및 57.4 ± 13.1로 나타났으며 침전물은 관찰되지 않았다. 특히, NE-5 및 NE-8 나노에멀전의 루테인 방출율은 144시간 후 안정기에 도달한 반면, 현탁액 내 루테인은 6% 이하로 제한적인 방출이 나타나는 것을 확인할 수 있었다.

상기 결과로부터 본 발명의 나노에멀전은 매우 우수한 안정성 및 개선된 루테인 방출 효율을 나타내는 것이 확인됨에 따라, 상기 나노에멀전을 이용한 루테인 제제는 효과적인 점안용 안과 조성물로 사용될 수 있다.

본 발명은 이소프로필 미리스테이트 (Isopropyl myristate)와 에틸알콜로 이루어진 오일상; 트윈 80(Tween 80; polysorbate 80)과 트리아세틴으로 이루어진 계면활성제상; 및 플루로닉 F127를 유효성분으로 함유하는 보조계면활성제상으로 이루어진 자가형성 나노에멀전 및 활성 성분인 루테인을 유효성분으로 함유하는 경구용 안과 조성물을 제공할 수 있다.

보다 상세하게는 상기 오일상은 이소프로필 미리스테이트 (Isopropyl myristate) 오일과 에틸알콜이 1:4 부피비로 혼합된 것일 수 있다.

또한, 상기 계면활성제상은 트윈 80(Tween 80; polysorbate 80)과 트리아세틴이 3:1 중량비로 혼합된 것일 수 있다.

또한, 상기 보조계면활성제상은 증류수에 플루로닉 F127를 10 내지 30 중량%로 용해시킨 것일 수 있다.

상기 자가형성 나노에멀전은 나노에멀전 총 100 중량부에 대하여, 오일상 1 내지 40 중량부, 계면활성제상 20 내지 40 중량부 및 보조계면활성제상 20 내지 70 중량부를 포함할 수 있다.

보다 상세하게 자가형성 나노에멀전의 오일상이 상기 함량 범위 이하일 경우 약물의 봉입률이 저하되는 문제점이 야기될 수 있으며, 상기 함량 범위 이상일 경우 투여 후 안정성이 불안정하게 되어 침전물이 발생하는 문제점이 야기될 수 있으며, 자가형성 나노에멀전의 계면활성제상이 상기 함량 범위 이하일 경우 제형의 안정성 저하 및 상 분리와 같은 문제점이 야기될 수 있으며, 상기 함량 범위 이상일 경우 위장 장애가 야기될 수 있다.

또한, 보조계면활성제상이 상기 함량 범위 이하일 경우, 제형의 안정성 저하 및 상 분리 문제점이 야기될 수 있으며, 상기 함량 범위 이상일 경우 위장 장애가 나타날 수 있다.

상기 경구용 안과 조성물은 조성물 총 100 중량부에 대하여, 자가형성 나노에멀전 99.99 내지 99 중량부 및 루테인 0.01 내지 1 중량부를 포함할 수 있다.

또한, 상기 경구용 안과 조성물은 에어로실(Aerosil) 및 저치환된 히드록시프로필 셀룰로오스(Low-Substituted Hydroxypropyl Cellulose; L-HPC)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 추가로 더 포함할 수 있다.

상기 경구용 안과 조성물은 정제, 캡슐제, 과립제, 산제, 환제 및 건조시럽제로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 제형일 수 있다.

본 발명의 다른 일실시예에 따르면, 상기 자가형성 나노에멀전과 에어로실 200 (Silicon oxide)과 L-HPC (Low-Substituted Hydroxypropyl Cellulose)를 이용하여 루테인이 함유된 습식과립을 제조하고, 상기 과립의 루테인 용출율을 제2 용출용액(대한약전, pH6.8)에서 용출 제2법(Paddle법, 대한약전)을 이용하여 확인한 결과, 도 12와 같이 에어로실 200에 L-HPC 40%로 혼합된 부형제에서 루테인 용출율이 가장 우수한 것으로 나타났다.

