KR20180071258A - Psma-표적화된 nir 염료 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 개시는 근적외선(NIR) 염료에 접합된, 전립선 특이적 막 항원(PSMA)-표적화된 화합물, 및 이를 치료 및 진단에 사용하는 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 개시는 전립선 특이적 막 항원(PSMA)을 발현하는 세포 및/또는 맥관구조와 연관된 질환을 진단하고 치료하는 화합물 및 방법을 제공한다. 본 개시는 상기 화합물을 제조하고 사용하는 방법 및 조성물, 상기 화합물을 도입하는 방법, 및 상기 화합물을 포함하는 키트도 기술한다.
Description
관련 출원
본 특허출원은 내용이 본 개시 내로 전체로서 참고로 도입되는, 2015년 9월 9일자로 출원된 미국 가특허출원 제62/216,157호와 관련되어 있고 이 가특허출원의 우선권 이익을 주장한다.
발명의 분야
본 개시는 전립선 특이적 막 항원(PSMA)-표적화된 근적외선(NIR) 염료 및 이를 치료 및 진단에 사용하는 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 개시는 전립선 특이적 막 항원(PSMA)을 발현하는 세포, 예컨대, 전립선암 및 관련 질환을 진단하고 수술(영상-안내된 수술)로 제거하는 화합물 및 방법을 제공한다. 본 개시는 상기 화합물을 제조하고 사용하는 방법 및 조성물, 상기 화합물을 도입하는 방법, 및 상기 화합물을 포함하는 키트도 기술한다.
전립선은 방광 아래의 골반에서 발견되는 남성 생식 장기들 중 하나이다. 이것은 생식 동안 질 내로 도입되는 정자의 생존에 필수적인 영양분 및 유체를 제공하는 정액을 생성하고 저장하는 기능을 수행한다. 많은 다른 조직들처럼, 전립선도 악성(암성) 또는 양성(비암성) 종양을 발생시키는 경향을 가진다. 미국 암학회는 2005년에 230,000명 이상의 남성들이 전립선암으로 진단받을 것이고 30,000명 이상의 남성들이 이 질환으로 인해 사망할 것이라고 예측하였다. 실제로, 전립선암은 서구 사회에서 가장 흔한 남성 암들 중 하나이고, 미국 남성들 사이에서 두 번째로 많은 형태의 악성종양이다. 전립선암에 대한 현재 치료 방법은 호르몬 요법, 방사선 요법, 수술, 화학요법, 광역학 요법 및 조합 요법을 포함한다. 치료의 선택은 일반적으로 암의 단계에 따라 달라진다. 그러나, 이들 치료들 중 대다수는 환자, 특히 50세 이상의 연령에서 전립선암으로 진단된 남성의 삶의 질에 영향을 미친다. 예를 들면, 호르몬 약물의 사용은 골다공증 및 간 손상과 같은 부작용을 종종 동반한다. 이러한 부작용은 질환 상태를 책임지는 조직에 더 선택적이거나 특이적이고 뼈 또는 간과 같은 비표적 조직을 피하는 치료의 사용에 의해 경감될 것이다. 본원에 기재된 바와 같이, 전립선 특이적 막 항원(PSMA)은 이러한 선택적 또는 특이적 치료를 위한 표적을 대표한다.
악성 질환의 수술적 제거는 암의 일차 치료를 위한 가장 흔하고 효과적인 요법 중 하나를 구성한다. 모든 검출가능한 악성 병변의 절제는 모든 암 환자들의 대략 50%에서 질환의 검출가능한 재발을 초래하지 않고 암의 재발이 관찰되는 환자의 경우 기대 수명을 연장시킬 수 있거나 이환율을 감소시킬 수 있다. 놀랄 것 없이, 더 많은 정량적 세포감소(cytoreduction)를 달성하는 수술 방법은 현재 더 큰 정밀조사를 받고 있다.
모든 검출가능한 악성 병변의 절제는 모든 암 환자들의 대략 50%에서 질환의 검출가능한 재발을 초래하지 않고 암의 재발이 관찰되는 환자의 경우 기대 수명을 연장시킬 수 있거나 이환율을 감소시킬 수 있다. 악성 병변의 전체 절제의 중요성을 고려할 때, 악성 병변이 정확히 및 완전하게 확인되는 것을 보장하는 것이 유리하다. 수술 동안 악성 조직의 확인은 현재 3종의 방법들에 의해 달성된다. 첫 번째, 비정상적인 색채, 질감 및/또는 형태를 기초로 많은 종양 덩어리들 및 결절들을 시각적으로 검출할 수 있다. 따라서, 종양 덩어리는 얼룩덜룩한 색채를 나타낼 수 있거나, 불규칙적인 경계를 가진 비대칭으로 보일 수 있거나, 건강한 장기의 윤곽으로부터 돌출될 수 있다. 악성 덩어리는 가소성, 탄성 또는 고체성의 차이로 인해 인접 건강한 조직으로부터 촉각에 의해 인식될 수도 있다. 마지막으로, 원발성 종양으로부터 배출 림프절 내로 수동적으로 유동하는 형광 염료를 사용하여 몇몇 암 병소들의 위치를 수술 중에 찾아낼 수 있다. 이 후자 방법에서, 암 세포가 이들 림프절들로 전이되었는지를 확인하기 위해 형광 (센티넬(sentinel)) 림프절을 시각적으로 확인할 수 있고 절제할 수 있고 조사할 수 있다.
PSMA의 명칭은 전립선암 세포 상에서의 그의 보다 높은 발현 수준에 주로 기인하나; 전립선암 세포에 대한 그의 구체적인 기능은 파악되지 않은 상태로 남아있다. PSMA는 인체 내의 다른 장기, 예컨대, 신장, 근위 소장 및 타액선과 비교될 때 악성 전립선 조직에서 과다발현된다. PSMA는 대다수의 고형 종양들의 신생맥관구조에서도 발현된다. PSMA가 뇌에서 발현될지라도, 그 발현은 최소한이고, PSMA의 대다수 리간드들은 극성을 띠고 혈액 뇌 장벽을 침투할 수 없다. PSMA는 세포내 분절(아미노산 1-18), 경막 도메인(아미노산 19-43) 및 광범위한 세포외 도메인(아미노산 44-750)을 포함하는, 약 110 kD 분자량을 가진 II형 세포 표면 막-결합된 당단백질이다. 세포내 분절 및 경막 도메인의 기능은 현재 중요하지 않은 것으로 생각되지만, 세포외 도메인은 여러 상이한 활성들에 관여한다. PSMA는 중추신경계에서 N-아세틸-아스파르틸 글루타메이트(NAAG)를 글루탐산 및 N-아세틸 아스파르트산으로 대사하는 역할을 한다. 따라서, N-아세틸 알파에 결합된 산성 디펩티다제(dipeptidase)(NAALADase)로서도 종종 지칭된다. PSMA는 근위 소장에서 폴리-y-글루타메이트화된 폴레이트로부터 γ-결합된 글루타메이트를 제거하고 펩티드 및 소분자로부터 a-결합된 글루타메이트를 제거하는 그의 역할로 인해 폴레이트 하이드롤라제(hydrolase) I(FOLH I) 또는 글루타메이트 카복시펩티다제(carboxypeptidase)(GCP II)로서도 종종 지칭된다.
PSMA 및 인간 트랜스페린 수용체(TfR) 둘 다가 II형 당단백질이기 때문에, PSMA는 TfR과도 유사성을 공유한다. 보다 구체적으로, PSMA는 TfR1 및 TfR2에 대한 각각 54% 및 60% 상동성을 보인다. 그러나, TfR이 가닥 사이의 설프하이드릴 결합의 형성으로 인해 이량체 형태로만 존재할지라도, PSMA는 이량체 또는 단량체 형태로 존재할 수 있다.
많은 다른 막-결합된 단백질들과 달리, PSMA는 비타민 수용체와 같은 세포 표면-결합된 수용체와 유사한 방식으로 세포 내로의 신속한 내재화를 겪는다. PSMA는 클라쓰린(clathrin)-코팅된 막공(pit)을 통해 내재화된 후, 세포 표면으로 재순환될 수 있거나 라이소좀으로 갈 수 있다. 상호전환의 직접적인 증거가 논쟁되고 있이만, PSMA의 이량체 형태와 단량체 형태는 상호전환될 수 있는 것이 암시되었다. 그렇다고 할지라도, PSMA의 이량체만이 효소 활성을 갖고, 단량체는 효소 활성을 갖지 않는다.
전립선암 세포의 세포 표면 상의 PSMA의 역할은 알려져 있지 않은 상태로 남아있을지라도, PSMA는 진단제, 영상화제 및 치료제를 포함하는 생물학적 활성 물질을 이러한 전립선암 세포에게 선택적 및/또는 특이적으로 전달하기 위한 실용적인 표적을 대표하는 것으로 인식되어 있다.
PROSTASCINT® 스캔으로서 알려져 있는, 항-PSMA 단일클론 항체(mAb) 7E11의 방사면역접합체는 전립선암 전이 및 재발을 진단하는 데 현재 사용되고 있다. 그러나, 이 물질은 해석하기 어려운 영상을 생성하는 경향을 가진다(Lange, P.H. PROSTASCINT scan for staging prostate cancer. Urology 2001, 57, 402-406; Haseman, M.K.; et al. Cancer Biother Radiopharm 2000, 15, 131-140; Rosenthal, S.A.; et al. Tech Urol 2001, 7, 27-37). 이 물질은 괴사 전립선암 세포에서 PSMA의 세포내 에피토프에 결합한다. 보다 최근에, PSMA의 세포외 도메인에 결합하고 방사성표지되고 동물에서 PSMA 양성 전립선 종양 모델 내에서 축적하는 것으로 밝혀진 단일클론 항체가 개발되었다. 그러나, 단일클론 항체를 사용한 진단 및 종양 검출은 이 항체의 큰 크기(150,000 Da)로 인한 낮은 투과성 및 비표적화된 조직으로부터의 느린 제거에 의해 한정되었다. 더욱이, 영상화 또는 치료 목적을 위한 방사성 또는 광학 영상화제의 선택적 표적화는 그의 긴 반감기(약 30일)로 인해 어렵다. 특히, 환자는 보다 긴 기간 동안 입원해야 하고 보다 많은 의료비를 지불해야 한다.
형광-안내된 수술에 대한 2종의 기대되는 방법들이 임상에서 사용하기 위해 현재 집중 연구되고 있다. 한 방법에서, 부착된 소광제와의 인접성으로 인해 정상 상태에서 최소한의 형광을 나타내는 활성화가능한 NIR 형광 프로브는 악성 조직에서 소광제의 방출 시 높은 형광을 띠게 된다. 가장 통상적으로 사용되는 방출 기작들 중 하나는 종양에 풍부한 프로테아제(즉, 카텝신(cathepsin), 카스파제(caspase) 및 매트릭스 메탈로프로테이나제(matrix metalloproteinase))에 의해 특이적으로 절단될 수 있는 펩티드 서열을 염료와 소광제 사이에 도입하는 것을 포함한다. 이 전략의 주요 장점은, 활성화 효소를 결여하는 조직이 우연히 절단 효소를 발현하지 않는 한, 이러한 조직에 형광이 부재함으로써, 배출 경로(예를 들면, 신장, 방광, 간)를 따라 조직을 비형광 상태로 남아있게 한다는 점에 있다. 악성 병변에 절단 프로테아제가 풍부하고 방출된 염료가 종양 내에 유지되는 한, 이러한 종양-활성화된 NIR 염료도 종양 덩어리에서 실질적인 형광을 생성할 수 있다. 이 방법의 주요 단점은 많은 관련 하이드롤라제들(이들 중 대다수는 천연 리모델링을 겪거나 염증을 경험하는 건강한 조직에서도 발현됨)의 좋지 않은 종양 특이성으로부터 비롯된다. 게다가, 원하는 프로테아제의 존재도는 종양 덩어리마다 달라짐으로써, 일부 악성 병변들에서 형광의 느린 활성화 또는 활성화 부재 및 다른 병변에서의 형광의 신속한 발생을 유발할 수 있다. 대체로, 이들 활성화가능한 펩티드들은 보다 높은 분자량, 보다 긴 리드 시간(24시간), 순환계 내의 펩티다제에 의한 펩티드 결합의 절단, 높은 거짓 양성 결과 및 매우 높은 제조 비용으로 이어질 수 있는, 펩티드 결합을 통해 연결된 20개 이상의 아미노산들을 함유한다.
활성화가능한 염료가 사용하는 다른 방출 기작은 순환계와 종양 내부 사이의 pH 차이 및 산화환원 전위의 변화이다.
둘째, 형광 염료는 부착된 염료가 리간드의 수용체를 과다발현하는 암에서 축적되게 하는 종양 특이적 표적화 리간드에 접합된다. PSMA-표적화된 항체-NIR 염료 접합체는 형광-안내된 암 수술을 위한 임상 시험에 아직 들어가지 않았지만, 여러 유형의 NIR 염료들이 임상 개발의 의도로 단일클론 항체, 예컨대, Her-2에 접합되었다. 불운하게도, 대다수의 이들 염료들은 단백질 내의 라이신 또는 시스테인 잔기를 사용하여, 가변적 친화성, 효능, PK 및 안전성 프로파일을 초래하는 불균질한 화학적 물질들을 유발하는 아미드, 디설파이드 또는 말레이미드 화학반응을 통해 비특이적으로 항체에 연결된다. 더욱이, 말레이미드 및 디설파이드 결합은 순환계에서 불안정한 것으로 알려져 있다(반감기 ≤2시간). 다른 한편으로, 정확한 구조 정의의 결여는 제조 공정 및 안전성과 연관된 어려움으로 인해 임상적 사용으로의 이들 접합체의 진전을 한정할 수 있다. 뿐만 아니라, 이들 항체의 제조는 소분자 리간드와 비교될 때 매우 비싸다. 대조적으로, 소분자 리간드(Mr >0.5 Da)는 고형 종양을 신속히 침투할 수 있고, 2시간 이내에 PSMA 음성 조직으로부터 제거되고, 높은 종양-대-배경 비를 보이고, 합성하기 쉽고, 합성 및 저장 동안 안정하다.
소분자 리간드가 가진 모든 장점들에도 불구하고, 소분자의 성질을 유지하거나 향상시키는 NIR 염료의 개발은 어렵다. 최근에, PSMA의 다양한 저분자량 억제제들이 가시광선 파장 염료(400 - 600 nm), 예컨대, 플루오레세인 및 로다민에 접합되었고 동물 모델[Kularatne SA, Wang K, Santhapuram HK, Low PS. Mol Pharm. 2009 May-Jun;6(3):780-9] 또는 배양물 중의 세포[Liu T, Nedrow-Byers JR, Hopkins MR, Berkman CE. Bioorg Med Chem Lett. 2011 Dec 1;21(23)] 또는 인간 혈액 샘플[He W, Kularatne SA, Kalli KR, Prendergast FG, Amato RJ, Klee GG, Hartmann LC, Low PS. Int J Cancer. 2008 Oct 15;123(8):1968-73]에서 시험되었다.
가시광선 파장 염료는 조직 내의 콜라겐의 존재로 인해 상대적으로 높은 수준의 비특이적 배경 광과 연관되어 있기 때문에 수술 중 영상-안내된 수술에 최적이 아니다. 따라서, 이들 통상적인 화합물들로부터의 신호 대 노이즈(noise) 비는 낮다. 더욱이, 생물학적 발색단, 특히 헤모글로빈에 의한 가시광선의 흡수는 침투 깊이를 수 밀리미터로 한정한다. 따라서, 조직에서 수 밀리미터보다 더 깊게 묻혀있는 종양은 전형적으로 검출되지 않은 상태로 남아있다. 더욱이, 플루오레세인(pKa = 6.4)의 이온화 평형은 5 내지 9의 범위에 걸쳐 pH 의존적 흡수 및 방사를 유발한다. 따라서, 플루오레세인 기반 염료의 형광은 낮은 pH(pH 5 미만)에서 소광된다.
따라서, PSMA를 표적화하는 소분자 리간드에 접합된 NIR 염료는 전립선암의 뮤린 모델에서 영상화제로서 시험되었다[(a) Humblet V, Lapidus R, Williams LR, Tsukamoto T, Rojas C, Majer P, Hin B, Ohnishi S, De Grand AM, Zaheer A, Renze JT, Nakayama A, Slusher BS, Frangioni JV. Mol Imaging. 2005 Oct-Dec;4(4):448-62.; (b) Thomas M, Kularatne SA, Qi L, Kleindl P, Leamon CP, Hansen MJ, Low PS.; (c) Chen Y, Dhara S, Banerjee SR, Byun Y, Pullambhatla M, Mease RC, Pomper MG. Biochem Biophys Res Commun. 2009 Dec 18;390(3):624-9; (d) Nakajima T, Mitsunaga M, Bander NH, Heston WD, Choyke PL, Kobayashi H. Bioconjug Chem. 2011 Aug 17;22(8):1700-5.; (e) Chen Y, Pullambhatla M, Banerjee SR, Byun Y, Stathis M, Rojas C, Slusher BS, Mease RC, Pomper MG. Bioconjug Chem. 2012 Dec 19;23(12):2377-85.; (f) Laydner H, Huang SS, Heston WD, Autorino R, Wang X, Harsch KM, Magi-Galluzzi C, Isac W, Khanna R, Hu B, Escobar P, Chalikonda S, Rao PK, Haber GP, Kaouk JH, Stein RJ. Urology. 2013 Feb;81(2):451-6.; (g) Kelderhouse LE, Chelvam V, Wayua C, Mahalingam S, Poh S, Kularatne SA, Low PS. Bioconjug Chem. 2013 Jun 19;24(6):1075-80].
이들 PSMA-표적화된 NIR 염료들은 배양물에서 전립선암 세포의 일부 표지부착을 보였지만, 이들은 PSMA 발현 전립선 종양 이종이식편 동물 모델에서 매우 약한 형광을 가졌다. 예를 들면, 상기 문헌(Humblet et al.)에 기재된 분자는 종양 이종이식편 모델에서 매우 낮은 종양 축적 및 형광을 보였다. NIR 염료는 리간드와의 사이에 적절한 스페이서의 결여로 인해 리간드와 PSMA 내의 결합 포켓의 결합을 방해했었을 수 있다. 다른 한편으로, 인 기반 리간드는 DUPA와 비교될 때 PSMA에 대한 보다 약한 친화성을 가진다. 게다가, 인 기반 리간드는 합성하기 어렵고, 다수의 단계들을 수반하고, 제조 비용이 비쌀 것이다.
문헌(Chen et al.)에 보고된 PSMA-표적화된 NIR 물질은 종양에 도달하는 데 20시간 이상이 걸리고 비표적화된 조직으로부터 제거되는 데 72시간이 걸린다. 또한 특히, 이 PSMA-표적화된 NIR 염료는 매우 느린 피부 제거를 가진다. 형질감염된 세포에서 사용된 PSMA의 결합 에피토프가 인공물일 수 있지만, 상기 염료는 PSMA 형질감염된 전립선암 세포 종양에서 매우 낮은 흡수 및 낮은 형광을 가졌다. 더욱이, 모든 다른 조직들에서 이 분자의 실질적인 비특이적 흡수가 있고 PSMA 음성 세포에서 축적 및 형광이 있는데, 이것은 문헌(Chen et al.)에 의해 보고된 NIR 접합체의 비특이적 및 비표적화된 성질을 시사한다.
문헌(Chen et al.) 및 문헌(Laydner et al.)의 저자들도 소분자 리간드를 IR800CW에 접합시켰다(NIR 염료). IR800CW는 n-하이드록시석신이미드 에스테르(NHS)와 함께 활성화된 카복실산을 가진 비대칭 염료이다. 이것은 합성하기에 매우 비싸고 상업적으로 입수가능한 공급원으로부터 구입하기에 더 비싼 분자이다(1 g이 $60,000 이상이다). IR800CW는 두 가지 이유로 인해 합성 동안 안정하지 않다는 단점도 가진다: (a) NHS 에스테르의 가수분해, 및 (b) 비닐 에테르의 가수분해. 합성 동안 IR800CW 접합체의 안정성의 결여는 60% 이상의 원하지 않는 부산물의 형성을 유발한다. 이것은 보다 높은 제조 비용으로 이어지는 복잡한 정제 기법, 및 임상적 해석을 위한 보다 긴 대기 기간을 요구하고, 외과의 및 환자는 상기 약물에 접근하지 못할 것이다.
문헌(Laydner et al.)의 저자들은 긴 펩티드 공간(6개 아미노산), 및 NHS 및 말레이미드를 가진 이작용성 링커를 통해 PSMA 리간드를 IR800CW에 접합시켰다. IR800CW에 의해 야기된 모든 단점들 이외에, 이 PSMA-표적화된 IR800CW 접합체는 다수의 단계들 중 5개 단계(리간드의 합성, 말레이미드 작용기를 통한 리간드와 이작용성 링커의 접합, 펩티드 링커의 합성, 펩티드 링커와 IR800CW의 접합, 아미드 결합을 통한 펩티드 링커-IR800CW와 리간드-이작용성 링커의 접합)로 합성을 요구하는 복잡한 합성 반응식을 가진다. 따라서, 제조 비용은 임상적 목적을 위한 이 분자의 효과적 제조를 방해한다. 이 분자에 대한 합성 반응식은 상기 분자 내의 다수의 키랄 중심들로 인해 더 복잡해진다. 그러나, 펩티드 스페이서는 다수의 키랄 중심들(입체이성질체들)을 가짐으로써, 전형적으로 FDA 승인을 위한 모든 입체이성질체들의 제조 및 평가에 대한 필요성을 필요로 한다. 예를 들면, 단지 3개의 아미노산들(즉, 3개의 키랄 중심들)을 가진 펩티드 스페이서는 8종의 상이한 약품들에 대한 독성 프로파일을 요구할 것인데, 이것은 이들 불균질한 혼합물이 상이한 친화성, 효능, PK 및 안전성 프로파일을 초래할 수 있기 때문이다.
문헌(Laydner et al.)에서 사용된 소분자 리간드는 GluNHCONHCys-SH이다. Cys 내의 유리 티올 모이어티(moiety)는 산화하는 경향을 나타내므로, 상기 분자는 아르곤 또는 질소 환경 하에서 취급되어야 하고 일반적으로 불안정한 분자를 유발한다. GluNHCONHCys-SH 리간드는 말레이미드 반응을 통해 이작용성 링커에 접합된다. 티올과 말레이미드 사이의 반응은 가역적이고 50%의 병든 생성물을 생산하는 것으로 잘 보고되어 있다. 더욱이, 말레이미드 결합은 인체 내의 순환계에서 안정하지 않으므로, 말레이미드 결합의 사용은 비표적화된 염료를 방출하여, 이의 비특이적 흡수를 유발할 위험이 있다.
문헌(Kelderhouse et al.)의 저자들은 말레이미드 기를 통해 DUPA-링커-Cys를 알렉사 플로우르(Alexa flour) 647에 접합시켰고 Dylight 750을 DUPA에 접합시켰다. 마찬가지로, 이들 분자들은 말레이미드와 연관된 모든 단점들을 가진다. 더욱이, 이들 저파장 NIR 염료들은 상업적으로 입수가능하지만 매우 비싸다. 실험적 전이성 마우스 모델에 대해 분자를 시험하였지만, 영상은 결론에 이르지 못하였다.
문헌(Liu et al.)도 PSMA-표적화된 NIR 염료를 보고하였고, 일부 시험관내 데이터가 보고되었으나, 동물 데이터는 보고되지 않았다. 리간드와 NIR 염료 사이의 적절한 스페이서의 결여는 생체 데이터의 결여에 기인하였을 수 있다. 더욱이, 이 염료는 다른 보고된 화합물들처럼 많은 단점들을 가진다. 이 염료는 인 기반 리간드이고 비대칭 염료이다. 따라서, 이 염료는 인 기반 리간드 및 비대칭 NIR 염료 둘 다에 대해 기재된 단점을 가진다.
