KR20180040046A

KR20180040046A - Cdcp1 발현 억제자를 포함하는 항암용 조성물

Info

Publication number: KR20180040046A
Application number: KR1020160131635A
Authority: KR
Inventors: 이수재; 최염홍
Original assignee: 한양대학교 산학협력단
Priority date: 2016-10-11
Filing date: 2016-10-11
Publication date: 2018-04-19

Abstract

본 발명은 CDCP1 유전자 발현 억제자로서 소정의 서열로 이루어진 siRNA를 포함하는 항암용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 조성물을 이용하는 경우, 유방암 세포의 악성화를 효과적으로 억제할 수 있고, 유방암의 전이를 효과적으로 억제할 수 있다.

Description

CDCP1 발현 억제자를 포함하는 항암용 조성물{Anti-Cancer Composition Comprising Inhibitor for Expression of HAS2}

본 발명은 CDCP1 유전자 발현 억제자로서 소정의 서열로 이루어진 siRNA를 포함하는 항암용 조성물에 관한 것이다.

유방암은 유방에 발생하는 악성 종양을 말한다. 유방암은 유방에 비정상적인 세포 조직이 계속 자라거나 다른 장기에 퍼지는 치명적인 병으로 알려졌다. 유방암은 림프노드(lymph node) 그리고 다른 기관으로 전이를 함으로서 생존율이 낮은 것으로 알려져 있다. 유방암은 임상적으로나 병리학적으로 매우 복잡하고 다양한 양상을 나타내는 암으로 알려져 있다.

유방암은 여러 가지 종류로 나눌 수 있다. 그 중 임상적 방면으로 분리를 한다면 크게 베젤 유사 타입(basal like type) 그리고 루미날 유사 타입(luminal like type)을 나눌 수가 있다. 루미날 유사 타입(Luminal like type)은 대부분 호르몬 수용체 양성을 나타냈지만, 베젤 유사 타입(basal like type)은 아무것도 없었다. 베젤 유사 타입(basal like Type)이 PR^- HER2^- ER^- 삼중음성 유방암과 비슷한 타입임이 알려져 있고, 루미날 타입(luminal type)보다는 악성화가 되어있다고 알려져 있다.

RNAi(RNA interference)란 12-21 mer의 siRNA(short interfering RNA)라고 불리는 dsRNA에 의해 서열 특이적으로 유전자 발현이 억제되는 현상이다(takara). siRNA의 개념을 사용한 치료약 개발은 특정 유전자의 발현 대사과정을 조절하기 위하여 임의의 중요한 mRNA를 특이적으로 파괴하는 원리를 이용한다(siRNA를 이용한 치료제 개발 현황, 이창묵). 그러므로 유전자 치료 개념에서 중요한 역할을 할 수 있다. 이러한 RNAi를 이용한 연구는 포유동물에서 사용한다는 보고가 9000여 편 이상으로 충분히 임상에서의 사용이 가능할 것으로 사료된다. 그리고 si-RNA연구는 약물 타겟 개발에 적용되기 시작하였고, 치료제로 사용하기 위한 기법들의 보고가 증가하고 있다.

당 단백질 CDCP1은 현재 다양한 암(cancer)에서 발현하고 있다고 밝혀져 있다. 특히 신장(kidney)(J Cancer Res Clin Oncol (2008) 134:1363-1369)과 췌장(pancreas)(Cancer Res; 70(12) June 15, 2010)에 발현이 높은 것으로 알려져 있다. 하지만 이의 CDCP1을 특이적으로 타겟하는 siRNA에 대해서는 알려진바 없다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 CDCP1을 타겟팅하여 유방암 악성화를 억제할 수 있는 약제학적 조성물을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과 소정의 핵산 서열을 갖는 siRNA를 이용하는 경우, CDCP1의 발현을 억제하여 상기 목적을 달성할 수 있음을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 유방암세포 악성화 억제용 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 CDCP1을 타겟팅하는 siRNA(small interfering RNA)를 유효 성분으로 포함하는 유방암세포 악성화 억제용 조성물을 제공한다.

