KR20180021346A - 세포 투과성 펩타이드를 이용한 호흡기 감염 질환의 백신 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 대장균 열-불안정성 장독소 B 서브유닛(E. coli Heat-labile Enterotoxin B Subunit, LTB)과 세포 투과성 펩타이드(Protein transduction domain, PTD)가 융합된 단백질 및 이를 포함하는 호흡기 감염 질환의 예방 및 치료용 백신 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 대장균 열-불안정성 장독소(E. coli Heat-labile Enterotoxin B Subunit, LTB)및 세포 투과성 펩타이드(PTD)를 포함하는 융합단백질은 점막면역 증강 효과가 있어 비강 내로 분무할 경우 비강관련림프조직(Nasal associated lymphoid tissue, NALT) 내로 용이하게 투과될 뿐만 아니라 면역관련세포를 효과적으로 자극시킴으로써 체액성 및 세포성 면역반응을 강하게 유도할 수 있다. 또한 상기 융합단백질에 의해 점막에서 유도 및 분비된 분비성 IgA(Secretory IgA, sIgA)는 감염초기 단계에서 병원체를 효과적으로 방어할 수 있고, 단백질이기 때문에 생체 내에서 안전하다는 장점이 있다. 따라서 본 발명의 융합단백질은 투여가 용이하며, 안정성이 보장되므로 다양한 호흡기 감염병 예방 백신 및 치료제에 적용이 가능하다.

Description

세포 투과성 펩타이드를 이용한 호흡기 감염 질환의 백신 조성물{The vaccine for respiratory infectious diseases using protein transduction domain(PTD)}
본 발명은 대장균 열-불안정성 장독소 B 서브유닛(E. coli Heat-labile Enterotoxin B Subunit, LTB)과 세포 투과성 펩타이드(Protein transduction domain, PTD)가 융합된 단백질 및 이를 포함하는 호흡기 감염 질환의 예방 및 치료용 백신 조성물에 관한 것이다.
현재 사용되고 있는 호흡기 감염병 예방 백신은 효과가 미미하며, 점막면역의 유도가 전혀 이루어지지 않는다. 또한 유전자변형생물체(Living modified organism, LMO)는 안전성 문제로 허가가 어렵기 때문에 백신 시장의 진입에 장애가 따르는 단점이 있다.
장독소형 대장균(Enterotoxigenic Escherichia coli, ETEC)은 하나 이상의 장독소를 생산하기 때문에 심한 수양성 설사를 유발한다. 이들 중 하나가 고분자량인 대장균 장독소(Heat-labile Enterotoxin, LT)이다. 상기 대장균 장독소 분자는 독성의 ADP 리보스전달효소 활성을 보유하는 하나의 A 서브유닛(27 kDa), 그리고 도넛과 같은 구조의 매우 안정하게 비공유결합으로 연결되어 있는 다섯 개의 B 서브유닛(11.6 kDa)으로 구성되어 있다. 대장균 장독소 B 서브유닛은 장내 상피세포 표면에 존재하는 GM1-강글리오사이드와 B 서브유닛 펜타머의 특수 상호작용에 의해 결합한다. 대장균 장독소 B 서브유닛은 면역원으로 사용되기도 하며, 공동 투여 항원을 위한 면역보조제로서의 기능도 수행한다.
백신의 비강 도입은 투여방법의 용이성, 경제성 및 안정성 측면에서 뛰어나며, 그 수월성 때문에 주사 백신을 대체할 수 있는 바람직한 대안이다. 비강 내로 분무할 경우 비강관련림프조직(Nasal associated lymphoid tissue, NALT) 내로 용이하게 투과될 뿐만 아니라 면역관련세포를 효과적으로 자극시킬 수 있기 때문에 체액성 및 세포성 면역반응을 강하게 유도할 수 있다는 장점이 있다.
이러한 배경 하에, 본 발명자들은 돼지 호흡기 감염병의 주된 원인체인 보데텔라 브론키셉티카(Bordetella bronchiseptica) 및 마이코플라즈마 하이오뉴모니에(Mycoplasma hyopneumoniae) 예방을 위한 백신 조성물에 대하여 연구하던 중, 면역증강물질인 대장균 열-불안정성 장독소(LTB) 유전자와 세포 투과성 펩타이드(PTD) 유전자를 포함하는 재조합 유전자를 제작하였고, 상기 재조합 유전자로부터 발현되는 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 백신 조성물을 이용하였을 때 생체 내에서 높은 수준의 항체가 생성되는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 대장균 열-불안정성 장독소 B 서브유닛(E. coli Heat-labile Enterotoxin B Subunit, LTB) 및 세포 투과성 펩타이드(Protein transduction domain, PTD)를 포함하는 융합단백질을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 융합단백질을 코딩하는 재조합 유전자, 상기 재조합 유전자를 포함하는 발현벡터 및 상기 발현벡터로 형질전환된 균주를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 융합단백질을 포함하는 면역증강용 약학적 조성물 및 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 융합단백질을 포함하는 호흡기 감염 질환 예방용 백신 조성물 및 호흡기 감염 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 대장균 열-불안정성 장독소 B 서브유닛(E. coli Heat-labile Enterotoxin B Subunit, LTB) 및 세포 투과성 펩타이드(Protein transduction domain, PTD)를 포함하는 융합단백질을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 융합단백질을 코딩하는 재조합 유전자를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 유전자를 포함하는, 발현벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 발현벡터로 형질전환된 균주를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 면역증강용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 면역증강용 식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 호흡기 감염 질환 예방용 백신 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 호흡기 감염 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 호흡기 감염 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 대장균 열-불안정성 장독소(E. coli Heat-labile Enterotoxin B Subunit, LTB) 및 세포 투과성 펩타이드(PTD)를 포함하는 융합단백질은 점막면역 증강 효과가 있어 비강 내로 분무할 경우 비강관련림프조직(Nasal associated lymphoid tissue, NALT) 내로 용이하게 투과될 뿐만 아니라 면역관련세포를 효과적으로 자극시킴으로써 체액성 및 세포성 면역반응을 강하게 유도할 수 있다. 또한 상기 융합단백질에 의해 점막에서 유도 및 분비된 분비성 IgA(Secretory IgA, sIgA)는 감염초기 단계에서 병원체를 효과적으로 방어할 수 있고, 단백질이기 때문에 생체 내에서 안전하다는 장점이 있다. 따라서 본 발명의 융합단백질은 투여가 용이하며, 안정성이 보장되므로 다양한 호흡기 감염병 예방 백신 및 치료제에 적용이 가능하다.
도 1은 대장균 열-불안정성 장독소(E. coli Heat-labile Enterotoxin B Subunit, LTB)를 코딩하는 유전자와 세포 투과성 펩타이드(Protein transduction domain, PTD)를 코딩하는 유전자가 재조합된 재조합 유전자 및 재조합 벡터의 모식도를 나타낸 도이다.
도 2는 재조합 유전자가 도입된 형질전환 균주에서 발현한 rPTDP1P2LTB 또는 rLTBR1R2PTD 융합단백질을 웨스턴 블랏(western blot)을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 백신 접종에 따른 마우스에서의 면역원성을 확인하기 위해 rPTDP1P2LTB 또는 rLTBR1R2PTD 방어항원 특이적인 혈청 내 IgG 항체가를 ELISA 분석을 통해 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 백신 접종에 따른 마우스에서의 면역원성을 확인하기 위해 rPTDP1P2LTB 또는 rLTBR1R2PTD 방어항원 특이적인 혈청 내 IgA 항체가를 ELISA 분석을 통해 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 백신 접종에 따른 마우스에서의 면역원성을 확인하기 위해 rPTDP1P2LTB 또는 rLTBR1R2PTD 방어항원 특이적인 혈청 내 IgG1 항체가를 ELISA 분석을 통해 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 백신 접종에 따른 마우스에서의 면역원성을 확인하기 위해 rPTDP1P2LTB 또는 rLTBR1R2PTD 방어항원 특이적인 혈청 내 IgG2c 항체가를 ELISA 분석을 통해 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 rPTDP1P2LTB 또는 rLTBR1R2PTD 방어항원 특이적인 기관지세척액 (Bronchoalveolar lavage fluid, BALF) 내 IgG 및 IgA 항체가를 ELISA 분석을 통해 측정한 결과를 나타낸 도이다.
