KR20180068965A

KR20180068965A - 신규한 단백질 및 검출 방법

Info

Publication number: KR20180068965A
Application number: KR1020187008831A
Authority: KR
Inventors: 나타샤 고든; 루크 오쇼너시; 브루스 미첼
Original assignee: 에어미드 헬스 그룹 리미티드
Priority date: 2015-08-31
Filing date: 2016-08-31
Publication date: 2018-06-22
Also published as: CN107922467A; EP3344648A1; JP2018533619A; HK1258012A1; US20180244734A1; US20200172586A1; AU2016315370A1; CA3034950A1; WO2017037126A1

Abstract

본 발명은 시멕스 렉툴라리우스(Cimex lectularius)에 특이적인 항원의 존재를 검출하기 위한 항체를 생성하는 데 사용하기 위한, 서열 번호 1 또는 5 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하는 시멕스 렉툴라리우스 유래의 단리된 단백질, 또는 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 6 및 서열 번호 7 중 어느 하나 이상으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하는 시멕스 렉툴라리우스 유래의 단리된 폴리펩티드로서, 상기 항체는 알, 유충, 탈피로부터 성숙한 암수 성충으로의 시멕스 렉툴라리우스 발생의 모든 단계에 있는 시멕스 렉툴라리우스 항원을, 2 ㎍/㎖ 미만의 항원 농도로 검출할 수 있는 것인, 단리된 단백질 또는 폴리펩티드를 제공한다.

Description

신규한 단백질 및 검출 방법

본 발명은 신규한 시멕스 렉툴라리우스(Cimex lectularius) 단백질, 및 환경, 예컨대 가정 또는 상업 환경에서 빈대의 존재를 검출하는 방법에 관한 것이다.

빈대는 적갈색이며, 날개가 없고, 우화를 위해 혈분을 필요로 하는 흡혈이 필수적인 곤충이다. 이들은 편평하고 타원형의 긴 모양이고 길이가 대략 5-7 mm이며 3쌍의 다리가 있다. 빈대는 인간과 기타 온혈 숙주의 혈액으로 생존하는 곤충이다. 빈대는 열, 냄새 나는 빈대 배설물, 그리고 포유동물, 새 및 그들 자신이 방출한 이산화탄소에 유인된다. 취침 공간, 매트리스, 박스 스프링스, 침실용 탁자, 침대 머리판은 빈대가 숨을 수 있는 이상적인 환경이다. 빈대는 주간 일조시간 동안 어둡고 밀폐된 곳에 숨어 있을 가능성이 크며 천, 목재 및 껄끄러운 사포 같은 표면에 있는 균열과 틈을 선호한다. 이들은 종종 침대와 가구의 틈과 균열에 숨어있는 것이 발견된다.

빈대는 혈액을 먹고, 밤에 활동적이며 노출된 피부의 어느 부위든 문다. 피부 발진, 알레르기 반응 및/또는 정신적 고통을 포함하여, 빈대 물림으로 인해 여러 가지 건강상의 부작용이 발생할 수 있다.

최근 몇 년 동안 유럽, 오스트레일리아 및 북아메리카에서 빈대의 침입 발생률이 극적으로 증가해왔다. 이는 부분적으로는 세계 여행 및 이주의 증가에 기인한다. 다른 이유로는 해충 방제 관리에 대한 살충제 저항성/변화의 증가 및 중고 가구의 사용이 포함된다. 빈대 개체수의 증가는 빈대 물림 및 관련 병태의 증가의 원인이 되었다.

침입으로 이어지는 빈대의 확산은 2가지 형태의 분산을 통해 발생한다: 1 - 빈대가 통풍 덕트, 벽의 구멍 및 파이프를 통해 걷기와 같은 그들 자체의 수단으로 방에서 방으로 이동하는 것을 필요로 하는 능동적 분산. 능동적 분산은 살충제의 분산, 성간 갈등 또는 숙주 자극의 결과일 수 있다. 2 - 빈대가 옷에 또는 짐과 가구 안에서 새로운 위치로 옮겨지는, 수동적 분산 또는 인간에 의한 운송으로서, 새와 박쥐도 빈대의 수동적 분산을 도모한다.

빈대는 5령기를 거친 후 성충에 이른다. 이 과정의 각 단계에서, 다음 단계로 진행하기 위한 탈피를 유도하는데 혈분이 필요하다. 암컷 빈대는 평생 동안 200-500개의 알을 낳을 수 있다.

인간과 독점적으로 상호 작용하는 빈대에는 크게 두 가지 종이 있다.

1. 시멕스 렉툴라리우스(일반적인 빈대)

2. 시멕스 헤미프테루스(Cimex hemipterus)(열대 지역에서 발견됨)

두 가지 종의 씨. 렉툴라리우스(C. lectularius ) 및 씨. 헤미프테루스(C. hemipterus)는 혼합된 개체군에서 번식하는 것으로 보이며 오스트레일리아와 영국에서 발견되고 있는 씨. 헤미프테루스의 출현율이 오히려 증가하였으며 이는 각각의 종의 생태적 적소가 정의되어 있으나 그 경계가 모호해지고 있음을 나타낸다.

최근 전사체학(transcriptomics)이 수행될 때까지는 일반적으로 분자 수준에서의 빈대에 대한 정보가 제한적이다. 전사체학은 특정 시기에 다양한 세포 또는 조직 유형에 존재하는 전사된 RNA에 대한 연구이다. 그 다음에, 이들 발현된 RNA는 분자 분석을 위해 cDNA 라이브러리로 만들어진다. 이 연구는 세 가지 다른 빈대 주(strain)(리치몬드(Richmond) - 살충제 내성, 할란(Harlan) - 살충제 민감성, 및 오하이오(Ohio) 아파트에서 살충제에 노출된 주)로부터 다수의 완전한 mRNA 및 부분적으로 완전한 mRNA의 서열 판독 결과를 가져왔다.

실제로, 빈대의 존재를 빠르고 쉽게 검출하는 방법을 제공할 필요가 있다.

본 발명에 따르면, 시멕스 렉툴라리우스에 특이적인 항원의 존재를 검출하기 위한 항체를 생성하는 데 사용하기 위한, 서열 번호 1 또는 5 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하는 시멕스 렉툴라리우스 유래의 단리된 단백질, 또는 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 6 및 서열 번호 7 중 어느 하나 이상으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하는 시멕스 렉툴라리우스 유래의 단리된 폴리펩티드로서, 상기 항체는 알, 유충, 탈피로부터 성숙한 암수 성충으로의 시멕스 렉툴라리우스 발생의 모든 단계에 있는 시멕스 렉툴라리우스 항원을 20 ㎍/㎖ 미만의 항원 농도로 검출할 수 있는 것인 단리된 단백질 또는 폴리펩티드가 제공된다.

본 발명의 한 실시양태는 시멕스 렉툴라리우스에 특이적인 항원의 존재를 검출하기 위한 항체를 생성하는 데 사용하기 위한, 서열 번호 4 또는 8 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하는 시멕스 렉툴라리우스 단백질 유래의 재조합 절단형 폴리펩티드로서, 상기 항체는 알로부터 성숙한 성충으로의 시멕스 렉툴라리우스 발생의 모든 단계에 있는 시멕스 렉툴라리우스 항원에, 20 ㎍/㎖ 미만의 항원 농도에서 특이적인 것인 재조합 절단형 폴리펩티드를 제공한다.

본 발명의 한 실시 양태에서, 생성된 항체는 단클론 항체이다.

본 발명의 한 실시양태에서, 항체는 10 ㎍/㎖ 미만의 농도의 시멕스 렉툴라리우스 항원을 검출할 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시양태에서, 생성된 항체는 시멕스 렉툴라리우스와 시멕스 헤미프테루스 둘 다에 특이적인 항원을 검출할 수 있다.

본 발명의 한 실시양태에서 시멕스 렉툴라리우스로부터 단리된 단백질은 불용성 단백질이다.

본 발명의 한 실시양태에서, 시멕스 렉툴라리우스로부터 단리된 단백질 또는 폴리펩티드는 알레르겐 테스트에 사용하기 위한 것이다.

본 발명에 따르면, 샘플 중의 시멕스 렉툴라리우스 또는 시멕스 헤미프테루스를 검출하는 방법으로서,

단클론 항체와 샘플을 접촉시켜 단클론 항체-폴리펩티드 복합체를 형성하는 단계; 및

단클론 항체-폴리펩티드 복합체를, 복합체에 결합하는 리포터 제제(reporter agent)로 표지된 추가의 단클론 항체와 접촉시켜, 샘플 중의 시멕스 렉툴라리우스 또는 시멕스 헤미프테루스의 존재를 검출하는 단계

를 포함하는 방법이 제공된다.

바람직하게는 샘플은 알, 유충, 탈피 또는 성충으로부터 암수 빈대 발생의 임의의 단계에 있는 시멕스 렉툴라리우스 또는 시멕스 헤미프테루스를 포함한다. 가장 바람직하게는 단클론 항체는 알, 유충, 탈피로부터 성숙한 암수 성충으로의 시멕스 렉툴라리우스 발생의 모든 단계에 있는 시멕스 렉툴라리우스 항원에 특이적이다.

측방 유동 막;

테스트 샘플을 수용하기 위한, 측방 유동 막의 하측 제1 단부에 위치하는 제1 영역으로서, 시멕스 렉툴라리우스 또는 시멕스 헤미프테루스에 특이적인 단클론 항체를 포함하고, 상기 항체는 리포터 제제로 표지된 것인 제1 영역;

측방 유동 막의 상측 제2 단부에 위치하며 고정화된 대조군 폴리펩티드를 포함하는 제2 영역; 및

제1 영역과 제2 영역 사이에 위치하며 시멕스 렉툴라리우스 또는 시멕스 헤미프테루스에 특이적인 고정화된 단클론 항체를 포함하는 제3 영역

을 포함하는 방법이 또한 제공된다.

바람직하게는 단클론 항체는 10 mg/㎖ 미만의 농도로 존재한다. 가장 바람직하게는 단클론 항체는 5 mg/㎖ 미만의 농도로 존재한다.

본 발명의 한 실시양태에서, 검출 가능한 표지제는 라텍스 항체 접합체 또는 금 항체 접합체 중 어느 하나 이상으로부터 선택된다.

본 발명의 또 다른 실시양태에서, 단클론 항체는 HRP 또는 비오틴 중 어느의 하나 이상으로 표지된다.