본 발명자들은 CDCP1을 타겟팅하여 유방암 악성화를 억제할 수 있는 약제학적 조성물을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과 소정의 핵산 서열을 갖는 siRNA를 이용하는 경우, CDCP1의 발현을 억제하여 상기 목적을 달성할 수 있음을 규명하였다.

본 발명에서의 "CDCP1(CUB domain-containing protein 1)"은 당단백질의 일종으로서, 본 발명자들은 CDCP1이 유방암의 악성화 단계(staging marker)에 따라 악성화가 더욱 진행되었을 수록 발현이 높아지며, CDCP1을 통한 신호 기작에 의해 세포의 이동 침윤능력이 조절된다.

본 발명자들은 상술한 CDCP1에 의해 야기되는 함암 치료상의 문제점을 해결하고자 CDCP1을 특이적으로 타겟팅하여 효과적으로 억제할 수 있는 siRNA 서열들을 발굴하였고, 그 효과를 입증하였다.

본 명세서 상의 용어 "siRNA(small interfering RNA)"는 사일런싱 RNA(silencing RNA)라고도 불리며, 21-23개의 뉴클레오티드로 구성된 siRNA는 특정 mRNA와 상보적인 뉴클레오티드로 구성되어 결합을 형성하고, 해당 mRNA가 발현하는 단백질의 생산을 억제시켜 결과적으로 유전자의 발현을 억제하는 역할을 한다.

본 명세서 상의 용어 "발현 억제"는 표적 유전자의 기능 저하를 야기하는 것을 의미하며, 바람직하게는 이에 의해 표적 유전자 발현이 탐지 불가능해지거나 무의미한 수준으로 존재하게 되는 것을 의미한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 siRNA는 서열목록 제1 서열 내지 제5 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나로 이루어진 단일가닥 RNA 시퀀스 및 이의 상보적인 RNA 시퀀스를 포함한다.

본 발명자들은 CDCP1의 발현을 억제시키기 위한, 소정의 서열로 이루어진 5종의 siRNA를 발굴하였다. 본 발명자들은 유방암 세포에 대하여 상술한 5종의 siRNA를 처리함으로써, 유방암 세포의 EMT(Epithelial mesenchymal transition)가 억제되는 것을 확인하였고, 이를 통해 유방암세포의 악성화가 억제됨을 확인하였다.

본 발명의 일 구체예에 있어서 본 발명의 siRNA는 서열목록 제1 서열로 이루어진 단일가닥 RNA 시퀀스 및 이의 상보적인 RNA 시퀀스를 포함한다. 본 발명자들은 서열목록 제1 서열 내지 제5 서열 중 특히 제1 서열의 경우,

본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 악성화는 유방암 세포의 이동 및 침윤 특성 상승이다. 본 발명자들은 침윤 및 이동 분석(invasion and migration assay)을 통해 CDCP1의 발현 억제가 유방암 세포의 침윤 및 이동 특성을 억제함을 밝혔다. 상술한 유방암 세포의 침윤 및 이동 특성의 억제는 비멘틴의 발현 억제에 의해 확인되었다. 상술한 "비멘틴"은 EMT(Epithelial-Mesenchymal Transition) 마커로 알려져 있으며, 유방암 세포에 대하여 CDCP1을 타겟팅하는 본 발명의 siRNA를 처리하는 경우, "비멘틴" 발현이 크게 감소하는 결과가 도출되는 바, 이는 결과적으로 유방암 세포의 악성화가 억제됨을 의미한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 본발명의 siRNA는 CDCP1의 발현을 억제함으로써, Zeb1(zinc finger E-box binding homeobox transcription factor 1)의 발현을 억제한다. 본 발명의 "Zeb1"은 EMT 조절인자로 알려져 있으며, 본 발명의 CDCP1 억제용 siRNA는 Zeb1의 억제를 통해 유방암 세포의 악성화를 억제한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 siRNA는 CDCP1의 발현을 억제함으로써, Src, PKCδ 및 PI3K-Akt 중 하나 이상의 발현을 억제한다. 상술한 Src, PKCδ 및 PI3K-Akt는 암세포의 악성화와 관련된 신호 물질들로서, 본 발명자들은 CDCP1을 타겟팅하는 siRNA를 처리시 상기 신호들이 감소하고, 이에 의해 유방암 세포의 악성화가 억제될 수 있다는 사실을 규명하였다.

