KR20180081528A - 심장 질환의 치료를 위한 포르밀-펩타이드 수용체 2/리폭신 a4 수용체 (fpr2/alx) 타겟팅 - Google Patents

Abstract

본 발명은 일반적으로 심장 질환의 치료를 위한 포르밀-펩타이드 수용체 2/리폭신(Lipoxin) A₄ 수용체 (FPR2/ALX)에 의한 염증 해소 자극에 기초한 치료적 접근에 관한 것이다.

Description

심장 질환의 치료를 위한 포르밀-펩타이드 수용체 2/리폭신 A4 수용체 (FPR2/ALX) 타겟팅

관련 출원에 대한 상호 참조

이 정규출원은 2015년 11월 24일에 출원된 미국 가출원 일련 번호 62/259,498호의 이점을 청구하며, 이는 문헌 전체로서 본원에 참조로 도입된다.

본 발명은 심장 질환의 치료를 위해 포르밀-펩타이드 수용체 2/리폭신(Lipoxin) A₄ 수용체 (FPR2/ALX)에 의한 염증 해소 자극에 기초한 치료적 접근을 기술한다.

심장 질환은 상당한 임상적 및 경제적 부담을 가하는 점점 유행하는 병태이다. 유병률의 증가는, 점진적으로 부정적인 심장 재형성 및 좌심실 기능 장애로 이어지는 누적 심근 손상을 초래하는 심근 경색으로부터 생존한 환자들에 의해 주도된다 (문헌[Viau DM et al., Heart, 2015, 101, 1862-7., Paulus WJ., Tschope C., J. Am. Coll. Car디올., 2013, 62, 263-71]). 이 질환의 증가하는 유병률 및 사회적 부담에도 불구하고, 최근 치료법의 발전은, 만약 있다고 해도, 거의 없었다. PCI 후의 급성 관상동맥 증후군 (ACS) 환자를 위한 표준 치료(standard of care)는 아스피린, 스타틴, 베타-차단제, 및 ACE 억제제/ARB 요법 (문헌[Zouein FA et al., J. Cardiovasc. Pharmacol., 2013, 62, 13-21])을 포함한다.

포르밀 펩타이드 수용체 2/리폭신 A₄ (FPR2/ALX)는 주로 포유류 식균 백혈구에 의해 발현되고 숙주 방어 및 염증에서 중요한 것으로 알려진 7 개의 막횡단 도메인, G 단백질-커플링된 수용체의 작은 그룹에 속한다. FPR2/ALX는 FPR1 및 FPR3과 상당한 서열 상동성을 공유한다. 총체적으로, 이들 수용체는 화학 주성인자로 작용하고 식세포를 활성화시키는 N-포르밀 및 비포르밀 펩타이드를 포함하는 다수의 구조적으로 다양한 작용제 그룹에 결합한다. 내인성 펩타이드 아넥신 1 및 그의 N-말단 절편 또한 인간 FPR1 및 FPR2/ALX에 결합한다. 중요하게는, 작은 프로-해소 매개체(pro-resolution mediators) (SPM)의 새로이 발견된 종류에 속하는 에이코사노이드 리폭신 A4가 FPR2에 대한 특이적 작용제로 최근 확인되었다 (문헌[Ye RD., et al., Pharmacol. Rev., 2009, 61, 119-61]).

내인성 FPR2/ALX 프로-해소 리간드, 예컨대 리폭신 A₄, 레졸빈 D1(resolvin D1), 및 아넥신 A1은 수용체에 결합하여 Gi 커플링, Ca²⁺ 이동 및 β-아레스틴 동원(β-arrestin recruitment)과 같은 다양한 세포질 캐스케이드를 유발한다. 리폭신 A₄에 의한 FPR2/ALX 활성화는 펩타이드 작용제, 예컨대 혈청 아밀로이드 A (SAA)의 효과를 변경하며, 세포 유형에 따라 인산화 경로에 대한 대안적인 효과를 갖는다. 리폭신은 호중구, 대식세포, T-, 및 B-세포를 포함하는 선천성 및 적응성 면역 시스템 모두의 성분을 조절한다. 호중구에서, 리폭신은 운동, 세포독성 및 수명을 조정한다. 대식세포에서, 리폭신은 세포자멸(apoptosis)를 방지하고 에페로시토시스(efferocytosis)를 향상시킨다. 대부분의 염증 세포에서, 리폭신은 또한 IL-6, IL-1β 및 IL-8과 같은 몇몇 프로-염증 시토카인(pro-inflammatory cytokine)의 발현을 하향-조절할 뿐만 아니라, 항-염증성 시토카인 IL-10의 발현을 상향-조절한다 (문헌[Chandrasekharan JA, Sharma-Walia N,. J. Inflamm. Res., 2015, 8, 181-92]).

호중구 및 대식세포에 대한 리폭신의 일차적인 효과는 염증의 종결 및 염증 해소의 개시이다. 후자는 주로 항-섬유성 상처 치유 및 손상된 조직의 항상성으로의 복귀를 향상시키는데 기여한다 (문헌[Romano M., et al., Eur. J. Pharmacol., 2015, 5, 49-63]). 리폭신 A₄ (LXA4)과 같은 내인성 작은 프로-해소 매개체 (SPM) 및 합성 화합물에 의한 FPR2/ALX의 활성화는 세포자멸성 세포의 에페로시토시스를 향상시키고 괴사성 세포 파편의 제거를 촉진하는 방식으로 단핵세포의 비-염증성(non-phlogistic) 동원 및 대식세포의 활성화의 자극을 초래한다. FPR2/ALX 활성의 자극은 또한 호중구 동원의 억제를 초래한다.