본 발명에 따르면, 샘플 중의 시멕스 렉툴라리우스 또는 시멕스 헤미프테루스의 존재를 검출하기 위한 진단 키트로서,

서열 번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8 중 어느 하나 이상으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 이의 단편에 특이적인 단클론 항체가 고정화되어 있는 하나 이상의 고체 표면을 포함하고, 상기 검출은

샘플 중 시멕스 렉툴라리우스 또는 시멕스 헤미프테루스 항원에 대한 상기 단클론 항체의 결합을 허용하는 조건하에서 샘플을 상기 항체와 접촉시키는 단계; 및

샘플에 결합하는 항체의 양을 대조군 값과 비교하고 이로부터 샘플 중 시멕스 렉툴라리우스 또는 시멕스 헤미프테루스의 존재 또는 부재를 결정하는 단계

를 포함하는 것인 진단 키트가 제공된다.

본 발명에 따르면, 본 발명의 진단 키트를 포함하는 시멕스 렉툴라리우스 또는 시멕스 헤미프테루스의 존재 또는 부재를 결정하기 위한 신속 검출 방법을 제공한다.

본 발명의 한 실시양태는 서열 번호 1 또는 5 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하는 시멕스 렉툴라리우스 유래의 단리된 단백질, 또는 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 6 및 서열 번호 7 중 어느 하나 이상으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하는 시멕스 렉툴라리우스 유래의 단리된 폴리펩티드를 제공한다.

본 발명의 한 실시양태는 서열 번호 4 또는 8 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하는 시멕스 렉툴라리우스 단백질 유래의 재조합 절단형 폴리펩티드를 제공한다.

본 발명은 첨부된 도면을 참조하여 하기의 설명으로부터 더욱 명확하게 이해될 것이다.
도 1은 생쥐 하이브리도마 세포주(진스크립트(GenScript USA Inc)에서 생성됨)로부터 빈대 알껍질 단백질 에피토프 1(ESP)(서열 번호 2) 및 3(서열 번호 3)에 대해 생산된 6가지 생쥐 IgG 단클론 항체를 나타내는 표이다.
도 2는 생쥐 하이브리도마 세포주(진스크립트에서 생성됨)로부터 빈대 단백질 1 에피토프 1(BBP1)(서열 번호 6) 및 2(서열 번호 7)에 대해 생산된 4가지 생쥐 IgG 단클론 항체를 나타내는 표이다.
도 3은 하이-트랩(Hi-Trap) 단백질 G 컬럼(GE Healthcare)에 의해 정제된 ESP 단클론 항체의 친화성 정제 프로파일이고, (a)는 단클론 항체 mAb ESP-1 [4B9E7] 및 (b) mAb ESP-3 [4D1B8 및 10B9F9]을 나타낸다. 단클론 항체는 1ml/분의 유속을 사용하여 0.1M 글리신, pH 6.5로 용리하였다. 화살표는 용리의 시작을 나타낸다. 피크 분획을 모으고 센트리콘(centricon) 장치를 사용하여 농축하였다.
도 4는 하이-트랩 단백질 G 컬럼(GE Healthcare)에 의해 정제된 BBP1 단클론 항체의 친화성 정제 프로파일이고, (a)는 단클론 항체 mAb BBP1-1 [5D3E8] 및 (b) mAb BBP1-2 [10B1C5]를 나타낸다. 단클론 항체는 1ml/분의 유속을 사용하여 0.1M 글리신, pH 6.5로 용리하였다. 화살표는 용리의 시작을 나타낸다. 피크 분획을 모으고 센트리콘 장치를 사용하여 농축하였다.
도 5는 도 3에서 단백질 G 컬럼 친화성 정제된 mAb ESP-1 및 mAb ESP-3 단클론 항체의 SDS-PAGE 분석이다.
레인 1: mAb ESP-1 통과액, 레인 2: 환원된 mAb ESP-1, 레인 3: 비환원된 mAb ESP-1, 레인 4: 블랭크 레인 5: mAb ESP-3 통과액, 레인 6: 환원된 ESP-3, 레인 7: 비환원된 mAb ESP-3, 레인 8: 블랭크, 레인 9: BSA 대조군(66.5kDa).
도 6은 도 4에서 단백질 G 컬럼 친화성 정제된 mAb BBP1-1 및 mAb BBP1-2 단클론 항체의 SDS-PAGE 분석이다.
레인 1: 미리 염색된 단백질 마커, 레인 2: 하이브리도마 배지 mAb BBP1-1, 레인 3: 환원된 mAb BBP1-1, 레인 4: 비환원된 mAb BBP1-1, 레인 5: 블랭크, 레인 6: 하이브리도마 배지 mAb BBP1-2, 레인 7: 환원된 mAb BBP1-2, 레인 8: 비환원된 mAb BBP1-2, 레인 9: BSA 대조군(66.5kDa).
도 7 (a)는 SDS-PAGE 단백질 겔에서 이동시킨 정제된 천연 ESP 단백질을 나타낸다.
도 7 (b)는 ESP 단백질을 확인하기 위해 토끼 다클론 항체 항-ESP-3을 사용하여 프로빙된 웨스턴 블롯이다.
도 8은 (a) mAb ESP-1 [4B9E7]의 비오틴 표지 vs (b) 비표지된 mAb ESP-1 [4B9E7]을 나타내는 도트 블롯이다. 스폿 1: 순수한 빈대 알 용해물; 스폿 2: 1/5 희석된 빈대 알 용해물; 스폿 3: BSA 대조군; 및 스폿 4: 막 위에 도트 형성된 순수한 항체(대조군).
도 9는 단클론 mAb ESP-1 및 mAb-ESP-3에 대한 최적 코팅 농도를 보여주는 ELISA 분석의 결과 그래프이다. 2차 접합체 염소 항-생쥐 HRP를 1/5000로 희석하였다. 최적의 코팅 농도는 mAb ESP-3에 대해 ∼ 5-10 ㎍/㎖로 확인되었다.
도 10은 BBP1 펩티드를 검출하는 경쟁적 BBP1 다클론 ELISA의 결과를 나타내는 그래프이다. 델타 OD는 450nm 및 630nm에서의 흡광도를 측정하여 수집하였다.
도 11은 배설물, 탈피물 및 빈대 사체 샘플 중의 BBP1 단백질을 검출하는 경쟁적 BBP1 다클론 ELISA의 결과를 나타내는 그래프이다. 델타 OD는 450nm 및 630nm에서의 흡광도를 측정하여 수집하였다.
도 12는 농축된 천연 및 재조합 절단된 ESP(rtESP: recombinant truncated ESP)의 검출을 나타내는 웨스턴 블롯이다.
레인 1: 분자량 표준 래더, 레인 2: 빈대 알 용해물, 레인 3: 면역 침전된 ESP 단백질, 레인 4: rtESP. 화살표는 36.3kDa에서 천연 ESP 단백질과 40kDa에서 rtESP를 나타낸다.
도 13은 농축된 천연 및 재조합 절단된 BBP1(rtBBP1)의 검출을 나타내는 웨스턴 블롯이다.
레인 1: 분자량 표준 래더, 레인 2: 빈대 용해물, 레인 3: 면역 침전된 BBP1 단백질, 레인 4: rtBBP1. 화살표는 63kDa에서 천연 BBP1 단백질과 39kDa에서 rtBBP1을 나타낸다.
도 14는 ESP 단백질에 대한 곤충 용해물 교차 반응성 및 항체 특이성을 나타내기 위한 (a) SDS-PAGE 겔 (b) mAb ESP-1로 프로빙된 웨스턴 블롯 및 (c) mAb ESP-3으로 프로빙된 웨스턴 블롯이다.
레인 1: 미리 염색된 단백질 마커, 레인 2: 할란 주 빈대 전체 곤충 용해물, 레인 3: 런던 실험실 주 빈대 전체 곤충 용해물, 레인 4: 할란 주 빈대 전체 알 용해물, 레인 5: 런던 실험실 주 빈대 전체 알 용해물, 레인 6: 집거미 전체 곤충 용해물, 레인 7: 집나방 전체 곤충 용해물, 레인 8: 바퀴벌레 전체 곤충 용해물, 레인 9: 바퀴벌레 알 전체 용해물, 레인 10: 쥐며느리 전체 곤충 용해물, 레인 11: 지네 전체 곤충 용해물, 레인 12: 집먼지 진드기 전체 용해물, 레인 13: 집파리 전체 곤충 용해물, 레인 14: 벌 전체 곤충 용해물 및 레인 15: BSA 대조군(66.5kDa); 화살표는 36.3 kDa에서 천연 ESP 단백질을 나타낸다.
도 15는 BBP1 단백질에 대한 곤충 용해물 교차 반응성 및 항체 특이성을 나타내기 위한 (a) SDS-PAGE 겔 (b) mAb BBP1-1로 프로빙된 웨스턴 블롯 및 (c) mAb BBP1-2로 프로빙된 웨스턴 블롯이다.
레인 1: 미리 염색된 단백질 마커, 레인 2: 할란 주 빈대 전체 곤충 용해물, 레인 3: 런던 실험실 주 빈대 전체 곤충 용해물, 레인 4: 할란 주 빈대 탈피물의 용해물, 레인 5: 런던 실험실 주 빈대 탈피물의 용해물, 레인 6: 집거미 전체 곤충 용해물, 레인 7: 집나방 전체 곤충 용해물, 레인 8: 바퀴벌레 전체 곤충 용해물, 레인 9: 바퀴벌레 알 전체 용해물, 레인 10: 쥐며느리 전체 곤충 용해물, 레인 11: 지네 전체 곤충 용해물; 레인 12: 집먼지 진드기 전체 용해물, 레인 13: 집파리 전체 곤충 용해물, 레인 14: 벌 전체 곤충 용해물 및 레인 15: BSA 대조군(66.5kDa). 화살표는 63kDa에서 천연 BBP1 단백질을 나타낸다.
도 16은 다양한 지리학적 지역의 시멕스 렉툴라리우스 및 시멕스 헤미프테루스의 검출을 보여주기 위한 (a) SDS-PAGE 겔 (b) mAb ESP-1로 프로빙된 웨스턴 블롯 및 (c) mAb ESP-3으로 프로빙된 웨스턴 블롯이다.
레인 1: 미리 염색된 단백질 마커, 레인 2: 할란 주(미국 - 시멕스 렉툴라리우스), 레인 3: 런던 실험실 주(살충제 감수성 -시멕스 렉툴라리우스), 레인 4: 런던 지역 주(피레스로이드 내성 -시멕스 렉툴라리우스), 레인 5: 케냐 지역 주(시멕스 렉툴라리우스), 레인 6: 케냐 열대 지역 주(시멕스 헤미프테루스), 레인 7: 독일 실험실 주(살충제 감수성 - 시멕스 렉툴라리우스), 레인 8: 스웨덴 지역 주(시멕스 렉툴라리우스), 레인 9: 정제된 천연 ESP, 레인 10: BSA(66.5kDa). 화살표는 36.3 kDa에서 천연 ESP 단백질을 나타낸다.
도 17은 다양한 지리학적 지역의 시멕스 렉툴라리우스 및 시멕스 헤미프테루스의 검출을 보여주기 위한 (a) SDS-PAGE 겔 (b) mAb BBP1-1로 프로빙된 웨스턴 블롯 및 (c) mAb BBP1-2로 프로빙된 웨스턴 블롯이다.
레인 1: 미리 염색된 단백질 마커, 레인 2: 할란 주(미국 - 시멕스 렉툴라리우스), 레인 3: 런던 실험실 주(살충제 감수성 -시멕스 렉툴라리우스), 레인 4: 런던 지역 주(피레스로이드 내성 -시멕스 렉툴라리우스), 레인 5: 스웨덴 지역 주(피레스로이드 내성 -시멕스 렉툴라리우스), 레인 6: 케냐 지역 주(시멕스 렉툴라리우스), 레인 7: 독일 실험실 주(살충제 감수성 - 시멕스 렉툴라리우스), 레인 8: 케냐 열대 지역 주(시멕스 헤미프테루스), 레인 9: BSA(66.5kDa). 화살표는 63kDa에서 천연 BBP1 단백질을 나타낸다.
도 18은 mAb ESP-1 [4B9E7] 및 mAb ESP-1-HRP 항체에 대한 결합 프로파일을 보여주는 포획 ELISA 분석 결과의 rtESP 표준 곡선이며, 델타 OD는 450 nm 및 630 nm에서의 흡광도를 측정하여 수집하였다.
도 19는 nESP ELISA 적정을 위한 결합 프로파일 및 이의 rtESP와의 상관관계를 보여주는 포획 ELISA 분석 결과의 그래프이며, 델타 OD는 450 nm 및 630 nm에서의 흡광도를 측정하여 수집하였다.
도 20은 nESP에 대한 포획 ELISA의 검출 한계의 그래프이며, 델타 OD는 450nm 및 630nm에서의 흡광도를 측정하여 수집하였다.
도 21은 nESP에 대한 포획 ELISA의 검출 한계를 보여주는 표이다.
도 22는 환경 테스트 챔버로부터 다양한 시기(24시간, 72시간, 1주, 2주, 3주 및 4주)에 취한 샘플 중의 nESP의 검출을 나타내는 그래프이다.
도 23은 mAb BBP1-1 및 mAb BBP1-1-HRP 항체에 대한 결합 프로파일을 보여주는 포획 ELISA 분석 결과의 rtBBP1 표준 곡선이며, 델타 OD는 450 nm 및 630 nm에서의 흡광도를 측정하여 수집하였다.
도 24는 nBBP1 ELISA 적정에 대한 결합 프로파일 및 이의 rtBBP1과의 상관 관계를 보여주는 포획 ELISA 분석 결과의 그래프이며, 델타 OD는 450 nm 및 630 nm에서의 흡광도를 측정하여 수집하였다.
도 25는 탈피물의 개수에 관하여 nBBP1에 대한 포획 ELISA의 검출 한계의 그래프이며, 델타 OD는 450 nm 및 630 nm에서의 흡광도를 측정하여 수집하였다.
도 26은 nBBP1에 대한 포획 ELISA의 검출 한계를 보여주는 표이다.
도 27은 환경 테스트 챔버로부터 다양한 시기(24시간, 72시간, 1주, 2주, 3주 및 4주)에 취한 샘플 중의 nBBP1의 검출을 나타내는 그래프이고, 델타 OD는 450 nm 및 630 nm에서의 흡광도를 측정하여 수집하였다.
도 28은 빈대 알 용해물 (a) 및 BBP1 (b)에 대한 측방 유동 테스트를 나타낸 것으로,
레인 1: 음성 대조군(8M 요소 용해 완충액), 레인 2: 추출된 빈대 알 용해물 (a); 및 양성 빈대 챔버 샘플 (b)
도 29는 mAb BBP1-1 (b) rtBBP1의 항 인간 IgE 검출을 나타내는 도트 블롯이다. A행: 레인 1: 0.5 mg/㎖ BSA, B행: 레인 1: 4 μg rtBBP1, 레인 2: 2 μg rtBBP1, 레인 3: 1μg rtBBP1, 레인 4: 0.5㎍ rtBBP1.

