KR20180015145A - 핵산-양이온성 중합체 조성물 및 그의 제조 및 사용 방법 - Google Patents

Abstract

본원에서 핵산, 양이온성 중합체 및 탄수화물을 함유하는 예비-동결건조 조성물이 제공된다. 또한, 상기한 것의 동결건조 조성물 및 재건 조성물뿐만 아니라 환자에서의 종양 치료를 위한 이들의 제조 방법이 제공된다.

Description

핵산-양이온성 중합체 조성물 및 그의 제조 및 사용 방법

본 발명은 일반적으로 종양 세포 생물학, 유전자 치료요법 및 암 치료 분야에 관한 것이다. 더 구체적으로, 본 발명은 동결건조될 수 있는 핵산 및 양이온성 중합체의 대상 조성물 및 그의 사용 및 제조 방법에 관한 것이다.

환자 세포로의 치료 전달에 의한 질환 치료를 위한 약물로서의 DNA 플라스미드의 사용은, 현재로서는 치료불가한 것으로 간주되는 광대한 범위의 병리학에 대한 신규 약물 제제의 개발에서 곧 있을 기술들 중 하나이다.

신체의 체내 뉴클레아제 분해를 극복함으로써 세포 내부에서 기능성 DNA 플라스미드의 유효한 전달을 달성하기 위해서는, 핵산 분자가 "벡터" 내에 포장되어야 한다.

유전자 치료요법에 대한 초기 대부분의 연구개발은 바이러스-매개형 벡터의 개발에 집중되었으나, 비-바이러스 형질주입체들이 잠재적으로 안전하며 유효한 유전자 치료요법 전달 방법으로서 개발되었다.

바이러스 벡터에 비해, 그러한 비-바이러스 전달 시스템은 낮은 독성 및 면역원성, 뉴클레아제에 대한 내성 및 개선된 안전성 프로파일을 포함한 여러 장점을 입증했다.

그러한 비-바이러스 전달 시스템의 비제한적 예시는, 창조되어 형질주입 공정 동안 DNA를 분해로부터 보호할 수 있는 리포플렉스 및/또는 폴리플렉스와 같은 신규 분자들을 포함한다.

리포플렉스 형성을 위해서는, 플라스미드 DNA를 조직화된 구조(예를 들어, 미셀 또는 리포좀)를 가진 양이온성 지질로 피복한다. 음으로 하전된 DNA 및 양으로 하전된 지질이 있는 그러한 양이온성 지질 복합체는 또한 세포막과 상호작용하여, 리포플렉스의 세포내 섭취를 허용하게 된다. 후속하여 리포플렉스 내 DNA는 세포질로 방출된다.

폴리플렉스는 DNA의 중합체와의 복합체이다. 일반적으로, 폴리플렉스는 양이온성 중합체를 이용하여, 이것이 다중음이온성 DNA와 상호작용하여 복합체를 형성한다.

개발된 광범위한 비-바이러스 벡터들 중에서도, 양이온성 중합체 선형 폴리에틸렌아민(PEI)(미국 특허 6,013,240, 본원에 전문이 참고문헌으로 포함됨)은 플라스미드 전달에서 여러 장점을 나타낸 바 있으며(문헌[Pathak et al., Biotechnol. J. 4:1559-1572 (2009)]; [Kasper et al., Journal of Controlled Release 151:246-255 (2011)] 참조), 임상 연구에서 이용된 바 있다(문헌[Gofrit et al., The Journal of Urology 191(6):1697-1702 (2014)]; [Abraham et al., The Journal of Urology 180(6):2379-2383 (2008)] 참조). 따라서, PEI는 비-바이러스 벡터의 "최적 표준"으로 간주된다(문헌[Pathak et al., Biotechnol. J. 4:1559-1572 (2009)]; [Kasper et al. Journal of Controlled Release 151:246-255(2011)] 참조).

선형 폴리에틸렌이민(LPEI) 및 DNA 플라스미드 기재의 폴리플렉스는 광범위한 형질이식체들 중에서도 형질주입 효율과 관련하여 그들의 유리한 품질로 공지되어 있다. 그러나, 수용액에서의 그러한 복합체들의 안정성은 제한적이고, 투여 전 새롭게 제조된 복합체가 필요하다는 점은 특히 고 DNA 농도 용액에서 집합별 변동 (batch-to-batch variations) 위험을 증가시킨다. 그러한 조건 하에, 상기 복합체들의 재현성 및 제어되는 품질은 약제학적 제품에서 필수적인 범위의 보장이 불가하다.

미국 특허 6,013,240 PCT/IL1998/000486(WO 1999/018195) PCT/IL2008/001405(WO 2009/053982) PCT/IL2006/001110(WO 2007/034487) PCT/IL2006/000785(US 8,067,573) PCT/IL2008/000071(US 7,928,083)

Pathak et al., Biotechnol. J. 4:1559-1572 (2009) Kasper et al., Journal of Controlled Release 151:246-255 (2011) Gofrit et al., The Journal of Urology 191(6):1697-1702 (2014) Abraham et al., The Journal of Urology 180(6):2379-2383 (2008) Pathak et al., Biotechnol. J. 4:1559-1572 (2009) Brus et al., Journal of Controlled Release 95:119-131 (2004) Kasper et al., European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 77:182-185(2011) Julia Christina Kasper, Doctoral Thesis "Lyophilization of Nucleic Acids Nanoparticles - Formulation Development, Stabilization Mechanisms, and Process Monitoring" (2012)

따라서, 더 최신식의 공업적으로 유용한 규모로 용이하게 규모조정될 수 있는 해당 핵산-양이온성 중합체 조성물의 제조 방법이 필요하다.

개시되는 본 발명의 발명자들은 본원에서 핵산, 양이온성 중합체 및 탄수화물을 포함하는, 예비-동결건조, 동결건조 및 재건된 조성물/제형물의 독특한 제조 방법을 개발했는데, 이는 수용액 중의 안정성이 상당히 개선되어 당업계에 공지된 유사한 조성물의 탁월한 대체재를 제공한다. 본 발명의 방법뿐만 아니라 그로써 제공되는 조성물은 정확하게 제조되며, 안전하고, 공업적 규모가 가능한 치료 응용을 위한 복합체를 제공한다.

