KR20180030698A - 나노 입자 동결건조물 형태를 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

나노 입자 동결건조물 형태를 위한 조성물 및 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 의약품으로 재구성될 수 있는 하나 이상의 핵산 활성제의 고체 동결건조물을 제조하기 위한 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 약학적으로 허용 가능한 용액 내의 지질 나노 입자의 수성 현탁액, 여기서 상기 지질 나노 입자는 하나 이상의 핵산 활성제를 캡슐화함, 덱스트린 화합물, 및 당류 화합물을 포함할 수 있다. 상기 핵산 활성제는 다른 RNAs 및 올리고뉴클레오티드 뿐만 아니라 RNA 간섭을 매개할 수 있는 RANi 분자일 수 있다.

Description

나노 입자 동결건조물 형태를 위한 조성물 및 방법
관련 출원
본 출원은 나노 입자 동결건조물 형태를 위한 조성물 및 방법으로 명명된 2015년 7월 22일자로 출원된 미국 가특허 출원 제 62/195,356 호의 우선권을 주장하며, 그 내용은 본 명세서에 전부 참고로 포함된다.
본 발명의 기술 분야
본 발명은 핵산 기반의 분자로 구성된 생물 약제(biopharmaceuticals) 및 치료제(therapeutics) 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 핵산 치료제 조성물의 동결건조물(lyophile) 형태를 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다.
핵산 화합물에 기초한 치료제는 그 중에서도 다양한 형태의 DNA 및 플라스미드, 하이브리드 올리고뉴클레오티드, 및 압타머(aptamers) 뿐만 아니라 siRNAs, 안티센스 RNA, 마이크로 RNAs 와 같은 다양한 RNA 형태를 포함한다.
핵산 치료제 및 다른 제제(agent)의 형질주입(transfection)은 활성 분자를 지질 나노 입자로 캡슐화함으로써 달성되었다. 이 방법론의 결점은 나노 입자 또는 이들의 캡슐화된 운반체(cargo)의 분해 때문에 나중에 사용할 수 있도록 조성물을 저장할 수 없다는 점이다. 예를 들어, siRNA 분자를 캡슐화하는 지질 나노 입자의 조성물은 25℃에서 단 몇 분 또는 몇 시간 동안, 그리고 4℃에서 단 몇 일 또는 몇 주 동안 안정적일 수 있다. 또 다른 결점은 매우 낮은 온도에서 지질 나노 입자 조성물의 저장에 대한 필요성을 포함한다.
치료제 조성물의 장기 저장을 제공하는 한 가지 방법은 동결건조물(lyophile) 형태를 제조하는 것으로, 이는 치료제 투여를 위한 제형(formulation)를 제공할 수 있도록 저장 및 재구성될 수 있다.
그러나, 일반적으로 핵산 제제(agents)를 포함하는 지질 나노 입자의 동결건조물 형태를 생성하는 것은 가능하지 않아, 지질 나노 입자는 캡슐화된 핵산 제제로 재생성되어 안정한 제형(formulation)을 형성할 수 있다. 동결건조 공정은 나노 입자 및/또는 핵산 제제를 파괴할 수 있다. 일부 방법은 보호 그룹 또는 성분을 지질 나노 입자, 또는 핵산 제제에 화학적으로 부착시키는 것을 포함하는데, 이는 불리하다. 다른 방법은 핵산 제제의 캡슐화를 제공하지 않고, 애주번트(adjuvant)로서 리포좀을 사용할 수 있다.
다양한 핵산 제제를 전달하기 위해 형질주입(transfection) 활성, 입자 크기, 저장 시간 및 혈청 안정성을 포함한 유리한 성질로 재구성될 수 있는 나노 입자의 동결건조물 형태를 제공하는 조성물 및 방법은 계속적으로 필요하다.
고체 동결건조물 형태로 저장될 수 있는 지질 나노 입자의 안정적인 용액 또는 현탁액을 형성하기 위한 조성물 및 화합물이 필요하며, 여기서 나노 입자는 핵산 제제를 캡슐화한다.
발명의 요약
본 발명은 핵산 기반의 분자로 구성된 치료제를 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 보다 구체적으로, 본 발명은 핵산 기반의 치료제 조성물의 동결건조물(lyophile) 형태를 위한 방법 및 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 효과적인 치료제 조성물로 재구성될 수 있는 나노 입자의 동결건조물 형태를 제공하며, 이는 형질주입을 위한 치료제 핵산 제제를 전달하는 데 사용될 수 있다.
일부 측면에서, 본 발명은 동결건조(lyophilization) 공정에서 안정한 치료제 지질 나노 입자의 용액 또는 현탁액을 형성하기 위한 조성물 및 화합물을 제공한다. 상기 치료제 지질 나노 입자는 핵산 제제를 캡슐화할 수 있으며, 고체 동결건조물 형태로 변형 및 저장될 수 있다. 상기 동결건조물 형태는 캡슐화된 핵산 제제로 치료제 지질 나노 입자를 제공하도록 재구성될 수 있다. 상기 재구성된 지질 나노 입자는 입자 크기 및 분포를 포함한 놀랍도록 유리한 형질주입 특성을 가질 수 있다.
본 발명의 실시양태는 핵산 치료제의 장기 저장을 위한 안정한 고체 동결건조물 형태를 제공하기 위해 동결건조 공정을 거칠 수 있는 치료제 지질 나노 입자의 용액 또는 현탁액을 형성하기 위한 일련의 조성물 및 화합물을 포함한다.
본 발명의 실시양태는 하기를 포함한다:
하기를 포함하는, 하나 이상의 핵산 활성제(active agent)를 포함하는 지질 나노 입자의 고체 동결건조물(lyophile)을 제조하기 위한 조성물:
약학적으로 허용 가능한 용액 내의 지질 나노 입자의 수성 현탁액, 여기서 상기 지질 나노 입자는 하나 이상의 핵산 활성제를 캡슐화함;
덱스트린 화합물; 및
당류(saccharide) 당(sugar) 화합물.
상기 조성물에서, 상기 덱스트린 및 당 화합물의 총량은 상기 조성물의 2% 내지 20% (w/v)이다.
상기 조성물에서, 상기 덱스트린 화합물은 상기 덱스트린 및 당 화합물의 총량의 40% 내지 70% (w/v)이다.
상기 조성물에서, 상기 덱스트린 화합물은 상기 덱스트린 및 당 화합물의 총량의 40 % 내지 55 % (w/v)이다.
상기 조성물에서, 상기 덱스트린 화합물은 상기 덱스트린 및 당 화합물의 총량의 40% 내지 45% (w/v)이다.
상기 조성물에서, 상기 조성물의 동결건조(lyophilization) 및 재구성(reconstitution) 시, 상기 나노 입자의 평균 크기는 본래 조성물에서의 나노 입자의 크기의 10% 이내이다.
상기 조성물에서, 상기 조성물의 동결건조, 저장(storage) 및 재구성 시, 상기 나노 입자의 평균 크기는 본래 조성물에서의 나노 입자의 크기의 10% 이내이다.
상기 조성물에서, 상기 동결건조된 조성물은 적어도 한달 동안 5℃에서 저장된다.
상기 조성물에서, 상기 동결건조된 조성물은 적어도 한달 동안 -20℃에서 저장된다.
상기 조성물에서, 상기 나노 입자는 45 nm 내지 110 nm의 평균 직경을 가진다.
상기 조성물에서, 상기 핵산 활성제의 농도는 1 mg/mL 내지 10 mg/mL, 또는 3 mg/mL 내지 5 mg/mL 이다.
상기 조성물에서, 상기 하나 이상의 핵산 활성제는 RNA 간섭을 매개할 수 있는 RNAi 분자이다. 상기 조성물에서, 상기 RNAi 분자는 siRNAs, shRNAs, ddRNAs, piRNAs 또는 rasiRNAs이다.
상기 조성물에서, 상기 하나 이상의 핵산 활성제는 miRNAs, 안티센스 RNAs, 플라스미드, 하이브리드 올리고뉴클레오티드 또는 압타머(aptamer)이다.
상기 조성물에서, 상기 약학적으로 허용 가능한 용액은 HEPES 완충액, 인산(phosphate) 완충액, 시트레이트(citrate) 완충액, 또는 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄(Tris(hydroxymethyl)aminomethane)을 포함하는 완충액이다.
상기 조성물에서, 상기 덱스트린 화합물은 사이클로덱스트린(cyclodextrin)이다.
상기 조성물에서, 상기 사이클로덱스트린 화합물은 설포알킬(sulfoalkyl),벤젠설포알킬(benzenesulfoalkyl), 아세토알킬(acetoalkyl), 하이드록시알킬(hydroxyalkyl), 하이드록시알킬 숙시네이트(hydroxyalkyl succinate), 하이드록시알킬 말로네이트(hydroxyalkyl malonate), 하이드록시알킬 글루타레이트(hydroxyalkyl glutarate), 하이드록시알킬 아디페이트(hydroxyalkyl adipate), 하이드록시알킬 (hydroxyalkyl), 하이드록시알킬 말레에이트(hydroxyalkyl maleate), 하이드록시알킬 옥살레이트(hydroxyalkyl oxalate), 하이드록시알킬 푸마레이트(hydroxyalkyl fumarate), 하이드록시알킬 시트레이트(hydroxyalkyl citrate), 하이드록시알킬 타르트레이트(hydroxyalkyl tartrate), 하이드록시알킬 말레이트(hydroxyalkyl malate), 또는 하이드록시알킬 시트라코네이트(hydroxyalkyl citraconate) 그룹으로 치환된 하나 이상의 2,3 및 6 하이드록실 위치를 가진다.
상기 조성물에서, 상기 사이클로덱스트린 화합물은 (2-하이드록시프로필)-β-사이클로덱스트린((2-hydroxypropyl)-β-cyclodextrin), 2-하이드록시프로필-β-사이클로덱스트린 숙시네이트(2-hydroxypropyl-β-cyclodextrin succinate), (2-하이드록시프로필)-γ-사이클로덱스트린((2-hydroxypropyl)-γ-cyclodextrin), 또는 2-하이드록시프로필-γ-사이클로덱스트린 숙시네이트(2-hydroxypropyl-γ-cyclodextrin succinate)이다.
상기 조성물에서, 상기 사이클로덱스트린 화합물은 설포부틸 에테르 β-사이클로덱스트린(sulfobutyl ether β-cyclodextrin) 또는 설포부틸 에테르 γ-사이클로덱스트린(sulfobutyl ether γ-cyclodextrin)이다.
상기 조성물에서, 상기 사이클로덱스트린 화합물은 메틸-β-사이클로덱스트린(methyl-β-cyclodextrin) 또는 메틸-γ-사이클로덱스트린(methyl-γ-cyclodextrin)이다.
상기 조성물에서, 상기 사이클로덱스트린 화합물은 중합체 사슬 또는 네트워크에 부착된 것이다.
상기 조성물에서, 상기 사이클로덱스트린 화합물은 흡착질(adsorbate) 화합물을 포함한다.
상기 조성물에서, 상기 흡착질 화합물은 콜레스테롤(cholesterol), 라노스테롤(lanosterol), 지모스테롤(zymosterol), 지모스테놀(zymostenol), 데스모스테롤(desmosterol), 스티그마스타놀(stigmastanol), 디하이드로라노스테롤(dihydrolanosterol), 7-디하이드로콜레스테롤(7-dehydrocholesterol), 페길화된 콜레스테롤(pegylated cholesterol), 콜레스테릴 아세테이트(cholesteryl acetate), 콜레스테릴 아라키도네이트(cholesteryl arachidonate), 콜레스테릴 부티레이트(cholesteryl butyrate), 콜레스테릴 헥사노에이트(cholesteryl hexanoate), 콜레스테릴 미리스테이트(cholesteryl myristate), 콜레스테릴 팔미테이트(cholesteryl palmitate), 콜레스테릴 베헤네이트(cholesteryl behenate), 콜레스테릴 스테아레이트(cholesteryl stearate), 콜레스테릴 카프릴레이트(cholesteryl caprylate), 콜레스테릴 n-데카노에이트(cholesteryl n-decanoate), 콜레스테릴 도데카노에이트(cholesteryl dodecanoate), 콜레스테릴 네르보네이트(cholesteryl nervonate), 콜레스테릴 펠라고네이트(cholesteryl pelargonate), 콜레스테릴 n-발레레이트(cholesteryl n-valerate), 콜레스테릴 올레에이트(cholesteryl oleate), 콜레스테릴 엘라이데이트(cholesteryl elaidate), 콜레스테릴 에루케이트(cholesteryl erucate), 콜레스테릴 헵타노에이트(cholesteryl heptanoate), 콜레스테릴 리놀레이데이트(cholesteryl linolelaidate), 콜레스테릴 리놀레이트(cholesteryl linoleate), 베타-시토스테롤(beta-sitosterol), 캄페스테롤(campesterol), 에르고스테롤(ergosterol), 브라시카스테롤(brassicasterol), 델타-7-스티그마스테롤(delta-7-stigmasterol), 및 델타-7-아베나스테롤( delta-7-avenasterol)로부터 선택된다.
상기 조성물에서, 상기 당류 당 화합물은 단당류 또는 이당류 당 화합물이다.
상기 조성물에서, 상기 당 화합물은 수크로스(sucrose), 락토오스(lactose), 락툴로스(lactulose), 말토오스(maltose), 트레할로스(trehalose), 셀로비오스(cellobiose), 코지비오스(kojibiose), 사케비오스(sakebiose), 이소말토오스(isomaltose), 소포로스(sophorose), 라미나리비오스(laminaribiose), 겐티오비오스(gentiobiose), 투라노오스(turanose), 말툴로스(maltulose), 이소말툴로스(isomaltulose), 겐티오비우로스(gentiobiulose), 만노비오스(mannobiose), 멜리비오스(melibiose), 멜리비우로스(melibiulose), 및 자일로비오스(xylobiose)로부터 선택된다.
하나 이상의 핵산 활성제의 고체 동결건조물(lyophile)를 제조하는 방법으로서, 상기 방법은 상기 기재된 조성물을 동결건조하는 것을 포함한다. 본 발명은 상기 고체 동결건조물을 재구성하여 제조된 의약품(drug product) 뿐만 아니라 상기 방법에 의해 제조된 고체 동결건조물도 추가로 고려한다.
본 발명은 하기를 포함하는, 핵산 의약품(drug product)을 제조하는 방법을 추가로 포함한다:
지질 나노 입자를 합성하는 단계 여기서, 상기 지질 나노 입자는 하나 이상의 핵산 활성제를 캡슐화하는 것임;
약학적으로 허용 가능한 용액에 지질 나노 입자의 수성 현탁액을 제공하는 단계;
상기 지질 나노 입자를 포함하는 용액에 덱스트린 화합물을 첨가하는 단계;
상기 지질 나노 입자를 포함하는 용액에 당류 당 화합물을 첨가하는 단계;
상기 지질 나노 입자를 포함하는 용액을 동결건조하여 고체 동결건조물(lyophile)을 형성하는 단계;
약학적으로 허용 가능한 담체에 상기 동견건조물을 재구성하여 핵산 의약품을 형성하는 단계.
상기 방법에서, 상기 덱스트린 및 당류 당 화합물의 총량은 상기 나노 입자를 포함하는 용액의 2% 내지 20% (w/v)이다.
상기 방법에서, 상기 덱스트린 화합물은 상기 덱스트린 및 당류 당 화합물의 총량의 40% 내지 70% (w/v)이다.
상기 방법에서, 상기 덱스트린 화합물은 상기 덱스트린 및 당류 당 화합물의 총량의 40% 내지 55% (w/v) 이다.
상기 방법에서, 상기 덱스트린 화합물은 상기 덱스트린 및 당류 당 화합물의 총량의 40% 내지 45% (w/v)이다.
상기 방법에서, 상기 재구성 시, 상기 나노 입자의 평균 크기는 합성될 때 나노 입자의 크기의 10% 이내이다.
상기 방법에서, 재구성 이전에 상기 동결건조물을 저장하는 단계를 더 포함한다.
상기 방법에서, 상기 동결건조물의 저장 및 재구성 시, 상기 나노 입자의 평균 크기는 합성될 때 나노 입자의 크기의 10% 이내이다.
상기 방법에서, 상기 동결건조물은 적어도 한달 동안 5℃에서 저장된다.
상기 방법에서, 상기 동결건조물은 적어도 한달 동안 -20℃에서 저장된다.
상기 방법에서, 상기 나노 입자는 45 nm 내지 110 nm의 평균 직경을 가진다.
상기 방법에서, 상기 핵산 활성제의 농도는 1 mg/mL 내지 10 mg/mL이다.