전세계적으로 빈대의 급속한 만연으로 인해 인간 건강에 미치는 영향에 대한 관심이 증가해왔다.

빈대는 인간의 혈액을 먹이로 한다. 빈대에 의해 물린 상처는 피부 과학적인 반응을 일으킬 수 있는데, 이는 물린 후에 상당한 시간 동안 자극을 유발할 수 있다. 대개 곤충이 어디에서 언제 물었는지 정확히 알지 못하는 사람에게 최초의 물린 자국이 나타난다. 이는 어떤 사람이 어디서 물렸는지 알지 못할 수 있는 상황을 만든다. 이는 호텔, 친구의 집, 소파 또는 침대 위에서였을 수 있다. 많은 경우에, 수개월 동안 또는 빈대가 목격되거나 배설물과 혈액 얼룩이 그들이 자주 먹이를 먹는 곳의 표면에서 발견될 때까지 아무런 반응이 없다. 빈대에 대한 두려움은 불안과 스트레스로 이어질 수 있다.

빈대가 전 세계적으로 증가함에 따라 빈대의 존재를 검출하는 개선된 수단에 대한 필요성이 강조된다. 빈대의 존재가 확인되면 곤충을 제거하기 위해 조치를 취할 수 있다. 그 대신, 빈대가 없는 것으로 확인되면 사람은 더 쉽게 잠들 수 있다.

다른 연구자들은 제한된 빈대 검출을 기재하였다. 톨리 MP 연구자들(Tolley MP et al.)("Identification of bed bug(Cimex Lectularius) surface deposited residues as a means of development of bed bug detection devices" URL:http://esa.confex.com/esa/2011/webprogram/paper54779.html)은 빈대 특이적인 타액 항원인 니트로포린을 사용하는 시스템을 기재하고 있다. 이 시스템은 빈대 배설물에는 없는 인간 혈액에 특이적인 항원에 의존한다. 결과의 민감도는 빈대 침입의 함수로 나타난다. 즉, 개체수가 적으면 검출 가능한 결과를 얻지 못한다.

WO2013/130613호(SRI International)는 체외 기생충에 대한 다클론 항체 검출 시스템을 기재한다. 이 시스템은 전체 동물 추출물을 포함하는 면역원으로부터 생성된 다클론 항체에 의존한다. 제조된 샘플은 계면활성제를 전혀 첨가하지 않아도 현저히 용해됨이 확인되었다. 전체 체외 기생충의 면역원에 대해 생성된 다클론 항체의 특이성은 그다지 높지 않을 것이며 가용성 단백질만 검출할 것이다.

완전히 대조적으로, 본 발명은 동정하여 단리한 신규한 시멕스 렉툴라리우스 단백질을 제공한다. 단리된 단백질은 불용성 단백질이다. 단백질은 빈대 알, 탈피물, 및 외골격 그리고 전체 곤충으로부터 쉽게 추출되지만 단리된 단백질을 용해시키는데 계면활성제가 필요하다. 외골격은 모든 생활 단계에서 살아 있거나 죽은 곤충에서 유래할 수 있다. 단리된 단백질과 폴리펩티드에 대해 생성된 항체는 알에서 1령 ∼ 5령의 형태로부터 성숙한 성충으로의 암수 빈대의 생활사에서 모든 단계로부터 항원의 존재를 검출할 수 있다고 밝혀졌다. 또한, 빈대가 수명이 다할 때까지 최대 5회까지 탈피할 수 있는 탈피물로부터 항원의 존재가 검출되었다. 항체는 밀접하게 관련된 다른 체외 기생충과 교차 반응 없이 매우 특이적으로 밝혀졌다. 단백질 상의 항체 에피토프 영역이 확인되었고, 단백질에 대해 매우 특이적임이 밝혀졌다. 에피토프 영역에 대해 생성된 항체는 샘플에서 매우 낮은 항원 농도의 항원을 검출하는 것으로 밝혀졌다.

놀랍게도 생성된 항체는 일반적인 빈대 종 시멕스 렉툴라리우스와 열대 지역에서 발견되는 시멕스 헤미프테루스 둘 다에서 단백질을 검출할 수 있었다. 본 발명의 특이적 항체를 사용하는 본 발명의 분석 시스템은 다양한 지리학적 지역의 빈대를 확인할 수 있다는 점에서 전 세계적으로 적용된다. 기후 변화 때문에 기후가 온화해 질수록 시멕스 헤미프테루스의 발생은 흔해진다. 본 발명은 빈대의 존재를 검출하는데 전 세계적으로 사용될 수 있는 민감한 분석 시스템을 제공한다.

신규 단백질, 알껍질 단백질(ESP: egg shell protein)이 시멕스 렉툴라리우스 알의 껍질 내에 존재한다는 것을 발견하였다.

두 번째 신규 단백질, 빈대 단백질 1(BBP1: bed bug protein 1)이 시멕스 렉툴라리우스 곤충의 모든 생활 단계에 존재한다는 것을 발견하였다. BBP1은 시멕스 렉툴라리우스의 배설물, 탈피물, 빈대 알, 빈대 성충, 제1 - 제5 령 형태 [U1]에서 검출되었다.

신규의 단리된 알껍질 단백질(ESP)은 서열 번호 1을 포함하는 363개 아미노산 단백질임이 밝혀졌다. 확인된 항체 에피토프 영역은 서열 번호 2 및 3을 포함한다. 알껍질 단백질(ESP)은 천연 ESP 단백질에서 나타나는 분해로부터 ESP 단백질을 안정화시키는 방법으로 절단된 단백질로서 생산하였다. 예측 구조 소프트웨어(Phyre2, 스크래치 프로테인 프레딕터(scratch protein predictor))는 ESP 단백질에 대해 2개의 도메인 구조를 나타냈다. ESP의 절단된 형태는 V114 - C363에서 시작하는 단백질의 예측된 C 말단 도메인을 포함하도록 개발되었다. 서열 번호 4를 포함하는 251개 아미노로 구성된 rtESP 단백질을 제조하여 ESP 분석에서 표준으로 사용하였다.