본 발명의 방법은 제형물의 임의의 구성요소의 내용물, 통합성, 안정성 및 생물학적 이용가능성에 부정적으로 영향을 주지 않고 동결건조 또는 예비-동결건조 제형물로 제형화될 수 있는 안정적이고, 정확하게 투여량 조절이 가능하며, 균질한 조성물/제형물의 공업적 제조를 가능하게 한다.

따라서, 제1 양태에서, 본 발명은 하나 이상의 핵산, 하나 이상의 양이온성 중합체, 및 하나 이상의 탄수화물을 함유하는 조성물의 제조 방법으로서, 하나 이상의 핵산 및 하나 이상의 양이온성 중합체 사이의 복합체 형성을 허용하는 조건 하에 핵산/탄수화물 용액을 양이온성 중합체/탄수화물 용액에 첨가하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.

일부 구현예에서, 핵산/탄수화물 용액 및 양이온성 중합체/탄수화물 용액은 각각 따로 독립적으로 제조될 수 있다. 각각의 용액은 언급한 바와 같이 그들의 조합에 앞서 동시에 또는 상이한 시점에 제조될 수 있다.

일부 구현예에서, 상기 방법은 각각의 두 용액을 수득하는 단계 및 하나 이상의 핵산 및 하나 이상의 양이온성 중합체 사이의 복합체 형성을 허용하는 조건 하에 핵산/탄수화물 용액을 양이온성 중합체/탄수화물 용액에 첨가하는 단계, 및 이들의 반대 순서의 것을 포함하여, 본 발명의 조성물을 수득할 수 있다.

일부 구현예에서, 상기 방법은

(a) 하나 이상의 핵산 및 하나 이상의 탄수화물의 용액을 수득하는 단계;

(b) 하나 이상의 양이온성 중합체 및 하나 이상의 탄수화물의 용액을 수득하는 단계;

(c) 하나 이상의 핵산 및 하나 이상의 양이온성 중합체 사이의 복합체 형성을 허용하는 조건 하에 핵산/탄수화물 용액을 양이온성 중합체/탄수화물 용액에 첨가하는 단계; 및

(d) 선택적으로, 조합된 핵산/양이온성 중합체/탄수화물 용액을 동결건조하여 동결건조된 조성물을 형성하는 단계

를 포함한다.

일부 구현예에서, 상기 방법은 핵산/탄수화물 용액의 제조 단계, 및 양이온성 중합체/탄수화물 용액 제조의 별도 단계를 포함한다.

일부 구현예에서, 상기 방법은

(a) 일정 분량의 하나 이상의 핵산을 제1 분량의 하나 이상의 탄수화물과 혼합하여 핵산/탄수화물 용액을 형성하는 단계; 및

(b) 일정 분량의 하나 이상의 양이온성 중합체를 제2 분량의 하나 이상의 탄수화물과 혼합하여 양이온성 중합체/탄수화물 용액을 형성하는 단계

를 포함한다.

상기 언급한 바와 같이, 하나 이상의 탄수화물이 본 발명의 방법에서 별도의 회분 또는 분량으로 사용된다. 제1 회분 또는 분량, 또는 제1 분량이 하나 이상의 핵산과 혼합되며, 제2 회분 또는 분량, 또는 제2 분량이 하나 이상의 양이온성 중합체와 혼합된다. 복합체 형성을 허용하고, 선택적으로는 고체인 안정적인 제품을 제공하기에 충분한 하나 이상의 탄수화물의 최소량이 되도록 제1 또는 제2 분량이 결정되어 선택된다.

본원에 사용된 바와 같이, 본 발명의 조성물 또는 제형물은 조성물의 안정성 및 독특성이 부여되도록 하나 이상의 핵산 및 하나 이상의 양이온성 중합체 사이의 복합체를 포함한다. 용어 "복합체", "폴리플렉스", "폴리플렉스 제형물", "대상 폴리플렉스 조성물", "대상 조성물" 등은 본원에서 본 발명의 조성물/제형물을 그의 임의의 특별한 구성요소가 아닌 통째로 지칭하도록 호환하여 사용된다.

본원에 예시된 바와 같이, 단계 (a) 및 (b)의 각 용액들은 서로 독립적으로 제조될 수 있으며, 사용 전에 저장될 수 있다. 각각의 용액들은 상기 언급된 순서대로 또는 임의의 기타 다른 순서대로 제조될 수 있으며, 단 이들은 단계 (c)에 제시된 바와 같이 서로에게 첨가되어야 하며, 즉 핵산/탄수화물 용액을 양이온성 중합체/탄수화물 용액에 첨가하거나 또는 역순으로 첨가한다. 한 용액의 다른 용액에 대한 특별히 정해진 순서로의 첨가는 하나 이상의 핵산 및 하나 이상의 양이온성 중합체 사이의 독특하고 안정적인 복합체의 용이한 형성을 허용하겠지만; 용액을 역순으로 첨가시 대량으로는 형성될 수 없는 복합체를 제공한다.

조성물 구성요소들 중 하나를 다른 하나에 첨가하거나 또는 그를 역순으로 하는 것은 언급한 바와 같이 탄수화물 재료의 양을 줄이고, 후속하여 조성물에서 하나 이상의 핵산의 상대적인 양을 늘려준다. 달리 말하면, 조성물 중의 하나 이상의 핵산의 양을 유지하면서 하나 이상의 탄수화물의 양을 줄이는 것을 가능하게 함으로써, 하나 이상의 탄수화물 대 하나 이상의 핵산 사이의 비율을 몇 배나 줄일 수 있다.