상기 방법에서, 상기 하나 이상의 핵산 활성제는 RNA 간섭을 매개할 수 있는 RNAi 분자이다. 상기 방법에서, 상기 RNAi 분자는 siRNAs, shRNAs, ddRNAs, piRNAs 또는 rasiRNAs이다.
상기 방법에서, 상기 하나 이상의 핵산 활성제는 miRNAs, 안티센스 RNAs, 플라스미드, 하이브리드 올리고뉴클레오티드 또는 압타머(aptamer)이다.
상기 방법에서, 상기 약학적으로 허용 가능한 담체(carrier)는 멸균수(sterile water), 주사용 증류수(water for injection), 멸균 생리 식염수(sterile normal saline), 주사용 정균수(bacteriostatic water for injection), 또는 네블라이져 용액(nebulizer solution)이다.
상기 방법에서, 상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 약학적으로 허용 가능한 용액이다.
상기 방법에서, 상기 약학적으로 허용 가능한 용액은 HEPES 완충액, 인산(phosphate) 완충액, 시트레이트(citrate) 완충액, 또는 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄(Tris(hydroxymethyl)aminomethane)을 포함하는 완충액이다.
상기 방법에서, 상기 덱스트린 화합물은 사이클로덱스트린이다.
상기 방법에서, 상기 사이클로덱스트린 화합물은 설포알킬(sulfoalkyl), 벤젠설포알킬(benzenesulfoalkyl), 아세토알킬(acetoalkyl), 하이드록시알킬(hydroxyalkyl), 하이드록시알킬 숙시네이트(hydroxyalkyl succinate), 하이드록시알킬 말로네이트(hydroxyalkyl malonate), 하이드록시알킬 글루타레이트(hydroxyalkyl glutarate), 하이드록시알킬 아디페이트(hydroxyalkyl adipate), 하이드록시알킬 (hydroxyalkyl), 하이드록시알킬 말레에이트(hydroxyalkyl maleate), 하이드록시알킬 옥살레이트(hydroxyalkyl oxalate), 하이드록시알킬 푸마레이트(hydroxyalkyl fumarate), 하이드록시알킬 시트레이트(hydroxyalkyl citrate), 하이드록시알킬 타르트레이트(hydroxyalkyl tartrate), 하이드록시알킬 말레이트(hydroxyalkyl malate), 또는 하이드록시알킬 시트라코네이트(hydroxyalkyl citraconate) 그룹으로 치환된 하나 이상의 2,3 및 6 하이드록실 위치를 가진다.
상기 방법에서, 상기 사이클로덱스트린 화합물은 (2-하이드록시프로필)-β-사이클로덱스트린((2-hydroxypropyl)-β-cyclodextrin), 2-하이드록시프로필-β-사이클로덱스트린 숙시네이트(2-hydroxypropyl-β-cyclodextrin succinate), (2-하이드록시프로필)-γ-사이클로덱스트린((2-hydroxypropyl)-γ-cyclodextrin), 또는 2-하이드록시프로필-γ-사이클로덱스트린 숙시네이트(2-hydroxypropyl-γ-cyclodextrin succinate)이다.
상기 방법에서, 상기 사이클로덱스트린 화합물은 설포부틸 에테르 β-사이클로덱스트린(sulfobutyl ether β-cyclodextrin) 또는 설포부틸 에테르 γ-사이클로덱스트린(sulfobutyl ether γ-cyclodextrin)이다.
상기 방법에서, 상기 사이클로덱스트린 화합물은 메틸-β-사이클로덱스트린(methyl-β-cyclodextrin) 또는 메틸-γ-사이클로덱스트린(methyl-γ-cyclodextrin)이다.
상기 방법에서, 상기 사이클로덱스트린 화합물은 흡착질(adsorbate) 화합물을 포함한다.
상기 방법에서, 상기 당류 당 화합물은 단당류 또는 이당류 당 화합물이다.
상기 방법에서, 상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 멸균수(sterile water), 주사용 증류수(water for injection), 멸균 생리 식염수(sterile normal saline), 주사용 정균수(bacteriostatic water for injection), 또는 네블라이져 용액(nebulizer solution)이다.
상기 방법에서, 상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 약학적으로 허용 가능한 용액이다.
상기 방법에서, 상기 재구성된 핵산 의약품은 0.2 μm를 초과한 크기를 갖는 응집체 입자(aggregate particles)를 0.001% (w/v) 미만으로 가진다.
상기 방법에서, 상기 핵산 의약품은 3 내지 30초 기간에 재구성된다.
상기 방법에서, 상기 핵산 의약품은 6개월의 저장 기간 후에 재구성되고 상기 핵산 제제의 80% 활성을 보유한다.
상기 방법에서, 상기 재구성된 핵산 의약품은 0.2 μm를 초과한 크기를 갖는 응집체 입자를 0.001% (w/v) 미만으로 가진다.
상기 방법에서, 상기 재구성된 핵산 의약품은 감소된 사이토카인(cytokine) 활성화를 가진다.
상기 방법에서, 상기 핵산 의약품은 3 내지 30초 기간에 재구성된다.
상기 방법에서, 상기 핵산 의약품은 6개월의 저장 기간 후에 재구성되고 상기 핵산 제제의 80% 활성을 보유한다.
도 1: 도 1은 Hsp47 (GP46)을 억제하기 위한 표적화된 siRNA 핵산 제제의 생체 내(in vivo) 효능에 대한 실험 결과를 나타낸 것으로, siRNA의 고체, 동결건조된 나노 입자 제형(formulation)의 재구성된 용액인 최종 의약품(drug product)로부터 얻은 것이다. 디메틸니트로스아민(Dimethylnitrosamine (DMN))로 유도된 간 섬유화 랫트 모델에서 재구성된 siRNA 약물 제형을 사용하였다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 재구성된 siRNA 나노 입자 약물 제형은 생체 내에서 Hsp47 (GP46)의 유전자 침묵(gene silencing)에 대해 강하고 놀라운 효능을 나타냈다. 생체 내 효능은 핵산 제제를 포함하는 동결건조되고 재구성된 나노 입자의 생존력(viability)에 대한 엄격한 테스트이다. 동결건조된 siRNA의 나노 입자 제형은 40% (w/v)의 (2-하이드록시프로필)-β-사이클로덱스트린((2-hydroxypropyl)-β-cyclodextrin) 및 60%의 수크로스(sucrose)로 구성된 총 10% (w/v)의 보호제(protectant) 함량을 포함하였다.
도 2: 도 2는 동결건조되고 재구성된 siRNA 나노 입자 제형(formulation)의 생체 내(in vivo) 혈장 농도 약물 동력학(pharmacokinetics)에 대한 실험 결과를 보여준다. Hsp47 (GP46)을 표적으로 하는 siRNA는 리포좀성(liposomal) 나노 입자로 제형화되었다. 나노 입자 제형은 수크로스 및 (2-하이드록시프로필)-β-사이클로덱스트린을 포함하는 보호제 조성물로 동결건조되었다. 동결건조된 siRNA의 나노 입자 제형은 40% (w/v)의 (2-하이드록시프로필)-β-사이클로덱스트린((2-hydroxypropyl)-β-cyclodextrin) 및 60%의 수크로스(sucrose)로 구성된 총 12.5% (w/v)의 보호제 함량을 포함하였다. 혈장 PK 프로파일은 동결된 제형(frozen formulation)과 비교하여 동결건조된 제형(lyophilized formulation)의 단일 투여 수준에서 정맥 내 투여 후 스프라그 돌리 랫트(Sprague Dawley rats)에서 평가되었다. 혈장 샘플의 siRNA 농도는 혼성화-기반의 ELISA(hybridization-based ELISA) 방법으로 결정되었다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 동결건조되고 재구성된 siRNA 약물 제형의 혈장 농도 약물 동력학은 단지 동결된 비교 대조군 제형과 본질적으로 동일하였다.
본 발명은 핵산 기반의 분자로 구성된 치료제를 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명은 핵산 제제를 포함하는 치료제 조성물의 동결건조물 형태를 제조하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다.
몇몇 측면에서, 본 발명은 효과적인 치료제 조성물로 재구성될 수 있는 나노 입자의 동결건조물 형태를 제공한다. 상기 나노 입자는 핵산 제제를 운반체(cargo)로 캡슐화할 수 있다. 본 발명의 상기 동결건조물 형태는 형질주입(transfection) 하기 위한 치료제 핵산 제제를 캡슐화하는 나노 입자 제형(formulations)을 다시 만들고(re-compose) 전달하는 데 사용될 수 있다.
추가의 측면에서, 본 발명은 동결건조 공정에서 안정한 치료제 나노 입자의 용액 또는 현탁액을 형성하기 위한 화합물 및 방법을 제공한다. 본 발명의 상기 동결건조 공정은 치료제 지질 나노 입자의 안정한 동결건조물 형태를 제공할 수 있고, 상기 나노 입자는 핵산 제제를 캡슐화할 수 있다. 상기 동결건조물 형태는 일정 기간 동안 저장될 수 있고, 캡슐화된 핵산 제제로 치료제 지질 나노 입자를 제공하기 위해 재구성될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 핵산 치료제의 장기 저장을 위한 안정한 고체 동결건조물 형태를 제공하기 위해 동결건조 공정을 거칠 수 있는 지질 나노 입자의 용액 또는 현탁액을 위한 일련의 조성물 및 화합물을 포함한다. 본 발명의 조성물 및 방법은 재구성될 수 있는 동결건조물 형태를 제공할 수 있고, 유리한 활성, 입자 크기, 저장 시간 및 혈청 안정성을 제공할 수 있다.
추가의 측면에서, 본 발명은 개체(subjects), 조직(tissues) 및 기관(organs)에 활성제(active agents) 또는 약물 화합물을 전달 및 분배하는 나노 입자를 제공하기 위한 화합물, 조성물 및 방법에 관한 것이다.
본 발명은 세포에 활성제를 전달하기 위한 일련의 지질 화합물 및 이온화성 화합물(ionizable compounds)을 제공한다. 본 명세서의 상기 지질 화합물 및 이온화성 화합물은 활성제를 전달하고 분배하기 위한 나노 입자를 형성하는 데 사용될 수 있다.
본 발명은 예를 들어, siRNA 제제를 포함하는 지질 나노 입자 약물 제형을 고려하며, 이는 상기 나노 입자의 현탁액의 동결건조(lyophilization) 및 상기 나노 입자의 현탁액으로 재구성(reconstitution)에 의해 제조될 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 지질 나노 입자는 siRNA 완충 용액에 지질/에탄올 용액을 고속 주입함으로써 합성될 수 있다. 제2 완충액은 정용여과(diafilter)되고 TFF 카트리지를 통한 외부 완충액(external buffer)으로서 사용되어, 최종 생성물 수성 현탁액을 제조할 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 상기 나노 입자는 45 nm 내지 110 nm의 평균 직경을 가질 수 있다. 상기 핵산 활성제의 농도는 1mg/mL 내지 10 mg/mL 일 수 있다.
상기 현탁액이 보호된 조성물로 제조될 때, 지질 나노 입자는 상기 현탁액의 동결건조를 견딜 수 있다는 것이 놀랍게도 밝혀졌다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명의 보호된 조성물은 약학적으로 허용 가능한 용액 내의 상기 지질 나노 입자의 수성 현탁액, 덱스트린 화합물, 및 당류(saccharide) 당(sugar) 화합물로 구성될 수 있다. 상기 지질 나노 입자는 하나 이상의 핵산 활성제와 같은 활성제를 캡슐화할 수 있다.
상기 보호된 현탁액의 동결건조는 고체 동결건조 생성물(a solid lyophile product)을 제공할 수 있으며, 이는 지질 나노 입자의 현탁액으로 재구성될 수 있다.
상기 재구성된 현탁액은 지질 나노 입자를 포함할 수 있으며, 이는 상기 활성제를 캡슐화하고 동결건조 전의 지질 나노 입자와 유사하다.
특정 실시양태에서, 상기 재구성된 현탁액은 캡슐화된 제제(encapsulated agent)의 활성을 제공할 수 있으며, 이는 동결건조 전의 현탁액의 활성과 유사하다.
추가의 측면에서, 상기 재구성된 현탁액은 동결건조 전 현탁액의 것과 유사한 안정한 나노 입자를 제공할 수 있다. 특정 측면에서, 상기 나노 입자의 평균 입자 크기는 동결건조 전 현탁액 중의 나노 입자의 크기와 거의 동일할 수 있다.
본 발명의 상기 조성물 및 방법은 캡슐화된 제제(encapsulated agent)를 가지는 나노 입자로 구성된 재구성된 현탁액의 놀라운 활성 및 안정성을 제공할 수 있다.
몇몇 추가 측면에서, 동결건조되고 재구성된 상기 보호된 현탁액은 동결건조를 위한 보호제(protectant) 조성물을 포함할 수 있다. 본 발명의 보호제 조성물은 덱스트린 화합물 및 당류 당 화합물로 구성될 수 있다. 상기 덱스트린 및 당류 당 화합물의 총량은 상기 보호된 현탁액의 2% 내지 20% (w/v)일 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 상기 덱스트린 화합물은 상기 보호제 조성물 중 덱스트린 및 당 화합물의 총량의 40% 내지 70% (w/v)일 수 있다. 특정 실시양태에서, 상기 덱스트린 화합물은 상기 보호제 조성물 중 덱스트린 및 당 화합물의 총량의 40% 내지 55% (w/v)일 수 있다. 추가의 실시양태에서, 상기 덱스트린 화합물은 상기 보호제 조성물 중 덱스트린 및 당 화합물의 총량의 40% 내지 45% (w/v)일 수 있다. 이러한 조성물은 재구성된 나노 입자 현탁액의 예상치 못한 유리한 성질, 예를 들어 나노 입자 크기 또는 활성의 미미한 변화를 제공할 수 있다.
몇몇 측면에서, 나노 입자의 보호된 현탁액의 동결건조 및 재구성 시, 상기 나노 입자의 평균 크기는 동결건조 전 본래의 조성물에서의 나노 입자의 크기의 10% 이내일 수 있다. 특정 측면에서, 나노 입자의 보호된 현탁액의 동결건조 및 재구성 시, 상기 나노 입자의 평균 크기는 동결건조 전 본래의 조성물에서의 나노 입자의 크기의 5% 이내일 수 있다.
본 발명은 예를 들어, siRNA 제제를 포함하는 지질 나노 입자 약물 제형을 고려하며, 이는 상기 나노 입자의 현탁액의 동결건조(lyophilization), 및 저장 기간 후 현탁액으로 상기 나노 입자의 재구성(reconstitution)에 의해 제조될 수 있다. 상기 재구성된 현탁액은 캡슐화된 제제(encapsulated agent)의 활성을 제공할 수 있으며, 동결건조 전 현탁액의 활성과 유사하다.
저장 기간 후에 제조된 상기 재구성된 현탁액은 지질 나노 입자를 포함할 수 있으며, 이는 상기 활성제를 캡슐화하고 동결건조 전 지질 나노 입자와 유사하다.
특정 실시양태에서, 저장 기간 후에 제조된 상기 재구성된 현탁액은 캡슐화된 제제(encapsulated agent)의 활성을 제공할 수 있으며, 동결건조 전 현탁액의 것과 유사하다.
추가의 측면에서, 저장 기간 후에 제조된 상기 재구성된 현탁액은 동결건조 전 현탁액의 것과 유사한 안정한 나노 입자를 제공할 수 있다. 특정 측면에서, 상기 나노 입자의 평균 입자 크기는 동결건조 전 나노 입자의 크기와 거의 동일할 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 상기 동결건조된 조성물은 적어도 한달 동안 5℃에서 저장될 수 있다. 추가의 실시양태에서, 상기 동결건조된 조성물은 적어도 한달 동안 20℃에서 저장될 수 있다.
활성제(Active agents)
본 발명의 상기 조성물 및 방법은 유전자 발현을 억제하기 위한 제제(agents)를 분산시키는 데 사용될 수 있다. 유전자 발현을 억제하기 위한 제제의 예는 리보 자임(ribozymes), 안티센스 핵산(anti-sense nucleic acids) 및 RNA 간섭 분자 (RNAi 분자)를 포함하는 억제성 핵산 분자를 포함한다.
본 발명의 치료제 조성물은 억제성 핵산 분자를 포함할 수 있다. RNA 간섭을 매개할 수 있는 핵산 분자의 예는 siRNA (small interfering RNA), miRNA (micro RNA), shRNA (short hairpin RNA), ddRNA (DNA-directed RNA), piRNA (Piwi-interacting RNA), 또는 rasiRNA (repeat associated siRNA) 및 이들의 변형된 형태와 같은 이중가닥 RNA(duplex RNA)를 포함하는 RNA 간섭에 활성이 있는 분자를 포함한다.
본 발명의 활성 치료제의 예는 DNA, 플라스미드, 하이브리드 올리고뉴클레오티드 또는 압타머(aptamer)를 포함한다.