본 발명은 대장균 열-불안정성 장독소(E. coli Heat-labile Enterotoxin B Subunit, LTB) 및 세포 투과성 펩타이드(Protein transduction domain, PTD)를 포함하는 융합단백질을 제공한다.
본 명세서에 사용된, 용어 '융합단백질'이란, 대장균 열-불안정성 장독소(E. coli Heat-labile Enterotoxin B Subunit, LTB) 및 세포 투과성 펩타이드(Protein transduction domain, PTD)를 포함하도록 인위적으로 합성된 단백질을 의미한다.
상기 열-불안정성 장독소(E. coli Heat-labile Enterotoxin B Subunit, LTB) 단백질은 바람직하게는 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성될 수 있으며, 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함하고, 이에 제한되지 않는다.
상기 세포투과성 펩타이드는 바람직하게는 Pep-1일 수 있으며, 상기 Pep-1은 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성될 수 있고, 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함하고, 이에 제한되지 않는다.
상기 단백질의 기능적 동등물이란, 단백질 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 폴리펩타이드를 포함하는 것으로 기능적으로 동일한 작용을 할 수 있는 단백질을 포함하는 개념이다.
또한, 상기 융합단백질에는 LTB 및 PTD 외에 방어항원을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 마이코플라즈마성 폐렴(Mycoplasma hyopneumoniae) 또는 위축성 비염(Bordetella bronchiseptica)의 방어항원일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 융합단백질의 자가조립서열의 배열 순서는 상기 융합단백질이 향상된 면역증강 활성 및 세포투과성을 나타내게 하는 한 특별히 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 일 실시예에서는 서열번호 5 또는 서열번호 6의 아미노산 서열로 구성된 융합단백질을 이용하였다.
또한, 각 단백질의 도메인은 상호 직접적으로 연결될 수도 있고, 링커를 통해 연결될 수도 있다. 상기 링커는 상기 융합단백질이 향상된 면역증강 활성 및 세포투과성을 나타내게 하는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 아미노산으로 구성된 펩타이드 링커를 사용할 수 있고, 보다 바람직하게는 잘구부러지는(flexible) 펩타이드 링커를 사용할 수 있다. 상기 펩타이드 링커는 상기 링커를 코딩하는 핵산을 각 도메인을 코딩하는 핵산 사이에 인프레임(in frame)으로 연결하여 발현벡터 내에 작동 가능하게 연결하여 발현시킬 수 있다. 아울러, 상기 융합단백질은 이에 포함되는 각 도메인의 야생형의 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 상이한 서열을 가지는 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 폴리펩타이드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다. 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다. 또한, 아미노산 서열상의 변이 또는 수식에 의해서 단백질의 열, pH등에 대한 구조적 안정성이 증가하거나 단백질 활성이 증가한 단백질을 포함할 수 있다.
상기 융합단백질 또는 상기 융합단백질을 구성하는 각 도메인의 폴리펩타이드는 당해 분야에 공지된 화학적 펩티드 합성방법으로 제조하거나, 상기 도메인을 코딩하는 유전자를 중합효소연쇄반응(Polymerase chain reaction, PCR)에 의해 증폭하거나 공지된 방법으로 합성한 후 발현벡터에 클로닝하여 발현시켜서 제조할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 융합단백질을 코딩하는 재조합 유전자 및 상기 재조합 유전자를 포함하는 발현벡터를 제공한다.
본 명세서에 사용된, 용어 '재조합 유전자'란, 대장균 열-불안정성 장독소(E. coli Heat-labile Enterotoxin B Subunit, LTB) 유전자 및 세포 투과성 펩타이드(Protein transduction domain, PTD) 유전자를 포함하도록 인위적으로 합성된 유전자를 의미한다.
상기 열-불안정성 장독소(E. coli Heat-labile Enterotoxin B Subunit, LTB) 유전자는 서열번호 3의 염기서열로 구성될 수 있으며, 상기 뉴클레오티드와 기능적으로 동일한 기능을 할 수 있는 변이체가 본 발명의 범위에 포함된다.
상기 세포투과성 펩타이드는 바람직하게는 Pep-1일 수 있으며, 상기 Pep-1의 유전자는 서열번호 4의 염기서열로 구성될 수 있고, 상기 뉴클레오티드와 기능적으로 동일한 기능을 할 수 있는 변이체가 본 발명의 범위에 포함된다.
또한, 상기 재조합 유전자는 방어항원 유전자를 포함할 수 있으며, 바람직하게는 마이코플라즈마성 폐렴(Mycoplasma hyopneumoniae) 또는 위축성 비염(Bordetella bronchiseptica)의 방어항원 유전자를 포함한 형태일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 재조합 유전자는 대장균 열-불안정성 장독소(E. coli Heat-labile Enterotoxin B Subunit, LTB) 및 세포 투과성 펩타이드(Protein transduction domain, PTD)의 융합단백질을 코딩하는 한 특별히 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 일 실시예에서는 서열번호 7 또는 서열번호 8의 염기서열로 구성된 재조합 유전자를 이용하였다.
상기 “기능적으로 동등한”이란 염기의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 서열번호 3 또는 서열번호 4로 표시되는 염기서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 3 또는 서열번호 4로 표시되는 염기서열에 의해 코딩된 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 코딩할 수 있는 염기서열을 의미한다. 예를 들어, 일부 염기서열이 결실(deletion), 치환(substitution) 또는 삽입(insertion)에 의해 변형되었지만, 상기 융합단백질을 코딩하는 핵산 분자와 기능적으로 동일한 작용을 할 수 있는 변이체(variants)를 포함하는 개념이다.
본 명세서에 사용된, 용어 "발현벡터"란, 목적하는 숙주세포에서 목적 펩타이드를 발현할 수 있는 재조합 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 제작물을 의미한다. 상기 발현벡터는 개시코돈, 종결코돈, 프로모터, 오퍼레이터 등의 발현조절 요소들을 포함하는데, 상기 개시코돈 및 종결코돈은 일반적으로 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 일부로 간주되며, 유전자 제작물이 투여 되었을 때 개체에서 반드시 작용을 나타내야 하며 코딩 서열과 인프레임(in frame)에 있어야 한다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다.
본 발명의 용어 "작동가능하게 연결(operably linked)"이란, 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결(functional linkage)되어 있는 상태를 의미한다. 예를 들어 프로모터와 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 작동가능하게 연결되어 코딩서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 발현 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용할 수 있다.
또한, 상기 발현벡터는 세포 배양액으로부터 단백질의 분리를 촉진하기 위하여 융합 폴리펩타이드의 배출을 위한 시그널 서열을 포함할 수 있다. 특이적인 개시 시그널은 또한 삽입된 핵산 서열의 효율적인 번역에 필요할 수도 있다. 이들 시그널은 ATG 개시코돈 및 인접한 서열들을 포함한다. 어떤 경우에는, ATG 개시코돈을 포함할 수 있는 외인성 번역 조절 시그널이 제공되어야 한다. 이들 외인성 번역 조절 시그널들 및 개시코돈들은 다양한 천연 및 합성 공급원일 수 있다. 발현 효율은 적당한 전사 또는 번역 강화 인자의 도입에 의하여 증가될 수 있다.