심혈관 시스템에서 FPR2/ALX 수용체 및 그의 프로-해소 작용제는 죽종형성성(atherogenic)-플라크(plaque) 안정화 및 치유에 기여하는 것으로 밝혀졌다 (문헌[Petri MH., et al., Cardiovasc. Res., 2015, 105, 65-74; and Fredman G., et al., Sci. Trans. Med., 2015, 7(275); 275ra20]). 리폭신 및 그의 수용체는 또한 전염성 질환, 건선, 피부염, 안구 염증, 패혈증, 통증, 대사성/당뇨병 질환, 암, COPD, 천식 및 알레르기성 질환, 낭포성 섬유증, 급성 폐 손상 및 섬유증, 류마티스성 관절염 및 기타 관절 질환, 알츠하이머 병, 신장 섬유증, 및 장기 이식을 포함하는 만성 염증성 인간 질환의 전임상 모델에서 유익한 것으로 나타났다 (문헌[Romano M., et al., Eur. J. Pharmacol., 2015, 5, 49-63, Perrett, M., et al., Trens in Pharm. Sci., 2015, 36, 737-755.]).

만성 염증은 많은 인간 질환의 발병 경로의 일부이며, FPR2/ALX 작용제를 사용한 해소 경로의 자극은 보호하는 및 회복하는 효과를 모두 가질 수 있다. 허혈-재관류(Ischaemia-reperfusion) (I/R) 손상은 심근 경색 및 뇌졸중과 같은 높은 이환율 및 사망률과 관련된 여러 질환의 공통적인 특징이다. 허혈-재관류 손상으로 인한 심근세포 사멸 및 병리학적 재형성과 관련된 비-생산적 상처 치유는 흉터 형성, 섬유증, 및 점진적인 심장 기능의 상실로 이어진다. 본 발명의 다양한 측면은 흉터 형성, 섬유증, 및 점진적인 심장 기능의 상실로 이어질 수 있는 심근세포 사멸 및 병리학적 재형성과 관련된 비-생산적 상처 치유를 포함하는 심장 질환의 치료에서 FPR2/ALX 작용제의 용도를 제공한다.

본 발명의 다양한 측면은 포르밀-펩타이드 수용체 2/리폭신 A4 수용체 (FPR2/ALX)에 의한 염증 해소 자극에 기초한 심장 질환에 대한 치료적 접근을 기술한다.

화합물 1은 1-(4-클로로페닐)-3-(5-이소프로필-1-메틸-3-옥소-2-페닐-2,3-디히드로-1H-피라졸-4-일)우레아 (문헌[Burli, R. W. et al. Biorg. Med. Chem. Lett. 16, 3713-3718 (2006)])이며, 다음의 구조를 갖는다:

본 발명은 화합물의 모든 제약상 허용되는 염 형태를 포함한다. 제약상 허용되는 염은 반대 이온(counter ion)이 화합물의 생리학적 활성 또는 독성에 크게 기여하지 않고, 그와 같이 약리상 등가물로 작용하는 것이다. 이러한 염은 시판되는 시약을 이용하는 보통의 유기 기법에 따라 제조될 수 있다. 일부 음이온성 염 형태는 아세테이트, 아시스트레이트, 베실레이트, 브로마이드, 클로라이드, 시트레이트, 푸마레이트, 글루쿠로네이트, 히드로브로마이드, 히드로클로라이드, 히드로아이오다이드, 아이오다이드, 락테이트, 말레에이트, 메실레이트, 니트레이트, 파모에이트, 포스페이트, 숙시네이트, 술페이트, 타르트레이트, 토실레이트, 및 크시노포에이트를 포함한다. 일부 양이온성 염 형태는 암모늄, 알루미늄, 벤자틴, 비스무스, 칼슘, 콜린, 디에틸아민, 디에탄올아민, 리튬, 마그네슘, 메글루민, 4-페닐시클로헥실아민, 피페라진, 칼륨, 나트륨, 트로메타민, 및 아연을 포함한다.

제약 조성물 및 사용 방법

본 발명의 화합물은 FPR2/ALX를 조정한다. 따라서, 본 발명의 일 측면은 치료 유효량의 FPR2/ALX 작용제를 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 심장 질환의 치료 방법이다.

본 발명의 또다른 측면은 심장 질환이 협심증, 불안정 협심증, 심근 경색, 심부전, 급성 관상동맥 질환, 급성 심부전, 만성 심부전, 및 심장 의원성 손상으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법이다.

본 발명의 또다른 측면은 심장 질환이 심근 경색 후 증후군인 방법이다.

본 발명의 또다른 측면은 심장 질환이 만성 심부전과 관련된 방법이다.

본 발명의 또다른 측면은 치료가 심근 상처 치유를 개선하기 위한 것인 방법이다.

본 발명의 또다른 측면은 치료가 심근 섬유증 감소를 개선하기 위한 것인 방법이다.

본 발명의 또다른 측면은 작용제가 1-(4-클로로페닐)-3-(5-이소프로필-1-메틸-3-옥소-2-페닐-2,3-디히드로-1H-피라졸-4-일)우레아 또는 그의 제약상 허용되는 염인 방법이다.

