KR20180019962A - 피부 상태 개선 및 모발 성장 촉진 효과를 가지는 펩타이드, 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 주름 개선과 같은 피부 상태 개선, 탈모 개선 또는 모발 성장 촉진용 펩타이드에 관한 것으로, 특정 서열로 구성된 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것이다.

Description

피부 상태 개선 및 모발 성장 촉진 효과를 가지는 펩타이드, 및 이의 용도{PEPTIDE EXHIBITING EFFICACIES OF IMPROVEMENT IN SKIN CONDITION AND HAIR GROWTH, AND USES THEREOF}

본 발명은 피부 상태 개선 모발 성장 촉진 효과가 우수한 신규 펩타이드에 관한 것이다.

시대가 변하면서 미용에 대한 관심이 날로 높아지는 과정에 모발은 중요한 한 부분을 차지하고 있다. 모발은 피부 표면에서 생산된 가늘고 각질화된 구조를 의미한다.

모발은 외부 충격에 대한 쿠션 역할과 더불어 직사광선, 한냉, 마찰, 위험 등 외부 자극으로부터 인체를 보호하고 신체에 유해한 비소, 수은, 아연 등의 중금속을 체외로 배출하는 기능을 하며 현대에는 장식의 미용 측면도 강조되고 있다.

그러나, 식생활 변화나 내외적 스트레스 증가를 비롯하여 여러 원인에 의해 탈모를 호소하는 환자가 증가하고 있어 이에 대한 치료법 개발이 초유의 관심사로 급부상하고 있다.

사람의 모발은 약 10만 내지15만개 정도이며, 각각의 모발은 서로 다른 성장주기를 가진다. 모발 성장주기는 3단계로 구성되며, 구체적으로 모발이 가장 활발하게 성장하는 성장기(anagen stage), 모발의 퇴화가 시작되는 퇴화기(catagen stage) 및 모발의 성장이 멈추거나 휴식에 접어드는 휴지기(telogen stage)로 분류된다.

일반적으로 탈모라 함은 이러한 주기 중에서 성장기의 모발 비율이 짧아지고 퇴행기 또는 휴지기의 모발이 증가하여 비정상적으로 다량의 모발이 탈락하는 것을 의미한다.

모발의 사멸과 탈락에는 남성호르몬이 매우 중요하게 작용하는 바, 남성호르몬에 의해 모낭에서 발현되는 인자들 중, DKK-1(Dickkopf-related protein 1)은 모낭 성장 저해와 사멸에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.

한편, 주기적인 모발 성장을 위해 모낭의 재생과 줄기세포의 활성화가 이루어져야 하며 이는 Wnt/β-카테닌(catenin)의 생성, 활성화에 의해 이루어지는 것으로 알려져 있다. 또한, 앞서 언급된 DKK-1은 Wnt/β-catenin의 길항제로 알려져 있어 모발 성장을 조절하는데 있어 상기의 신호 체계가 매우 중요함을 알 수 있다.

현재까지 개발된 탈모증의 치료 또는 예방용 제제로는 혈행 촉진, 모근 기능 강화, 두피보습 및 남성호르몬 억제를 위한 여성호르몬을 주성분으로 한 제제나 미녹시딜(minoxidil), 피나스트라이드(finasteride), 트리코사카라이드(trichosaccharide) 등을 함유한 제제 등이 있지만, 성기능장애, 기형아 출산 가능성, 전신 발모 등의 부작용으로 인하여 사용에 많은 제약이 있다.

본 발명은 전술한 종래 기술의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 본 발명의 목적은 생체안정성이 우수하며, 모발 상태와 피부 상태 개선 효과가 우수한 신규의 펩타이드를 제공하는 것이다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 피부 상태 개선용 펩타이드가 제공된다.

일 실시예에 있어서, 상기 펩타이드는 섬유아세포, 각질세포, 또는 모낭세포의 성장을 촉진할 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 펩타이드는 탈모 개선 또는 모발 성장 촉진용일 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 펩타이드는 항산화 활성을 가질 수 있다.

본 발명의 다른 일 측면에 따르면, 서열번호 1 또는 서열번호 2 의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 탈모 개선 또는 모발 성장 촉진용 조성물이 제공된다.

본 발명의 또 다른 일 측면에 따르면, 서열번호 1 또는 서열번호 2 의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 피부 외용제 조성물이 제공된다.

일 실시예에 있어서, 상기 조성물이 항산화, 주름 개선, 피부탄력 개선, 피부노화 방지, 또는 피부재생용일 수 있다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 크기가 작은 펩타이드를 사용함에 따라 우수한 피부 침투율을 구현할 수 있고, 이로 인해 모발 및 피부 상태 개선 효과를 향상시킬 수 있다.

상기 펩타이드는 우수한 탈모 억제, 모발 생성, 주름 개선 등의 활성으로 인해 의약품, 의약외품, 건강기능식품, 화장료 등 미용 목적의 제품에 활용될 수 있다.