본 명세서의 예비 동결건조 제형 중 상기 활성 핵산 분자의 농도는 약 1 mg/mL 내지 약 10 mg/mL 일 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 명세서의 제형 중 상기 활성 핵산 분자의 농도는 약 1 mg/mL 내지 약 5 mg/mL, 또는 2 mg/mL 내지 4 mg/mL 일 수 있다.
예비 동결건조 지질 나노 입자 제형(Pre- lyophilization lipid nanoparticle formulations)
본 발명의 실시양태는 지질 나노 입자의 조성물을 제공할 수 있으며, 상기 조성물은 동결건조 공정을 위한 보호제(protectant) 화합물을 포함한다.
상기 지질 나노 입자는 당업계에 공지된 임의의 조성물을 가질 수 있다. 상기 지질 나노 입자는 당업계에 공지된 공정을 포함하는 임의의 공정에 의해 캡슐화 된 운반체(cargo)로 합성되고 적재될 수있다.
몇몇 실시양태에서, 상기 지질 나노 입자는 침지 주입 공정에 의해 제조될 수 있다. 지질 나노 입자를위한 공정의 몇몇 예가 US 2013/0115274에 제시되어 있다.
리포좀을 제조하기 위한 몇몇 예가 Szoka, Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9:467 (1980); Liposomes, Marc J. Ostro, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1983, Chapter 1에 제시되어 있다.
일반적으로, 지질 나노 입자는 유기 용매 중의 지질 성분(component)을 활성 핵산 제제를 포함하는 수성 완충액과 혼합함으로써 합성될 수 있다. 상기 리포좀은 여과(filtration) 또는 압출(extrusion)에 의해 크기가 정해질 수있다. 상기 리포좀 현탁액 또는 용액은 정용여과(diafiltration)에 의해 추가로 변형될 수 있다.
동결건조 공정을 위해 안정화된 본 발명의 지질 나노 입자 조성물은 현탁액 중에 핵산 제제와 같은 하나 이상의 활성제를 캡슐화하는 지질 나노 입자를 포함할 수 있다. 상기 현탁액은 수성일 수 있고, 에탄올과 같은 수혼화성(water-miscible) 용매를 포함할 수 있다. 동결건조 공정을 위해 안정화된 상기 조성물은 동결건조 공정에서 리포좀을 안정화시키는 보호제 화합물을 추가로 포함할 수 있다.
합성된 지질 나노 입자의 평균 크기는 40 nm 내지 120 nm, 또는 45 nm 내지 110 nm, 또는 85 nm 내지 105 nm 일 수 있다.
본 발명의 지질 나노 입자 조성물 중 상기 활성제의 농도는 약 0.1 mg/mL 내지 약 10 mg/mL 범위 일 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 지질 나노 입자 조성물 중 상기 활성제의 농도는 0.5 mg/mL 내지 8 mg/mL, 또는 1 mg/mL 내지 6 mg/mL, 또는 2 mg/mL 내지 5 mg/mL, 또는 3 mg/mL 내지 4 mg/mL일 수 있다.
보호제 화합물의 예는 덱스트린 화합물을 포함한다.
덱스트린 화합물의 예는 말토덱스트린(maltodextrins), 및 베타- 및 감마- 사이클로덱스트린(cyclodextrins)을 포함한다.
덱스트린 화합물의 예는 메틸화된 베타- 및 감마- 사이클로덱스트린 화합물, 및 설포알킬 에테르 베타- 및 감마- 사이클로덱스트린 화합물을 포함한다.
덱스트린 화합물의 예로는 설포알킬(sulfoalkyl), 벤젠설포알킬(benzenesulfoalkyl), 아세토알킬(acetoalkyl), 하이드록시알킬(hydroxyalkyl), 하이드록시알킬 숙시네이트(hydroxyalkyl succinate), 하이드록시알킬 말로네이트(hydroxyalkyl malonate), 하이드록시알킬 글루타레이트(hydroxyalkyl glutarate), 하이드록시알킬 아디페이트(hydroxyalkyl adipate), 하이드록시알킬 (hydroxyalkyl), 하이드록시알킬 말레에이트(hydroxyalkyl maleate), 하이드록시알킬 옥살레이트(hydroxyalkyl oxalate), 하이드록시알킬 푸마레이트(hydroxyalkyl fumarate), 하이드록시알킬 시트레이트(hydroxyalkyl citrate), 하이드록시알킬 타르트레이트(hydroxyalkyl tartrate), 하이드록시알킬 말레이트(hydroxyalkyl malate), 또는 하이드록시알킬 시트라코네이트(hydroxyalkyl citraconate) 그룹으로 치환된 하나 이상의 2,3 및 6 하이드록실 위치를 가지는 사이클로덱스트린을 포함한다.
덱스트린 화합물의 예는 (2-하이드록시프로필)-β-사이클로덱스트린((2-hydroxypropyl)-β-cyclodextrin), 2-하이드록시프로필-β-사이클로덱스트린 숙시네이트(2-hydroxypropyl-β-cyclodextrin succinate), (2-하이드록시프로필)-γ-사이클로덱스트린((2-hydroxypropyl)-γ-cyclodextrin), 및 2-하이드록시프로필-γ-사이클로덱스트린 숙시네이트(2-hydroxypropyl-γ-cyclodextrin succinate)를 포함한다.
덱스트린 화합물의 예는 하이드록시에틸 β-사이클로덱스트린(hydroxyethyl β-cyclodextrin)을 포함한다.
덱스트린 화합물의 예는 디메틸 β-사이클로덱스트린(dimethyl β-cyclodextrin) 및 트리메틸 β-사이클로덱스트린 (trimethyl β-cyclodextrin)을 포함한다.
덱스트린 화합물의 예는 설포부틸 에테르 β-사이클로덱스트린(sulfobutyl ether β-cyclodextrin) 및 설포부틸 에테르 γ-사이클로덱스트린(sulfobutyl ether γ-cyclodextrin)을 포함한다.
덱스트린 화합물의 예는 메틸-β-사이클로덱스트린(methyl-β-cyclodextrin) 또는 메틸-γ-사이클로덱스트린(methyl-γ-cyclodextrin)을 포함한다.
덱스트린 화합물의 예는 하이드록시프로필-설포부틸-β-사이클로덱스트린(hydroxypropyl-sulfobutyl-β-cyclodextrin)을 포함한다.
덱스트린 화합물의 예는 H107 시그마(SIGMA) 사이클로덱스트린 (시그마-알드리치 사(Sigma-Aldrich Corp.))을 포함한다.
덱스트린 화합물의 예는 카바맥스(CAVAMAX), 카바솔(CAVASOL) 및 카바트론(CAVATRON) 사이클로덱스트린 (애쉬랜드 사(Ashland Inc.))을 포함한다.
덱스트린 화합물의 예는 클레포스(KLEPTOSE) 및 크라이스멥(CRYSMEB) 사이클로덱스트린 (로케테 아메리카 사(Roquette America Inc.))을 포함한다.
덱스트린 화합물의 예는 캅티솔(CAPTISOL) 사이클로덱스트린 (리간드 파마슈티칼 사(Ligand Pharmaceuticals, Inc.))을 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 덱스트린 화합물의 예는 중합체 사슬 또는 네트워크에 부착된 덱스트린 화합물을 포함한다. 예를 들어, 사이클로덱스트린 분자는 폴리아크릴산(polyacrylic acid)의 중합체에 부착될 수 있다. 추가의 실시양태에서, 사이클로 덱스트린 분자는 아크릴로일(acryloyl) 그룹과 같은 가교 결합 화합물과 함께 결합 될 수 있다. 특정 실시양태에서, 부착된 사이클로 덱스트린 화합물을 갖는 아크릴레이트(vinyl acrylate) 하이드로겔 형태가 사용될 수 있다.
몇몇 측면에서, 본 발명의 지질 나노 입자 조성물에 사용되는 덱스트린 화합물은 지질 나노 입자 조성물에 도입되기 전에 흡착질(adsorbate) 화합물과 결합될 수 있다. 임의의 특정 이론에 구애되지 않고, 상기 덱스트린 화합물에 의한 스테롤(sterol) 화합물의 예비 흡착(pre-adsorption)은 재구성된 의약품(drug product)에서 상기 활성제의 활성 손실을 방지할 수 있는 내포 복합체(inclusion complex)를 형성할 수 있다.
흡착질 화합물의 예는 콜레스테롤(cholesterol), 라노스테롤(lanosterol), 지모스테롤(zymosterol), 지모스테놀(zymostenol), 데스모스테롤(desmosterol), 스티그마스타놀(stigmastanol), 디하이드로라노스테롤(dihydrolanosterol), 7-디하이드로콜레스테롤(7-dehydrocholesterol)을 포함한다.
흡착질 화합물의 페길화된 콜레스테롤(pegylated cholesterols) 및 콜레스탄 3-옥소-(C1-22)아실 화합물(cholestane 3-oxo-(C1-22)acyl compounds), 예를 들어, 콜레스테릴 아세테이트(cholesteryl acetate), 콜레스테릴 아라키도네이트(cholesteryl arachidonate), 콜레스테릴 부티레이트(cholesteryl butyrate), 콜레스테릴 헥사노에이트(cholesteryl hexanoate), 콜레스테릴 미리스테이트(cholesteryl myristate), 콜레스테릴 팔미테이트(cholesteryl palmitate), 콜레스테릴 베헤네이트(cholesteryl behenate), 콜레스테릴 스테아레이트(cholesteryl stearate), 콜레스테릴 카프릴레이트(cholesteryl caprylate), 콜레스테릴 n-데카노에이트(cholesteryl n-decanoate), 콜레스테릴 도데카노에이트(cholesteryl dodecanoate), 콜레스테릴 네르보네이트(cholesteryl nervonate), 콜레스테릴 펠라고네이트(cholesteryl pelargonate), 콜레스테릴 n-발레레이트(cholesteryl n-valerate), 콜레스테릴 올레에이트(cholesteryl oleate), 콜레스테릴 엘라이데이트(cholesteryl elaidate), 콜레스테릴 에루케이트(cholesteryl erucate), 콜레스테릴 헵타노에이트(cholesteryl heptanoate), 콜레스테릴 리놀레이데이트(cholesteryl linolelaidate) 및 콜레스테릴 리놀레이트(cholesteryl linoleate)를 포함한다.
흡착 화합물의 예로는 피토스테롤(phytosterols), 베타-시토스테롤(beta-sitosterol), 캄페스테롤(campesterol), 에르고스테롤(ergosterol), 브라시카스테롤(brassicasterol), 델타-7-스티그마스테롤(delta-7-stigmasterol), 및 델타-7-아베나스테롤(delta-7-avenasterol)을 포함한다.
보호제 화합물의 추가의 예는 당류(saccharide) 화합물을 포함한다. 당류 화합물의 예는 당(sugar) 화합물을 포함한다.
보호제 화합물의 예는 수크로스(sucrose), 락토오스(lactose), 락툴로스(lactulose), 말토오스(maltose), 트레할로스(trehalose), 셀로비오스(cellobiose), 코지비오스(kojibiose), 사케비오스(sakebiose), 이소말토오스(isomaltose), 소포로스(sophorose), 라미나리비오스(laminaribiose), 겐티오비오스(gentiobiose), 투라노오스(turanose), 말툴로스(maltulose), 이소말툴로스(isomaltulose), 겐티오비우로스(gentiobiulose), 만노비오스(mannobiose), 멜리비오스(melibiose), 멜리비우로스(melibiulose), 및 자일로비오스(xylobiose)와 같은 이당류 뿐만 아니라 C(5-6) 알도오스(aldoses) 및 케토오스(ketoses)와 같은 단당류를 포함한다.
보호제 당류 화합물의 예는 피콜(ficoll)과 같은 다당류를 포함한다.
예비 동결건조 제형 중의 보호제 화합물의 농도는 약 1% (w/v) 내지 약 25% (w/v)일 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 예비 동결건조 제형 중의 보호제 화합물의 농도는 2% (w/v) 내지 20% (w/v), 또는 4% (w/v) 내지 16% (w/v) 또는, 5% (w/v) 내지 15% (w/v), 또는 6% (w/v) 내지 14% (w/v) 또는 8% (w/v) 내지 12% (w/v)일 수 있다.
특정 실시양태에서, 예비 동결건조 제형 중의 보호제 화합물의 농도는 6% (w/v), 또는 8% (w/v), 또는 10% (w/v), 또는 12% (w/v), 또는 14% (w/v), 또는 16% (w/v), 또는 18% (w/v), 또는 20% (w/v), 또는 22% (w/v), 또는 24% (w/v)일 수 있다.
동결건조 공정( Lyophilization processes)
동결건조 공정은 약학 분야에서 공지된 바와 같이, 유리 용기(glass vessels), 또는 예를 들어, 유리 바이알(glass vials), 또는 이중 챔버 용기(dual-chamber vessels)와 같은 임의의 적합한 용기에서 수행될 수 있다.
보호제 화합물을 포함하는 본 발명의 안정화된 지질 나노 입자 조성물은 유리 용기에 도입될 수 있다. 용기에 첨가된 상기 조성물의 부피는 0.1 내지 20 mL, 또는 1 내지 10 mL 일 수 있다.
약학 분야에 공지된 것을 포함하는 임의의 동결건조 공정이 사용될 수 있다. 예를 들어, Remington 's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Mack Publishing Co., Easton, Penn. (1990) 참조.
상기 동결건조 공정은 약 -40℃ 내지 약 -30℃의 온도에서 상기 보호제로 안정화된 지질 나노 입자 조성물을 동결시키는 것을 포함할 수 있다. 상기 동결된 조성물(frozen composition)은 동결건조된 조성물로부터 건조될 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 상기 동결하는 단계는 몇 분에 걸쳐 주위 온도에서 최종 온도로 온도를 상승시킬 수 있다. 온도 상승은 약 1℃/분이 될 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 상기 건조하는 단계는 약 0 내지 250 mTorr, 또는 50 내지 150 mTorr의 압력에서, 약 -15℃ 내지 약 -38℃의 온도에서 수행될 수 있다. 상기 건조하는 단계는 주위 온도(ambient temperature)까지 고온에서 며칠 동안에 걸쳐 계속될 수 있다. 상기 고체 동결건조물 중의 잔여의 물(water) 수준은 약 5% 미만, 또는 4% 미만, 또는 3% 미만, 또는 2% 미만, 또는 1% 미만 (w/v) 일 수 있다.
동결건조 후, 본 발명의 상기 보호제로 안정화된 지질 나노 입자 조성물은 약학 분야에 공지된 방법에 의해 재구성될 수 있다.
몇몇 측면에서, 본 발명은 동결건조 후 본 발명의 보호제로 안정화된 지질 나노 입자 조성물로부터 제조된 재구성된 의약품에 응집된 입자의 수준을 억제하는 방법을 제공한다.
몇몇 실시양태에서, 동결건조 후 본 발명의 보호제로 안정화된 지질 나노 입자 조성물로부터 제조된 상기 재구성된 의약품은 감소된 수준의 응집체 입자를 가질 수 있다.
특정 실시양태에서, 동결건조 후 본 발명의 보호제로 안정화된 지질 나노 입자 조성물로부터 제조된 상기 재구성된 의약품은 약 0.2 ㎛ 초과, 또는 약 0.5 ㎛ 초과, 또는 약 1㎛ 초과의 크기를 가지는 감소된 수준의 응집체 입자를 가질 수 있다.
재구성된 의약품(Reconstituted drug product)
상기 동결건조물은 약학적으로 허용 가능한 담체에서 재구성될 수 있다.
약학적으로 허용 가능한 담체의 예는 멸균수(sterile water), 주사용 증류수(water for injection), 멸균 생리 식염수(sterile normal saline), 주사용 정균수(bacteriostatic water for injection), 또는 네블라이져 용액(nebulizer solution)을 포함한다.
약학적으로 허용 가능한 담체의 예는 약학적으로 허용 가능한 용액을 포함한다.
약학적으로 허용 가능한 용액의 예는 HEPES 완충액, 인산(phosphate) 완충액, 시트레이트(citrate) 완충액, 및 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄(Tris(hydroxymethyl)aminomethane)을 포함하는 완충액을 포함한다.
약학적으로 허용 가능한 용액의 예는 약학적으로 허용 가능한 완충 용액을 포함한다.
약학적으로 허용 가능한 용액의 예는 말레산(maleic acid), 타르타르산(tartaric acid), 락트산(lactic acid), 아세트산(acetic acid), 중탄산 나트륨(sodium bicarbonate) 및 글리신(glycine)의 완충 용액을 포함한다.
상기 재구성된 동결건조물은 의약품으로 사용할 수 있다.
상기 재구성된 동결건조물은 투여용으로 미리 결정된 농도를 제공하기 위해 등장성 식염수(isotonic saline) 또는 다른 부형제(excipient)로 추가로 희석될 수 있다.