문헌(Nakajima et al.)은 ICG에 접합된 항-PSMA 항체(J591)를 보고하였다. 불운하게도, 이 화합물은 다른 건강한 조직, 예컨대, 간으로부터 제거되는 데 72시간이 걸렸다. 또한, 상기 화합물은 6일 동안 순환계에서 남아있었는데, 이것은 상기 화합물이 인체에서 30일 이상 동안 체내에 남아있을 것임을 시사한다. 더욱이, ICG는 단백질 내의 라이신 잔기를 사용하여 아미드를 통해 J591에 비특이적으로 연결됨으로써, 가변적 친화성, 효능, PK 및 안전성 프로파일을 야기하는 불균질한 화학적 물질들을 유발하였다. 정확한 구조 정의의 결여는 제조 공정 및 안전성과 연관된 어려움으로 인해 임상적 사용을 위한 이 접합체의 발전을 한정할 수 있다.
보고된 PSMA-표적화된 NIR 염료의 보다 높은 비특이성 및 피부로부터의 느린 제거는 이 화합물의 좋지 않은 약물동력학적(PK) 성질에 기인할 수 있다.
따라서, 생체내 조직 영상화에 사용하고 영상-안내된 수술에 사용하기 위해 증가된 안정성, 보다 우수한 PK 성질, 보다 높은 가용성, 신속한 종양 축적, 높은 형광, 신속한 피부 제거 및 보다 높은 종양-대-배경 비(TBR)를 가진, 병든 조직의 PSMA 발현 암 세포 또는 신생맥관구조를 특이적으로 표적화하는 데 사용될 수 있는 염료 물질에 대한 필요성이 남아있다.
본 개시는 화합물의 임상적 성질(예를 들면, 안정성, PK 성질, 가용성, 신속한 종양 축적, 보다 높은 형광, 신속한 피부 제거 및 보다 높은 종양-대-배경 비)을 개선하기 위해 상이한 링커를 통해 NIR 염료에 결합된 PSMA-표적화된 리간드를 제공한다. 본 개시는 영상-안내된 수술에서의 상기 화합물의 용도 및 이를 합성하는 방법을 제공한다. 본 개시는 염료 분자에서 양전하를 링커에 추가하거나 음전하의 수를 감소시킴으로써 리간드-링커-NIR 염료 접합체의 총 전하를 변경시키는 것도 제공한다. 본 개시는 NIR 접합체의 생체내 친화성 및 PK 성질을 개선하기 위한 신규 고친화성 리간드도 제공한다. 본 개시는 전립선암을 포함하나 이것으로 한정되지 않는, PSMA를 발현하는 종양의 표적화된 영상화에 사용하기 위한 화합물, 및 예를 들면, PSMA 양성 조직 및 종양과 관련된 영상화 및 수술에 사용하는 방법도 제공한다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 화합물은 하기 식을 가진다:
B-X-Y-Z
상기 식에서,
B는 PSMA-표적화된 분자이고;
X는 스페이서이고;
Y는 아미노산 스페이서이고;
Z는 NIR 염료이다.
일부 실시양태에서, PSMA-표적화된 분자는 소분자, 리간드, 억제제, 아고니스트 또는 이들의 유도체로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, PSMA-표적화된 화합물은 리간드이다. 일부 실시양태에서, PSMA-표적화된 화합물은 DUPA이다. 다른 실시양태에서, PSMA-표적화된 화합물은 PSMA에 결합하는 소분자이다.
일부 실시양태에서, X는 소수성 스페이서이다. 일부 실시양태에서, X는 에이트 아미노옥톤산(eight aminooctonoic acid)(EAOA); 7개 원자의 쇄; 길이가 7개 원자인 스페이서; 길이가 7개 내지 24개 원자인 쇄; 및 임의적으로 각각 치환되는 2개의 아릴 또는 아릴 알킬 기를 포함하는 펩티드로서, 1개의 아릴 또는 아릴 알킬 기가 약 7개 내지 약 11개, 또는 약 7개 내지 약 14개의 원자를 갖고, 다른 아릴 또는 아릴 알킬 기가 약 10개 내지 약 14개, 또는 약 10개 내지 약 17개의 원자를 가진 것인 펩티드로 구성된 군으로부터 선택된다. 또 다른 실시양태에서, 스페이서는 약 1개 내지 약 30개의 원자, 또는 약 2개 내지 약 20개의 원자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 스페이서는 길이가 7개 원자이다. 일부 실시양태에서, 스페이서는 EAOA를 포함한다. 일부 실시양태에서, 스페이서는 가변적으로 하전된다. 일부 실시양태에서, X는 양전하를 가진다. 다른 실시양태에서, X는 음전하를 가진다.
일부 실시양태에서, Y는 산성(음으로 하전된) 아미노산, 예컨대, 아스파르트산 및 글루탐산, 및 이들의 유도체; 염기성(양으로 하전된) 아미노산, 예컨대, 아르기닌, 히스티딘 및 라이신, 및 이들의 유도체; 중성 극성 아미노산, 예컨대, 글리신, 세린, 쓰레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴 및 글루타민, 및 이들의 유도체; 중성 비극성(소수성) 아미노산, 예컨대, 알라닌, 류신, 이소류신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판 및 메티오닌; 및 이들의 유도체로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, Y는 방향족 아미노산 및 이의 유도체이다. 일부 실시양태에서, Y는 양전하를 가진다. 다른 실시양태에서, Y는 음전하를 가진다.
일부 실시양태에서, Z는 LS288, IR800, SP054, S0121, KODAK, S2076, S0456, 및/또는 하기 염료들로 구성된 군으로부터 선택된 염료를 포함하나 이들로 한정되지 않는, 근적외선 염료들로 구성된 군으로부터 선택된다:
일부 실시양태에서, Z는 가변적으로 하전된다. 일부 실시양태에서, Z는 양전하를 가진다. 다른 실시양태에서, Z는 음전하를 가진다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 화합물은 하기 식을 가진다:
B-X-Y-Z
상기 식에서,
B는 PSMA-표적화된 화합물이고; X는 스페이서이고; Y는 황 함유 측쇄 기를 가진 아미노산 스페이서이고; Z는 NIR 염료이다. 일부 실시양태에서, 황 함유 측 기를 가진 아미노산 스페이서는 시스테인이다. 일부 실시양태에서, 황 함유 측 기를 가진 아미노산 스페이서는 메티오닌이다. 일부 실시양태에서, 황 함유 측 기를 가진 아미노산 스페이서는 티오페놀 모이어티를 함유하는 분자이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 화합물은 하기 식을 가진다:
B-X-Y-Z
상기 식에서,
B는 PSMA-표적화된 화합물이고; X는 스페이서이고; Y는 칼코겐(chalcogen) 함유 측쇄 기를 가진 아미노산 스페이서이고; Z는 NIR 염료이다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 하기 식의 화합물을 제공한다:
B-X-Y-Z
상기 식에서,
B는 PSMA-표적화된 화합물이고; X는 스페이서이고; Y는 티로신, 시스테인, 라이신 또는 이들의 유도체로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산이고; Z는 NIR 염료이다. 일부 실시양태에서, Y는 티로신 또는 티로신 유도체를 포함한다. 일부 실시양태에서, Y는 티로신을 포함하고 탄소 동위체는 티로신의 방향족 고리 상에 존재한다. 일부 실시양태에서, Y는 수소 동위체를 가진 방향족 고리를 가진 아미노산을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 화합물 B-X-Y-Z를 포함하고, 이때 B는 DUPA 또는 이의 유도체를 포함하고, X는 EAOA를 포함하고, Y는 티로신을 포함하고, Z는 S0456을 포함한다.
본 발명은 하기 구조식을 가진 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 동위체에 관한 것이기도 하다:
상기 식에서,
R1은 수소 또는 SO3H를 나타내고;
R2는 수소, CH3, C3H6SO3 -, C3H6SO3H 또는 C4H8SO3 -, 또는 C4H8SO3H 또는 C3H6N+(CH3)3을 나타내고;
R3 및 R5는 각각 탄소, 임의적으로 하나 이상의 공유 결합을 나타내고;
R4는 임의적으로 하나 이상의 공유 결합을 가진 탄소를 나타내고;
R6은 질소, 산소 또는 황, 또는 원자 부재(방향족 고리와 비닐 고리 사이의 직접적인 C-C 결합)를 나타내고;
R7은 임의적이고, 존재할 때 분광 성질을 향상시키기 위한, 예컨대, 비닐 에테르 가교의 휘도 및 안정성을 증가시키기 위한 방향족 치환기를 나타내고;
R8은 임의적이고, 존재할 때 방향족 아미노산, 예컨대, Phe, Trp, His 또는 이들의 유도체, 양이온성 아미노산, 예컨대, Arg, Lys 또는 이들의 유도체, 음이온성 아미노산, 예컨대, Asp, Glu 또는 이들의 유도체, 방향족/양이온성/음이온성 산의 비천연 아미노산 또는 이들의 유도체를 가진 링커를 나타내고;
R9는 임의적이고, 존재할 때 선형 탄소 쇄, 또는 폴리에틸렌 글리콜 링커, 양이온성 링커 또는 이들의 유도체를 나타내고;
R10은 CO2H, PO3H2, SO3H, CH2SO3H, CH2CONHCH2SO3H 또는 CH2CONHCH2CH2SO3H를 나타내고;
R11은 CO2H, SO3H, CH2CONHCH2SO3H 또는 CH2CONHCH2CH2SO3H를 나타내고;
R12는 수소, 메틸 기 또는 CH2를 나타내고, 임의적으로 각각 결합을 공유하는 CH2를 나타낼 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 화합물은 약 500 nm 내지 약 900 nm의 흡수 및 방사 최대치를 가진다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 화합물은 약 600 nm 내지 800 nm의 흡수 및 방사 최대치를 가진다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 화합물은 조직 세포에 분포된 후 형광을 발하도록 만들어진다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 화합물은 근적외선 파장의 여기 광에 노출됨으로써 형광을 발하도록 만들어진다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 화합물은 DUPA의 결합 친화성과 유사한 PSMA에 대한 결합 친화성을 가진다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 화합물은 종양 세포에의 표적화에 대해 고도로 선택적이다. 특히 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 화합물은 전립선암 세포에 표적화된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 화합물은 이를 필요로 하는 대상체에게 투여되고, 일부 실시양태에서 투여되는 조성물은 상기 화합물 이외에 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함한다.
본 발명의 일부 실시양태는 PSMA 발현 생물학적 조직을 광학 영상화하는 방법으로서,
(a) 상기 생물학적 조직을, PSMA-표적화된 NIR 염료 화합물을 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계;
(b) 상기 조성물 중의 상기 화합물이 생물학적 표적 내부에 분포하기 위한 시간을 허용하는 단계;
(c) 상기 화합물에 의해 흡수될 수 있는 파장의 여기 광으로 상기 조직을 조명하는 단계; 및
(d) 상기 화합물에 의해 방사된 광학 신호를 검출하는 단계
를 포함하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 이 방법은 높은 PSMA 발현과 연관된 질환의 검출에 이용된다. 일부 실시양태에서, (d)에서 방사된 신호로부터 영상을 구축하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 단계 (a)가 구별가능한 신호 성질을 가진 2종 이상의 형광 화합물들을 조직과 접촉시키는 것을 포함하고, 임의적으로 상기 조직이 대상체 내에 존재하는 것인 상기 언급된 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 조명 및/또는 검출 방법 단계를 위한 내시경, 카테터, 단층촬영 시스템, 핸드-헬드(hand-held) 광학 영상화 시스템, 수술용 고글 또는 수술 중 현미경의 용도를 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 암을 치료하는 데 사용된다. 일부 실시양태에서, 암은 전립선암, 폐암, 방광암, 췌장암, 간암, 신장암, 육종, 유방암, 뇌암, 신경내분비 암종, 결장암, 고환암 또는 흑색종으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 PSMA-표적화된 NIR 염료 화합물은 PSMA 발현 세포의 영상화를 위해 사용된다. 일부 실시양태에서, 이 세포는 전립선 세포, 전립선암 세포, 방광암 세포, 췌장암 세포, 간암 세포, 폐암 세포, 신장암 세포, 육종 세포, 유방암 세포, 뇌암 세포, 신경내분비 암종 세포, 결장암 세포, 고환암 세포 또는 흑색종 세포로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 발명은 (a) PSMA-표적화된 NIR 염료 화합물과 표적 세포 유형의 적어도 하나의 세포의 결합을 허용하는 시간 동안 및 조건 하에서 생물학적 샘플을 이 화합물과 접촉시키는 단계; 및 (b) 임의적으로 상기 생물학적 샘플에서 상기 화합물의 존재 또는 부재를 검출하는 단계를 포함하는, 생물학적 샘플에서 세포 유형을 표적화하는 방법으로서, 검출 단계 (b)에서의 화합물의 존재는 상기 표적 세포 유형이 상기 생물학적 샘플에 존재한다는 것을 표시하는 것인 방법도 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 PSMA 발현 세포를 광학적으로 검출하는 방법으로서, 본 발명의 PSMA 표적화 NIR 염료 화합물을 투여하고 상기 화합물을 여기 광원에 노출시키는 단계, 및 상기 화합물로부터 형광을 검출하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 여기 광원은 근적외선 파장 광이다. 일부 실시양태에서, 여기 광 파장은 약 600 내지 1000 나노미터의 범위 내에 있다. 일부 실시양태에서, 여기 광 파장은 약 670 내지 850 나노미터의 범위 내에 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 대상체에 대해 영상-안내된 수술을 수행하는 방법으로서,
a) PSMA 표적화 NIR 염료 화합물이 소정의 수술 부위에서 축적하는 데 충분한 조건 하에서 및 시간 동안 이 화합물을 포함하는 조성물을 투여하는 단계;
b) 적외선 광을 사용하여 상기 화합물을 조명함으로써 상기 화합물을 가시화하는 단계; 및
c) 적외선 광에 의한 여기 시 형광을 발하는 영역의 수술적 절제를 수행하는 단계
를 포함하는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법의 일부 실시양태에서, 적외선 광 파장은 약 600 내지 1000 나노미터의 범위 내에 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 방법은 약 670 내지 850 나노미터의 범위 내에 있는 적외선 광 파장을 이용한다.
본 발명의 일부 실시양태는 대상체에서 질환을 진단하는 방법으로서,
a) PSMA-표적화된 NIR 염료 화합물과 적어도 하나의 PSMA 발현 세포의 결합을 허용하는 시간 동안 및 조건 하에서 소정량의 상기 화합물을, 진단을 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계;
b) 생물학적 샘플에 존재하는 상기 화합물로부터의 신호를 측정하는 단계;
c) b)에서 측정된 신호를 적어도 하나의 대조군 데이터 세트와 비교하는 단계로서, 적어도 하나의 대조군 데이터 세트가 표적 세포 유형을 포함하지 않는 생물학적 샘플과 접촉된 제1항의 화합물로부터의 신호를 포함하는 것인 단계; 및
d) 질환의 진단을 제공하는 단계로서, 단계 c)에서의 비교가 질환의 존재를 표시하는 것인 단계
를 포함하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일부 실시양태는 PSMA 표적화 NIR 염료 화합물을 포함하는 키트를 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 키트는 PSMA 발현 세포의 영상화를 위해 사용된다. 일부 실시양태에서, PSMA 발현 세포는 종양 세포이다. 일부 실시양태에서, PSMA 발현 세포는 비-전립선암 세포이다. 일부 실시양태에서, PSMA 발현 세포는 전립선 종양 세포이다. 일부 실시양태에서, PSMA 발현 세포는 암 세포이다. 일부 실시양태에서, PSMA 발현 영역은 종양 세포의 신생맥관구조이다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 전이성 질환의 검출을 위해 사용된다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 화합물은 개선된 수술 절제 및/또는 개선된 예후를 위해 사용된다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 방법은 비-NIR 접합된 형광 염료보다 더 선명한 수술 절제면을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 PSMA-표적화된 NIR 염료 화합물은 개선된 종양-대-배경 비를 가진다.
다른 실시양태에서, 본 발명의 화합물은 방광암 세포, 췌장암 세포, 간암 세포, 폐암 세포, 신장암 세포, 육종 세포, 유방암 세포, 뇌암 세포, 신경내분비 암종 세포, 결장암 세포, 고환암 세포 또는 흑색종 세포로 구성된 군으로부터 선택된 비-전립선암 세포를 영상화하거나, 진단하거나 검출하는 데 사용된다. 다른 실시양태에서, 검출되는 세포는 5 mm 초과의 깊이로 피부 아래에 있다. 일부 실시양태에서, 검출되는 조직은 5 mm 초과의 깊이로 피부 아래에 있다. 다른 실시양태에서, 검출되는 종양은 5 mm 초과의 깊이로 피부 아래에 있다. 일부 실시양태에서, 검출되는 세포는 6 mm, 7 mm, 8 mm, 9 mm 또는 10 mm 초과의 깊이로 대상체의 피부 아래에 있다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 염료 프로브는 가시광선 스펙트럼의 외부에서 검출될 수 있다. 일부 실시양태에서, 가시광선 스펙트럼보다 더 큰 염료 프로브가 사용된다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 화합물은 650 nm 내지 900 nm의 파장에 민감한 염료 프로브를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 PSMA-표적화된 NIR 염료 화합물은 약 650 nm 내지 1000 nm, 예를 들면, 한 실시양태에서 대략 800 nm의 근적외선 영역에서 최대 광 흡수 파장을 가진다.
제공된 방법의 또 다른 실시양태에서, 비-전립선암은 방광암, 췌장암, 간암, 폐암, 신장암, 육종, 유방암, 뇌암, 신경내분비 암종, 결장암, 고환암 또는 흑색종이다.
제공된 방법의 추가 실시양태에서, PSMA 발현 암 세포는 종양의 세포이다. 제공된 방법의 추가 실시양태에서, PSMA 발현 암은 종양이다. 일부 실시양태에서, 종양의 부피는 적어도 1000 mm3이다. 일부 실시양태에서, 종양의 부피는 1000 mm3 미만이다. 일부 실시양태에서, 종양의 부피는 950 mm3 미만이다. 일부 실시양태에서, 종양의 부피는 900 mm3 미만이다. 일부 실시양태에서, 종양의 부피는 850 mm3 미만이다. 일부 실시양태에서, 종양의 부피는 800 mm3 미만이다. 일부 실시양태에서, 종양의 부피는 750 mm3 미만이다. 일부 실시양태에서, 종양의 부피는 700 mm3 미만이다. 일부 실시양태에서, 종양의 부피는 650 mm3 미만이다. 일부 실시양태에서, 종양의 부피는 600 mm3 미만이다. 일부 실시양태에서, 종양의 부피는 550 mm3 미만이다. 일부 실시양태에서, 종양의 부피는 500 mm3 미만이다. 일부 실시양태에서, 종양의 부피는 450 mm3 미만이다. 일부 실시양태에서, 종양의 부피는 400 mm3 미만이다. 일부 실시양태에서, 종양의 부피는 350 mm3 미만이다. 일부 실시양태에서, 종양의 부피는 300 mm3 미만이다. 일부 실시양태에서, 종양의 부피는 250 mm3 미만이다. 일부 실시양태에서, 종양의 부피는 200 mm3 미만이다. 일부 실시양태에서, 종양의 부피는 150 mm3 미만이다. 일부 실시양태에서, 종양의 부피는 100 mm3 미만이다. 한 실시양태에서, 종양의 부피는 적어도 75 mm3이다. 또 다른 실시양태에서, 종양의 부피는 75 mm3 미만이다. 또 다른 실시양태에서, 종양의 부피는 70 mm3 미만이다. 또 다른 실시양태에서, 종양의 부피는 65 mm3 미만이다. 또 다른 실시양태에서, 종양의 부피는 60 mm3 미만이다. 또 다른 실시양태에서, 종양의 부피는 55 mm3 미만이다. 한 실시양태에서, 종양의 부피는 적어도 50 mm3이다. 다른 실시양태에서, 종양은 50 mm3 미만이다. 또 다른 실시양태에서, 종양의 부피는 45 mm3 미만이다. 다른 실시양태에서, 종양의 부피는 40 mm3 미만이다. 또 다른 실시양태에서, 종양의 부피는 35 mm3 미만이다. 또 다른 실시양태에서, 종양의 부피는 30 mm3 미만이다. 또 다른 실시양태에서, 종양의 부피는 25 mm3 미만이다. 또 다른 실시양태에서, 종양의 부피는 20 mm3 미만이다. 또 다른 실시양태에서, 종양의 부피는 15 mm3 미만이다. 또 다른 실시양태에서, 종양의 부피는 10 mm3 미만이다. 또 다른 실시양태에서, 종양의 부피는 12 mm3 미만이다. 또 다른 실시양태에서, 종양의 부피는 9 mm3 미만이다. 또 다른 실시양태에서, 종양의 부피는 8 mm3 미만이다. 또 다른 실시양태에서, 종양의 부피는 7 mm3 미만이다. 또 다른 실시양태에서, 종양의 부피는 6 mm3 미만이다. 또 다른 실시양태에서, 종양의 부피는 5 mm3 미만이다.
한 실시양태에서, 종양은 본 발명의 PSMA-표적화된 NIR 염료 화합물을 사용한 수술적 퇴축 전에 적어도 5 mm의 길이를 가진다. 한 실시양태에서, 이들 방법은 5 mm 미만의 종양을 검출한다. 다른 실시양태에서, 본원의 방법은 4 mm 미만의 종양을 검출한다. 일부 실시양태에서, 본원의 방법은 3 mm 미만의 종양을 검출한다. 또 다른 실시양태에서, 종양은 적어도 6 mm의 길이를 가진다. 또 다른 실시양태에서, 종양은 적어도 7 mm의 길이를 가진다. 또 다른 실시양태에서, 종양은 적어도 8 mm의 길이를 가진다. 또 다른 실시양태에서, 종양은 적어도 9 mm의 길이를 가진다. 또 다른 실시양태에서, 종양은 적어도 10 mm의 길이를 가진다. 또 다른 실시양태에서, 종양은 적어도 11 mm의 길이를 가진다. 추가 실시양태에서, 종양은 적어도 12 mm의 길이를 가진다. 추가 실시양태에서, 종양은 적어도 13 mm의 길이를 가진다. 추가 실시양태에서, 종양은 적어도 14 mm의 길이를 가진다. 또 다른 실시양태에서, 종양은 적어도 15 mm의 길이를 가진다. 또 다른 실시양태에서, 종양은 적어도 16 mm의 길이를 가진다. 또 다른 실시양태에서, 종양은 적어도 17 mm의 길이를 가진다. 추가 실시양태에서, 종양은 적어도 18 mm의 길이를 가진다. 추가 실시양태에서, 종양은 적어도 19 mm의 길이를 가진다. 추가 실시양태에서, 종양은 적어도 20 mm의 길이를 가진다. 또 다른 실시양태에서, 종양은 적어도 21 mm의 길이를 가진다. 또 다른 실시양태에서, 종양은 적어도 22 mm의 길이를 가진다. 또 다른 실시양태에서, 종양은 적어도 23 mm의 길이를 가진다. 추가 실시양태에서, 종양은 적어도 24 mm의 길이를 가진다. 추가 실시양태에서, 종양은 적어도 25 mm의 길이를 가진다. 추가 실시양태에서, 종양은 적어도 30 mm의 길이를 가진다.
