KR20180071349A - 생물학적 시료의 움직임 및/또는 생물학적 시료 성분의 움직임에 대한 광학적인 시험관내 검출 방법 및 장치 - Google Patents

생물학적 시료의 움직임 및/또는 생물학적 시료 성분의 움직임에 대한 광학적인 시험관내 검출 방법 및 장치 Download PDF

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Abstract

본 발명은 생물학적 시료의 움직임 및/또는 생물학적 시료 성분의 움직임에 대한 광학적인 시험관내 검출 방법 및 장치에 관한 것이다. 상기 방법은 (a) 전체 생물학적 시료(1)를 조명하도록 구성된 시료를 조명하기 위한 광폭 필드 조명 장치 및 생물학적 시료로부터의 광(9, 9a, 9b)을 검출하는 검출기(3)를 제공하는 단계; (b) 상기 생물학적 시료(1)를 상기 광폭 필드 조명 장치로 조명하는 단계; 및 (c) 상기 검출기(3)의 출력 신호(6c)에 따라 상기 생물학적 시료(1)의 움직임을 검출하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 검출기(3)는 복수의 검출 구역들(4a)로 세분되어 있는 검출 영역(3a)을 포함하고, 상기 각각의 검출 구역들(4a)의 검출 신호들(4c)의 시간에 대해 도함수를 형성하고(S1), 절대값 생성 또는 제곱에 의해 상기 도함수를 수정하고(S2), 모든 검출 구역들(4a)의 미분 및 수정된 검출 신호들(4c)을 합하거나 평균화한 후(S3), 출력 신호(6c)로써 제공할 수 있다.

Description

생물학적 시료의 움직임 및/또는 생물학적 시료 성분의 움직임에 대한 광학적인 시험관내 검출 방법 및 장치
본 발명은 직경이 최소 100㎛인 생물학적 시료의 움직임 및/또는 생물학적 시료 성분의 움직임에 대한 광학적인 시험관내 검출 방법 및 장치에 관한 것이다.
발달 생물학, 독성 시험 및 제약 연구와 같은 분야에서 폐쇄 및 3 차원 세포 및 조직 배양의 능동 역학을 모니터링 하기 위한 요구 사항이 존재한다는 것이 실제 사례로부터 알려져 있다.
근육 조직으로 분화된 배아 줄기 세포에서 추출한 조직 샘플은 예를 들어 시험할 물질의 유해성을 확인하기 위해 독성 시험의 일부로 사용된다. 여기서 근육 조직에 적용되는 물질이 근육 조직의 근육 수축에 영향을 미치는지 여부가 조사된다. 근육 조직의 수축은 물질의 독성을 나타내는 지표가 될 수 있다. 세포 클러스터(cell cluster)의 형태와 같은 3 차원 생물학적 샘플에서 움직임, 예를 들어 수축을 검출하기 위한 측정 방법이 필요하다. 이러한 세포 클러스터의 일반적인 직경은 100 ~ 400㎛이며, 밀리미터 범위 내의 직경도 가능하다.
이러한 연구는 주로 시각적인 관찰을 통해 주로 수행되며 비디오 현미경과 후속 이미지 분석을 사용하는 경우는 드물다. 첫 번째는 시간 소모적이며 항상 주관적인 평가와 관련이 있다. 후자는 복잡한 이미징 광학 및 상당한 연구 노력으로 연결된 복잡한 이미지 분석이 요구된다는 단점이 있다. 작은 변위에 대한 그들의 고유한 민감성은 또 다른 단점이다.
임피던스 측정과 같은 비 광학적인 방법은 오직 샘플과 접촉하여 작동한다. 샘플 형태가 레벨(부착성 단분자층)에서 벗어나거나 심지어 입체적이며 또한 매체에서 자유롭게 헤엄치는 경우, 위에서 언급한 기술을 적용할 수 없다.
자동 이미징 방법은, 예를 들어, 10㎛의 초점 깊이 및 50 내지 400㎛의 셀 클러스터의 상기 언급된 전형적인 크기에 대해 샘플의 5 내지 40 이미지 레벨이 측정되어야 한다는 단점을 갖는다. 일반적인 움직임을 감지할 수 있는 데 최소 측정 기간 10초, 및 재위치 지정 또는 초점 맞추기에 필요한 추가 시간이 필요하므로 이러한 방법은 여러 샘플을 신속하게 모니터링 하는데 적합하지 않다.
생물학적 역동성의 시간 척도로 인해 모니터링 기간이 길기 때문에 많은 수의 샘플을 연속적으로 측정하지 않는다. 그러나 실제로, 예를 들어 96 또는 384와 같은 마이크로-역가 플레이트(micro-titre plate)로도 알려진, 멀티-웰 플레이트(multi-well plate)에 저장되어 있는, 서로 분리된 다수의 샘플에 대해 이러한 움직임 검출을 수행할 필요가 있다. 이미징 방법은 기하학적인 이유로 멀티-웰 플레이트의 모든 캐비티(cavity)에서 이미징 광학 장치의 배열을 실현하는 것이 어렵고 건축 공간이 부족하기 때문에 다수의 샘플을 병행 측정하는 데 적합하지 않다.
발달 생물학, 독성 시험 및 제약 연구와 같은 분야에서 폐쇄 및 3 차원 세포 및 조직 배양의 능동 역학을 모니터링 하기 위한 요구 사항이 존재한다는 것이 실제 사례로부터 알려져 있다.