“치료 유효량”은 심혈관 질환 및 병태 분야의 전문인에 의해 이해되는 바와 같은 의미있는 환자 이익을 제공하는데 필요한 작용제의 양을 의미한다.

“환자”는 심혈관 질환 및 병태 분야의 전문인에 의해 결정되는 바와 같은 치료에 적합한 심혈관 병태를 갖는, 인간을 포함한 포유동물 종을 의미한다.

본원에서 사용된 바와 같이, “치료하는” 또는 “치료”는 포유동물, 특히 인간에서의 질환-상태의 치료를 포괄하며, (a) 질환-상태를 억제하는 것, 즉, 그의 발생을 저지하는 것; 및/또는 (b) 질환-상태를 완화시키는 것, 즉, 질환 상태의 퇴행을 유발하는 것; 및/또는 (c) 질환 상태의 예방을 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "예방"은 환자에게 치료 유효량의 1 종 이상의 본 발명의 화합물 또는 그의 입체이성질체, 호변이성질체, 제약상 허용되는 염, 또는 용매화물을 투여함으로써 위험을 감소 및/또는 최소화시키는 및/또는 질환 상태의 재발의 위험을 감소시키는 질환 상태의 예방적 치료이다. 일반 집단과 비교하여 임상적 질환 상태를 앓을 위험을 증가시키는 것으로 알려진 인자에 기초하여 예방 요법을 위한 환자가 선택될 수 있다. 예방 치료의 경우에, 임상적 질환 상태의 병태는 나타날 수 있거나 아직 나타나지 않을 수 있다. "예방" 치료는 (a) 1차 예방 및 (b) 2차 예방으로 나뉠 수 있다. 1차 예방은 아직 임상적 질환 상태를 갖는 것으로 나타나지 않은 환자에서의 질환 상태의 위험을 감소 또는 최소화시키기 위한 치료로서 정의되지만, 2차 예방은 동일한 또는 유사한 임상적 질환 상태의 재발 또는 제2 발생의 위험을 최소화 또는 감소시키는 것으로서 정의된다.

본원에서 사용된 바와 같이, "방지"는 임상적 질환-상태의 발생 확률을 감소시키는 것을 목표로 하는, 포유동물, 특히 인간에서의 준임상적 질환-상태의 방지적 치료를 포괄한다. 일반 집단과 비교하여 임상적 질환 상태를 앓을 위험을 증가시키는 것으로 알려진 인자에 기반하여 방지적 요법을 위한 환자가 선택된다.

또다른 실시양태에서, 본 발명은 요법에서 동시적, 분리적 또는 순차적 사용을 위한 본 발명의 화합물 및 추가적인 치료제(들)의 조합된 제제를 제공한다.

본 발명의 화합물은 하나 또는 그 이상의, 바람직하게는 1 내지 3 개의, 다음의 루프 이뇨제, 안지오텐신 전환 효소 (ACE) 억제제, 안지오텐신 II 수용체 차단제 (ARB), 안지오텐신 수용체-네프릴리신 억제제 (ARNI), 베타 차단제, 미네랄로코르티코이드 수용체 길항제, 니트록실 공여체, RXFP1 작용제, APJ 작용제 및 강심제로부터 선택되는 심부전제와 함께 사용될 수 있다. 이러한 약제는 푸로세미드, 부메타니드, 토르세미드, 사쿠비트리알-발사르탄, 티아지드 이뇨제, 캅토프릴, 에날라프릴, 리시노프릴, 카르베딜롤, 메토폴롤, 비소프롤롤, 세레락신, 스피로노락톤, 에플러레논, 이바브라딘, 칸데사르탄, 에프로사르탄, 이르베스타라인, 로사르탄, 올메사르탄, 텔미사르탄, 및 발사르탄을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

심장 질환은 협심증, 불안정 협심증, 심근 경색, 심부전, 급성 관상동맥 질환, 급성 심부전, 만성 심부전, 및 심장 의원성 손상, 및 심혈관 질환 및 병태 분야의 전문인에 의해 이해되는 바와 같은 다른 관련 질환을 포괄하는 질환의 종류이다.

본 발명의 화합물은 일반적으로 치료 유효량의 FPR2/ALX 화합물 및 제약상 허용되는 담체로 이루어진 제약 조성물로서 주어지며, 통상적인 부형제를 함유할 수 있다. 치료 유효량은 의미있는 환자 이익을 제공하기 위해 필요한 양이다. 제약상 허용되는 담체는 허용되는 안전성 프로파일을 갖는 통상적으로 공지된 담체이다. 조성물은 캡슐, 정제, 로젠지제, 및 분말뿐만 아니라 액체 현탁액, 시럽, 엘릭서, 및 용액을 포함하는 모든 보통의 고체 및 액체 형태를 포괄한다. 조성물은 보통의 제제 기법을 사용하여 제조되며, 통상적인 부형제 (예컨대 결합제 및 습윤제) 및 비히클 (예컨대 물 및 알콜)이 조성물에 일반적으로 사용된다. 예를 들어, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th edition, Mack Publishing Company, Easton, PA (1985)]을 참고하라.