하나 이상의 핵산 및 하나 이상의 양이온성 중합체 사이의 복합체는 물질 나노입자로 형성되는데, 여기서 각 나노입자는 크기가 몇 나노미터가 되며(나노입자 형태가 구형이면 직경이 나노미터, 또는 나노입자 형태가 구형이 아니라면 나노미터 축을 가짐), 각각은 하나 이상의 핵산, 하나 이상의 양이온성 중합체 및 선택적으로는 소량의 하나 이상의 탄수화물을 함유하게 된다. 예비-동결건조된 조성물 중에 형성되고, 동결건조된 조성물 중에도 존재하며, 나아가 재건된 제형물 중에도 존재하는 나노입자가 예비-동결건조 조성물에서는 크기가 약 40 nm 내지 약 50 nm이며, 재건된 조성물에서는 나노 입자 크기가 약 80 nm 내지 약 90 nm의 범위이다. 하기에 상세하게 설명되는 바와 같이, 더 큰 나노입자는 더 높은 농도가 이용될 때 수득된다.

핵산/탄수화물 용액의 양이온성 중합체/탄수화물 용액으로의 첨가는 실온에서, 또는 특히 사용되는 특성 구성요소, 조성물의 부피 및 기타 다른 파라미터에 따라 임의의 원하는 온도에서 실시될 수 있다. 일부 구현예에서, 첨가는 일정한 속도로 그리고 조합된 핵산/양이온성 중합체 용액 형성을 위한 일정한 혼합 하에 한다. 일부 구현예에서, 상기 속도는 제조될 각 부피에 대해 조정되며, 적합한 일정한 속도의 결정은 당업자에게 일상적인 수준 내에 있다.

일부 구현예에서, 첨가는, 상기 기재한 바와 같이, 소규모 제조에 대해서는 2 ml/분 내지 7 ml/분의 속도로, 또는 1 리터 제조에 대해서는 80 ml/분이 될 수 있거나, 또는 제조되는 조성물/제형물 또는 제제의 부피에 따라서는 가변(증가 또는 감소)적일 수 있다. 더 큰 속도가 또한 채용될 수도 있다.

예를 들어, 100 ml의 핵산, 예를 들어 플라스미드를 초기 농도 4 mg/ml로 포함하는 1 리터의 폴리플렉스는 1리터 용액에 총 0.4 g로 사용된다. 1 리터 용액은 100 g의 탄수화물, 예를 들어 트레할로오스를 함유한다. 따라서, 이러한 예시에서, 1 리터 용액 중의 트레할로오스 중량 대 1 리터 용액 중의 DNA의 중량의 비율은 100/0.4 또는 250이다.

또 다른 예시에서, 핵산의 양은 약 2.5 ml 내지 약 100 ml이며, 10% w/v 트레할로오스 용액의 제1 유효량은 약 10 ml 내지 약 400 ml이다. 추가로(또는 대안적으로), 양이온성 중합체의 양은 약 1.2 ml 내지 약 48 ml이고, 10% w/v 트레할로오스 용액의 제2 유효량은 약 11.3 ml 내지 약 452 ml이다.

이해할 수 있듯, 본 발명의 조성물 또는 용액이 다양한 부피로, 예를 들어 약 25 ml 내지 약 1,000 ml; 예를 들어 25 ml, 50 ml, 75 ml, 100 ml, 125 ml, 150 ml, 175 ml, 200 ml, 225 ml, 250 ml, 275 ml, 300 ml, 325 ml, 350 ml, 375 ml, 400 ml, 425 ml, 450 ml, 475 ml, 500 ml, 525 ml, 550 ml, 575 ml, 600 ml, 625 ml, 650 ml, 675 ml, 700 ml, 725 ml, 750 ml, 775 ml, 800 ml, 825 ml, 850 ml, 875 ml, 900 ml, 925 ml, 950 ml, 975 ml, 또는 1,000 ml로 제조될 수 있다. 더 큰 부피 또는 더 적은 부피 또는 중간값 부피로도 제조될 수 있다.

당업자는 본원에 기재된 방법이 1,000 ml보다 훨씬 더 큰 값, 예를 들어 1,000 ml, 1,500 ml, 2,000 ml, 2,500 ml, 3,000 ml, 3,500 ml, 4,000 ml, 4,500 ml, 5,000 ml, 5,500 ml, 6,000 ml, 6,500 ml, 7,000 ml, 7,500 ml, 8,000 ml, 8,500 ml, 9,000 ml, 9,500 ml, 10,000 ml 또는 그 이상으로 조합된 핵산/양이온성 중합체 용액의 부피를 형성하도록 쉽게 개변될 수 있음을 알 것이다.

당업계의 수많은 조성물들과는 달리, 핵산/양이온성 중합체 용액을 함유하여 본 발명에 따라 제조되는 조성물은 균질 현탁액을 형성한다. 본원에 사용된 바와 같이, 본 발명의 "조성물", "제형물", "제제"는 예를 들어 용액, 현탁액 또는 분산액과 같은 액체 형태로, 또는 선택적으로는 동결건조된 고체 형태로 존재할 수 있다. 일부 구현예에서, 조성물이 액체 조성물인 경우, 이는 물 현탁액의 형태로 존재한다. 일부 구현예에서, 액체 조성물은 일반적으로 완전히 또는 부분적으로 가용성인 조성물 구성요소 중 임의의 하나를 일정량 가진 현탁액의 형태로 존재할 수 있다. 일부 구현예에서, 조성물이 고체 형태인 경우, 이는 대상 동결건조 조성물이다.

본 발명의 방법은 선택적으로는 동결건조된 조성물을 수득하기 위해 본 발명의 조성물을 동결건조하는 단계를 포함한다. 동결건조된 조성물은 사용 직전에 재건될 수 있다.

따라서, 본 발명에 따른 방법에는 동결건조 단계가 없을 수 있는데, 그러한 경우 수득되는 조성물 또는 제형물이 예비-동결건조 조성물 또는 제형물이다. 동결건조 단계가 필요하거나 또는 요망되는 경우, 조성물은 습윤 조성물의 동결건조를 위해 당업계에 공지된 조건 하에 처리될 수 있다.