본 발명인 유방암세포 악성화 억제용 조성물은 약제학적 조성물로서 이용될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물은 유효성분 이외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 한편, 본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 바람직하게는 1일 당 0.0001-1000 mg/kg(체중)이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구로 투여되는 경우, 피부에 국소적으로 도포, 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 국소 투여, 경피 투여, 관절강 투여 등으로 투여할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은, 당업계에서 통상적으로 사용되는 유방암 치료용 항암 조성물과 병용하여 사용될 수 있으며, 보다 구체적으로는 아비트렉세이트(Abitrexate), 아브락산(Abraxane), 아도-트라스투주맙 엠탄신(Ado-Trastuzumab Emtansine), 아피니토르(Afinitor), 아나스트로졸(Anastrozole), 아레디아(Aredia), 아리미덱스(Arimidex), 아로마신(Aromasin), 카페시타빈(Capecitabine), 클라펜(Clafen), 시클로포스파마이드(Cyclophosphamide), 시톡산(Cytoxan), 도세탁셀(Docetaxel), 독소루비신 히드로클로라이드(Doxorubicin Hydrochloride), 엘렌스(Ellence), 에피루비신 히드로클로라이드(Epirubicin Hydrochloride), 에리불린 메실레이트(Eribulin Mesylate), 에베로리무스(Everolimus), 엑셈스탄(Exemestane), 5-FU, 화레스톤(Fareston), 파슬로덱스(Faslodex), 페마라(Femara), 포렉스(Folex), 포렉스 PFS(Folex PFS), 풀베스트란트(Fulvestrant), 젬시타빈 히드로클로라이드(Gemcitabine Hydrochloride), 젬자(Gemzar), 고세렐린 아세테이트(Goserelin Acetate), 할라벤(Halaven), 허셉틴(Herceptin), 이브란스(Palbociclib), 익사베필론(Ixabepilone), 익셈프라(Ixempra), 캐싸일라(Kadcyla), 라파티닙 디토실레이트(Lapatinib Ditosylate), 레트로졸(Letrozole), 메게스트롤 아세테이트(Megestrol Acetate), 메토트렉세이트(Methotrexate), 메토트렉세이트 LPF(Methotrexate LPF), 멕세이트(Mexate), 멕세이트-AQ(Mexate-AQ), 네오사르(Neosar), 놀바덱스(Nolvadex), 파클리탁셀(Paclitaxel), 팔보시클립(Palbociclib), 파미드로네이트 디소듐(Pamidronate Disodium), 퍼제타(Perjeta), 퍼투주맙(Pertuzumab), 타목시펜 시트레이트(Tamoxifen Citrate), 탁솔(Taxol), 탁소텔(Taxotere), 티오테파(Thiotepa), 토레미펜(Toremifene), 트라스트주맙(Trastuzumab), 타이커브(Tykerb), 벨반(Velban), 벨사르(Velsar), 빈블라스틴 설페이트(Vinblastine Sulfate), 젤로다(Xeloda), 또는 졸라덱스 등의 유방암 치료용 항암제와 병용 투여될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 siRNA는 종래 알려진 유전자 전달체(gene delivery system)에 포함되는 형태로 제공될 수 있다. 본 명세서에서 용어 "유전자 전달체"는 원하는 타겟 유전자를 대상 세포에 도입하여 발현시키기 위한 매개체를 의미한다. 이상적인 유전자 전달체는 인체에 무해하고 대량생산이 용이하며 효율적으로 유전자를 전달할 수 있어야 한다.