또한, 고형화된 에멀전을 수상에서 재분산시킨 후 나타나는 재현성을 확인한 결과, 도 12 및 표 6과 같이 모든 조성의 부형제에서 직경기준 10nm 크기의 매우 미세한 에멀전의 액적 상태를 확인할 수 있었으며, 상기 에멀전들은 매우 우수한 재현성을 나타내는 것이 확인됨에 따라, 상기 자가형성 나노에멀전을 이용한 루테인 제제는 효과적인 경구 투여용 안과 조성물로 사용될 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

< 참조예 1> 물질

식품 등급의 80% 루테인(Lutein)를 Xhengsheng Kangyuang Biomedical Co. (Xianyang, China)에서 구입하였으며, 루테인 분석용 표준 및 크로톤(Croton) 오일을 Sigma-Aldrich에서 구입하였다. 이소프로필 미리스테이트 (Isopropyl myristate; IPM), 트리아세틴(Triacetin), 트윈 80(Tween 80; polysorbate 80), 에틸 알콜(Ethyl alcohol) 100%, 올리브 오일 및 대두유를 Samchun Co. (Seoul, Korea)에서 구입하였다.

피세올(Peceol), 라우로글리콜 90(Laurogylcol 90), 라브라솔(Labrasol), 라우로글리콜 FCC, 라브라필 M 1944 CS를 Gattefosse(France)에서 제공받았으며, 모든 화합물은 분석용 등급으로 사용되었다.

< 참조예 2> High-performance liquid chromatography ( HPLC )

자동 샘플러, 고압력 기울기용리 펌프 및 UV 검출기가 구비된 HPLC (Agilent 1200 series, Agilent Tech., USA)를 이용하여 루테인을 정량하였다.

역상 Spherisorb ODS 2 컬럼(250×4.6mm i.d., pore size 5μm, Waters corp., USA)을 이용하였으며, 아세토나이트릴과 메탄올(70:30, v/v %) 혼합물로 구성된 이동상을 등용매적으로 흘려주었다.

루테인의 머무름 시간은 6.7분이었으며, 1.0 ml/min 유속과 컬럼 건조 온도는 30℃로 유지시켰다.

446nm에서 컬럼 용출액을 검출하고 표준 루테인 용액의 선형 표준화 곡선을 이용하여 루테인 농도를 계산하였다.

< 실시예 1> 안과용 나노에멀전 조성 확인

1. 나노에멀전 제조를 위한 부형제 스크리닝

오일 및 계면활성제에서 우수한 약물 용해성을 나타내는 나노에멀전을 제조하기 위해 성분 스크리닝을 수행하였다.

다양한 오일, 계면활성제 및 보조계면활성제 내에서 루테인 용해성을 확인하기 위해 각 부형제 1ml에 과량의 루테인을 첨가한 후 30분간 교반하고 15분간 초음파 처리하였다.

25℃에서 6시간 인큐베이션 후, 0.45 μm PVDF 막 필터를 이용하여 루테인 용액 내 용해되지 않은 루테인을 제거하고 HPLC (Agilent Tech. co, USA)를 이용하여 각 부형제 내 루테인 농도를 확인하였다.

나노에멀전 시스템 안정성을 위해, 조용매로 에탄올을 사용하였다. 조용매는 수용액상과 오일상 사이에서 변형된 계면활성제를 분할하는 기능을 하고 겔, 침전물 및 액정과 같은 경질 구조를 제거하여 나노에멀전을 안정화시키는 역할을 한다(Szumala 2015).

다양한 알콜 중 탄소 체인 길이가 3 이상인 지방족 알콜은 강한 자극을 유도하는 반면, 에탄올은 사용된 지방족 중 가벼운 자극을 나타내는 것으로 알려짐에 따라, 에탄올을 오일 상에 4:1로 첨가한 후 다양한 비율의 계면활성제 및 보조계면활성제 혼합물과 1:1 비율로 혼합하고 물을 적정하였다.

하기 표준방법에 따라, 계면활성제와 보조계면활성제의 최적 비율을 확인하였다.