일부 실시양태에서, 본 개시는 근적외선(NIR) 염료에 접합된 전립선 특이적 막 항원(PSMA)-표적화된 화합물, 및 이를 치료 및 진단에 사용하는 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 개시는 전립선 특이적 막 항원(PSMA)을 발현하는 세포와 연관된 질환, 예컨대, 전립선암, 고형 종양 및 관련 질환을 진단하고 치료하는 화합물 및 방법을 제공한다. 본 개시는 상기 화합물을 제조하고 사용하는 방법 및 조성물, 상기 화합물을 도입하는 방법, 및 상기 화합물을 포함하는 키트도 기술한다. PSMA-표적화된 화합물, 예컨대, 링커(L)를 통해 NIR 염료에 접합된 DUPA는 전립선암, 및 PSMA를 발현하거나 과다발현하는 병원성 세포 집단을 수반하는 관련 질환의 영상화, 진단 및/또는 치료에 유용할 수 있다는 것을 발견하였다. PSMA는 세포 표면 수용체, 예컨대, 비타민 수용체에 의해 관찰된 엔도사이토시스(endocytosis)와 유사한 과정에서 내재화되는 세포 표면 단백질이다. 따라서, 그의 길이를 따라 소정의 길이, 및/또는 소정의 직경, 및/또는 미리 선택된 작용기를 가진 링커를 포함하는 일부 접합체들이 이러한 질환을 치료하고/하거나, 영상화하고/하거나 진단하는 데 사용될 수 있다는 것을 발견하였다.
한 예시적 실시양태에서, 링커 L은 방출가능한 또는 방출불가능한 링커일 수 있다. 한 양태에서, 링커 L은 길이가 적어도 약 7개 원자이다. 한 변경에서, 링커 L은 길이가 적어도 약 10개 원자이다. 한 변경에서, 링커 L은 길이가 적어도 약 14개 원자이다. 또 다른 변경에서, 링커 L은 길이가 약 7개 내지 약 22개, 약 7개 내지 약 20개, 또는 약 7개 내지 약 18개 원자이다. 또 다른 변경에서, 링커 L은 길이가 약 14개 내지 약 22개, 약 15개 내지 약 12개, 또는 약 14개 내지 약 20개 원자이다.
대안적 양태에서, 링커 L은 길이가 적어도 약 10 옹스트롬(Å)이다.
한 변경에서, 링커 L은 길이가 적어도 약 15 Å이다. 또 다른 변경에서, 링커 L은 길이가 적어도 약 20 Å이다. 또 다른 변경에서, 링커 L은 길이가 약 10 Å 내지 약 30 Å의 범위 내에 있다.
대안적 양태에서, 링커 L의 길이의 적어도 부분은 결합 리간드 B에 연결된 말단에서 직경이 약 5 Å 이하이다. 한 변경에서, 링커 L의 길이의 적어도 부분은 결합 리간드 B에 연결된 말단에서 직경이 약 4 Å 이하 또는 약 3 Å 이하이다. 약 5 Å 이하, 약 4 Å 이하 또는 약 3 Å 이하의 직경 요건을 포함하는 예시적 실시양태는 소정의 길이의 링커에 대한 그 요건을 포함함으로써, 링커의 원통형 유사 부분을 규정할 수 있다는 것이 인식된다. 예시적으로, 또 다른 변경에서, 링커는 길이가 적어도 약 7 Å이고 직경이 약 5 Å 이하, 약 4 Å 이하 또는 약 3 Å 이하인 결합 리간드에 연결된 말단에서 원통형 부분을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 링커 L은 친수성 측쇄를 가진 아미노산, 예컨대, Ser, Thr, Cys, Arg, Orn, Lys, Asp, Glu, Gln 등 잔기를 포함하는, PSMA의 하나 이상의 잔기와 상호작용할 수 있는 하나 이상의 친수성 링커를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 링커 L은 소수성 측쇄를 가진 아미노산, 예컨대, Val, Leu, Phe, Tyr, Met 등 잔기를 포함하는, PSMA의 하나 이상의 잔기와 상호작용할 수 있는 하나 이상의 소수성 링커를 포함한다. 상기 실시양태 및 양태는 단독으로 또는 서로 조합되어 링커 L에 포함될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 예를 들면, 길이가 적어도 약 7개 원자이고 직경이 약 5 Å, 약 4 Å 이하 또는 약 3 Å 이하이고 Val, Leu, Phe, Tyr, Met 등 잔기를 포함하는, PSMA의 하나 이상의 잔기와 상호작용할 수 있는 하나 이상의 친수성 링커도 포함하는 링커 L이 본원에서 고려되고 기재된다.
또 다른 실시양태에서, 링커의 한 말단은 분지되어 있지 않고 탄소, 산소, 질소 및 황 원자의 쇄를 포함한다. 한 실시양태에서, 탄소, 산소, 질소 및 황 원자의 선형 쇄는 길이가 적어도 5개 원자이다. 한 변경에서, 상기 선형 쇄는 길이가 적어도 7개 원자 또는 적어도 10개 원자이다. 또 다른 실시양태에서, 탄소, 산소, 질소 및 황 원자의 쇄는 치환되지 않는다. 한 변경에서, 탄소, 산소, 질소 및 황 원자의 쇄의 부분은 2가 단편에 의해 환형화된다. 예를 들면, 디펩티드 Phe-Phe을 포함하는 링커(L)는 2개의 질소를 에틸렌 단편으로 환형화함으로써 피페라진-1,4-디일 구조, 또는 이의 치환된 변이체를 포함할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 질환 및 질환 상태를 치료하고/하거나, 질환 또는 질환 상태를 진단하고/하거나, PSMA를 발현하거나 과다발현하는 세포의 병원성 집단과 연관된 조직 및/또는 세포를 영상화하기에 효과적인 양으로 본원에 기재된 접합체를 포함하는 약학 조성물이 본원에 기재된다. 예시적으로, 상기 약학 조성물은 하나 이상의 담체, 희석제 및/또는 부형제도 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 질환 및 질환 상태를 치료하고/하거나, 질환 또는 질환 상태를 진단하고/하거나, PSMA를 발현하거나 과다발현하는 세포의 병원성 집단과 연관된 조직 및/또는 세포를 영상화하는 방법이 본원에 기재된다. 이러한 방법은 질환 및 질환 상태를 치료하고/하거나, 질환 또는 질환 상태를 진단하고/하거나, PSMA를 발현하거나 과다발현하는 세포의 병원성 집단과 연관된 조직 및/또는 세포를 영상화하기에 효과적인 양으로 본원에 기재된 접합체, 및/또는 본원에 기재된 접합체를 함유하는 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
도 1 - 화학적 도면 (1) 내지 (9)는 가변적 길이 링커를 가진 PSMA-표적화된 DUPA-링커-NIR 영상화제의 구조를 보여준다.
도 2(A) - PSMA-표적화된 DUPA-FITC(플루오레세인 이소티오시아네이트) 접합체(14)의 구조.
도 2(B) - PSMA-표적화된 DUPA-FITC(플루오레세인 이소티오시아네이트) 접합체(14), 및 배양물 중의 PSMA 양성 22Rv1 인간 전립선암 세포 및 PSMA 음성 A549 인간 폐포 기저 상피 세포에 대한 그의 결합 친화성(KD) 및 특이성. RPMI 배지에 용해된 DUPA-FITC를 RPMI 배양 배지 중의 22Rv1 또는 A549 세포에 표시된 농도로 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. 그 다음, 배지를 제거하고 새로운 배지로 (3회) 세척하고 PBS(포스페이트 완충 식염수)로 대체하였다. 유세포분석을 이용하여 샘플을 분석하였다. 오차 막대는 SD(n = 3)를 나타낸다. s는 항원 인식 부위 내에 함유된다.
도 3 - DUPA-FITC(14)에 대한 DUPA-NIR 접합체 1 내지 9의 상대적 결합 친화성. PSMA 양성 22Rv1 인간 전립선암 세포를 100 nM DUPA-FITC의 존재 하에서 증가하는 농도의 DUPA-NIR 접합체와 함께 37℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. 그 다음, 배지를 제거하고 새로운 배지로 (3회) 세척하고 PBS로 대체하였다. 유세포분석을 이용하여 세포에 결합된 형광을 분석하였다.
도 5 - PSMA-표적화된 DUPA-NIR 접합체 1 내지 9의 조직 생체분포 데이터로부터의 종양-대-조직 형광 비. 영상화 후, 생체내 영상화 소프트웨어를 이용하여 각각의 조직에 대해 관심 있는 영역(ROI) 내부의 형광을 측정한 후, 종양-대-조직 형광을 계산하였다.
도 6 - 리간드와 NIR 염료 사이에 방향족 아미노산 링커를 가진 PSMA-표적화된 DUPA-링커-NIR 영상화제의 구조.
도 7 - DUPA-FITC(14)에 대한 방향족 아미노산 링커를 가진 DUPA-NIR 접합체의 상대적 결합 친화성. PSMA 양성 22Rv1 인간 전립선암 세포를 100 nM DUPA-FITC의 존재 하에서 증가하는 농도의 DUPA-NIR 접합체와 함께 37℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. 그 다음, 배지를 제거하고 새로운 배지로 (3회) 세척하고 PBS로 대체하였다. 유세포분석을 이용하여 세포에 결합된 형광을 분석하였다.
도 8 - 인간 전립선 종양 이종이식편(22Rv1 세포)을 보유하는 마우스의 형광 영상화를 이용하였을 때 DUPA-NIR 접합체 15 및 23의 조직 생체분포 분석 및 종양-대-조직 비. 꼬리 정맥을 통해 DUPA-NIR 염료 접합체를, 22Rv1 종양 이종이식편을 가진 수컷 누드 마우스에게 주사하였다. DUPA-NIR 염료 접합체를 투여한 지 2시간 후 상기 마우스를 안락사시켰고, 선택된 조직을 채취하였고, 조직을 IVIS 영상화기(ex = 745 nm, em = ICG, 노출 = 1s)로 영상화하였다. 영상화 후, 생체내 영상화 소프트웨어를 이용하여 각각의 조직에 대해 관심 있는 영역(ROI) 내부의 형광을 측정한 후, 종양-대-조직 형광을 계산하였다.
도 9 - 역치를 조절한 후 전신 또는 반신 형광 영상을 백색 광 영상 위에 겹쳐 놓는다. 20 nmol의 14를 22Rv1 인간 전립선 종양 이종이식편 보유 마우스에게 주사하고 상이한 시간 간격으로 IVIS 영상화기(ex = 745 nm, em = ICG, 노출 시간 = 1s)로 영상화하였다.
도 10 - 역치를 조절한 후 전신 또는 반신 형광 영상을 백색 광 영상 위에 겹쳐 놓는다. 20 nmol의 23을 22Rv1 인간 전립선 종양 이종이식편 보유 마우스에게 주사하고 상이한 시간 간격으로 IVIS 영상화기(ex = 745 nm, em = ICG, 노출 시간 = 1s)로 영상화하였다.
도 11 - 역치를 조절한 후 전신 또는 반신 형광 영상을 백색 광 영상 위에 겹쳐 놓는다. 20 nmol의 25를 22Rv1 인간 전립선 종양 이종이식편 보유 마우스에게 주사하고 상이한 시간 간격으로 IVIS 영상화기(ex = 745 nm, em = ICG, 노출 시간 = 1s)로 영상화하였다.
도 12 - 역치를 조절한 후 전신 또는 반신 형광 영상을 백색 광 영상 위에 겹쳐 놓는다. 6 nmol의 35를 22Rv1 인간 전립선 종양 이종이식편 보유 마우스에게 주사하고 상이한 시간 간격으로 IVIS 영상화기(ex = 745 nm, em = ICG, 노출 시간 = 1s)로 영상화하였다.
도 13 - 역치를 조절한 후 전신 또는 반신 형광 영상을 백색 광 영상 위에 겹쳐 놓는다. 6 nmol의 36을 22Rv1 인간 전립선 종양 이종이식편 보유 마우스에게 주사하고 상이한 시간 간격으로 IVIS 영상화기(ex = 745 nm, em = ICG, 노출 시간 = 1s)로 영상화하였다.
도 14 - 리간드와 NIR 염료 사이에 양전하 링커를 가진 PSMA-표적화된 DUPA-링커-NIR 영상화제의 구조.
도 15 - DUPA-FITC(14)에 대한 DUPA-NIR 접합체의 상대적 결합 친화성. PSMA 양성 22Rv1 인간 전립선암 세포를 100 nM DUPA-FITC의 존재 하에서 증가하는 농도의 DUPA-NIR 접합체와 함께 37℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. 그 다음, 배지를 제거하고 새로운 배지로 (3회) 세척하고 PBS로 대체하였다. 유세포분석을 이용하여 세포에 결합된 형광을 분석하였다.
도 16 - 인간 전립선 종양 이종이식편(22 Rv1 세포)을 보유하는 마우스의 형광 영상화를 이용하였을 때 DUPA-NIR 접합체 39 및 41의 종양-대-조직 비. 꼬리 정맥을 통해 DUPA-NIR 염료 접합체를, 22Rv1 종양 이종이식편을 가진 수컷 누드 마우스에게 주사하였다. DUPA-NIR 염료 접합체를 투여한 지 2시간 후 상기 마우스를 안락사시켰고, 선택된 조직을 채취하였고, 조직을 IVIS 영상화기(ex = 745 nm, em = ICG, 노출 시간 = 1s)로 영상화하였다. 영상화 후, 생체내 영상화 소프트웨어를 이용하여 각각의 조직에 대해 관심 있는 영역(ROI) 내부의 형광을 측정한 후, 종양-대-조직 형광을 계산하였다.
도 17 - 역치를 조절한 후 전신 또는 반신 형광 영상을 백색 광 영상 위에 겹쳐 놓는다. 20 nmol의 39를 22Rv1 인간 전립선 종양 이종이식편 보유 마우스에게 주사하고 상이한 시간 간격으로 IVIS 영상화기(ex = 745 nm, em = ICG, 노출 시간 = 1s)로 영상화하였다.
도 18 - 역치를 조절한 후 전신 또는 반신 형광 영상을 백색 광 영상 위에 겹쳐 놓는다. 20 nmol의 40을 22Rv1 인간 전립선 종양 이종이식편 보유 마우스에게 주사하고 상이한 시간 간격으로 IVIS 영상화기(ex = 745 nm, em = ICG, 노출 시간 = 1s)로 영상화하였다.
도 19 - 역치를 조절한 후 전신 또는 반신 형광 영상을 백색 광 영상 위에 겹쳐 놓는다. 20 nmol의 41을 22Rv1 인간 전립선 종양 이종이식편 보유 마우스에게 주사하고 상이한 시간 간격으로 IVIS 영상화기(ex = 745 nm, em = ICG, 노출 시간 = 1s)로 영상화하였다.
도 20 - 리간드와 NIR 염료 사이에 음전하 링커를 가진 PSMA-표적화된 DUPA-링커-NIR 영상화제의 구조.
도 21 - DUPA-FITC(14)에 대한 49 및 50의 DUPA-NIR 접합체의 상대적 결합 친화성. PSMA 양성 22Rv1 인간 전립선암 세포를 100 nM DUPA-FITC의 존재 하에서 증가하는 농도의 DUPA-NIR 접합체와 함께 37℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. 그 다음, 배지를 제거하고 새로운 배지로 (3회) 세척하고 PBS로 대체하였다. 유세포분석을 이용하여 세포에 결합된 형광을 분석하였다.
도 22 - 인간 전립선 종양 이종이식편(22 Rv1 세포)을 보유하는 마우스의 형광 영상화를 이용하였을 때 DUPA-NIR 접합체 49 및 50의 조직 생체분포 분석 및 종양-대-조직 비. 꼬리 정맥을 통해 DUPA-NIR 염료 접합체를, 22Rv1 종양 이종이식편을 가진 수컷 누드 마우스에게 주사하였다. DUPA-NIR 염료 접합체를 투여한 지 2시간 후 상기 마우스를 안락사시켰고, 선택된 조직을 채취하였고, 조직을 IVIS 영상화기(ex = 745 nm, em = ICG, 노출 시간 = 1s)로 영상화하였다. 영상화 후, 생체내 영상화 소프트웨어를 이용하여 각각의 조직에 대해 관심 있는 영역(ROI) 내부의 형광을 측정한 후, 종양-대-조직 형광을 계산하였다.
도 23 - 가변적으로 하전된 NIR 염료 분자를 가진 PSMA-표적화된 DUPA-링커-NIR 영상화제의 구조.
도 24 - DUPA-FITC(14)에 대한 DUPA-NIR 접합체의 상대적 결합 친화성. PSMA 양성 22Rv1 인간 전립선암 세포를 100 nM DUPA-FITC의 존재 하에서 증가하는 농도의 DUPA-NIR 접합체와 함께 37℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. 그 다음, 배지를 제거하고 새로운 배지로 (3회) 세척하고 PBS로 대체하였다. 유세포분석을 이용하여 세포에 결합된 형광을 분석하였다.
도 25 - 역치를 조절한 후 전신 또는 반신 형광 영상을 백색 광 영상 위에 겹쳐 놓는다. 20 nmol의 54를 22Rv1 인간 전립선 종양 이종이식편 보유 마우스에게 주사하고 상이한 시간 간격으로 IVIS 영상화기(ex = 745 nm, em = ICG, 노출 시간 = 1s)로 영상화하였다.
도 26 - 역치를 조절한 후 전신 또는 반신 형광 영상을 백색 광 영상 위에 겹쳐 놓는다. 20 nmol의 55를 22Rv1 인간 전립선 종양 이종이식편 보유 마우스에게 주사하고 상이한 시간 간격으로 IVIS 영상화기(ex = 745 nm, em = ICG, 노출 시간 = 1s)로 영상화하였다.
도 27 - 역치를 조절한 후 전신 또는 반신 형광 영상을 백색 광 영상 위에 겹쳐 놓는다. 20 nmol의 56을 22Rv1 인간 전립선 종양 이종이식편 보유 마우스에게 주사하고 상이한 시간 간격으로 IVIS 영상화기(ex = 745 nm, em = ICG, 노출 시간 = 1s)로 영상화하였다.
도 28 - 역치를 조절한 후 전신 또는 반신 형광 영상을 백색 광 영상 위에 겹쳐 놓는다. 20 nmol의 57을 22Rv1 인간 전립선 종양 이종이식편 보유 마우스에게 주사하고 상이한 시간 간격으로 IVIS 영상화기(ex = 745 nm, em = ICG, 노출 시간 = 1s)로 영상화하였다.
도 29 - 역치를 조절한 후 전신 또는 반신 형광 영상을 백색 광 영상 위에 겹쳐 놓는다. 20 nmol의 58을 22Rv1 인간 전립선 종양 이종이식편 보유 마우스에게 주사하고 상이한 시간 간격으로 IVIS 영상화기(ex = 745 nm, em = ICG, 노출 시간 = 1s)로 영상화하였다.
도 30 - 역치를 조절한 후 전신 또는 반신 형광 영상을 백색 광 영상 위에 겹쳐 놓는다. 20 nmol의 60을 22Rv1 인간 전립선 종양 이종이식편 보유 마우스에게 주사하고 상이한 시간 간격으로 IVIS 영상화기(ex = 745 nm, em = ICG, 노출 시간 = 1s)로 영상화하였다.
도 31 - 여러 가지 종류의 링커들 및 NIR 염료들을 가진 PSMA-표적화된 DUPA-링커-NIR 영상화제들의 구조.
도 32 - DUPA-FITC(14)에 대한 DUPA-NIR 접합체의 상대적 결합 친화성. PSMA 양성 22Rv1 인간 전립선암 세포를 100 nM DUPA-FITC의 존재 하에서 증가하는 농도의 DUPA-NIR 접합체와 함께 37℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. 그 다음, 배지를 제거하고 새로운 배지로 (3회) 세척하고 PBS로 대체하였다. 유세포분석을 이용하여 세포에 결합된 형광을 분석하였다.
도 33 - 역치를 조절한 후 전신 또는 반신 형광 영상을 백색 광 영상 위에 겹쳐 놓는다. 20 nmol의 63을 22Rv1 인간 전립선 종양 이종이식편 보유 마우스에게 주사하고 상이한 시간 간격으로 IVIS 영상화기(ex = 745 nm, em = ICG, 노출 시간 = 1s)로 영상화하였다.
도 34 - 역치를 조절한 후 전신 또는 반신 형광 영상을 백색 광 영상 위에 겹쳐 놓는다. 6 nmol의 63을 22Rv1 인간 전립선 종양 이종이식편 보유 마우스에게 주사하고 상이한 시간 간격으로 IVIS 영상화기(ex = 745 nm, em = ICG, 노출 시간 = 1s)로 영상화하였다.
도 35 - 역치를 조절한 후 전신 또는 반신 형광 영상을 백색 광 영상 위에 겹쳐 놓는다. 20 nmol의 64를 22Rv1 인간 전립선 종양 이종이식편 보유 마우스에게 주사하고 상이한 시간 간격으로 IVIS 영상화기(ex = 745 nm, em = ICG, 노출 시간 = 1s)로 영상화하였다.
도 36 - 상이한 리간드를 가진 PSMA-표적화된 NIR 영상화제의 구조.
도 37 - DUPA-FITC(14)에 대한 PSMA-표적화된 NIR 접합체의 상대적 결합 친화성. PSMA 양성 22Rv1 인간 전립선암 세포를 100 nM DUPA-FITC의 존재 하에서 증가하는 농도의 DUPA-NIR 접합체와 함께 37℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. 그 다음, 배지를 제거하고 새로운 배지로 (3회) 세척하고 PBS로 대체하였다. 유세포분석을 이용하여 세포에 결합된 형광을 분석하였다.
도 38 - 역치를 조절한 후 전신 또는 반신 형광 영상을 백색 광 영상 위에 겹쳐 놓는다. 6 nmol의 14를 22Rv1 인간 전립선 종양 이종이식편 보유 마우스에게 주사하고 상이한 시간 간격으로 IVIS 영상화기(ex = 745 nm, em = ICG, 노출 시간 = 1s)로 영상화하였다.
도 2(A) - PSMA-표적화된 DUPA-FITC(플루오레세인 이소티오시아네이트) 접합체(14)의 구조.
도 2(B) - PSMA-표적화된 DUPA-FITC(플루오레세인 이소티오시아네이트) 접합체(14), 및 배양물 중의 PSMA 양성 22Rv1 인간 전립선암 세포 및 PSMA 음성 A549 인간 폐포 기저 상피 세포에 대한 그의 결합 친화성(KD) 및 특이성. RPMI 배지에 용해된 DUPA-FITC를 RPMI 배양 배지 중의 22Rv1 또는 A549 세포에 표시된 농도로 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. 그 다음, 배지를 제거하고 새로운 배지로 (3회) 세척하고 PBS(포스페이트 완충 식염수)로 대체하였다. 유세포분석을 이용하여 샘플을 분석하였다. 오차 막대는 SD(n = 3)를 나타낸다. s는 항원 인식 부위 내에 함유된다.
도 3 - DUPA-FITC(14)에 대한 DUPA-NIR 접합체 1 내지 9의 상대적 결합 친화성. PSMA 양성 22Rv1 인간 전립선암 세포를 100 nM DUPA-FITC의 존재 하에서 증가하는 농도의 DUPA-NIR 접합체와 함께 37℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. 그 다음, 배지를 제거하고 새로운 배지로 (3회) 세척하고 PBS로 대체하였다. 유세포분석을 이용하여 세포에 결합된 형광을 분석하였다.
도 5 - PSMA-표적화된 DUPA-NIR 접합체 1 내지 9의 조직 생체분포 데이터로부터의 종양-대-조직 형광 비. 영상화 후, 생체내 영상화 소프트웨어를 이용하여 각각의 조직에 대해 관심 있는 영역(ROI) 내부의 형광을 측정한 후, 종양-대-조직 형광을 계산하였다.
도 6 - 리간드와 NIR 염료 사이에 방향족 아미노산 링커를 가진 PSMA-표적화된 DUPA-링커-NIR 영상화제의 구조.