부형제의 예는 긴장제(tonicifiers)를 포함한다.
부형제의 예는 인간 혈청 알부민(human serum albumin), 소 혈청 알부민(bovine serum albumin), α-카제인(α-casein), 글로불린(globulins), α-락트알부민(α-lactalbumin), LDH, 리소자임(lysozyme), 미오글로빈(myoglobin), 오발부민(ovalbumin) 및 RNase A와 같은 안정화제(stabilizers)를 포함한다.
부형제의 예는 아세트산 칼륨(potassium acetate), 아세트산 나트륨(sodium acetate) 및 중탄산 나트륨(sodium bicarbonate)과 같은 완충액을 포함한다.
부형제의 예는 글리신(glycine), 알라닌(alanines), 아르기닌(arginine), 베타인(betaine), 류신(leucine), 라이신(lysine), 글루탐산(glutamic acid), 아스파라트산(aspartic acid), 히스티딘(histidine), 프롤린(proline), 4-하이드록시프롤린(4-hydroxyproline), 사르코신(sarcosine), γ-아미노부티르산(γ-aminobutyric acid), 알라노파인(alanopine), 옥토파인(octopine), 스트롬바인(strombine), 및 트리메틸아민 N-옥사이드(trimethylamine N-oxide)와 같은 아미노산을 포함한다.
부형제의 예는 폴리소르베이트 20(polysorbate 20), 폴리소르베이트 80(polysorbate 80) 및 폴록사머 407(poloxamer 407)과 같은 비이온성 계면활성제를 포함한다.
부형제의 예는 포스포티딜 콜린(phosphotidyl choline), 에탄올아민(ethanolamine), 아세틸트립토파네이트(acethyltryptophanate), 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol), 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone), 에틸렌 글리콜(ethylene glycol), 글리세린(glycerin), 글리세롤(glycerol), 프로필렌 글리콜(propylene glycol), 소르비톨(sorbitol), 자일리톨(xylitol), 덱스트란(dextran) 및 젤라틴(gelatin)과 같은 분산제를 포함한다.
부형제의 예는 아스코르브산(ascorbic acid), 시스테인(cysteine), 티오글리세롤(thioglycerol), 티오글리콜산(thioglycolic acid), 티오솔비톨(thiosorbitol) 및 글루타티온(glutathione)과 같은 항산화제를 포함한다.
부형제의 예는 디티오트레이톨(dithiothreitol), 티올(thiols), 및 티오펜(thiophenes)과 같은 환원제를 포함한다.
부형제의 예는 EDTA, EGTA, 글루탐산 및 아스파르트산과 같은 킬레이트제를 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 동결건조물은 마개가 있는 바이알을 통해 주사기 바늘을 사용하여 재구성될 수 있다. 상기 동결건조물은 바이알을 흔들거나 흔들지 않고 재구성할 수 있다.
재구성을위한 시간은 3 내지 30 초, 또는 그 이상일 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 상기 재구성된 핵산 의약품은 0.2 ㎛ 초과의 크기를 갖는 0.001% (w/v) 미만의 응집체 입자를 가질 수 있다.
특정 측면에서, 상기 재구성된 핵산 의약품은 감소된 사이토카인 활성화를 가질 수 있다.
추가의 측면에서, 상기 핵산 의약품은 6개월의 저장 기간 후에 재구성될 수 있고 상기 핵산 제제의 80% 활성을 보유할 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 상기 핵산 의약품은 6개월의 저장 기간 후에 재구성될 수 있고 상기 지질 나노 입자의 평균 입자 크기는 25% 미만 동결건조 전보다 또는 초과일 수 있다.
특정 실시양태에서, 상기 핵산 의약품은 24개월의 저장 기간 후에 재구성될 수 있고 상기 핵산 제제의 90% 활성을 보유할 수 있다.
추가의 실시양태에서, 상기 핵산 의약품은 24개월의 저장 기간 후에 재구성될 수 있고, 상기 지질 나노 입자의 평균 입자 크기는 25% 미만 동결건조 전보다 또는 초과일 수 있다.
RNAi 분자( RNAi molecules)
본 발명의 조성물에서 제형화된 활성 RNA 간섭을 유발하는 성분의 양은 투여의 이점을 초과하는 역효과를 일으키지 않는 양일 수 있다. 이러한 양은 배양된 세포를 사용한 시험관 내(in vitro) 시험 또는 모델 동물 또는 마우스, 랫트, 개, 또는 돼지 등과 같은 포유류에서의 시험에 의해 결정될 수 있고, 이러한 시험 방법은 당업자에게 알려진 것이다. 본 발명의 방법은 인간을 포함한 임의의 동물에게 적용될 수 있다.
제형화된 활성 성분의 양은 상기 제제(agent) 또는 조성물이 투여되는 방식에 따라 달라질 수 있다. 예를 들면, 1회의 투여에 상기 조성물을 복수 단위로 사용하는 경우, 상기 조성물의 하나의 단위로 제형화된 유효 성분의 양은 상기 복수 단위에 의해 1회 투여에 필요한 활성 성분의 양을 분할함에 의해 결정될 수 있다.
본 발명의 상기 핵산 분자 및 RNAi 분자는 세포 내로의 진입을 돕거나, 촉진시키거나 또는 가능하게 하는 리포좀 제형 내 상기 분자를 직접적인 적용에 의해 세포, 조직, 기관 또는 개체로 전달 또는 투여될 수 있다.
본 발명의 상기 핵산 분자 및 RNAi 분자는 양이온성 지질로 복합체화, 리포좀으로 패킹화 및 표적 세포 또는 조직에 전달될 수 있다. 상기 핵산 또는 핵산 복합체는 생체 외(ex vivo), 또는 생체 내(in vivo) 조직에 피부 도포(dermal application), 경피 투여(transdermal application) 또는 주사(injection)를 통해 국소적으로 투여될 수 있다.
본 발명의 억제성 핵산 분자 또는 조성물은 단위 투여량 형태(unit dosage form)로 투여될 수 있다. 질병으로부터 고등받는 환자에게 상기 화합물을 투여하는 적합한 제형 또는 조성물을 제공하기 위해 통상적인 약학적 관행은 사용될 수 있다. 임의의 적절한 투여 경로는 사용될 수 있으며, 예를 들어, 투여는 비경구(parenteral), 정맥 내(intravenous), 동맥 내(intraarterial), 피하(subcutaneous), 종양 내(intratumoral),근육 내(intramuscular), 두개 내(intracranial), 안와 내(intraorbital), 안구(ophthalmic), 심실 내(intraventricular), 간장 내(intrahepatic), 낭 내(intracapsular), 척수강 내(intrathecal), 뇌조 내(intracistemal), 복강 내(intraperitoneal), 비강 내(intranasal), 에어로졸(aerosol), 좌약(suppository), 또는 경구(oral) 투여일 수 있다.
본 명세서의 조성물 및 방법은 상기 핵산 분자의 발현을 허용하는 방식으로 본 발명의 하나 이상의 RNAi 분자를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터를 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 핵산 분자 및 RNAi 분자는 DNA 또는 RNA 벡터에 삽입된 전사 유닛으로부터 발현될 수 있다. 재조합 벡터는 DNA 플라스미드 또는 바이러스 벡터 일 수 있다.
예를 들어, 상기 벡터는 이중 가닥(duplex)의 RNAi 분자의 두 가닥 모두를 암호화하는 서열, 또는 자기-상보적이어서 RNAi 분자를 형성하는 단일 핵산 분자를 암호화하는 서열을 포함할 수 있다. 발현 벡터는 둘 이상의 핵산 분자를 암호화하는 핵산 서열을 포함할 수 있다.
핵산 분자는 세포 내에서 진핵 세포 프로모터로부터 발현될 수 있다. 당업자는 진핵 세포에서 임의의 핵산이 적절한 DNA/RNA 벡터로부터 발현될 수 있음을 인식한다.
지질 제형은 정맥 내, 근육 내 또는 복강 내 주사에 의해, 또는 경구로 또는 흡입 또는 당업계에 공지된 다른 방법에 의해 동물에게 투여될 수 있다.
올리고뉴클레오티드를 투여하기 위한 약학적으로 허용 가능한 제형(formulations)은 공지되어 있고 사용될 수 있다.
상기 방법의 한 실시양태에서, 상기 억제성 핵산 분자는 약 5 내지 500 mg/m2/일(day), 예를 들어, 5, 25, 50, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 또는 300 mg/m2/일(day)의 투여량(dosage)으로 투여될 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명의 상기 억제성 핵산 분자는 약 1 내지 100 mg/kg, 예를 들어, 1, 5, 10, 20, 25, 50, 75 또는 100 mg/kg의 투여량으로 전신 투여된다 .
추가의 실시양태에서, 상기 투여량은 약 25 내지 500 mg/m2/일(day)의 범위일 수 있다.
제형을 제조하기 위한 당업계에 공지된 방법은 예를 들어, "Remington: The Science and Practice of Pharmacy" Ed. A. R. Gennaro, Lippincourt Williams & Wilkins, Philadelphia, Pa., 2000에서 발견된다.
비경구여 투여를 위한 제형은, 예를 들어, 부형제(excipients), 멸균수(sterile water), 또는 식염수(saline), 폴리에틸렌 글리콜과 같은 폴리알킬렌 글리콜, 식물성 오일, 또는 수소화된 나프탈렌을 포함할 수 있다. 생체적합성, 생분해성 락티드 폴리머(lactide polymer), 락티드/글리콜리드(lactide/glycolide) 공중합체, 또는 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌(polyoxyethylene-polyoxypropylene) 공중합체는 상기 화합물의 방출을 조절하는 데 사용될 수 있다. 억제성 핵산 분자를 위한 다른 잠재적으로 유용한 비경구 전달 시스템은 에틸렌-비닐 아세테이트(ethylene-vinyl acetate) 공중합체 입자, 삼투 펌프, 이식 가능한 투입(infusion) 시스템 및 리포좀을 포함한다. 흡입을 위한 제형은 부형제, 예를 들어, 락토오스(lactose)를 포함할 수 있거나, 예를 들어, 폴리옥시에틸렌-9-라우릴 에테르(polyoxyethylene-9-lauryl ether), 글리코콜레이트(glycocholate) 및 디옥시콜레이트(deoxycholate)를 포함하는 수용액일 수 있거나, 점비액(nasal drop), 또는 겔 형태로 투여하기 위한 유성 용액일 수 있다.
상기 제형은 종양 질환(neoplastic disease) 또는 상태에 대한 치료를 제공하기 위해 치료학적 유효한 양 (예를 들어, 병리학적 상태를 예방, 제거 또는 감소시키는 양)으로 인간 환자에게 투여될 수 있다. 본 발명의 뉴클레오티드 올리고머(oligomer)의 바람직한 투여량은 장애의 유형 및 범위, 특정 환자의 전반적인 건강 상태, 상기 화합물 부형제의 제형 및 그의 투여 경로와 같은 변수에 좌우될 수 있다.
지질 조성물의 예(Examples of lipid compositions)
특정 실시양태에서, 네 가지 지질 유사 성분, 즉 하나 이상의 이온화성 지질 분자(ionizable lipid molecules), 구조적 지질(structural lipid), 하나 이상의 안정화제 지질, 및 상기 조성물의 면역원성을 감소시키기 위한 하나 이상의 지질은 상기 조성물의 지질 성분의 100% 일 수 있다.
지질 나노 입자 조성물의 예를 표 1에 나타내었다.
표 1: 지질 성분의 조성물 (각각 전체의 mol%로 표시)
이온화성
(Ionizable)		 양이온성
(Cationic)		 구조적
(Structural)		 안정화제
(Stabilizer)		 면역감소
(Reduce immun.)
17 0 35 40 8
20 0 35 40 5
25 0 35 39 1
25 0 35 35 5
25 0 30 40 5
25 0 40 30 5
30 0 25 40 5
35 0 25 35 5
40 0 30 25 5
25 5 30 35 5
25 10 30 30 5
25 15 25 30 5
이온화성 지질 유사 분자(Ionizable lipid-like molecules)
이온화성 분자의 예는 화학식 Ⅰ에 나타낸 구조를 갖는 화합물을 포함한다
Figure pct00001
화학식 Ⅰ
여기서 R1 및 R2 은
Figure pct00002
Figure pct00003
이고,
여기서 n 및 m은 각각 독립적으로 1 내지 2; 및 R4 및 R5 은 각각 독립적으로 C(12-20) 알킬 그룹, 또는 C(12-20) 알케닐 그룹이고;
여기서 R3 은 1-아제티딘(1-azetidines), 1-피롤리딘(1-pyrrolidines), 1-피페리딘(1-piperidines), 4-모르폴린(4-morpholines), 및 1,4-피페라진(1,4-piperazines)에서 선택되고, 상기 고리는 임의의 탄소 원자 위치에서 하기로 치환될 수 있고,
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
그리고 또한 아미노 및 아미노알킬 그룹에서 선택될 수 있고, 이는 하기로 치환될 수 있다
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
여기서
각 R6 은 독립적으로 H, 알킬, 히드록실, 하이드록시알킬, 알콕시, 알콕시알콕시, 및 아미노알킬에서 선택되고;
각 R7 은 독립적으로 H, 알킬, 하이드록시알킬 및 아미노알킬에서 선택되고;
각 R8 은 독립적으로 H, 알킬, 하이드록시알킬, 및 아미노알킬이고, 임의의 두 개의 R8 은 고리를 형성할 수 있고;
q 는 0 내지 4이고;
Q 는 O 또는 NR7이고;
p 는 1 내지 4이다.
이온화성 지질의 예는 하기 화합물을 포함한다:
화합물 A6은
Figure pct00011
((2-((3S,4R)-3,4-디하이드록시피롤리딘-1-일)아세틸)아잔디일)비스(에탄-2,1-디일) (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트) (((2-((3S,4R)-3,4-dihydroxypyrrolidin-1-yl)acetyl)azanediyl)bis(ethane-2,1-diyl) (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-bis(octadeca-9,12-dienoate))이다.
이온화성 지질의 예는 하기 화합물을 포함한다:
화합물 A9은
Figure pct00012
((2-(3-(하이드록시메틸)아제티딘-1-일)아세틸)아잔디일)비스(에탄-2,1-디일) 디테트라데카노에이트 (((2-(3-(hydroxymethyl)azetidin-1-yl)acetyl)azanediyl)bis(ethane-2,1-diyl) ditetradecanoate)이다.
이온화성 지질의 예는 하기 화합물을 포함한다:
화합물 AA는
Figure pct00013
((2-(4-(2-하이드록시에틸)피페라진-1-일)아세틸)아잔디일)비스(에탄-2,1-디일) (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트) (((2-(4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl)acetyl)azanediyl)bis(ethane-2,1-diyl) (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-bis(octadeca-9,12-dienoate))이다.
이온화성 지질에 대한 예는 하기 화합물을 포함한다:
화합물 AB는
Figure pct00014
((2-(4-(2-하이드록시에틸)피페라진-1-일)아세틸)아잔디일)비스(에탄-2,1-디일) (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-디에노에이트) (((2-(4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl)acetyl)azanediyl)bis(ethane-2,1-diyl) (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-bis(octadeca-9,12-dienoate)) 이다.
이온화성 지질의 예는 하기 화합물을 포함한다:
화합물 C2는
Figure pct00015
2-((1-(((9Z,12Z)-헵타데카-9,12-디엔-1-일)옥시)-5-(((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일)옥시)-1,5-디옥소펜탄-3-yl)아미노)-N,N,N-트리메틸-2-옥소에탄-1-아미늄 (2-((1-(((9Z,12Z)-heptadeca-9,12-dien-1-yl)oxy)-5-(((9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-yl)oxy)-1,5-dioxopentan-3-yl)amino)-N,N,N-trimethyl-2-oxoethan-1-aminium)이다.
이온화성 지질의 예는 하기 화합물을 포함한다:
화합물 F5는
Figure pct00016
2-((9Z,12Z)-N-(3-(디메틸아미노)프로필)옥타데카-9,12-디엔아미도)에틸 (9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에노에이트 (2-((9Z,12Z)-N-(3-(dimethylamino)propyl)octadeca-9,12-dienamido)ethyl (9Z,12Z)-octadeca-9,12-dienoate)이다.
이온화성 지질의 예는 하기 화합물을 포함한다:
화합물 F7은
Figure pct00017
N,N,N-트리메틸-3-((9Z,12Z)-N-(2-(((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에노일)옥시)에틸)옥타데카-9,12-디엔아미도)프로판-1-아미늄 (N,N,N-trimethyl-3-((9Z,12Z)-N-(2-(((9Z,12Z)-octadeca-9,12-dienoyl)oxy)ethyl)octadeca-9,12-dienamido)propan-1-aminium)이다.