(1) 각 성분을 완벽하게 혼합하여 실온에서 24시간 동안 상 분리가 일어나는지 확인하고; (2) 단계적으로 물을 적정하였다. 성분 혼합물 용량 2ml에 물을 0.2ml로 고정하여 적정하였으며, 한 단계 적정 후 샘플을 보호 조건에서 저장하고 2시간 동안 상 분리 또는 탁함이 나타나지 않는 것을 확인한 후 다음 단계인 0.2 ml의 물을 재 적정하고; (3) 적정된 물의 전체 용량으로 최적의 성분 비율을 결정하였다.

또한, 다양한 오일 및 계면활성제에서 루테인 용해성을 확인하였다.

그 결과, 도 1과 같이 오일 중에서는 코르톤 오일(4.74 mg/ml)이 가장 높은 루테인 용해도를 나타내었으며, 그 다음으로 이소프로필 미리스테이트(IPM, 3.04 mg/ml), 트리아세틴(1.414 mg/ml), 올리브 오일 (1.741 mg/ml) 및 대두유 (1.41 mg/ml) 순으로 나타났다.

그러나 코르톤 오일은 살아있는 유기체에 염증을 유발시키므로 그 다음 높은 용해도를 나타내며 안과적으로 사용가능한 오일인 IPM을 오일 상으로 선택하였으며, 조용매로 에탄올을 선택하였다.

조용매는 수용액상과 오일상 사이에서 변형된 계면활성제를 분할하는 기능을 수행하여 나노에멀전을 안정화시키는 역할을 한다.

계면활성제로는 높은 루테인 용해능과 높은 HLB 값(HLB=15)을 나타내는 트윈 80을 선택하였으며, 우수한 생체적합성과 안구 자극이 없는 트리아세틴을 보조계면활성제 및 제2의 오일상으로 선택하였다. 상기 모든 성분들은 안구 적용이 가능한 성분들이다(Conquet et al. 1977; Hughes Jr 1948).

2. 슈도터너리 상평형도 (Pseudo-ternary phase diagram) 확인

자가형성 유화영역을 확인하기 위해 물 적정 방법을 이용하여 루테인 존재하에서 슈도터너리 상평형도를 수행하였다.

각각의 유리 바이알에 0%에서 100%까지 다양한 비율로 오일과 계면활성제 상을 혼합한 후 각 혼합물을 교반하에서 물상으로 PBS를 적정하고 투명한 나노에멀전이될 때까지 시각적으로 관찰하였다.

그 결과, 도 2(a)와 같이 오일상으로 IPM(오일)과 에틸알콜(조용매)를 1:4 부피비로 혼합하고, 계면활성제 상으로 트윈 80(계면활성제)과 트리아세틴(보조계면활성제)를 3:1 중량비로 혼합하고 물상으로 PBS 버퍼(150 mM)를 사용하는 것이 최적의 구성비율로 나타났다.

또한, 시료가 불투명에서 투명으로 변화거나 투명에서 불투명으로 변화하는 것을 관찰하여 상 경계를 확인하였다.

상평형도에서 에멀전 평가는 깨끗하고 투명한 상을‘좋음’으로 평가하였으며, 상이 깨끗하지 않거나 상 분리가 나타난 경우‘나쁨’으로 평가하였다.

상기 기준에 따라 슈도터너리 상평형도 상에 흰 부분으로 표시된 ‘좋음’상태의 자가 유화 영역을 확인하여 표 1과 같이 각각 다른 8 제제 군을 선택하였다.

NE-1, 2, 3 및 4는 2에서 10.6%까지 오일 증가 비율에 따른 제제군이며, NE-5, 6 및 7은 2% 오일로 고정시킨 제제군이며, NE-8은 오일량을 1%로 최소화한 제제군이다.

code	water(%)	Oil(%)			Surfactant(%)
	PBS buffer	IPM	EtOH	Subtotal	Tween80	Triacetin	Subtotal
NE-1	66	2.0	8.0	10	18.0	6.0	24
NE-2	45	5.0	20.0	25	22.5	7.5	30
NE-3	24	8.0	32.0	40	27.0	9.0	36
NE-4	5	10.6	42.4	53	31.5	10.5	42
NE-5	72	2.0	8.0	10	13.5	4.5	18
NE-6	75	2.0	8.0	10	11.25	3.75	15
NE-7	80	2.0	8.0	10	7.5	2.5	10
NE-8	80	1.0	4.0	5	11.25	3.75	15

상기 표 1과 같이 NE-1, 2, 3 및 4는 2에서 10.6%까지 오일 증가 비율이 증가한 반면 PBS 버퍼 상의 비율은 66%에서 5%로 감소하였다.