고형 조성물은 일반적으로 투여량 단위로 제제화되고, 투여량 당 약 1 내지 1000 mg의 활성 성분 형태를 제공하는 조성물이 바람직하다. 투여량의 일부 예로는 1 mg, 10 mg, 100 mg, 250 mg, 500 mg, 및 1000 mg이 있다.

액체 조성물은 보통 투여량 단위 범위 내에 있다. 일반적으로, 액체 조성물은 1-100 mg/mL의 단위 투여량 범위에 있을 것이다. 투여량의 일부 예로는 1 mg/mL, 10 mg/mL, 25 mg/mL, 50 mg/mL 및 100 mg/mL가 있다.

본 발명은 모든 통상적인 투여 방식을 포괄한다; 경구 및 비경구적 방법이 바람직하다. 일반적으로 투여 용법은 임상적으로 사용되는 다른 심혈관제와 유사할 것이다. 전형적으로, 1 일 투여량은 매일 0.1-100 mg/kg 체중일 것이다. 일반적으로는, 경구적으로 더 많은, 그리고 비경구적으로 더 적은 화합물이 필요하다. 그러나 특정 투여 용법은 건강한 의학적 판단을 사용하는 의사에 의해 결정될 것이다.

생물학적 방법 및 결과

FPR2 및 FPR1 cAMP 분석. 포스콜린 (FPR2/ALX에 대하여 5 μM 최종 또는 FPR1에 대하여 10 μM 최종) 및 IBMX (200 μM 최종)의 혼합물을 1.7 nM 내지 100 μM의 범위의 최종 농도에서 DMSO (1 % 최종) 중의 시험 화합물로 사전에 점찍은(pre-dotted) 384-웰 프록시플레이트(Proxiplate) (퍼킨-엘머(Perkin-Elmer) 사)에 첨가하였다. 인간 FPR1 또는 인간 FPR2/ALX 수용체를 과발현하는 중국 햄스터 난소 세포 (CHO)를 10 % 적합화 FBS, 250 μg/ml 제오신 및 300 μg/ml 하이그로마이신 (라이프 테크놀로지(Life Technologies) 사)이 보충된 F-12 (햄스(Ham's)) 배지에서 배양하였다. 0.1 % BSA (퍼킨-엘머 사)가 보충된 둘베코의 PBS(Dulbecco's PBS) (칼슘 및 마그네슘과 함께) (라이프 테크놀로지 사)에 웰 당 2,000 개의 인간 FPR2 세포 또는 웰 당 4000 개의 인간 FPR1 세포를 첨가하여 반응을 개시하였다. 반응 혼합물을 실온에서 30 분 동안 인큐베이션하였다. 제조회사의 지시에 따라 HTRF 하이레인지(HiRange) cAMP 분석 시약 키트 (시스바이오(Cisbio) 사)를 사용하여 세포 내 cAMP 수준을 결정하였다. 크립테이트 컨쥬게이트된 항-cAMP 및 d2 형광단-표지된 cAMP의 용액을 공급된 용균 완충용액에서 따로 제조하였다. 반응이 완료되면, 동일한 부피의 d2-cAMP 용액 및 항-cAMP 용액으로 세포를 용해시켰다. 1 시간의 실온 인큐베이션 후, 400 nm 여기(excitation) 및 590 nm 및 665 nm에서의 이중 방출(dual emission)에서 엔비젼(Envision) (퍼킨-엘머 사)을 사용하여 시간-분해 형광 강도를 측정하였다. 검량선은 665 nm 방출로부터의 형광 강도 비를 cAMP 농도에 대한 590 nm 방출로부터의 강도에 대해 플로팅함으로써 1 μM에서 0.1 pM까지 범위의 농도에서 외부 cAMP 표준으로 구성하였다. 그 다음 cAMP 수준 대 화합물 농도의 플롯으로부터 4-파라메트릭 로지스틱 방정식에 피팅함으로써, cAMP 생성을 억제하는 화합물의 효능 및 활성을 결정하였다.

dHL60 비-부착 세포주를 사용한 Flipr 분석. HL60 세포를 1.5x10⁵ 세포/ml로 희석하고 1.3 % DMSO를 함유하는 배양 배지에서 37 ℃에서 5 일 동안 성장시켰다. 6 일째에 세포를 계수하여 세포 생존율이 대략 95 %라는 것을 확인하였다. 1.2x10⁷ 개의 세포를 스핀 다운시키고 분석 완충용액으로 세포를 한 번 세척하였다. 상등액을 제거하고 세포를 fluo-4 AM 로딩 다이(loading dye)와 함께 12 ml 완충용액에 재-현탁하고 37 ℃에서 30 분 동안 세포를 표지하였다. 로딩 완충용액 : HBSS (인비트로젠(Invitrogen) 사, cat 14075), 20 mM HEPES, 0.1 % FAF-BSA, 0.025 % 플루로닉(pluronic) F127 (인비트로젠 사, P3000MP) 15μl, 2.5 mM 프로베네시드, 1.9 μM Fluo-4AM (인비트로젠 사, F14201). 인큐베이션 후, 세포를 반응 완충용액으로 한 번 세척하여 염료를 제거하고 1x10⁶ 세포/ml에서 재-현탁하였다. 세척 다음에, 세포를 폴리-D-리신으로 사전-코팅된 96 웰 분석 플레이트에 100 μl/웰로 도말하였다. 분석 플레이트를 1000 rpm에서 10 분 동안 원심분리한 다음 FLIPR에 넣고 칼슘 플럭스 분석을 수행하였다.