아울러, 상기 발현벡터는 융합단백질의 검출을 용이하게 하기 위하여, 임의로 엔도펩티아이제를 사용하여 제거할 수 있는 단백질 태그를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 용어 "태그(tag)"란, 정량가능한 활성 또는 특성을 나타내는 분자를 의미하며, 플로오레세인과 같은 화학적 형광물질(fluoracer), 형광 단백질(GFP) 또는 관련 단백질과 같은 폴리펩타이드 형광물질을 포함한 형광분자일 수도 있고; Myc 태그, 플래그(Flag) 태그, 히스티딘 태그, 루신 태그, IgG 태그, 스트랩타비딘 태그 등의 에피톱 태그일 수도 있다. 특히, 에피톱 태그를 사용할 경우, 바람직하게는 6개 이상의 아미노산 잔기로 구성되고, 보다 바람직하게는 8개 내지 50개의 아미노산 잔기로 구성된 펩타이드 태그를 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 발현벡터는 상술한 본 발명에서 제공하는 융합단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있는데, 이때 사용되는 벡터는 본 발명의 융합단백질을 생산할 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 플라스미드 DNA, 파아지 DNA 등이 될 수 있고, 보다 바람직하게는 상업적으로 개발된 플라스미드(pBHA, pUC18, pBAD, pIDTSAMRT-AMP 등), 대장균 유래 플라스미드(pYG601BR322, pBR325, pUC118, pUC119 등), 바실러스 서브틸리스 유래 플라스미드(pUB110, pTP5 등), 효모-유래 플라스미드(YEp13, YEp24, YCp50 등), 파아지 DNA(Charon4A, Charon21A, EMBL3, EMBL4, λgt10, λgt11, λZAP 등), 동물 바이러스 벡터(레트로바이러스(retrovirus), 아데노바이러스(adenovirus), 백시니아 바이러스(vaccinia virus) 등), 곤충 바이러스 벡터(배큘로바이러스(baculovirus) 등), 식물 바이러스 벡터(담배 모자이크 바이러스(Tobacco mosaic virus) 등) 등이 될 수 있다. 상기 발현벡터는 숙주 세포에 따라서 단백질의 발현량과 수식 등이 다르게 나타나므로, 목적에 가장 적합한 숙주세포를 선택하여 사용함이 바람직하다. 예를 들어, 본 발명의 실시예에서는 상기 폴리뉴클레오티드를 6개의 히스티딘 태그가 포함된 pET-15b 및 pET-21b 벡터에 도입하여 발현벡터를 제작하였다.
본 발명의 일 실시예서 사용한 발현벡터는 pET21b-PTDP1P2LTB 및 pET15b-LTBR1R2PTD으로 명명하였으며, 발현벡터 내 재조합 유전자인 PTDP1P2LTB는 서열번호 7, LTBR1R2PTD는 서열번호 8로 표시될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 발현벡터로 형질전환된 균주를 제공한다.
상기 재조합 벡터는 당업계에 공지된 방법으로 세포 내에 도입할 수 있다.
예를 들어, 이에 한정되지는 않으나, 일시적 형질감염(transient transfection), 미세주사, 형질도입(transduction), 세포융합, 칼슘 포스페이트 침전법, 리포좀 매개된 형질감염(liposome-mediated transfection), DEAE 덱스트란-매개된 형질감염(DEAEDextran- mediated transfection), 폴리브렌-매개된 형질감염(polybrene-mediated transfection), 전기침공법(electroporation), 유전자 총(gene gun) 및 세포 내로 핵산을 유입시키기 위한 다른 공지의 방법에 의해 세포 내로 도입할 수 있다.
본 발명에서 제공하는 형질전환체는 상기 본 발명에서 제공하는 발현벡터를 숙주에 도입하여 형질전환시켜서 제작되고, 상기 발현벡터에 포함된 폴리뉴클레오티드를 발현시켜서, 본 발명의 융합단백질을 생산하는데 사용될 수 있다. 상기 형질전환은 다양한 방법에 의하여 수행될 수 있는데, 다양한 세포활성을 높은 수준으로 향상시킬수 있는 효과를 나타내는 본 발명의 융합단백질을 생산할 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않으나, CaCl2 침전법, CaCl2 침전법에 DMSO(dimethyl sulfoxide)라는 환원물질을 사용함으로써 효율을 높인 Hanahan 방법, 전기천공법(electroporation), 인산칼슘 침전법, 원형질 융합법, 실리콘 카바이드 섬유를 이용한 교반법, 아그로박테리아 매개된 형질전환법, PEG를 이용한 형질전환법, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 및 건조/억제 매개된 형질전환 방법 등이 사용될 수 있다. 또한, 상기 형질전환제의 제작에 사용되는 숙주 역시 본 발명의 융합단백질을 생산할 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않으나, 대장균(E. coli), 스트렙토마이세스, 살모넬라 티피뮤리움 등의 박테리아 세포; 사카로마이세스 세레비지애, 스키조사카로마이세스 폼베 등의 효모 세포; 피치아 파스토리스 등의 균류 세포; 드로조필라, 스포도프테라 Sf9 세포 등의 곤충 세포; CHO, COS, NSO, 293, 보우 멜라노마 세포 등의 동물 세포; 또는 식물 세포가 될 수 있다. 본 발명의 일실시예서는 E. coli Rosetta (DE3) 균주를 숙주로서 사용하였다.
또한, 본 발명은 상기 융합단백질을 포함하는 면역증강용 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 약학적 및 식품 조성물을 포함한다.
본 명세서에 사용된, 용어 '면역증강용'은 백신 또는 접종물 등에 의해 특이적 면역 반응들을 증진시키는 것을 의미하며, 면역원성 물질에 대한 특이적 면역반응성을 가속, 연장 또는 그 품질을 증진시키는 작용을 하는 것으로 정의될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 융합단백질을 포함하는 호흡기 감염 질환 예방용 백신 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 감염성 질환은 바이러스(virus), 세균(bacteria), 곰팡이(fungi), 원생동물(protozoa) 등의 병원균이 숙주를 침범하여 발생하는 질병을 의미한다.
상기 호흡기 감염성 질환은 돼지 생식기 호흡기 증후군(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus), 오제스키병(Aujeszky's virus), 돼지콜레라(Hog cholera virus), 돼지 인플루엔자(Swine influenza virus) 및 돼지 호흡기형 코로나바이러스 감염증(Porcine respiratory coronavirus), 마이코플라즈마성 폐렴(Mycoplasma hyopneumoniae), 위축성 비염(Bordetella bronchiseptica), 파스튜렐라 폐렴(Pasteurella multocida), 흉막 폐렴(Actinobacillus pleureopneumoniae), 글래써병(Haemophilus parasuis) 및 살모넬라균증(Salmonella spp.)을 포함하며, 바람직하게는 마이코플라즈마성 폐렴(Mycoplasma hyopneumoniae) 또는 위축성 비염(Bordetella bronchiseptica)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 백신은 추가로 약리학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함한다. 백신에 적합한 담체는 기술분야의 당업자에게 공지되어 있으며, 단백질, 설탕 등을 포함하지만, 이로 한정되는 것은 아니다. 상기의 담체는 수용액 또는 비-수용액, 현탁액, 및 에멀전일 수 있다. 비-수용액 담체의 예는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식용유 예컨대 올리브 오일, 및 주사가능한 유기 에스테르 예컨대 에틸 올리에이트를 들 수 있다. 수용액 담체는 식염수 및 완충배지를 포함하는, 물, 알콜/수용액, 에멀전 또는 현탁액을 포함한다. 비경구 담체는 염화나트륨 용액, 링거 덱스트로오스, 덱스트로오스 및 염화나트륨, 유산처리 링거 또는 고정 오일을 포함한다. 정맥주사용 담체는 예컨대 링거 덱스트로오스를 기본으로 하는 것과 같은 전해질 보충제, 액체 및 영양 보충제 등을 포함한다. 방부제 및 기타 첨가제 예컨대 예를 들면 항미생물제제, 항산화제, 킬레이트제, 불활성 가스 등과 같은 것이 추가로 존재할 수 있다. 바람직한 방부제는 포르말린, 티메로살, 네오마이신, 폴리믹신 B 및 암포테리신 B를 포함한다.
또한, 상기 백신 조성물은 애주번트를 추가로 포함할 수 있다.