근육 조직으로 분화된 배아 줄기 세포에서 추출한 조직 샘플은 예를 들어 시험할 물질의 유해성을 확인하기 위해 독성 시험의 일부로 사용된다. 여기서 근육 조직에 적용되는 물질이 근육 조직의 근육 수축에 영향을 미치는지 여부가 조사된다. 근육 조직의 수축은 물질의 독성을 나타내는 지표가 될 수 있다. 세포 클러스터(cell cluster)의 형태와 같은 3 차원 생물학적 샘플에서 움직임, 예를 들어 수축을 검출하기 위한 측정 방법이 필요하다. 이러한 세포 클러스터의 일반적인 직경은 100 ~ 400㎛이며, 밀리미터 범위 내의 직경도 가능하다.
이러한 연구는 주로 시각적인 관찰을 통해 주로 수행되며 비디오 현미경과 후속 이미지 분석을 사용하는 경우는 드물다. 첫 번째는 시간 소모적이며 항상 주관적인 평가와 관련이 있다. 후자는 복잡한 이미징 광학 및 상당한 연구 노력으로 연결된 복잡한 이미지 분석이 요구된다는 단점이 있다. 작은 변위에 대한 그들의 고유한 민감성은 또 다른 단점이다.
임피던스 측정과 같은 비 광학적인 방법은 오직 샘플과 접촉하여 작동한다. 샘플 형태가 레벨(부착성 단분자층)에서 벗어나거나 심지어 입체적이며 또한 매체에서 자유롭게 헤엄치는 경우, 위에서 언급한 기술을 적용할 수 없다.
자동 이미징 방법은, 예를 들어, 10㎛의 초점 깊이 및 50 내지 400㎛의 셀 클러스터의 상기 언급된 전형적인 크기에 대해 샘플의 5 내지 40 이미지 레벨이 측정되어야 한다는 단점을 갖는다. 일반적인 움직임을 감지할 수 있는 데 최소 측정 기간 10초, 및 재위치 지정 또는 초점 맞추기에 필요한 추가 시간이 필요하므로 이러한 방법은 여러 샘플을 신속하게 모니터링 하는데 적합하지 않다.
생물학적 역동성의 시간 척도로 인해 모니터링 기간이 길기 때문에 많은 수의 샘플을 연속적으로 측정하지 않는다. 그러나 실제로, 예를 들어 96 또는 384와 같은 마이크로-역가 플레이트(micro-titre plate)로도 알려진, 멀티-웰 플레이트(multi-well plate)에 저장되어 있는, 서로 분리된 다수의 샘플에 대해 이러한 움직임 검출을 수행할 필요가 있다. 이미징 방법은 기하학적인 이유로 멀티-웰 플레이트의 모든 캐비티(cavity)에서 이미징 광학 장치의 배열을 실현하는 것이 어렵고 건축 공간이 부족하기 때문에 다수의 샘플을 병행 측정하는 데 적합하지 않다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 생물학적 시료 및/또는 생물학적 시료 성분의 움직임에 대한 광학적 시험관내 검출을 위한 방법을 제공한다. 상기 생물학적 시료는 공간적 범위를 갖는 생물학적 시료다. 바람직하게는 상기 생물학적 시료는 다수의, 특히 많은 수의 생물학적 세포(cell)를 포함하는 생물학적 시료다. 상기 생물학적 시료의 직경은 모든 공간 방향에서 적어도 50㎛일 수 있으며, 모든 공간 방향에서 바람직하게는 100㎛이상이다.
또한, 상기 생물학적 시료의 직경은 광폭 필드 조명 장치에 의해 도달할 수 있는 굴절-한계 분해능보다 크다. 그러나, 본 발명은 전술한 바와 같은 치수를 갖는 생물학적 시료에 제한되지 않는다.
상기 생물학적 시료는 3차원 세포 배양 및/또는 조직 배양 또는 세포 클러스터 형태일 수 있다. 특히, 상기 생물학적 시료는 살아있는 세포, 예를 들어 근육 세포 또는 일반적으로 활동적인 역동 능력을 갖거나, 및/또는 운동을 개시할 수 있는 세포를 포함할 수 있다.
생물학적 시료의 움직임의 검출은 특히 시료 내의 움직임 또는 생물학적 시료의 성분의 움직임으로 이해되어야 한다. 다시 말해, 공간적 범위를 지닌 생물학적 시료 내 또는 내부의 동적 현상이 일반적으로 감지 가능해야 한다. 근육 세포의 세포 배양과 함께 이러한 움직임은 예를 들어 개별적인 근육 세포의 수축에 의해 촉발될 수 있다.
그러나 생물학적 시료는 또한 자유-유영성 미생물 샘플, 예를 들어 정자일 수 있다. 이 경우 자유-유영성 미생물의 움직임을 검출하는 방법은 예를 들어 정자의 경우 정자 운동성을 결정하는 데 사용될 수 있다.
상기 생물학적 시료의 직경은 바람직하게는 5mm 이하, 더욱 바람직하게는 1mm 이하일 수 있다.
본 발명의 방법은 전체 생물학적 시료를 조명하도록 구성된 시료를 조명하기 위한 광폭 필드 조명 장치 및 생물학적 시료로부터의 광을 검출하는 검출기를 제공하는 단계를 포함한다.
상기 검출기는 복수의 검출 구역들로 세분되어 있는 검출 영역을 포함한다. 예를 들어, 검출기는 매트릭스형으로 배열된 픽셀 요소를 갖는 2차원 픽셀 어레이 검출기, 예를 들면 광 화소 센서일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 검출 영역은 적어도 100 또는 10ⅹ10개의 검출 구역들로 세분될 수 있다. 예를 들어, 검출기의 검출 영역은 10,000 또는 그 이상의 검출 구역들로 세분될 수 있다. 예를 들어 서로 인접한 다중 행으로 배열된 100ⅹ100개 또는 그 이상의 픽셀 또는 채널을 포함할 수 있다. 공간 해상도 또는 픽셀 카운트가 클수록 검출된 강도의 움직임에 의한 변화가 평균치가 아니고, 누적적으로 검출될 수 있다는 것이 보다 확실하다.