본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

본 명세서에서 사용되는 용어는 본 발명에서의 기능을 고려하면서 가능한 현재 널리 사용되는 일반적인 용어들을 선택하였으나, 이는 당 분야에 종사하는 기술자의 의도 또는 판례, 새로운 기술의 출현 등에 따라 달라질 수 있다. 또한, 특정한 경우는 출원인이 임의로 선정한 용어도 있으며, 이 경우 해당되는 발명의 설명 부분에서 상세히 그 의미를 기재할 것이다. 따라서 본 발명에서 사용되는 용어는 단순한 용어의 명칭이 아닌, 그 용어가 가지는 의미와 본 발명의 전반에 걸친 내용을 토대로 정의되어야 한다.

다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.

수치 범위는 상기 범위에 정의된 수치를 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 최대의 수치 제한은 낮은 수치 제한이 명확히 쓰여져 있는 것처럼 모든 더 낮은 수치 제한을 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 최소의 수치 제한은 더 높은 수치 제한이 명확히 쓰여져 있는 것처럼 모든 더 높은 수치 제한을 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 수치 제한은 더 좁은 수치 제한이 명확히 쓰여져 있는 것처럼, 더 넓은 수치 범위 내의 더 좋은 모든 수치 범위를 포함할 것이다.

이하, 본 발명의 실시예를 상세히 기술하나, 하기 실시예에 의해 본 발명이 한정되지 아니함은 자명하다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 피부 상태 개선용 펩타이드가 제공된다. 또한, 상기 펩타이드는 상기 아미노산 서열을 일부로서 포함할 수도 있다.

본 발명자들은 생물학적으로 유효한 활성을 가지는 펩타이드를 발굴하고자 예의 노력한 결과, 상기 펩타이드의 주름 개선 효과와 같은 우수한 피부 상태 개선 효과, 및 탈모 개선 및 모발 성장 촉진 효과를 규명하였다.

상기 펩타이드(peptide)는 아미드 결합(또는 펩타이드 결합)으로 연결된 하나 이상의 아미노산으로 구성된 폴리머를 의미한다. 본 발명의 목적상 상기 펩타이드는 탈모 개선, 모발 성장 촉진 및 주름 개선 효과를 나타내는 펩타이드 또는 이의 단편을 의미할 수 있다.

상기 펩타이드를 명명하는 일반적인 규칙은 구체적으로 지시된 예외사항이 없는 경우 3문자 또는1문자 아미노산 코드를 기초로 할 수 있다. 예컨대, 아미노산 구조의 중심부를 3문자 코드(예컨대, Ala, Lys)로 표시하며, 3문자 코드의 앞에 "D-"를 적음으로써 D-입체형태(예컨대, D-Ala, D-Lys)를 구체적으로 지시하지 않은 경우라면L-입체형태로 가정할 수 있다. 상기 펩타이드를 구성하는 아미노산 잔기는 천연 또는 비-천연아미노산 잔기일 수 있다.

상기 펩타이드는 섬유아세포 또는 각질세포의 성장을 촉진하여 피부에 탄력을 부여할 수 있고, 이에 따라 주름 형성을 억제할 수 있다. 나아가, 상기 펩타이드는 모낭세포의 성장을 촉진하여 모발의 성장을 유도할 수도 있다.

피부 속 각질세포와 섬유아세포는 정신적 스트레스, 외부의 유해 요인, 내인성 노화 등 다양한 원인에 의해 손상을 받아 퇴화하고 밀도가 감소할 수 있다. 특히, 내외적 스트레스에 의한 각질세포 및 섬유아세포의 손상은 피부세포의 밀도를 저하시키고 콜라겐(collagen)의 합성을 방해하므로 피부 주름의 형성을 심화시킬 수 있다.

상기 콜라겐은 결합 조직의 주성분이며 뼈와 피부에 주로 분포하는 성분으로, 피부의 구조와 형태를 유지하고 단단한 강도와 탄력을 제공하는 경단백질이다. 피부가 노화되거나 자외선, 열 등에 노출이 되면 콜라겐 합성능력이 저하되고 콜라겐 양이 현저히 감소할 수 있다. 상기 콜라겐 양이 감소하면 근육의 형태를 유지하지 못하므로 피부 주름(wrinkle)이 생성될 수 있다.

상기 펩타이드는 인체 내 성장인자를 구성하는 펩타이드에서 유래한 것으로 작은 분자량과 크기로 인해 피부 투과율이 높고, 그로 인한 피부 생장 촉진 효과가 우수하다.

상기 펩타이드는 섬유아세포 및 각질세포의 성장을 촉진하고 콜라겐 합성을 촉진하므로, 피부의 각질층, 상피층, 진피층을 성장시키고 주름 개선, 피부탄력 개선, 피부노화 방지, 피부보습 개선, 피부 재생 등의 효과를 나타낼 수 있다.

한편, 테스토스테론(testosterone)이 전환된 물질인 디하이드로테스토스테론(dihydrogestosterone)은 안드로겐성 탈모를 유도하는 것으로 알려져 있다.

상기 디하이드로테스토스테론은 모낭세포 내에 존재하는 안드로겐 수용체와 결합하여 모유두 세포로 유입되고, 이 과정에서 TGF-β, DKK-1, BMP 등을 비롯한 모낭세포 파괴물질들을 생산시켜 탈모를 유발한다.

즉, 디하이드로테스토스테론의 생성량을 감소시키거나, 모낭세포로의 유입 경로를 차단하거나, 모낭세포의 재생을 통해 탈모 개선 내지 모발 성장의 효과를 달성할 수 있다.