시멕스 렉툴라리우스의 모든 생활 단계에서 발견된 신규의 단리된 단백질(빈대 단백질 1- BBP1)은 서열 번호 5를 포함하는 651개 아미노산 단백질임이 밝혀졌다. 확인된 항체 에피토프 영역은 서열 번호 6 및 7을 포함한다. BBP1은 매우 반복적인 아미노산 서열을 가진 큰 단백질이며, 이러한 이유로 재조합 단백질을 제작할 때 BBP1의 절단된 형태를 생산하였다. 단백질 N 말단 영역의 280개 아미노산을 사용하여 서열 번호 8을 포함하는 절단된 재조합 단백질을 생산하였다.

신규의 단리된 시멕스 렉툴라리우스 단백질은 다른 곤충의 단백질과 유사한 PFAM 도메인이 없는 것으로 밝혀졌다. 서열 번호 1을 포함하는 알껍질 단백질은 시멕스 렉툴라리우스의 알껍질에만 존재하는 것으로 밝혀졌다. 서열 번호 5를 포함하는 빈대 단백질 1-BBP1은 시멕스 렉툴라리우스의 배설물 및 탈피, 알, 성충 및 제1 ∼ 제5 령 형태에 존재하는 것으로 밝혀졌다.

본 발명에 따라, 단백질 또는 폴리펩티드 서열의 변이체 또는 단편은 보존적 치환 또는 변형을 포함하여 단백질의 면역원 특성을 유지한다. 또한, 또는 별법으로, 변이체는 폴리펩티드의 항원 특성에 최소한의 영향을 미치는 아미노산의 결실 또는 첨가를 포함하는 다른 변형을 포함할 수 있다.

천연 알껍질(ESP 단백질)과 빈대 단백질 1(BBP1 단백질) 단백질은 분별 단백질 추출법으로 정제하고 항체 특이성에 대해 웨스턴 블롯 방법으로 확인하였다.

단백질에서 항체 에피토프 영역을 확인하였고, 신규한 시멕스 렉툴라리우스 단백질에 특이적인 단클론 항체와 다클론 항체 둘 다를 사용하여 민감한 검출 분석법을 개발하였다. 신규 단백질의 분리 및 확인과 신규 단백질에 대한 항체의 생성은 샘플 중의 빈대의 검출에 가능한 용도를 제공한다. 이 분석법을 사용하여 모든 생활 단계에서 시멕스 렉툴라리우스의 존재를 검출할 수 있다.

단백질에 대해 생성된 항체의 민감도는 매우 높다고 확인되었다. 항체는 샘플에서 20 μg/㎖ 미만인 항원 농도 수준을 검출할 수 있었다. 항체는 1-3 μg/㎖ 정도로 낮은 항원 농도 수준을 검출할 수 있다.

신규 단백질의 항체 에피토프 영역에 대해 생성된 항체를 사용하여 분석 시스템을 개발하였다.

본 발명의 항체를 사용하는 검출 분석법은 많은 지역에서 유용하게 적용된다. 항체를 사용한 검출 분석법은 샘플 중의 빈대의 존재 또는 부재를 신속하고 쉽게 결정하도록 한다. 국내 사용자 또는 호텔은 환경에 빈대가 없음을 확실하게 확인할 수 있을 것이다. 마찬가지로 개별 여행자는 호텔 방이나 침대에 빈대가 없는지 확인하기 위해 사용하기 쉬운 분석 키트를 휴대할 수 있을 것이다. 신속하고 쉬운 판독 결과를 보이는 검출 분석 키트를 갖는 것은 환경에 빈대의 존재 또는 부재를 신속하게 결정하는데 매우 유용할 것이다. 예를 들어 ELISA 분석법 또는 측방 유동 검사 또는 임의의 다른 신속 분석 플랫폼과 같은 다양한 유형의 검출 분석법이 개발될 수 있다. 본 발명의 항체는 배열, 나노 입자 또는 막 위에 항체가 있는 표면이 제공되고/거나 현탁액 형식으로 제공되는 분석 형식 내에 이용될 수 있다.

딥 스틱 테스트(dipstick test) 형태의 측방 유동 면역 크로마토그래피 검출 방법은, 빈대의 존재를 검출하기 위해 이용되었으며 신속하고 매우 민감한 검출 방법을 제공하는 것으로 밝혀졌다(도 28). 이용시 샘플은 테스트하는 영역에서 채취하여 희석액에 넣을 수 있다. 단클론이 부착된 샘플 패드를 샘플 희석액에 담그어 선이 보이면 빈대의 존재를 나타내는 것이다.

샘플 중의 빈대의 존재를 검출하기 위해 본원에 개시된 항체를 사용하기 위한 다른 포맷은 당업자에게 명백할 것이다.

빈대에 대한 알레르기의 발생은 증가하고 있으며 심각한 불쾌감을 일으키고 건강이 나빠지게 할 수 있다. 반복적인 노출로 빈대 물림에 대한 민감도가 증가하는 것처럼 보이지만, 물림과 이의 후속 반응은 종종 오진된다. 어떤 사람이 빈대에 대해 특이적 알레르기가 있는지를 결정할 수 있는 능력은 매우 중요할 것이다.

본 발명의 신규 단백질은 알레르겐 테스트에 사용될 수 있음이 확인되었다. 빈대 단백질은 물림 또는 노출 후에 IgE 면역 반응을 유도한다. 이 반응은 웰트(welt) 및 천식을 포함하는 많은 다양한 증상을 일으킬 수 있다. 피부 단자 테스트(SPT: skin prick testing)는 특정 알레르겐에 대한 알레르기 반응을 입증한다. 본 발명의 신규 단백질을 사용하는 SPT를 사용하여 빈대에 대한 알레르기가 있음을 확인할 수 있다. 구체적인 진단은 치료법 선택에 도움을 줄 것이며 회피를 통해 증상의 재발을 방지하는데도 도움이 될 것이다.

본 발명은 하기 실시예에 의해 추가로 예시될 것이다.

실시예 1 - 시멕스 렉툴라리우스 알에서 천연 ESP 추출

급식 3일 후에 빈대 알을 수집하여 부화하도록 하였다. 부화된 알을 요소 용해 완충액(8M 요소, 2M 티오요소, 25mM 트리스(Tris), pH8.0, 150mM NaCl, 1mM EDTA, 1mM EGTA 및 1% 트리톤 X-100)에 재현탁하고 1분 버스트로 3회 초음파 처리하였다. 샘플을 27000 x g에서 10분 동안 원심분리하여 샘플의 가용성 및 불용성 분획을 분리하였다.

250개의 알로부터 얻은 천연 단백질의 생산량은 전체 정제된 천연 단백질 약 6.2 mg이었다.

실시예 2 - 시멕스 렉툴라리우스 전신 및 탈피물로부터 천연 BBP1 추출

빈대 사체 및 탈피물을 요소 용해 완충액(8M 요소, 2M 티오요소, 25mM 트리스, pH8.0, 150mM NaCl, 1mM EDTA, 1mM EGTA 및 1% 트리톤 X -100)에 재현탁하고 1분 버스트로 5분 동안 볼텍스하였다. 샘플을 27000 x g에서 10 분 동안 원심분리하여 샘플의 가용성 및 불용성 분획을 분리하였다.

10개의 탈피물로부터 얻은 천연 단백질의 수율은 전체 정제된 천연 단백질 중 약 30 μg이었다.

추출하여 단리된 신규 단백질은 PBS 단독으로 성공적으로 추출되지 않기 때문에 불용성 단백질임이 확인되었다. 두 단백질 모두가 완전히 용해되기 위해서는 계면활성제의 사용이 요구된다.

실시예 3 - 생쥐 단클론 항체( mAb : monoclonal antibody)의 생성 및 클론의 선택

빈대 알껍질 단백질 에피토프(ESP) 1- 서열 번호 2 및 3- 서열 번호 3에 대한 6가지 생쥐 IgG 단클론 항체(mAb) 및 빈대 단백질 1 에피토프 1(BBP1) - 서열 번호 6 및 2 - 서열 번호 7에 대한 4가지 생쥐 IgG mAb를 생쥐 하이브리도마 세포주(GenScript USA Inc.에서 상업적으로 생성)로부터 생산하였다. mAb ESP-3에 대한 두 클론을 결합하여 면역 반응의 민감도를 크게 증가시켰다. 선택된 단클론 항체에 대한 표는 도 1 및 2에 나타낸다.

하이브리도마 세포를 T175 조직 배양 플라스크에서 10% FBS를 포함하는 DMEM + L 글루타민 + 항생제 보충제에서 증식하였으며, 하이브리도마 세포가 안정되면, 10% FBS를 2% FBS로 감소시켰다. 하이브리도마 세포는 배지가 황색으로 변하고 세포가 사멸할 때까지(∼ 2주) 항체 생산을 위해 배양하였다. 4℃에서 최대 속도(4300 x g)에서 30분 동안 원심분리하여 상등액을 수집하였다.

mAb는 4℃에서 하룻밤 황산 암모늄 침전(50%)에 의해 하이브리도마 세포 상등액으로부터 정제하였다. 침전된 항체를 PBS에 재현탁하고 투석/완충액 교환하여 염을 제거하였다. 하이 트랩 단백질 G 컬럼(GE Healthcare)을 제조사의 지시에 따라 사용하여 mAb ESP-1 [4B9E7], mAb ESP-3 [4D1B8 & 10B9F9], mAb BBP1-1 [5D3E8] 및 BBP1-2 [10B1C5]를 추가로 정제하였다. 간략하게, 투석된 황산 암모늄 침전된 mAb를 0.45 ㎛ 필터를 통해 여과하였다. 그 후 이를 1ml 단백질 G 컬럼(GE Healthcare)에 통과시켰다. 컬럼으로부터 결합되지 않은 단백질을 PBS로 씻어냈다(5배 컬럼 부피 x 3회). mAb를 글리신-HCl(0.1 M, pH = 6.5)로 용리하고 농축한 후 4℃에서 PBS(pH = 7.5)에 대해 하룻밤 투석하였다. 정제 공정 중에 흡광도는 AKTA 스타트(AKTA Start) FLPC 시스템을 사용하여 280 nm의 파장에서 모니터하였다. 정제된 mAb의 농도는 OD 280nm에서 계산하였다.

도 3은 단백질 G 컬럼 상 ESP에 대해 정제된 단클론 항체 (a) mAb ESP-1 및 (b) mAb ESP-3의 용리를 나타낸다. 도 4는 단백질 G 컬럼 상 BBP1에 대해 정제된 단클론 항체 (a) mAb BBP1-1 및 (b) mAb BBP1-2의 용리를 나타낸다.

mAb의 순도는 환원 및 비환원 조건하에서 SDS-PAGE로 평가하였다. 도 5는 mAb ESP-1 및 mAb 항체 ESP-3 정제 SDS-PAGE를 나타낸다. 도 6은 mAb BBP1-1 및 mAb BBP1-2 정제 SDS-PAGE를 나타낸다.