장치, 특히 상기 검출기는 각각의 검출 구역들의 검출 신호들의 시간에 대해 도함수를 형성하고, 절대값 생성 또는 제곱에 의해 상기 도함수를 수정하고, 모든 검출 구역들의 미분 및 수정된 검출 신호들을 합하거나 평균화한 후, 출력 신호로써 제공한다. 개별 검출 구역들의 검출 신호의 신호에 대한 도함수를 형성하는 것은 각각의 경우, 예를 들어 각 필셀의 각 검출 구역의 검출 신호에 대한 n차 미분 값, n≥1이 결정된다는 것을 의미한다. 바람직하게는 제1 시간에 대한 도함수는 각각의 경우, 즉 n=1에서 결정된다.
본 발명에 따르면, 개별 검출 구역들(이하, 채널 또는 픽셀이라고 한다.)의 형태로 공간적으로 분해하는 검출 영역을 갖는 검출기가 사용된다. 개별 검출 구역들의 측정 신호 또는 측정 곡선은 디지털 형태 또는 아날로그 형태로 존재할 수 있으며, 제1 단계에서 시간에 대한 미분을 거쳐 정류된다. 그러나, 개별 검출 구역들의 정류된 신호 또는 데이터는 합산되거나 평균화되며, 이에 따라 검출 영역 상의 시료에 의해 생성된 패턴 또는 이미지의 동역학에 대한 정량적 측정을 초래할 수 있다. 외부적으로, 영역 누적 이동 센서는 비공간적으로 분해된 신호 또는 데이터를 출력하는 검출기일 수 있다. 따라서, 검출기는 단일 채널 신호를 출력하도록 구성될 수 있다. 동적 파라미터를 측정하고 정의하기 위해 패턴 인식 및 궤도 생성과 같은 복잡한 분석은 필요하지 않다.
따라서, 검출기는 비화상 형성 검출기인 것이 바람직하다. 검출기의 출력 신호는 아날로그 또는 디지털일 수 있다.
본 발명의 측정 방법, 일정한 조명 강도를 갖는 정량적 밝기 변화의 총합 또는 평균에 있어서, 검출 영역 상의 밝기 변화 또는 강도 변화를 통해 시료의 동적 현상이 인식된다는 또 다른 이점이 있다. 이는 서로 긍정적인 또는 부정적인 측정을 방지한다. 또한, 측정 감도가 증가할 수 있다.
광폭 필드 조명 장치는 비-주사 조명 장치, 즉 샘플 내의 개별 이미지 평면에 초점을 맞추기 위한 광학 시스템의 사용 또는 시료 볼륨을 연속적으로 스캐닝하기 위한 광학 시스템의 사용 없이 전체 시료를 조명할 수 있는 조명 장치로 이해되어야 한다. 이러한 광폭 필드 조명 장치에서, 전체 시료 체적으로부터의 모든 신호 기여는 검출기에 의해 동시에 검출된다.
따라서, 본 발명에 따른 방법의 다른 이점은 비교적 단순한 광학 요소를 사용하여 상기 방법을 수행할 수 있고, 시료 체적을 연속적으로 스캐닝하는 광학 시스템을 생략할 수 있다는 것이다. 이에 따라, 상기 방법을 수행하는 장치는 경제적이고 구조적으로 컴팩트하게 구성될 수 있다. 또한, 이러한 방법은 부적응으로 인한 오류에 약간의 민감성이 있다.
측정 신호 및 구조적으로 컴팩트한 설계의 간단한 평가 능력 및 높은 민감성으로 인해, 상기 방법은 다수의 시료의 병행 모니터링에 특히 적합하며, 높은 공정 효율을 위해 스크리닝 환경 또는 자동화된 고속 회전 공정(높은 처리량 검사 공정)에 통합될 수 있다.
바람직한 실시예에 따르면, 개별 검출 구역들의 검출 신호들의 시간 및 정류에 대한 도함수의 형성은 집적 회로에 의해 수행된다. 예를 들어, 집적 회로는 CMOS(complementary metal oxide semiconductor) 회로일 수 있다. 이는 측정 신호의 신속한 처리 및 검출기의 경제적이고 구조적으로 컴팩트한 실시예를 가능하게 한다.
예를 들어, 시료 및/또는 시료 성분의 움직임은 검출기의 출력 신호의 값이 미리 결정된 임계 값을 초과하는 경우에 검출될 수 있다. 근육 세포의 경우에는, 출력 신호가 주기성을 갖는 경우에 시료의 움직임을 감지할 수 있다.
특히 바람직한 실시예에 따르면, 시료 내의 움직임은 회절 패턴의 변화에 기초하여 인식된다. 이 실시예에 따르면, 광폭 필드 조명 장치는 간섭 광을 생성하는 광원을 포함하고, 시료에 의해 회절된 광원으로부터의 광에 의해 생성된 회절 패턴의 적어도 일부가 검출기의 검출 영역 상에 맵핑될 수 있다.
회절 패턴에서 패턴의 각 포인트는 전체 시료로부터의 신호 기여를 포함한다. 따라서, 원칙적으로 시료에 의해 생성된 회절 패턴의 부분 영역을 검출기로 검출하는 것으로 충분하다. 변화하는 운동 패턴의 전체적인 밝기는 시간에 따라 거의 일정하게 유지되지만, 시료 내의 움직임은 움직임 패턴, 예를 들어 스펙클 패턴(speckle pattern)의 변화를 생성한다. 본 발명의 측정 방법을 통해 검출 영역을 더 작은 검출 구역으로 세분화하고, 측정 곡선이 가산되거나 평균화되기 전에 측정 곡선의 시간 변화를 정류하는 접근법을 사용하여 시료에서의 움직임에 의해 발생된 변화가 평균화되는 것을 방지한다.