이들 중, 상기 펩타이드는 디하이드로테스토스테론의 생성량을 유의적으로 억제하고, 모낭세포를 성장시키는 작용을 통해 우수한 탈모 개선 또는 모발 성장 효과를 구현할 수 있다.

따라서, 상기 펩타이드가 국소적으로 피부에 적용될 때, 주름 개선과 같은 피부 상태 개선, 탈모 개선, 모발 성장 촉진 등의 전반적인 효과가 동시에 구현될 수 있다.

한편, 상기 펩타이드는 생체 내의 단백질을 추출한 후 단백질 분해효소로 처리하여 저분자량화하거나, 유전자 재조합 및 단백질 발현시스템을 이용하여 생물학적으로 제조할 수 있고, 또는 펩타이드 합성기 등을 이용한 화학 합성 방법으로 제조할 수 있다.

예컨대, 유전자 조작을 통하여 융합파트너 및 상기 펩타이드로 구성된 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 제조하고, 상기 유전자로 숙주 미생물을 형질 전환시킨 후 숙주 미생물에서 융합 단백질 형태로 발현시킬 수 있다.

상기 융합 단백질은 단백질 분해효소 또는 화합물을 이용하여 절단 및 분리할 수 있고, 상기 펩타이드가 수득될 수 있다. 구체적으로, Factor Xa 또는 엔테로키나제와 같은 단백질 분해효소, CNBr 또는 하이드록실아민과 같은 화합물에 의해 절단될 수 있는 아미노산 잔기를 코딩하는 DNA 서열을 상기 융합파트너 및 상기 펩타이드의 유전자 사이에 삽입할 수 있다.

상기 펩타이드의 N 또는 C-말단은 아세틸기, 플루오레닐 메톡시 카르보닐기, 포르밀기, 팔미토일기, 미리스틸기, 스테아릴기 또는 폴리에틸렌글리콜(PEG)가 결합될 수 있다. 상기 펩타이드는 상기 변형에 의해 안정성이 현저히 개선될 수 있다. 상기 안정성은 in vivo 안정성뿐만 아니라, 저장 안정성도 포함하는 개념이다. 상기 보호기는 생체 내의 단백질 절단효소의 공격으로부터 본 발명의 펩타이드를 보호할 수 있다.

또한, 상기 펩타이드는 상기 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드의 기능적 동등물을 포함할 수 있다. 상기 “기능적 동등물"은 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 아미노산 서열과 적어도 40% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 것으로, 상기 아미노산 서열과 실질적으로 동질의 생리활성을 가지는 단백질을 의미한다.

상기 "실질적으로 동질의 생리활성"은 상기 펩타이드의 구조적, 기능적 상동성으로 인한 항염 활성 등 피부 상태 개선 활성을 의미한다. 상기 서열 상동성은 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 대비하여 결정되며, 비교 영역에서의 일부 핵산 서열이 추가 또는 삭제될 수 있다.

본 발명의 다른 일 측면에 따르면, 서열번호 1 또는 서열번호 2 의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 탈모 개선 또는 모발 성장 촉진용 조성물이 제공된다.

상기 “탈모”는 정상적으로 모발이 존재해야 하는 부위에 모발이 결손된 상태를 의미하며, 일반적으로 두피의 성모가 빠지는 것을 의미한다. 성모는 색이 없고 굵기가 가는 연모와는 달리 결손 시 미용상의 문제를 일으킬 수 있다.

탈모는 임상적으로 흉터가 형성되는 것과 그렇지 않은 두 종류로 구분될 수 있으며, 흉터가 형성되는 탈모(반흔성)는 모낭이 파괴되므로 모발이 재생되지 않는 반면, 흉터가 형성되지 않는 탈모(비반흔성)는 모낭이 유지되므로 증상 부위가 사라진 후에 모발이 재생된다.

상기 조성물의 적용 대상이 되는 탈모는 원형 탈모(alopecia areata), 전두 탈모(alopecia totalis), 범발성 탈모(alopecia universalis), 남성형 탈모(androgenic alopecia), 휴지기 탈모(telogen effluvium), 성장기 탈모(anagen effluvium), 또는 화학치료-유발 탈모(chemotherapy-induced alopecia)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

현재 상기 탈모의 치료를 위해 미녹시딜, 피나스트라이드 등의 의약품이나 모발 이식술 등이 이용되고 있고, 특히 원형 탈모의 경우 국소 스테로이드 제제나 전신 스테로이드 제제, 면역 요법 등이 이용되고 있다.

관련하여, 상기 펩타이드는 모낭세포의 성장을 촉진할 수 있으므로, 근본적으로 모발의 성장을 촉진함과 동시에 성장하는 모발을 효과적으로 보호할 수 있다. 상기 모낭세포 내에 존재하는 안드로겐 수용체, 및 이와 연계되는 디하이드로테스토스테론의 작용에 관해서는 전술한 것과 같다.

상기 “탈모 개선” 또는 “모발 성장”은 유사한 의미로 사용될 수 있으며, 이는 당업계에서 사용되는 또 다른 용어인 양모 촉진, 육모 촉진과 동일한 의미를 내포할 수 있다.

본 발명의 또 다른 일 측면에 따르면, 서열번호 1 또는 서열번호 2 의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 피부 외용제 조성물이 제공된다.