일부 구현예에서, 본 발명의 방법은 0℃ 미만의 온도에서의 용액 냉동을 포함하는 동결건조 순환을 포함한다. 일부 구현예에서, 온도는 -50℃ 내지 0℃, -45℃ 내지 0℃, -40℃ 내지 0℃, -35℃ 내지 0℃이다. 일부 구현예에서, 동결건조는 약 -45±5℃의 온도에서 달성된다.

일부 구현예에서, 본 발명의 방법은 12 시간 이상, 20 시간 이상, 24 시간 이상, 30 시간 이상, 36 시간 이상, 48 시간 이상, 52 시간 이상, 60 시간 이상, 66 시간 이상, 72 시간 이상의 기간 동안의 용액 냉동을 포함하는 동결건조 순환을 포함한다.

일부 구현예에서, 용액은 24 시간 내지 72 시간 이상 동결건조된다.

일부 구현예에서, 본 발명의 방법은 약 -45±5℃의 온도에서 12 시간 이상, 20 시간 이상, 24 시간 이상, 30 시간 이상, 36 시간 이상, 48 시간 이상, 52 시간 이상, 60 시간 이상, 66 시간 이상, 72 시간 이상 용액의 냉동을 포함하는 동결건조 순환을 포함한다.

대상 동결건조 조성물은 대상 재건 조성물 제공을 위한 당업계에 공지된 임의의 방법(들)을 이용해 재건될 수 있다. 예를 들어, 적절한 부피의 이차증류수 DDW 또는 IV 주사용수를 첨가해 재건될 수 있다. 일반적으로, 대상 동결건조 조성물에 첨가되는 부피는 동결건조 전 최초에 첨가되는 부피이다.

본원에 기재된 본 발명에 따라 제조되는 대상 예비-동결건조 조성물을 위한 나노입자는 약 40 nm 내지 약 50 nm의 범위이며, 대상 재건된 조성물의 나노입자는 약 80 nm 내지 약 90 nm의 범위이다.

핵산 및 양이온성 중합체 사이에 형성된 복합체는 복합체 내 탄수화물 대 핵산-양이온성 중합체의 w/w 비율이 특히 조성물 형성에 이용된 특정 탄수화물 및 핵산에 좌우되어 변경될 수 있다. 일부 구현예에서, 그 비율이 50 내지 5,000이다.

일부 구현예에서, 그 비율이 50 내지 4,000이다. 일부 구현예에서, 그 비율이 50 내지 3,000이다. 일부 구현예에서, 그 비율이 50 내지 2,000이다. 일부 구현예에서, 그 비율이 50 내지 1,000이다. 일부 구현예에서, 그 비율이 50 내지 500이다.

일부 구현예에서, 그 비율이 약 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295, 300, 305, 310, 315, 320, 325, 330, 335, 340, 345, 350, 355, 360, 365, 370, 375, 380, 385, 390, 395, 400, 405, 410, 415, 420, 425, 430, 435, 440, 445, 450, 455, 460, 465, 470, 475, 480, 485, 490, 495, 또는 500이다.

일부 구현예에서, 그 비율이 약 950, 955, 960, 965, 970, 975, 980, 985, 990, 995, 1,000, 1,005, 1,010, 1,015, 1,020, 1,025, 1,030, 1,035, 1,040, 1,045, 1,050, 1,055, 1,060, 1,065, 1,070, 1,075, 1,080, 1,085, 1,090, 1,095, 2,000, 2,005, 2,010, 2,015, 2,020, 2,025, 2,030, 2,035, 2,040, 2,045, 2,050, 2,055, 2,060, 2,065, 2,070, 2,075, 2,080, 2,085, 2,090, 2,095, 3,000, 3,005, 3,010, 3,015, 3,020, 3,025, 3,030, 3,035, 3,040, 3,045, 3,050, 3,055, 3,060, 3,065, 3,070, 3,075, 3,080, 3,085, 3,090, 3,095, 4,000, 4,005, 4,010, 4,015, 4,020, 4,025, 4,030, 4,035, 4,040, 4,045, 4,050, 4,055, 4,060, 4,065, 4,070, 4,075, 4,080, 4,085, 4,090, 4,095, 또는 5,000이다.

일부 구현예에서, 그 비율이 약 125 또는 250 또는 500 또는 1,000이다.

일부 구현예에서, 그 비율이 1,000 미만이다. 일부 구현예에서, 그 비율이 125 또는 500이다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 방법으로 제공되는 제품을 제공한다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 하나 이상의 핵산, 하나 이상의 양이온성 중합체 및 하나 이상의 탄수화물을 함유하는 대상 동결건조 조성물을 제공하는데, 여기서 하나 이상의 탄수화물 대 핵산-양이온성 중합체의 w/w 비율이 50 내지 5,000이 되도록 하나 이상의 핵산 및 하나 이상의 양이온성 중합체가 복합체를 형성한다.

본 발명의 방법으로 제조된 것 및 기타 다른 방법으로 제조된 것이며, 자체로 신규한 본 발명의 제품은 하나 이상의 핵산, 하나 이상의 양이온성 중합체 및 하나 이상의 탄수화물을 함유하는 예비-동결건조, 동결건조 및 재건 조성물 또는 용액일 수 있는데, 여기서 하나 이상의 탄수화물 대 핵산-양이온성 중합체의 w/w 중량비가 50 내지 5,000이 되도록 하나 이상의 핵산 및 하나 이상의 양이온성 중합체가 복합체를 형성한다.

용어 "예비-동결건조 조성물" 등은 본원에 기재된 방법에 따라 제조된 중간체를 지칭한다. 구체적으로, 대상 예비-동결건조 조성물은 핵산이 중합체에 첨가되는 "역방향" 순서로 제조된다. 그러한 "대상 예비-동결건조 조성물"은 핵산(예를 들어, DNA), 중합체(예를 들어, PEI), 및 탄수화물 용액(예를 들어, 트레할로오스)을 포함한다.

용어 "동결건조 조성물" 등은 건조 재료(즉, 동결건조 후 대상 예비-동결건조 조성물)를 지칭한다.