특히, 전체 회절 패턴이 검출 영역 상에 이미지화되는 변형 예가 유리하다. 이것에 의해, 동작 인식의 감도가 향상된다. 또한, 전체 패턴의 사용은 (작은 패턴 부분의 측정과 비교하여) 측정의 근본적으로 개선된 재현성 및 유사한 시료 간의 일정한 양립성에 이르게 한다.
생성된 회절 패턴의 변화로 인해 시료 내의 움직임이 인식되는 예로서 강조된 실시예 이외에, 광폭 필드 조명 장치는 검출 영역 상에 시료의 이미지를 재현하도록 구성될 수 있다. 다른 실시예에 따르면, 광폭 필드 조명 장치는 간섭성 또는 비간섭성 광을 생성할 수 있는 광원과, 검출 시 검출 영역 상에 시료를 이미지화하기 위해 이미징 광 경로를 생성하도록 구성된 광학 시스템을 포함한다.
여기서, 광범위하게 다른 와이드-필드 조명 및/또는 이미징 접근법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 광폭 필드 조명 장치는 투과-광 현미경, 암시야 현미경 또는 와이드-필드 형광 현미경일 수 있다. 와이드-필드 조명 장치의 타입 및/또는 시료에 대한 검출기의 위치에 따라, 시료로부터 들어오고 검출기에 검출된 광은 시료의 방사 방향 및/또는 편광 상태와의 상호 작용에 의해 시료 내의 임의의 원하는 위치에서 변경되는 와이드-필드 조명 장치의 광원의 광(radiation), 특히 빛이 될 수 있다.
와이드-필드 조명 장치는 조사 측에 배치된 조명 광학 시스템을 포함할 수 있으며, 조명 광학 시스템은 시료를 완전히 균일하게 조명하기 위해 광원의 광이 전체 시료로 지향되는 것을 특징으로 한다. 또한, 광학 시스템은 시료와의 상호 작용을 통해 시료 내의 임의 지점에서 그 방사 방향, 편광 상태 및/또는 회절 패턴이 검출기의 검출기 표면 상으로 변화되는 광원을 포함한다. 조명 광학 시스템 및/또는 검출 광학 시스템의 이러한 기능적 특성은 이후의 실시예를 참조하여 이후에 설명되는 바와 같이, 예를 들어 필터, 렌즈, 조리개(어퍼쳐), 굴절 소자 등과 같은 하나 이상의 적절하게 배열되고 설계된 공지된 광학 구성 요소를 사용하여 실현될 수 있다.
또한, 본 발명의 방법은 시료용 리셉터클을 제공하는 단계를 포함할 수 있다. 시료용 리셉터클은 캐리어 매트릭스, 바람직하게는 바이오폴리머를 포함할 수 있다. 시료용 리셉터클은 또한 행잉 드롭(hanging drop) 내에 위치하는 캐리어 매트릭스로서 설계될 수 있으며, 캐리어 매트릭스는 바람직하게는 예를 들어 알긴산과 같은 바이오폴리머이다. 시료의 리셉터클은 스크리닝 환경에서 상기 방법을 사용하기 위한 멀티-웰 플레이트(multi-well plate)(microtitre plate))의 캐비티 일 수 있다. 리셉터클 또한 개별 캐비티에 행잉 드롭을 형성하도록 설계된 멀티-웰 플레이트의 캐비티가 될 수 있다. 이러한 행잉 드롭 멀티 웰 플레이트는 예를 들어, Insphero AG, CH-8952 Schlieren에 의해 "GravityPLUSTM 3d Culture and Assay Platform"이라는 이름으로 제공된다. 특허문헌 EP2342317B1 또한 그러한 플레이트를 개시한다.
이미 상기 방법은 자동화된 고 처리량 방법의 일부로서 검사될 시료, 예컨대 다수의 시료의 병렬 모니터링에 특히 적합하다는 것이 이미 언급되었다. 따라서, 본 방법의 또 다른 유리한 개선점은 움직임의 병행 광학 검출이 서로 분리된 몇몇 생물학적 시료에서 동일하게 수행된다는 것이 고려된다.
생물학적 시료용 리셉터클은 바람직하게는 여기에 멀티-웰 플레이트 또는 행잉 드롭 멀티-웰 플레이트일 수 있다. 시료를 수용하기 위해 행과 열로 배열된 다수의 캐비티를 갖는다. 검출기는 검출기 어레이로서, 바람직하게는 포토다이오드 어레이로서 설계되며, 개별 검출기의 그리드 거리는 멀티 웰 플레이트의 캐비티의 그리드 거리와 동일하다.
검출기의 검출 영역의 직경은 9mm 이하일 수 있다. 멀티-웰 플레이트, 특히 96 웰 플레이트에 담긴 시료의 움직임 감지에 검출기를 사용하는 경우에 특히 유용하다.
광원은 개개의 캐비티를 조명하도록 구성된다. 유리한 변형예에 따르면, 캐비티 내의 샘플을 조명하기 위한 광원은 레이저 다이오드 어레이로서 구성되며, 개별 레이저 다이오드의 그리드 거리는 멀티 웰 플레이트의 캐비티의 그리드 거리와 동일하다. 레이저 다이오드 어레이는 공간 절약 및 에너지 효율적인 조명 소스를 나타낸다.
양호한 방열을 가능하게 하기 위해, 레이저 다이오드 어레이의 브라킷은 열전도성 재료, 바람직하게는 알루미늄으로 제조될 수 있다. 이 변형예에 따른 광학 기는 또한 렌즈 어레이의 각각의 렌즈가 레이저 다이오드 중 하나에 할당되고 렌즈가 레이저 다이오드의 광을 캐비티로 안내하는 렌즈 어레이, 예를 들어 마이크로 렌즈 어레이를 포함할 수 있다.