본 발명의 유전자 전달체를 제조하기 위해, 본 발명의 siRNA를 발현하는 뉴클레오타이드 서열은 적합한 발현 컨스트럭트(expression construct) 내에 존재하는 것이 바람직하다. 상기 발현 컨스트럭트에서, 본 발명의 siRNA를 발현하는 뉴클레오타이드 서열은 프로모터에 작동적으로 결합된 것이 바람직하다. 본 명세서에서, 용어 "작동적으로 결합된"은 핵산 발현 조절 서열(예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다. 본 발명에 있어서, 본 발명의 뉴클레오타이드 서열에 결합된 프로모터는, 바람직하게는 동물세포, 보다 바람직하게는 포유동물 세포에서 작동하여 이에 작동적으로 결합된 뉴클레오타이드 서열의 전사를 조절할 수 있는 것으로서, 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 및 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터를 포함하며, 예컨대 CMV(포유동물 사이토 메갈로 바이러스) 프로모터, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, HSV의 tk 프로모터, RSV 프로모터, EF1 알파 프로모터, 메탈로티오닌 프로모터, 베타-액틴 프로모터, 인간 IL-2 유전자의 프로모터, 인간 IFN 유전자의 프로모터, 인간 IL-4 유전자의 프로모터, 인간 림포톡신 유전자의 프로모터 및 인간 GM-CSF 유전자의 프로모터, U6 프로모터를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 유전자 전달체는 다양한 형태로 제작할 수 있는 데, 이는 (ⅰ) 내이키드(naked) 재조합 DNA 분자, (ⅱ) 플라스미드, (ⅲ) 바이러스 벡터, 그리고, (ⅳ) 상기 내이키드 재조합 DNA 분자 또는 플라스미드를 포함하는 리포좀 또는 니오좀의 형태로 제작할 수 있다.

본 발명의 siRNA 서열은 통상적인 유전자 치료에 이용되는 모든 유전자 전달 시스템에 적용될 수 있으며, 바람직하게는 플라스미드, 아데노바이러스(Lockett LJ, et al., Clin. Cancer Res. 3:2075-2080(1997)), 아데노-관련 바이러스(Adeno-associated viruses: AAV, Lashford LS., et al., Gene Therapy Technologies, Applications and Regulations Ed. A. Meager, 1999), 레트로바이러스(Gunzburg WH, et al., Retroviral vectors. Gene Therapy Technologies, Applications and Regulations Ed. A. Meager, 1999), 렌티바이러스(Wang G. et al., J. Clin. Invest. 104(11):R55-62(1999)), 헤르페스 심플렉스 바이러스(Chamber R., et al., Proc. Natl. Act . Sci USA 92:1411-1415(1995)), 배시니아 바이러스(Puhlmann M. et al., Human Gene Therapy 10:649-657(1999)), 리포좀(Metho s in Molecular Biology, Vol 199, S.C. Basu and M. Basu (Eds.), Human Press 2002) 또는 니오좀에 적용될 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 유방암세포 악성화 억제용 조성물을 제공한다.

(b) 본 발명의 조성물을 이용하는 경우, 유방암 세포의 악성화를 효과적으로 억제할 수 있다.

(c) 본 발명의 조성물을 이용하는 경우, 유방암의 전이를 효과적으로 억제할 수 있다.

도 1의 A는 CDCP1을 타겟팅 할 수 있는 5개의 siRNA 염기서열을 나타낸다.
도 1의 B는 5개 siRNA 서열에 의한 CDCP1 mRNA 발현 억제 효과를 나타낸다.
도 2의 A는 베젤A, 베젤B 타입의 유방암 세포에서 당단백질 CDCP1의 발현이 루미날 타입의 유방암세포보다 높게 나타나는 것을 보여주는 GOBO 데이터베이스 결과를 나타낸다.
도 2의 B는 세포주 별 CDCP1의 발현 정도를 보여주는 그래프를 나타낸다.
도 2의 C는 베젤, 루미날 타입의 유방암 세포에서의 CDCP1 mRNA 발현양을 보여주는 그래프를 나타낸다.
도 3은 59개의 사람 유방 조직을 면역조직화학염색 방법을 통해 관찰한 결과를 나타낸다.
도 4의 A는 CDCP1 발현을 억제하는 siRNA(1)을 처리하였을 때 이동능력과 침윤능력이 감소하는 결과를 확인한 것을 나타낸다.
도 4의 B는 siRNA(1) 및 siRNA(2)를 처리하였을 때 베젤 타입 유방암 세포의 중간엽성 세포표현형의 마커인 비멘틴이 특이적으로 감소하는 것을 보여주는 웨스턴 블랏팅 결과를 나타낸다. si-CDCP1(1)은 siRNA(1)을 처리한 결과를 나타내고, si-CDCP1(2)는 siRNA(2)를 처리한 결과를 나타낸다.
도 4의 C는 상술한 도 4의 B의 결과를 면역형광염색법으로 확인한 결과를 나타낸다.
도 4의 D는 CDCP1 억제할 때의 EMT 조절 인자들의 발현 변화를 관찰 시, Zeb1의 발현이 감소하는 것을 웨스턴 블랏을 통해 확인한 결과를 나타낸다.
도 4의 E는 상술한 도 4의 D의 결과를 면역형광염색법으로 관찰한 결과를 나타낸다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