용어 "대상 재건 조성물" 등은 대상 동결건조 조성물 및 재건에 사용되는 액체 담체(예를 들어, DDW 또는 IV 주사용수)를 지칭한다. 일반적으로, 대상 재건 조성물은 환자에 대한 투여 전에 의학 실무자, 예를 들어 내과의에 의해 재건된다.

일부 구현예에서, 조성물은 액체 매질, 예를 들어 물을 함유하는 예비-동결건조 조성물 또는 용액이다. 일부 구현예에서, 동결건조된 조성물은 무수성의 건 조성물이다.

본원에 기재된 대상 동결건조 조성물은 무정형 분말이다. 대상 예비-동결건조 및 재건(즉, 주사용수로 재건 후) 조성물은 색상이 약간 백색의 유백색이다(즉, 분해의 징조를 나타내지 않음).

나아가, 대상 예비-동결건조 조성물은 대상 동결건조 조성물 제조를 위해 당업계에 공지되거나 또는 본원에 기재된 임의의 동결건조 방법을 이용해 장기간 저장을 위해 동결건조될 수 있다. 동결건조 후, 대상 동결건조 조성물의 선반 수명이 12개월 이상(예를 들어, 적어도 12 개월, 13 개월, 14 개월, 15 개월, 16 개월, 17 개월, 18 개월, 19 개월, 20 개월, 21 개월, 22 개월, 23 개월, 24 개월, 또는 그 이상)이다.

대상 동결건조 조성물은 대상 재건 조성물을 제공하기 위해 당업계에 공지된 임의의 방법 또는 본원에 기재된 임의의 방법을 이용해 사용 전에 재건될 수 있다. 재건 후, 재건된 조성물은 색상이 약간 백색인 유백색이다(즉, 분해의 징조를 나타내지 않음).

본 발명의 조성물 또는 제형물로 제형화될 수 있는 하나 이상의 핵산은, DNA 또는 RNA를 포함하는 임의의 핵산 포함 분자이다. 용어 "핵산"은 또한 DNA 및 RNA의 임의의 공지된 염기 유사체들, 예를 들어 4-아세틸시토신, 8-히드록시-N6-메틸아데노신, 아지리디닐시토신, 슈도이소시토신, 5-(카르복시히드록실-메틸)우라실, 5-플루오로우라실, 5-브로모우라실, 5-카르복시메틸아미노메틸-2-티오우라실, 5-카르복시메틸아미노메틸우라실, 디히드로우라실, 이노신, N6-이소펜테닐아데닌, 1-메틸아데닌, 1-메틸슈도우라실, 1-메틸구아닌, 1-메틸이노신, 2,2-디메틸구아닌, 2-메틸아데닌, 2-메틸구아닌, 3-메틸시토신, 5-메틸시토신, N6-메틸아데닌, 7-메틸구아닌, 5-메틸아미노메틸우라실, 5-메톡시-아미노메틸-2-티오우라실, 5'-메톡시카르보닐메틸우라실, 5-메톡시우라실, 2-메틸티오-N6-이소펜테닐아데닌, 우라실-5-옥시아세트산 메틸에스테르, 우라실-5-옥시아세트산, 옥시부톡소신, 슈도우라실, 큐어신(queosine), 2-티오시토신, 5-메틸-2-티오우라실, 2-티오우라실, 4-티오우라실, 5-메틸우라실, 우라실-5-옥시아세트산 및 2,6-디아미노퓨린을 포함하는 서열을 포함한다.

일부 구현예에서, 핵산은 플라스미드, 즉 세포독성 유전자 산물을 인코딩하는 이종성 서열에 작동적으로 연결되어 있는 조절 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드인데, 여기서 상기 조절 서열은 암 세포에서 특이적으로 발현되는 유전체 각인 유전자 유래이다.

일부 구현예에서, 본원에 사용된 용어 "플라스미드"는 정의된 임의의 핵산(즉, DNA, shRNA, siRNA, 올리고뉴클레오티드 등)을 가리키는 것을 의미한다.

일부 구현예에서, 하나 이상의 핵산은 본원에 참고문헌으로 포함되는 PCT/IL1998/000486(WO 1999/018195), 또는 그로부터 파생된 임의의 US 출원들에서 언급되는 플라스미드이다.

일부 구현예에서, 하나 이상의 핵산은 본원에 참고문헌으로 포함되는 PCT/IL2008/001405(WO 2009/053982), 또는 그로부터 파생된 임의의 US 출원들에서 언급되는 플라스미드이다.

일부 구현예에서, 하나 이상의 핵산은 본원에 참고문헌으로 포함되는 PCT/IL2006/001110(WO 2007/034487), 또는 그로부터 파생된 임의의 US 출원들에서 언급되는 플라스미드이다.

일부 구현예에서, 하나 이상의 핵산은 본원에 참고문헌으로 포함되는 PCT/IL2006/000785(US 8,067,573), 또는 그로부터 파생된 임의의 US 출원들에서 언급되는 플라스미드이다.

일부 구현예에서, 하나 이상의 핵산은 본원에 참고문헌으로 포함되는 PCT/IL2008/000071(US 7,928,083), 또는 그로부터 파생된 임의의 US 출원들에서 언급되는 플라스미드이다.

일부 구현예에서, 플라스미드 중의 조절 서열은 H19 조절 서열(예를 들어, H19 프로모터, H19 인핸서, 또는 H19 프로모터 및 H19 인핸서의 두 가지 모두)일 수 있다. 예를 들어, H19 조절 서열은 H19 프로모터 및 인핸서를 포함할 수 있고, 이종성 서열은 β-갈락토시다아제, 디프테리아 독소, 슈도모나스 독소, 리신, 콜레라 독소, 망막아세포종 유전자, p53, 단순포진 티미딘 키나아제, 대상포진 티미딘 키나아제, 시토신 디아미나아제, 니트로리덕타아제, 시토크롬 p-450 2B1, 티미딘 포스포릴라아제, 퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라아제, 알칼리성 포스파타아제, 카르복시펩티다아제 A 및 G2, 리나마라아제, β-락타마아제 및 잔틴 옥시다아제로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질을 인코드한다.