도 7 - DUPA-FITC(14)에 대한 방향족 아미노산 링커를 가진 DUPA-NIR 접합체의 상대적 결합 친화성. PSMA 양성 22Rv1 인간 전립선암 세포를 100 nM DUPA-FITC의 존재 하에서 증가하는 농도의 DUPA-NIR 접합체와 함께 37℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. 그 다음, 배지를 제거하고 새로운 배지로 (3회) 세척하고 PBS로 대체하였다. 유세포분석을 이용하여 세포에 결합된 형광을 분석하였다.
도 8 - 인간 전립선 종양 이종이식편(22Rv1 세포)을 보유하는 마우스의 형광 영상화를 이용하였을 때 DUPA-NIR 접합체 15 및 23의 조직 생체분포 분석 및 종양-대-조직 비. 꼬리 정맥을 통해 DUPA-NIR 염료 접합체를, 22Rv1 종양 이종이식편을 가진 수컷 누드 마우스에게 주사하였다. DUPA-NIR 염료 접합체를 투여한 지 2시간 후 상기 마우스를 안락사시켰고, 선택된 조직을 채취하였고, 조직을 IVIS 영상화기(ex = 745 nm, em = ICG, 노출 = 1s)로 영상화하였다. 영상화 후, 생체내 영상화 소프트웨어를 이용하여 각각의 조직에 대해 관심 있는 영역(ROI) 내부의 형광을 측정한 후, 종양-대-조직 형광을 계산하였다.
도 9 - 역치를 조절한 후 전신 또는 반신 형광 영상을 백색 광 영상 위에 겹쳐 놓는다. 20 nmol의 14를 22Rv1 인간 전립선 종양 이종이식편 보유 마우스에게 주사하고 상이한 시간 간격으로 IVIS 영상화기(ex = 745 nm, em = ICG, 노출 시간 = 1s)로 영상화하였다.
도 10 - 역치를 조절한 후 전신 또는 반신 형광 영상을 백색 광 영상 위에 겹쳐 놓는다. 20 nmol의 23을 22Rv1 인간 전립선 종양 이종이식편 보유 마우스에게 주사하고 상이한 시간 간격으로 IVIS 영상화기(ex = 745 nm, em = ICG, 노출 시간 = 1s)로 영상화하였다.
도 11 - 역치를 조절한 후 전신 또는 반신 형광 영상을 백색 광 영상 위에 겹쳐 놓는다. 20 nmol의 25를 22Rv1 인간 전립선 종양 이종이식편 보유 마우스에게 주사하고 상이한 시간 간격으로 IVIS 영상화기(ex = 745 nm, em = ICG, 노출 시간 = 1s)로 영상화하였다.
도 12 - 역치를 조절한 후 전신 또는 반신 형광 영상을 백색 광 영상 위에 겹쳐 놓는다. 6 nmol의 35를 22Rv1 인간 전립선 종양 이종이식편 보유 마우스에게 주사하고 상이한 시간 간격으로 IVIS 영상화기(ex = 745 nm, em = ICG, 노출 시간 = 1s)로 영상화하였다.
도 13 - 역치를 조절한 후 전신 또는 반신 형광 영상을 백색 광 영상 위에 겹쳐 놓는다. 6 nmol의 36을 22Rv1 인간 전립선 종양 이종이식편 보유 마우스에게 주사하고 상이한 시간 간격으로 IVIS 영상화기(ex = 745 nm, em = ICG, 노출 시간 = 1s)로 영상화하였다.
도 14 - 리간드와 NIR 염료 사이에 양전하 링커를 가진 PSMA-표적화된 DUPA-링커-NIR 영상화제의 구조.
도 15 - DUPA-FITC(14)에 대한 DUPA-NIR 접합체의 상대적 결합 친화성. PSMA 양성 22Rv1 인간 전립선암 세포를 100 nM DUPA-FITC의 존재 하에서 증가하는 농도의 DUPA-NIR 접합체와 함께 37℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. 그 다음, 배지를 제거하고 새로운 배지로 (3회) 세척하고 PBS로 대체하였다. 유세포분석을 이용하여 세포에 결합된 형광을 분석하였다.
도 16 - 인간 전립선 종양 이종이식편(22 Rv1 세포)을 보유하는 마우스의 형광 영상화를 이용하였을 때 DUPA-NIR 접합체 39 및 41의 종양-대-조직 비. 꼬리 정맥을 통해 DUPA-NIR 염료 접합체를, 22Rv1 종양 이종이식편을 가진 수컷 누드 마우스에게 주사하였다. DUPA-NIR 염료 접합체를 투여한 지 2시간 후 상기 마우스를 안락사시켰고, 선택된 조직을 채취하였고, 조직을 IVIS 영상화기(ex = 745 nm, em = ICG, 노출 시간 = 1s)로 영상화하였다. 영상화 후, 생체내 영상화 소프트웨어를 이용하여 각각의 조직에 대해 관심 있는 영역(ROI) 내부의 형광을 측정한 후, 종양-대-조직 형광을 계산하였다.
도 17 - 역치를 조절한 후 전신 또는 반신 형광 영상을 백색 광 영상 위에 겹쳐 놓는다. 20 nmol의 39를 22Rv1 인간 전립선 종양 이종이식편 보유 마우스에게 주사하고 상이한 시간 간격으로 IVIS 영상화기(ex = 745 nm, em = ICG, 노출 시간 = 1s)로 영상화하였다.
도 18 - 역치를 조절한 후 전신 또는 반신 형광 영상을 백색 광 영상 위에 겹쳐 놓는다. 20 nmol의 40을 22Rv1 인간 전립선 종양 이종이식편 보유 마우스에게 주사하고 상이한 시간 간격으로 IVIS 영상화기(ex = 745 nm, em = ICG, 노출 시간 = 1s)로 영상화하였다.
도 19 - 역치를 조절한 후 전신 또는 반신 형광 영상을 백색 광 영상 위에 겹쳐 놓는다. 20 nmol의 41을 22Rv1 인간 전립선 종양 이종이식편 보유 마우스에게 주사하고 상이한 시간 간격으로 IVIS 영상화기(ex = 745 nm, em = ICG, 노출 시간 = 1s)로 영상화하였다.
도 20 - 리간드와 NIR 염료 사이에 음전하 링커를 가진 PSMA-표적화된 DUPA-링커-NIR 영상화제의 구조.
도 21 - DUPA-FITC(14)에 대한 49 및 50의 DUPA-NIR 접합체의 상대적 결합 친화성. PSMA 양성 22Rv1 인간 전립선암 세포를 100 nM DUPA-FITC의 존재 하에서 증가하는 농도의 DUPA-NIR 접합체와 함께 37℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. 그 다음, 배지를 제거하고 새로운 배지로 (3회) 세척하고 PBS로 대체하였다. 유세포분석을 이용하여 세포에 결합된 형광을 분석하였다.
도 22 - 인간 전립선 종양 이종이식편(22 Rv1 세포)을 보유하는 마우스의 형광 영상화를 이용하였을 때 DUPA-NIR 접합체 49 및 50의 조직 생체분포 분석 및 종양-대-조직 비. 꼬리 정맥을 통해 DUPA-NIR 염료 접합체를, 22Rv1 종양 이종이식편을 가진 수컷 누드 마우스에게 주사하였다. DUPA-NIR 염료 접합체를 투여한 지 2시간 후 상기 마우스를 안락사시켰고, 선택된 조직을 채취하였고, 조직을 IVIS 영상화기(ex = 745 nm, em = ICG, 노출 시간 = 1s)로 영상화하였다. 영상화 후, 생체내 영상화 소프트웨어를 이용하여 각각의 조직에 대해 관심 있는 영역(ROI) 내부의 형광을 측정한 후, 종양-대-조직 형광을 계산하였다.
도 23 - 가변적으로 하전된 NIR 염료 분자를 가진 PSMA-표적화된 DUPA-링커-NIR 영상화제의 구조.
도 24 - DUPA-FITC(14)에 대한 DUPA-NIR 접합체의 상대적 결합 친화성. PSMA 양성 22Rv1 인간 전립선암 세포를 100 nM DUPA-FITC의 존재 하에서 증가하는 농도의 DUPA-NIR 접합체와 함께 37℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. 그 다음, 배지를 제거하고 새로운 배지로 (3회) 세척하고 PBS로 대체하였다. 유세포분석을 이용하여 세포에 결합된 형광을 분석하였다.
도 25 - 역치를 조절한 후 전신 또는 반신 형광 영상을 백색 광 영상 위에 겹쳐 놓는다. 20 nmol의 54를 22Rv1 인간 전립선 종양 이종이식편 보유 마우스에게 주사하고 상이한 시간 간격으로 IVIS 영상화기(ex = 745 nm, em = ICG, 노출 시간 = 1s)로 영상화하였다.
도 26 - 역치를 조절한 후 전신 또는 반신 형광 영상을 백색 광 영상 위에 겹쳐 놓는다. 20 nmol의 55를 22Rv1 인간 전립선 종양 이종이식편 보유 마우스에게 주사하고 상이한 시간 간격으로 IVIS 영상화기(ex = 745 nm, em = ICG, 노출 시간 = 1s)로 영상화하였다.
도 27 - 역치를 조절한 후 전신 또는 반신 형광 영상을 백색 광 영상 위에 겹쳐 놓는다. 20 nmol의 56을 22Rv1 인간 전립선 종양 이종이식편 보유 마우스에게 주사하고 상이한 시간 간격으로 IVIS 영상화기(ex = 745 nm, em = ICG, 노출 시간 = 1s)로 영상화하였다.
도 28 - 역치를 조절한 후 전신 또는 반신 형광 영상을 백색 광 영상 위에 겹쳐 놓는다. 20 nmol의 57을 22Rv1 인간 전립선 종양 이종이식편 보유 마우스에게 주사하고 상이한 시간 간격으로 IVIS 영상화기(ex = 745 nm, em = ICG, 노출 시간 = 1s)로 영상화하였다.
도 29 - 역치를 조절한 후 전신 또는 반신 형광 영상을 백색 광 영상 위에 겹쳐 놓는다. 20 nmol의 58을 22Rv1 인간 전립선 종양 이종이식편 보유 마우스에게 주사하고 상이한 시간 간격으로 IVIS 영상화기(ex = 745 nm, em = ICG, 노출 시간 = 1s)로 영상화하였다.
도 30 - 역치를 조절한 후 전신 또는 반신 형광 영상을 백색 광 영상 위에 겹쳐 놓는다. 20 nmol의 60을 22Rv1 인간 전립선 종양 이종이식편 보유 마우스에게 주사하고 상이한 시간 간격으로 IVIS 영상화기(ex = 745 nm, em = ICG, 노출 시간 = 1s)로 영상화하였다.
도 31 - 여러 가지 종류의 링커들 및 NIR 염료들을 가진 PSMA-표적화된 DUPA-링커-NIR 영상화제들의 구조.
도 32 - DUPA-FITC(14)에 대한 DUPA-NIR 접합체의 상대적 결합 친화성. PSMA 양성 22Rv1 인간 전립선암 세포를 100 nM DUPA-FITC의 존재 하에서 증가하는 농도의 DUPA-NIR 접합체와 함께 37℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. 그 다음, 배지를 제거하고 새로운 배지로 (3회) 세척하고 PBS로 대체하였다. 유세포분석을 이용하여 세포에 결합된 형광을 분석하였다.
도 33 - 역치를 조절한 후 전신 또는 반신 형광 영상을 백색 광 영상 위에 겹쳐 놓는다. 20 nmol의 63을 22Rv1 인간 전립선 종양 이종이식편 보유 마우스에게 주사하고 상이한 시간 간격으로 IVIS 영상화기(ex = 745 nm, em = ICG, 노출 시간 = 1s)로 영상화하였다.
도 34 - 역치를 조절한 후 전신 또는 반신 형광 영상을 백색 광 영상 위에 겹쳐 놓는다. 6 nmol의 63을 22Rv1 인간 전립선 종양 이종이식편 보유 마우스에게 주사하고 상이한 시간 간격으로 IVIS 영상화기(ex = 745 nm, em = ICG, 노출 시간 = 1s)로 영상화하였다.
도 35 - 역치를 조절한 후 전신 또는 반신 형광 영상을 백색 광 영상 위에 겹쳐 놓는다. 20 nmol의 64를 22Rv1 인간 전립선 종양 이종이식편 보유 마우스에게 주사하고 상이한 시간 간격으로 IVIS 영상화기(ex = 745 nm, em = ICG, 노출 시간 = 1s)로 영상화하였다.
도 36 - 상이한 리간드를 가진 PSMA-표적화된 NIR 영상화제의 구조.
도 37 - DUPA-FITC(14)에 대한 PSMA-표적화된 NIR 접합체의 상대적 결합 친화성. PSMA 양성 22Rv1 인간 전립선암 세포를 100 nM DUPA-FITC의 존재 하에서 증가하는 농도의 DUPA-NIR 접합체와 함께 37℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. 그 다음, 배지를 제거하고 새로운 배지로 (3회) 세척하고 PBS로 대체하였다. 유세포분석을 이용하여 세포에 결합된 형광을 분석하였다.
도 38 - 역치를 조절한 후 전신 또는 반신 형광 영상을 백색 광 영상 위에 겹쳐 놓는다. 6 nmol의 14를 22Rv1 인간 전립선 종양 이종이식편 보유 마우스에게 주사하고 상이한 시간 간격으로 IVIS 영상화기(ex = 745 nm, em = ICG, 노출 시간 = 1s)로 영상화하였다.
정의
본 발명은 본원에 기재된 특정 방법, 프로토콜, 세포주, 구축물 및 시약으로 한정되지 않고 그 자체가 달라질 수 있다는 것을 이해할 것이다. 본원에서 사용된 용어는 특정 실시양태만을 기술하기 위한 것이고, 첨부된 청구범위에 의해서만 한정될 본 발명의 범위를 한정하기 위한 것이 아니라는 것도 이해할 것이다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용된 바와 같이, 문맥이 달리 명시하지 않는 한, 단수 형태는 복수 지시대상을 포함한다. 따라서, 예를 들면, "전립선 특이적 막 항원 리간드" 또는 "PSMA 리간드"의 지칭은 하나 이상의 이러한 리간드의 지칭이고 당분야에서 숙련된 자에게 알려진 그의 등가물 등을 포함한다.
달리 정의되어 있지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 기술을 가진 자에게 통상적으로 이해된 의미와 동일한 의미를 가진다. 본원에 기재된 방법, 장치 및 재료와 유사하거나 동등한 임의의 방법, 장치 및 재료가 본 발명의 실시 또는 시험에서 사용될 수 있지만, 바람직한 방법, 장치 및 재료가 지금부터 기재된다.
본원에서 언급된 모든 공개문헌들 및 특허들은 예를 들면, 기재된 본 발명과 관련하여 사용될, 공개문헌에 기재된 구축물 및 방법을 기술하고 개시하기 위해 본원에 참고로 도입된다. 본원에서 논의된 공개문헌들은 본원의 출원일 전에 그들의 개시에 대해서만 제공된다. 본원에서 어느 것도 본 발명자들이 선행 발명을 통해 또는 임의의 다른 이유로 이러한 개시를 예상할 자격이 없다는 것을 인정하는 것으로서 해석되어서는 안 된다.
본 발명의 PSMA-표적화된 NIR 접합체에 대하여, 용어 "항원성 면에서 특이적" 또는 "특이적으로 결합한다"는 PSMA의 하나 이상의 에피토프에 결합하나, 항원들의 혼합된 집단을 함유하는 샘플에서 다른 분자를 실질적으로 인식하고 이 분자에 결합하지 않는 PSMA 표적화 화합물을 지칭한다.
본원에서 사용될 때 용어 "에피토프"는 DUPA에 의해 인식되는 PSMA 상의 부위를 지칭한다. 에피토프는 아미노산의 선형 또는 입체구조적으로 형성된 서열 또는 모양일 수 있다.
본원에서 사용될 때, "PSMA 표적화 화합물" 또는 "PSMA-표적화된 화합물"은 적어도 PSMA 또는 PSMA의 에피토프에의 특이적 결합이라는 생물학적 활성을 가진 소분자, 리간드, 폴리펩티드 및 단백질을 포함할 것이다. 이들 화합물들은 PSMA 또는 적어도 하나의 PSMA 에피토프에 결합하는 리간드, 수용체, 펩티드 또는 임의의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 화합물은 PSMA 표적화 화합물을 포함하거나, PSMA 그 자체의 부분에 결합할 수 있거나, PSMA와 연관된 세포 표면 단백질 또는 수용체에 결합할 수 있다.
용어 "작용기", "활성 모이어티", "활성화 기", "이탈기", "반응성 부위", "화학적 반응성 기" 및 "화학적 반응성 모이어티"는 분자의 상이한 규정가능한 부분 또는 유닛을 지칭하기 위해 당분야 및 본원에서 사용된다. 상기 용어들은 화학 분야에서 다소 동의어이고 일부 기능 또는 활성을 수행하고 다른 분자와 반응하는 분자의 부분을 표시하기 위해 본원에서 사용된다.
용어 "아미노산"은 천연 생성 아미노산 및 비천연 생성 아미노산뿐만 아니라, 천연 생성 아미노산과 유사한 방식으로 작용하는 아미노산 유사체 및 아미노산 모방 물질도 지칭한다. 천연적으로 코딩된 아미노산은 20종의 일반 아미노산들(알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 라이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 쓰레오닌, 트립토판, 티로신 및 발린), 및 피로라이신 및 셀레노시스테인이다. 아미노산 유사체는 천연 생성 아미노산과 동일한 기본 화학 구조, 즉 수소, 카복실 기, 아미노 기 및 R 기에 결합된 α 탄소를 가진 화합물, 예컨대, 호모세린, 노르류신, 메티오닌 설폭사이드, 메티오닌 메틸 설포늄을 지칭한다. 이러한 유사체는 변형된 R 기(예컨대, 노르류신) 또는 변형된 펩티드 골격을 갖지만, 천연 생성 아미노산과 동일한 기본 화학 구조를 보유한다.
아미노산들은 그들의 통상적으로 알려진 3 문자 부호, 또는 IUPAC-IUB 생화학 명명위원회(Biochemical Nomenclature Commission)에 의해 권장된 1 문자 부호에 의해 본원에서 지칭될 수 있다.
본 발명은 무엇보다도 질환 및/또는 암에 관여하는 PSMA 발현 세포의 초기 진단 및 수술 치료와 연관된 문제점, 및 특히 비한정적 예로서 보다 높은 특이성, 감소된 배경 신호 및 증가된 종양 형광을 포함하는 개선된 영상화, 진단 및 생물학적 성질을 가진 PSMA-표적화된 염료 접합체를 다룬다.
상세한 설명
화학요법 및 방사선요법은 모든 암 환자들의 5% 미만을 치유하지만, 수술은 미국에서 고형 종양을 가진 환자의 50%를 치유한다. 미국에서 매년 700,000명 이상의 환자들이 암 수술을 받고, 수술 환자의 40%가 5년 이내에 국소부위 질환의 재발을 가진다. 종양학 분야에서의 주요 발전에도 불구하고, 초기 검출, 음성 주변부를 가진 원발성 종양의 완전한 수술적 절제에 대한 장애물을 극복하는 방법, 및 전이성 암 세포의 제거 및 위성(satellite) 질환의 확인에 대한 필요성이 남아있다. 이들 3가지 목표의 달성은 질환 제거를 개선할 뿐만 아니라, 수술 후 화학요법 및 방사선에 대한 결정도 안내한다. 비표적화된 형광 염료가 일부 종양에서 수동적으로 축적되는 것으로 밝혀졌지만, 수득된 종양-대-배경 비는 종종 좋지 않고, 악성 조직과 건강한 조직 사이의 경계는 규정하기 어려울 수 있다. 리간드-표적화된 형광 염료들(예를 들면, EC17: 폴레이트-EDA-FITC)이 조직의 영상화를 위해 사용되고 있지만, 이 염료들은 깊은 조직을 침투하지 못하므로 조직 샘플 내의 보다 깊은 부위보다 오히려 조직의 표면 상에서 특정 세포만을 확인할 것이기 때문에 비효과적이다. 추가로, 플루오레세인 기반 염료는 낮은 저장 수명 안정성이라는 단점을 가진다. 형광 이소티오시아네이트(FITC) 화합물에 의해 형성된 티오우레아 가교는 용이하게 분해되어, 불안정한 화합물을 만든다. 추가로, EC17은 영상화 부위를 둘러싸는 조직에서 콜라겐으로부터의 상대적으로 높은 수준의 비특이적 배경 노이즈라는 결점을 가진 플루오레세인을 사용한다. 더욱이, 생물학적 발색단, 특히 헤모글로빈에 의한 가시광선의 흡수는 플루오레세인을 포함하는 염료의 유용성을 더 한정한다. 따라서, 통상적인 염료는 조직에서 수 밀리미터보다 더 깊이 묻혀있을 수 있는 종양을 용이하게 검출할 수 없다. 나아가, 플루오레세인으로부터의 형광은 낮은 pH(pH 5 미만)에서 소광된다.
염료 물질이 검출 및 수술 유도, 또는 초기 조직, 전이성 조직 및 다른 조직 영상화의 검출을 제공하는 데 유용하기 위해서는 이들 결점들을 극복하는 것이 중요하다. 본 발명은 안정하고, 적외선 범위에서 형광을 발하고, 표적화된 조직 내부에 깊이 침투하여 PSMA를 발현하는 조직의 영역의 특이적 및 선명한 확인을 유발하고, PSMA를 발현하지 않는 조직으로부터 신속히 제거되어 높은 종양-대-배경 비를 수득하고, 피부로부터 신속히 제거되는 근적외선 염료의 PSMA-표적화된 접합체를 제공한다. 더 구체적으로, PSMA-표적화된 접합체는 하나 이상의 원자 스페이서, 아미노산, 아미노산 유도체로 구성된 링커를 통해 근적외선 염료에 결합된다. 훨씬 더 구체적으로, 원자 스페이서가 중성 또는 하전된 원자를 가진 소수성 7-원자 스페이서이고 아미노산 스페이서가 방향족 아미노산 또는 방향족 아미노산의 유도체, 또는 음전하 또는 양전하 아미노산 및 티로신 또는 티로신의 유도체인 경우가 발견되었다. 링커의 전하를 변경하여 신속한 피부 제거 및 신속한 종양 축적을 수득함으로써 보다 높은 종양-대-배경 비를 수득할 수 있다. 더욱이, 방향족 아미노산, 또는 티로신 또는 티로신의 유도체를 가짐으로써 NIR 염료의 형광 강도를 유지하거나 심지어 향상시키고, NIR 염료의 전하를 변경하여 신속한 피부 제거를 달성할 수 있다.
본 개시는 NIR 염료에 결합된 PSMA-표적화된 리간드 및 이를 합성하는 방법을 제공한다. 본 개시는 전립선암을 포함하나 이것으로 한정되지 않는, PSMA를 발현하는 종양의 표적화된 영상화에 사용하기 위한 화합물, 및 예를 들면, PSMA 양성 조직 및 종양을 수반하는 영상화 및 수술에 사용하는 방법도 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 화합물은 하기 식을 가진다:
B-X-Y-Z
상기 식에서,
B는 PSMA-표적화된 화합물이고;
X는 스페이서이고;
Y는 아미노산 스페이서이고;
Z는 NIR 염료이다.
일부 실시양태에서, PSMA-표적화된 화합물은 소분자, 리간드 또는 이들의 유도체로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, PSMA-표적화된 화합물은 리간드이다. 일부 실시양태에서, PSMA-표적화된 화합물은 DUPA이다. 다른 실시양태에서, PSMA-표적화된 화합물은 PSMA에 결합하는 소분자이다.