상기 애주번트는 면역반응의 향상 및/또는 접종 후 흡수 속도를 촉진하는 화합물 또는 혼합물을 칭하는 것으로 임의의 흡수-촉진제를 포함한다. 허용가능한 애주번트는 프로인트 완전애주번트, 프로인트 불완전애주번트, 사포닌, 미네랄 젤 예컨대 수산화 알루미늄, 계면활성제 예컨대 리소레시틴, 플루론 폴리올, 다중음이온, 펩타이드, 오일, 탄화수소 에멀전, 키홀림펫 헤모시아닌, 디니트로페놀 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 백신은 생백신, 약독화 백신 및 사독 백신으로 이루어진 군에서 선택된 1종의 백신일 수 있다.
본 발명의 목적을 위한 백신 조성물의 투여량은 체중 1kg 당 0.01ml 내지 10ml 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 백신 조성물은 근육, 피하, 복강, 정맥, 경구, 비강, 진피, 안구 및 뇌 내로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 투여 경로를 통해 투여될 수 있으며, 본 발명에서는 비강 투여가 바람직하다.
본 발명의 백신 조성물은 면역학적 유효량으로 개체에 투여할 수 있으며, 상기 “면역학적 유효량"이란 호흡기 감염 질환 예방 효과를 나타낼 수 있을 정도의 충분한 양과 부작용이나 심각한 또는 과도한 면역반응을 일으키지 않을 정도의 양으로서 정확한 투여 농도는 투여될 특정 면역원에 따라 달라지며, 예방 접종 대상자의 연령, 체중, 건강, 성별, 개체의 약물에 대한 민감도, 투여 경로, 투여 방법 등 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있으며, 1회 내지 수회 투여가능 하다.
또한, 본 발명은 상기 융합단백질을 포함하는 호흡기 감염 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
상기 조성물은 약학적 및 식품 조성물을 포함한다.
본 명세서에 사용된, 용어 '치료'는 이롭거나 바람직한 임상적 결과를 수득하기 위한 접근을 의미한다. 본 발명의 목적을 위해서, 이롭거나 바람직한 임상적 결과는 비제한적으로, 증상의 완화, 질병 범위의 감소, 질병 상태의 안정화(즉, 악화되지 않음), 질병 진행의 지연 또는 속도의 감소, 질병 상태의 개선 또는 일시적 완화 및 경감(부분적이거나 전체적으로), 검출가능하거나 또는 검출되지 않거나의 여부를 포함한다. '치료'는 치료학적 치료 및 예방적 또는 예방조치 방법 모두를 가리킨다. 상기 치료들은 예방되는 장애뿐만 아니라 이미 발생한 장애에 있어서 요구되는 치료를 포함한다. 질병을 '완화(Palliating)'하는 것은 치료를 하지 않은 경우와 비교하여, 질병상태의 범위 및/또는 바람직하지 않은 임상적 징후가 감소되거나 및/또는 진행의 시간적 추이(time course)가 늦춰지거나 길어지는 것을 의미한다.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 당해 기술 분야에 알려진 적합한 제제는 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 것을 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물을 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 유효성분에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 상기 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글라이콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글라이콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 경구 혹은 비경구적으로 투여할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여방식, 대상 개체의 연령, 체중, 성, 질병 증상의 정도, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 달라질 수 있으며, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 개체에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 액제, 에멀젼, 시럽 및 에어로졸 등의 경구형 제형으로 경구 투여되거나, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 직장, 정맥, 복강, 경막, 근육 또는 피하 투여될 수 있다.
한편, 본 발명의 융합단백질은 면역 증강 또는 호흡기 감염 질환의 예방 또는 개선을 목적으로 식품 조성물, 특히 건강기능식품에 첨가될 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 건강기능식품의 형태일 수 있으며, '건강기능식품'은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, '기능성'이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.
상기 식품 조성물은 식품 첨가물을 추가로 포함할 수 있으며, '식품첨가물'로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한 식품의약품 안정청에 승인된 식품첨가물공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.
상기 "식품첨가물공전"에 수재된 품목으로 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼륨, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성품, 감색소, 감초추출물, 결정셀롤로오스, 구아검 등의 천연첨가물, L-글루타민산나트륨제제, 면류첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합 제제류들을 들 수 있다.
본 발명의 융합단백질이 포함된 식품으로는 빵, 떡류, 건과류, 캔디류, 초콜릿류, 츄잉껌, 쨈류와 같은 과자류 아이스크림류, 빙과류, 아이스크림 분말류와 같은 아이스크림 제품류 우유류, 저지방 우유류, 유당분해 우유, 가공유류, 산양유, 발효유류, 버터유류, 농축유류, 유크림류, 버터유, 자연치즈, 가공치즈, 분유류, 유청류와 같은 유가공품류 식육가공품, 알가공품, 햄버거와 같은 식육제품류 어묵, 햄, 소세지, 베이컨 등의 어육가공품과 같은 어육제품류 라면류, 건면류, 생면류, 유탕면류, 호화건먼류, 개량숙면류, 냉동면류, 파스타류와 같은 면류 과실음료, 채소류음료, 탄산음료, 두유류, 요구르트 등의 유산균음료, 혼합음료와 같은 음료 간장, 된장, 고추장, 춘장, 청국장, 혼합장, 식초, 소스류, 토마토케첩, 카레, 드레싱과 같은 조미식품 마가린, 쇼트닝 및 피자를 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 포함할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일주스, 과일주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 포함할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.01 내지 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
본 발명의 융합단백질을 포함한 음료 조성물은 상기 융합단백질을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, (예를 들어, 포도당, 과당 등); 디사카라이드, (예를 들어 말토스, 슈크로스 등); 및 폴리사카라이드, (예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등)과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등)) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다.
본 발명을 실시예 및 실험예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 더욱 쉽게 이해할 수 있도록 예시하는 것으로 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니며, 이 때, 사용되는 기술용어 및 과학용어에 있어 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 일반적으로 이해하는 의미를 지닌다.
실시예 1. 2종의 돼지 감염성 병원체 방어항원의 선별
돼지에서 경제적 손실이 가장 큰 호흡기 감염성 병원체인 돼지마이코플라즈마성 폐렴(Mycoplasma hyopneumoniae, Mhp) 및 위축성 비염 병원체(Bordetella bronchiseptica, Bb)의 유전체 정보를 미국국립생물공학정보센터(National Center for Biotechnology Information, NCBI)로부터 제공받아 항원성 및 면역원성을 갖는 방어항원(항원결정기, epitope)을 선별하여 하기 표 1에 나타내었다. 이 때 방어항원은 본 발명자의 선행연구 결과와 최근 보고된 문헌을 분석하여 동물실험에서 효과가 입증된 것을 선별하였다.
No. 병원체 항원 크기 (bp) 문헌
1 M. hyopneumoniae Adhesin
P97 R1R2		 627 Conceicao et al., 2006, Woolley et al., 2014, Zou et al., 2013, Chen et al., 2006, Raymond et al., 2007, Lee et al., 2014, Abhijit et al., 2014
2 B. bronchiseptica Adhesin
pertactin P1P2		 303 Zhao et al., 2009, Zhao et al., 2008, Shin et al., 2007, Hegazy WA and Hensel M, 2012, Inatsuka CS et al., 2010, Nicholson TL et al., 2009, Qian Zhang et al., 2013
3 E. coli Heat-Labile Enterotoxin subunit B (LTB) 300 Fabricio et al., 2006, Deng et al., 2013, You et al., 2014, Abhijit et al., 2014
4 Protein transduction domain (PTD) Pep-1 63 Morris et al., 2001, Kwon et al., 2011, Lee et al., 2011
실시예 2. 선별된 돼지 전염성병원체 방어항원을 포함하는 PTD와 LTB의 융합단백질 발현을 위한 E. coli 발현 벡터의 제작
방어항원(Bb 항원 또는 Mhp 항원)이 융합된 재조합 유전자는 ㈜바이오니아에 의뢰하여 합성하였으며, 재조합 유전자 제조를 위해 사용한 대장균 열-불안정성 장독소 B 서브유닛(E. coli Heat-labile Enterotoxin B Subunit, LTB) 및 세포 투과성 펩타이드(Protein transduction domain, PTD)의 아미노산 서열 및 유전자 염기서열을 하기 표 2 내지 5에 나타내었다.