다른 구현예에서, 조절 서열은 IGF-2 P4 프로모터 또는 IGF-2 P3 프로모터이다.

본원에 기재된 방법에 사용하기에 적합한 플라스미드는, 세포독성 유전자 산물을 인코드하는 이종성 서열에 작동적으로 연결된 조절 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있으며, 여기서 조절 서열은 암 세포에서 특이적으로 발현되는 유전체 각인 유전자 유래이다.

조절 서열은 H19 조절 서열(예를 들어, H19 프로모터, H19 인핸서, 또는 H19 프로모터 및 H19 인핸서의 두 가지 모두), IGF-2 P4 프로모터, 또는 IGF-2 P3 프로모터일 수 있다. 예를 들어, H19 조절 서열은 H19 프로모터 및 인핸서일 수 있고, 이종성 서열은 β-갈락토시다아제, 디프테리아 독소, 슈도모나스 독소, 리신, 콜레라 독소, 망막아세포종 유전자, p53, 단순포진 티미딘 키나아제, 대상포진 티미딘 키나아제, 시토신 디아미나아제, 니트로리덕타아제, 시토크롬 p-450 2B1, 티미딘 포스포릴라아제, 퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라아제, 알칼리성 포스파타아제, 카르복시펩티다아제 A 및 G2, 리나마라아제, β-락타마아제, 및 잔틴 옥시다아제로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질을 인코드한다. H19 인핸서는 이종성 서열에 대해 3'에 위치할 수 있다.

당업자는 이종성 서열이 하기 중 임의의 하나 이상의 것으로부터 선택될 수 있다는 것을 인지할 것이다: β-갈락토시다아제; 디프테리아 독소; 슈도모나스 독소; 리신; 콜레라 독소; 망막아세포종 유전자; p53; 단순포진 티미딘 키나아제; 대상포진 티미딘 키나아제; 시토신 디아미나아제; 니트로리덕타아제; 시토크롬 p-450 2B1; 티미딘 포스포릴라아제; 퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라아제; 알칼리성 포스파타아제; 카르복시펩티다아제 A 및 G2; 리나마라아제; β-락타마아제; 잔틴 옥시다아제에 대한 코딩 서열; 및 cdk2, cdk8, cdk21, cdc25A, 싸이클린 D1, 싸이클린 E, 싸이클린 A, cdk4, 발암유전자 형태의 p53, c-fos, c-jun, Kr-ras 및 Her2/neu로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자를 인코드하는 서열에 특이적으로 혼성화하는 안티센스 서열. 이종성 서열은 또한 cdk2, cdk8, cdk21, cdc25A, 싸이클린 D1, 싸이클린 E, 싸이클린 A, cdk4, 발암유전자 형태의 p53, c-fos, c-jun, Kr-ras 및 Her2/neu로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자를 인코드하는 RNA를 특이적으로 절단하는 리보자임을 인코드할 수 있다.

본원에 기재된 대상 예비-동결건조 및 재건 조성물 핵산의 농도는 0.1 mg/mL 내지 0.8 mg/mL(예를 들어, 0.1 mg/mL, 0.2 mg/mL, 0.3 mg/mL, 0.4 mg/mL, 0.5 mg/mL, 0.6 mg/mL, 0.7 mg/mL, 또는 0.8 mg/mL), 또는 그 미만일 수 있다. 그러한 핵산 농도는 선행 기술 조성물에서의 핵산 로오드(즉, 약 0.01 mg/mL 내지 0.05 mg/mL)보다 약 8 배 내지 40 배 더 크다. 본원에 기재된 대상 예비-동결건조 및 재건 조성물에서, 핵산 및 PEI가 모두 트레할로오스 용액에 희석되어 있다.

본 발명의 방법 및 제형물에 이용되는 하나 이상의 탄수화물은 당업계에 공지된 임의의 탄수화물 물질이다. 본원에 사용된 바와 같이, " 탄수화물 "은 일반 화학식 (CH₂O)_n을 가진 임의의 화합물을 포함하는 것을 의미하며, 탄수화물 화학 분야에 널리 공지된 용어 "단당류", "다당류", "올리고당" 및 "당류"로 호환되어 이용될 수 있다.

탄수화물은 단당류, 이당류, 삼당류 및 올리고당류뿐만 아니라 다당류, 예를 들어 글리코겐, 셀룰로오스 및 전분 중 임의의 것일 수 있다.

일부 구현예에서, 하나 이상의 탄수화물은 단당류, 예를 들어 글루코오스, 프룩토오스, 만노오스, 자일로오스, 아라비노오스, 갈락토오스 등으로부터; 이당류, 예를 들어 트레할로오스, 수크로오스, 셀로비오스, 말토오스, 락토오스 등으로부터; 올리고당류, 예를 들어 라피노오스, 스타키오스, 말토덱스트린 등; 다당류, 예를 들어 셀룰로오스, 헤미셀룰로오스, 전분 등으로부터 선택된다.

일부 구현예에서, 하나 이상의 탄수화물은 트레할로오스, 글루코오스, 수크로오스, 락토오스, 만니톨, 소르비톨, 라피노오스, PVP 및 덱스트로오스로부터 선택된다.

일부 구현예에서, 하나 이상의 탄수화물은 글루코오스 또는 수크로오스가 아니다.

일부 구현예에서, 하나 이상의 탄수화물은 단당류 또는 이당류이다.

일부 구현예에서, 하나 이상의 탄수화물은 트레할로오스이다.

용어 " 양이온성 중합체 "는 임의의 천연, 합성 또는 반-합성 중합체이며, 양이온성기 및/또는 양이온성기로 이온화될 수 있는 기를 포함한다. 양이온성 중합체는 친수성 또는 양친매성일 수 있다. 일부 구현예에서, 양이온성 중합체는 1차, 2차, 3차 및/또는 4차 아민기를 포함하는 중합체들로부터 선택된다. 아민기는 주된 중합체 사슬 중 일부일 수 있거나, 또는 사슬 상의 펜던트일 수 있거나, 또는 그에 연결된 하나 이상의 측면 기들을 통해 해당 사슬과 회합되어 있을 수 있다.