구체적으로, 상기 피부 외용제 조성물은 항산화, 주름 개선, 피부탄력 개선, 피부노화 방지, 또는 피부재생용일 수 있다.

상기 피부 상태 개선 효과는 항산화능, 피부 노화 및 주름의 예방 또는 개선, 피부 보호, 피부 장벽 기능 개선, 피부자극 완화, 피부 세포 증식 및 재생능, 콜라겐 합성 증진능 등 피부에 유익한 효과를 모두 포괄할 수 있다.

상기 "주름"은 피부가 쇠하여 생긴 잔줄을 의미하며 유전자에 의한 원인, 피부 진피에 존재하는 콜라겐 및 엘라스틴의 감소, 외부환경 등에 의해 유발될 수 있다.

상기 "주름 개선"은 피부에 주름이 생성되는 것을 억제 또는 저해하거나, 이미 생성된 주름을 완화되는 현상을 의미한다.

상기 "피부 탄력"은 진피층에 존재하는 엘라스틴(elastin)으로 구성된 탄력섬유에 의해 구현되는 탄성을 의미하며, 상기 탄력섬유는 고무와 같이 낮은 탄성계수를 가지고 있으므로 외력에 의해 쉽게 변형되고, 외력이 제거되었을 때는 쉽게 원상태로 복원될 수 있다.

상기 탄력섬유는 엘라스틴이라는 무정형의 기질에 미원섬유(microfibrils)들이 박혀 있으며, 상기 엘라스틴은 라이신에서 유래한 데스모신(desmosine) 및 아이소데스모신(isodesmosine)이라는 탄력섬유에서만 발견되는 독특한 아미노산으로 구성된 단백질이다. 상기 데스모신 및 아이소데스모신은 긴 펩타이드 사슬 내에서 가교(cross-links)를 형성하며, 상기 구조가 엘라스틴에 고무 유사 성질을 부여할 수 있다.

상기 "피부 탄력 개선"은 엘라스틴으로 구성된 탄력섬유가 콜라겐과 함께 존재하며, 상기 엘라스틴과 콜라겐이 충분히 존재하는 상태에서 피부 탄력이 유지 또는 향상되는 현상을 의미한다.

상기 “유효 성분으로 포함하는”은 탈모 개선, 모발 성장 촉진, 또는 피부 개선 효과를 나타낼 수 있는, 예컨대, 모발 성장 효능과 관련된 디하이드로테스토스테론 억제, 주름 개선 효능과 관련된 콜라겐 합성, 또는 탄력 개선 등을 나타낼 수 있는 정도의 유효량을 함유하는 것을 의미할 수 있다.

상기 펩타이드는 상기 탈모 개선, 모발 성장 또는 피부 상태 개선 활성으로 인해 약학적 조성물, 화장료 조성물, 피부 외용제 등 다양한 용도로 활용될 수 있다.

상기 약학적 조성물은 당해 기술 분야에서 통상적인 방법에 따라 약제학적으로 허용되는 산 부가염을 형성할 수 있다. 유리산은 유기산 및 무기산이 사용될 수 있으며, 예컨대, 상기 무기산은 염산, 브롬산, 황산, 또는 인산 일 수 있으며, 상기 유기산은 구연산(Citric acid), 초산, 젖산, 주석산(Tartaric acid), 말레인산, 푸마르산(Fumaric acid), 포름산, 프로피온산(Propionic acid), 옥살산, 트리플루오로아세트산, 벤조산, 글루콘산, 메탄설폰산, 글리콜산, 숙신산(Succinic acid), 4-톨루엔설폰산, 벤젠설폰산, 살리실산, 니코틴산, 이소니코틴산, 피콜린산, 글루탐산 또는 아스파르트산일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 약학적 조성물은 통상적으로 사용되는 사용되는 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

상기 조성물은 경구적 전달, 비경구적 전달의 형태로 투여될 수 있다. 상기 펩타이드는 전신 또는 국소 투여될 수 있으며, 상기 투여는 경구 투여 및 비경구 투여를 포함할 수 있다. 상기 화합물이 조성물로서 투여되는 경우, 적절한 투여 형태를 제공하도록 적합한 양의 약학적으로 허용되는 비히클 또는 담체와 함께 제형화될 수 있다.

또한, 상기 펩타이드를 포함하는 조성물은 약학적 조성물의 제조에 사용되는 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

상기 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유를 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 상기 조성물은 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제제화 하여 사용할 수 있다.

상기 경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 상기 고형제제는 상기 펩타이드와 이의 분획물들에 적어도 하나 이상의 부형제, 예컨대, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 또는 젤라틴 등을 혼합하여 조제할 수 있다. 상기 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제가 사용될 수도 있다.

상기 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 사용될 수 있으며, 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

상기 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 사용될 수 있다. 상기 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르가 사용될 수 있다. 상기 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴이 사용될 수 있다.　

상기 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 바람직하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

한편, 상기 화장료 조성물 또는 피부 외용제는 통상의 방법에 의해 제형화될 수 있다. 피부 외용제의 제형화에 있어서 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 내용을 참조할 수 있고, 화장료 조성물의 제형화에 있어서 International cosmetic ingredient dictionary, 6th ed., The cosmetic, Toiletry and Fragrance Association, Inc., Washington, 1995에 개시되어 있는 내용을 참조할 수 있다.