또한, 증가된 오일과 계면활성제 혼합물이 나노에멀전의 특징에 얼마나 영향을 미치는 확인하기 위해 선택된 제제군으로, NE-1, NE-5, NE-6 및 NE-7은 오일 2%로 고정시킨 반면, 계면활성제 혼합물의 비율은 18% 내지 10% 감소시켰다.

또한, NE-8 제제는 오일 상의 양을 5%로 최소화하였다.

많은 양의 계면활성제는 안구 자극의 원인이 될 수 있으며, 5% 이상의 고농도의 오일은 잠재적으로 시야 흐림을 유발할 수 있기 때문에 계면활성제 혼합물과 오일의 최적 함량 비율을 5% 내지 20% 이하로 한정하였다.

< 실시예 2> 루테인을 포함한 안과용 나노에멀전 특징 확인

1. 루테인이 포함된 나노에멀전 제조 및 루테인 용해력 확인

오일 및 계면활성제 혼합물에 과량의 루테인을 첨가하여 교반하고 초음파처리한 후 상기 루테인이 용해된 오일-계면활성제 혼합물에 물상을 첨가하고 약하게 교반하고 초음파처리하여 균질한 나노에멀전을 제조하였다.

균질화된 모든 제제를 0.45 μm PVDF 막으로 여과하여 용해되지 않은 루테인을 제거하고 깨끗한 용액 상태로 446nm에서 HPLC를 수행하여 루테인을 분석하였다.

나노에멀전 제제의 투과 백분율은 UV-1200 Spectrophotometer (Labentech, Incheon, Republic of Korea)를 이용하여 λ=580nm에서 측정되었으며, 확실한 결과값을 얻기위해 모든 실험은 세 번 반복 수행되었다(n=3).

2. 입자 크기 및 입도 분포 확인

멀티 앵글 사이징 옵션(BI-MAS)이 갖추어진 Zetasizer Nano-ZS (Malvern Instruments, UK)를 이용하여 양자 상관법으로 나노에멀전의 입도 분포 및 실질적인 유체역학 직경(Deff)을 확인하였다.

각 시료는 약 40배의 증류수를 넣어 희석한 후 측정하였으며, 각각 세 번 반복 측정하여 평균 Deff 값을 얻었다(n=3).

나노에멀전의 안정성을 확인하기 위해, 7일 동안 각 제제를 실온에 저장하고 Zetasizer Nano-ZS(Malvern Instruments, UK)를 이용하여 입자 크기를 확인하였다.

3. 초분광 영상을 이용한 나노에멀전의 수용액상 분산 형태 확인

나노에멀전 시각적 관찰을 위해, 광산란 현미경(Nikon)과 Cytoviva high resolution adapter(CytoViva, Auburn, AL)를 이용하였다.

DC-stabilized 150-W halogen light source로 조명을 조절하고, 램프 전압은 11V로 하였으며, 내부 중성 농도 필터를 이용하여 빛 세기를 감소시켰다.

이미지를 얻기 위해, the Institute for Technology Development (ITD) (Stennis, Miss)로부터 하이퍼 비쥬얼 소프트웨어를 제공 받아 사용하였다.

초분광 화상 현미경 시스템은 특히 액체 시료 내 나노 크기의 구조를 보기 위한 고강도, 암시야 광원을 이용하여 입자 존재량과 입자 무리 크기를 정량할 수 있으며, 초분광 이미징 시스템은 시료의 추가적인 화학적 조작 없이 나노 크기의 에멀전 및 입자를 포함한 작은 물체의 시각화가 가능하다.