β-아레스틴 동원 검정. 디스커버엑스(DiscoveRx) 표준 프로토콜을 사용하였다.

HL-60 세포 배양 및 분화. HL-60 세포주 (ATCC 사, CCL-240, lot 60398411)를 20 % 소 태아 혈청, 50 U/ml 페니실린 및 50 μg/ml 스트렙토마이신이 보충된 IMDM (라이프 테크(Life Tech) 사, cat 12440-053) 배지에서 5 % CO₂로 37 ℃에서 유지하였다. 세포는 DMSO에서 과립구 계통으로 분화되었고; 2.5 × 10⁵ 세포/ml를 1.25 % DMSO에서 5 일 동안 인큐베이션하였다.

호중구 및 HL-60 세포 이동 분석 작용제 모드. 5 일간의 분화 후, 세포를 3x10⁷ 세포/ml의 농도에서 0.2 %의 지방산 없는 BSA와 함께 페놀 없는 RPMI (인비트로젠 사, cat 11835)에 재현탁하였다. dHL-60 세포 (100μl 중 10⁵개)를 각 HTS 트랜스웰(transwell)-96웰 플레이트 (코닝#3387)의 위 챔버에 첨가하였다. 이동은 트랜스웰 플레이트의 하부 챔버에 화학주성인자를, 그리고 상부 챔버에 dHL60 세포를 넣음으로써 유도되었다. 세포를 5 % CO₂로 37 ℃에서 5 미크론 필터를 가로 질러 120 분 동안 이동시켰다. 이동시킨 다음에, 트랜스웰 아래 챔버 (이동된 분획)에 남아있는 호중구 또는 dHL-60 세포를 셀-타이터-글로(cell-titer-glo) 발광 세포 생존율 분석 (프로메가(Promega) 사, G7571)을 사용하여 정량하였다.

호중구 및 HL-60 세포 이동 분석 길항제 모드. 5 일간의 분화 후, 세포를 3x10⁷ 세포/ml의 농도에서 0.2 % 지방산 없는 BSA와 함께 페놀 없는 RPMI (인비트로젠 사, cat 11835)에서 재현탁하였다. dHL-60 세포 (100μl 중 10⁵개)를 5 % CO₂로 37 ℃에서 여러 농도의 화학주성인자와 함께 15 분 동안 사전-인큐베이션하였다. 그 다음 0.8 μM의 재조합 혈청 아밀로이드 A1 펩티드 (rSAA1, 페프로테크(PeproTech) 사, Cat # 300-53)를 각 HTS 트랜스웰-96-웰 플레이트 (코닝#3387)의 하부 챔버에 첨가하였다. 이동은 트랜스웰 플레이트의 상부 챔버에 화학주성인자 및 dHL60 세포 혼합물을 넣음으로써 유도되었다. 세포를 5 % CO₂로 37 ℃에서 5 미크론 필터를 가로 질러 120 분 동안 이동시켰다. 이동시킨 다음에, 트랜스웰 아래 챔버 (이동된 분획)에 남아있는 호중구 또는 dHL-60 세포를 셀-타이터-글로 발광 세포 생존율 분석 (프로메가 사, G7571)을 사용하여 정량하였다.

식균작용 향상. 수확 4 일 전, PBS (-/-) 중 1 % 바이오겔(Biogel) 1 ml의 복막 주사에 의해 대식세포를 5 마리의 C57BL6 마우스의 복막으로 이끌어냈다. 복막 삼출물을 수확하고, 한데 합한 다음에 여과하여 바이오겔 비즈를 제거하였다. 먼저, 70 μm 셀 스트레이너를 통과시킨 후 두 개의 40 μm 셀 스트레이너를 연속적으로 통과시켜 여과하였다. 삼출물을 1X PBS (-/-)로 50 ml로 희석하고 4 ℃에서 10 분 동안 300 x g에서 원심분리하였다. 세포 펠렛을 20-30ml 1X PBS (+/+)에 서서히 재현탁하고, 세포를 넥셀콤 셀로미터(Nexelcom Cellometer) 계수기를 사용하여 계수하였다. 세포 농도는 1X PBS (+/+)에서 1,250,000 세포/ml로 조절하였다. 100 μl (125k)의 세포를 96-웰 코스타르(Costar) 3904 플레이트의 각 웰에 넣었다. 플레이트를 150 x g에서 30 초 동안 원심분리하여 부착을 촉진시켰다. 37 ℃/5 % CO₂에서 90 분간 인큐베이션 한 후, 비-부착성 세포를 흡인하고 부착된 대식세포 (~50K)를 150 μl 1X PBS (-/-)로 한 번 세척한 다음, 135μl의 예열된 혈청-없는 대식세포 SFM/1X 펜-스트렙(Pen-Strep) 배지에서 37 ℃/5 % CO₂에서 밤새 인큐베이션하였다. 다음 날, 혈청-없는 대식세포 SFM 배지에서 새로 제조된 10X 화합물 15 ul를 각 웰에 넣고 37 ℃/5 % CO₂에서 15 분 동안 혼합하고 인큐베이션하였다. 식균작용은 옵소닌화된(opsonized) FITC 지모산(Zymosan) 입자 (라이프 테크놀로지 사)의 10 배 과량 (125K/μl의 4μl) 첨가에 의해 개시된다. 식균작용은 37 ℃/5 % CO₂에서 45 분 동안 진행되었다. 웰을 흡인하고, 식균작용을 150 μl의 빙냉(ice-cold) 1X PBS (-/-)/2mM EDTA로 정지시키고 다시 흡인하였다. 비-섭취된 지모산 입자로부터의 형광 신호를 1:15로 희석한 150 μl의 빙냉 트리판 블루 용액으로 2 분 동안 소광시킨 다음, 흡인하여 제거하였다. 마지막으로, 플레이트를 1:50으로 희석한 150μl의 트리판 블루에서 스펙트라맥스 제미니(SpectraMAX Gemini) EM 형광 플레이트 판독기상에서 판독하였다. 플레이트 판독기 설정=하부 판독:여기 493 nm: 방출 525 nm: 컷오프 515 nm: 오토믹스 오프: 보정 온: PMT=자동: 열 우선순위:판독/웰= 20.