일부 구현예에서, 하나 이상의 양이온성 중합체가 폴리에틸렌이민, 폴리알릴아민, 폴리에테르아민, 폴리비닐피리딘, 그 위에 양으로 하전된 관능기를 가진 다당류, 폴리아미노산, 폴리-L-히스티딘, 폴리-D-라이신, 폴리-DL-라이신, 폴리-L-라이신, 폴리-e-CBZ-0-라이신, 폴리-e-CBZ-DL-라이신, 폴리-e-CBZ-L-라이신, 폴리-OL-오르니틴, 폴리-L-오르니틴, 폴리-DELTA-CBZ-DL-오르니틴, 폴리-L-아르기닌, 폴리-DL-알라닌-폴리-L-라이신, 폴리(-L-히스티딘, L-글루탐산)-폴리-DL-알라닌-폴리-L-라이신, 폴리(L-페닐알라닌, L-글루탐산)-폴리-DL-알라닌-폴리-L-라이신, 폴리(L-타이로신, L-글루탐산)-폴리-DL-알라닌-폴리-L-라이신, L-아르기닌의 트립토판과의 공중합체, 타이로신, 또는 세린, D-글루탐산의 D-라이신과의 공중합체, L-글루탐산의 라이신과의 공중합체, 오르니틴, 또는 라이신 및 오르니틴의 혼합물 및 폴리-(L-글루탐산)으로부터 선택된다.

일부 구현예에서, 하나 이상의 양이온성 중합체는 폴리에틸렌이민(PEI)이다.

이론에 구애됨 없이, 본원에 기재된 대상 예비-동결건조, 동결건조 및 재건 조성물에서, 세 가지 구성요소(즉, 플라스미드, 양이온성 중합체 및 탄수화물)가 함께 조합되어 신규 물질 형태를 제공한다. 대조적으로, 대상 선행 기술 조성물에서는, 먼저 형성된 복합체에 탄수화물이 첨가되어, 동결보호제 및 안정화제로만 제공되어, 본 발명의 것에 비해 더 많은 비율이 필요하다. 따라서, 본원에 기재된 대상 조성물에서의 탄수화물 대 핵산의 비율은 선행 기술에 사용되는 것에 비해 약 40 배 내지 약 400 배 더 낮다.

일부 구현예에서, PEI의 아민기의 몰 대 핵산의 인산기의 몰의 비율은 2 내지 10(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 6 내지 8)이다.

일부 구현예에서, 대상 조성물은 히스티딘 및/또는 염화나트륨을 포함하지 않는다.

대상 그러한 조성물에서, 양으로 하전된 PEI 및 음으로 하전된 핵산이 탄수화물(예를 들어, 트레할로오스)의 존재 하에 나노입자를 형성한다. 예비-동결건조 용액을 위한 나노입자는 약 40 nm 내지 약 50 nm(예를 들어, 약 40 nm, 41 nm, 42 nm, 43 nm, 44 nm, 45 nm, 46 nm, 47 nm, 48 nm, 49 nm, 또는 50 nm)의 범위이며, 재건 생성물을 위한 나노입자는 약 80 nm 내지 약 90 nm(예를 들어, 약 80 nm, 81 nm, 82 nm, 83 nm, 84 nm, 85 nm, 86 nm, 87 nm, 88 nm, 89 nm, 또는 90 nm)의 범위이다.

일반적으로, 특히 나노입자를 제공하는 양으로 하전된 PEI 및 음으로 하전된 핵산에 따라서는 나노입자 크기가 40 nm 내지 약 500 nm로 가변적일 수 있다. 따라서, 나노입자는 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295, 300, 305, 310, 315, 320, 325, 330, 335, 340, 345, 350, 355, 360, 365, 370, 375, 380, 385, 390, 395, 400, 405, 410, 415, 420, 425, 430, 435, 440, 445, 450, 455, 460, 465, 470, 475, 480, 485, 490, 495 및 500 nm로부터 선택되는 크기를 가질 수 있다.

본 발명은 추가로 본원에 개시된 제형물을 고려한다.

추가로, 본 발명에 따른 조성물, 제형물 및 제제의 용도가 고려된다. 일부 구현예에서, 본 발명에 따른 조성물, 제형물 및 제제가 의약에서의 사용을 위해 제형화될 수 있다. 따라서, 본 발명은 추가로 약제학적 조성물, 제형물 및 제제를 제공한다.

본 발명은 추가로 의약 제조에서의 본 발명에 따른 조성물, 제형물 또는 제제의 용도를 제공한다.

일부 구현예에서, 의약은 본 발명에 따라 채용되는 하나 이상의 핵산에 의해 치료가능한 질환 또는 장애를 앓고 있는 대상체의 치료 방법에 사용하기 위한 것이다.

일부 구현예에서, 하나 이상의 핵산에 의해 치료가능한 질환 또는 장애는 증식성 질환 및 장애로부터 선택된다.

일부 구현예에서, 상기 질환은 류마티스성 관절염이다.

따라서, 하나 이상의 증식성 질환 또는 장애의 치료 또는 예방 방법 및 류마티스성 관절염의 치료 또는 예방 방법이 제공된다.

하나 이상의 증식성 질환 또는 장애는 암으로부터 선택될 수 있다. 따라서, 본 발명은 추가로 환자에서의 종양의 치료 또는 예방에서의 용도를 고려한다. 본 발명에 따른 일반적인 치료 방법은 동결건조 조성물의 수득 및 유효량의 조성물에 대한 예를 들어 이차증류수(DDW) 또는 IV 주사용수를 이용한 조성물의 재건, 및 재건된 조성물의 대상체에 대한 투여를 수반할 수 있다.

일부 구현예에서, 증식성 질환이 암일 때, 이는 방광 암종, 간세포 암종, 간모세포종, 횡문근육종, 난소 암종, 자궁경부 암종, 폐 암종, 유방 암종, 두경부에서의 편평상피암종, 식도 암종, 갑상선 암종, 성상세포종, 신경절모세포종, 및 신경아세포종으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

한 구현예에서, 방광 암종은 비-근육 침습성 방광암이며, 조성물은 방광내로, 정맥내로, 종양내로, 또는 당업계에 공지된 임의의 기타 다른 적합한 방법(들)을 이용하여 투여된다.