이온화성 지질의 예는 하기 화합물을 포함한다:
화합물 C24은
Figure pct00018
N,N,N-트리메틸-2-(((S)-3-(((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일)옥시)-2-((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔아미도)-3-옥소프로필)아미노)-2-옥소에탄-1-아미늄 (N,N,N-trimethyl-2-(((S)-3-(((9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-yl)oxy)-2-((9Z,12Z)-octadeca-9,12-dienamido)-3-oxopropyl)amino)-2-oxoethan-1-aminium)이다.
구조적 지질(Structural lipids)
구조적 지질의 예는 콜레스테롤, 스테롤 및 스테로이드를 포함한다.
구조적 지질의 예는 콜란(cholanes), 콜레스탄(cholestanes), 에르고스탄(ergostanes), 캄페스탄(campestanes), 포리페라스탄(poriferastanes), 스티그마스탄(stigmastanes), 고르고스탄(gorgostanes), 라노스탄(lanostanes), 고난(gonanes), 에스트란(estranes), 안도로스탄(androstanes), 프레그난(pregnanes), 및 사이클로아르탄(cycloartanes)을 포함한다.
구조적 지질의 예는 콜레스테롤, 라노스테롤, 지모스테롤, 지모스테놀, 데스모스테롤, 스티그마스타놀, 디하이드로라노스테롤 및 7-디하이드로콜레스테롤과 같은 스테롤 및 동물성 스테롤(zoosterols)을 포함한다.
구조적 지질의 예는 페길화된 콜레스테롤 및 콜레스탄 3-옥소-(C1-22)아실 화합물, 예를 들어, 콜레스테릴 아세테이트, 콜레스테릴 아라키도네이트, 콜레스테릴 부티레이트, 콜레스테릴 헥사노에이트, 콜레스테릴 미리스테이트, 콜레스테릴 팔미테이트, 콜레스테릴 베헤네이트, 콜레스테릴 스테아레이트, 콜레스테릴 카프릴레이트, 콜레스테릴 n-데카노에이트, 콜레스테릴 도데카노에이트, 콜레스테릴 네베보네이트, 콜레스테릴 펠라고네이트, 콜레스테릴 n-발레레이트, 콜레스테릴 올레에이트, 콜레스테릴 엘라이데이트, 콜레스테릴 에루케이트, 콜레스테릴 헵타노에이트, 콜레스테릴 리놀레이레이트 및 콜레스테릴 리놀레이트를 포함한다.
구조적 지질의 예는 피토스테롤, 베타-시토스테롤, 캄페스테롤, 에르고스테롤, 브라시카스테롤, 델타-7-스티그마스테롤 및 델타-7-아베나스테롤과 같은 스테롤을 포함한다.
안정화제 지질(Stabilizer lipids)
안정화제 지질의 예는 양쪽 이온성(zwitterionic) 지질을 포함한다.
안정화제 지질의 예는 인지질과 같은 화합물을 포함한다.
인지질의 예는 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine), 포스파티딜에탄올아민 (phosphatidylethanolamine), 포스파티딜세린(phosphatidylserine), 포스파티딜이노시톨(phosphatidylinositol), 포스파티드산(phosphatidic acid), 팔미토일올레오일 포스파티딜콜린(palmitoyloleoyl phosphatidylcholine), 리소포스파티딜콜린(lysophosphatidylcholine), 리소포스파티딜에탄올아민(lysophosphatidylethanolamine), 디팔미토일포스파티딜콜린(dipalmitoylphosphatidylcholine), 디올레오일포스파티딜콜린(dioleoylphosphatidylcholine), 디스테아로일포스파티딜콜린(distearoylphosphatidylcholine) 및 오르디리노레오일포스파티딜콜린(ordilinoleoylphosphatidylcholine)을 포함한다.
안정화제 지질의 예는 포스파티딜에탄올아민(phosphatidyl ethanolamine) 화합물 및 포스파티딜 콜린(phosphatidyl choline)화합물을 포함한다.
안정화제 지질의 예는 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholine, DOPC)을 포함한다.
안정화제 지질의 예는 디피타노일 포스파티딜 에탄올아민 (diphytanoyl phosphatidyl ethanolamine, DPhPE) 및 1,2-디피타노일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (1,2-Diphytanoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholine, DPhPC)을 포함한다.
안정화제 지질의 예는 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DSPC), 1,2- 디 팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DPPC), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, DPPE) 및 1,2- 디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, DOPE)을 포함한다.
안정화제 지질의 예는 1,2-디라우로일-sn-글리세롤 (1,2-dilauroyl-sn-glycerol, DLG); 1,2-디미리스토일-sn-글리세롤 (1,2-dimyristoyl-sn-glycerol, DMG); 1,2-디팔미토일-sn-글리세롤 (1,2-dipalmitoyl-sn-glycerol, DPG); 1,2-디스테아로일-sn-글리세롤 (1,2-distearoyl-sn-glycerol, DSG); 1,2-디아라키도일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (1,2-diarachidoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DAPC); 1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (1,2-dilauroyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DLPC); 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DMPC); 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-O-에틸-3-포스포콜린 (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-O-ethyl-3-phosphocholine, DPePC); 1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (1,2-dilauroyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, DLPE); 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, DMPE); 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, DSPE); 1-팔미토일-2-리노레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (1-palmitoyl-2-linoleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine); 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세롤-3-포스포콜린 (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, POPC); 1-팔미토일-2-리소-sn-글리세로-포스포콜린 (1-palmitoyl-2-lyso-sn-glycero-3-phosphocholine, P-Lyso-PC); 및 1-스테아로일-2-리소-sn-글리세로-3-포스포콜린 (1-Stearoyl-2-lyso-sn-glycero-3-phosphocholine, S-Lyso-PC)을 포함한다.
면역원성을 감소시키기 위한 지질(Lipids for reducing immunogenicity )
면역원성을 감소시키기 위한 지질의 예는 중합성 화합물(polymeric compounds) 및 중합체-지질 컨쥬게이트(polymer-lipid conjugates)를 포함한다.
면역원성을 감소시키기 위한 지질의 예는 폴리에틸렌글리콜(polyethyleneglycol, PEG) 영역을 갖는 페길화된 지질을 포함한다. 상기 PEG 영역은 임의의 분자량일 수 있다. 몇몇 실시양태에서, PEG 영역은 200, 300, 350, 400, 500, 550, 750, 1000, 1500, 2000, 3000, 3500, 4000 또는 5000 Da의 분자량을 가질 수 있다.
면역원성을 감소시키기 위한 지질의 예는 메톡시폴리에틸렌글리콜(methoxypolyethyleneglycol) 영역을 갖는 화합물을 포함한다.
면역원성을 감소시키기 위한 지질의 예는 카보닐-메톡시폴리에틸렌글리콜(carbonyl-methoxypolyethyleneglycol) 영역을 갖는 화합물을 포함한다.
면역원성을 감소시키기 위한 지질의 예는 다중 분지의 PEG(a multi-branched PEG) 영역을 갖는 화합물을 포함한다.
면역원성을 감소시키기 위한 지질의 예는 폴리글리세린(polyglycerine) 영역을 갖는 화합물을 포함한다.
면역원성을 감소시키기 위한 지질의 예는 DSPE-mPEG, DMPE-mPEG, DPPE-mPEG, 및 DOPE-mPEG와 같은 중합성 지질을 포함한다.
면역원성을 감소시키기 위한 지질의 예는 PEG-인지질(PEG-phospholipids) 및 PEG-세라마이드(PEG-ceramides)를 포함한다.
양이온성 지질(Cationic lipids)
양이온성 지질의 예는 US 2013/022665 A1에 기재된 HEDC 화합물 및 US 2013/0330401 A1 및 US 2013/0115274 A1에 기재된 다른 화합물을 포함한다. 양이온성 지질의 추가의 예는 당업계에 공지되어 있다.
나노 입자 제형( Nanoparticle formulations)
본 발명의 실시양태는 리포좀 나노 입자 조성물을 제공할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 이온화성 분자는 리포좀 조성물을 형성하는 데에 사용될 수 있으며, 리포좀 조성물은 지질-유사 분자의 이중층을 가질 수 있다.
나노 입자 조성물은 본 발명의 리포좀 구조, 이중층 구조, 미셀, 라멜라 구조(lamellar structure) 또는 이들의 혼합물에 하나 이상의 상기 이온화성 분자를 가질 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 조성물은 하나 이상의 액체 비히클(vehicle) 성분을 포함할 수 있다. 본 발명의 활성제의 전달에 적합한 액체 비히클은 약학적으로 허용 가능한 액체 비히클일 수 있다. 액체 비히클은 유기 용매, 또는 물과 유기 용매의 조합을 포함할 수 있다.
본 발명의 실시양태는 10 내지 1000 nm 크기를 갖는 지질 나노 입자를 제공할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 상기 리포좀 나노 입자는 10 내지 150 nm의 크기를 가질 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 상기 리포좀 나노 입자는 상기 RNAi 분자를 캡슐화할 수 있고, 인간 혈청에 1시간 동안 노출 후 상기 캡슐화된 RNAi 분자를 80% 이상 보유할 수 있다. 본 발명은 세포, 조직, 기관, 및 유기체(organisms) 및 개체(subjects)에 활성제를 분배하는 데 사용하기 위한 조성물을 제공할 수 있으며, 상기 조성물은 본 발명의 하나 이상의 이온화성 지질을 포함한다.
본 발명의 조성물은 구조적 지질, 하나 이상의 안정화제 지질, 및 상기 조성물의 면역원성을 감소시키기 위한 하나 이상의 지질과 함께, 하나 이상의 상기 이온화성 지질 분자를 포함할 수 있다.
본 발명의 이온화성 지질 분자는 본 발명의 조성물의 임의의 몰%(mol%) 일 수 있다.
본 발명의 조성물의 상기 이온화성 지질 분자는 상기 조성물의 지질 성분의 15 몰% 내지 40 몰% 일 수 있다. 특정 실시양태에서, 조성물의 상기 이온화성 지질 분자는 상기 조성물의 지질 성분의 20 몰% 내지 35 몰% 일 수있다. 추가의 실시양태에서, 조성물의 상기 이온화성 지질 분자는 상기 조성물의 지질 성분의 25 몰% 내지 30 몰% 일 수 있다.
본 발명의 조성물의 상기 구조적 지질은 상기 조성물의 지질 성분의 25 몰% 내지 40 몰% 일 수 있다. 특정 실시양태에서, 조성물의 상기 구조적 지질은 상기 조성물의 지질 성분의 30 몰% 내지 35 몰% 일 수 있다.
본 발명의 조성물의 상기 안정화제 지질의 합은 상기 조성물의 지질 성분의 25 몰% 내지 40 몰% 일 수 있다. 특정 실시양태에서, 조성물의 상기 안정화제 지질의 합은 상기 조성물의 지질 성분의 30 몰% 내지 40 몰% 일 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 둘 이상의 안정화제 지질을 포함할 수 있으며, 상기 각각의 안정화제 지질은 개별적으로 상기 조성물의 지질 성분의 5 몰% 내지 35 몰% 일 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 둘 이상의 안정화제 지질을 포함할 수 있으며, 상기 각각의 안정화제 지질은 개별적으로 상기 조성물의 지질 성분의 10 몰% 내지 30 몰% 일 수 있다.
특정 실시양태에서, 상기 하나 이상의 안정화제 지질의 합은 상기 조성물의 지질의 25 몰% 내지 40 몰% 일 수 있으며, 상기 각각의 안정화제 지질은 개별적으로 5 몰% 내지 35 몰% 일 수 있다.
특정 실시양태에서, 상기 하나 이상의 안정화제 지질의 합은 상기 조성물의 지질의 30 몰% 내지 40 몰% 일 수 있으며, 상기 각각의 안정화제 지질은 개별적으로 10 몰% 내지 30 몰% 일 수 있다.
상기 조성물의 면역원성을 감소시키기 위한 하나 이상의 지질은 상기 조성물의 지질 성분의 총 1 몰% 내지 8 몰% 일 수 있다. 특정 실시양태에서, 상기 조성물의 면역원성을 감소시키기 위한 하나 이상의 지질은 상기 조성물의 지질 성분의 총 1 몰% 내지 5 몰% 일 수 있다.
추가의 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 양이온성 지질을 추가로 포함할 수 있으며, 양이온성 지질은 상기 조성물의 지질 성분의 5 몰% 내지 25 몰% 일 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 양이온성 지질을 추가로 포함할 수 있으며, 양이온성 지질은 상기 조성물의 지질 성분의 5 몰% 내지 15 몰% 일 수 있다. 이러한 측면에서, 본 발명의 조성물의 상기 이온화성 지질 분자에 대한 상기 양이온성 지질의 농도의 몰비는 5:35 내지 25:15일 수 있다.
본 발명의 조성물에서, 상기 지질 성분의 전체는 하나 이상의 상기 이온화성 지질 분자 성분, 하나 이상의 구조적 지질, 하나 이상의 안정화제 지질 및 상기 조성물의 면역 원성을 감소시키기 위한 하나 이상의 지질을 포함할 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 조성물은 상기 이온화성 지질 화합물 A6, 상기 구조적 지질 콜레스테롤, 상기 안정화제 지질 DOPC 및 DOPE, 및 상기 면역원성을 감소시키기 위한 지질 DPPE-mPEG을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 화합물 A6은 상기 조성물의 15 내지 25 몰% 일 수 있고; 결합된 콜레스테롤, DOPC 및 DOPE는 상기 조성물의 75 내지 85 몰 %일 수 있고; 및 DPPE-mPEG는 상기 조성물의 5 몰% 일 수 있다.
하나의 실시양태에서, 화합물 A6은 상기 조성물의 25 몰% 일 수 있고; 콜레스테롤은 상기 조성물의 30 몰% 일 수 있고, DOPC는 상기 조성물의 20 몰% 일 수 있고, DOPE는 상기 조성물의 20 몰% 일 수 있고; 및 DPPE-mPEG (2000)은 상기 조성물의 5 몰% 일 수 있다.
약학적 조성물(Pharmaceutical compositions)
본 발명은 또한 본 발명의 조성물을 개체(subject)에게 투여함으로써 질병을 치료하기 위해 활성제를 개체의 기관에 분배하기 위한 방법을 고려한다. 치료될 수 있는 기관은 폐, 간, 췌장, 신장, 결장, 뼈, 피부 및 장을 포함한다.
추가의 측면에서, 본 발명은 일련의 약학적 제형(formulations)을 제공한다.
본 명세서의 약학적 제형은 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제와 함께, 본 발명의 약물 담체, 또는 지질 뿐만 아니라 활성제를 포함할 수 있다. 일반적으로, 본 명세서의 활성제는 임의의 억제성 핵산 분자 및 임의의 소형 분자 약물을 포함하는, 악성 종양을 위한 활성제를 포함한다. 억제성 핵산 분자의 예는 리보 자임, 안티센스 핵산, 및 RNA 간섭 분자 (RNAi 분자)를 포함한다.
본 발명의 약학적 제형은 하기 각각의 하나 이상을 포함할 수 있다: 계면 활성제(surface active agent), 희석제(diluent), 부형제(excipient), 방부제(preservative), 안정화제(stabilizer), 염료(dye) 및 현탁제(suspension agent).
본 발명의 상기 화합물 및 조성물을 제형화(formulating) 및 투여하기 위한 방법 뿐만 아니라 약학적 제형을 위한 몇몇의 약학적 담체, 희석제 및 성분은 Remington 's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Mack Publishing Co., Easton, Penn. (1990)에 기재되어 있다.
방부제의 예는 벤조산 나트륨(sodium benzoate), 아스코르브산(ascorbic acid), 및 p-하이드록시 벤조산(p-hydroxhbenzoic acid)의 에스테르(esters)를 포함한다.
계면 활성제의 예는 알코올, 에스테르, 황산화 지방족 알코올(sulfated aliphatic alcohols)을 포함한다.
부형제의 예는 수크로스, 글루코오스, 락토오스, 전분, 결정 셀룰로오스, 만니톨, 경질 무수 실리케이트(light anhydrous silicate), 마그네슘 알루미네이트(magnesium aluminate), 마그네슘 메타실리케이트 알루미네이트(magnesium metasilicate aluminate), 합성 알루미늄 실리케이트(synthetic aluminum silicate), 칼슘 카보네이트(calcium carbonate), 소듐 액시드 카보네이트(sodium acid carbonate), 칼슘 하이드로젠 포스페이트(calcium hydrogen phosphate), 및 칼슘 카복시메틸 셀룰로스(calcium carboxymethyl cellulose)를 포함한다.