광원은 레이저 다이오드 어레이 대신에 광원로서 종래의 광원(레이저, 아크 램프 등)으로 설계될 수 있으며, 여기서 광원의 광은 샘플을 광섬유 번들에 의해 조명하기 위한 샘플을 내포하는 개별 캐비티에 결합된다. 각 광섬유는 여기서 캐비티에 할당된다. 이것은 샘플 근처에서 과도한 열 발산을 피하기 위해 샘플로부터 충분한 거리에서 광원을 작동시킬 수 있다는 이점을 제공하는 것이다.
또 다른 변형예에 따르면, 단순한 실현 변형예을 나타내는 것으로, 광원이 대응 성능 용량을 가져야 하므로, 에너지 효율의 단점을 갖는 광원을 갖는 멀티-웰 플레이트를 표면에 조명하는 가능성이 존재한다. 빛이 편리하게 설계된 응축기 광학기구를 통해 안내되고 여기에 병행하게 되고 캐비티에서 목표로 하는 각도 의존적인 통과 필터가 있을 경우 이점이 있다
본 발명의 다른 일 실시예에 따르면, 생물학적 시료 및/또는 시료 성분의 움직임을 비접촉식 시험관내 검출을 위한 장치가 제공된다. 생물학적 시료의 직경은 모든 공간 방향에서 적어도 50㎛일 수 있다.
장치는 전체 생물학적 시료를 조명하도록 구성된 시료를 조명하기 위한 광폭 필드 조명 장치를 포함한다. 장치는 복수의 검출 구역들로 세분되어 있는 검출 영역을 포함하고, 상기 생물학적 시료로부터의 광을 검출하는 검출기를 더 포함한다. 검출기는 각각의 검출 구역들의 검출 신호들의 시간에 대해 도함수를 형성하고, 절대값 생성 또는 제곱에 의해 상기 도함수를 수정하고, 모든 검출 구역들의 미분 및 수정된 검출 신호들을 합하거나 평균화한 후, 출력 신호로써 제공한다.
본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 검출기는 각각의 검출 구역들의 검출 신호들의 시간에 대한 도함수 형성 및 수정을 수행하도록 구성된 집적 회로, 바람직하게는 CMOS 회로를 포함한다.
검출기는 단일 채널 신호 및/또는 검출 영역에 대해 비공간적으로 분해된 신호 또는 데이터를 출력할 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 복수의 검출 구역들로 세분되어 있는 검출 영역을 포함하는 광학적 검출을 위한 검출기가 제공된다. 검출기는 각각의 검출 구역들의 검출 신호들의 시간에 대해 도함수를 형성하고, 절대값 생성 또는 제곱에 의해 상기 도함수를 수정하고, 모든 검출 구역들의 미분 및 수정된 검출 신호들을 합하거나 평균화한 후, 출력 신호로써 제공하도록 구성될 수 있다.
순수하게 방법의 일부로서 공개된 특징들은 또한 반복을 피하기 위해 장치에 대해 공개되고 청구된 것으로 간주되어야 한다. 본 발명의 상기 언급된 양태 및 특징은, 특히 검출기, 광폭 필드 조명 장치의 구성과 관련된 양태 및 특징은 예를 들어 장치에도 역시 적용된다.
전술한 바람직한 실시예 및 본 발명의 특징은 임의의 방식으로 서로 결합될 수 있다. 본 발명의 추가의 세부 사항 및 이점은 첨부된 도면을 참조하여 후술될 것이다. 동일한 부분들은 도면들에서 동일한 참조 번호들로 식별되고 별도로 설명되지 않을 것이다.
본 발명에 따른 검출 방법은 비교적 간단한 광학 요소들을 사용하여 수행될 수 있고, 개별 이미지 레벨에 초점을 맞추고 샘플 볼륨을 연속적으로 스캔하기 위한 광학기구는 필요하지 않으며, 따라서, 본 방법을 수행하기 위한 장치는 비용면에서 효율적으로 실현될 수 있고 콤팩트한 구조로 구현될 수 있다.
측정 신호의 단순한 평가 및 컴팩트한 구조 덕분에 본 발명에 따른 검출 방법은 다수의 샘플을 동시에 모니터링하는 데 적합하며 선별적인 환경이나 자동화된 고 처리 공정, 예를 들어 고 처리 스크리닝 공정에 프로세스-효율 방식으로 통합될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 방법 및 장치를 개략적으로 도시한 것이다.
도 2는 검출 영역 상의 스펙클 패턴의 표면을 도시한 것이다
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 검출기의 데이터 처리 공정을 개략적으로 도시한 것이다.
도 4는 개별 픽셀의 측정 값에 대한 도함수 및 정류 효과를 도시한 것이다.
도 5는 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 방법 및 장치를 개략적으로 도시한 것이다.
각 도면을 설명하면서 유사한 참조부호를 유사한 구성요소에 대해 사용하였다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 방법 및 장치를 개략적으로 도시한 것이다.
상기 방법을 수행하기 위하여, 생물학적 시료(1)에서의 움직임에 대한 광학적 시험관내 검출을 위한 장치가 제공된다. 생물학적 시료(1)는 근육 조직으로부터의 세포 집합체일 수 있다.
장치는 시료(1)를 위한 리셉터클(미도시), 광폭 필드 조명 장치(2) 및 검출기(3)를 포함한다.