1. 세포배양

인간유방암세포주 MCF7, SKBR3, T47D, BT549.MDAMB231(아메리칸타입컬쳐콜렉션사)로부터 확립되었다. 세포들은 37℃의 가습된 5% CO₂ 조건에서 배양하였다. 인간 유방암 세포는 10% 태아소혈청, 페니실린(100 unit/ml) 및 스트렙토마이신(100 g/ml)이 보충된 DMEM에서 배양되었다.

2. 웨스턴블랏(Western blot) 분석

세포용해물(lysates)은 단백질 분해효소 억제제가 보충된 용해 버퍼(lysis buffer)[40 mM 트리스-HCL(pH 8.0), 120 mM NaCl, 0.1% Nonidet-P40]로 단백질을 추출하여 준비하였다. 단백질은 SDS-PAGE에 의해 분리하고, 니트로셀룰로스막 (Amersham사)으로 이동시켰다. 막은 TBS(Tris-buffered saline) 내의 5% 탈지분유로 차단(blocked)하였고, 4℃에서 하루 동안 1차 항체와 배양하였다. 블랏은 HRP가 결합한 2차항체로 수행하였고, 단백질은 제조사의 지침에 따른 강화된 화학 발광(ECL) 절차(Amersham사)를 이용하여 시각화하였다.

3. 시약 및 항체

N-cadherin, CDCP1, ZEB1, Snail, ERK. P38, JNK은 Cell Signaling Technology(Beverly 사)로부터 얻었다. 폴리클로날항체 비멘틴은 Thermo Science사로부터 얻었다. Snail, c-Src, Slug, Twist, p-PKC delta는 santacruz에서 얻었다. 4,6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI) 및 β-액틴에 대한 모노클로날항체는 Sigma 사로부터 입수하였다. 항-마우스 Alexa Fluor 488 및 항-래빗 Alexa Fluor 488은 Invitrogen사로부터 구입했다. 사이토칸어레이(cytokine array) 키트는 R&D회사에서 구입하였다.

4. 면역세포화학(EMT 분석)

세포는 4% 파라포름알데하이드로 고정하였고, PBS 상에서 0.1% 트리톤 X-100을 이용하여 투과시켰다. 세포고정 후, 세포는 4℃에서 하루 동안 1% 태아소혈청및 0.1% 트리톤 X-100과 PBS 용액상에 적절한 1차 항체와 함께 배양하였다. 사용된 항체는 하기와 같다: 인간 안티-E-캐드헤린(anti-E-cadherin)(마우스폴리클로날항체, 1:200), 안티-N-캐드헤린(마우스폴리클로날항체, 1:200) 및 안티-비멘틴(Vimentin)(래빗폴리클로날항체, 1:200). 염색은 안티-래빗 또는 안티-마우스 Alexa Flour 488 (Molecular Probes 사)를 사용해 시각화하였다.

핵(nuclei)은 4, 6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI)(Sigma 사)을 사용하여 대조염색 하였다. 염색된 세포는 형광-현미경(Olympus IX71)을 사용하여 시각화하였다.