일부 실시양태에서, X는 소수성 스페이서이다. 일부 실시양태에서, X는 에이트 아미노옥톤산(EAOA); 7개 원자의 쇄; 폴리에틸렌 글리콜 스페이서; 길이가 7개 원자인 스페이서; 양이온성 스페이서; 7개 원자의 쇄; 길이가 7개 내지 24개 원자인 쇄; 및 임의적으로 각각 치환되는 2개의 아릴 또는 아릴 알킬 기를 포함하는 펩티드로서, 1개의 아릴 또는 아릴 알킬 기가 약 7개 내지 약 11개, 또는 약 7개 내지 약 14개의 원자를 갖고, 다른 아릴 또는 아릴 알킬 기가 약 10개 내지 약 14개, 또는 약 10개 내지 약 17개의 원자를 가진 것인 펩티드로 구성된 군으로부터 선택된다. 또 다른 실시양태에서, 스페이서는 약 1개 내지 약 30개의 원자, 또는 약 2개 내지 약 20개의 원자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 스페이서는 길이가 7개 원자이다. 일부 실시양태에서, 스페이서는 EAOA를 포함한다. 일부 실시양태에서, 스페이서는 가변적으로 하전된다. 일부 실시양태에서, X는 양전하를 가진다. 다른 실시양태에서, X는 음전하를 가진다.
일부 실시양태에서, Y는 산성(음으로 하전된) 아미노산, 예컨대, 아스파르트산 및 글루탐산; 염기성(양으로 하전된) 아미노산, 예컨대, 아르기닌, 히스티딘 및 라이신; 중성 극성 아미노산, 예컨대, 글리신, 세린, 쓰레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴 및 글루타민; 중성 비극성(소수성) 아미노산, 예컨대, 알라닌, 류신, 이소류신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판 및 메티오닌; 및 이들의 유도체로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, Y는 방향족 아미노산이다. 일부 실시양태에서, Y는 양전하를 가진다. 다른 실시양태에서, Y는 음전하를 가진다.
일부 실시양태에서, Z는 LS288, IR800, SP054, S0121, KODAK, S2076, S0456, 및/또는 하기 염료들로 구성된 군으로부터 선택된 염료를 포함하나 이들로 한정되지 않는 근적외선 염료들로 구성된 군으로부터 선택된다:
일부 실시양태에서, Z는 가변적으로 하전된다. 일부 실시양태에서, Z는 양전하를 가진다. 다른 실시양태에서, Z는 음전하를 가진다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 화합물은 하기 식을 가진다:
B-X-Y-Z
상기 식에서,
B는 PSMA-표적화된 화합물이고; X는 스페이서이고; Y는 황 함유 측쇄 기를 가진 아미노산 스페이서이고; Z는 NIR 염료이다. 일부 실시양태에서, 황 함유 측 기를 가진 아미노산 스페이서는 시스테인이다. 일부 실시양태에서, 황 함유 측 기를 가진 아미노산 스페이서는 메티오닌이다. 일부 실시양태에서, 황 함유 측 기를 가진 아미노산 스페이서는 티오페놀 모이어티를 함유하는 분자이다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 화합물은 하기 식을 가진다:
B-X-Y-Z
상기 식에서,
B는 PSMA-표적화된 화합물이고; X는 스페이서이고; Y는 칼코겐 함유 측쇄 기를 가진 아미노산 스페이서이고; Z는 NIR 염료이다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 하기 식의 화합물을 제공한다:
B-X-Y-Z
상기 식에서,
B는 PSMA-표적화된 화합물이고; X는 스페이서이고; Y는 티로신, 시스테인, 라이신 또는 이들의 유도체로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산이고; Z는 NIR 염료이다. 일부 실시양태에서, Y는 티로신 또는 티로신 유도체를 포함한다. 일부 실시양태에서, Y는 티로신을 포함하고, 탄소 동위체는 티로신의 방향족 고리 상에 있다. 일부 실시양태에서, Y는 수소 동위체를 가진 방향족 고리를 가진 아미노산을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 화합물은 하기 식을 가진다:
B-X-Y-Z
상기 식에서,
B는 PSMA-표적화된 화합물이고; X는 스페이서이고; Z는 NIR 염료이고; Y는 하기 화합물들로 구성된 군으로부터 선택된 티로신의 유도체 또는 이의 라세미체 혼합물을 포함한다:
일부 실시양태에서, 본 발명은 화합물 B-X-Y-Z를 포함하고, 이때 B는 DUPA 또는 이의 유도체를 포함하고 X는 EAOA를 포함하고 Y는 티로신을 포함하고 Z는 S0456을 포함한다.
하기 구조식을 가진 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 이의 동위체:
상기 식에서,
R1은 수소 또는 SO3H를 나타내고;
R2는 수소, CH3, C3H6SO3 -, C3H6SO3H 또는 C4H8SO3 -, 또는 C4H8SO3H 또는 C3H6N+(CH3)3을 나타내고;
R3 및 R5는 각각 탄소, 임의적으로 하나 이상의 공유 결합을 나타내고;
R4는 임의적으로 하나 이상의 공유 결합을 가진 탄소를 나타내고;
R6은 질소, 산소 또는 황, 또는 원자 부재(방향족 고리와 비닐 고리 사이의 직접적인 C-C 결합)를 나타내고;
R7은 임의적이고, 존재할 때 분광 성질을 향상시키기 위한, 예컨대, 비닐 에테르 가교의 휘도 및 안정성을 증가시키기 위한 방향족 치환기를 나타내고;
R8은 임의적이고, 존재할 때 방향족 아미노산, 예컨대, Phe, trp, His 또는 이들의 유도체, 양이온성 아미노산, 예컨대, Arg, Lys 또는 이들의 유도체, 음이온성 아미노산, 예컨대, Asp, Glu 또는 이들의 유도체, 방향족/양이온성/음이온성 산의 비천연 아미노산 또는 유도체를 가진 링커를 나타내고;
R9는 임의적이고, 존재할 때 선형 탄소 쇄, 또는 폴리에틸렌 글리콜 링커, 양이온성 링커, 또는 이들의 유도체를 나타내고;
R10은 CO2H, PO3H2, SO3H, CH2SO3H, CH2CONHCH2SO3H, 또는 CH2CONHCH2CH2SO3H를 나타내고;
R11은 CO2H, SO3H, CH2CONHCH2SO3H, 또는 CH2CONHCH2CH2SO3H를 나타내고;
R12는 수소, 메틸 기 또는 CH2를 나타내고, 임의적으로 각각 결합을 공유하는 CH2를 나타낼 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 하기 구조식을 가진 화합물을 포함한다:
일부 실시양태에서, 본 발명은 하기 구조식을 가진 화합물을 포함한다:
일부 실시양태에서, 본 발명은 하기 구조식을 가진 화합물을 포함한다:
일부 실시양태에서, 본 발명은 하기 구조식을 가진 화합물을 포함한다:
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일부 실시양태에서, 본 발명은 하기 구조식을 가진 화합물을 포함한다:
일부 실시양태에서, 본 발명은 하기 구조식을 가진 화합물을 포함한다:
일부 실시양태에서, 본 발명은 하기 구조식을 가진 화합물을 포함한다:
일부 실시양태에서, 본 발명은 하기 구조식을 가진 화합물을 포함한다:
일부 실시양태에서, 본 발명은 하기 구조식을 가진 화합물을 포함한다:
일부 실시양태에서, 본 발명은 하기 구조식을 가진 화합물을 포함한다:
일부 실시양태에서, 본 발명은 하기 구조식을 가진 화합물을 포함한다:
본 발명의 추가 바람직한 화합물은 하기 화합물들을 포함한다:
구조식 35의 화합물이 본 발명에서 특히 바람직하다.
추가로, 화합물 35의 입체이성질체들, 예컨대, 하기 표에 제시된 입체이성질체들도 본 발명의 방법에서 사용하기에 유용한 PSMA-표적화된 근적외선(NIR) 염료인 것으로 고려된다.
본 발명의 추가 바람직한 화합물은 하기 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 이들의 동위체를 포함한다:
상기 식에서,
R1은 수소 또는 SO3H를 나타내고;
R2는 수소, 또는 CH3, 또는 C3H6SO3 -, 또는 C3H6SO3H 또는 C4H8SO3 -, 또는 C4H8SO3H 또는 C3H6N+(CH3)3을 나타내고;
R3 및 R5는 각각 탄소, 임의적으로 하나 이상의 공유 결합, 또는 산소, 또는 황, 또는 질소를 나타내고;
R4는 임의적으로 하나 이상의 공유 결합을 가진 탄소를 나타내고;
R6은 질소, 산소 또는 황, 또는 원자 부재(방향족 고리와 비닐 고리 사이의 직접적인 C-C 결합)를 나타내고;
R7은 임의적이고, 존재할 때 전자 공여 방향족 치환기를 나타내고;
R8은 임의적이고, 존재할 때 방향족 아미노산, 예컨대, Phe, Trp, His, Tyr 또는 이들의 유도체, 및/또는 양이온성 아미노산, 예컨대, Arg, Lys 또는 이들의 유도체, 및/또는 음이온성 아미노산, 예컨대, Asp, Glu 또는 이들의 유도체, 및/또는 방향족/양이온성/음이온성 산의 비천연 아미노산 또는 유도체를 가진 링커를 나타내고;
R9는 임의적이고, 존재할 때 선형 탄소 쇄, 또는 폴리에틸렌 글리콜 링커, 폴리에틸렌 아민 링커, 양이온성 링커, 또는 이들의 유도체를 나타내고;
R10은 CO2H, PO3H2, SO3H, CH2SO3H, CH2CONHCH2SO3H, 또는 CH2CONHCH2CH2SO3H를 나타내고;
R11은 CO2H, SO3H, CH2CONHCH2SO3H, 또는 CH2CONHCH2CH2SO3H를 나타내고;
R12는 수소, 메틸 기, CH2COOH, 또는 CH2를 독립적으로 나타내고, 임의적으로 각각 결합을 공유하는 CH2를 나타낼 수 있다.
본 발명의 추가 바람직한 화합물은 하기 화합물들을 포함한다:
본 발명의 추가 바람직한 화합물은 하기 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 이들의 동위체를 포함한다:
상기 식에서,
R1은 수소 또는 SO3H를 나타내고;
R2는 수소, 또는 CH3, 또는 C3H6SO3 -, 또는 C3H6SO3H 또는 C4H8SO3 -, 또는 C4H8SO3H 또는 C3H6N+(CH3)3을 나타내고;
R3 및 R5는 각각 탄소, 임의적으로 하나 이상의 공유 결합, 또는 산소, 또는 황, 또는 질소를 나타내고;
R4는 임의적으로 하나 이상의 공유 결합을 가진 탄소를 나타내고;
R6은 질소, 산소 또는 황, 또는 원자 부재(방향족 고리와 비닐 고리 사이의 직접적인 C-C 결합)를 나타내고;
R7은 임의적이고, 존재할 때 전자 공여 방향족 치환기를 나타내고;
R8은 임의적이고, 존재할 때 방향족 아미노산, 예컨대, Phe, Trp, His, Tyr 또는 이들의 유도체, 및/또는 양이온성 아미노산, 예컨대, Arg, Lys 또는 이들의 유도체, 및/또는 음이온성 아미노산, 예컨대, Asp, Glu 또는 이들의 유도체, 및/또는 방향족/양이온성/음이온성 산의 비천연 아미노산 또는 유도체를 가진 링커를 나타내고;
R9는 임의적이고, 존재할 때 선형 탄소 쇄, 또는 폴리에틸렌 글리콜 링커, 폴리에틸렌 아민 링커, 양이온성 링커, 또는 이들의 유도체를 나타내고;
R10은 CO2H, PO3H2, SO3H, CH2SO3H, CH2CONHCH2SO3H, 또는 CH2CONHCH2CH2SO3H를 나타내고;
R11은 CO2H, SO3H, CH2CONHCH2SO3H, 또는 CH2CONHCH2CH2SO3H를 나타내고;
R12는 수소, 메틸 기, CH2COOH, 또는 CH2를 독립적으로 나타내고, 임의적으로 각각 결합을 공유하는 CH2를 나타낼 수 있다.
본 발명의 추가 바람직한 화합물은 하기 화합물들을 포함한다:
일부 실시양태에서, 본 발명의 화합물은 약 500 nm 내지 약 900 nm의 흡수 및 방사 최대치를 가진다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 화합물은 약 600 nm 내지 800 nm의 흡수 및 방사 최대치를 가진다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 화합물은 조직 세포에 분포된 후 형광을 발하도록 만들어진다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 화합물은 이 화합물을 근적외선 파장의 여기 광에 노출시킴으로써 형광을 발하도록 만들어진다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 화합물은 DUPA의 결합 친화성과 유사한 PSMA에 대한 결합 친화성을 가진다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 화합물은 종양 세포에의 표적화에 대해 고도로 선택적이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 화합물은 이를 필요로 하는 대상체에게 투여되고, 일부 실시양태에서 투여되는 조성물은 상기 화합물 이외에 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함한다.
본 발명의 일부 실시양태는 PSMA 발현 생물학적 조직을 광학 영상화하는 방법으로서,
(a) 상기 생물학적 조직을, PSMA-표적화된 NIR 염료 화합물을 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계;
(b) 상기 조성물 중의 화합물이 생물학적 표적 내부에 분포하기 위한 시간을 허용하는 단계;
(c) 상기 조직을 상기 화합물에 의해 흡수될 수 있는 파장의 여기 광으로 조명하는 단계; 및
(d) 상기 화합물에 의해 방사된 광학 신호를 검출하는 단계
를 포함하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 이 방법은 높은 PSMA 발현과 연관된 질환의 검출에 사용된다. 일부 실시양태에서, 단계 (d)에서 방사된 신호로부터 영상을 구축하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 단계 (a)가 구별될 수 있는 신호 성질을 가진 2종 이상의 형광 화합물들을 조직과 접촉시키는 것을 포함하고, 임의적으로 상기 조직이 대상체 내에 있는 것인 상기 언급된 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 조명 및/또는 검출 방법 단계를 위한 내시경, 카테터, 단층촬영 시스템, 핸드-헬드 광학 영상화 시스템, 수술용 고글 또는 수술 중 현미경의 용도를 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 암을 치료하는 데 사용된다. 일부 실시양태에서, 암은 전립선암, 방광암, 췌장암, 간암, 폐암, 신장암, 육종, 유방암, 뇌암, 신경내분비 암종, 결장암, 고환암 또는 흑색종으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 PSMA-표적화된 NIR 염료 화합물은 PSMA 발현 세포의 영상화를 위해 사용된다. 일부 실시양태에서, 이 세포는 전립선 세포, 전립선암 세포, 방광암 세포, 췌장암 세포, 간암 세포, 폐암 세포, 신장암 세포, 육종 세포, 유방암 세포, 뇌암 세포, 신경내분비 암종 세포, 결장암 세포, 고환암 세포 또는 흑색종 세포로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 발명은 a) PSMA-표적화된 NIR 염료 화합물과 표적 세포 유형의 적어도 하나의 세포의 결합을 허용하는 시간 동안 및 조건 하에서 생물학적 샘플을 이 화합물과 접촉시키는 단계; 및 b) 임의적으로 상기 생물학적 샘플에서 상기 화합물의 존재 또는 부재를 검출하는 단계를 포함하는, 생물학적 샘플에서 세포 유형을 표적화하는 방법으로서, 검출 단계 c)에서의 화합물의 존재는 상기 표적 세포 유형이 상기 생물학적 샘플에 존재한다는 것을 표시하는 것인 방법도 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 PSMA 발현 세포를 광학적으로 검출하는 방법으로서, 본 발명의 PSMA 표적화 NIR 염료 화합물을 투여하고 상기 화합물을 여기 광원에 노출시키는 단계, 및 상기 화합물로부터 형광을 검출하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 여기 광원은 근적외선 파장 광이다. 일부 실시양태에서, 여기 광 파장은 약 600 내지 1000 나노미터의 범위 내에 있다. 일부 실시양태에서, 여기 광 파장은 약 670 내지 850 나노미터의 범위 내에 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 대상체에 대해 영상-안내된 수술을 수행하는 방법으로서,
a) PSMA 표적화 NIR 염료 화합물이 소정의 수술 부위에서 축적하는 데 충분한 조건 하에서 및 시간 동안 이 화합물을 포함하는 조성물을 투여하는 단계;
b) 적외선 광을 사용하여 상기 화합물을 조명함으로써 상기 화합물을 가시화하는 단계; 및
c) 적외선 광에 의한 여기 시 형광을 발하는 영역의 수술적 절제를 수행하는 단계
를 포함하는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법의 일부 실시양태에서, 적외선 광 파장은 약 600 내지 1000 나노미터의 범위 내에 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 방법은 약 670 내지 850 나노미터의 범위 내에 있는 적외선 광 파장을 이용한다.
본 발명의 일부 실시양태는 대상체에서 질환을 진단하는 방법으로서,
a) PSMA-표적화된 NIR 염료 화합물과 적어도 하나의 PSMA 발현 세포 또는 조직의 결합을 허용하는 시간 동안 및 조건 하에서 소정량의 상기 화합물을, 진단을 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계(PSMA는 대다수의 고형 종양들의 신생맥관구조에서도 발현됨);
b) 생물학적 샘플에 존재하는 상기 화합물로부터의 신호를 측정하는 단계;
c) b)에서 측정된 신호를 적어도 하나의 대조군 데이터 세트와 비교하는 단계로서, 적어도 하나의 대조군 데이터 세트가 표적 세포 유형을 포함하지 않는 생물학적 샘플과 접촉된 제1항의 화합물로부터의 신호를 포함하는 것인 단계; 및
d) 질환의 진단을 제공하는 단계로서, 단계 c)에서의 비교가 질환의 존재를 표시하는 것인 단계
를 포함하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일부 실시양태는 PSMA 표적화 NIR 염료 화합물을 포함하는 키트를 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 키트는 PSMA 발현 세포 또는 조직의 영상화를 위해 사용된다. 일부 실시양태에서, PSMA 발현 세포는 종양 세포이다. 일부 실시양태에서, PSMA 발현 세포는 비-전립선암 세포이다. 일부 실시양태에서, PSMA 발현 세포는 전립선 종양 세포이다. 일부 실시양태에서, PSMA 발현 세포는 암 세포이다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 전이성 질환의 검출을 위해 사용된다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 화합물은 개선된 수술 절제 및/또는 개선된 예후를 위해 사용된다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 방법은 비-NIR 접합된 형광 염료보다 더 선명한 수술 절제면을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 PSMA-표적화된 NIR 염료 화합물은 개선된 종양-대-배경 비를 가진다.
다른 실시양태에서, 본 발명의 화합물은 방광암 세포, 췌장암 세포, 간암 세포, 폐암 세포, 신장암 세포, 육종 세포, 유방암 세포, 뇌암 세포, 신경내분비 암종 세포, 결장암 세포, 고환암 세포 또는 흑색종 세포로 구성된 군으로부터 선택된 비-전립선암 세포를 영상화하거나, 진단하거나 검출하는 데 사용된다. 다른 실시양태에서, 검출되는 세포는 5 mm 초과의 깊이로 피부 아래에 있다. 일부 실시양태에서, 검출되는 조직은 5 mm 초과의 깊이로 피부 아래에 있다. 다른 실시양태에서, 검출되는 종양은 5 mm 초과의 깊이로 피부 아래에 있다. 일부 실시양태에서, 검출되는 세포는 6 mm, 7 mm, 8 mm, 9 mm 또는 10 mm 초과의 깊이로 대상체의 피부 아래에 있다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 염료 프로브는 가시광선 스펙트럼의 외부에서 검출될 수 있다. 일부 실시양태에서, 가시광선 스펙트럼보다 더 큰 염료 프로브가 사용된다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 화합물은 650 nm 내지 900 nm의 파장에 민감한 염료 프로브를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 PSMA-표적화된 NIR 염료 화합물은 약 650 nm 내지 1000 nm, 예를 들면, 한 실시양태에서 대략 800 nm의 근적외선 영역에서 최대 광 흡수 파장을 가진다.
제공된 방법의 또 다른 실시양태에서, 비-전립선암은 방광암, 췌장암, 간암, 폐암, 신장암, 육종, 유방암, 뇌암, 신경내분비 암종, 결장암, 고환암 또는 흑색종이다.
제공된 방법의 추가 실시양태에서, PSMA 발현 암 세포는 종양의 세포이다. 제공된 방법의 추가 실시양태에서, PSMA 발현 암은 종양이다. 일부 실시양태에서, 종양의 부피는 적어도 1000 mm3이다. 일부 실시양태에서, 종양의 부피는 1000 mm3 미만이다. 일부 실시양태에서, 종양의 부피는 950 mm3 미만이다. 일부 실시양태에서, 종양의 부피는 900 mm3 미만이다. 일부 실시양태에서, 종양의 부피는 850 mm3 미만이다. 일부 실시양태에서, 종양의 부피는 800 mm3 미만이다. 일부 실시양태에서, 종양의 부피는 750 mm3 미만이다. 일부 실시양태에서, 종양의 부피는 700 mm3 미만이다. 일부 실시양태에서, 종양의 부피는 650 mm3 미만이다. 일부 실시양태에서, 종양의 부피는 600 mm3 미만이다. 일부 실시양태에서, 종양의 부피는 550 mm3 미만이다. 일부 실시양태에서, 종양의 부피는 500 mm3 미만이다. 일부 실시양태에서, 종양의 부피는 450 mm3 미만이다. 일부 실시양태에서, 종양의 부피는 400 mm3 미만이다. 일부 실시양태에서, 종양의 부피는 350 mm3 미만이다. 일부 실시양태에서, 종양의 부피는 300 mm3 미만이다. 일부 실시양태에서, 종양의 부피는 250 mm3 미만이다. 일부 실시양태에서, 종양의 부피는 200 mm3 미만이다. 일부 실시양태에서, 종양의 부피는 150 mm3 미만이다. 일부 실시양태에서, 종양의 부피는 100 mm3 미만이다. 한 실시양태에서, 종양의 부피는 적어도 75 mm3이다. 또 다른 실시양태에서, 종양의 부피는 75 mm3 미만이다. 또 다른 실시양태에서, 종양의 부피는 70 mm3 미만이다. 또 다른 실시양태에서, 종양의 부피는 65 mm3 미만이다. 또 다른 실시양태에서, 종양의 부피는 60 mm3 미만이다. 또 다른 실시양태에서, 종양의 부피는 55 mm3 미만이다. 한 실시양태에서, 종양의 부피는 적어도 50 mm3이다. 다른 실시양태에서, 종양은 50 mm3 미만이다. 또 다른 실시양태에서, 종양의 부피는 45 mm3 미만이다. 다른 실시양태에서, 종양의 부피는 40 mm3 미만이다. 또 다른 실시양태에서, 종양의 부피는 35 mm3 미만이다. 또 다른 실시양태에서, 종양의 부피는 30 mm3 미만이다. 또 다른 실시양태에서, 종양의 부피는 25 mm3 미만이다. 또 다른 실시양태에서, 종양의 부피는 20 mm3 미만이다. 또 다른 실시양태에서, 종양의 부피는 15 mm3 미만이다. 또 다른 실시양태에서, 종양의 부피는 10 mm3 미만이다. 또 다른 실시양태에서, 종양의 부피는 12 mm3 미만이다. 또 다른 실시양태에서, 종양의 부피는 9 mm3 미만이다. 또 다른 실시양태에서, 종양의 부피는 8 mm3 미만이다. 또 다른 실시양태에서, 종양의 부피는 7 mm3 미만이다. 또 다른 실시양태에서, 종양의 부피는 6 mm3 미만이다. 또 다른 실시양태에서, 종양의 부피는 5 mm3 미만이다.