리셉터클은 특정 유형의 리셉터클에 국한되지 않고, 예를 들어 캐리어, 캐리어 플레이트 또는 용기로서, 멀티 웰 플레이트의 캐비티로서 또는 시료의 적용 및 유형에 따라 편리하게 설계될 수 있다. 시료가 배양되는 생체 고분자의 형태, 예를 들어 알긴산 염 형태의 담체 매트릭스로서 존재할 수 있다.
도 1에 도시된 예시적인 실시예에서, 광폭 피드 조명 장치는 간섭성 광(레이저)을 생성하는 광원이다. 전체 시료(1)는 광원(2)에 의해 생성된 간섭성 광(8)에 의해 조명된다. 샘플을 완전히 균일하게 조명하기 위하여, 광원(2)의 방사선이 전체 시료(1) 상에 지향되는 조명 광학 시스템(미도시)을 제공하는 것이 적합할 수 있다. 광학 요소의 이러한 기능 특성은 하나 이상의 적절하게 배열되고 설계된 공지된 광학 구성 요소, 예를 들어 필터, 렌즈, 조리개(apertures), 굴절 소자 등과 같은 구성 요소를 사용하여 실현될 수 있다.
시료(1)에서 회절된 광원(2)의 광은, 예를 들어 도2에 도시된 바와 같이, 스펙클 패턴(20)의 형태로 높은 강도의 중심 및 낮은 세기의 에지 영역을 갖는 회절 패턴을 생성한다.
장치는 회절 패턴(20)을 검출하기 위한 광학 검출기(3)를 더 포함한다. 검출기(3)는 시료(1)에 의해 회절된 광원(2)으로부터의 광(9)에 의해 생성된 회절 패턴(20)이 검출기(3)의 검출 영역(3a) 상에 맵핑한다.
여기서, 검출 영역은 2차원 화소 배열 영역으로서 형성되고, 검출 영역(3a)은 개별 화소(4)에 의해 복수의 검출 영역(4a)으로 세분된다. 검출 영역은 다수의 픽셀들(4), 예를 들어 도 1에 도시되지는 않았으나, 10ⅹ10 이상의 펙셀들(4)로 세분된다. 따라서, 각 픽셀은 스펙클 패턴(20)의 일부를 측정한다.
개별 픽셀(4)의 측정된 광 세기에 기초한 데이터 공정도 도 3을 참조하여 설명한다.
도 3은 개별 필셀(4a)로 세분된 검출 영역(3a)의 사시도이다. 각 필셀(4)은 각 픽셀 영역(검출 구역, 4a)에서의 광 강도의 시간 변화를 검출 신호(4c)의 형태로 출력한다. 순전히 예시로서 참조 부호 30a로 표시된 바와 같이, 제1 픽셀의 그러한 시간 변화가 측정되고, 상기 픽셀은 하강 곡선 형태에 의해 도시된 바와 같이 광 세기의 감소를 측정한다. 동시에, 제2 픽셀은 참조 부호 30b로 표시된 바와 같이 광 세기의 증가를 측정할 수 있다.
이러한 시간 변화는 시료 내의 움직임 또는 시료 성분의 움직임에 기인하며, 이는 시료에 의해 생성된 회절 패턴(20)이 변경됨을 의미한다.
제1 단계(S1)에서, 시간에 대한 도함수는 개별 픽셀(4)의 측정된 검출 신호(4c)로부터 형성된다. 이 미분 연산의 결과는 곡선(31a, 31b)에 의해 예로서 도시된다. 이어서, 제2 단계(S2)에서 개별 결과, 즉 각 픽셀(4)의 미분 측정 결과가 예를 들어 절대값 생성 또는 제곱에 의해 정류된다. 이러한 정류의 결과는 예로서 곡선(32a, 32b)에 의해 도시된다.
제3 단계(S3)에서, 모든 픽셀(4)의 미분 및 정류된 검출 신호는 합산(또는 대안적으로 편균화)된 다음, 검출기(3)의 축력 신호(6c)로서 제공된다. 이 합산의 결과는 곡선 33에 의해 보여진다.
이 경우, 개별 픽셀의 측정 데이터의 시간 및 후속 정류에 대한 차별화는 검출기(3)의 집적 회로 CMOS에 의해 수행된다. 따라서, 이 CMOS 회로는 각 픽셀에 대해 미분 및 정류된 신호(5c)를 출력한다. 이후, CMOS의 출력 데이터는 합산기(6)에서 합산된다.
따라서, 검출기(3)는 단지 하나의 데이터 출력(6c)을 갖는 검출기로서 바깥쪽에 나타나며, 이를 통해 비공간적으로 분해된 신호/데이터(7)가 출력된다. 검출 영역(3a)과 관련하여 비공간적으로 분해된 신호는 누적 면적, 즉 전체 감지 영역에서 시료의 동적 현상에 의해 생성된 양적 밝기 변화의 총계(또는 평균)를 측정한다.
시료의 움직임은 출력 신호(7)에서 피크로 이어지며, 이는 쉽게 인식할 수 있다.
본 발명의 접근법의 이점을 명확하게 하기 위하여, 도 4는 검출 영역(3a)의 랜덤하게 선택된 이미지 영역(간략화를 위해 '픽셀'로 명명됨, 4), 이 경우 픽셀 48, 72, 96, 120, 144의 측정 값의 미분 및 정류의 영향을 도시한 것이다. 본 발명의 시연을 위해, 심장 근육 조직 모델로 기록된 스펙클 패턴의 비디오를 비디오 소프트웨어로 192개의 이미지 세그먼트(픽셀)로 분해하고, 각 세그먼트의 평균 밝기를 시간의 함수(Ji(t))로서 기록하였다. 데이터 분석 소프트웨어의 도움으로 Ji(t)는 미분화되고 제곱한 후, 이들 처리된 데이터 세트를 합산하였다(ε(¶Ji/¶t2).