Bb 항원의 증폭을 위해 이용한 정방향 프라이머(5'-CATATGAAAGAAACCTGGTGGGAA-3')는 Nde I 제한효소(Enzynomics, Korea) 절단부위를, 역방향 프라이머(5'-CTCGAGACTGATTGCCGCAATTGA-3')는 XhoⅠ 제한효소(Enzynomics) 절단부위를 포함하고 있다. Mhp 항원의 증폭을 위해 이용한 정방향 프라이머(5'-CATATGGCTCCCCAGACTATTACA-3')는 NdeⅠ 제한효소(Enzynomics) 절단부위를, 역방향 프라이머(5'-CGTCTCTTACACTTTGCGTTTTTT-3')는 BsmBⅠ 제한효소(Enzynomics) 절단부위를 가지고 있다. 따라서 합성된 Bb(rPTDP1P2LTB)는 Nde I과 XhoⅠ 제한효소로, Mhp(rLTBR1R2PTD)는 NdeⅠ과 BsmBⅠ 제한효소로 절단한 뒤, 각각의 insert DNA 10-50 ng과 pBHA 벡터(Bioneer, Korea) 100 ng, 라이게이스(ligase) 10X 완충액 1 μl, T4 DNA 라이게이스(ligase) (Promega, USA) 1 μl 그리고 증류수를 넣어 총 10 μl를 혼합하여 실온에서 3시간동안 반응하였다. 그 다음 E. coli DH5 alpha competent cell 50 μl에 샘플 2 μl를 혼합한 뒤 얼음에서 40분간 반응하였으며, 42℃에서 1분 30초간 반응시킨 다음 다시 얼음에 5분간 반응하였다. 그 후, LB 액체배지 1 ml을 첨가한 후 37℃에서 40분간 배양하고, 16,000 rpm으로 1분간 원심분리한 후 상층액을 제거하여 100 μg/ml의 앰피실린이 포함된 LB 고체배지에 도말하였다. 37℃에서 16시간동안 배양한 후 단일 콜로니를 얻었으며, 플라스미드 DNA extraction kit(Promega, USA)를 이용하여 합성된 플라스미드 DNA를 추출하였다.
구분 명칭 크기 서열
서열번호 1 대장균 열-불안정성 장독소 B 서브유닛(LTB) 아미노산 서열 11.3 kDa APQTITELCSEYRNTQIYTINDKILSYTESMAGKREMVIITFKSGATFQVEVPGSQHIDSQKKAIERMKDTLRIAYLTETKIDKLCVWNNKTPNSIAAIS
구분 명칭 크기 서열
서열번호 2 세포 투과성 펩타이드(PTD)
아미노산 서열		 2.83 kDa KETWWETWWTEWSQPKKKRKV
구분 명칭 크기 서열
서열번호 3 대장균 열-불안정성 장독소 B 서브유닛(LTB) 뉴클레오티드
서열		 300 bp GCTCCCCAGACTATTACAGAACTATGTTCGGAATATCGCAACACACAAATATATACGATAAATGACAAAATACTATCATATACGGAATCGATGGCAGGCAAAAGAGAAATGGTTATCATTACATTTAAGAGCGGCGCAACATTTCAGGTCGAAGTCCCGGGCAGTCAACATATAGACTCCCAAAAAAAAGCCATTGAAAGGATGAAGGACACATTAAGAATCGCATATCTGACCGAGACCAAAATTGATAAATTATGTGTATGGAATAATAAAACCCCCAATTCAATTGCGGCAATCAGT
구분 명칭 크기 서열
서열번호 4 세포 투과성 펩타이드(PTD) 뉴클레오티드 서열 63
bp		 AAAGAAACCTGGTGGGAAACCTGGTGGACCGAATGGAGCCAGCCGAAAAAAAAACGCAAAGTG
실시예 3. 재조합 융합단백질의 서열 분석(Sequencing analysis)
상기 실시예 2에서 획득한 형질전환체는 콜로니 PCR을 통해 재조합 유전자의 크기를 확인하였으며, 플라스미드 DNA를 추출하여 합성된 유전자의 염기서열 분석(Genotech, Korea)을 의뢰하였다. 재조합된 벡터 pET21b-PTDP1P2LTB와 pET15b-LTBR1R2PTD 내의 재조합 유전자 PTDP1P2LTB 및 LTBR1R2PTD 염기서열 결과는 하기 표 6 내지 표 9에 나타내었으며, 각각의 단백질은 rPTDP1P2LTB, rLTBR1R2PTD로 명명하였다.
구분 명칭 크기 서열
서열번호 5 rPTDP1P2LTB
아미노산 서열		 25.67 kDa MKETWWETWWTEWSQPKKKRKVQRATIRRGDAPAGGAVPGGAVPGGFGPLLDGWYGVDVSDSTVDLAQGAKAPPAPKPAPQPGPQPGPQPPQPPQPPQPPQPPQRQPEAPAPQPPAGRELSAAVDMAPQTITELCSEYRNTQIYTINDKILSYTESMAGKREMVIITFKSGATFQVEVPGSQHIDSQKKAIERMKDTLRIAYLTETKIDKLCVWNNKTPNSIAAISLEHHHHHH
구분 명칭 크기 서열
서열번호 6 rLTBR1R2PTD
아미노산 서열		 38.63 kDa MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMAPQTITELCSEYRNTQIYTINDKILSYTESMAGKREMVIITFKSGATFQVEVPGSQHIDSQKKAIERMKDTLRIAYLTETKIDKLCVWNNKTPNSIAAISLEGIPTKEGKREEVDKKVKELDNKIKGILPQPPAAKPEAAKPVAAKPEAAKPVAAKPEAAKPEAAKPVAAKPEAAKPVAAKPEAAKPVATNEGTPNQGKKAEGAPNQGKKAEGAPSQGKKAEGASNQQSPTTELTNYLPELGKKIDEIIKKQGKNWKTEVELIEDNIAGDAKLLYFVLRDDSKSGDPKKSSLKVKITVKQSNNNQELKSKKETWWETWWTEWSQPKKKRKV
구분 명칭 크기 서열
서열번호 7 PTDP1P2LTB 뉴클레오티드 서열 705 bp ATGAAAGAAACCTGGTGGGAAACCTGGTGGACCGAATGGAGCCAGCCGAAAAAAAAACGCAAAGTGCAGCGCGCGACGATACGGCGGGGGGACGCGCCTGCCGGCGGTGCGGTTCCAGGCGGTGCTGTTCCCGGCGGCTTCGGCCCCCTCCTTGACGGCTGGTATGGCGTGGATGTATCGGATTCCACCGTGGACCTCGCTCAGGGCGCGAAGGCGCCGCCGGCGCCCAAGCCCGCGCCGCAGCCCGGTCCCCAGCCCGGTCCCCAGCCGCCGCAGCCGCCGCAGCCGCCGCAGCCGCCgcagccgccACAGAGGCAGCCGGAAGCGCCGGCGCCGCAACCGCCGGCGGGCAGGGAGTTGTCCGCCGCCGTCGACATGGCTCCCCAGACTATTACAGAACTATGTTCGGAATATCGCAACACACAAATATATACGATAAATGACAAAATACTATCATATACGGAATCGATGGCAGGCAAAAGAGAAATGGTTATCATTACATTTAAGAGCGGCGCAACATTTCAGGTCGAAGTCCCGGGCAGTCAACATATAGACTCCCAAAAAAAAGCCATTGAAAGGATGAAGGACACATTAAGAATCGCATATCTGACCGAGACCAAAATTGATAAATTATGTGTATGGAATAATAAAACCCCCAATTCAATTGCGGCAATCAGTCTCGAGCACCACCACCACCACCACTGA
구분 명칭 크기 서열
서열번호 8 LTBR1R2PTD 뉴클레오티드 서열 1059 bp ATGGAGCCAGCCGAAAAAAAAACGCAAAGTGTAA
실시예 4. 재조합 균주의 제작 및 융합단백질 발현 확인
방어항원 융합단백질을 발현하는 균주를 제작하기 위해 E. coli Rosetta (DE3) competent cell 50 μl에 실시예 2에서 제조한 플라스미드 20 μl를 혼합하여 상기 실시예 2에서 제작된 재조합 벡터로부터 방어항원 융합단백질을 발현하는 콜로니를 획득하였다. 각 선별된 형질전환체의 단백질 발현 확인을 위해 LB 액체배지 12.5 ml에 앰피실린 12.5 μl 및 CRP 12.5 μl를 첨가하여 형질전환체를 접종한 뒤 37℃에서 16시간동안 배양하였다. 그 후, 앰피실린 500 μl 및 CRP 500 μl를 첨가한 LB 배지에 5 ml의 시드(seed)를 넣고 OD600 1.0까지 배양하였다. 그 후, 배양액에 0.5M IPTG 500 μl를 첨가한 후, 22℃에서 16시간동안 배양하였다. 배양액의 1 ml을 채취하여 재조합 유전자 도입 후 샘플을 보관하였다.