실시예 4 - 다클론 항체의 생성

ESP 단백질에 대한 다클론 항체는 GenScript USA Inc.에서 상업적으로 생성하였다. 간략하게, ESP, 서열 번호 2를 포함하는 ESP-1 및 서열 번호 3을 포함하는 ESP-3, 및 BBP1에 대해 하나의 펩티드, 서열 번호 7을 포함하는 BBP1-2를 생성하였다. 펩티드를 운반 단백질에 접합하여 펩티드당 2마리의 토끼를 면역화하는데 사용하였다. 다클론 항체는 친화성 정제하고 ELISA에 의해 확인하였다.

도 7 (a)는 SDS-PAGE 단백질 겔 상에서 이동시킨 정제된 천연 ESP 단백질을 나타낸다. 도 7 (b)는 ESP 단백질을 확인하기 위해 토끼 다클론 항체 항-ESP-3을 사용하여 프로빙된 웨스턴 블롯이다.

실시예 5 - ESP-1 [ 4B9E7 ] mAb의 비오티닐화

ESP에 대한 단클론 항체를 비오티닐화하여 ESP 단백질에 대한 항체 신호를 증폭하였다.

정제된 mAb ESP-1 [4B9E7]을 2-8℃에서 여러 번 교환한 탄산 완충액[0.1% NaN₃ 함유 0.1M 탄산나트륨 완충액(NaHCO₃/Na₂CO₃) pH 9.5]에 대해 투석하였다. 투석 후, 단백질 농도를 2 mg/㎖로 조정하였다. NHS-D-비오틴(Sigma)을 사용하기 직전에(빛으로부터 용액을 보호하기 위해) DMSO에 2 mg/㎖의 농도로 용해하였다. 면역글로불린 용액의 전체 부피의 10%에 해당하는 부피를 사용하여, NHS-D-비오틴 용액을 서서히 교반하면서 단클론 항체 용액에 나누어 첨가하고, 이를 실온에서 4 시간 동안 로터리 휠에서 인큐베이션하였다. 반응 용액을 4℃에서 여러 번 교환한 PBS 완충액(0.01M 인산나트륨, 0.15M 염화나트륨, pH 7.4, 0.1 % NaN₃ 함유)에 대해 투석하여 결합되지 않은 비오틴을 제거하였다. 투석 후 비오티닐화 mAb ESP-1 [4B9E7]는 -20℃의 어두운 곳에 보관하였다(비오틴이 빛에 민감하기 때문).

비오티닐화 효율은 도트 블롯 분석을 통해 확인하였다(도 8). 비오티닐화가 단클론 항체의 효율을 향상시키는 것을 확인하였다.

실시예 6 - 최적의 코팅 농도를 결정하기 위한 포획 ELISA

96 웰 ELISA 플레이트를 50mM 탄산 완충액 pH 9.6에 100㎕/웰로 연속 희석된 mAb ESP-1 또는 mAb ESP-3(20 - 0.312 ㎍/㎖)으로 코팅하고 실온에서 하룻밤 인큐베이션하였다. 코팅된 ELISA 플레이트를 PBST(PBS + 0.05% 트윈(Tween)-20)로 3회 세척하고 실온에서 2시간 동안 차단하였다(탄산 완충액 pH 9.6 중 10% 수크로오스, 1% BSA). 세척 후, 염소 항-생쥐 항체를 1/4000로 희석하여 100㎕/웰로 첨가하고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. ELISA 플레이트를 PBST로 4회 세척하고, 100㎕/웰의 울트라 TMB ELISA 검출 시약을 사용하여 가시화하였다. 5분 후에 H₂SO₄를 사용하여 반응을 정지시켰다. 450nm 및 630nm에서의 흡광도를 측정하여 델타 OD 값을 계산하는데 사용하였다(도 9)

실시예 7 - BBP1 다클론 경쟁 ELISA를 사용하여 시멕스 렉툴라리우스 전체 곤충 및 탈피물을 검출하기 위한 분석

BBP1 비오티닐화

BBP1 펩티드(서열 번호 7)를 EZ-링크 설포-NHS 비오틴(Thermo fisher)으로 제조사의 지시에 따라 비오티닐하였다. 간략하게, BBP1 펩티드를 20배 과량의 설포-NHS 비오틴과 혼합하고 실온에서 30분 동안 회전시키면서 인큐베이션하였다. 그 후 샘플을 C18 컬럼(Pierce)에 통과시켜 반응된 BBP1-비오틴으로부터 유리 비오틴을 제거하였다.

BBP1 ELISA를 위한 샘플 추출

5개 탈피물, 5마리 빈대 사체 및 1cm의 배설물 휴지를 500㎕의 TBS 식염수(25mM 트리스, 150mM NaCl, pH 7.2, 0.1% BSA, 0.05% 트윈 20)에서 2.5 시간 동안 회전시키면서 인큐베이션하였다. 샘플을 그대로 사용하였다.

경쟁 ELISA

뉴트라비딘(Neutravidin) 플레이트(Pierce)는 제조사의 지시에 따라 사용하였다. 상기 ELISA 플레이트를 트리스 완충 식염수(25mM 트리스, 150mM NaCl, pH 7.2, 0.1 % BSA, 0.05 % 트윈 20) 중의 BBP1- 비오틴 펩티드(2.5 ㎍/㎖) 100㎕로 코팅하고, 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. ELISA 플레이트를 TBS로 3회 세척한 후 50㎕의 펩티드(다양한 농도) 또는 샘플(순수한) 및 50㎕의 항-BBP1 다클론 항체(최종 500ng/㎖ 또는 1 ㎍/㎖)를 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하고 3회 세척한 후, 1/2500로 희석된 항-토끼-HRP 100㎕를 첨가하였다. TMB ELISA 검출 시약을 사용하여 신호를 가시화하고 5분 후에 H₂SO₄를 사용하여 반응을 정지시켰다. 델타 OD는 450nm 및 630nm에서의 흡광도를 측정하여 수집하였다.

분석은 낮은 수준의 BBP1 단백질을 검출할 수 있었다. BBP1 항체는 합성된 BBP1 펩티드를 2.5 ㎍/㎖ 정도로 낮은 수준에서 검출할 수 있었다(도 10). 또한, BBP1 항체는 배설물 휴지, 탈피물 및 빈대 사체로부터 추출한 순수한 샘플에서 천연 BBP1 단백질을 검출할 수 있었다(도 11).

실시예 8- 재조합 단백질 정제

ESP 및 BBP1(rtESP 및 rtBBP1) 절단된 단백질의 유전자를 g 블록(통합 DNA 기술)으로서 생성하고 pET32a 벡터에 클로닝하였다. 단백질은 rtESP-pET32a일 경우 오리가미(origami)(DE3)pLysS(novagen) 또는 rtBPP-pET32a 세포일 경우 BL21(DE3)pLysS(novagen)에서 제조사의 지시에 따라 발현하였다. 재조합 단백질은 봉입체에서 발현되었다. 세균 펠렛을 용해 완충액(5% 트리톤 X-100, 0.1mM PMSF, 인산 완충액(250 mM 인산염, pH 8.0, 300mM NaCl)에 재현탁하고 용해물이 투명해질 때까지 50% 최대 동력(사이클론(Syclon), 초음파 균질기)으로 초음파 처리하였다. 봉입체를 27000 x g에서 15분 동안 펠렛화한 후, 세척 완충액 I(50mM 트리스, pH 8.0, 0.5% 트리톤 X-100, 1mM DTT 인산 완충액)에서 1회 세척한 후 세척 완충액 II(50mM 트리스, pH 8.0, 1mM DTT, 인산 완충액)에서 세척하였다. 그 후 단백질 펠릿을 단백질 재현탁 완충액(6M GuHCl, 10mM 이미다졸, 인산 완충액)에 재현탁하였다.

rtBBP1을 mAb BBP1-1 CNBr 세파로스 컬럼을 사용하여 추가로 정제하였다. rtBBP1 현탁액을 컬럼에 통과시키고 10배 컬럼 부피의 PBS로 세척하였다. 100mM 글리신 pH 3에서 컬럼으로부터 단백질을 용리하고 1M 트리스(pH 8.0)로 완충시켰다.

실시예 9 - 천연 ESP 및 BBP1의 농축 및 검출

TSA(10mM 트리스, pH 8.0, 140mM NaCl) 중 mAb ESP-3/mAb BBP1-1 CNBr 세파로스 컬럼을 사용하여 빈대 알 용해물 및 빈대 전체 용해물로부터 천연 ESP와 BBP1 단백질을 면역침전시켰다. 결합되지 않은 단백질은 세척 완충액(500mM NaCl, 10mM 트리스 pH8.0, 1% 트리톤 X-100, 1% 소듐 데옥시콜레이트, 0.1% SDS) 및 TSA로 비드를 6회 세척하여 제거하였다. 농축된 샘플을 환원 조건하에서 12.5% SDS-PAGE에서 분리하였다. 단백질 샘플을 니트로셀룰로스 막 위로 옮겼다.

니트로셀룰로오스 막은 PBST 중 5% 분유로 차단하였다. 1/1000로 희석된 mAb ESP-1 또는 mAb BBP1-1로 막을 1시간 동안 프로빙하였다. 니트로셀룰로오스 막을 PBST로 3회 세척한 후, 1/2000로 희석된 항-생쥐-HRP로 1시간 동안 프로빙하였다. PBST로 막을 3회 세척하고 DAB(3,3'-디아미노벤지딘) 기질로 신호를 가시화하였다.

천연 및 재조합 절단된 ESP의 검출 결과는 도 12에 나타낸다. 화살표는 36.3kDa에서 천연 ESP 단백질과 40kDa에서 rtESP를 나타낸다.

천연 및 재조합 절단된 BBP1의 검출 결과는 도 13에 나타낸다. 화살표는 63kDa에서 천연 BBP1 단백질과 39kDa에서 rtBBP1을 나타낸다.

실시예 10 - ESP 및 BBP1 단백질에 대한 단클론 항체의 교차 반응성 및 항체 특이성을 결정하기 위한 면역 블롯

ESP 및 BBP1에 대한 단클론 항체의 교차 반응성은 국내 환경과 관련된 다양한 곤충과 이들의 알에 대해 확인하였다. 곤충을 모은 후 액체 질소에서 동결하여 막자와 막자사발로 분쇄하였다.