4. 나노에멀전 제제 확인 결과

4-1. 나노에멀전 상태 확인

에멀전 내 입자크기가 100 nm 이하일 경우, 빛은 에멀전을 산란 없이 통과할 수 있으므로 나노에멀전이 투명하게 나타나는 데(Leong et al. 2009), 각 나노에멀전 제제의 광학적 이미지를 확인한 결과, 도 2(b)와 같이 NE-6 및 NE-7을 제외한 나노에멀전 제제는 투명하였으며 상 분리가 나타나지 않았다.

상기 NE-6 및 NE-7은 NE-5보다 계면활성제 양이 감소된 제제로, 감소된 계면활성제에 의해 제제의 입자무리 분산 및 상 분리를 유도된 것을 확인할 수 있었다.

한편, 실온에서 24시간 인큐베이션 후, 초분광 현미경으로 나노에멀전의 실제 이미지를 확인하였다.

그 결과, NE-5 및 NE-8은 여전히 투명성을 나타내었으며, 나노사이즈 구형 입자가 좁은 입경 분포로 존재하는 것이 확인되었다. 반면 NE-2 및 NE-4는 불투명해지고 큰 크기의 불규칙적인 집합체가 확인되었다.

상기 결과로부터 NE-5 및 NE-8이 안정성이 우수한 루테인 제제 후보군으로 확인되었다.

4-2. 나노에멀전 내 루테인 용해성 및 투과율 확인

나노에멀전 내 루테인 용해도를 확인한 결과, 도 4와 같이 오일 성분 비율을 10%(NE-1)에서 53%(NE-4) 증가시켰을 때, 루테인의 용해도가 증가하였다.

그러나 NE-4에서 루테인 2.3mg/ml 이상이 용해된 이유는 오일 및 계면활성제의 높은 함량 때문으로 NE-4를 실온에서 24시간 동안 인큐베이션한 결과, 탁하게 변화되었으며, NE-6 및 NE-7 제제의 루테인 함량은 상 분리에 의해 확인되지 못하였다.

반면, 오일의 성분 비율을 10%로 고정하고 계면활성제를 24% (NE-1)에서 18% (NE-5)로 감소시킨 제제의 경우, 각 제제 내 루테인 함량 차이는 크게 나타나지 않았다.

상기 결과로부터 가용화된 약물은 주로 오일상 내 약물의 용해도에 영향을 받는 것이 확인되었다(Shafiq et al. 2007).

한편, 나노에멀전 제제의 투과 백분율은 UV-120 spectrophotometer를 이용하여 λ=580nm에서 확인한 결과, 도 4(a)와 같이 특이적인 응집이 없이 깨끗한 NE-1, NE-5 및 NE-8 제제는 높은 투과 백분율을 나타내었다.

4-3. 크기 및 안정성 확인

나노에멀전의 입자 크기 및 입도 분포를 확인한 결과, 표 2 및 도 5(a)와 같이 나노에멀전의 입자 크기는 제제 NE-1에서 NE-4로 오일 농도증가에 따라, 입자 크기가 점차 증가하는 것을 확인할 수 있었으며, 에멀전 제제 내 오일 상의 성분 비율이 10% 이상으로 증가될 경우, 48시간 이내 마이크로에멀전이 형성되어 크림 형태를 나타내었다.

반면, 적은 양의 오일 상을 가진 NE-1, NE-5 및 NE-8에서는 10-12nm 입자크기로 안정하게 분산된 것을 확인할 수 있었다.

시간의 함수로서 크기와 크기 분포의 변화에 저항하는 능력은 나노 입자의 안정성을 특징화하기 위한 일반적인 방법으로, 나노에멀전에 함유된 루테인의 용해성을 확인하기 위해 7일간 실온에서 입자 크기를 평가하였다.

그 결과 도 5(b)와 같이 10% 이하의 오일 상을 가진 나노에멀전에서는 특이적인 입자 크기 증가가 나타나지 않았다.