현탁제의 예는 코코넛 오일, 올리브 오일, 참깨 오일, 땅콩 오일, 콩, 셀룰로스 아세테이트 프탈레이트(cellulose acetate phthalate), 메틸아세테이트-메타크릴레이트 공중합체(methylacetate-methacrylate copolymer), 및 에스테르 프탈레이트(ester phthalates)를 포함한다.
유전자 침묵(gene silencing)에 대해 활성인 하나 이상의 분자의 전달을 위한 본 발명의 치료제 제형은 이를 필요로 하는 포유 동물에게 투여될 수 있다. 리포좀 안에 캡슐화될 수 있는 상기 제형의 치료학적 유효한 양 및 활성제는 악성 종양을 예방 또는 치료하기 위해 포유류에 투여될 수 있다.
투여 경로는 국부적(local) 또는 전신적(systemic)일 수 있다.
본 발명의 치료학적으로 유효한 제형은 정맥 내, 복강 내, 근육 내, 피하, 및 경구를 포함한 다양한 경로로 투여될 수 있다.
투여 경로는 예를 들어, 척수강 내, 직접 심실 내, 복강 내, 비강 내 또는 안구 내(intraocular) 주사 뿐만 아니라 근육 내, 피하, 정맥 내, 골수 내(intramedullary) 주사를 포함한 비경구 전달을 포함할 수 있다.
상기 제형은 또한 미리 결정된 속도로 연장된 및/또는 정기의 펄스 투여(pulsed administration)를 위해 데포 주사(depot injections), 삼투압 펌프 등을 포함하는 서방형(sustained) 또는 방출 제어(controlled release) 투약 형태로 투여될 수 있다.
본 발명의 상기 조성물은 경구 및 비경구 경로 모두를 포함하는 다양한 경로를 통해 투여될 수 있으며, 그 예는 경구, 정맥 내, 근육 내, 피하, 국소, 폐 내(intrapulmonary), 기도 내(intra-airway), 기관 내(intratracheal), 기관지 내(intrabronchial), 비강(nasal), 직장(rectal), 동맥 내(intraarterial), 문맥 내(intraportal), 심실 내(intraventricular), 골수 내 (intramedullar), 림프절 내(intra-lymph-node), 임파선 내(intralymphatic), 뇌 내(intrabrain), 척수강 내(intrathecal), 뇌실 내(intracerebroventricular), 점막의(transmucosal), 경피의(percutaneous), 비강 내(intranasal), 복강 내(intraperitoneal), 및 자궁 내(intrauterine) 경로를 포함하나, 이에 한정되지 않으며, 각각의 투여 경로에 적합한 투여 형태로 제형화될 수 있다. 이러한 투여 형태 및 제형화 방법은 임의의 공지된 투여 형태 및 방법으로부터 적절하게 선택될 수 있다. 예로 Hyojun Yakuzaigaku, Standard Pharmaceutics, Ed. by Yoshiteru Watanabe et al., Nankodo, 2003. 참조.
경구 투여에 적합한 투약 형태의 예는 분말, 과립, 정제, 캡슐, 액체, 현탁액, 에멀젼, 겔 및 시럽을 포함하나, 이에 한정되지 않으며, 비경구 투여에 적합한 투약 형태의 예는 주사 가능한 용액, 주사 가능한 현탁액, 주사 가능한 에멀젼, 및 즉시 사용 가능한 주사와 같은 주사제를 포함한다. 비경구 투여를 위한 제형은 수성 또는 비수성 등장액 멸균 용액 또는 현탁액과 같은 형태일 수 있다.
예를 들어, 볼루스(bolus) 주사 또는 연속 주입에 의한 비경구 투여를 위한 약학적 제형은 수용성 형태의 상기 활성 제형의 수용액을 포함한다. 상기 활성 화합물의 현탁액은 적절한 유성 주사 현탁액으로서 제조될 수 있다. 수성 주사 현탁액은 소듐 카르복시메틸 셀룰로스(sodium carboxymethyl cellulose), 소르비톨, 또는 덱스트란과 같은 상기 현탁액의 점도를 증가시키는 물질을 포함할 수 있다. 선택적으로, 상기 현탁액은 고농축 용액의 제조를 허용하는 상기 화합물의 용해도를 증가시키는 적합한 안정화제 또는 제제(agents)를 포함할 수도 있다.
주사를 위한 제형은 방부제가 첨가된 단위 투여 형태, 예를 들어 앰플(ampoules), 또는 다회 투여 용기에 제공될 수 있다. 상기 제형은 유성 또는 수성 비히클 중의 현탁액, 용액 또는 에멀젼과 같은 형태를 취할 수 있고, 현탁제, 안정화제 및/또는 분산제와 같은 제제(agents)를 포함할 수 있다. 대안적으로, 상기 활성 성분은 사용하기 전에 적절한 비히클, 예를 들어 멸균된 발열원(pyrogen)이 없는 물로 구성하기 위한 분말 형태일 수 있다.
앞서 기재된 제조 이외에, 상기 제형은 또한 데포제(depot preparation)로서 제형화될 수 있다. 이러한 장시간 작용 제형은 근육 내 주사에 의해 투여될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 상기 제형은 적합한 중합성 또는 소수성 물질, 예를 들면 허용 가능한 오일 중의 에멀젼, 또는 이온 교환 수지, 또는 약한 용해성 유도체(sparingly soluble derivatives), 예를 들어 난용성 염(sparingly soluble salt)으로서 제형화될 수 있다.
본 발명의 조성물 및 제형은 또한 국소 전달을 위해 제형화될 수 있고 국소 전달 비히클의 적용을 위한 임의의 적합한 방법을 사용하여 개체의 피부에 적용될 수 있다. 예를 들어, 상기 제형은 수동으로, 어플리케이터를 사용하여, 또는 둘 다를 포함하는 공정에 의해 적용될 수 있다. 적용 후에, 상기 제형은 예를 들어 문지름에 의해 개체의 피부 내에서 작용될 수 있다. 적용은 매일 여러 번 또는 하루에 한 번씩 수행될 수 있다. 예를 들어, 상기 제형은 1 일 1 회, 1 일 2 회, 또는 하루에 여러 번 개체의 피부에 적용될 수 있거나 2 일마다 1 회, 3 일에 1 회, 또는 대략 매주 1 회, 2 주에 1 회, 또는 몇 주에 한 번씩 적용될 수 있다.
본 명세서에 기재된 상기 제형 또는 약학적 조성물은 임의의 적합한 수단에 의해 개체에게 투여될 수 있다. 투여 방법의 예는, 그 중에서도, (a) 주입 펌프 전달(infusion pumpdelivery)을 포함하는, 주사, 피하, 복강 내, 정맥 내, 근육 내, 피부 내(intradermally), 안와 내, 낭 내, 척수 내(intraspinally), 또는 흉골 내(intrasternally) 등을 통한 투여; (b) 살아있는 조직과 상기 활성 화합물을 접촉시키기 위해 당업자에 의해 적절하게 여겨지는 것 뿐만 아니라 신장(renal) 또는 심장(cardiac) 영역에 직접적으로 주사, 예를 들면, 데포 주입(depot implantation);과 같은 국소 투여를 포함한다.
상기 약학적 조성물을 위한 정확한 제형, 투여 경로 및 투여량은 환자의 상태를 고려하여 개개의 의사에 의해 선택될 수 있다. 예를 들어, Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 12th Ed., Sec. 1, 2011을 참조. 전형적으로, 환자에게 투여되는 상기 조성물의 투여량 범위는 환자의 체중의 약 0.5 내지 약 1000 mg/kg 일 수 있다. 복용량은 환자에 의해 요구되는 바에 따라, 1일 또는 그 이상의 날 동안 1회 또는 일련의 2회 또는 그 이상일 수 있다. 화합물에 대한 인간 투여량이 적어도 몇몇 조건으로 확립된 경우, 투여량은 거의 동일하거나, 확립된 인간 투여량의 약 0.1% 내지 500%, 보다 바람직하게는 약 25% 내지 250%의 투여량일 것이다. 새롭게 발견된 약학적 조성물의 경우와 같이, 인간 투여량이 확립되지 않은 경우, 적합한 인간 투여량은 ED50 또는 ID50 값, 또는 시험관 내 또는 동물에서 독성 연구 및 효능 연구에 의해 평가된 생체 내 연구로부터 유도된 다른 적절한 값으로부터 유추될 수 있다.
실시예
실시예 1: 동결건조 및 재구성에 의한 siRNA 지질 나노 입자 약물 제형의 제조.
지질/에탄올 용액을 siRNA 완충 용액에 10분 동안 고속으로 주입하여 지질 나노 입자를 합성하였다. 그 후, 시트르레이트 완충액 pH 6.1, PBS pH 7.0, 트리스 pH 7.2 및 HEPES pH 7.4로부터 선택된 제2 완충액을 정용여과하고 TFF 카트리지를 통한 외부 완충액으로서 사용되어, 최종 생성물 수성 현탁액을 제조하였다.
보호제 화합물의 다양한 양을 최종 생성물 수성 현탁액에 첨가한 후, 0.2/0.8 마이크로미터 여과하였다. 지질 나노 입자는 500 mL 또는 1000 mL 배치(barches)로 제조되었다.
결과: 지질 나노 입자는 동결건조 공정을 견뎠고, 상기 동결건조물은 본래의 현탁액에 존재하는 크기에 가까운 평균 입자 크기를 갖는 지질 나노 입자의 재구성된 현탁액을 제공한다는 것이 놀랍게도 밝혀졌다.
실시예 2: 본 발명의 재구성된 siRNA 약물 제형은 안정한 입자 크기 및 siRNA 캡슐화를 나타내며, 이는 의약품 사용하기에 적합하다. 본 발명의 siRNA 제형의 놀라운 수준의 안정성은 보호된 동결건조 조성물의 특성으로부터 발생한다.
본 발명에서, Hsp47을 표적으로 하는 siRNA는 다음과 같은 대략적인 조성을 갖는 리포좀성 나노 입자로 제형화되었다: 이온화성 지질 40 몰%, DOPE 30 몰%, 콜레스테롤 25 몰% 및 PEG-DMPE 5.0 몰%.
나노 입자 제형을 수크로스 및 (2-하이드록시프로필)-β-사이클로덱스트린을 포함하는 보호제 조성물로 동결건조시켰다. 조성물의 총 보호제 함량은 10% (w/v)이었다. 사용된 양은 6% 수크로스 및 4% (2-하이드록시프로필)-β-사이클로덱스트린이었다. 따라서, (2-하이드록시프로필)-β-사이클로덱스트린의 함량은 수크로스와 (2-하이드록시프로필)-β-사이클로덱스트린를 더한 총량의 40% (w/v)이었다.
지질/에탄올 용액을 siRNA 완충 용액에 고속으로 주입하여 지질 나노 입자를 합성하여 최종 생성물 수성 현탁액을 제조하였다. siRNA-함유 나노 입자의 초기 벌크 제형은 99-101 nm의 평균 나노 입자 크기 범위를 가졌다.
동결건조되고 재구성된 siRNA 약물 제형을 siRNA의 입자 크기 및 캡슐화의 안정성에 대해 테스트하였다.
일반적으로, siRNA 나노 입자 제형은 예비-동결건조된 상태와 동결건조되고 재구성된 상태 사이의 평균 입자 크기의 약 10% 미만의 변화를 나타내는 것이 가장 바람직하다. 또한, siRNA 나노 입자 제형은 동결건조되고 재구성된 상태의 siRNA 캡슐화 효율의 적어도 약 85%인 것이 가장 바람직하다.
재구성된 siRNA 나노 입자 생성물의 안정성을 표 2에 나타내었다. 표 2에서, 동결건조 및 재구성 후의 평균 입자 크기 및 siRNA 캡슐화 효율(AL)을 동결건조 전(BL)의 동결, 해동된 용액으로부터 수득한 유사한 결과와 함께 나타내었다.
표 2: 동결건조 전 및 재구성 후 나노 입자 안정성
총 보호제
% (w/v)		 Z(avg)
(nm)		 PDI 제타(Zeta)
(mV)		 %EE [siRNA]
mg/mL
BL AL BL AL BL AL BL AL
10% (A)* 105 108 0.14 0.167 -1.4 -1.7 91 86 1.9
10% (B) 106 110 0.156 0.138 -1.8 -1.7 92 87 2
10% (C) 106 108 0.15 0.165 -2 -1.7 92 87 1.9
10% (D) 105 111 0.146 0.157 -1.7 -2.4 92 85 1.8
10% (A) 106 111 0.134 0.149 -1.5 -1.1 93 88 3.7
12.5% (A) 106 112 0.165 0.186 -1.7 -1.6 93 87 3.7
15% (A) 105 112 0.17 0.141 -1.3 -1.1 93 87 3.6
15% (A) 106 116 0.14 0.149 -1.3 -0.5 93 88 4.4
15% (B) 105 116 0.154 0.157 -1.3 -0.7 93 88 4.4
15% (C) 105 118 0.151 0.15 -1.1 -0.8 93 88 4.5
*표 2에서, 4개의 다른 상업적 공급원 A, B, C 및 D로부터의 (2-하이드록시프로필)-β-사이클로덱스트린) 보호제 화합물을 사용하였다.
표 2에서, 모든 보호제 조성물은 최종 재구성된 siRNA 약물 제형의 적합한 안정성을 나타냈다. 최고 수준의 siRNA 농도 및 총 보호제 (15%)에서의 샘플을 제외하고, siRNA 나노 입자 제형은 동결건조되고 재구성된 상태의 적어도 85%의 siRNA 캡슐화 효율뿐만 아니라 동결건조 전 상태와 동결건조되고 재구성된 상태 사이에서 평균 입자 크기의 10% 미만의 변화를 나타냈다.
표 2의 결과는, 60% 수크로스 및 40% (2-하이드록시프로필)-β-사이클로덱스트린을 포함하는 보호제 조성물로부터 동결건조에 의해 나노 입자 제형으로부터 제조된 본 발명의 재구성된 siRNA 약물 제형이 평균 입자 크기 및 siRNA 캡슐화 효율에 있어서 유리하게 안정적임을 나타낸다.
실시예 3 : 디메틸니트로사민(Dimethylnitrosamine, DMN) 유도된 간 섬유증 랫트 모델.
본 발명의 재구성된 siRNA 약물 제형은 생체 내에서 유전자 침묵에 대해 강하고 놀라운 효능을 나타냈다. 동결건조 및 재구성된 siRNA 제형으로 생체 내 녹다운(knockdown)이 관찰되었다. 리포좀성 제형 내에 캡슐화된 siRNA를 디메틸니트로사민 (DMN) 유도된 간 섬유화 랫트 모델에 사용하였다.
Hsp47 (GP46)을 표적으로 하는 siRNA를 하기와 같은 대략적인 조성을 갖는 리포좀성 나노 입자로 제형화하였다: 이온화성 지질 40 몰%, DOPE 30 몰%, 콜레스테롤 25 몰%, 및 PEG-DMPE 5.0 몰%..
나노 입자 제형을 수크로스 및 (2-하이드록시프로필)-β-사이클로덱스트린을 포함하는 보호제 조성물로 동결건조시켰다. 총 보호제 함량은 10% (w/v)이었다. (2-하이드록시프로필)-β-사이클로덱스트린의 함량은 20% 내지 40% (w/v)로 다양했다.
샘플을 -80℃에서 저장한 신선하고 당일 동결건조된 케이크(cake)로부터 수득하였다. 샘플을 식염수(saline)로 재구성하고 0.17 mg/mL siRNA 농도까지 식염수로 추가 희석하였다. 재구성 시간은 3 mL의 부피로 약 20초였다.
Hsp47 siRNA의 최종 의약품 재구성 용액을 생체 내 효력에 대해 시험하였으며, 이는 핵산 제제를 포함하는 동결건조되고 재구성된 나노 입자의 생존력에 대한 엄격한 시험이다.