한 실시양태에서, 종양은 본 발명의 PSMA-표적화된 NIR 염료 화합물을 사용한 수술적 퇴축 전에 적어도 5 mm의 길이를 가진다. 한 실시양태에서, 이 방법은 5 mm 미만의 종양을 검출한다. 다른 실시양태에서, 본원의 방법은 4 mm 미만의 종양을 검출한다. 일부 실시양태에서, 본원의 방법은 3 mm 미만의 종양을 검출한다. 또 다른 실시양태에서, 종양은 적어도 6 mm의 길이를 가진다. 또 다른 실시양태에서, 종양은 적어도 7 mm의 길이를 가진다. 또 다른 실시양태에서, 종양은 적어도 8 mm의 길이를 가진다. 또 다른 실시양태에서, 종양은 적어도 9 mm의 길이를 가진다. 또 다른 실시양태에서, 종양은 적어도 10 mm의 길이를 가진다. 또 다른 실시양태에서, 종양은 적어도 11 mm의 길이를 가진다. 추가 실시양태에서, 종양은 적어도 12 mm의 길이를 가진다. 추가 실시양태에서, 종양은 적어도 13 mm의 길이를 가진다. 추가 실시양태에서, 종양은 적어도 14 mm의 길이를 가진다. 또 다른 실시양태에서, 종양은 적어도 15 mm의 길이를 가진다. 또 다른 실시양태에서, 종양은 적어도 16 mm의 길이를 가진다. 또 다른 실시양태에서, 종양은 적어도 17 mm의 길이를 가진다. 추가 실시양태에서, 종양은 적어도 18 mm의 길이를 가진다. 추가 실시양태에서, 종양은 적어도 19 mm의 길이를 가진다. 추가 실시양태에서, 종양은 적어도 20 mm의 길이를 가진다. 또 다른 실시양태에서, 종양은 적어도 21 mm의 길이를 가진다. 또 다른 실시양태에서, 종양은 적어도 22 mm의 길이를 가진다. 또 다른 실시양태에서, 종양은 적어도 23 mm의 길이를 가진다. 추가 실시양태에서, 종양은 적어도 24 mm의 길이를 가진다. 추가 실시양태에서, 종양은 적어도 25 mm의 길이를 가진다. 추가 실시양태에서, 종양은 적어도 30 mm의 길이를 가진다.
일부 실시양태에서, 본 개시는 근적외선(NIR) 염료에 접합된 전립선 특이적 막 항원(PSMA)-표적화된 화합물 및 이를 치료 및 진단에 사용하는 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 개시는 전립선 특이적 막 항원(PSMA)을 발현하는 세포와 연관된 질환, 예컨대, 전립선암 및 관련 질환을 진단하고 치료하는 화합물 및 방법을 제공한다. 본 개시는 상기 화합물을 제조하고 사용하는 방법 및 조성물, 상기 화합물을 도입하는 방법, 및 상기 화합물을 포함하는 키트도 기술한다. PSMA-표적화된 화합물, 예컨대, DUPA, 또는 링커(L)를 통한 PSMA 표적화 리간드와 NIR 염료의 접합은 전립선암, 및 PSMA를 발현하거나 과다발현하는 병원성 세포 집단을 수반하는 관련 질환의 영상화, 진단 및/또는 치료에 유용할 수 있다는 것을 발견하였다. PSMA는 세포 표면 수용체, 예컨대, 비타민 수용체에 의해 관찰된 엔도사이토시스와 유사한 과정에서 내재화되는 세포 표면 단백질이다. PSMA는 대다수의 고형 종양들의 신생맥관구조에서도 발현된다. 따라서, 그의 길이를 따라 소정의 길이, 및/또는 소정의 직경, 및/또는 미리 선택된 작용기를 가진 링커를 포함하는 일부 접합체들이 이러한 질환을 치료하고/하거나, 영상화하고/하거나 진단하는 데 사용될 수 있다는 것을 발견하였다.
한 예시적 실시양태에서, 링커 L은 방출가능한 또는 방출불가능한 링커일 수 있다. 한 양태에서, 링커 L은 길이가 적어도 약 7개 원자이다. 한 변경에서, 링커 L은 길이가 적어도 약 10개 원자이다. 한 변경에서, 링커 L은 길이가 적어도 약 14개 원자이다. 또 다른 변경에서, 링커 L은 길이가 약 7개 내지 약 22개, 약 7개 내지 약 24개, 또는 약 7개 내지 약 20개 원자이다. 또 다른 변경에서, 링커 L은 길이가 약 14개 내지 약 31개, 약 14개 내지 약 24개, 또는 약 14개 내지 약 20개 원자이다.
대안적 양태에서, 링커 L은 길이가 적어도 약 10 옹스트롬(Å)이다.
한 변경에서, 링커 L은 길이가 적어도 약 15 Å이다. 또 다른 변경에서, 링커 L은 길이가 적어도 약 20 Å이다. 또 다른 변경에서, 링커 L은 길이가 약 10 Å 내지 약 30 Å의 범위 내에 있다.
대안적 양태에서, 링커 L의 길이의 적어도 부분은 결합 리간드 B에 연결된 말단에서 직경이 약 5 Å 이하이다. 한 변경에서, 링커 L의 길이의 적어도 부분은 결합 리간드 B에 연결된 말단에서 직경이 약 4 Å 이하 또는 약 3 Å 이하이다. 약 5 Å 이하, 약 4 Å 이하 또는 약 3 Å 이하의 직경 요건을 포함하는 예시적 실시양태는 소정의 길이의 링커에 대한 그 요건을 포함함으로써, 링커의 원통형 유사 부분을 규정할 수 있다는 것이 인식된다. 예시적으로, 또 다른 변경에서, 링커는 길이가 적어도 약 7 Å이고 직경이 약 5 Å 이하, 약 4 Å 이하 또는 약 3 Å 이하인 결합 리간드에 연결된 말단에서 원통형 부분을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 링커 L은 친수성 측쇄를 가진 아미노산, 예컨대, Ser, Thr, Cys, Arg, Orn, Lys, Asp, Glu, Gln 등 잔기를 포함하는, PSMA의 하나 이상의 잔기와 상호작용할 수 있는 하나 이상의 친수성 링커를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 링커 L은 소수성 측쇄를 가진 아미노산, 예컨대, Val, Leu, Phe, Tyr, Met 등 잔기를 포함하는, PSMA의 하나 이상의 잔기와 상호작용할 수 있는 하나 이상의 소수성 링커를 포함한다. 상기 실시양태 및 양태는 단독으로 또는 서로 조합되어 링커 L에 포함될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 예를 들면, 길이가 적어도 약 7개 원자이고 직경이 약 5 Å, 약 4 Å 이하 또는 약 3 Å 이하이고 Val, Leu, Phe, Tyr, Met 등 잔기를 포함하는, PSMA의 하나 이상의 잔기와 상호작용할 수 있는 하나 이상의 친수성 링커도 포함하는 링커 L이 본원에서 고려되고 기재된다.
또 다른 실시양태에서, 링커의 한 말단은 분지되어 있지 않고 탄소, 산소, 질소 및 황 원자의 쇄를 포함한다. 한 실시양태에서, 탄소, 산소, 질소 및 황 원자의 선형 쇄는 길이가 적어도 5개 원자이다. 한 변경에서, 선형 쇄는 길이가 적어도 7개 원자 또는 적어도 10개 원자이다. 또 다른 실시양태에서, 탄소, 산소, 질소 및 황 원자의 쇄는 치환되지 않는다. 한 변경에서, 탄소, 산소, 질소 및 황 원자의 쇄의 부분은 2가 단편에 의해 환형화된다. 예를 들면, 디펩티드 Phe-Phe를 포함하는 링커(L)는 2개의 질소를 에틸렌 단편으로 환형화함으로써 피페라진-1,4-디일 구조, 또는 이의 치환된 변이체를 포함할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 질환 및 질환 상태를 치료하고/하거나, 질환 또는 질환 상태를 진단하고/하거나, PSMA를 발현하거나 과다발현하는 세포의 병원성 집단과 연관된 조직 및/또는 세포를 영상화하기에 효과적인 양으로 본원에 기재된 접합체를 포함하는 약학 조성물이 본원에 기재된다. 예시적으로, 상기 약학 조성물은 하나 이상의 담체, 희석제 및/또는 부형제도 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 질환 및 질환 상태를 치료하고/하거나, 질환 또는 질환 상태를 진단하고/하거나, PSMA를 발현하거나 과다발현하는 세포의 병원성 집단과 연관된 조직 및/또는 세포를 영상화하는 방법이 본원에 기재된다. 이러한 방법은 질환 및 질환 상태를 치료하고/하거나, 질환 또는 질환 상태를 진단하고/하거나, PSMA를 발현하거나 과다발현하는 세포의 병원성 집단과 연관된 조직 및/또는 세포를 영상화하기에 효과적인 양으로 본원에 기재된 접합체, 및/또는 본원에 기재된 접합체를 함유하는 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 이러한 PSMA-표적화된 NIR 염료 접합체는 조직 내의 PSMA 발현 종양 세포에 결합한다는 것이 본원에서 확인된다. 더욱이, 형광 강도는 폴레이트 수용체 양성 종양의 경우 폴레이트로 표적화되는 다른 근적외선 염료에 의해 이미 관찰된 강도보다 더 크다. 이 증가된 강도는 모니터링되는 조직으로부터의 생물학적 샘플의 보다 작은 영역(예를 들면, 보다 작은 종양)의 표적화 및 선명한 확인을 가능하게 한다. 추가로, 본 발명의 화합물의 증가된 강도는 보다 낮은 용량/양의 염료가 투여될 수 있고 여전히 유의미한 결과를 생성한다는 추가된 장점을 제공한다. 따라서, 본 발명의 화합물은 더 경제적인 영상화 기법으로 이어진다. 더욱이, 통상적인 영상화 화합물에 비해 더 낮은 용량의 본 발명의 화합물이 신체에의 외래 물질의 투여에 수반되는 독성 및 다른 부작용을 최소화한다는 추가된 장점이 있다.
나아가, 작은 종양의 확인은 음성 주변부를 생성하기 위한 원발성 종양의 보다 정확하고 보다 효과적인 절제로 이어질 뿐만 아니라, 전이성 암 세포를 보유하는 림프절의 정확한 확인 및 제거, 및 위성 질환의 확인으로도 이어질 것이다. 이들 장점들 각각은 치료되는 환자에 대한 보다 우수한 임상 결과와 양의 상관관계를 가진다.
특정 실시양태에서, 티로신 및 티로신 유도체 이외에 근적외선 염료와 시스테인 또는 시스테인 유도체의 PSMA-표적화된 접합체도 유용할 수 있다고 생각된다. 나아가, PSMA-표적화된 모이어티와 염료의 직접적인 결합 또는 아민 링커를 통한 염료와 DUPA 또는 PSMA-표적화된 리간드의 결합도 접합체로부터의 형광의 강도 손실을 생성하는 반면, 사이의 연결 모이어티로서 티로신 또는 티로신 유도체의 존재는 본 발명의 티로신 기반 화합물이 SO456을 접합시키기 위해 여분의 아민 링커를 요구하지 않는다는 사실의 결과로서, 및 추가로 티로신의 페놀 모이어티를 통한 접합이 향상된 형광으로 이어지기 때문에 접합된 화합물의 형광을 향상시킨다고 생각된다.
상기 화합물은 형광-매개된 분자 단층촬영 영상화 시스템, 예컨대, 깊은 조직에서 근적외선 형광 활성화를 검출하도록 디자인된 형광-매개된 분자 단층촬영 영상화 시스템과 함께 사용될 수 있다. 상기 화합물은 분자 및 조직 특이성을 제공하고 높은 형광 대비 및 보다 밝은 형광 신호를 생성하고, 배경 자가형광을 감소시킴으로써, 생체내의 병든 조직(예를 들면, 암)의 개선된 초기 검출 및 분자 표적 평가를 가능하게 한다. 상기 화합물은 깊은 조직 3차원적 영상화, 표적화된 수술, 및 생물학적 샘플에서 표적 세포 유형의 양을 정량하는 방법을 위해 사용될 수 있다.
특정 실시양태에서, 링커는 10개 미만의 원자이다. 다른 실시양태에서, 링커는 20개 미만의 원자이다. 일부 실시양태에서, 링커는 30개 미만의 원자이다. 일부 실시양태에서, 링커는 PSMA 표적화 화합물과 NIR 염료를 분리하는 원자의 수에 의해 정의된다. 또 다른 실시양태에서, 링커는 적어도 7개 원자의 쇄 길이를 가진다. 일부 실시양태에서, 링커는 적어도 14개 원자의 쇄 길이를 가진다. 또 다른 실시양태에서, 링커는 7개 원자 내지 20개 원자의 쇄 길이를 가진다. 또 다른 실시양태에서, 링커는 14개 원자 내지 24개 원자의 쇄 길이를 가진다.
본 발명에서 사용하기에 적합한 PSMA 표적화 화합물은 예를 들면, 배타적이기 위한 것인 아닌 하기 기준들을 기초로 선택될 수 있다: PSMA를 발현하는 생존 세포에의 결합; PSMA를 발현하는 신생맥관구조에의 결합; PSMA에의 결합의 고친화성; (함께 사용될 때 상보적 활성을 가진 항체들이 동일한 에피토프에의 결합에 대해 경쟁할 가능성을 제거하기 위한) PSMA 상의 유일무이한 에피토프에의 결합; PSMA를 발현하는 세포의 옵소닌화(opsonization); 이펙터 세포의 존재 하에서 PSMA를 발현하는 세포의 성장 억제, 식세포작용 및/또는 사멸의 매개; NAALADase, 폴레이트 하이드롤라제, 디펩티딜 펩티다제 IV 및/또는 γ-글루타밀 하이드롤라제 활성의 조절(억제 또는 향상); 이펙터 세포의 부재 하에서 성장 억제, 세포 주기 정지 및/또는 세포독성; PSMA의 내재화; PSMA 상의 입체구조적 에피토프에의 결합; PSMA를 발현하지 않는 세포 또는 조직과의 최소한의 교차반응성; 및 단량체 형태의 PSMA보다 오히려 이량체 형태의 PSMA에의 우선적 결합.
본원에서 제공된 PSMA 표적화 화합물, PSMA 항체 및 이들의 항원 결합 단편은 전형적으로 상기 기준들 중 하나 이상, 일부 경우 5개 초과의 기준들을 충족시킨다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 PSMA 표적화 화합물은 상기 기준들 중 6개 이상의 기준들을 충족시킨다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 PSMA 표적화 화합물은 상기 기준들 중 7개 이상의 기준들을 충족시킨다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 PSMA 표적화 화합물은 상기 기준들 중 8개 이상의 기준들을 충족시킨다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 PSMA 표적화 화합물은 상기 기준들 중 9개 이상의 기준들을 충족시킨다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 PSMA 표적화 화합물은 상기 기준들 중 10개 이상의 기준들을 충족시킨다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 PSMA 표적화 화합물은 상기 기준들 모두를 충족시킨다.
본원에서 제공된 본 발명의 PSMA-표적화된 화합물(예를 들면, PSMA-표적화된 NIR 염료 접합체)에 의해 영상화될 수 있는 종양의 예로는 PSMA를 발현하는 임의의 종양, 예를 들면, 전립선, 방광, 췌장, 폐, 결장, 신장, 흑색종 및 육종이 있다. PSMA를 발현하는 종양은 PSMA를 발현하는 신생맥관구조를 가진 종양을 포함한다.
일부 실시양태에서, PSMA-표적화된 분자는 PSMA에 결합하고 세포 상에서 발현된 PSMA에 의해 내재화된다. 따라서, PSMA 리간드 접합체는 세포 상에서 발현된 PSMA에 의해 내재화된다. 이 내재화가 일어나는 기작은 본 발명의 실시에 결정적이지는 않다.
일부 실시양태에서, PSMA 표적화 화합물은 PSMA 분자의 세포외 도메인 내의 입체구조적 에피토프에 결합한다. 다른 실시양태에서, PSMA 표적화 화합물은 PSMA 상의 이량체 특이적 에피토프에 결합한다. 일반적으로, 이량체 특이적 에피토프에 결합하는 화합물은 PSMA 단량체보다 오히려 PSMA 이량체에 우선적으로 결합한다. 본 발명의 일부 실시양태에서, PSMA 표적화 화합물은 PSMA 이량체에 우선적으로 결합한다. 본 발명의 일부 실시양태에서, PSMA 표적화 화합물은 단량체성 PSMA 단백질에 대한 낮은 친화성을 가진다.
일부 실시양태에서, PSMA 표적화 화합물은 리간드이다. 일부 실시양태에서, PSMA 표적화 화합물은 2-[3-(1,3-디카복시프로필)우레이도]펜탄디오산(DUPA)이다. 일부 실시양태에서, PSMA 표적화 화합물은 PSMA 발현 생존 세포에 결합하는 DUPA 또는 PSMA의 유도체, 리간드, 억제제, 또는 아고니스트이다.
본 발명의 PSMA 표적화 NIR 염료는 비-NIR 염료 또는 비표적화된 NIR 염료에 접합된 PSMA 표적화 화합물의 종양-대-배경 신호 비보다 더 높은 종양-대-배경 신호 비를 생성한다. 일부 실시양태에서, 개선은 10배이다. 일부 실시양태에서, 상기 종양-대-배경 신호 비는 적어도 4배 개선이다. 일부 실시양태에서, 종양-대-배경 비는 적어도 1.5배까지 증가된다. 일부 실시양태에서, PSMA-표적화된 NIR 염료 배경 신호는 파장이 600 nm 미만인 광에 반응하는 형광 염료에 접합된 PSMA-표적화된 화합물의 배경 신호의 절반이다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 생존 세포에 대해 PSMA-표적화된 NIR 염료를 사용하는 방법은 파장이 600 nm 미만인 광에 반응하는 형광 염료에 접합된 PSMA-표적화된 화합물의 배경 신호의 절반 미만의 배경 신호를 생성한다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 생존 세포에 대해 PSMA-표적화된 NIR 염료를 사용하는 방법은 파장이 500 nm 미만인 광에 반응하는 형광 염료에 접합된 PSMA-표적화된 화합물의 배경 신호의 절반 미만의 배경 신호를 생성한다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 생존 세포에 대해 PSMA-표적화된 NIR 염료를 사용하는 방법은 파장이 600 nm 미만인 광에 반응하는 형광 염료에 접합된 PSMA-표적화된 화합물의 배경 신호의 3분의 1 미만의 배경 신호를 생성한다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 생존 세포에 대해 PSMA-표적화된 NIR 염료를 사용하는 방법은 파장이 500 nm 미만인 광에 반응하는 형광 염료에 접합된 PSMA-표적화된 화합물의 배경 신호의 3분의 1 미만의 배경 신호를 생성한다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 생존 세포에 대해 PSMA-표적화된 NIR 염료를 사용하는 방법은 파장이 600 nm 미만인 광에 반응하는 형광 염료에 접합된 PSMA-표적화된 화합물의 배경 신호의 4분의 1 미만의 배경 신호를 생성한다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 생존 세포에 대해 PSMA-표적화된 NIR 염료를 사용하는 방법은 파장이 500 nm 미만인 광에 반응하는 형광 염료에 접합된 PSMA-표적화된 화합물의 배경 신호의 4분의 1 미만의 배경 신호를 생성한다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 생존 세포에 대해 PSMA-표적화된 NIR 염료를 사용하는 방법은 파장이 600 nm 미만인 광에 반응하는 형광 염료에 접합된 PSMA-표적화된 화합물의 배경 신호의 5분의 1 미만의 배경 신호를 생성한다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 생존 세포에 대해 PSMA-표적화된 NIR 염료를 사용하는 방법은 파장이 500 nm 미만인 광에 반응하는 형광 염료에 접합된 PSMA-표적화된 화합물의 배경 신호의 5분의 1 미만의 배경 신호를 생성한다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 생존 세포에 대해 PSMA-표적화된 NIR 염료를 사용하는 방법은 파장이 600 nm 미만인 광에 반응하는 형광 염료에 접합된 PSMA-표적화된 화합물의 배경 신호의 8분의 1 미만의 배경 신호를 생성한다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 생존 세포에 대해 PSMA-표적화된 NIR 염료를 사용하는 방법은 파장이 500 nm 미만인 광에 반응하는 형광 염료에 접합된 PSMA-표적화된 화합물의 배경 신호의 8분의 1 미만의 배경 신호를 생성한다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 생존 세포에 대해 PSMA-표적화된 NIR 염료를 사용하는 방법은 파장이 600 nm 미만인 광에 반응하는 형광 염료에 접합된 PSMA-표적화된 화합물의 배경 신호의 10분의 1 미만의 배경 신호를 생성한다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 생존 세포에 대해 PSMA-표적화된 NIR 염료를 사용하는 방법은 파장이 500 nm 미만인 광에 반응하는 형광 염료에 접합된 PSMA-표적화된 화합물의 배경 신호의 10분의 1 미만의 배경 신호를 생성한다.
일부 실시양태에서, PSMA 표적화 화합물은 PSMA에 특이적으로 결합하는 소분자 리간드이다. 이러한 소분자 리간드는 그의 천연 입체구조에서 PSMA의 효소 부위에 결합할 수 있다. 또한, 이러한 소분자 리간드는 PSMA 항체 리간드에 대한 특성들 중 어느 하나 이상의 특성을 가질 수 있다.
본 개시는 PSMA 발현 세포, 조직 또는 종양의 표적화된 영상화를 위해 사용되는 PSMA 표적화 화합물에 접합되는 아미노산 결합 기를 합성하는 방법도 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시는 PSMA 표적화 화합물, 결합 기 및 NIR 염료를 포함하는 화합물 또는 이의 염 유도체에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 결합 기는 아미노산, 이의 이성질체, 유도체 또는 라세미체 혼합물일 수 있다. 일부 양태에서, 염료는 LS288, IR800, SP054, S0121, KODAK, S2076, S0456, 및/또는 하기 염료들로 구성된 군으로부터 선택된 염료로 구성된 군으로부터 선택된다:
일부 실시양태에서, 본 개시는 아미노산 결합 기를 NIR 염료에 접합시키는 방법으로서, 아미노산이 티로신, 세린, 쓰레오닌, 라이신, 아르기닌, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 셀레노시스테인, 이들의 이성질체 및 유도체일 수 있는 것인 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 아미노산, 이의 이성질체 또는 유도체는 다소 몰 과량으로 형광 염료를 첨가할 때 형광 기와 아미노산, 이의 이성질체 또는 유도체의 접합을 생성하는 -OH, -NH2 또는 -SH 작용기를 함유한다. 다른 실시양태에서, 아미노산, 이의 이성질체 또는 유도체는 합성 시 화합물의 휘도 및 검출을 증가시키는 염료와 에테르 결합을 생성하는 -OH 작용기를 함유한다. 일부 실시양태에서, 본 개시는 아미노산 결합 기와 NIR 염료의 접합에 관한 것으로서, 이때 아미노산, 이의 이성질체 또는 유도체는 합성 시 상기 염료와 C-S, C-Se, C-Po 또는 C-Te 결합을 생성하는 -SH, -SeH, -PoH 또는 -TeH 작용기를 함유한다. 일부 양태에서, 본 개시는 아미노산 결합 기와, 약 500 nm 내지 약 900 nm의 흡수 및 방사 최대치를 가진 염료의 접합에 관한 것이다. 다른 양태에서, 아미노산 결합 기는 약 600 nm 내지 약 800 nm의 흡수 및 방사 최대치를 가진 형광 염료에 접합된다.