재조합 유전자 도입 후의 샘플을 재조합 유전자 도입 전의 샘플과 비교하기 위해, 재조합 유전자 도입 후의 샘플 및 재조합 유전자 도입 전 채취한 샘플 각각 80 μl에 SDS 샘플 완충액 20 μl를 혼합한 후, 95℃에서 10분간 반응시켰다. 반응 후 시료를 두 개의 12% 폴리아크릴아마이드 겔(polyacrylamide gel)에 20 μl씩 로딩(loading)하였으며, 한 판은 쿠마시 브릴리언트 블루(coomassie brilliant blue)로 염색하였다. 다른 겔은 NC 멤브레인에 트랜스퍼를 실시하였다. 멤브레인은 3% BSA 용액으로 1시간동안 블락킹하였으며, 1차 항체로 His probe antibody(1% BCA 용액)를 1:10,000으로 희석하여 사용하였고, 이를 4℃에서 16시간동안 반응하였다. 상기 멤브레인을 TBST 완충액으로 5분간 5회 세척한 후, 2차 항체로 His tag HRP 항체(TBST)를 1:20,000으로 희석하여 1시간동안 처리하였다. 다시 TBST 완충액으로 5분간 5회 세척한 뒤 HRP 기질을 처리하고 ImageQuant™ (LAS-4000, GE Healthcare, Japan)를 이용하여 분석하였으며, 그 결과를 도 2 에 나타내었다.
도 2 에 나타낸 바와 같이, 재조합 유전자를 포함하는 벡터를 균주에 도입한 후 형질전환된 균주에서 rPTDP1P2LTB, rLTBR1R2PTD 융합단백질이 발현된 것을 확인하였다.
실시예 5. 융합단백질 정제
상기 실시예 4의 rPTDP1P2LTB, rLTBR1R2PTD 융합단백질의 발현이 확인된 형질전환체를 각각 유도 발현하여 얻은 세포들은 1X Native 완충액(50mM NaPO4, 0.5M NaCl)을 첨가한 뒤 초음파기를 이용하여 파쇄하였다. 그 후 파쇄물을 원심분리하여 봉입체(inclusion body)와 세포질(상층액)로 분리하였으며, 목적 단백질의 His6 태깅(tagging) 특성을 이용하여 Ni2+-NTA 친화 컬럼(Nitrilotriacetic acid Sepharose affinity column, GE Healthcare, USA)으로 정제하였다. 정제된 단백질은 안정화 완충액(50mM Tris, 0.2M NaCl, 2mM EDTAl, pH 7.5)을 이용하여 투석을 실시하였다. 투석된 단백질은 Amicon ultra-15 원심분리기(Millipore, USA)를 이용하여 농축된 정제 단백질을 수득하였다.
상기 정제된 융합단백질 rPTDP1P2LTB 및 rLTBR1R2PTD를 이하 실험에서 사용하였다.
실험예 1. 마우스에서 rPTDP1P2LTB와 rLTBR1R2PTD 방어항원에 대한 면역원성 시험
LTB와 PTD가 융합된 Bb와 Mhp 방어항원 발현시스템을 통해 정제 및 농축된 단백질을 이용하여 마우스에서 면역원성을 평가하였다. 실험동물은 7주령의 C57BL/6 암컷 마우스(Koatech, Korea)를 이용하였다. 모든 마우스는 강원대학교 실험동물센터에서 사육하였으며, 실험동물의 윤리적 사용을 위해 3R원칙에 따라 동물실험을 수행하였다. 또한, 모든 실험은 국립강원대학교의 동물실험 윤리위원회 규정하에서 국내법에 따라 실시하였다(허가번호 KW-150619-1). 한 군당 10마리의 마우스를 사용하였으며, rPTDP1P2LTB 접종군, rLTBR1R2PTD 접종군 그리고 대조군으로서 PBS 접종군으로 나누었다. 투여량과 투여경로는 마우스 1마리당 20 μg을 비강으로 접종하였으며, 접종 후 14일 뒤 추가접종을 1회 실시하였다. 시료의 채취는 접종 전(DPI 0), 접종 후 14, 28 그리고 42일에 모세관을 이용하여 마우스 개체마다 약 300~500 μL의 혈액을 안와채혈 한 후, 6,000 rpm으로 10분간 원심분리하여 상층액인 혈청을 분리하였으며, 상기 분리된 혈청을 이후 실험에 사용하였다.
실험예 2. 마우스에서의 항체가 조사(ELISA)
백신 접종에 따른 마우스에서의 면역원성을 조사하기 위해 rPTDP1P2LTB 또는 rLTBR1R2PTD 방어항원에 특이적인 혈청 내 IgG, IgA, IgG1, IgG2c를 효소결합 면역흡착 분석(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)법을 사용하여 측정하였다. 구체적으로, 제작된 방어항원에 대한 마우스에서의 체액성 면역 및 점막면역유도 효과를 비교하기 위하여 간접 ELISA를 실시하였다. MaxiSorp 96 웰 플레이트(Nunc, Denmark)에 농축된 rPTDP1P2LTB 또는 rLTBR1R2PTD 방어항원을 0.05M 탄산수소나트륨 완충액(pH 9.4)에 희석하여 각 웰당 500 ng씩 분주 한 뒤 4℃에서 16시간동안 코팅한 후 TPBS(0.05% Tween 20/PBS)로 3번 세척하였다. PBS에 1% 소혈청 알부민(bovine serum albumin, BSA)을 희석(BSA/PBS)하여 각각의 웰에 분주한 후 37℃에서 2시간 동안 블로킹하고 TPBS로 3번 세척하였다. 마우스 혈청 시료를 0.1% BSA/PBS로 계단 희석하여 37℃에서 2시간 동안 반응시킨 뒤 TPBS로 3번 세척하였다. 2차 항체로는 염소 항-마우스 IgG H+L (SouthernBiotech, USA)을 사용하여 100 μL/웰씩 첨가하여, 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 기질로는 테트라메틸-벤지딘(tetramethyl-benzidine; TMB, Surmodics, USA)을 100 μL/웰씩 첨가하여 실온에서 5분 동안 암반응시킨 후, 2N H2SO4 100 μL/웰씩 첨가하여 반응을 중단시켰다. 그 후 450 nm 파장에서 흡광도(Bio-Rad, USA)를 측정하였고, 0.1 이상 나타낸 값의 희석배수를 항체 역가로 산출하여 항체가를 측정하였으며, 그 결과를 도 3 내지 도 6에 나타내었다.