본 연구에서는 180 내지 200 g의 체중 범위를 갖는 7-8 마리의 수컷으로 이루어진 10 그룹의 나이브(Naive) 스프라그 돌리 랫트(Sprague Dawley rats)를 사용하였다. pH 7.4의 PBS를 갖는 액체 투여 형태가 사용되었다. 투여일에, 투여에 앞서, 제형을 재구성하고 식염수를 사용하여 그룹별 농도로 희석시켰다. 동결된 대조군 제형을 해동시키고, 투여하기 하루 전에 희석시켰다. 주사 당일에 5 mg/mL의 투명한 투여 용액을 얻기 위한 DMN의 양을 pH 7.4의 PBS에 첨가하였다. 투여는 복강 내 주사로 이루어졌다. 투여는 연속 3 일 동안, QD, 1~3일이었다. 투여량은 0.17 - 0.5 mg/mL의 제형 농도 범위를 이용한 0.5-1.5 mg/kg (siRNA)이었고, 투여된 부피는 3 mL/kg이었다. DMN 투여 전에 랫트의 무게를 재고 10 mg/kg 의 DMN (5 mg/ml 용액)을 1-3일에 투여 부피 2 mL/kg 로 복강 내 주사하였다. 4-6 일에, 동물에게 투여 부피 1 mL/kg의 DMN을 주사하였다. 5일째에, DMN-처리된 동물을 약물 투여 전의 체중(5일)에 기초한 그룹으로 무작위 추출하였다. 시험 물품을 6 일째에 투여하였다 (DMN 주사 첫 날이 1 일이었다). 7일 째에, 랫트의 간을 수득하고, 절단된 간문맥(clipped hepatic portal vein)을 통해 pH 7.4의 PBS (20 mL / 분의 속도로 40 mL)로 즉시 씻어냈다(flush). 1 개의 2 mm 두께의 횡단면의 간 구획을 좌측 롭스(lateral lobs)에서 수집하였다.
gp46 mRNA 녹다운 평가. RNeasy 컬럼 (퀴아젠(Qiagen))을 사용하여 랫트 간으로부터 총 RNA를 추출하였다. RNA를 나노드롭(Nanodrop) 분광 광도계(spectrophotometer)를 사용하여 정량화하였다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 40% (2-하이드록시프로필)-β-사이클로덱스트린으로 보호된 본 발명의 재구성된 siRNA 약물 제형은 생체 내에서 Hsp47 (GP46)의 유전자 침묵에 대한 강하고 놀라운 효능을 나타냈다.
특히, 40% (2-하이드록시프로필)-β-사이클로덱스트린으로 보호된 제형의 생체 내 Hsp47 (GP46) 유전자 침묵 효능은 본질적으로 100%였다.
반면, 20% 내지 30%의 (2-하이드록시프로필)-β-사이클로덱스트린을 포함하는 제형의 생체 내 효능은 허용할 수 없을 정도로 낮은 유전자 녹다운을 나타내었고, 단지 각각 47% 및 32% 였다.
요약하면, 예상치 못한 유리한 결과는 본 발명의 리포좀성 siRNA 제형의 동결건조를 위한 보호제 조성물이 수크로스 및 (2-히드록시프로필)-β-사이클로덱스트린을 포함하는 조성물 중 적어도 40% (2-하이드록시프로필)-β-사이클로덱스트린으로 제조될 수 있음을 보여준다.
물리적 특성(characterizaiton)은 약 40% 내지 약 70% (2-하이드록시프로필)-β-사이클로덱스트린 및 나머지 수크로스를 포함하는 보호제 조성물로부터 동결건조에 의해 나노 입자 제형으로부터 제조된 본 발명의 재구성된 siRNA 약물 제형이 평균 입자 크기에 있어서 유리하게 안정적이었다. 약 40% (2-하이드록시프로필)-β-사이클로덱스트린 이하에서, 제형은 비정상적으로 증가된 캡슐화 값을 갖는 경향이 있었으며, 이는 바람직하지 않은 구조적 변화의 징후이다. 따라서, (2-하이드록시프로필)-β-사이클로덱스트린 성분의 바람직한 범위는 약 40% 내지 약 70% 였다.
결론적으로, 본 발명의 재구성된 siRNA 약물 제형은 생체 내에서 핵산 약물 제제에 대해 놀라운 효능을 갖는 40% 내지 70% (2-하이드록시프로필)-β-사이클로덱스트린을 이용한다.
실시예 4: 본 발명의 재구성된 siRNA 약물 제형은 생체 내에서 유전자 침묵을 위한 충분한 혈장 농도를 나타냈다. 동결건조 및 재구성된 siRNA 제형의 혈장 약물 동력학(pharmacokinetics)이 생체 내에서 관찰되었다.
Hsp47 (GP46)을 표적으로하는 siRNA를 하기와 같은 대략적인 조성을 갖는 리포좀성 나노 입자로 제형화하였다: 이온화성 지질 40 몰%, DOPE 30 몰%, 콜레스테롤 25 몰% 및 PEG-DMPE 5.0 몰%.
나노 입자 제형을 수크로스 및 (2-하이드록시프로필)-β-사이클로덱스트린을 포함하는 보호제 조성물로 동결건조시켰다. 총 보호제 함량은 12.5% (w/v)이었다. (2-하이드록시프로필)-β-사이클로덱스트린의 함량은 총 보호제의 40% (w/v), 나머지는 수크로스였다.
혈장 PK 프로파일을 동결된 제형과 비교하여 동결건조된 제형의 단일 투여 수준에서 정맥 내 투여한 후 스프라그 돌리 랫트(Sprague Dawley rats)에서 평가하였다. 혈장 샘플의 siRNA 농도는 혼성화(hybridization)-기반의 ELISA 방법에 의해 결정되었다. 스프라그 돌리 랫트를 이중 목정맥(jugular vein) 카테터(catheter)로 준비하였다. 동물에게 1 일째에 하나의 문정맥 카테터를 통해 15초 동안 시험 물질을 1 회 볼루트 정맥 내 주사하였다. 각각의 동물의 문정맥 카테터로부터 전혈 약 0.30 mL를 각각의 시점에서 K2EDTA 튜브로 수집하였다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 동결건조되고 재구성된 siRNA 약물 제형의 혈장 농도 약물 동력학은 단지 동결된 비교 대조군 제형과 본질적으로 동일하였다. 동결건조되고 재구성된 siRNA 핵산 약물 제형은 혈장 내에서 놀랍도록 효율적인 수준의 약물 제제(agent)를 제공하였다.
이 실험에서, 단일 투여 후 시간-농도 곡선 (AUC) 및 최대 혈장 농도 (Cmax) 하의 면적을 표 3에 나타내었다.
표 3 : 동결건조되고 재구성된 핵산 제형의 혈장 약물 동력학
재구성된
(Reconstituted)		 동결된
(Frozen)
AUC 2751 2683
Cmax 2922 3350
결론적으로,이 실험은 동결건조되고 재구성된 핵산 제형의 혈장 농도 약물 동력학은 단지 동결된 비교 양성 대조군 제형과 본질적으로 동일함을 보여준다. 따라서, 동결건조되고 재구성된 siRNA 핵산 약물 제형은 혈장 내에서 놀랍도록 효율적인 수준의 약물 제제를 제공하고, 비-동결건조 조성물에 비해 분해되지 않았다.
실시예 5: 100 nm 크기 범위의 지질 나노 입자를 보호.
지질/에탄올 용액을 siRNA 완충액에 분산시켜 최종 생성물 수성 현탁액을 제조하여 지질 나노 입자를 합성하였다. 나노 입자는 105-106 nm의 평균 크기를 가졌다. 나노 입자는 이온화성 지질로서 화합물 HEDC를 사용하여 합성되었다 (예를 들어, US 2013/022665 A1 참조). 나노 입자는 Hsp47을 표적으로 하는 siRNA를 캡슐화했다.
표 4는 동결건조 전의 나노 입자의 특성을 나타내며, 여기서 최종 생성물 수성 현탁액은 단지 동결되고 해동된다. 표 5는 동결건조 후의 나노 입자 특성을 나타낸다.
표 4 내지 표 5의 평균 입자 크기의 증가는 단지 6.7 %이다.
표 4: 동결건조 전 나노 입자 특성 (100 nm 크기 범위)
No. 수크로스/2HPBCD
　(wt%/wt%)		 예비-동결건조 (동결)
(Pre-lyophilization (Frozen))
Z(avg) (nm) PDI 제타(Zeta)
(mV)		 EE
(%)		 [siRNA]
(mg/mL)		 수율 (yield)
(%)
1 6/4 105 0.14 -1.4 91 2.1 103
2 6/4 106 0.16 -1.8 92 2.1 105
3 6/4 106 0.15 -2 92 2.1 104
4 6/4 105 0.15 -1.7 92 2.1 104
5 6/4 106 0.14 -1.3 93 5.1 101
6 6/4 105 0.15 -1.3 93 4.9 99
7 6/4 105 0.15 -1.1 93 5.2 103
8 6/4 106 0.16 -0.9 93 5.2 104
표 5: 동결건조 후 나노 입자 특성 (100 nm 크기 범위)
No. 수크로스/2HPBCD
　(wt%/wt%)		 예비-동결건조 (동결)
(Pre-lyophilization (Frozen))
Z(avg) (nm) PDI 제타(Zeta)
(mV)		 EE
(%)		 [siRNA]
(mg/mL)		 수율 (yield)
(%)
1 6/4 108 0.17 -1.7 86 1.9 94
2 6/4 110 0.14 -1.7 87 2.0 98
3 6/4 108 0.16 -1.7 87 1.9 95
4 6/4 111 0.16 -2.4 85 1.8 92
5 6/4 116 0.15 -0.5 88 4.4 88
6 6/4 116 0.16 -0.7 88 4.4 89
7 6/4 118 0.15 -0.8 88 4.5 90
8 6/4 114 0.12 -1.3 87 4.42 88
추가 시험에서, 6% (w/v) 수크로스, 4% (w/v) (2-하이드록시프로필)-β-사이클로덱스트린 및 농도 2mg/mL의 Hsp47을 표적으로 하는 siRNA를 포함하는 9 개의 최종 생성물 용액을 동결건조 및 재구성 시 평균 입자 크기 증가에 대해 시험하였다. 동결건조 후 재구성된 의약품은, 동결 건조 전에 최종 생성물 용액에 비해, 평균 입자 크기가 5% 미만으로, 102 nm부터 107 nm까지, 놀랍게 거의 증가하지 않았다.
실시예 6: 50 nm 크기 범위의 지질 나노 입자를 보호.
지질/에탄올 용액을 siRNA 완충액에 고속으로 주입하여 지질 나노 입자를 합성하여 최종 생성물 수성 현탁액을 제조하였다. 나노 입자의 평균 크기는 48-50 nm이었다. 화합물 A6을 이온화성 지질로 사용하여 나노 입자를 합성하였다. 나노 입자는 2 mg/mL에서 Hsp47을 표적으로 하는 siRNA를 캡슐화했다.
표 6은 50 nm 범위의 나노 입자의 동결 건조 전 (BL) 및 동결 건조후 (AL)의 나노 입자 특성을 나타낸다.
표 6: 50 nm 범위의 나노 입자의 동결 건조 전후의 나노 입자 특성
수크로스/2HPBCD
　(wt%/wt%)		 Z(avg)
(nm)		 PDI
 제타(Zeta)
(mV)		 % EE
BL AL BL AL BL AL BL AL
5/5 48 53 0.07 0.13 -2.3 -3.3 76 66
6/4 48 51 0.07 0.14 -2.8 -4.8 81 68
12/0 50 75 0.08 0.25 -4.9 -2 86 81
실시예 7: 장기 보관을 위한 siRNA 지질 나노 입자의 보호.
본 발명의 재구성된 siRNA 약물 제형은 생체 내에서 유전자 침묵을 위한 장기 안정성을 나타냈다.
Hsp47 (GP46)을 표적으로 하는 siRNA를 하기와 같은 대략적인 조성을 갖는 리포좀성 나노 입자로 제형화 하였다: 이온화성 지질 40 몰%, DOPE 30 몰%, 콜레스테롤 25 몰% 및 PEG-DMPE 5.0 몰%.
나노 입자 제형을 수크로스 및 (2-하이드록시프로필)-β-사이클로덱스트린을 포함하는 보호제 조성물로 동결건조시켰다. 전체 보호제 함량은 10% 부터 12.5%까지 15% (w/v)까지였다. (2-하이드록시프로필)-β-사이클로덱스트린의 함량은 40% (w/v), 수크로스 60%였다. 사이클로덱스트린은 CAVITRON W7 HP5 PHARMA 사이클로덱스트린이었다.
바이알을 표 7에 나타낸 온도에서 4 주 동안 저장하였다. 저장 및 재구성 후, 표 7에 나타낸 바와 같이, 나노 입자의 평균 크기(PS, Z-avg)는 놀라울 정도로 안정했다.
표 7에 나타낸 바와 같이, siRNA 나노 입자의 크기는 본래 조성물에서의 나노 입자의 크기의 4% 이내였다.
표 7: 나노 입자 특성
샘플 총% 보호제
(sample total % protectant)		 온도 -20℃ 온도 5℃
초기 Z-avg 1 mo Z-avg 초기 Z-avg 1 mo Z-avg
Z-avg PDI Z-avg PDI Z-avg PDI Z-avg PDI
10 103 0.12 99 0.15 103 0.12 102 0.14
12.5 101 0.13 101 0.15 101 0.13 100 0.16
15 102 0.13 --- --- 102 0.13 102 0.15
10 100 0.13 99 0.17 100 0.13 96 0.16
12.5 95 0.16 94 0.14 95 0.16 94 0.14
15 96 0.13 95 0.13 96 0.13 96 0.13
10 95 0.15 95 0.16 95 0.15 96 0.15
12.5 95 0.15 92 0.11 95 0.15 93 0.14
15 94 0.13 92 0.14 94 0.13 91 0.14
실시예 8: 장기 보관을 위한 siRNA 지질 나노 입자의 보호.
본 발명의 재구성된 siRNA 제형은 생체 내에서 유전자 침묵에 대한 장기 안정성을 나타냈다.
Hsp47 (GP46)을 표적으로 하는 siRNA를 하기와 같이 대략적인 조성을 갖는 리포좀성 나노 입자로 제형화 하였다: 이온화성 지질 40 몰%, DOPE 30 몰%, 콜레스테롤 25 몰% 및 PEG-DMPE 5.0 몰%.
나노 입자 제형을 수크로스 및 (2-하이드록시프로필)-β-사이클로덱스트린을 포함하는 보호제 조성물로 동결건조시켰다. 총 보호제 함량은 10% 부터 12.5%까지 15% (w/v) 까지였다. (2-하이드록시프로필)-β사이클로덱스트린의 함량은 40% (w/v), 수크로스 60%이었다. 사이클로덱스트린은 CAVITRON W7 HP7 PHARMA 사이클로덱스트린이었다.
바이알을 표 8에 나타낸 온도에서 4주 동안 저장하였다. 저장 및 재구성 후, 표 8에 나타낸 바와 같이, 나노 입자의 평균 크기 (PS, Z-avg)는 놀라울 정도로 안정했다.
표 8에 나타낸 바와 같이, siRNA 나노 입자의 크기는 본래 조성물에서의 나노 입자의 크기의 5% 이내였다.
표 8: 나노 입자 특성
샘플 총% 보호제
(sample total % protectant)		 온도 -20℃ 온도 5℃
초기 Z-avg 1 mo Z-avg 초기 Z-avg 1 mo Z-avg
Z-avg PDI Z-avg PDI Z-avg PDI Z-avg PDI
10 103 0.11 99 0.14 103 0.11 99 0.15
12.5 101 0.14 99 0.15 101 0.14 98 0.15
15 102 0.15 --- --- 102 0.15 97 0.14
10 96 0.13 95 0.13 96 0.13 93 0.13
12.5 94 0.12 91 0.12 94 0.12 91 0.13
15 94 0.13 89 0.14 94 0.13 91 0.14
10 94 0.15 89 0.15 94 0.15 89 0.13
12.5 91 0.15 87 0.13 91 0.15 88 0.14
15 90 0.14 86 0.15 90 0.14 87 0.12
본 명세서에서 구체적으로 언급된 모든 공보, 특허 및 문헌은 모든 목적을 위해 그 전체가 참고 문헌으로 인용된다.
본 발명은 기재된 특정 방법, 프로토콜, 재료 및 시약이 다양할 수 있기 때문에 이에 한정되지 않는다. 본 명세서에서 사용되는 용어는 특정 실시양태만을 설명하기 위한 것이며, 본 발명의 범위를 제한하려는 것이 아님을 이해해야 한다. 본 명세서의 설명의 범위 및 사상을 벗어나지 않고 다양한 변경 및 수정이 본 명세서에 개시된 설명에 이루어질 수 있고, 이들 실시양태는 본 명세서 및 첨부된 청구항 범위 내에 있다는 것은 당업자에게 쉽게 명백할 것이다.
본 명세서 및 첨부된 청구항에서 사용된 바와 같이, 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 문맥이 달리 명시하지 않는 한 복수 참조를 포함한다는 것을 주의해야 한다. 또한, 용어 "a"(또는 "an"), "하나 이상" 및 "적어도 하나"는 본 명세서에서 상호교환 가능하게 사용될 수 있다. 용어 "포함하다(comprises)", "포함하는(comprising)", "포함하는(containing)", "포함하는(including)" 및 "갖는(having)"은 상호교환 가능하게 사용될 수 있으며, 제한없이 광범위하게 판독되어야 한다.