심부전을 위한 FPR2/ALX 작용제. 리폭신 A₄ (LXA₄), 아스피린 유발된 15-epi-리폭신A₄ (ATL) 및 레졸빈 D1 (RvD1)과 같은 내인성 작은 프로-해소 매개체 (SPM)뿐만 아니라, 화합물 1과 같은 합성 소분자 리간드에 의한 FPR2/ALX의 활성화는 세포자멸성 세포의 에페로시토시스를 향상시키고 괴사성 세포 파편의 제거를 촉진하는 방식으로 단핵세포의 비염증성 동원 및 대식세포의 활성화의 자극을 초래한다. FPR2/ALX 활성의 자극은 또한 호중구 동원의 억제를 초래한다. 두 메커니즘의 활성화는 상처 치유 메커니즘의 향상과 손상된 심장의 항상성으로의 복귀에 필요하다고 제시되었다.

화합물 1의 시험관 내 전임상 약리학. 리폭신A₄와 같은 FPR2/ALX 천연 프로-해소 리간드는 수용체와 결합하여 Gi 커플링, Ca²⁺ 이동 및 β-아레스틴 동원과 같은 다양한 세포질 캐스케이드를 유발한다. 리폭신A₄에 의한 FPR2/ALX 활성화는 펩타이드 작용제, 예컨대 혈청 아밀로이드 A (SAA)의 효과를 변경하며, 세포 유형에 따라 인산화 경로에 대한 대안적인 효과를 갖는다. 호중구에서, 리폭신은 그들의 운동, 세포독성 및 수명을 조정한다. 대식세포에서, 리폭신은 그들의 세포자멸을 방지하고 에페로시토시스를 향상시킨다. 대부분의 염증 세포에서, 리폭신은 또한 IL-6, IL-1β 및 IL-8과 같은 몇몇 프로-염증 시토카인의 발현을 하향-조절할 뿐만 아니라, 항-염증성 시토카인 IL-10의 발현을 상향-조절한다. 호중구 및 대식세포에 대한 리폭신의 일차 효과는 염증의 종결 및 염증 해소의 개시 모두에 기여하는 것이라고 생각된다. 후자는 주로 향상된 항-섬유성 상처 치유 및 손상된 조직의 항상성으로의 복귀에 기여한다. 화합물 1은 FPR2/ALX 천연 SPM와 유사하게 염증 해소를 향상시킴으로써 상처 치유를 촉진하는 것으로 생각되는 FPR2/ALX의 소분자 작용제이다.

화합물 1을 다음의 시험관 내 세포 기반 분석에 따라 시험하였다. 인간 FPR2/ALX (hFPR2/ALX) 및 인간 FPR1 (hFPR1) 수용체를 과-발현하는 CHO-A12 세포주에서, 화합물 1은 hFPR2/ALX Gi 커플링의 강력한 (50 nM) 활성인자로, 아데닐실라제(Adenylcylase)의 억제를 통해 cAMP 저하를 초래하였다. 화합물 1은 또한 밀접하게 관련된 hFPR1 수용체의 동등하게 강력한 (10 nM) 활성인자였다. 단일 hFPR2/ALX의 두 개의 마우스 오르토로그(ortholog), mFPR2 및 mFPR3을 과-발현하는 CHO-A12 세포주에서, 화합물 1은 mFPR3 (> 10,000 nM)에 대해 활성이 없는 mFPR2/ALX의 매우 강력한 (20 nM) 활성인자였다. 인간 hFPR1에서와 유사하게, 화합물 1은 mFPR1 수용체와 대략 50 nM의 기능 친화성으로 비-선택적이었다. 인간 HL60 세포주와 같은 호중구에서, 화합물 1은 세포질 Ca²⁺ 수준을 강력하게 (50 nM) 증가시켰다. 화합물 1은 또한 디스커버엑스 패스헌터(Pathhunter) CHO-K1 hFPR2/ALX 세포주에서 3100 nM의 강도로 β-아레스틴 동원을 자극했다.