상기 결과로부터 10% 이하의 오일 상을 가진 나노에멀전이 높은 안정성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.

code	Emulsion			Lutein Loaded Emulsion
	Size(nm) a	PDI a	Appearance b	Size(nm) a	PDI a	Appearance b
NE-1	12.0±0.1	0.07±0.02	투명	11.5±0.10	0.05±0.02	투명
NE-2	30.2±0.7	0.45±0.02	불투명	42.2±21.2	0.58±0.35	불투명
NE-3	63.7±0.6	0.27±0.01	불투명	136.4±7.7	0.21±0.02	불투명
NE-4	137.5±1.1	0.17±0.03	불투명	172.3±23.4	0.17±0.03	불투명
NE-5	13.1±0.1	0.08±0.02	투명	12.7±0.7	0.07±0.03	투명
NE-6	N/A	N/A	분리	N/A	N/A	분리
NE-7	N/A	N/A	분리	N/A	N/A	분리
NE-8	12.4±0.3	0.07±0.04	투명	10.8±0.1	0.03±0.03	투명

5. In vitro 약물 방출 확인

각막 내에서 약물의 지속적인 방출은 눈 속 깊은 층까지 효과적인 약물 투과를 가능하게 하므로, 적은 용량으로 전신 및 눈에 부작용 없이 치료 효과를 향상시키기 위해서는 나노에멀전의 우수한 용해 활성 및 약물의 지속적인 방출이 고려되어야 한다(Ammar et al. 2009).

이에 따라 상기 루테인이 함유된 제제의 약물 방출 효율을 확인하기 위해, 루테인이 함유된 나노에멀전을 투석막 튜브(Spectra/Por; MWCO 3500)에 세 번 옮겨 담고 10ml PBS가 포함된 15 ml 튜브에서 인큐베이션하였다. 상기 인큐베이션은 37℃, 100 rev/min으로 교반시킨 진탕 수조(Nexus Tech., Seoul)에서 수행되었다.

sink condition을 유지하기 위해 정해진 시간 간격으로 투석막의 외측부를 회수한 후 신선한 PBS (pH 7.4)로 교체하였으며, PBS로 방출된 루테인 함량은 HPLC (Buyukozturk et al. 2010; Constantinides 1995) 분석을 수행하여 나노에멀전(NE-5 및 NE-8), 대두유 및 전분 현탁액으로부터 루테인의 in vitro 누적 방출 프로필을 확인하였다.

그 결과, 도 6과 같이 NE-5 및 NE-8의 경우, 나노에멀전에 함유된 루테인의 40%가 처음 24시간 내에 지속적으로 방출되어 144시간째 약물의 방출량 백분율은 각각 66.3 ± 13.2 및 57.4 ± 13.1로 나타났으며 침전물은 관찰되지 않다. 특히, NE-5 및 NE-8 나노에멀전의 루테인 방출율은 144시간 후 안정기에 도달한 반면, 현탁액 내 루테인은 6% 이하로 제한적인 방출이 나타나는 것을 확인할 수 있었다.

상기 결과로부터 대조군인 대두유 및 전분 현탁액보다 NE-5 및 NE-8 제제는 나노에멀전의 안정성 및 루테인 방출률이 매우 우수한 것을 확인할 수 있었다.

한편, 이소프로필 미리스테이트가 각각 2% 및 1%로 포함된 NE-5 및 NE-8의 루테인 방출을 비교한 결과, 오일이 높은 함량으로 포함된 나노에멀전의 약물 방출 효과가 더 좋은 것으로 확인되었으며, 오일 함량이 높은 NE-5는 상대적으로 NE-8보다 입자 크기에 영향을 받지 않는 것을 확인할 수 있었다.

높은 함량의 오일은 수용액 내 전체 지방 입자 수 증가를 유도하고, 이를 통하여 표면적을 증가시켜 약물 방출 효과를 향상시킬 수 있다(Ammar et al. 2009).

< 실시예 3> 경구용 나노에멀전 조성 확인

상기 실시예 1과 같은 방법으로 경구용 자가형성 나노에멀전을 제조하기 위해 오일상, 계면활성제상 및 보조계면활성제상에서 루테인의 용해도를 도 7과 같이 확인하고 가장 높은 용해도를 나타낸 오일 및 계면활성제를 선택하여 적절한 비율로 혼합하고 각각의 상을 구성하였다.