구체적으로, 상기 화장료 조성물은 일반적인 유화 제형 및 가용화 제형의 형태로 제조할 수 있다. 예컨대, 유연 화장수 또는 영양 화장수 등의 화장수; 훼이셜 로션, 바디로션 등의 유액; 영양 크림, 수분 크림, 아이 크림 등의 크림; 에센스; 화장연고; 스프레이; 젤; 팩; 선 스크린; 메이크업 베이스; 액체 타입, 고체 타입 또는 스프레이 타입 등의 파운데이션; 파우더; 클렌징 크림, 클렌징 로션, 클렌징 오일 등의 메이크업 제거제; 또는 클렌징 폼, 비누, 바디워시 등의 세정제로 제형화될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 또한 상기 피부 외용제는, 연고, 패취, 겔, 크림 또는 분무제로 제형화될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 화장료 조성물 또는 외용제는 각각의 제형에 있어서 상기 필수성분 외에 제형의 종류 또는 사용 목적 등에 따라 본 발명에 따른 목적을 저해하지 않는 범위 내에서 다른 성분들이 적절히 배합될 수 있다.

상기 화장료 조성물 또는 외용제는 통상적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있으며, 예컨대 유분, 물, 계면활성제, 보습제, 저급 알코올, 증점제, 킬레이트제, 색소, 방부제, 향료 등을 적절히 배합할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 허용 가능한 담체는 제형에 따라 달리할 수 있다. 예컨대, 연고, 페이스트, 크림 또는 젤로 제형화될 때 담체 성분으로서 동물성 유, 식물성 유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크, 산화아연 또는 이들의 혼합물이 사용될 수 있다

상기 화장료 조성물 또는 외용제가 파우더 또는 스프레이로 제형화될 때, 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록사이드, 칼슘 실케이트, 폴리아미드 파우더 또는 이들의 혼합물이 사용될 수 있고, 스프레이의 경우 클로로플루오로히드로카본, 프로판, 부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진제를 더 포함할 수 있다.

상기 화장료 조성물 또는 외용제가 용액 또는 유탁액으로 제형화될 때, 담체 성분으로서 용매, 용해화제, 또는 유탁화제가 사용될 수 있고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-브틸글리콜 오일이 사용될 수 있고, 특히, 목화씨 오일, 땅콩 오일, 옥수수 배종 오일, 올리브 오일, 피마자 오일 및 참깨 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 사용될 수 있다.

상기 화장료 조성물 또는 외용제가 현탁액으로 제형화될 때, 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리 옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 사용될 수 있다.

상기 화장료 조성물이 비누로 제형화될 때, 담체 성분으로서 지방산의 알칼리 금속 염, 지방산 헤미에스테르 염, 지방산 단백질 히드롤리제이트, 이세티오네이트, 라놀린 유도체, 지방족 알코올, 식물성 유, 글리세롤, 당 등이 사용될 수 있다.

상기 화장료 조성물 또는 피부 외용제는 최종 제품의 품질이나 기능에 따라 업계에서 통상적으로 사용되는 지방 물질, 유기용매, 용해제, 농축제, 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉 쇄제, 킬레이트화제, 보존제, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품학 또는 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 추가적으로 함유할 수 있다.

다만, 상기 보조제 및 그 혼합 비율은 본 발명에 따른 화장료 조성물의 바람직한 성질에 영향을 미치지 않도록 적절히 선택할 수 있다.

이하 실시예를 통해, 본 발명을 더욱 상술하나 하기 실시예에 의해 본 발명이 제한되지 아니함은 자명하다.

실시예 : 펩타이드의 제조

9-플루오레닐메톡시카르보닐(9-fluorenylmethoxycarbonyl; Fmoc)을 아미노산의 보호기로 사용하는 통상의 고체상 펩타이드 합성법(solid phase peptide synthesis: SPPS)을 이용하여 펩타이드를 합성하였다. N-히드록시벤조 트리아졸(N-hydroxybenzotriazole; HOBt)와 N,N-디아이소프로필카보 디이미드(N,N'-diisopropylcarbodiimide; DIC)를 활성화제로 사용하여 아미노산 잔기를 연장하였다[참고문헌 : Wang C. Chan, Perter D. White, 'Fmoc-solid phase peptide synthesis', Oxford].

합성된 펩타이드를 C18 역상 고성능액체크로마토그래피(HPLC, Waters Associates, USA)를 이용하여 순수 분리하였다. 컬럼은 ACQUITY UPLC BEH300 C18 (2.1 x 100 mm, 1.7 μM, Waters Co, USA)을 이용하였다.

상기 방법에 따라 합성된 펩타이드는 하기 표 1과 같다.

구분	서열	비고
실시예 1	HGSPWG	서열번호 1
실시예 2	HGKLNGIKW	서열번호 2

실험예 1 : 세포 성장 효과 시험

상기 실시예에 따라 제조된 펩타이드에 대한 성장인자의 유사 효능 및 억제 효능을 분석하기 위해 HaCaT 각질세포주와 NIH3T3 섬유아세포, 그리고 HHFDPC 모낭세포를 이용한 SRB(Sulforhodamine B) 비색법을 이용하여 측정하였다(Rizzino, et al. Cancer Res. 48:4266(1988)).