호중구에서의 세포질 칼슘 이동 및 대식세포에서의 cAMP 수준의 조정은 세포 운동 (화학주성) 또는 식(phago)-에페로시토시스의 향상과 각각 관련되어있다. 이러한 활성 모두는 FPR2/ALX 수용체의 프로-해소 작용제로서 화합물 분류에 필수적이다. 인간 HL60 세포주를 사용하여 화합물 1은 78 nM의 효력으로 화학주성을 단독으로 자극하였다. 화합물 1은 또한 189 nM의 친화성으로 SAA에 의해 유도된 화학주성을 길항하였다. 마우스 바이오-겔로부터 이끌어낸 복막 대식세포에서, 피코몰 범위의 화합물 1은 치료되지 않은 대조군 세포와 비교하여, 형광으로 표지된 지모산의 식균작용을 실험 조건에 따라 250 내지 60 % 사이로 향상시켰다. 이 화합물은 단일 mFPR2 및 mFPR3 또는 이중 mFPR2/FPR3 녹아웃(knockout) 마우스로부터 분리된 바이오-겔에서 이끌어낸 복막 대식세포에서는 이와 같은 향상을 보이지 않았다.

동물 모델. 심근 경색을 유도하기 위해 좌전 하행 동맥 주위에 결찰기(ligature)를 사용하여 마우스에서 영구적인 관상 동맥 폐쇄를 실행하였다. 경구-투여된 화합물 1(1 및 10 mg/kg; QD) 또는 화합물이 없는 투여 용액 (QD, 비히클로 지칭됨)을 사용한 치료를 심근 경색 후 24 시간에 개시하였다. 개흉술을 받았지만 경색이 없는 마우스는 수술적 "샴(sham)" 대조군으로 포함되었다. 구조/기능 관계를 평가하기 위해 마우스를 심근 경색 후 28 일 동안 평가하였다. 심장은 심근의 수동적 역학을 평가하기 위해 마우스로부터 제거되었다. 이를 위해, 절제한 심장의 좌심실 내에 넣은 풍선의 팽창 및 수축 사이클을 통해 좌심실의 생체 외 압력-부피 관계를 측정하였다. 또한, 심근 흉터의 이-차원적인 변형을 측정하여 경색된 조직의 순응도를 결정하였다. 또한 좌심실의 치수, 경색 부위 및 경색 콜라겐 조성을 측정하기 위해 심장을 조직학적으로 치료하였다.

심근 섬유증을 평가하기 위해, 마우스에게 안지오텐신 II를 항원투여하여 심장 비대 및 좌심실 콜라겐 침착을 자극하였다. 마우스에게 피하에 이식된 삼투 미니-펌프 (~2 mg/kg/일)를 사용하여 안지오텐신 II를 투여하였다. 별도의 그룹의 마우스에 염수를 함유하는 피하 펌프 (수술적 "샴" 그룹)를 이식하였고; 이 마우스들은 펌프 이식 수술에 대한 대조군 역할을 하였다. 구체적인 연구 설계에 따라, 마우스를 안지오텐신 II 펌프 이식 24 시간 전, 펌프 이식과 동시에, 또는 펌프 이식 3일 후에 화합물 1 (1 및 10 mg kg; QD) 또는 화합물이 없는 투여 용액 (QD, 비히클로 지칭됨)으로 치료하였다. 치료는 정확한 연구 설계에 따라 2-3 주간 지속되었다. 치료 단계의 끝에서, 심장을 동물으로부터 제거하고 심근 히드록시프롤린에 대한 표준 비색 분석법을 사용하여, 또는 심장의 횡-단면 조직학에 의하여 콜라겐 수준/섬유증을 평가하였다.

두 모델 모두에서, 염증의 해소 및 심장 치유의 향상에서의 FPR2/ALX의 역할을 지원하는 다음의 종말점이 관찰되었다.

치료는 생전(in-life) 단계에 걸쳐 잘 견디어졌고, 마우스의 생리기능상에 부작용이 나타나지 않았다. 높은 투여량으로 치료된 마우스는 전반적인 사망률에 감소를 보여, 치료에 의한 생존상 이점을 시사하였다.

화합물 1에 의한 치료는 좌심실의 생체 외 수동적 역학 측정에 의해 결정된 바와 같이 심근의 정상적인 순응성 특성을 보존하였다. 치료 단계의 끝에서, 심장은 고칼륨-함유 심정지 용액을 사용하여 확장기에서 정지시켰다. 변경된 풍선 카테터 조립체를 좌심실에 넣고, 풍선을 팽창시키고 수축시켜 좌심실 심근의 압력-부피 관계 및 수동적 순응성 특성을 측정하였다. 화합물 1로 치료된 마우스의 압력-부피 곡선은 감소된 좌심실 부피를 나타내는 용량-의존적 방식으로 좌로 이동시켰다. 화합물 1 치료에서 더 작은 좌심실 부피는 더 적은 경색 후 재형성을 나타낸다. 화합물 1로 치료된 마우스의 압력-부피 기울기는 비히클보다 컸고, 정상적인 샴 대조군 마우스와 유사하여 심근의 비히클 대비 증가된 강성 및 비-경색된 샴 대조군과 유사한 정상 순응도 특성의 보존을 나타내었다.

2-차원 흉터 변형 (즉, 팽창성)은 압력-부피 측정에 수반되어 디지털 비디오 카메라로 측정되었다. 화합물 1에 의한 치료는, 비히클 치료에 비해 둘레 및 종방향 변형을 감소시켜 흉터의 증가된 강성 및 흉터 확장에 대한 경향의 감소를 나타냈다. 변형은 정상적인 샴 대조군 심장과 유사하여 치유된 흉터의 정상적인 순응도의 유지를 나타냈다.