추가 실시양태에서, 본 개시는 아미노산 결합 기를 PSMA 리간드에 접합시키는 방법으로서, 아미노산 결합 기가 티로신, 세린, 쓰레오닌, 라이신, 아르기닌, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 셀레노시스테인, 이들의 이성질체 또는 유도체이고 디펩티드 결합을 통해 폴레이트에 접합되는 것인 방법을 제공한다. 추가 양태에서, 본 개시는 결합 기를 폴레이트 리간드에 접합시키는 방법으로서, 상기 결합 기가 티로신, 세린, 쓰레오닌, 라이신, 아르기닌, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 셀레노시스테인, 이의 이성질체 또는 유도체인 방법을 제공한다. 다른 실시양태에서, 본 개시는 프테로일 리간드를 아미노산 결합 기에 접합시키는 방법에 관한 것으로서, 이때 상기 결합 기는 티로신, 세린, 쓰레오닌, 라이신, 아르기닌, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 셀레노시스테인, 이의 이성질체 또는 유도체이다. 일부 양태에서, 상기 결합 기의 카복실산은 임의의 아미노산의 알파 탄소에 결합됨으로써, 표적화된 수용체에 대한 화합물의 특이성을 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 링커의 전하는 화합물에 대한 특이성에 기여하고, 이때 표적화된 수용체에 대한 상기 화합물의 관찰된 결합 친화성은 적어도 15 nM이다.
다른 실시양태에서, 본 개시는 영상-안내된 수술, 종양 영상화, 전립선 영상화, PSMA 발현 조직 영상화, PSMA 발현 종양 영상화, 감염 질환 또는 법의학 적용을 위한 DUPA-EAOA-Tyr-S0456으로서 명명된 화합물의 용도에 관한 것으로서, 이때 EAOA는 에이트 아미노옥톤산이다. 다른 양태에서, 상기 화합물은 DUPA-EAOA-(D)Tyr-S0456, DUPA-EAOA-호모Tyr-S0456, DUPA-EAOA-베타-호모-Tyr-S0456, DUPA-EAOA-(NMe)-Tyr-S0456, DUPA-EAOA-Tyr(OMe)-S0456, DUPA-EAOA-Tyr(OBn)-S0456, DUPA-EAOA-NHNH-Tyr-OAc-S0456, 이들의 염 및 유도체로 구성된 군으로부터 선택된 DUPA-EAOA-Tyr-S0456 유도체이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 PSMA-표적화된 화합물은 PSMA의 소분자 리간드이다.
PSMA-표적화된 NIR 염료 접합체 및 이의 합성
하기 반응식은 본 발명의 PSMA-표적화된 NIR 염료 접합체의 합성을 보여준다.
[반응식 1]
[반응식 2]
[반응식 3]
[반응식 4]
[반응식 5]
하기 실시예는 단지 본 개시의 특정 실시양태를 예시하기 위해 제공되고 첨부된 청구범위를 한정하기 위한 것이 아니다. 본원에서 논의된 바와 같이, 개시된 화합물 및 방법의 특정 특징은 이들이 제공하는 작동가능성 또는 장점에 필요하지 않는 다양한 방식들로 변형될 수 있다. 예를 들면, 상기 화합물은 이 화합물이 사용될 구체적인 용도에 따라 다양한 아미노산들 및 아미노산 유도체들뿐만 아니라, 표적화 리간드도 포함할 수 있다. 당분야에서 숙련된 자는 이러한 변형이 첨부된 청구범위 내에 포함된다는 것을 인식할 것이다.
실시예
실시예 (1): 리간드와 NIR 염료 사이의 링커/스페이서의 길이가 무작위적으로 변경된 PSMA-표적화된 NIR 염료 접합체의 임상 전 평가
[반응식 1]
[반응식 2]
(a) 시험관내 연구
도 2는 PSMA-표적화된 DUPA-FITC(플루오레세인 이소티오시아네이트) 접합체(14)의 구조, 및 배양물 중의 PSMA 양성 22Rv1 인간 전립선암 세포 및 PSMA 음성 A549 인간 폐포 기저 상피 세포에 대한 그의 결합 친화성(KD) 및 특이성을 보여준다. RPMI 배지에 용해된 DUPA-FITC를 RPMI 배양 배지 중의 22Rv1 또는 A549 세포에 표시된 농도로 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. 그 다음, 배지를 제거하고 새로운 배지로 (3회) 세척하고 PBS(포스페이트 완충 식염수)로 대체하였다. 유세포분석을 이용하여 샘플을 분석하였다. 오차 막대는 SD(n = 3)를 나타낸다. **는 A549 세포에 결합하지 않는다는 것을 표시한다.
도 3: DUPA-FITC(14)에 대한 DUPA-NIR 접합체 1 내지 9의 상대적 결합 친화성. PSMA 양성 22Rv1 인간 전립선암 세포를 100 nM DUPA-FITC의 존재 하에서 증가하는 농도의 DUPA-NIR 접합체와 함께 37℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. 그 다음, 배지를 제거하고 새로운 배지로 (3회) 세척하고 PBS로 대체하였다. 유세포분석을 이용하여 세포에 결합된 형광을 분석하였다.
DUPA-NIR 접합체의 결합 친화성을 모니터링하였고, 데이터는 표 1에 표시되어 있다.
[표 1]
생체내 연구. 생체내 분석을 위해, DUPA-NIR 접합체의 조직 분포를 모니터링하였고, 이 분포는 도 4에 표시되어 있다. 보다 구체적으로, 인간 전립선 종양 이종이식편(22Rv1 세포)을 보유하는 마우스의 형광 영상화를 이용하여 DUPA-NIR 접합체 1 내지 9의 생체분포를 모니터링하였다. 꼬리 정맥을 통해 DUPA-NIR 염료 접합체를, 22Rv1 종양 이종이식편을 가진 수컷 누드 마우스에게 주사하였다. DUPA-NIR 염료 접합체를 투여한 지 2시간 후 상기 마우스를 안락사시켰고, 선택된 조직을 채취하였고, 조직을 IVIS 영상화기(ex = 745 nm, em = ICG, 노출 시간 = 1s)로 영상화하였다. 결과는 도 4에 표시되어 있다.
또한, 종양-대-조직 형광의 비를 보여주기 위해 상기 접합체를 시험하였다. 도 5는 PSMA-표적화된 DUPA-NIR 접합체 1 내지 9의 조직 생체분포 데이터로부터의 종양-대-조직 형광 비를 보여준다. 영상화 후, 생체내 영상화 소프트웨어를 이용하여 각각의 조직에 대해 관심 있는 영역(ROI) 내부의 형광을 측정한 후, 종양-대-조직 형광을 계산하였다.
결론: 시험관내 결합 친화성 데이터는 화합물 3(7 원자 스페이서), 4(12 원자 스페이서) 및 5(15 원자 스페이서)가 PSMA에 대한 매우 높은 친화성을 가진 반면, 화합물 1(3 원자 스페이서) 및 2(3 원자 스페이서)는 PSMA에 대한 낮은 친화성을 가진다는 것을 보여주었다. 상기 데이터는 PSMA-표적화된 NIR 염료가 최적의 효과적인 결합 친화성을 갖기 위해 DUPA와 NIR 물질 사이에 7 원자 스페이서의 최소 길이를 요구한다는 것을 보여준다.
화합물 4인 DUPA-EAOA-Tyr-S0456(EAOA - 에이트 아미노옥톤산)은 평가된 모든 화합물들 중에서 가장 우수한 종양-대-배경 비(TBR)를 보였다. 화합물 4도 종양에서 보다 높은 형광 강도를 보였다. 화합물 6 및 7은 이 실시예에서 평가된 화합물들 중에서 두 번째 및 세 번째로 가장 우수한 TBR을 보였다. 그러나, 화합물 6 및 7에 대한 종양에서의 형광 강도는 화합물 3, 4 및 5의 형광 강도에 비해 더 낮았다. PSMA 발현 전립선암 세포 및 종양 조직에 대한 친화성 및 특이성, 종양에서의 형광 강도, 종양-대-배경 비 등을 고려한 후, 다른 화합물들이 임상뿐만 아니라 실험 조건에서도 일부 귀중한 정보를 제공할 수 있을지라도, 화합물 4를 적합한 임상 후보로서 간주할 수 있는 듯하다.
실시예 2: 리간드와 NIR 염료 사이에 방향족 아미노산 링커를 가진 PSMA-표적화된 NIR 접합체의 임상 전 평가
도 6은 리간드와 NIR 염료 사이에 방향족 아미노산 링커를 가진 PSMA-표적화된 DUPA-링커-NIR 영상화제의 구조를 보여준다. 합성 반응식은 반응식 3에 표시되어 있다.
(b) 합성
[반응식 3]
시험관내 연구. 도 7은 DUPA-FITC(14)에 대한 방향족 아미노산 링커를 가진 DUPA-NIR 접합체의 상대적 결합 친화성을 보여준다. PSMA 양성 22Rv1 인간 전립선암 세포를 100 nM DUPA-FITC의 존재 하에서 증가하는 농도의 DUPA-NIR 접합체와 함께 37℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. 그 다음, 배지를 제거하고 새로운 배지로 (3회) 세척하고 PBS로 대체하였다. 유세포분석을 이용하여 세포에 결합된 형광을 분석하였다.
표 2는 PSMA 양성 22Rv1 인간 전립선암 세포에 대한 방향족 링커를 가진 DUPA-NIR 접합체의 결합 친화성의 데이터를 보여준다.
[표 2]
생체내 연구. 도 8은 인간 전립선 종양 이종이식편(22Rv1 세포)을 보유하는 마우스의 형광 영상화를 이용하여 DUPA-NIR 접합체 15 및 23의 조직 생체분포 분석 및 종양-대-조직 비를 보여준다. 꼬리 정맥을 통해 DUPA-NIR 염료 접합체를, 22Rv1 종양 이종이식편을 가진 수컷 누드 마우스에게 주사하였다. DUPA-NIR 염료 접합체를 투여한 지 2시간 후 상기 마우스를 안락사시켰고, 선택된 조직을 채취하였고, 조직을 IVIS 영상화기(ex = 745 nm, em = ICG, 노출 시간 = 1s)로 영상화하였다. 영상화 후, 생체내 영상화 소프트웨어를 이용하여 각각의 조직에 대해 관심 있는 영역(ROI) 내부의 형광을 측정한 후, 종양-대-조직 형광을 계산하였다.
도 9는 역치를 조절한 후 전신 또는 반신 형광 영상을 백색 광 영상 위에 겹쳐 놓은 것을 보여준다. 20 nmol의 15를 22Rv1 인간 전립선 종양 이종이식편 보유 마우스에게 주사하고 상이한 시간 간격으로 IVIS 영상화기(ex = 745 nm, em = ICG, 노출 시간 = 1s)로 영상화하였다.
도 10은 역치를 조절한 후 전신 또는 반신 형광 영상을 백색 광 영상 위에 겹쳐 놓은 것을 보여준다. 20 nmol의 23을 22Rv1 인간 전립선 종양 이종이식편 보유 마우스에게 주사하고 상이한 시간 간격으로 IVIS 영상화기(ex = 745 nm, em = ICG, 노출 시간 = 1s)로 영상화하였다.
도 11은 역치를 조절한 후 전신 또는 반신 형광 영상을 백색 광 영상 위에 겹쳐 놓은 것을 보여준다. 20 nmol의 25를 22Rv1 인간 전립선 종양 이종이식편 보유 마우스에게 주사하고 상이한 시간 간격으로 IVIS 영상화기(ex = 745 nm, em = ICG, 노출 시간 = 1s)로 영상화하였다.
도 12는 역치를 조절한 후 전신 또는 반신 형광 영상을 백색 광 영상 위에 겹쳐 놓은 것을 보여준다. 6 nmol의 35를 22Rv1 인간 전립선 종양 이종이식편 보유 마우스에게 주사하고 상이한 시간 간격으로 IVIS 영상화기(ex = 745 nm, em = ICG, 노출 시간 = 1s)로 영상화하였다.
도 13은 역치를 조절한 후 전신 또는 반신 형광 영상을 백색 광 영상 위에 겹쳐 놓은 것을 보여준다. 6 nmol의 36을 22Rv1 인간 전립선 종양 이종이식편 보유 마우스에게 주사하고 상이한 시간 간격으로 IVIS 영상화기(ex = 745 nm, em = ICG, 노출 시간 = 1s)로 영상화하였다.
결론: 이들 시험관내 결합 친화성 데이터는 화합물 15, 23, 25 및 36이 PSMA에 대한 매우 높은 친화성을 가진다는 것을 보여주었다. 뿐만 아니라, 화합물 15, 23, 25, 35 및 36은 동물에게 투여된 지 2시간 내지 4시간 이내에 매우 우수한 전신 영상화 데이터를 보였다. 추가로, 화합물 15 및 35는 뛰어난 종양-대-배경 비(TBR)를 보였다. PSMA 발현 전립선암 세포 및 종양 조직에 대한 친화성 및 특이성, 종양에서의 형광 강도, 종양-대-배경 비, 낮은 비용으로 출발 물질의 용이한 합성 및 입수가능성을 고려한 후, 다른 화합물들도 임상 후보 및/또는 실험 후보 둘 다로서 유용할 수 있을지라도, 화합물 15 및 35를 뛰어난 임상 후보로서 간주할 수 있다.
실시예 (3): 리간드와 NIR 염료 사이에 양전하 링커를 가진 PSMA-표적화된 NIR 접합체의 임상 전 평가
도 14는 리간드와 NIR 염료 사이에 양전하 링커를 가진 PSMA-표적화된 DUPA-링커-NIR 영상화제의 구조를 보여주고, 이 물질에 대한 합성 반응식은 반응식 4에 표시되어 있다:
[반응식 4]
도 15는 DUPA-FITC(14)에 대한 DUPA-NIR 접합체의 상대적 결합 친화성을 보여준다. PSMA 양성 22Rv1 인간 전립선암 세포를 100 nM DUPA-FITC의 존재 하에서 증가하는 농도의 DUPA-NIR 접합체와 함께 37℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. 그 다음, 배지를 제거하고 새로운 배지로 (3회) 세척하고 PBS로 대체하였다. 유세포분석을 이용하여 세포에 결합된 형광을 분석하였다.
생체내 연구: 도 16은 인간 전립선 종양 이종이식편(22 Rv1 세포)를 보유하는 마우스의 형광 영상화를 이용하여 DUPA-NIR 접합체 39 및 41의 종양 대 조직 비를 보여준다. 꼬리 정맥을 통해 DUPA-NIR 염료 접합체를, 22Rv1 종양 이종이식편을 가진 수컷 누드 마우스에게 주사하였다. DUPA-NIR 염료 접합체를 투여한 지 2시간 후 상기 마우스를 안락사시켰고, 선택된 조직을 채취하였고, 조직을 IVIS 영상화기(ex = 745 nm, em = ICG, 노출 시간 = 1s)로 영상화하였다. 영상화 후, 생체내 영상화 소프트웨어를 이용하여 각각의 조직에 대해 관심 있는 영역(ROI) 내부의 형광을 측정한 후, 종양-대-조직 형광을 계산하였다.
도 17은 역치를 조절한 후 전신 또는 반신 형광 영상을 백색 광 영상 위에 겹쳐 놓은 것을 보여준다. 20 nmol의 39를 22Rv1 인간 전립선 종양 이종이식편 보유 마우스에게 주사하고 상이한 시간 간격으로 IVIS 영상화기(ex = 745 nm, em = ICG, 노출 시간 = 1s)로 영상화하였다.
도 18은 역치를 조절한 후 전신 또는 반신 형광 영상을 백색 광 영상 위에 겹쳐 놓은 것을 보여준다. 20 nmol의 40을 22Rv1 인간 전립선 종양 이종이식편 보유 마우스에게 주사하고 상이한 시간 간격으로 IVIS 영상화기(ex = 745 nm, em = ICG, 노출 시간 = 1s)로 영상화하였다.
도 19는 역치를 조절한 후 전신 또는 반신 형광 영상을 백색 광 영상 위에 겹쳐 놓은 것을 보여준다. 20 nmol의 41을 22Rv1 인간 전립선 종양 이종이식편 보유 마우스에게 주사하고 상이한 시간 간격으로 IVIS 영상화기(ex = 745 nm, em = ICG, 노출 시간 = 1s)로 영상화하였다.
결론: 이들 시험관내 결합 친화성 데이터는 화합물 41이 PSMA에 대한 매우 높은 친화성을 가진다는 것을 보여주었다. 화합물 39, 40 및 41은 시간 의존적 영상화 연구에서 매우 우수한 전신 영상화 및 신속한 피부 제거를 보였다. Arg을 리간드-에이트 아미노옥톤산 링커와 NIR 염료 사이의 링커에 추가하여, 양전하의 수를 증가시켰고 전체 분자의 총 음전하를 감소시켰다. Arg 모이어티를 갖는 것이 PSMA에 대한 분자의 친화성을 감소시켰을지라도, 이들 화합물들은 신속한 피부 제거를 보였다. PSMA 발현 전립선암 세포 및 종양 조직에 대한 친화성 및 특이성, 및 신속한 피부 제거를 고려한 후, 다른 화합물들도 임상 후보 및/또는 실험 후보 둘 다로서 유용할 수 있을지라도, 화합물 41을 임상 후보로서 간주할 수 있다.
실시예 (4): 리간드와 NIR 염료 사이에 음전하 링커를 가진 PSMA-표적화된 NIR 접합체의 임상 전 평가
도 20은 리간드와 NIR 염료 사이에 음전하 링커를 가진 PSMA-표적화된 DUPA-링커-NIR 영상화제의 구조를 보여준다. 합성 반응식은 반응식 5에 표시되어 있다.
[반응식 5]
시험관내 연구: 도 21은 DUPA-FITC(14)에 대한 DUPA-NIR 접합체 49 및 50의 상대적 결합 친화성을 보여준다. PSMA 양성 22Rv1 인간 전립선암 세포를 100 nM DUPA-FITC의 존재 하에서 증가하는 농도의 DUPA-NIR 접합체와 함께 37℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. 그 다음, 배지를 제거하고 새로운 배지로 (3회) 세척하고 PBS로 대체하였다. 유세포분석을 이용하여 세포에 결합된 형광을 분석하였다.
생체내 연구: 도 22는 인간 전립선 종양 이종이식편(22 Rv1 세포)을 보유하는 마우스의 형광 영상화를 이용하여 DUPA-NIR 접합체 49 및 50의 종양-대-조직 비를 보여준다. 꼬리 정맥을 통해 DUPA-NIR 염료 접합체를, 22Rv1 종양 이종이식편을 가진 수컷 누드 마우스에게 주사하였다. DUPA-NIR 염료 접합체를 투여한 지 2시간 후 상기 마우스를 안락사시켰고, 선택된 조직을 채취하였고, 조직을 IVIS 영상화기(ex = 745 nm, em = ICG, 노출 시간 = 1s)로 영상화하였다. 영상화 후, 생체내 영상화 소프트웨어를 이용하여 각각의 조직에 대해 관심 있는 영역(ROI) 내부의 형광을 측정한 후, 종양-대-조직 형광을 계산하였다.
결론: 화합물 49는 PSMA에 대한 낮은 결합 친화성을 갖지만, 매우 높은 종양 축적(높은 형광 강도) 및 우수한 종양-대-배경 비를 가진다.
실시예 (5): NIR 염료 분자의 전하가 변경된 PSMA-표적화된 NIR 염료 접합체의 임상 전 평가
도 23은 가변적으로 하전된 NIR 염료 분자를 가진 PSMA-표적화된 DUPA-링커-NIR 영상화제의 구조를 보여준다.
도 24: DUPA-FITC(14)에 대한 DUPA-NIR 접합체의 상대적 결합 친화성. PSMA 양성 22Rv1 인간 전립선암 세포를 100 nM DUPA-FITC의 존재 하에서 증가하는 농도의 DUPA-NIR 접합체와 함께 37℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. 그 다음, 배지를 제거하고 새로운 배지로 (3회) 세척하고 PBS로 대체하였다. 유세포분석을 이용하여 세포에 결합된 형광을 분석하였다.
도 25: 역치를 조절한 후 전신 또는 반신 형광 영상을 백색 광 영상 위에 겹쳐 놓는다. 20 nmol의 54를 22Rv1 인간 전립선 종양 이종이식편 보유 마우스에게 주사하고 상이한 시간 간격으로 IVIS 영상화기(ex = 745 nm, em = ICG, 노출 시간 = 1s)로 영상화하였다.
도 26은 역치를 조절한 후 전신 또는 반신 형광 영상을 백색 광 영상 위에 겹쳐 놓은 것을 보여준다. 20 nmol의 55를 22Rv1 인간 전립선 종양 이종이식편 보유 마우스에게 주사하고 상이한 시간 간격으로 IVIS 영상화기(ex = 745 nm, em = ICG, 노출 시간 = 1s)로 영상화하였다.
도 27은 역치를 조절한 후 전신 또는 반신 형광 영상을 백색 광 영상 위에 겹쳐 놓은 것을 보여준다. 20 nmol의 56을 22Rv1 인간 전립선 종양 이종이식편 보유 마우스에게 주사하고 상이한 시간 간격으로 IVIS 영상화기(ex = 745 nm, em = ICG, 노출 시간 = 1s)로 영상화하였다.
도 28은 역치를 조절한 후 전신 또는 반신 형광 영상을 백색 광 영상 위에 겹쳐 놓은 것을 보여준다. 20 nmol의 57을 22Rv1 인간 전립선 종양 이종이식편 보유 마우스에게 주사하고 상이한 시간 간격으로 IVIS 영상화기(ex = 745 nm, em = ICG, 노출 시간 = 1s)로 영상화하였다.
도 29는 역치를 조절한 후 전신 또는 반신 형광 영상을 백색 광 영상 위에 겹쳐 놓은 것을 보여준다. 20 nmol의 58을 22Rv1 인간 전립선 종양 이종이식편 보유 마우스에게 주사하고 상이한 시간 간격으로 IVIS 영상화기(ex = 745 nm, em = ICG, 노출 시간 = 1s)로 영상화하였다.
도 30은 역치를 조절한 후 전신 또는 반신 형광 영상을 백색 광 영상 위에 겹쳐 놓은 것을 보여준다. 20 nmol의 60을 22Rv1 인간 전립선 종양 이종이식편 보유 마우스에게 주사하고 상이한 시간 간격으로 IVIS 영상화기(ex = 745 nm, em = ICG, 노출 시간 = 1s)로 영상화하였다.
결론: 이들 시험관내 결합 친화성 데이터는 화합물 15, 55, 56 및 60이 PSMA에 대한 매우 높은 친화성을 가진다는 것을 보여주었다. 따라서, 화합물 15, 54, 57 및 60은 시간 의존적 영상화 연구에서 매우 우수한 전신 영상화 및 신속한 피부 제거를 보여주었다. 따라서, NIR 염료로부터의 황산 기(SO3H)의 제거에 의한 음전하의 감소는 신속한 피부 제거 및 신속한 종양 축적을 유발하는 데 도움을 주었다. PSMA 발현 전립선암 세포 및 종양 조직에 대한 친화성 및 특이성, 및 신속한 피부 제거를 고려한 후, 화합물 54, 57 및 60을 임상 후보로서 간주할 수 있다.
화합물 (6): PSMA-표적화된 NIR 염료 접합체의 임상 전 평가: 여러 가지 종류의 DUPA-NIR 접합체들
도 31: 여러 가지 종류의 링커들 및 NIR 염료들을 가진 PSMA-표적화된 DUPA-링커-NIR 영상화제들의 구조.
도 32는 DUPA-FITC(14)에 대한 DUPA-NIR 접합체의 상대적 결합 친화성을 보여준다. PSMA 양성 22Rv1 인간 전립선암 세포를 100 nM DUPA-FITC의 존재 하에서 증가하는 농도의 DUPA-NIR 접합체와 함께 37℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. 그 다음, 배지를 제거하고 새로운 배지로 (3회) 세척하고 PBS로 대체하였다. 유세포분석을 이용하여 세포에 결합된 형광을 분석하였다.
생체내 연구. 도 33은 역치를 조절한 후 전신 또는 반신 형광 영상을 백색 광 영상 위에 겹쳐 놓은 것을 보여준다. 20 nmol의 63을 22Rv1 인간 전립선 종양 이종이식편 보유 마우스에게 주사하고 상이한 시간 간격으로 IVIS 영상화기(ex = 745 nm, em = ICG, 노출 시간 = 1s)로 영상화하였다.