분쇄된 용해물을 요소 용해 완충액 및 프로테아제 억제제, pH8에 재현탁하였다. 2시간 동안 부드럽게 혼합하여 단백질을 추출하였다. 이어서 용해물을 27,000 x g에서 원심분리하여 가용성 상등액을 제거하였다. 가용성 상등액을 제거하고 스핀 필터 컬럼을 통해 여과하였다. 브래드 포드(Bradford) 분석법에 의해 단백질 농도를 결정하고 저분자량 컷-오프(cut-off)를 갖는 센트리콘 장치를 사용하여 묽은 단백질 용해물을 농축하였다. 그 후 샘플을 12.5% SDS-PAGE 겔에 로딩하고 환원 조건하에서 이동시켰다. 그 결과는 도 14 (a)에 나타낸다.

전기영동 후, 정제된 mAb 각각으로 프로빙하기 위해 단백질을 니트로셀룰로오스 막 위로 옮겼다.

니트로셀룰로오스 막은 PBST 중 5% 분유로 차단하였다. 1/1000로 희석된 mAb ESP-1, mAb ESP-3, 및 1/2000로 희석된 mAb BBP1-1 및 mAb BBP1-2로 1시간 동안 막을 프로빙하였다. 니트로셀룰로오스 막을 PBST로 3회 세척한 후, 1/2000로 희석된 항-생쥐-HRP로 1시간 동안 프로빙하였다. 막을 PBST로 3회 세척하고 DAB(3,3'-디아미노벤지딘) 기질로 신호를 가시화하였다.

도 14 (b)는 mAb ESP-1로 프로빙한 결과를 나타낸다. 도 14 (c)는 mAb ESP-3으로 프로빙한 결과를 나타낸다. 화살표는 36.3 kDa에서 천연 ESP 단백질을 나타낸다.

단클론 항체는 할란 주 빈대 전체 알 용해물과 런던 실험실 주 빈대 전체 알 용해물(도 14 (b) 및 (c) 레인 4 및 5) 둘 다에 매우 특이적이라는 것이 확인되었다. 테스트한 다른 알과 교차 반응은 확인되지 않았다.

실시예 11 - BBP1 단백질에 대한 단클론 항체의 교차 반응성 및 항체 특이성을 결정하기 위한 면역 블롯

앞의 실시예에서와 같이 BBP1에 대한 단클론 항체의 교차 반응성을 국내 환경과 관련된 다양한 곤충에 대해 확인하였다.

도 15 (a)는 12.5% SDS-PAGE 겔에서 환원 조건하에서 이동시킨 샘플을 나타낸다. 도 15 (b)는 mAb BBP1-1로 프로빙한 결과를 나타낸다. 도 15 (c)는 mAb BBP1-2로 프로빙한 결과를 나타낸다. 화살표는 63kDa에서 천연 BBP1 단백질을 나타낸다.

단클론 항체는 할란 주 빈대 전체 곤충 용해물과 탈피물의 용해물 및 런던 실험실 주 빈대 전체 용해물과 탈피물의 용해물 모두에 특이적으로 확인되었다(도 15 (b) (c) 레인 2 내지 5). 테스트한 다른 곤충의 다른 용해물과 교차 반응성은 전혀 확인되지 않았다.

실시예 12 - 다양한 지역의 시멕스 렉툴라리우스 및 시멕스 헤미프테루스의 검출을 조사하기 위한 면역 블롯 .

다양한 시멕스 렉툴라리우스 빈대 및 다양한 지역으로부터와 열대 케냐 빈대 종(시멕스 헤미프테루스)으로부터 수집한 빈대 알을 요소 용해 완충액에서 이전에 기재한 바와 같이 추출하였다. 샘플을 27000 x g에서 10분 동안 원심 분리하여 가용성 및 불용성 샘플 분획을 분리하였다. 가용성 분획의 농도는 브래드포드 분석법에 의해 결정하였고, 모든 샘플을 동일한 농도로 희석하고 환원 조건하에서 12.5% SDS-PAGE에서 분리하였다. 단백질을 니트로셀룰로오스 막 위로 옮기고 웨스턴 블롯을 전술한 바와 같이 수행하였다.

ESP에 대한 환원 조건하의 SDS-PAGE 결과는 도 16 (a)에 나타낸다. mAb ESP-1을 사용한 검출을 보여주는 웨스턴 블롯은 도 16 (b)에 나타내고 mAb ESP-3을 사용한 것은 도 16 (c)에 나타낸다. 화살표는 36.3 kDa에서 천연 ESP 단백질을 나타낸다.

BBP1에 대한 환원 조건하의 SDS-PAGE 결과는 도 17 (a)에 나타낸다. mAb BBP1-1을 사용한 검출을 보여주는 웨스턴 블롯은 도 17 (b)에 나타내고 mAb BBP1-2를 사용한 것은 도 17 (c)에 나타낸다. 화살표는 63kDa에서 천연 BBP1 단백질을 나타낸다.

놀랍게도, 단클론 항체는 시멕스 렉툴라리우스뿐 아니라 시멕스 헤미프테루스에서 ESP 및 BBP1에 특이적인 것으로 확인되었다(도 16, 레인 6 및 도 17, 레인 8).

실시예 13 - 현장 실험

호텔 객실을 복제하기 위해 환경 테스트 챔버를 설치하였으며, 침대, 침대 옆의 사물함과 의자를 포함하였다. 연구 기간 동안 챔버의 온도(23℃)와 상대 습도(45% ± 5%)를 제어하였다. 급식한 빈대(혼합된 생활 단계)를 주 1회 간격으로 챔버에 넣었다. 활발한 침입의 급격한 효과를 모니터하기 위해 연속적으로 매주 빈대 수를 두 배로 넣었다. 1주일 후에 챔버에 인공 공급 장치를 도입하여 챔버 내에서 빈대가 한 번 먹이를 먹도록 하였다. 연구 24, 48시간 및 1, 2, 3, 4주째에 알려진 빈대 활동 지역에서 진공 샘플을 채취하였다.

실시예 14 - 포획 ELISA

96 웰 ELISA 플레이트를 50mM 탄산 완충액 pH 9.6 중 mAb ESP-3 또는 mAb BBP1-1(50μg/㎖) 100㎕/웰로 코팅하고 4℃에서 하룻밤 인큐베이션하였다. 코팅된 ELISA 플레이트를 PBST(PBS + 0.05% 트윈-20)로 3회 세척하고 실온에서 2시간 동안 차단하였다(탄산 완충액 pH 9.6 중 10% 수크로오스, 1% BSA). 추출된 빈대 샘플을 PBST, 1% BSA에 ¼로 희석한 후 ELISA 플레이트에 연속 희석(1:2)하고 플레이트 쉐이커 플랫폼 위 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세척 후, 1/500로 희석한 mAb ESP-1-HRP 또는 mAb BBP1-2-HRP 항체를 100㎕/웰로 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. ELISA 플레이트를 PBST로 3회 세척하고, 100㎕/웰의 울트라 TMB ELISA 검출 시약을 사용하여 가시화하였다. 10분 후에 H₂SO₄를 사용하여 반응을 정지시켰다. 450nm 및 630nm에서의 흡광도를 측정하여 델타 OD 값을 계산하는데 사용하였다.

rtESP 단백질의 표준 곡선은 도 18에 나타낸다. nESP ELISA 적정 및 rtESP와의 상관 관계는 도 19에 나타낸다. 검출 한계(LOD: limit of detection)를 보여주는 ELISA의 결과는 도 20에 나타낸다. 항체는 10μg/㎖ 미만의 농도로 존재하는 ESP 단백질을 검출할 수 있었다. 이 분석법은 1 내지 2개 정도로 적은 빈대 알을 함유한 샘플에서 ESP 단백질을 검출할 수 있었다(도 21).

ELISA를 사용하여 다양한 시기에 제어된 챔버 내에서의 빈대 알의 검출 결과는 도 22에 나타낸다.

rtBBP1 단백질의 표준 곡선은 도 23에 나타낸다. nBPP1 ELISA 적정 및 rtBBP1과의 상관관계는 도 24에 나타낸다. 곤충 탈피물에 의한 검출 한계(LOD)를 보여주는 ELISA의 결과는 도 25에 나타낸다. 항체는 10 ㎍/㎖ 미만의 농도로 존재하는 BBP1 단백질을 검출할 수 있었다. 이 분석법은 빈대로부터의 1개 정도로 적은 탈피물을 함유한 샘플에서 BBP1 단백질을 검출할 수 있었다(도 26).

ELISA를 사용하여 다양한 시기에 제어된 챔버 내에서 빈대의 검출 결과는 도 27에 나타낸다.

실시예 15 - 라텍스 - mAb 접합체의 생성:

10% w/v 용액 내 400nm의 카르복실화된 마이크로스피어 100 ㎕를 활성화 완충액(50 mM MES pH6.0)으로 3회 세척하였다. 마이크로스피어 카르복실기를 4.8 mM 1-에틸-3-[3-디메틸아미노프로필]카르보디이미드(EDC) 및 48 mM N-히드록시술포숙신이미드(술포-NHS)로 실온에서 30분 동안 활성화하였다. 그 후, 마이크로스피어를 활성화 완충액으로 2회 세척한 후 활성화 완충액 중 50mg/g의 항체(mAb ESP-1 또는 mAb BBP1-2)를 첨가하였다. 마이크로스피어:항체 용액을 4℃에서 하룻밤 혼합하였다. 1% 마이크로스피어 용액을 30 ㎕의 에탄올아민으로 실온에서 30분 동안 켄칭한 후, 실온에서 차단 완충액(50 mM 트리스, pH 8.0 및 1% 카세인)으로 3시간 동안 회전시키면서 차단하였다. 차단 완충액을 사용하여 2회 세척한 후, 마이크로스피어를 차단 완충액에 최종 농도 1%로 재현탁하였다. 마이크로스피어는 단분산 입자를 보장하기 위해 공정 중에 일정 간격으로 초음파 처리하였다.

상이한 농도의 항체를 마이크로스피어에 적용할 수 있으며, ESP 및 BBP1 단백질에 대해 상이한 항체를 사용할 수 있다. 상기 방법은 항체 농도 수준을 증가시키는 BSA 결합 단계의 첨가에 제한되지 않는다.

실시예 16 - 측방 유동 테스트 준비

측방 유동 테스트는 카세트 또는 다른 신속 검출 형식에 사용될 수도 있는 딥 스틱 모델로 이루어진다. 하이플로우 플러스(HiFlow plus) 막(Millipore)을 막 지지 카드에 부착하고 테스트 라인의 mAb ESP-3(5 mg/㎖, 2.5 mg/㎖, 1 mg/㎖) 또는 mAb BBP1-1(6 mg/㎖, 3㎎/㎖, 1㎎/㎖)의 대조군 라인의 항-생쥐(250㎍/㎖)의 대조 주로 분무하였다.