도 3 내지 도 6에 나타낸 바와 같이, 접종 전(DPI 0)에는 모든 군에서 IgG, IgA, IgG1, IgG2c 항체가가 매우 낮은 수준을 나타냈다. 그러나 최초접종 2주 뒤(DPI 14)부터 백신 접종군은 높은 면역반응을 유도하였으며, 2차 접종 2주 뒤(DPI 28)에도 항체가는 계속해서 증가하였다. 2차 접종 4주 뒤(DPI 42)에는 모든 실험구간에서 가장 높은 수준의 항체가를 나타냈으며, 대조군과 비교하여 매우 높은 항체가를 나타내며 유의적인 차이를 보였다(p<0.0001).
또한 DPI 54에서 측정한 기관지세척액(Bronchoalveolar lavage fluid, BALF) 내 IgG와 IgA 항체가를 측정하였으며, 그 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7에 나타낸 바와 같이, 기관지세척액 내 IgG와 IgA 항체가는 대조군(PBS)에 비해 높은 수준의 항체가를 나타내며, 유의적인 차이를 보였다(p<0.0001).
상기 결과로부터, 기존의 백신과는 달리 면역증강 효과를 주는 LTB와 세포투과성 단백질인 PTD가 방어항원에 융합되어 있어 마우스 비강으로 백신을 투여하는 경우 비강관련림프조직(Nasal associated lymphoid tissue, NALT)을 보다 효과적으로 자극하여 체액성 및 세포성 면역반응을 강하게 유도함을 확인하였다.
이하 본 발명의 융합단백질을 포함하는 면역증강용 약학적 조성물 및 식품 조성물, 호흡기 감염 질환 예방용 백신 조성물 및 약학적 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명을 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.
제제예 1. 약학적 제제의 제조
1. 산제의 제조
본 발명의 융합단백질 20 mg
유당 100 mg
탈크 10 mg
상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.
2. 정제의 제조
본 발명의 융합단백질 10 mg
옥수수전분 100 mg
유당 100 mg
스테아린산 마그네슘 2 mg
상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.
3. 캡슐제의 제조
본 발명의 융합단백질 10 mg
결정성 셀룰로오스 3 mg
락토오스 14.8 mg
마그네슘 스테아레이트 0.2 mg
통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.
4. 주사제의 제조
본 발명의 융합단백질 10 mg
만니톨 180 mg
주사용 멸균 증류수 2974 mg
Na2HPO42H2O 26 mg
통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당 (2 ml) 상기의 성분 함량으로 제조한다.
5. 액제의 제조
본 발명의 융합단백질 20 mg
이성화당 10 g
만니톨 5 g
정제수 적량
통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100 ml로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.
제제예 2. 식품 제제의 제조
1. 건강식품의 제조
본 발명의 융합단백질 100 mg
비타민 혼합물 적량
비타민 A 아세테이트 70 g
비타민 E 1.0 mg
비타민 B1 0.13 mg
비타민 B2 0.15 mg
비타민 B6 0.5 mg
비타민 B12 0.2 g
비타민 C 10 mg
비오틴 10 g
니코틴산아미드 1.7 mg
엽산 50 g
판토텐산 칼슘 0.5 mg
무기질 혼합물 적량
황산제1철 1.75 mg
산화아연 0.82 mg
탄산마그네슘 25.3 mg
제1인산칼륨 15 mg
제2인산칼슘 55 mg
구연산칼륨 90 mg
탄산칼슘 100 mg
염화마그네슘 24.8 mg
상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.
2. 건강음료의 제조
본 발명의 융합단백질 100 mg
비타민 C 15 g
비타민 E(분말) 100 g
젖산철 19.75 g
산화아연 3.5 g
니코틴산아미드 3.5 g
비타민 A 0.2 g
비타민 B1 0.25 g
비타민 B2 0.3g
물 정량
통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간 동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2L 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.
상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만 수요계층이나, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.
<110> BeesonBiogics Co., Ltd. KNU-Industry Cooperation Foundation BioCeltran <120> The vaccine for respiratory infectious diseases using protein transduction domain(PTD) <130> seq-1.1p <160> 8 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 100 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 1 Ala Pro Gln Thr Ile Thr Glu Leu Cys Ser Glu Tyr Arg Asn Thr Gln 1 5 10 15 Ile Tyr Thr Ile Asn Asp Lys Ile Leu Ser Tyr Thr Glu Ser Met Ala 20 25 30 Gly Lys Arg Glu Met Val Ile Ile Thr Phe Lys Ser Gly Ala Thr Phe 35 40 45 Gln Val Glu Val Pro Gly Ser Gln His Ile Asp Ser Gln Lys Lys Ala 50 55 60 Ile Glu Arg Met Lys Asp Thr Leu Arg Ile Ala Tyr Leu Thr Glu Thr 65 70 75 80 Lys Ile Asp Lys Leu Cys Val Trp Asn Asn Lys Thr Pro Asn Ser Ile 85 90 95 Ala Ala Ile Ser 100 <210> 2 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein transduction domain, PTD <400> 2 Lys Glu Thr Trp Trp Glu Thr Trp Trp Thr Glu Trp Ser Gln Pro Lys 1 5 10 15 Lys Lys Arg Lys Val 20 <210> 3 <211> 300 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 3 gctccccaga ctattacaga actatgttcg gaatatcgca acacacaaat atatacgata 60 aatgacaaaa tactatcata tacggaatcg atggcaggca aaagagaaat ggttatcatt 120 acatttaaga gcggcgcaac atttcaggtc gaagtcccgg gcagtcaaca tatagactcc 180 caaaaaaaag ccattgaaag gatgaaggac acattaagaa tcgcatatct gaccgagacc 240 aaaattgata aattatgtgt atggaataat aaaaccccca attcaattgc ggcaatcagt 300 300 <210> 4 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein transduction domain, PTD <400> 4 aaagaaacct ggtgggaaac ctggtggacc gaatggagcc agccgaaaaa aaaacgcaaa 60 gtg 63 <210> 5 <211> 234 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PTDP1P2LTB <400> 5 Met Lys Glu Thr Trp Trp Glu Thr Trp Trp Thr Glu Trp Ser Gln Pro 1 5 10 15 Lys Lys Lys Arg Lys Val Gln Arg Ala Thr Ile Arg Arg Gly Asp Ala 20 25 30 Pro Ala Gly Gly Ala Val Pro Gly Gly Ala Val Pro Gly Gly Phe Gly 35 40 45 Pro Leu Leu Asp Gly Trp Tyr Gly Val Asp Val Ser Asp Ser Thr Val 50 55 60 Asp Leu Ala Gln Gly Ala Lys Ala Pro Pro Ala Pro Lys Pro Ala Pro 65 70 75 80 Gln Pro Gly Pro Gln Pro Gly Pro Gln Pro Pro Gln Pro Pro Gln Pro 85 90 95 Pro Gln Pro Pro Gln Pro Pro Gln Arg Gln Pro Glu Ala Pro Ala Pro 100 105 110 Gln Pro Pro Ala Gly Arg Glu Leu Ser Ala Ala Val Asp Met Ala Pro 115 120 125 Gln Thr Ile Thr Glu Leu Cys Ser Glu Tyr Arg Asn Thr Gln Ile Tyr 130 135 140 Thr Ile Asn Asp Lys Ile Leu Ser Tyr Thr Glu Ser Met Ala Gly Lys 145 150 155 160 Arg Glu Met Val Ile Ile Thr Phe Lys Ser Gly Ala Thr Phe Gln Val 165 170 175 Glu Val Pro Gly Ser Gln His Ile Asp Ser Gln Lys Lys Ala Ile Glu 180 185 190 Arg Met Lys Asp Thr Leu Arg Ile Ala Tyr Leu Thr Glu Thr Lys Ile 195 200 205 Asp Lys Leu Cys Val Trp Asn Asn Lys Thr Pro Asn Ser Ile Ala Ala 210 215 220 Ile Ser Leu Glu His His His His His His 225 230 <210> 6 <211> 352 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LTBR1R2PTD <400> 6 Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro 1 5 10 15 Arg Gly Ser His Met Ala Pro Gln Thr Ile Thr