5. 침윤이동분석

세포(4×10⁴세포/웰)를 침윤 및 이동분석을 위해 0.2 ml의 영양 배지에 현탁했다. 침윤 분석을 위해 세포는 8-mm 포어 크기의 트랜스웰 챔버(Transwell chamber)(Corning Glass 사)의 상부 웰(upper well) 상에 채워넣었다. 상기 상부웰은 0.8 ml의 성장배지로 채워진 하부 웰 챔버의 상면(upper side) 상에서 성장인자-감소된 매트리겔(BD Diosciences사) 10 mg/ml로 프리코팅 되어있다. 37℃에서 48 시간 배양 후 필터의 상부 표면상의 비침습 세포를 고정하고, Diff-Quick 키트(Fisher 사)로 염색하였고, 20배율로 촬영하였다. 침습력은 웰당 5 미시영역에서세포의 수를 세는 것으로 결정하였고, 침습의 규모는 미세 영역당 세포의 평균수로 표현하였다. 세포는 위상차 현미경(Leica Microsystems 사)으로 이미지화 하였다. 이동 분석을 위하여, 같은 타입의 막을 포함하는 대조 인서트(inserts)를 갖지만 매트리겔 코팅은 갖지 않는 챔버를 사용하였다(24-웰플레이트의 웰당 하나의 챔버). 성장 배지 0.2 ml 내의 4×10⁴개의 세포를 각 인서트 상부 끝 측에 첨가하고, 증식배지 0.8 ml를 각 인서트의 기저 측에 첨가하였다. 침습 분석을 위해 위와 같이 인서트를 처리하였다.

6. 형질전환

si-RNA를 세포 내에 형질 주입하기 위하여 리포펙타민(Lipofectamine) 2000 시약(Invitrogen 사)을 이용하였다. 형질 주입할 때는 optiMEM을 통하여 6시간 동안 주입시키고 세포 배양 배지로 체인지를 한 후 48시간 후 세포를 하베스트하여서 실험을 진행하였다.

7. 면역조직 화학 염색

총 59개의 사람 유방암 조직과 정상 유방 조직을 biomax사에서 구매를 하여 IHC(면역 조직 화학 염색) 방법을 통하여 CDCP1의 발현 정도를 관찰하였다. 우선 파라핀을 제거하기 위하여 60도에 파라핀을 녹였다. 그리고 크실렌으로 각각 10분 처리하여 파라핀을 완전히 제거하고, 고농도 알코올로부터 저농도 알코올을 순차적으로 처리하여 크실렌을 제거하였다. 블록킹 용액으로 블록킹하고 30분 후 항체 CDCP1(세포 염색)을 1:400 혼합하여 4℃에 하루동안(overnight) 결합시켰다. 다음날 2차 항체 1:1000을 결합시킨 후 ABC staining kit를 30분 동안 사용하였다. 최종 DAB 염색(staining)을 한 후 다시 탈수 과정을 거쳐 조직 염색을 마무리한다.

8. 통계분석, 데이터베이스 사용

모든 실험데이터는 평균값으로 기재하였고, 에러바는 실험적인 표준 오차를 나타낸다. 통계 분석은 비모수 스튜던트 t 검정(non-parametric Student t test)으로 수행하였다. 유방암 세포에서 CDCP1의 발현 정도를 루미날 타입(Luminal Type) 그리고 베젤 타입(Basal Type)으로 확인한 내용은 GOBO DATABASE를 통하여 찾았다.

결과

1. CDCP1을 타겟팅하는 si-RNA 5개 염기서열의 발굴 및 CDCP1 블록킹 확인

CDCP1을 타겟팅 할 수 있는 si-RNA 5개 염기서열을 확인하였다(참조: 도 1a). 5개의 si-RNA 염기서열을 각각 MDAMB231 세포주에 처리한 후 real-rime PCR로 CDCP1의 블록킹을 확인하였다(참조: 도 1b).