HaCaT 각질세포주, NIH3T3 섬유아세포, 및 HHFDPC 모낭세포를 각각 250 ㎖ 용량의 조직 배양용 플라스크를 이용하여 10% 우태아혈청(FBS; fetal bovine serum)을 포함하는 DMEM(Dulbecco's modied Eagle's medium)에서 배양하였다.

배양된 세포주들을 1% 트립신 용액으로 배양용기 바닥에서 떼어낸 후 원심분리하여 세포 침전물만을 모았다. 이를 FBS가 함유되지 않은 DMEM 배양액에 다시 현탁한 후, 96-웰 조직 배양용 평판에 각 웰 당 3 X 10³ 세포가 되도록 넣고 24시간 동안 37℃, 5% CO₂ 조건 하에서 배양하였다.

24시간 뒤 혈청을 완전히 제외한 동일한 배양액으로 배지를 교환하고, 표준 설정을 위해 공 시료와 합성 펩타이드를 10% DMSO에 멸균상태로 녹인 후 10mg/L의 농도로 72시간을 위와 동일 조건으로 배양하였다.

배양이 완료된 후 상층액을 제거하고 에탄올을 이용하여 세포를 고정화 한 후, PBS(phosphate buffer saline)로 3회 세척하였다. 세척액을 제거한 뒤 비색 SRB 용액으로 처리하였으며, 이후 1% 아세트산(acetic acid)으로 충분히 세척하고 현미경으로 세포를 관찰하여 생존 세포의 상태를 관찰하였다. 이 때, 590nm파장의 흡광도를 측정하여 세포의 생존 상태를 측정하였다.

즉, 상기 실시예의 펩타이드를 처리한 각각의 세포와 어떠한 처리도 하지 않은 세포(음성 대조군)의 세포 증식률을 비교하였고, 이에 따른 상대적 수치를 하기 표 2에 나타내었다.

구분	HaCaT 각질세포			NIH3T3 섬유아세포			HHFDPC 모낭세포
세포 증식률 (%)	실시예 1	실시예 2	대조군	실시예 1	실시예 2	대조군	실시예 1	실시예 2	대조군
	135	136	100	142	140	100	153	157	100

상기 표 2를 참고하면, 상기 실시예의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드가 각질세포, 섬유아세포, 및 모낭세포의 성장을 대폭 향상시키며, 특히 섬유아세포의 경우 1.4배 이상을 향상시켰다.

상기 결과는 상기 아미노산 서열로 구성된 펩타이드가 주름 개선과 같은 피부 상태 개선 효과를 향상시킬 수 있으며, 우수한 탈모 개선 내지 모발 생성 효과를 구현할 수 있음을 시사한다.

실험예 2 : 5알파-환원효소(5α-reductase) 저해 활성 시험

탈모의 주 원인으로 알려진 5알파-환원효소(5α-reductase)에 대한 상기 펩타이드의 저해능을 평가하였다.

쥐의 모유두세포(DPCs, Dermal papilla cells)를 24 웰 플레이트에 5x10⁵ cells/well의 농도로 분주하여 24시간 동안 배양하였다. 상기 펩타이드를 10mg/L 및 50mg/L 농도로 각 웰에 처리하고 1시간 경과 후 50nM 농도의 테스토스테론(testosterone)으로 자극하였다. 배양이 완료된 용액에서 상층액을 분리하여 DPCs 펠릿을 수득하였다.

이하의 과정에서, 디하이드로테스토스테론(DHT, dihydrotestosterone)의 농도는 효소면역측정법(ELISA, enzyme-linked immunosorbent assay)을 이용하여 측정하였다.

Rabbit Anti-DHT 항체로 코팅된 DHT ELISA microtiter strips에 상기 DPCs 펠릿을 100㎕씩 분주하고, 각 웰에 DHT 항혈청을 25㎕씩 분주하여 2 내지 8℃에서 15~20시간 동안 반응시킨 뒤 3회 세척하였다.

각 웰에 DHT-HRP Enzyme Conjugate를 100㎕씩 분주하고, shaker 상에서 30분간 실온에서 반응시킨 뒤 3회 세척하였다. 기질 100㎕를 분주하고, 20~30분간 실온에서 반응시킨 뒤, 100㎕의 Stop 용액을 처리하여 450 nm에서 흡광도를 측정하여 DHT 생성량으로 나타내었다. 펩타이드를 처리하지 않은 대조군에 대한 상대적인 DHT의 생성량을 저해율(%)로 계산하였고, 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.

구분	시료 농도 (mg/L)	5알파-환원효소 저해율(%)
실시예 1 (펩타이드)	0	0
	10	48
	50	67
실시예 2 (펩타이드)	0	0
	10	49
	50	66

상기 표 3을 참고하면, 상기 실시예의 펩타이드를 처리하지 않은 대조군과 비교하여, 상기 실시예의 펩타이드를 처리한 배지는 농도 의존적으로 5알파-환원효소 저해율이 증가하였다.

즉, 상기 결과는 상기 실시예의 펩타이드가 디하이드로테스토스테론의 생성을 억제하여 5알파-환원효소의 활성을 저해시킴으로써 우수한 탈모 개선 또는 모발 성장 효과를 구현할 수 있음을 시사한다.