본 명세서에서 값의 범위를 열거한 것은 단지 범위 내에 속하는 각각의 개별값을 개별적으로 언급하는 약식 방법으로서 기능하도록 의도된 것이며, 본 명세서에 달리 지시되지 않는 한 각각의 개별 값은 본 명세서에서 개별적으로 인용된 것처럼 명세서에 통합된다. 마쿠쉬 그룹에 있어서, 당업자는 이 기재가 마쿠쉬 그룹의 구성원의 하위그룹뿐만 아니라 개별 구성원을 포함한다는 것을 인식할 것이다.
추가의 상세한 설명없이, 당업자는 상기 기재에 기초하여 본 발명을 최대한 활용할 수 있다고 믿어진다. 따라서, 이하의 특정 실시양태는 단지 예시적인 것으로 해석되어야 하며, 임의의 방법으로 본 명세서의 나머지 부분을 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다.
본 명세서에 개시된 모든 특징은 임의의 조합으로 조합될 수 있다. 본 명세서에 개시된 각각의 특징은 동일하거나 동등하거나 유사한 목적을 수행하는 대안적인 특징으로 대체될 수 있다.

Claims (56)

  1. 하기를 포함하는, 하나 이상의 핵산 활성제(active agent)를 포함하는 지질 나노 입자의 고체 동결건조물(lyophile)을 제조하기 위한 조성물:
    약학적으로 허용 가능한 용액 내의 지질 나노 입자의 수성 현탁액, 여기서 상기 지질 나노 입자는 하나 이상의 핵산 활성제를 캡슐화함;
    덱스트린 화합물; 및
    당류(saccharide) 당(sugar) 화합물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 덱스트린 및 당 화합물의 총량은 상기 조성물의 2% 내지 20% (w/v)인, 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 덱스트린 화합물은 상기 덱스트린 및 당 화합물의 총량의 40% 내지 70% (w/v)인, 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 덱스트린 화합물은 상기 덱스트린 및 당 화합물의 총량의 40% 내지 55% (w/v) 인, 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 덱스트린 화합물은 상기 덱스트린 및 당 화합물의 총량의 40% 내지 45% (w/v)인, 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 조성물의 동결건조(lyophilization) 및 재구성(reconstitution) 시, 상기 나노 입자의 평균 크기는 본래 조성물에서의 나노 입자의 크기의 10% 이내인, 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 조성물의 동결건조, 저장(storage) 및 재구성 시, 상기 나노 입자의 평균 크기는 본래 조성물에서의 나노 입자의 크기의 10% 이내인, 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 동결건조된 조성물은 적어도 한달 동안 5℃에서 저장되는 것인, 조성물.
  9. 제7항에 있어서, 상기 동결건조된 조성물은 적어도 한달 동안 -20℃에서 저장되는 것인, 조성물.
  10. 제1항에 있어서, 상기 나노 입자는 45 nm 내지 110 nm의 평균 직경을 가지는 것인, 조성물.
  11. 제1항에 있어서, 상기 핵산 활성제의 농도는 1 mg/mL 내지 10 mg/mL인, 조성물.
  12. 제1항에 있어서, 상기 지질 나노 입자는 화합물 A6, 화합물 A9, 화합물 AA, 화합물 AB, 화합물 C2, 화합물 F5, 화합물 F7 및 화합물 C24로부터 선택된 화합물을 포함하는 것인, 조성물.
  13. 제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 핵산 활성제는 RNA 간섭을 매개할 수 있는 RNAi 분자인, 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 상기 RNAi 분자는 siRNAs, shRNAs, ddRNAs, piRNAs 또는 rasiRNAs인, 조성물.
  15. 제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 핵산 활성제는 miRNAs, 안티센스 RNAs, 플라스미드, 하이브리드 올리고뉴클레오티드 또는 압타머(aptamer)인, 조성물.
  16. 제1항에 있어서, 상기 약학적으로 허용 가능한 용액은 HEPES 완충액, 인산(phosphate) 완충액, 시트레이트(citrate) 완충액, 또는 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄(Tris(hydroxymethyl)aminomethane)을 포함하는 완충액인, 조성물.
  17. 제1항에 있어서, 상기 덱스트린 화합물은 사이클로덱스트린(cyclodextrin)인, 조성물.
  18. 제17항에 있어서, 상기 사이클로덱스트린 화합물은 설포알킬(sulfoalkyl), 벤젠설포알킬(benzenesulfoalkyl), 아세토알킬(acetoalkyl), 하이드록시알킬(hydroxyalkyl), 하이드록시알킬 숙시네이트(hydroxyalkyl succinate), 하이드록시알킬 말로네이트(hydroxyalkyl malonate), 하이드록시알킬 글루타레이트(hydroxyalkyl glutarate), 하이드록시알킬 아디페이트(hydroxyalkyl adipate), 하이드록시알킬 (hydroxyalkyl), 하이드록시알킬 말레에이트(hydroxyalkyl maleate), 하이드록시알킬 옥살레이트(hydroxyalkyl oxalate), 하이드록시알킬 푸마레이트(hydroxyalkyl fumarate), 하이드록시알킬 시트레이트(hydroxyalkyl citrate), 하이드록시알킬 타르트레이트(hydroxyalkyl tartrate), 하이드록시알킬 말레이트(hydroxyalkyl malate), 또는 하이드록시알킬 시트라코네이트(hydroxyalkyl citraconate) 그룹으로 치환된 하나 이상의 2,3 및 6 하이드록실 위치를 가지는 것인, 조성물.
  19. 제17항에 있어서, 상기 사이클로덱스트린 화합물은 (2-하이드록시프로필)-β-사이클로덱스트린((2-hydroxypropyl)-β-cyclodextrin), 2-하이드록시프로필-β-사이클로덱스트린 숙시네이트(2-hydroxypropyl-β-cyclodextrin succinate), (2-하이드록시프로필)-γ-사이클로덱스트린((2-hydroxypropyl)-γ-cyclodextrin), 또는 2-하이드록시프로필-γ-사이클로덱스트린 숙시네이트(2-hydroxypropyl-γ-cyclodextrin succinate)인, 조성물.
  20. 제17항에 있어서, 상기 사이클로덱스트린 화합물은 설포부틸 에테르 β-사이클로덱스트린(sulfobutyl ether β-cyclodextrin) 또는 설포부틸 에테르 γ-사이클로덱스트린(sulfobutyl ether γ-cyclodextrin)인, 조성물.
  21. 제17항에 있어서, 상기 사이클로덱스트린 화합물은 메틸-β-사이클로덱스트린(methyl-β-cyclodextrin) 또는 메틸-γ-사이클로덱스트린(methyl-γ-cyclodextrin)인, 조성물.
  22. 제17항에 있어서, 상기 사이클로덱스트린 화합물은 중합체 사슬 또는 네트워크에 부착된 것인, 조성물.
  23. 제17항에 있어서, 상기 사이클로덱스트린 화합물은 흡착질(adsorbate) 화합물을 포함하는 것인, 조성물.
  24. 제23항에 있어서, 상기 흡착질 화합물은 콜레스테롤(cholesterol), 라노스테롤(lanosterol), 지모스테롤(zymosterol), 지모스테놀(zymostenol), 데스모스테롤(desmosterol), 스티그마스타놀(stigmastanol), 디하이드로라노스테롤(dihydrolanosterol), 7-디하이드로콜레스테롤(7?dehydrocholesterol), 페길화된 콜레스테롤(pegylated cholesterol), 콜레스테릴 아세테이트(cholesteryl acetate), 콜레스테릴 아라키도네이트(cholesteryl arachidonate), 콜레스테릴 부티레이트(cholesteryl butyrate),콜레스테릴 헥사노에이트(cholesteryl hexanoate), 콜레스테릴 미리스테이트(cholesteryl myristate), 콜레스테릴 팔미테이트(cholesteryl palmitate), 콜레스테릴 베헤네이트(cholesteryl behenate), 콜레스테릴 스테아레이트(cholesteryl stearate), 콜레스테릴 카프릴레이트(cholesteryl caprylate), 콜레스테릴 n-데카노에이트(cholesteryl n-decanoate), 콜레스테릴 도데카노에이트(cholesteryl dodecanoate), 콜레스테릴 네르보네이트(cholesteryl nervonate), 콜레스테릴 펠라고네이트(cholesteryl pelargonate), 콜레스테릴 n-발레레이트(cholesteryl n-valerate), 콜레스테릴 올레에이트(cholesteryl oleate), 콜레스테릴 엘라이데이트(cholesteryl elaidate), 콜레스테릴 에루케이트(cholesteryl erucate), 콜레스테릴 헵타노에이트(cholesteryl heptanoate), 콜레스테릴 리놀레이데이트(cholesteryl linolelaidate), 콜레스테릴 리놀레이트(cholesteryl linoleate), 베타-시토스테롤(beta-sitosterol), 캄페스테롤(campesterol), 에르고스테롤(ergosterol), 브라시카스테롤(brassicasterol), 델타-7-스티그마스테롤(delta-7-stigmasterol), 및 델타-7-아베나스테롤( delta-7-avenasterol)로부터 선택된 것인, 조성물.
  25. 제1항에 있어서, 상기 당류 당 화합물은 단당류 또는 이당류 당 화합물인, 조성물.
  26. 제25항에 있어서, 상기 당 화합물은 수크로스(sucrose), 락토오스(lactose), 락툴로스(lactulose), 말토오스(maltose), 트레할로스(trehalose), 셀로비오스(cellobiose), 코지비오스(kojibiose), 사케비오스(sakebiose), 이소말토오스(isomaltose), 소포로스(sophorose), 라미나리비오스(laminaribiose), 겐티오비오스(gentiobiose), 투라노오스(turanose), 말툴로스(maltulose), 이소말툴로스(isomaltulose), 겐티오비우로스(gentiobiulose), 만노비오스(mannobiose), 멜리비오스(melibiose), 멜리비우로스(melibiulose), 및 자일로비오스(xylobiose)로부터 선택된 것인, 조성물.
  27. 하나 이상의 핵산 활성제의 고체 동결건조물(lyophile)를 제조하는 방법으로서,
    상기 방법은 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 동결건조하는 것을 포함하는, 방법.
  28. 제27항의 방법으로 제조된 고체 동결건조물.
  29. 제27항에 따른 고체 동결건조물을 재구성하는 것을 포함하는 의약품(drug product)을 제조하는 방법.
  30. 제29항의 방법으로 제조된 의약품.
  31. 하기를 포함하는, 핵산 의약품을 제조하는 방법:
    지질 나노 입자를 합성하는 단계 여기서, 상기 지질 나노 입자는 하나 이상의 핵산 활성제를 캡슐화함;
    약학적으로 허용 가능한 용액에 지질 나노 입자의 수성 현탁액을 제공하는 단계;
    상기 지질 나노 입자를 포함하는 용액에 덱스트린 화합물을 첨가하는 단계;
    상기 지질 나노 입자를 포함하는 용액에 당류 당 화합물을 첨가하는 단계;
    상기 지질 나노 입자를 포함하는 용액을 동결건조하여 고체 동결건조물(lyophile)을 형성하는 단계;
    약학적으로 허용 가능한 담체에 상기 동견건조물을 재구성하여 핵산 의약품을 형성하는 단계.
  32. 제31항에 있어서, 상기 덱스트린 및 당류 당 화합물의 총량은 상기 나노 입자를 포함하는 용액의 2% 내지 20% (w/v)인, 방법.
  33. 제31항에 있어서, 상기 덱스트린 화합물은 상기 덱스트린 및 당류 당 화합물의 총량의 40% 내지 70% (w/v)인, 방법.
  34. 제31항에 있어서, 상기 덱스트린 화합물은 상기 덱스트린 및 당류 당 화합물의 총량의 40% 내지 55% (w/v) 인, 방법.
  35. 제31항에 있어서, 상기 덱스트린 화합물은 상기 덱스트린 및 당류 당 화합물의 총량의 40% 내지 45% (w/v)인, 방법.
  36. 제31항에 있어서, 상기 재구성 시, 상기 나노 입자의 평균 크기는 합성될 때 나노 입자의 크기의 10% 이내인, 방법.
  37. 제31항에 있어서, 재구성 이전에 상기 동결건조물을 저장하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  38. 제37항에 있어서, 상기 동결건조물의 저장 및 재구성 시, 상기 나노 입자의 평균 크기는 합성될 때 나노 입자의 크기의 10% 이내인, 방법.
  39. 제37항에 있어서, 상기 동결건조물은 적어도 한달 동안 5℃에서 저장되는 것인, 방법.
  40. 제37항에 있어서, 상기 동결건조물은 적어도 한달 동안 -20℃에서 저장되는 것인, 방법.
  41. 제31항에 있어서, 상기 나노 입자는 45 nm 내지 110 nm의 평균 직경을 가지는 것인, 방법.
  42. 제31항에 있어서, 상기 핵산 활성제의 농도는 1 mg/mL 내지 10 mg/mL인, 방법.
  43. 제31항에 있어서, 상기 하나 이상의 핵산 활성제는 RNA 간섭을 매개할 수 있는 RNAi 분자인, 방법.
  44. 제31항에 있어서, 상기 약학적으로 허용 가능한 용액은 HEPES 완충액, 인산(phosphate) 완충액, 시트레이트(citrate) 완충액, 또는 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄(Tris(hydroxymethyl)aminomethane)을 포함하는 완충액인, 방법.
  45. 제31항에 있어서, 상기 덱스트린 화합물은 사이클로덱스트린인, 방법.
  46. 제45항에 있어서, 상기 사이클로덱스트린 화합물은 설포알킬(sulfoalkyl), 벤젠설포알킬(benzenesulfoalkyl), 아세토알킬(acetoalkyl), 하이드록시알킬(hydroxyalkyl), 하이드록시알킬 숙시네이트(hydroxyalkyl succinate),하이드록시알킬 말로네이트(hydroxyalkyl malonate), 하이드록시알킬 글루타레이트(hydroxyalkyl glutarate), 하이드록시알킬 아디페이트(hydroxyalkyl adipate), 하이드록시알킬 (hydroxyalkyl), 하이드록시알킬 말레에이트(hydroxyalkyl maleate), 하이드록시알킬 옥살레이트(hydroxyalkyl oxalate), 하이드록시알킬 푸마레이트(hydroxyalkyl fumarate), 하이드록시알킬 시트레이트(hydroxyalkyl citrate), 하이드록시알킬 타르트레이트(hydroxyalkyl tartrate), 하이드록시알킬 말레이트(hydroxyalkyl malate), 또는 하이드록시알킬 시트라코네이트(hydroxyalkyl citraconate) 그룹으로 치환된 하나 이상의 2,3 및 6 하이드록실 위치를 가지는 것인, 방법.
  47. 제45항에 있어서, 상기 사이클로덱스트린 화합물은 (2-하이드록시프로필)-β-사이클로덱스트린((2-hydroxypropyl)-β-cyclodextrin), 2-하이드록시프로필-β-사이클로덱스트린 숙시네이트(2-hydroxypropyl-β-cyclodextrin succinate), (2-하이드록시프로필)-γ-사이클로덱스트린((2-hydroxypropyl)-γ-cyclodextrin), 또는 2-하이드록시프로필-γ-사이클로덱스트린 숙시네이트(2-hydroxypropyl-γ-cyclodextrin succinate)인, 방법.
  48. 제45항에 있어서, 상기 사이클로덱스트린 화합물은 설포부틸 에테르 β-사이클로덱스트린(sulfobutyl ether β-cyclodextrin) 또는 설포부틸 에테르 γ-사이클로덱스트린(sulfobutyl ether γ-cyclodextrin)인, 방법.
  49. 제45항에 있어서, 상기 사이클로덱스트린 화합물은 메틸-β-사이클로덱스트린(methyl-β-cyclodextrin) 또는 메틸-γ-사이클로덱스트린(methyl-γ-cyclodextrin)인, 방법.
  50. 제45항에 있어서, 상기 사이클로덱스트린 화합물은 흡착질(adsorbate) 화합물을 포함하는 것인, 방법.
  51. 제31항에 있어서, 상기 당류 당 화합물은 단당류 또는 이당류 당 화합물인, 방법.
  52. 제31항에 있어서, 상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 멸균수(sterile water), 주사용 증류수(water for injection), 멸균 생리 식염수(sterile normal saline), 주사용 정균수(bacteriostatic water for injection), 또는 네블라이져 용액(nebulizer solution)인, 방법.
  53. 제31항에 있어서, 상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 약학적으로 허용 가능한 용액인, 방법.
  54. 제31항에 있어서, 상기 재구성된 핵산 의약품은 0.2 ㎛를 초과한 크기를 갖는 응집체 입자를 0.001% (w/v) 미만으로 갖는 것인, 방법.
  55. 제31항에 있어서, 상기 핵산 의약품은 3 내지 30초 기간에 재구성된 것인, 방법.
  56. 제31항에 있어서, 상기 핵산 의약품은 6개월의 저장 기간 후에 재구성되고 상기 핵산 제제의 80% 활성을 보유하는 것인, 방법.
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