2. 세포주의 종류와 CDCP1 발현의 상관관계 확인

유방암 세포는 전이 능력의 정도로써 크게 두 종류로 구분할 수 있다. 전이 능력이 상대적으로 높은 타입을 베젤(basal) 타입이라 칭하고, 전이 능력이 낮은 타입을 루미날(luminal) 타입이라고 칭한다. 전이 능력이 높다고 여기는 베젤(basal)A, 베젤(basal)B 타입의 유방암 세포에서 당단백질 CDCP1의 발현이 루미날 타입의 유방암 세포보다 높게 나타남을 GOBO 데이터베이스를 통해 알 수 있었다(참조: 도 1a의 좌측 패널). 에스트로겐 수용체(ER)와 프로게스테론 수용체(PR) 그리고 HER2의 발현이 나타나지 않는 트리플 네거티브(Triple negative, TN) 타입은 유방암 세포 중에서도 가장 악성화 되어 있고, 타겟팅이 쉽지 않아 치료가 가장 어렵다고 알려져 있다. 이러한 TN 타입에서도 CDCP1의 발현이 가장 높게 나타나 있는 것을 알 수 있었다. 즉 유방암 세포의 악성화의 정도와 CDCP1의 발현 정도가 같은 경향성을 보인다는 사실을 알 수 있었다. 세포주 별 발현 그래프를 확인해 보았을 시에도 악성화 되어 있는 세포주일 수록 CDCP1의 발현 정도가 높게 나타나는 것을 확인 하였다(참조: 도 1b). 실제 베젤, 루미날 타입의 유방암 세포에서의 CDCP1 mRNA의 양을 측정하여 비교해보니 데이터베이스에서 관찰한 경향성과 마찬가지로 더 악성화 되어 있는 베젤 타입에서의 CDCP1의 발현 정도가 더 높은 것으로 확인되었다(참조: 도 1c).

3. 유방암의 악성화 정도와 CDCP1 발현의 상관관계

총 59개의 사람 유방 조직을 IHC(면역 조직 화학 염색)방법을 통하여 관찰하였다. CDCP1의 발현정도를 관찰하였을 때, 정상 유방조직에서는 CDCP1의 발현을 관찰할 수 없었다. 하지만 유방암 조직 샘플 중에서는 약 37.5% 정도가 CDCP1를 높게 발현하는 것으로 확인할 수 있었다. 또한 가장 악성화 되어 있다고 알려져 있는 조직 중 하나인, 유방암에서 림프절로 전이가 일어난 조직 샘플 중에서는 70% 정도가 CDCP1을 높게 발현하는 것으로 확인할 수 있었다(참조: 도 3). 즉 세 종류의 조직을 놓고 비교하였을 때, 그 악성화 정도에 따라서 CDCP1의 발현도가 나타남을 확인하였다. 즉 유방암의 악성화 정도를 진단할 때에 CDCP1의 발현정도를 그 진단 지표로써 사용할 수 있다는 결과를 도출하였다.

4. 유방암 세포의 전이 능력에 있어서의 CDCP1의 기능

베젤(Basal) 타입에서 더 높게 나타나는 전이능력에 있어서의 CDCP1의 기능을 확인하기 위하여 세포의 이동성과 침윤성을 확인할 수 있는 침윤 및 이동 분석(invasion and migration assay)을 실시하였다. CDCP1의 발현을 억제하는 si-RNA(1)을 처리 하였을 때 이동능력과 침윤능력이 감소하는 것을 확인하였다(참조: 도 4a). 베젤(Basal) 타입의 유방암 세포는 중간엽(mesenchymal)성 세포 표현형을 나타내게 되는데, si-CDCP1(1)과 (2)를 처리하였을 때, 이 표현형의 마커(marker) 중 하나인 비멘틴(vimentin)이 특이적으로 감소하는 것을 웨스턴 블랏팅(western blotting)을 통하여 확인할 수 있었다(참조: 도 4b). 도 4b의 결과를 면역형광염색법(immunofluorescence stain)을 이용하여 관찰하였다(참조: 도 4c). 대부분의 암세포는 이동능력과 침윤능력이 상대적으로 높은 중간엽성 세포 표현형을 획득하는데 EMT(Epithelial-Mesenchymal Transition)의 과정을 겪게 된다. 이러한 EMT가 일어날 때 많은 조절인자가 관여하게 된다. CDCP1을 억제하였을 때, EMT 조절인자들의 발현 변화를 확인해 본 결과, Zeb1의 발현이 감소하는 것을 웨스턴 블랏팅을 통하여 관찰하였다(참조: 도 4d). 도 4d에서의 결과를 면역형광염색법(immunofluorescence stain)을 이용하여 관찰하였다(참조: 도 4e). 즉, 베젤(basal) 타입의 유방암세포는 CDCP1을 발현함으로써 중간엽성 세포 표현형을 유지하게 되는데, 이는 EMT 조절인자인 Zeb1을 통해서 일어나게 된다. siRNA(1)을 이용하는 경우 EMT 마커들의 발현이 가장 높은 효율로 억제되었으며, 이상의 결과로 CDCP1의 악성화를 저해 시키는데 siRNA(1)이 가장 효과적인 것으로 확인이 되었다.