경구용 나노에멀전 제조를 위해, 플루로닉(Pluronic)® F127을 증류수에 20%(w/v)로 용해시켜 보조계면활성제상으로는 사용하였으며, 트윈 80과 트리아세틴을 3:1의 비율로 혼합하여 계면활성제상으로 사용하였으며, 오일상은 이소프로필 미리스테이트와 에탄올을 1:4로 혼합하여 사용하여 상평형도를 확인하고, 상기 상평형도로부터 표 3과 같은 8종류의 시료를 선택하였다.

code	co-surfactant	Oil( % )			Surfactant
	F127 20%(W/V)	IPM	EtOH	Subtotal	Tween80	Triacetin	Subtotal
F-1	66	2.0	8.0	10	18.0	6.0	24
F-2	45	5.0	20.0	25	22.5	7.5	30
F-3	24	8.0	32.0	40	27.0	9.0	36
F-4	5	10.6	42.4	53	31.5	10.5	42
F-5	72	2.0	8.0	10	13.5	4.5	18
F-6	75	2.0	8.0	10	11.25	3.75	15
F-7	80	2.0	8.0	10	7.5	2.5	10
F-8	80	1.0	4.0	5	11.25	3.75	15

< 실시예 4> 루테인을 포함한 경구용 나노에멀전 특징 확인

1. 루테인 용해도 및 나노에멀전 제제의 투과율 확인

상기 실시예 3에서 선택된 8 종류 시료의 약물 용해도 및 투명도를 상기 실시예 2에 개시된 방법으로 확인하였다.

그 결과, 도 9와 같이 F-7을 제외한 다른 시료들은 모두 투명성을 나타내었으며, 약물용해도는 하기 표 4와 같았다.

	Lutein solubility
	(mg/ml)
F-1	2.05 ± 0.11
F-2	2.26 ± 0.23
F-3	2.34 ± 0.30
F-4	1.12 ± 0.06
F-5	1.13 ± 0.050
F-6	1.31 ± 0.05
F-7	N/A
F-8	0.81 ± 0.02

2. 나노에멀전 입자 크기 및 안정성 확인

상기 실시예 2와 같은 방법으로 F-7을 제외한 다른 시료들의 크기 분포도를 확인하였으며, 7 일간 실온에서 상기 시료들의 안정성을 확인하였다.

그 결과, 도 10과 같이 상기 시료들은 직경 기준 10nm 크기의 매우 미세한 나노에멀전이 형성되었으며, 매우 안정한 것을 확인할 수 있었다.

< 실시예 5> 루테인을 포함한 경구용 조성물 제조

1. 경구형 제제 제조

표 4와 같은 조성으로 제조된 에멀전을 고형화시켜 습식 과립으로 제조하였다.

과립 제조를 위해, Aerosil (Silicon oxide) 200과 L-HPC (Low-Substituted Hydroxypropyl Cellulose)를 사용하였으며, 나노 에멀전으로 F-1을 표 5와 같은 조성으로 혼합하여 도 11과 같은 경구용 과립 제제를 제조하였다.

w/ w% Fraction of L-HPC	Weight Total(g)	Aerosil 200 (g)	L-HPC(g)	Tested formulation	Feature	Mixture Ratio(ml/g)
0%	0.500	0.500	0.000	F1	습식 과립	3ml/g
20%	0.500	0.417	0.083	F1	습식 과립	3ml/g
40%	0.500	0.357	0.143	F1	습식 과립	2ml/g

2. 루테인 용출률 및 재현성 확인

상기 표 5와 같이 서로 다른 혼합비로 조성된 부형제로 제조된 습식과립을 제2 용출용액(대한약전, pH6.8)에서 용출 제2법(Paddle법, 대한약전)을 이용하여 시간에 따른 루테인 용출율을 확인하였다.

그 결과, 도 12와 같이 Aerosil 200에 L-HPC 40%로 혼합된 부형제에서 루테인 용출율이 가장 우수한 것으로 나타났다.