Glu Leu Cys Ser Glu 20 25 30 Tyr Arg Asn Thr Gln Ile Tyr Thr Ile Asn Asp Lys Ile Leu Ser Tyr 35 40 45 Thr Glu Ser Met Ala Gly Lys Arg Glu Met Val Ile Ile Thr Phe Lys 50 55 60 Ser Gly Ala Thr Phe Gln Val Glu Val Pro Gly Ser Gln His Ile Asp 65 70 75 80 Ser Gln Lys Lys Ala Ile Glu Arg Met Lys Asp Thr Leu Arg Ile Ala 85 90 95 Tyr Leu Thr Glu Thr Lys Ile Asp Lys Leu Cys Val Trp Asn Asn Lys 100 105 110 Thr Pro Asn Ser Ile Ala Ala Ile Ser Leu Glu Gly Ile Pro Thr Lys 115 120 125 Glu Gly Lys Arg Glu Glu Val Asp Lys Lys Val Lys Glu Leu Asp Asn 130 135 140 Lys Ile Lys Gly Ile Leu Pro Gln Pro Pro Ala Ala Lys Pro Glu Ala 145 150 155 160 Ala Lys Pro Val Ala Ala Lys Pro Glu Ala Ala Lys Pro Val Ala Ala 165 170 175 Lys Pro Glu Ala Ala Lys Pro Glu Ala Ala Lys Pro Val Ala Ala Lys 180 185 190 Pro Glu Ala Ala Lys Pro Val Ala Ala Lys Pro Glu Ala Ala Lys Pro 195 200 205 Val Ala Thr Asn Glu Gly Thr Pro Asn Gln Gly Lys Lys Ala Glu Gly 210 215 220 Ala Pro Asn Gln Gly Lys Lys Ala Glu Gly Ala Pro Ser Gln Gly Lys 225 230 235 240 Lys Ala Glu Gly Ala Ser Asn Gln Gln Ser Pro Thr Thr Glu Leu Thr 245 250 255 Asn Tyr Leu Pro Glu Leu Gly Lys Lys Ile Asp Glu Ile Ile Lys Lys 260 265 270 Gln Gly Lys Asn Trp Lys Thr Glu Val Glu Leu Ile Glu Asp Asn Ile 275 280 285 Ala Gly Asp Ala Lys Leu Leu Tyr Phe Val Leu Arg Asp Asp Ser Lys 290 295 300 Ser Gly Asp Pro Lys Lys Ser Ser Leu Lys Val Lys Ile Thr Val Lys 305 310 315 320 Gln Ser Asn Asn Asn Gln Glu Leu Lys Ser Lys Lys Glu Thr Trp Trp 325 330 335 Glu Thr Trp Trp Thr Glu Trp Ser Gln Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val 340 345 350 <210> 7 <211> 705 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PTDP1P2LTB <400> 7 atgaaagaaa cctggtggga aacctggtgg accgaatgga gccagccgaa aaaaaaacgc 60 aaagtgcagc gcgcgacgat acggcggggg gacgcgcctg ccggcggtgc ggttccaggc 120 ggtgctgttc ccggcggctt cggccccctc cttgacggct ggtatggcgt ggatgtatcg 180 gattccaccg tggacctcgc tcagggcgcg aaggcgccgc cggcgcccaa gcccgcgccg 240 cagcccggtc cccagcccgg tccccagccg ccgcagccgc cgcagccgcc gcagccgccg 300 cagccgccac agaggcagcc ggaagcgccg gcgccgcaac cgccggcggg cagggagttg 360 tccgccgccg tcgacatggc tccccagact attacagaac tatgttcgga atatcgcaac 420 acacaaatat atacgataaa tgacaaaata ctatcatata cggaatcgat ggcaggcaaa 480 agagaaatgg ttatcattac atttaagagc ggcgcaacat ttcaggtcga agtcccgggc 540 agtcaacata tagactccca aaaaaaagcc attgaaagga tgaaggacac attaagaatc 600 gcatatctga ccgagaccaa aattgataaa ttatgtgtat ggaataataa aacccccaat 660 tcaattgcgg caatcagtct cgagcaccac caccaccacc actga 705 <210> 8 <211> 1059 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LTBR1R2PTD <400> 8 atgggcagca gccatcatca tcatcatcac agcagcggcc tggtgccgcg cggcagccat 60 atggctcccc agactattac agaactatgt tcggaatatc gcaacacaca aatatatacg 120 ataaatgaca aaatactatc atatacggaa tcgatggcag gcaaaagaga aatggttatc 180 attacattta agagcggcgc aacatttcag gtcgaagtcc cgggcagtca acatatagac 240 tcccaaaaaa aagccattga aaggatgaag gacacattaa gaatcgcata tctgaccgag 300 accaaaattg ataaattatg tgtatggaat aataaaaccc ccaattcaat tgcggcaatc 360 agtctcgagg ggatccctac aaaagaaggt aaaagagaag aagtagataa aaaagttaaa 420 gaattagata ataaaataaa aggtatatta cctcagcccc cagcagctaa accagaagca 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Claims (20)

  1. 대장균 열-불안정성 장독소 B 서브유닛(E. coli Heat-labile Enterotoxin B Subunit, LTB) 및 세포 투과성 펩타이드(Protein transduction domain, PTD)를 포함하는 융합단백질.
  2. 제1항에 있어서, 세포 투과성 펩타이드(Protein transduction domain, PTD)는 Pep-1인 것을 특징으로 하는, 융합단백질.
  3. 제1항에 있어서, 상기 융합단백질은 호흡기 감염 질환의 방어항원을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 융합단백질.
  4. 제3항에 있어서, 상기 호흡기 감염 질환의 방어항원은 마이코플라즈마성 폐렴(Mycoplasma hyopneumoniae) 또는 위축성 비염(Bordetella bronchiseptica)의 방어항원인 것을 특징으로 하는, 융합단백질.
  5. 제1항에 있어서, 상기 대장균 열-불안정성 장독소 B 서브유닛(E. coli Heat-labile Enterotoxin B Subunit, LTB)은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 하는, 융합단백질.
  6. 제1항에 있어서, 상기 세포 투과성 펩타이드(Protein transduction domain, PTD)는 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 하는, 융합단백질.
  7. 제4항에 있어서, 상기 융합단백질은 서열번호 5(rPTDP1P2LTB) 또는 서열번호 6(rLTBR1R2PTD)의 아마노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 하는, 융합단백질.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 융합단백질을 코딩하는 재조합 유전자.
  9. 제8항에 있어서, 상기 재조합 유전자는 서열번호 7 또는 서열번호 8의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 하는, 재조합 유전자.
  10. 제8항의 재조합 유전자를 포함하는, 발현벡터.
  11. 제10항의 발현벡터로 형질전환된 균주.
  12. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 면역증강용 약학적 조성물.
  13. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 면역증강용 식품 조성물.
  14. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 호흡기 감염 질환의 예방용 백신 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 상기 호흡기 감염 질환은 마이코플라즈마성 폐렴(Mycoplasma hyopneumoniae) 또는 위축성 비염(Bordetella bronchiseptica)인 것을 특징으로 하는, 호흡기 감염 질환의 예방용 백신 조성물.
  16. 제14항에 있어서, 상기 백신은 비강 투여용인 것을 특징으로 하는, 호흡기 감염 질환의 예방용 백신 조성물.
  17. 제14항에 있어서, 상기 백신은 점막면역을 유도하는 것을 특징으로 하는, 호흡기 감염 질환의 예방용 백신 조성물.
  18. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 호흡기 감염 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  19. 제18항에 있어서, 상기 호흡기 감염 질환은 마이코플라즈마성 폐렴(Mycoplasma hyopneumoniae) 또는 위축성 비염(Bordetella bronchiseptica)인 것을 특징으로 하는, 호흡기 감염 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  20. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 호흡기 감염 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
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