도 34는 역치를 조절한 후 전신 또는 반신 형광 영상을 백색 광 영상 위에 겹쳐 놓은 것을 보여준다. 6 nmol의 63을 22Rv1 인간 전립선 종양 이종이식편 보유 마우스에게 주사하고 상이한 시간 간격으로 IVIS 영상화기(ex = 745 nm, em = ICG, 노출 시간 = 1s)로 영상화하였다.
도 35는 역치를 조절한 후 전신 또는 반신 형광 영상을 백색 광 영상 위에 겹쳐 놓은 것을 보여준다. 20 nmol의 64를 22Rv1 인간 전립선 종양 이종이식편 보유 마우스에게 주사하고 상이한 시간 간격으로 IVIS 영상화기(ex = 745 nm, em = ICG, 노출 시간 = 1s)로 영상화하였다.
결론: 이들 시험관내 결합 친화성 데이터는 화합물 62, 64, 65 및 66이 PSMA에 대한 낮은 친화성을 가진다는 것을 보여주었다. 그러나, 화합물 63 및 64는 시간 의존적 영상화 연구에서 매우 우수한 전신 영상화 및 신속한 피부 제거도 보였다. 따라서, 다른 화합물들도 임상 후보 및/또는 실험 후보 둘 다로서 유용할 수 있다 하더라고, 화합물 63 및 64를 특히 바람직한 임상 후보로서 간주할 수 있다.
실시예 (7): PSMA-표적화된 NIR 염료 접합체의 임상 전 평가: DUPA에 대한 대안적 리간드.
도 36은 상이한 리간드를 가진 PSMA-표적화된 NIR 영상화제의 구조를 보여준다.
도 37은 PSMA 양성 22Rv1 세포 및 PSMA 음성 A549 세포의 경우 DUPA-FITC(14)에 대한 PSMA-표적화된 NIR 접합체 15의 상대적 결합 친화성을 보여준다. 암 세포를 100 nM DUPA-FITC의 존재 하에서 증가하는 농도의 화합물 15와 함께 37℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. 그 다음, 배지를 제거하고 새로운 배지로 (3회) 세척하고 PBS로 대체하였다. 유세포분석을 이용하여 세포에 결합된 형광을 분석하였다.
도 38은 역치를 조절한 후 전신 또는 반신 형광 영상을 백색 광 영상 위에 겹쳐 놓은 것을 보여준다. 6 nmol의 15를 22Rv1 인간 전립선 종양 이종이식편 보유 마우스에게 주사하고 상이한 시간 간격으로 IVIS 영상화기(ex = 745 nm, em = ICG, 노출 시간 = 1s)로 영상화하였다.
결론: DUPA와 비교되었을 때 PSMA에 대한 보다 높은 친화성을 가진, DUPA에 대한 대안적 리간드가 합성되었지만, 이 실시예는 화합물 15가 PSMA 양성 22Rv1 세포에 대한 매우 높은 친화성을 가지나, PSMA 음성 A549 세포에 대해서는 이러한 친화성을 갖지 않는다는 것을 보여주고, 이것은 화합물 15가 PSMA에 대해 고도로 특이적이라는 것을 시사한다. 시간 의존적 전신 영상화 연구는 화합물 15가 마우스의 PSMA 양성 종양 및 신장에서 축적된다는 것을 보여주었고, 이것은 화합물 15가 뛰어난 임상 후보라는 것을 다시 입증한다.
Claims (70)
- 하기 식을 가진 화합물:
B-X-Y-Z
상기 식에서,
B는 전립선 특이적 막 항원(PSMA)에 결합할 수 있는 화합물을 포함하고,
X는 탄화수소 쇄, 또는 헤테로원자를 가진 탄화수소 쇄를 포함하고,
Y는 적어도 하나의 아미노산 또는 이의 유도체를 포함하고,
Z는 근적외선(NIR) 염료를 포함한다. - 제1항에 있어서, B가 소분자, 리간드, 억제제, 아고니스트 및 이들의 유도체로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 화합물.
- 제1항에 있어서, B가 2-[3-(1,3-디카복시프로필)-우레이도]펜탄디오산(DUPA) 또는 이의 유도체인 화합물.
- 제1항에 있어서, X가 소수성 스페이서인 화합물.
- 제1항에 있어서, X의 길이가 7개 원자 내지 14개 원자인 화합물.
- 제1항에 있어서, X가 에이트 아미노옥톤산(eight aminooctonoic acid)(EAOA), 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 및 폴리에틸렌 아민(PEA) 링커로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 화합물.
- 제1항에 있어서, X가 EAOA인 화합물.
- 제1항에 있어서, X가 N-아미노-dPEG2-산인 화합물
- 제1항에 있어서, Y가 음으로 하전된 아미노산을 포함하는 것인 화합물.
- 제1항에 있어서, Y가 양으로 하전된 아미노산을 포함하는 것인 화합물.
- 제1항에 있어서, Y가 방향족 아미노산을 포함하는 것인 화합물.
- 제1항에 있어서, Z가 양전하를 가진 것인 화합물.
- 제1항에 있어서, Z가 음전하를 가진 것인 화합물.
- 제1항에 있어서, Z가 LS288, IR800, SP054, S0121, KODAK, S2076, S0456,로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 화합물.
- 제1항에 있어서, B가 DUPA 또는 이의 유도체를 포함하고; X가 EAOA, PEG 및 PEA로 구성된 군으로부터 선택되고; Y가 페닐알라닌-티로신, 히스티딘-티로신, 페닐알라닌-아르기닌-티로신 및 히스티딘-티로신으로 구성된 군으로부터 선택되고; Z가 S0456을 포함하는 것인 화합물.
- 하기 구조식을 가진 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 이들의 동위체:
상기 식에서,
R1은 수소 또는 SO3H를 나타내고;
R2는 수소, 또는 CH3, 또는 C3H6SO3 -, 또는 C3H6SO3H 또는 C4H8SO3 -, 또는 C4H8SO3H 또는 C3H6N+(CH3)3을 나타내고;
R3 및 R5는 각각 탄소, 임의적으로 하나 이상의 공유 결합, 또는 산소, 또는 황, 또는 질소를 나타내고;
R4는 임의적으로 하나 이상의 공유 결합을 가진 탄소를 나타내고;
R6은 질소, 산소 또는 황, 또는 원자 부재(방향족 고리와 비닐 고리 사이의 직접적인 C-C 결합)를 나타내고;
R7은 임의적이고, 존재할 때 전자 공여 방향족 치환기를 나타내고;
R8은 임의적이고, 존재할 때 방향족 아미노산, 예컨대, Phe, Trp, His, Tyr 또는 이들의 유도체, 및/또는 양이온성 아미노산, 예컨대, Arg, Lys 또는 이들의 유도체, 및/또는 음이온성 아미노산, 예컨대, Asp, Glu 또는 이들의 유도체, 및/또는 방향족/양이온성/음이온성 산의 비천연 아미노산 또는 유도체를 가진 링커를 나타내고;
R9는 임의적이고, 존재할 때 선형 탄소 쇄, 또는 폴리에틸렌 글리콜 링커, 폴리에틸렌 아민 링커, 양이온성 링커, 또는 이들의 유도체를 나타내고;
R10은 CO2H, PO3H2, SO3H, CH2SO3H, CH2CONHCH2SO3H, 또는 CH2CONHCH2CH2SO3H를 나타내고;
R11은 CO2H, SO3H, CH2CONHCH2SO3H, 또는 CH2CONHCH2CH2SO3H를 나타내고;
R12는 독립적으로 수소, 메틸 기, CH2COOH 또는 CH2를 나타내고, 임의적으로 각각 결합을 공유하는 CH2를 나타낼 수 있다. - 제16항에 있어서, 하기 화합물들 또는 이들의 라세미체 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된 화합물:
- 하기 구조식을 가진 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 이들의 동위체:
상기 식에서,
R1은 수소 또는 SO3H를 나타내고;
R2는 수소, 또는 CH3, 또는 C3H6SO3 -, 또는 C3H6SO3H 또는 C4H8SO3 -, 또는 C4H8SO3H 또는 C3H6N+(CH3)3을 나타내고;
R3 및 R5는 각각 탄소, 임의적으로 하나 이상의 공유 결합, 또는 산소, 또는 황, 또는 질소를 나타내고;
R4는 임의적으로 하나 이상의 공유 결합을 가진 탄소를 나타내고;
R6은 질소, 산소 또는 황, 또는 원자 부재(방향족 고리와 비닐 고리 사이의 직접적인 C-C 결합)를 나타내고;
R7은 임의적이고, 존재할 때 전자 공여 방향족 치환기를 나타내고;
R8은 임의적이고, 존재할 때 방향족 아미노산, 예컨대, Phe, Trp, His, Tyr 또는 이들의 유도체, 및/또는 양이온성 아미노산, 예컨대, Arg, Lys 또는 이들의 유도체, 및/또는 음이온성 아미노산, 예컨대, Asp, Glu 또는 이들의 유도체, 및/또는 방향족/양이온성/음이온성 산의 비천연 아미노산 또는 유도체를 가진 링커를 나타내고;
R9는 임의적이고, 존재할 때 선형 탄소 쇄, 또는 폴리에틸렌 글리콜 링커, 폴리에틸렌 아민 링커, 양이온성 링커, 또는 이들의 유도체를 나타내고;
R10은 CO2H, PO3H2, SO3H, CH2SO3H, CH2CONHCH2SO3H, 또는 CH2CONHCH2CH2SO3H를 나타내고;
R11은 CO2H, SO3H, CH2CONHCH2SO3H, 또는 CH2CONHCH2CH2SO3H를 나타내고;
R12는 독립적으로 수소, 메틸 기, CH2COOH 또는 CH2를 나타내고, 임의적으로 각각 결합을 공유하는 CH2를 나타낼 수 있다. - 제18항에 있어서, 하기 화합물들로 구성된 군으로부터 선택된 화합물:
- 하기 구조식을 가진 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 이들의 동위체:
상기 식에서,
R1은 수소 또는 SO3H를 나타내고;
R2는 수소, 또는 CH3, 또는 C3H6SO3 -, 또는 C3H6SO3H 또는 C4H8SO3 -, 또는 C4H8SO3H 또는 C3H6N+(CH3)3을 나타내고;
R3 및 R5는 각각 탄소, 임의적으로 하나 이상의 공유 결합, 또는 산소, 또는 황, 또는 질소를 나타내고;
R4는 임의적으로 하나 이상의 공유 결합을 가진 탄소를 나타내고;
R6은 질소, 산소 또는 황, 또는 원자 부재(방향족 고리와 비닐 고리 사이의 직접적인 C-C 결합)를 나타내고;
R7은 임의적이고, 존재할 때 전자 공여 방향족 치환기를 나타내고;
R8은 임의적이고, 존재할 때 방향족 아미노산, 예컨대, Phe, Trp, His, Tyr 또는 이들의 유도체, 및/또는 양이온성 아미노산, 예컨대, Arg, Lys 또는 이들의 유도체, 및/또는 음이온성 아미노산, 예컨대, Asp, Glu 또는 이들의 유도체, 및/또는 방향족/양이온성/음이온성 산의 비천연 아미노산 또는 유도체를 가진 링커를 나타내고;
R9는 임의적이고, 존재할 때 선형 탄소 쇄, 또는 폴리에틸렌 글리콜 링커, 폴리에틸렌 아민 링커, 양이온성 링커, 또는 이들의 유도체를 나타내고;
R10은 CO2H, PO3H2, SO3H, CH2SO3H, CH2CONHCH2SO3H, 또는 CH2CONHCH2CH2SO3H를 나타내고;
R11은 CO2H, SO3H, CH2CONHCH2SO3H, 또는 CH2CONHCH2CH2SO3H를 나타내고;
R12는 독립적으로 수소, 메틸 기, CH2COOH 또는 CH2를 나타내고, 임의적으로 각각 결합을 공유하는 CH2를 나타낼 수 있다. - 제20항에 있어서, 하기 화합물들로 구성된 군으로부터 선택되는 화합물:
- 제1항에 있어서, 아미노산이 산소 함유 측쇄 기를 포함하는 것인 화합물.
- 제22항에 있어서, 산소 함유 측쇄 기를 포함하는 아미노산이 페닐알라닌-티로신, 페닐알라닌-세린 및 페닐알라닌-티라민으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 화합물.
- 제22항에 있어서, 산소 함유 측쇄 기를 포함하는 아미노산이 페닐알라닌-티로신인 화합물.
- 제1항에 있어서, 아미노산이 황 함유 측쇄 기를 포함하는 것인 화합물.
- 제25항에 있어서, 황 함유 측쇄 기를 포함하는 아미노산이 페닐알라닌-시스테인, 페닐알라닌-메티오닌, 페닐알라닌-셀레노시스테인 또는 히스티딘-시스테인으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 화합물.
- 제25항에 있어서, 황 함유 측쇄 기를 포함하는 아미노산이 페닐알라닌-시스테인인 화합물.
- 제1항에 있어서, 아미노산이 질소 함유 측쇄 기를 포함하는 것인 화합물.
- 제28항에 있어서, 질소 함유 측쇄 기를 포함하는 아미노산이 페닐알라닌-라이신, 페닐알라닌-오르니틴, 페닐알라닌-아르기닌 또는 히스티딘-라이신으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 화합물.
- 제28항에 있어서, 질소 함유 측쇄 기를 포함하는 아미노산이 페닐알라닌-라이신인 화합물.
- 제1항에 있어서, 아미노산이 티로신, 시스테인, 라이신 또는 이들의 유도체, 또는 페닐알라닌-티로신, 페닐알라닌-시스테인, 페닐알라닌-라이신, 히스티딘-티로신 또는 이들의 유도체로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 화합물.
- 제1항에 있어서, Y가 페닐알라닌-티로신 또는 이의 유도체를 포함하는 것인 화합물.
- 제1항에 있어서, Y가 아미노산 또는 이의 유도체의 동위체를 포함하는 것인 화합물.
- 제33항에 있어서, 탄소 동위체가 티로신 또는 페닐알라닌의 방향족 고리 상에 존재하는 것인 화합물.
- 제33항에 있어서, 수소 동위체가 티로신 또는 페닐알라닌의 방향족 고리의 치환기인 화합물.
- 제1항에 있어서, 아미노산 유도체가 하기 화합물들 또는 이들의 라세미체 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된 티로신의 유도체인 화합물:
- 제1항에 있어서, 약 500 nm 내지 약 900 nm의 흡수 및 방사 최대치를 가진 화합물.
- 제37항에 있어서, 약 600 nm 내지 800 nm의 흡수 및 방사 최대치를 가진 화합물.
- 제1항에 있어서, 조직 세포에 분포된 후 형광을 발하도록 제조된 화합물.
- 제39항에 있어서, 조직 세포가 전립선 세포, 전립선암 세포, 방광암 세포, 췌장암 세포, 간암 세포, 폐암 세포, 신장암 세포, 육종 세포, 유방암 세포, 뇌암 세포, 신경내분비 암종 세포, 결장암 세포, 고환암 세포 및 흑색종 세포로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 화합물.
- 제16항에 있어서, 약 500 nm 내지 약 900 nm의 흡수 및 방사 최대치를 가진 화합물.
- 제18항에 있어서, 약 500 nm 내지 약 900 nm의 흡수 및 방사 최대치를 가진 화합물.
- 제20항에 있어서, 약 500 nm 내지 약 900 nm의 흡수 및 방사 최대치를 가진 화합물.
- 제16항에 있어서, 조직 세포에 분포된 후 형광을 발하도록 제조된 화합물.
- 제18항에 있어서, 조직 세포에 분포된 후 형광을 발하도록 제조된 화합물.
- 제20항에 있어서, 조직 세포에 분포된 후 형광을 발하도록 제조된 화합물.
- 제44항에 있어서, 조직 세포가 전립선 세포, 전립선암 세포, 방광암 세포, 췌장암 세포, 간암 세포, 폐암 세포, 신장암 세포, 육종 세포, 유방암 세포, 뇌암 세포, 신경내분비 암종 세포, 결장암 세포, 고환암 세포 및 흑색종 세포로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 화합물.
- 제45항에 있어서, 조직 세포가 전립선 세포, 전립선암 세포, 방광암 세포, 췌장암 세포, 간암 세포, 폐암 세포, 신장암 세포, 육종 세포, 유방암 세포, 뇌암 세포, 신경내분비 암종 세포, 결장암 세포, 고환암 세포 및 흑색종 세포로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 화합물.
- 제46항에 있어서, 조직 세포가 전립선 세포, 전립선암 세포, 방광암 세포, 췌장암 세포, 간암 세포, 폐암 세포, 신장암 세포, 육종 세포, 유방암 세포, 뇌암 세포, 신경내분비 암종 세포, 결장암 세포, 고환암 세포 및 흑색종 세포로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 화합물.
- 제1항에 있어서, 근적외선 파장의 여기 광에 노출됨으로써 형광을 발하도록 제조된 화합물.
- 제1항에 있어서, DUPA의 결합 친화성과 유사한, PSMA에 대한 결합 친화성을 가진 화합물.
- 제1항에 있어서, 종양 세포에의 표적화에 대해 고도로 선택적인 화합물.
- 제1항의 화합물, 및 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하는 조성물.
- PSMA를 발현하는 생물학적 조직을 광학 영상화하는 방법으로서,
(a) 상기 생물학적 조직을 제1항의 조성물과 접촉시키는 단계;
(b) 상기 조성물 중의 화합물이 생물학적 표적 내부에 분포할 시간을 허용하는 단계;
(c) 상기 화합물에 의해 흡수될 수 있는 파장의 여기 광으로 상기 조직을 조명하는 단계; 및
(d) 상기 화합물에 의해 방사된 광학 신호를 검출하는 단계
를 포함하는 방법. - 제54항에 있어서, 화합물에 의해 방사된 신호를 영상의 구축에 사용하는 것인 방법.
- 제54항에 있어서, 생물학적 조직이 전립선 세포, 전립선암 세포, 방광암 세포, 췌장암 세포, 간암 세포, 폐암 세포, 신장암 세포, 육종 세포, 유방암 세포, 뇌암 세포, 신경내분비 암종 세포, 결장암 세포, 고환암 세포 및 흑색종 세포로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
- PSMA를 발현하는 생물학적 조직을 광학 영상화하는 방법으로서,
(a) 상기 생물학적 조직을 제16항의 조성물과 접촉시키는 단계;
(b) 상기 조성물 중의 화합물이 생물학적 표적 내부에 분포할 시간을 허용하는 단계;
(c) 상기 화합물에 의해 흡수될 수 있는 파장의 여기 광으로 상기 조직을 조명하는 단계; 및
(d) 상기 화합물에 의해 방사된 광학 신호를 검출하는 단계
를 포함하는 방법. - 제57항에 있어서, 화합물에 의해 방사된 신호를 영상의 구축에 사용하는 것인 방법.
- 제57항에 있어서, 생물학적 조직이 전립선 세포, 전립선암 세포, 방광암 세포, 췌장암 세포, 간암 세포, 폐암 세포, 신장암 세포, 육종 세포, 유방암 세포, 뇌암 세포, 신경내분비 암종 세포, 결장암 세포, 고환암 세포 및 흑색종 세포로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
- PSMA를 발현하는 생물학적 조직을 광학 영상화하는 방법으로서,
(a) 상기 생물학적 조직을 제18항의 조성물과 접촉시키는 단계;
(b) 상기 조성물 중의 화합물이 생물학적 표적 내부에 분포할 시간을 허용하는 단계;
(c) 상기 화합물에 의해 흡수될 수 있는 파장의 여기 광으로 상기 조직을 조명하는 단계; 및
(d) 상기 화합물에 의해 방사된 광학 신호를 검출하는 단계
를 포함하는 방법. - 제60항에 있어서, 화합물에 의해 방사된 신호를 영상의 구축에 사용하는 것인 방법.
- 제60항에 있어서, 생물학적 조직이 전립선 세포, 전립선암 세포, 방광암 세포, 췌장암 세포, 간암 세포, 폐암 세포, 신장암 세포, 육종 세포, 유방암 세포, 뇌암 세포, 신경내분비 암종 세포, 결장암 세포, 고환암 세포 및 흑색종 세포로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
- PSMA를 발현하는 생물학적 조직을 광학 영상화하는 방법으로서,
(a) 상기 생물학적 조직을 제20항의 조성물과 접촉시키는 단계;
(b) 상기 조성물 중의 화합물이 생물학적 표적 내부에 분포할 시간을 허용하는 단계;
(c) 상기 화합물에 의해 흡수될 수 있는 파장의 여기 광으로 상기 조직을 조명하는 단계; 및
(d) 상기 화합물에 의해 방사된 광학 신호를 검출하는 단계
를 포함하는 방법. - 제63항에 있어서, 화합물에 의해 방사된 신호를 영상의 구축에 사용하는 것인 방법.
- 제63항에 있어서, 생물학적 조직이 전립선 세포, 전립선암 세포, 방광암 세포, 췌장암 세포, 간암 세포, 폐암 세포, 신장암 세포, 육종 세포, 유방암 세포, 뇌암 세포, 신경내분비 암종 세포, 결장암 세포, 고환암 세포 및 흑색종 세포로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
- a) 제1항의 화합물과 표적 세포 유형의 적어도 하나의 세포 또는 표적 조직의 맥관구조의 결합을 허용하는 시간 동안 및 조건 하에서 생물학적 샘플을 이 화합물과 접촉시키는 단계; 및
b) 임의적으로 상기 생물학적 샘플에서 상기 화합물의 존재 또는 부재를 검출하는 단계
를 포함하는, 생물학적 샘플에서 표적 세포 유형을 확인하는 방법으로서, 검출 단계 b)에서의 상기 화합물의 존재는 상기 표적 세포 유형이 상기 생물학적 샘플에 존재한다는 것을 표시하는 것인 방법. - a) 제16항의 화합물과 표적 세포 유형의 적어도 하나의 세포의 결합을 허용하는 시간 동안 및 조건 하에서 생물학적 샘플을 이 화합물과 접촉시키는 단계; 및
b) 임의적으로 상기 생물학적 샘플에서 상기 화합물의 존재 또는 부재를 검출하는 단계
를 포함하는, 생물학적 샘플에서 표적 세포 유형을 확인하는 방법으로서,
c) 검출 단계 b)에서의 상기 화합물의 존재는 상기 표적 세포 유형이 상기 생물학적 샘플에 존재한다는 것을 표시하는 것인 방법. - a) 제18항의 화합물과 표적 세포 유형의 적어도 하나의 세포의 결합을 허용하는 시간 동안 및 조건 하에서 생물학적 샘플을 이 화합물과 접촉시키는 단계; 및
b) 임의적으로 상기 생물학적 샘플에서 상기 화합물의 존재 또는 부재를 검출하는 단계
를 포함하는, 생물학적 샘플에서 표적 세포 유형을 확인하는 방법으로서,
c) 검출 단계 b)에서의 상기 화합물의 존재는 상기 표적 세포 유형이 상기 생물학적 샘플에 존재한다는 것을 표시하는 것인 방법. - a) 제20항의 화합물과 표적 세포 유형의 적어도 하나의 세포의 결합을 허용하는 시간 동안 및 조건 하에서 생물학적 샘플을 이 화합물과 접촉시키는 단계; 및
b) 임의적으로 상기 생물학적 샘플에서 상기 화합물의 존재 또는 부재를 검출하는 단계
를 포함하는, 생물학적 샘플에서 표적 세포 유형을 확인하는 방법으로서,
c) 검출 단계 b)에서의 상기 화합물의 존재는 상기 표적 세포 유형이 상기 생물학적 샘플에 존재한다는 것을 표시하는 것인 방법. - 제1항의 화합물을 포함하는 키트.
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