또한, 고형화된 에멀전을 수상에서 재분산시킨 후 나타나는 재현성을 확인한 결과, 도 12 및 표 6과 같이 모든 조성의 부형제에서 직경기준 10nm 크기의 매우 미세한 에멀전의 액적 상태를 확인할 수 있었으며, 상기 에멀전들은 매우 우수한 재현성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.

w/ w% Fraction of L-HPC	Size(d.nm)	PDI
0%	9.81±0.18	0.046±0.026
20%	9.84±0.04	0.094±0.026
40%	9.87±0.18	0.073±0.025

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (13)

1. 이소프로필 미리스테이트(Isopropyl myristate)와 에틸알콜로 이루어진 오일상; 트윈 80(Tween 80; polysorbate 80)과 트리아세틴으로 이루어진 계면활성제상; 및 수상으로 이루어진 나노에멀전 및 활성 성분인 루테인을 유효성분으로 함유하는 점안용 안과 조성물.
2. 청구항 1에 있어서, 상기 오일상은 이소프로필 미리스테이트 (Isopropyl myristate)오일과 에틸알콜이 1:4 부피비로 혼합된 것을 특징으로 하는 점안용 안과 조성물.
3. 청구항 1에 있어서, 상기 계면활성제상은 트윈 80(Tween 80; polysorbate 80)과 트리아세틴이 3:1 중량비로 혼합된 것을 특징으로 하는 점안용 안과 조성물.
4. 청구항 1에 있어서, 상기 나노에멀전은 나노에멀전 총 100 중량부에 대하여, 오일상 1 내지 10 중량부, 계면활성제상 10 내지 20 중량부 및 수상 70 내지 90 중량부를 포함하는 것을 특징으로 하는 점안용 안과 조성물.
5. 청구항 1에 있어서, 상기 점안용 안과 조성물은 조성물 총 100 중량부에 대하여, 나노에멀전 99.99 내지 99.9 중량부 및 루테인 0.01 내지 0.1 중량부를 포함하는 것을 특징으로 하는 점안용 안과 조성물.
6. 이소프로필 미리스테이트 (Isopropyl myristate)와 에틸알콜로 이루어진 오일상; 트윈 80(Tween 80; polysorbate 80)과 트리아세틴으로 이루어진 계면활성제상; 및 플루로닉 F127를 유효성분으로 함유하는 보조계면활성제상으로 이루어진 자가형성 나노에멀전 및 활성 성분인 루테인을 유효성분으로 함유하는 경구용 안과 조성물.
7. 청구항 6에 있어서, 상기 오일상은 이소프로필 미리스테이트 (Isopropyl myristate) 오일과 에틸알콜이 1:4 부피비로 혼합된 것을 특징으로 하는 경구용 안과 조성물.
8. 청구항 6에 있어서, 상기 계면활성제상은 계면활성제인 트윈 80(Tween 80; polysorbate 80)과 트리아세틴이 3:1 중량비로 혼합된 것을 특징으로 하는 경구용 안과 조성물.
9. 청구항 6에 있어서, 상기 보조계면활성제상은 증류수에 플루로닉 F127를 10 내지 30 중량%로 용해시킨 것을 특징으로 하는 경구용 안과 조성물.
10. 청구항 6에 있어서, 상기 자가형성 나노에멀전은 나노에멀전 총 100 중량부에 대하여, 오일상 1 내지 40 중량부, 계면활성제상 20 내지 40 중량부 및 보조계면활성제상 20 내지 70 중량부를 포함하는 것을 특징으로 하는 경구용 안과 조성물.
11. 청구항 6에 있어서, 상기 경구용 안과 조성물은 조성물 총 100 중량부에 대하여, 자가형성 나노에멀전 99.99 내지 99 중량부 및 루테인 0.01 내지 1 중량부를 포함하는 것을 특징으로 하는 경구용 안과 조성물.
12. 청구항 6에 있어서, 상기 경구용 안과 조성물은 에어로실(Aerosil) 및 저치환된 히드록시프로필 셀룰로오스(Low-Substituted Hydroxypropyl Cellulose; L-HPC)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 추가로 더 포함하는 것을 특징으로 하는 경구용 안과 조성물.
13. 청구항 6에 있어서, 상기 경구용 안과 조성물은 정제, 캡슐제, 과립제, 산제, 환제 및 건조시럽제로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 제형인 것을 특징으로 하는 경구용 안과 조성물.

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