도 4의 좌측 열의 5개의 상부 그래프는 각각 검출기(3)의 픽셀 48, 72, 96, 120, 144에 의해 측정된 광 세기의 시간 변화(30)를 나타낸 것이다. 모든 이미지 세그먼트들의 측정 값들이 합산된다면, 도 4의 좌측 아래 다이어그램에 도시된 시간 변화로 결과가 보여지며, 이는 시료에서의 움직임은 확실하게 감지할 수 없다.
도 4의 우측 열의 5개의 상부 그래프는 각각 픽셀 48, 72, 96, 120, 144의 측정된 광 세기의 미분화되고 순차적으로 정류된 시간 변화(32)를 나타낸 것이다. 모든 이미지 세그먼트들의 처리된 값들이 합산된다면, 도 4의 우측 하단에 도시된 바와 같이 시간 변화(33)가 나타난다. 이로써, 시료의 움직임은 변화(33)의 개별 피크를 통해 쉽게 감지할 수 있다.
도 5는 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 방법 및 장치를 개략적으로 도시한 것이다. 여기서, 동일한 참조 부호를 갖는 구성요소는 도 1의 구성요소와 동일하며 별도로 설명하지 않는다.
전체 생물학적 시료(1)는 광폭 필드 조명 장치에 의해, 즉 시료 내의 개별적인 이미지 평면에 초점을 맞추기 위해서 또는 시료 볼륨을 연속적으로 스캐닝하기 위한 광학 시스템의 사용 없이 조명된다. 본 실시예의 특징은 광폭 필드 조명 장치의 광원이 간섭 광을 생성하지 않는다는 것이다. 결과적으로, 시료(1)에 의해 검출 가능한 회절 패턴이 생성되지 않는다. 오히려, 광폭 필드 조명 장치의, 예를 들어 볼록 렌즈의 형태인 광학 시스템(10)이 제공되어, 이를 통해 촬상 광 경로(9a, 9b)가 생성되어, 시료(1)를 검출기(3)의 검출 영역(3a)에 투영한다. 예를 들어, 광폭 필드 조명 장치는 투과-광 현미경, 암시야 현미경 또는 와이드-필드 형광 현미경일 수 있다. 측정 데이터의 처리공정은 전술한 실시예와 유사하게 진행된다. 따라서, 이미징 광학 시스템을 갖는 실시예는 공간 샘플을 모니터링하는데 적합하지만, 회절 패턴에 기초한 실시예보다 유리한 것으로 고려된다.
본 발명이 특정 실시예를 참조하여 설명되었지만, 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 다른 변경이 수행될 수 있고 등가물이 대체물로서 사용될 수 있음은 당업자에게 명백하다. 또한 많은 수정이 관련 범위를 벗어나지 않고 수행될 수 있다. 결론적으로, 본 발명은 개시된 실시예에 한정되지 않고, 첨부된 특허청구범위에 속하는 모든 실시예를 포함해야 한다. 본 발명은 특히, 청구된 청구범위에 관계없이, 대상에 대한 보호 및 종속 관계의 특성을 모두 청구한다.
1: 생물학적 시료 2: 광폭 필드 조명 장치, 광원
3: 검출기 4: 픽셀
5: 집적회로 6: 합산기
7: 출력신호 8: 간섭광

Claims (16)

  1. (a) 전체 생물학적 시료(1)를 조명하도록 구성된 시료를 조명하기 위한 광폭 필드 조명 장치 및 생물학적 시료로부터의 광(9; 9a, 9b)을 검출하는 검출기(3)를 제공하는 단계;
    (b) 상기 생물학적 시료(1)를 상기 광폭 필드 조명 장치로 조명하는 단계; 및
    (c) 상기 검출기(3)의 출력 신호(6c)에 따라 상기 생물학적 시료(1)의 움직임을 검출하는 단계를 포함하고,
    상기 검출기(3)는 복수의 검출 구역들(4a)로 세분되어 있는 검출 영역(3a)을 포함하고, 상기 각각의 검출 구역들(4a)의 검출 신호들(4c)의 시간에 대해 도함수를 형성하고(S1), 절대값 생성 또는 제곱에 의해 상기 도함수를 수정하고(S2), 모든 검출 구역들(4a)의 미분 및 수정된 검출 신호들(4c)을 합산하거나 평균화한 후(S3), 출력 신호(6c)로써 제공하는 것을 특징으로 하는 생물학적 시료의 움직임에 대한 광학적인 시험관내 검출 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 각각의 검출 구역들의 검출 신호들의 시간에 대한 도함수 형성(S1) 및 수정(S2)은 집적 회로(5), 바람직하게는 CMOS 회로에 의해 검출기(3)에서 수행되는 것을 특징으로 하는 생물학적 시료의 움직임에 대한 광학적인 시험관내 검출 방법.
  3. 전술한 항들 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) 상기 검출기(3)는 단일 채널 신호(33)를 출력하고, 및/또는
    (b) 상기 검출기가 상기 검출 영역(3a)에 대해 공간적으로 분해되지 않은 신호(33) 또는 데이터를 출력하고, 및/또는
    (c) 상기 검출기93)는 비화상 형성 검출기인 것을 특징으로 하는 생물학적 시료의 움직임에 대한 광학적인 시험관내 검출 방법.