심장의 조직학적 평가는 화합물 1 치료에 의한 좌심실 챔버 면적의 감소를 보여주었다. 챔버 면적은 비-경색 샴에 가까운 수준으로 감소되었다 (비히클 치료된 심장에 비해 1 및 10 mg/kg에서 각각 28-30 % 감소, p <0.05).

경색 부위의 좌심실 벽 두께 (전방 좌심실 자유 벽)의 조직학적 평가는 화합물 1 치료에 의해 비히클에 비해 증가된 벽 두께를 보여주었다. 평균 전방 벽 두께 값은 비-경색 샴에서 관찰된 수준에 근접하여, 심근 무결성의 보전을 나타냈다. (비히클에 비해 45-65 % 증가된 벽 두께, p <0.05).

조직학에 의해 (좌심실 면적의 %로) 측정된 경색 면적은 화합물 1에서 감소하였다 (1 및 10 mg/kg에서 비히클 대비 각각 44-49 % 감소함; p <0.05). 이 데이터는 화합물 1을 사용한 치료가 심근 경색 후 경색의 확장과 경색 벽이 얇아지는 것을 감소시킴을 시사한다.

피하 삼투압 미니-펌프에 의해 투여된 연속적인 안지오텐신 II 항원투여가 있는 마우스에서 심근 섬유증을 평가하였다.

심근 섬유증에 대한 화합물 1의 전-치료 효과는 안지오텐신 II 항원투여 24 시간 전에 마우스를 가바즈(gavage)에 의해 구강 치료함으로써 시험되었다. 이 설계는 섬유증 방지를 평가하기 위해 구성되었다. 치료된 마우스는 2 주 동안 경구 가바즈에 의해 매일 투약되었다. 치료 그룹은 저용량 및 고용량 화합물 1, 비히클 대조군 및 안지오텐신 II 항원투여가 없는 비치료 샴 그룹으로 구성되었다. 화합물 1 및 안지오텐신 II 항원투여의 동시적인 치료 후 2 주 동안 심장의 콜라겐 침착에 대해 평가하였다. 콜라겐의 대용으로 측정된 좌심실 히드록시프롤린 함량은 대조군에 비해 화합물 1 치료군에서 감소하였다 (비히클 대비 1 mg/kg에서는 83 %, 10 mg/kg에서는 75 %, p <0.05). 수준은 샴 그룹으로부터 취한 정상적인 항원투여되지 않은 심장에서 측정된 것에 근접하였다. 간질 콜라겐의 비교가능한 감소는 좌심실의 조직학에 의해 나타났다. 상기 데이터는 FPR2/ALX 작용제가 심근 섬유증을 약화시킬 수 있음을 나타낸다.

안지오텐신 Ⅱ 항원투여 시에 화합물 1로 치료했을 때, 히드록시프롤린 함량 및 간질 콜라겐 수준 모두에서 비교가능한 감소가 조직학에 의하여 관찰되었다.

화합물 1의 치료는 또한 심근 섬유증 발생 후에 주어진 경우에 심근 섬유증을 감소시킬 수 있다. 이 설계는 중재적 요법으로서 심근 섬유증을 개선시키는 화합물 1의 용량을 평가하도록 구성된다. 진행중인 안지오텐신 II 노출 설정에서, 섬유증을 발생시키기 위해 안지오텐신 II로 3 일 동안 항원투여된 마우스를 화합물 1로 2.5 주 동안 치료하였다. 치료 단계의 끝에서, 심장은 조직학에 의해 평가되었다. 화합물 1 치료는 비히클에 비해 좌심실에서 간질 섬유증을 감소시켰다 (비히클 대비 ~74 % 감소, p <0.001). 섬유증 수준은 안지오텐신 II 항원투여가 없는 치료되지 않은 샴 그룹에서 측정된 것과 유사하였다.

본 발명은 전술한 예시적인 실시예에 한정되지 않으며, 그의 본질적인 속성으로부터 벗어나지 않으면서 다른 특정 형태로 구체화될 수 있다는 것이 당업자에게 명백할 것이다. 그러므로, 실시예는 모든 면에서 예시적이며 제한적이지 않은 것으로 고려되어야 하고, 전술한 실시예보다는 첨부된 청구범위를 참조하는 것이 바람직하며, 청구범위의 의미 및 동등한 범위 내에 있는 모든 변경은 따라서 그 안에 수용되도록 의도되었다.

Claims (7)

1. 치료 유효량의 FPR2/ALX 작용제를 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 심장 질환의 치료 방법.
2. 제1항에 있어서, 심장 질환이 협심증, 불안정 협심증, 심근 경색, 심부전, 급성 관상동맥 질환, 급성 심부전, 만성 심부전, 및 심장 의원성 손상으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
3. 제1항에 있어서, 치료가 심근 경색 후 증후군에 관련된 방법.
4. 제1항에 있어서, 치료가 만성 심부전에 관련된 방법.
5. 제1항에 있어서, 치료가 심근 상처 치유를 개선하기 위한 것인 방법.
6. 제1항에 있어서, 치료가 심근 섬유증을 감소시키기 위한 것인 방법.
7. 제1항에 있어서, 작용제가 1-(4-클로로페닐)-3-(5-이소프로필-1-메틸-3-옥소-2-페닐-2,3-디히드로-1H-피라졸-4-일)우레아 또는 그의 제약상 허용되는 염인 방법.