실험예 3 : 발모 기능성 평가 시험

상기 실시예에 따라 제조된 펩타이드의 발모 기능성을 평가하기 위해 탈모증상이 나타나는 성인 남녀를 대상으로 아래와 같은 임상실험을 실시하였다.

30~60세의 성인 남녀 총 20명(남성 15명, 여성 5명)을 2그룹으로 나누어 시판되는 미녹시딜 5% 제품 및 상기 실험예 1의 조성물로 제조된 액상 토닉을 1일 1회(1회당 5㎖)씩 3개월 동안 탈모 부위에 도포하여 그 결과를 관찰하였다.

효과의 판정은 세발 시 일일 평균 탈모량, 육안판정 소견 및 자각증상 개선 정도를 평가 척도로써 5단계로 평가하였고, 이들의 평균 값을 종합개선도로 산출하였다. 이 때, 각각의 평가 척도는 5점 만점으로 각 등급을 1점 단위로 설정하였다. 구체적인 평가 기준은 하기 표 4에 나타내었으며, 이에 따른 평가 결과를 하기 표 5에 나타내었다.

점수	육안판정	자각증상	세발 시 탈모량
1	악화	악화	증가
2	유지	유지	유지
3	약간 개선	약간 개선	소량 감소
4	보통 개선	보통 개선	중간 감소
5	대폭 개선	대폭 개선	대량 감소

구분	육안판정	자각증상	세발 시 탈모량	종합개선도
실시예 1	4.2	3.5	4.2	3.97
실시예 2	4.1	3.6	4.1	3.93
미녹시딜	4.3	3.8	4.1	4.06

상기 표 5를 참고하면, 상기 펩타이드를 함유하는 조성물은 대조군인 미녹시딜 처리군과 비교하여 육안판정, 자각증상, 세발 시 탈모량에 있어서 동등한 효과를 나타내었다.

상기 결과는 상기 실시예에 따른 펩타이드가 발모 촉진 기능에 있어서 현재 시판되는 제품에 비해 우수한 효과를 구현할 수 있고, 사용자의 전반적인 만족도를 향상시킬 수 있음을 시사한다.

실험예 4 : 프로스타글란딘 E2(PGE2) 억제 활성 시험

프로스타글란딘 E2(PGE2)의 활성 억제는 염증으로 인한 탈모 현상을 예방할 수 있기 때문에, 상기 실시예에 따라 제조된 펩타이드의 프로스타글란딘 PGE2의 생성 억제 효과를 확인하였고, 측정 장비로는 Prostaglandin E2 EIA Kit를 사용하였다.

RAW 264.7 세포에 상기 실시예의 펩타이드를 0.1% LPS와 함께 0.1, 1, 10, 50 mg/L 농도로 각각 24시간 처리한 후, 세포 배양 상층액을 goat anti-mouse로 코팅된 96웰 플레이트에 50㎕씩 로딩하고, 여기에 1차 항체 용액50㎕와 PGE2 conjugate 50㎕씩 첨가하여 4℃에서 18시간 동안 반응시켰다. 이후, 세척용액으로 5회 세척하고 Ellman's reagent을 200㎕씩 처리하여 60분간 교반하면서 반응 시킨 후, 405-420 nm에서 흡광도를 측정하였고 그 결과를 하기 표6에 나타내었다. 이 때, 상기 펩타이드를 첨가하지 않은 음성 대조군의 PGE2 생성량에 대한 상대적인 값(%)으로 나타내었다.

구분	펩타이드 농도 (mg/L)
	0	0.1	1	10	50
PGE2 생성율 (%)	100	99	96	73	48

상기 표 6을 참고하면, LPS 자극에 의해 생성되는 PGE2는 상기 펩타이드에 의해 그 생성량이 억제되는 것을 알 수 있고, 이러한 억제 효과는 상기 펩타이드에 대해 농도 의존적으로 향상되어 50mg/L인 경우에 48%로 가장 우수한 억제 활성을 나타내는 것을 알 수 있다.

상기 결과는 상기 실시예의 펩타이드가 프로스타글란딘에 의한 염증 반응을 효과적으로 억제하여 우수한 탈모 개선 효과를 나타낼 수 있음을 시사한다.

실험예 5 : 활성산소 분해 효과

자유라디칼인 DPPH(1, 1-diphenyl -2-picryl hydrazyl)를 이용한 자유라디칼 소거활성 측정방법을 이용하여 활성산소 분해 효과를 확인하였다.

시험관에 4mL 메탄올을 넣고 상기 펩타이드를 농도별로 첨가하였다. 0.15mM DPPH 용액 1mL를 첨가하여 실온에서 30분간 반응시킨 후 520 nm에서 흡광도를 측정하였다.

기질과 DPPH가 없는 Initial(Ai)과 blank(Ab)를 측정하였으며, 양성대조군으로 α-tocopherol 및 BHT를 사용하였다. 결과는 하기 표 7에 나타내었다.

구분	0 mg/L	1 mg/L	10 mg/L	50 mg/L
실시예 1	0	44.3	66.1	83.1
실시예 2	0	45.5	64.2	79.7
α-tocopherol	0	43.9	62.3	77.8
BHT	0	39.8	54.9	68.7

[DPPH 소거율%]

상기 실시예의 펩타이드는 당업계에 널리 알려진 α-tocopherol 및 BHT보다 자유라디칼 소거활성이 높은 것으로 평가되었다. 상기 결과는 상기 펩타이드가 활성산소의 분해를 효과적으로 촉진할 수 있으며, 항산화 활성에 의한 피부 노화 방지 및 피부 상태 개선 효과가 우수함을 시사한다.