  4. 전술한 항들에 있어서,
    상기 광폭 필드 조명 장치는 간섭 광을 생성하는 광원(2)을 포함하고, 상기 시료(1)에 의해 회절된 상기 광원(2)으로부터의 광(9)에 의해 생성된 회절 패턴(20)의 적어도 일부가 상기 검출기(3)의 상기 검출 영역(3a) 상에 이미징되는 것을 특징으로 하는 생물학적 시료의 움직임에 대한 광학적인 시험관내 검출 방법.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 광폭 필드 조명 장치는 광원 및 광학 시스템(10)을 포함하고, 상기 광학 시스템(10)은 상기 검출기(3)의 상기 검출 영역(3a)에 시료(1)를 이미지화하기 위한 이미징 선 경로(9a, 9b)를 생성하는 것을 특징으로 하는 생물학적 시료의 움직임에 대한 광학적인 시험관내 검출 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 광폭 필드 조명 장치는 투과-광 현미경, 암시야 현미경 또는 와이드-필드 형광 현미경인 것을 특징으로 하는 생물학적 시료의 움직임에 대한 광학적인 시험관내 검출 방법.
  7. 전술한 항들 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 시료(1)의 움직임 및/또는 상기 시료(1)의 성분의 움직임은 상기 검출기의 상기 출력 신호(33)의 값이 미리 결정된 임계 값을 초과하는 경우 및/또는 상기 출력 신호(33)가 주기성을 갖는 경우에 검출되는 것을 특징으로 하는 생물학적 시료의 움직임에 대한 광학적인 시험관내 검출 방법.
  8. 전술한 항들 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 생물학적 시료(1)는
    (a) 3차원 세포 배양 및/또는 조직 배양 또는 세포 클러스터이거나, 또는 (b) 자유-유영성 미생물의 샘플, 예를 들어 정자인 것을 특징으로 하는 생물학적 시료의 움직임에 대한 광학적인 시험관내 검출 방법.
  9. 전술한 항들 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 시료(1)용 리셉터클이,
    (a) 서포트 매트릭스, 바람직하게는 바이오폴리머(15)를 포함하고; 및/또는 (b) 행잉 드롭(hanging drop)을 포함하고; 및/또는
    (c) 멀티웰 플레이트 또는 행잉 드롭 멀티웰 플레이트의 캐비티(cavity)인 것을 특징으로 하는 생물학적 시료의 움직임에 대한 광학적인 시험관내 검출 방법.
  10. 전술한 항들 중 어느 한 항에 있어서,
    각각의 움직임에 대한 병행 광학 검출이 복수의 상호 분리된 생물학적 시료 또는 시료 성분에서 수행되고,
    시료용 리셉터클은 복수의 캐비티를 포함하는 시료들을 수용하기 위해 행과 열로 배열된 다수의 캐비티를 갖는 멀티웰 플레이트 또는 행잉 드롭 멀티웰 플레이트이며,
    복수의 검출기(3)가 검출기 어레이의 형태로 제공되고, 검출기 어레이의 검출기는 각각의 캐비티와 관련된 것을 특징으로 하는 생물학적 시료의 움직임에 대한 광학적인 시험관내 검출 방법.
  11. 전술한 항들 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 검출기(3)의 상기 검출 영역(3a)의 직경은 9mm 이하인 것을 특징으로 하는 생물학적 시료의 움직임에 대한 광학적인 시험관내 검출 방법.
  12. 전술한 항들 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) 상기 생물학적 시료(3)는 다수의 셀을 포함하고, 및/또는
    (b) 상기 생물학적 시료의 직경은 모든 공간 방향에서 적어도 50㎛이며, 및/또는
    (c) 상기 생물학적 시료의 직경은 광폭 필드 조명 장치에 의해 도달할 수 있는 굴절-한계 분해능보다 큰 것을 특징으로 하는 생물학적 시료의 움직임에 대한 광학적인 시험관내 검출 방법.
  13. 전체 생물학적 시료(1)를 조명하도록 구성된 시료를 조명하기 위한 광폭 필드 조명 장치; 및
    복수의 검출 구역들(4a)로 세분되어 있는 검출 영역(3a)을 포함하고, 상기 생물학적 시료로부터의 광을 검출하는 검출기(3)를 포함하며,
    상기 검출기(3)는 상기 각각의 검출 구역들(4a)의 검출 신호들(4c)의 시간에 대해 도함수를 형성하고, 절대값 생성 또는 제곱에 의해 상기 도함수를 수정하고, 모든 검출 구역들(4a)의 미분 및 수정된 검출 신호들(4c)을 합하거나 평균화한 후, 출력 신호(33)로써 제공하는 것을 특징으로 하는 생물학적 시료의 움직임의 비접촉식 시험관내 검출 장치.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 검출기는 상기 각각의 검출 구역들(4a)의 검출 신호들(4c)의 시간에 대한 도함수 형성 및 수정을 수행하도록 구성된 집적 회로(5), 바람직하게는 CMOS 회로를 포함하는 것을 특징으로 하는 생물학적 시료의 움직임의 비접촉식 시험관내 검출 장치.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서,
    (a) 상기 검출기(3)는 단일 채널 신호(33)를 출력하고, 및/또는
    (b) 상기 검출기(3)가 상기 검출 영역에 대해 공간적으로 분해되지 않은 신호 (33)를 출력하고, 및/또는
    (c) 상기 검출 영역(3a)이 적어도 100 또는 10ⅹ10 멀티 라인으로 인접 배열된 픽셀들(4)로 세분되는 것을 특징으로 하는 생물학적 시료의 움직임의 비접촉식 시험관내 검출 장치.
  16. 광학적 검출을 위한 검출기(3)로서,
    상기 검출기(3)는 복수의 검출 구역들(4a)로 세분되어 있는 검출 영역(3a)을 포함하고,
    상기 검출기(3)는 상기 각각의 검출 구역들(4a)의 검출 신호들(4c)의 시간에 대해 도함수를 형성하고, 절대값 생성 또는 제곱에 의해 상기 도함수를 수정하고, 모든 검출 구역들(4a)의 미분 및 수정된 검출 신호들(4c)을 합하거나 평균화한 후, 출력 신호(33)로써 제공하는 것을 특징으로 하는 검출기.
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