상기한 바와 같이 제조된 라텍스 접합체(mAb ESP-1 및 mAb BBP1-2)를 접합 완충액(2% 생선 피부 젤라틴, 1% 수크로오스, 1% 트리톤 X-100, 1% 트윈 20, 1.5 mg/㎖ PEG 4000)에 0.05% - 0.1%의 농도로 희석한 후 유리 섬유 막에 도포하고 37℃에서 72시간 동안 건조하였다. 또한, 유리 섬유 막을 샘플 패드로서 사용하여 접합체 완충액으로 전처리하고 접합체 패드와 동일한 조건하에서 건조하였다.

측방 유동 테스트는 분무된 막의 상단부 위에 흡수 패드를 그리고 분무된 막의 하단부 위에 접합체 패드를 약간 겹치게 하여 구성하였다. 샘플 패드는 테스트의 하단부에서 접합체 패드와 약간 겹친다. 막을 37℃에서 24시간 동안 건조한 후 75mm x 4mm 테스트 스트립으로 절단하였다. 빈대 챔버 샘플과 알 용해물에 대해 측방 유동 스트립을 테스트하였다. 대조군으로 요소 용해 완충액을 사용하였다. 양성 결과는 도 28 (a) - ESP 및 도 28 (b) - BBP1에 나타낸다.

다른 샘플링 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들어 테스트 부위의 스왑(swab) 또는 와이프(wipe)를 취한 다음 그 스왑 또는 와이프를 측방 유동 스트립이 잠긴 희석액에 첨가할 수 있다.

실시예 17 - 금 - mAb 접합체의 생성:

측방 유동 테스트에 사용하기 위해 금-mAb 접합체를 제조하였다.

완충되지 않은 콜로이드 금을 pH 7.5로 완충시킨 후 10 ㎍/㎖의 mAb(mAb ESP-3)를 용액에 첨가하고 2시간 동안 회전시켰다. 금 mAb 접합체를 BSA 차단 용액으로 실온에서 2시간 동안 차단하였다. 금 mAb 접합체를 광범위하게 세척하였다.

금 mAb 접합체(mAB ESP-3)는 접합 완충액(2% 생선 피부 젤라틴, 1% 수크로오스, 1% 트리톤 X-100, 1% 트윈 20, 1.5 mg/㎖ PEG 4000, 1.5 mg/㎖ PVPK-30) 중에 1.5-2.5의 OD 범위로 사용한 후, 유리 섬유 막에 도포하고 37℃에서 72시간 동안 건조하였다. 또한, 유리 섬유 막을 샘플 패드로서 사용하여 접합체 완충액으로 전처리하고 접합체 패드와 동일한 조건하에서 건조하였다.

실시예 18- 알레르겐 테스트

rtBBP1은 적정 농도(4 μg/㎖, 2 μg/㎖, 1 μg/㎖, 0.5 ㎍/㎖)로 니트로셀룰로오스 막 위에 도트를 형성하였으며, 대조군으로 BSA(0.5 mg/㎖)을 사용하였다. 니트로셀룰로오스 막은 PBST 중 5% 분유로 차단하였다. 막을 1/1000로 희석된 mAb BBP1-1 또는 인간 혈청으로 2시간 동안 프로빙하였다. 니트로셀룰로오스 막을 PBST로 3회 세척한 후, 1/2000로 희석된 항-생쥐-HRP 또는 1/500로 희석된 항-인간 IgE-페록시다아제로 1시간 동안 프로빙하였다. 막을 PBST로 3회 세척하고 DAB(3,3'-디아미노벤지딘) 기질로 신호를 가시화하였다. 도트 블롯의 결과는 도 29에 나타낸다.

본 발명은 매우 낮은 농도 수준의 시멕스 렉툴라리우스 및 시멕스 헤미프테루스 둘 다를 검출할 수 있는 다클론 및 단클론 항체를 제공한다. 단클론 항체는 빈대에 특이적인 항원을 검출하기 위한 사용 현장 분석(point-of-use assay)에 유용하게 적용된다. 분석 방법은 ELISA 분석법 또는 측방 유동 면역 크로마토그래피 테스트를 포함할 수 있다. 사용자는 어떤 부위를 진공 청소하거나, 스왑하거나 와이프하여 샘플을 판독기에 삽입할 수 있다. 매우 낮은 빈대 개체수를 검출할 수 있다. 선택적인 시약은 수집 장치의 빈대 샘플을 용해하는 용액을 포함할 수 있다.

본 발명이, 단지 예로서 제시되어 있는, 본원에 기재된 특정 세부사항에 한정되지 않는다는 것과, 첨부된 청구범위에 정의된 바와 같은 본 발명의 범위를 벗어나지 않으면서 다양한 변경 및 변형이 가능하다는 것이 물론 이해될 것이다.

SEQUENCE LISTING <110> Airmid Healthgroup Ltd <120> Novel proteins and detection methods <130> P15641 <160> 8 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 363 <212> PRT <213> Cimex lectularius <400> 1 Met Ile Ile Phe Ala Leu Ala Ala Leu Gln Leu Ala Ala Gly Cys Val 1 5 10 15 Tyr Gln Gly Thr Asp Ala Gly Tyr Ala Asn Asp Ala Thr Tyr Phe Asn 20 25 30 Gly Val Ala Asn Gly Leu Asn Thr Val Ser Asn Asp Phe Asn Gly Val 35 40 45 Ala Thr Gly Phe Asn Gly Val Ala Thr Gly Phe Asn Gly Val Ala Thr 50 55 60 Gly Phe Asn Gly Val Ala Thr Gly Phe Asn Gly Val Ala Thr Gly Phe 65 70 75 80 Asn Gly Val Ala Thr Gly Phe Asp Gly Val Ala Thr Asp Leu Asn Gly 85 90 95 Val Ser Thr Gly Phe Val Asn Ala Ala Pro Ala Thr Asp Ala Val Asp 100 105 110 Tyr Val Ala Gly Asn Asn Leu Asp Gly Val Ala Ser Gly Phe Val Asp 115 120 125 Asn Ala Ala Gly Tyr Tyr Asn Ala Pro Thr Thr Cys Leu Thr His Arg 130 135 140 Leu Glu Gln Val Val Arg Pro Val Val Asp Glu Cys Val Arg His Val 145 150 155 160 Pro Val Val Arg Lys Thr Val Arg His Gln Glu Glu Gln Phe Thr Arg 165 170 175 His Val Pro Val Val Glu Lys Thr Val Ser Gln Gln Glu Glu Lys Phe 180 185 190 Val Arg His Val Pro Val Val Gln Lys Tyr Thr Arg Pro Val Val Glu 195 200 205 Thr Arg Thr His His Val Pro Val Val Lys His Arg Thr Lys Thr Val 210 215 220 Val Glu Pro Tyr Thr Asp His Val Pro Val Thr Glu Lys Tyr Thr Arg 225 230 235 240 Pro Val Glu Glu Thr Val Val Arg Thr Val Pro Val Val Glu Arg Arg 245 250 255 Thr Lys Pro Val Val His Gln His Val Arg His Val Pro Val Thr Glu 260 265 270 Arg Arg Ser Arg Pro Val Val Glu Ser His Val Thr Thr Val Pro Val 275 280 285 Lys Gln Arg Phe Val Lys Asn Leu Val Glu Gln Arg Val Arg Ser Ser 290 295 300 Ser Asn Pro Cys Ala Pro Cys Pro Pro Gly Phe Tyr Ser Gly Val Glu 305 310 315 320 Gly Tyr Ala Pro Ala Ser Tyr Ala Thr Ser Ser Phe Ala Ala Pro Ala 325 330 335 Leu Gly Asp Val Tyr Thr Gly Ser Phe Ala Gly His Ala Thr Glu Thr 340 345 350 Leu Pro Ala Thr Tyr Asn Thr His Ala Thr Cys 355 360 <210> 2 <211> 14 <212> PRT <213> Cimex lectularius <400> 2 Arg His Val Pro Val 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Glu Ser His Val Thr Thr Val Pro Val Lys 165 170 175 Gln Arg Phe Val Lys Asn Leu Val Glu Gln Arg Val Arg Ser Ser Ser 180 185 190 Asn Pro Cys Ala Pro Cys Pro Pro Gly Phe Tyr Ser Gly Val Glu Gly 195 200 205 Tyr Ala Pro Ala Ser Tyr Ala Thr Ser Ser Phe Ala Ala Pro Ala Leu 210 215 220 Gly Asp Val Tyr Thr Gly Ser Phe Ala Gly His Ala Thr Glu Thr Leu 225 230 235 240 Pro Ala Thr Tyr Asn Thr His Ala Thr Cys 245 250 <210> 5 <211> 651 <212> PRT <213> Cimex lectularius <400> 5 Met Leu Val Val Leu Ser Leu Ala Leu Val Ala Leu Ala His Ala Gly 1 5 10 15 Gly Pro Ala His Tyr Arg Thr Ala Ser Gly Ala Val Gly Val Leu Asp 20 25 30 Gly Ser Leu Gly Gln Thr His Glu Glu Thr Gln Lys Gly Tyr Ala Gly 35 40 45 Asp Ser Val Ser Gln Phe Thr Ser Asn Val Gln Gly Ala His Ser Tyr 50 55 60 Ser Thr Asn Ser Phe Ser Arg Thr Thr Asn Gly Gly Val Ala Val Gly 65 70 75 80 Ala Pro Ala Val Ala Ala Val Arg Thr Val Gly Pro Ala Val Ser Tyr 85 90 95 Ala Thr Pro Ala Val Ala Ala Leu Arg Gly Ala Ser Phe Asn His Leu 100 105 110 Gly Tyr Ser Ser Gly Leu Gly Leu Ser Ser Gly Leu Gly Tyr Gly Ser 115 120 125 Gly Val Arg Tyr Gly Ala Gly Leu Gly Tyr Gly Ser Gly Leu Arg Tyr 130 135 140 Gly Ser Gly Leu Gly Tyr Gly Ser Gly Leu Arg Tyr Gly Ser Gly Leu 145 150 155 160 Gly Tyr Gly Ser Gly Leu Ser Tyr Gly Ala Gly Leu Gly Tyr Gly Ser 165 170 175 Gly Leu Arg Tyr Gly Ala Gly Leu Gly Tyr Gly Ser Gly Val Ser Tyr 180 185 190 Gly Ala Gly Leu Gly Tyr Thr Ala Val Ser Pro Ala Val Thr Thr Val 195 200 205 His Ala Ala Pro Ala Val Thr Thr Val His Ala Ala Pro Ala Val Ala 210 215 220 Ser Leu Arg Ser Ser Thr Tyr His Gly Ser Gly Tyr Thr Gly Ala Gly 225 230 235 240 Tyr Ala Ser Ala Ala Pro Leu Val Ser Gly Leu Arg Thr Ser Ser Val 245 250 255 Ser Tyr Ser Ser Pro Ala Val Thr Thr Val His Ala Ala Pro Ala Val 260 265 270 Ala Ala Val Arg Thr Val Ala Pro Ala Val Ser Tyr Ala Ala Pro Ala 275 280 285 Val Ser Tyr Ala Ala Pro Ala Val Ala Ser Val Arg Ser Ser Thr Tyr 290 295 300 His Gly Asn Gly Tyr Thr Gly Ala Ser Tyr Ala Ala Pro Ala Val Ser 305 310 315 320 Ala Val Arg Thr Val Ala Pro Ala Val Ser Tyr Ala Ala Pro Ala Val 325 330 335 Ser Tyr Ala Ala Pro Ala Val Ser Tyr Ala Ala Pro Ala Val Ala Ser 340 345 350 Val Arg Ser Ser Thr Tyr His Gly Asn Gly Tyr Thr Gly Ala Ser Tyr 355 360 365 Ala Ala Pro Ala Val Ala Ala Val Arg Thr Ser Ser Val Ser Tyr Ser 370 375 380 Ser Pro Ala Val Thr Thr Val His Ala Ala Pro Ala Val Ala Ala Val 385 390 395 400 Arg Thr Val Thr Pro Ala Val Ser Tyr Ala Ala Pro Ala Val Ala Ser 405 410 415 Val Arg Ser Ser Ser Tyr His Gly Asn Gly Tyr Thr Gly Val Gly Tyr 420 425 430 Gly Ala Val Ala Pro Ala Val Ser Tyr Ala Ala Pro Ala Val Ala Ala 435 440 445 Val Arg Asn Val Thr Pro Ala Val Ser Tyr Ser Ala Pro Ala Val Thr 450 455 460 Thr Val His Ala Ala Pro Ala Val Ala Ala Val Arg Thr Val Ala Pro 465 470 475 480 Ala Val Ser Tyr Ala Ala Pro Ala Val Ala Ser Val Arg Ser Ser Ser 485 490 495 Tyr His Gly Asn Gly Tyr Thr Gly Val Gly Tyr Gly Ala Val Ala Pro 500 505 510 Ala Val Ser Tyr Ala Ala Pro Ala Val Ala Ala Val Arg Thr Val Ser 515 520 525 Thr Pro Ala Val Ser Tyr Ala Ala Pro Ala Val Thr Thr Val His Ala 530 535 540 Thr Pro Ala Phe Ser Tyr Gly Ala Pro Ala Phe Arg Thr Val Ser Ala 545 550 555 560 Gly Pro Ala Val Asn Thr Tyr Ser Ser Ser Ser Tyr Leu Gly Asn Ala 565 570 575 Tyr Gly Gly Leu Gly Tyr Ala Ala His Val Ser Pro Val Ala Val Gly 580 585 590 Tyr Ser Ala Pro Ser Val Arg Thr Tyr Ser Thr Ala Thr Pro Leu Phe 595 600 605 Lys Ser Tyr Ala Ala Ala Pro Ala Leu Thr Thr Tyr Ala Ala His Ser 610 615 620 Ala Pro Leu Ala Val Gly Phe Ser Ala Ala Pro Ser Val Ser His Ala 625 630 635 640 Thr Phe Ser Ser Leu Gly Ser Ser Tyr Ser Phe 645 650 <210> 6 <211> 14 <212> PRT <213> Cimex lectularius <400> 6 Ser Gly Leu Arg Thr Ser Ser Val Ser Tyr Ser Ser Pro Ala 1 5 10 <210> 7 <211> 14 <212> PRT <213> Cimex lectularius <400> 7 His Ser Tyr Ser Thr Asn Ser Phe Ser Arg Thr Thr Asn Gly 1 5 10 <210> 8 <211> 280 <212> PRT <213> Cimex lectularius <400> 8 Met Leu Val Val Leu Ser Leu Ala Leu Val Ala Leu Ala His Ala Gly 1 5 10 15 Gly Pro Ala His Tyr Arg Thr Ala Ser Gly Ala 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Claims