실험예 6 : 세포 내의 활성산소종 측정시험(DCF-DA assay)

펩타이드를 처리한 후 실리카(silica)로 자극한 세포 내에서 생성되는 활성산소종의 양을 음성대조군과 비교하여 활성산소종(reactive oxygen species; ROS) 제거능을 평가하였다(Cho et al., 1999; Kim et al., 2002).

Raw 264.7 세포를 1×10⁴ cells/well 농도로 96 웰 플레이트에 접종하여 배양하였다. 배지를 새로운 배지로 교환한 후 일정농도의 펩타이드를 처리하여 24시간 동안 세포를 배양하였다.

각 well에 WST-1용액(EZ-CYTOX, DOGEN, Korea)을 10.0 μL씩 넣고 1시간 동안 세포를 배양한 후 ELISA reader(Bio-Rad)로 measurement wavelength 450 nm, reference wavelength 655 nm에서 흡광도를 측정하였다.

펩타이드는 최종농도 기준으로 최대 20μM이 되도록 dimethylsulfoxide(DMSO, Sigma-Aldrich, USA)로 희석하였으며 DMSO를 공시험액(음성대조군)으로 사용하였다. 신뢰도를 확보하고자 실험을 3회 반복하였다.

상기 실험은 세포활성 측정시험인 WST-1 assay와 동일한 세포주 및 동일한 세포배양조건 하에서 실시되었다. 배양한 Raw 264.7 세포를 Phosphate Buffered Saline(PBS; sodium chloride 137 mM, phosphate buffer 10 mM, potassium chloride 2.7 mM, all from Biopure, Canada) 용액으로 1회 세척한 후 Raw 264.7 세포를 수확하였다. 15 mL PBS 용액으로 현탁하였으며 20 mM 2', 7'-Dichlorofluorescein diacetate 15 μL를 첨가하고 1시간 동안 배양하였다.

1200 rpm으로 2분간 원심분리한 후 PBS 용액으로 1회 세척하여 1×10⁵ cells/mL로 희석한 후, 대조물질 및 펩타이드를 처리하고 10분간 배양하였다. 20 mg/mL의 실리카를 50 μL 처리하여 1시간 동안 배양하였다. 6000 rpm으로 5분간 원심분리하여 수득한 세포 펠릿(pellet)을 200 μL PBS 용액으로 분산시킨 후 96 웰 플레이트에 접종하였다.

fluorescence microplate reader를 이용하여 485 nm excitation / 535 nm emission에서 형광도를 측청하여 활성산소종 양을 평가하였다.

검액 농도에 대한 활성산소종 측정시험에 처리한 펩타이드는 세포활성 측정을 통해 설정한 검액 농도로 사용하였다.

음성대조군으로는 시료물질 대신 DMSO를 사용하였으며, 양성대조군으로는 아스코르빈산(Sigma-Aldrich)을 DMSO에 100 mg/mL로 희석하여 100 μg/mL의 농도로 사용하였다.

상기 결과를 기반으로 동일 농도에 대한 활성산소종 측정시험을 수행하였으며, 처리한 펩타이드는 펩타이드는 50 mg/L의 농도로 사용하였다. 신뢰도를 확보하고자 실험을 4회 반복하였다. 측정 결과는 하기 표 8과 같다.

구분	측정값
실시예 1	76.2
실시예 2	74.5
아스코르빈산	73.9

[ROS 생성억제율(% of control)]

상기 실시예의 펩타이드는 당업계에 널리 알려진 아스코르빈산 보다 자유라디칼 소거활성이 동등한 수준으로 평가되었다.

즉, 상기 결과는 상기 펩타이드가 활성산소종 제거능이 우수하며, 자유라디칼 소거활성으로 인한 항산화 효과가 뛰어남을 시사한다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.

본 발명의 범위는 후술하는 청구범위에 의해 나타내어지며, 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> AHN, INSOOK <120> PEPTIDE EXHIBITING EFFICACIES OF IMPROVEMENT IN SKIN CONDITION AND HAIR GROWTH, AND USES THEREOF <130> 16PP11163 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SEQ ID:NO 1 <400> 1 His Gly Ser Pro Trp Gly 1 5 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SEQ ID:NO 2 <400> 2 His Gly Lys Leu Asn Gly Ile Lys Trp 1 5

Claims (7)

1. 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 피부 상태 개선용 펩타이드.
2. 제1항에 있어서,
   섬유아세포, 각질세포, 또는 모낭세포의 성장을 촉진하는 펩타이드.
3. 제1항에 있어서,
   탈모 개선 또는 모발 성장 촉진용인 펩타이드.
4. 제1항에 있어서,
   항산화 활성을 가지는 펩타이드.
5. 서열번호 1 또는 서열번호 2 의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 탈모 개선 또는 모발 성장 촉진용 조성물.
6. 서열번호 1 또는 서열번호 2 의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 피부 외용제 조성물.
7. 제6항에 있어서,
   항산화, 주름 개선, 피부탄력 개선, 피부노화 방지, 또는 피부재생용인 조성물.