5. CDCP1 억제에 따른 유방암세포 전이 억제의 신호 기작

유방암세포가 전이능력을 획득하게 되는데 중요하다고 알려져 있는 신호들 중에 CDCP1이 관련되어 있는 신호를 찾기 위해서 CDCP1의 발현을 siRNA(1)을 처리하여 억제한 뒤 악성화에 관여하는 신호들의 활성을 웨스턴 블랏팅(western blotting)으로 확인해 보았다. 정상 세포 및 암세포에서 주요 신호 인자인 MAPK 신호의 활성에 CDCP1이 미치는 영향을 알아보기 위해서, CDCP1의 발현을 억제시킨 유방암 세포에서 신호를 관찰했다. MAPK 신호의 활성에는 특별한 영향이 없음을 확인하였다(참조: 도 5a). 도 5a에서의 결과와 마찬가지로 Src 신호의 활성에 CDCP1이 미치는 영향을 알아보기 위해서, CDCP1의 발현을 억제시킨 유방암 세포에서 신호를 관찰했다. CDCP1에 의해 Src의 신호가 활성화될 수 있음을 알 수 있었다(참조: 도 5b). 또한 PKCδ 신호가 CDCP1에 의해 활성화될 수 있음을 알 수 있었다(참조: 도 5c). 또한 PI3K-Akt 신호가 CDCP1에 의해 활성화될 수 있음을 알 수 있었다(참조: 도 5d). 이상의 결과에 의해 CDCP1을 저해 시키는 siRNA(1)이 Src, PKCδ 및/또는 PI3K-Akt 신호를 저해시킴으로써 유방암의 악성화를 타겟팅 할 수 있음을 알 수 있었다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> IUCF-HYU (Industry-University Cooperation Foundation Hanyang University) <120> Anti-Cancer Composition Comprising Inhibitor for Expression of HAS2 <130> PN150529 <160> 5 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> si-RNA for CDCP1 gene <400> 1 gguguccuuu auaccuuau 19 <210> 2 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> si-RNA for CDCP1 gene <400> 2 auugacugua ugucaggcc 19 <210> 3 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> si-RNA for CDCP1 gene <400> 3 aucgagucug uguuugaggg 20 <210> 4 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> si-RNA for CDCP1 gene <400> 4 uucaaccucu cucugcaag 19 <210> 5 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> si-RNA for CDCP1 gene <400> 5 caccugccug uggagcugc 19

Claims

CDCP1을 타겟팅하는 siRNA(small interfering RNA)를 유효 성분으로 포함하는 유방암세포 악성화 억제용 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 siRNA는 서열목록 제1 서열 내지 제5 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나로 이루어진 단일가닥 RNA 시퀀스 및 이의 상보적인 RNA 시퀀스를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 2 항에 있어서, 상기 siRNA는 서열목록 제1 서열로 이루어진 단일가닥 RNA 시퀀스 및 이의 상보적인 RNA 시퀀스를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 악성화는 유방암 세포의 이동 및 침윤 특성 상승인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 siRNA는 CDCP1의 발현을 억제함으로써, Zeb1의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 siRNA는 CDCP1의 발현을 억제함으로써, Src, PKCδ 및 PI3K-Akt 중 하나 이상의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 조성물.