시멕스 렉툴라리우스(Cimex lectularius)에 특이적인 항원의 존재를 검출하기 위한 항체를 생성하는 데 사용하기 위한, 서열 번호 1 또는 5 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하는 시멕스 렉툴라리우스 유래의 단리된 단백질, 또는 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 6 및 서열 번호 7 중 어느 하나 이상으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하는 시멕스 렉툴라리우스 유래의 단리된 폴리펩티드로서, 상기 항체는 알, 유충, 탈피로부터 성숙한 암수 성충으로의 시멕스 렉툴라리우스 발생의 모든 단계에 있는 시멕스 렉툴라리우스 항원을, 20 ㎍/㎖ 미만의 항원 농도로 검출할 수 있는 것인, 단리된 단백질 또는 폴리펩티드.
시멕스 렉툴라리우스에 특이적인 항원의 존재를 검출하기 위한 항체를 생성하는 데 사용하기 위한, 서열 번호 4 또는 8 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하는 제1항에 따른 시멕스 렉툴라리우스 단백질 유래의 재조합 절단형 폴리펩티드로서, 상기 항체는 알, 유충, 탈피로부터 성숙한 암수 성충으로의 시멕스 렉툴라리우스 발생의 모든 단계에 있는 시멕스 렉툴라리우스 항원에, 20 ㎍/㎖ 미만의 항원 농도에서 특이적인 것인 재조합 절단형 폴리펩티드.
제1항 또는 제2항에 있어서, 생성된 항체가 단클론 항체인, 시멕스 렉툴라리우스 유래의 단리된 단백질 또는 폴리펩티드.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 10 ㎍/㎖ 미만의 농도의 시멕스 렉툴라리우스 항원을 검출할 수 있는 것인 단리된 단백질 또는 폴리펩티드.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 생성된 항체는 시멕스 렉툴라리우스와 시멕스 헤미프테루스(Cimex hemipterus) 둘 다에 특이적인 항원을 검출할 수 있는 것인, 시멕스 렉툴라리우스 유래의 단리된 단백질 또는 폴리펩티드.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질이 불용성 단백질인, 시멕스 렉툴라리우스 유래의 단리된 단백질.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 알레르겐 테스트에 사용하기 위한, 시멕스 렉툴라리우스 유래의 단리된 단백질 또는 폴리펩티드.
샘플 중의 시멕스 렉툴라리우스 또는 시멕스 헤미프테루스를 검출하는 방법으로서,
샘플을 제3항에 따른 특이적인 단클론 항체와 접촉시켜 단클론 항체-폴리펩티드 복합체를 형성하는 단계; 및
단클론 항체-폴리펩티드 복합체를, 복합체에 결합하는 리포터 제제(reporter agent)로 표지된 추가 단클론 항체와 접촉시켜, 샘플 중의 시멕스 렉툴라리우스 또는 시멕스 헤미프테루스의 존재를 검출하는 단계
를 포함하는 방법.
제8항에 있어서, 샘플은 알, 유충, 탈피 또는 성충으로부터의 암수 빈대 발생의 임의의 단계에 있는 시멕스 렉툴라리우스 또는 시멕스 헤미프테루스를 포함하는 것인 방법.
제8항 또는 제9항에 있어서, 단클론 항체가 알, 유충, 탈피로부터 성숙한 암수 성충으로의 시멕스 렉툴라리우스 발생의 모든 단계에 있는 시멕스 렉툴라리우스 항원에 특이적인 것인 방법.
샘플 중의 시멕스 렉툴라리우스 또는 시멕스 헤미프테루스를 검출하는 방법으로서,
측방 유동 막;
테스트 샘플을 수용하기 위한, 측방 유동 막의 하측 제1 단부에 위치하는 제1 영역으로서, 제3항에 따른 시멕스 렉툴라리우스 또는 시멕스 헤미프테루스에 특이적인 단클론 항체를 포함하고, 상기 항체는 리포터 제제로 표지된 것인 제1 영역;
측방 유동 막의 상측 제2 단부에 위치하며 고정화된 대조군 폴리펩티드를 포함하는 제2 영역; 및
제1 영역과 제2 영역 사이에 위치하며 시멕스 렉툴라리우스 또는 시멕스 헤미프테루스에 특이적인 고정화된 단클론 항체를 포함하는 제3 영역
을 포함하는 방법.
제10항에 있어서, 단클론 항체가 10 mg/㎖ 미만의 농도로 존재하는 것인 방법.
제10항 또는 제11항에 있어서, 단클론 항체가 5 mg/㎖ 미만의 농도로 존재하는 것인 방법.
제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 검출 가능한 표지제가 라텍스 항체 접합체 또는 금 항체 접합체 중 어느 하나 이상으로부터 선택되는 것인 방법.
제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 단클론 항체가 HRP 또는 비오틴 중 어느 하나 이상으로 표지되는 것인 방법.
샘플 중의 시멕스 렉툴라리우스 또는 시멕스 헤미프테루스의 존재를 검출하기 위한 진단 키트로서,
서열 번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8 중 어느 하나 이상으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 이의 단편에 특이적인 단클론 항체가 고정화되어 있는 하나 이상의 고체 표면을 포함하고, 상기 검출은
샘플 중 시멕스 렉툴라리우스 또는 시멕스 헤미프테루스 항원에 대한 상기 단클론 항체의 결합을 허용하는 조건하에서 샘플을 상기 항체와 접촉시키는 단계, 및
샘플에 결합하는 항체의 양을 대조군 값과 비교하고 이로부터 샘플 중 시멕스 렉툴라리우스 또는 시멕스 헤미프테루스의 존재 또는 부재를 결정하는 단계
를 포함하는 것인 진단 키트.
제15항에 따른 진단 키트를 포함하는 시멕스 렉툴라리우스 또는 시멕스 헤미프테루스의 존재 또는 부재를 결정하기 위한 신속 검출 방법.
서열 번호 1 또는 5 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하는 시멕스 렉툴라리우스 유래의 단리된 단백질, 또는 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 6 및 서열 번호 7 중 어느 하나 이상으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하는 시멕스 렉툴라리우스 유래의 단리된 폴리펩티드.
서열 번호 4 또는 8 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하는 시멕스 렉툴라리우스 단백질 유래의 재조합 절단형 폴리펩티드.