달리 정의되지 않으면, 본원에 사용된 모든 과학기술 용어들은 본 발명이 속한 분야의 당업자가 통상적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것과 유사하거나 또는 동등한 방법 및 재료가 본 발명의 실시 또는 시험에 이용될 수 있지만, 적합한 방법 및 재료가 하기에 기재된다. 본원에서 언급되는 모든 출판물, 특허 출원, 특허 및 기타 다른 참고문헌들은 그 전체가 참고문헌으로 포함된다. 상충하는 경우, 정의를 포함하여 본 발명의 명세서가 우선한다. 추가로, 재료, 방법 및 실시예는 오직 설명을 위한 것으로, 한정을 의도하는 것은 아니다.

본 발명의 기타 다른 특징 및 장점은 하기의 상세한 설명 및 특허청구범위에서 명백할 것이다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "글루코오스 폴리플렉스", "대상 글루코오스 조성물" 등은 트레할로오스 대신 다당류로서 글루코오스를 이용해 제조된 대상 선행기술 조성물을 지칭한다. 마찬가지로, 용어 "표준 폴리플렉스 제제", "대상 표준 조성물" 등은 플라스미드에 대한 중합체에 의한 첨가(즉, "역방향" 순서)로 제조되는 대상 선행기술 조성물을 지칭한다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "응집화", "응집" 등은 허용가능한 것으로 간주되는 최고 입자 크기보다 더 큰 크기를 가진 입자를 지칭한다. 최고의 허용가능한 입자 크기를 결정하기 위해, 광 산란의 상이한 측정법이 제공되며, 표준 제조 및 신규 제조 방법은 임의의 차이가 존재하는지 여부를 보기 위해 비교된다.

종양 세포의 이종성 코딩 서열의 특이적 발현을 지령하기 위해 이용되는 조절 서열은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 상류방향 H19 프로모터 영역 및/또는 하류방향 H19 인핸서 영역을 포함하는 H19 조절 서열은 본원에 전문이 참고문헌으로 포함되는 미국 특허 6,087,164에 기재되어 있다. 인간 H19 유전자의 하류방향 인핸서 영역은 선택적으로는 H19 프로모터/이종성 유전자 구축물에 첨가되어, 강화된 수준의 종양 세포-특이적 발현을 제공한다.

미국 특허 6,087,164는 또한 H19 인핸서 또는 그의 활성 단편과 조합된 IGF-2 P3 및 P4 프로모터의 용도를 기재한다.

당업자는 암 세포에서 발현되는 유전체 각인 및 비-각인 유전자 유래의 조절 서열을 이용하여 적절한 숙주 세포, 예를 들어 H19-발현 암종 세포(예를 들어, 방광 암종 세포)에서 이종성 코딩 서열의 종양 특이적 발현을 지령할 수 있다. 종양 특이적 발현을 지령할 그들의 능력을 보유한 임의의 변경된 조절 서열이 추가 사용을 위한 재조합 발현 벡터에 혼입되어야 한다.

광범위한 이종성 유전자들, 예를 들어 독성 유전자 산물, 잠재적으로 독성인 유전자 산물 및 항증식 또는 세포분열억제 유전자 산물을 인코드하는 유전자는 그러한 조절 서열의 제어 하에 발현될 수 있다. 효소(예를 들어, CAT, 베타-갈락토시다아제, 루시퍼라아제), 형광 단백질, 예를 들어 녹색 형광 단백질, 또는 항원 마커를 포함하는 마커 유전자들이 또한 발현될 수 있다.

세포독성 유전자 산물들은 독소 및 아폽토시스-유도제를 모두 포함하도록 광범위하게 정의된다. 추가로, 세포독성 산물들은 프로-드러그를 세포독성 산물로 변환하는 약물 대사 효소를 포함한다. 본 발명의 방법에 사용될 수 있는 세포독성 유전자 산물의 예시는, 디프테리아 독소, 슈도모나스 독소, 리신, 콜레라 독소, PE40 및 종양 억제자 유전자, 예를 들어 망막아세포종 유전자 및 p53을 포함한다. 추가로, 세포 아폽토시스를 유발하는 아폽토시스 펩티드를 인코드하는 서열이 사용될 수 있다. 그러한 아폽토시스 펩티드는, 알츠하이머 A 베타 펩티드(LaFerla et al., Nat. Genet. 9:21-30 (1995)), 심방 나트륨이뇨펩티드(Wu et al., J. Biol. Chem. 272:14860-14866 (1997)), 칼시토닌 유전자-관련 펩티드(Sakuta et al., J. Neuroimmunol. 67:103-109 (1996)), 및 공지되거나 또는 발견된 기타 다른 아폽토시스 펩티드를 포함한다.

프로-드러그를 세포독성 산물로 변환시키는 약물 대사 효소는, 티미딘 키나아제(단순포진 또는 대상포진 바이러스 유래), 시토신 디아미나아제, 니트로리덕타아제, 시토크롬 p-450 2B1, 티미딘 포스포릴라아제, 퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라아제, 알칼리성 포스파타아제, 카르복시펩티다아제 A 및 G2, 리나마라아제, 베타-락타마아제 및 잔틴 옥시다아제(배경기술에 대해 문헌[Rigg and Sikora, Mol. Med. Today, pp. 359-366 (August 1997)) 참조)를 포함한다.

추가로, 안티센스, 안티유전자 또는 앱타머 올리고뉴클레오티드가 발현 구축체를 이용해 암 세포에 전달될 수 있다. 리보자임 또는 단일-가닥 RNA가 또한 암 세포에서 발현되어, 관심대상 특별한 유전자의 발현을 억제할 수 있다. 그러한 안티센스 또는 리보자임 분자들에 대한 표적 유전자는 세포 유지 또는 암 세포 표현형의 유지에 핵심적인 유전자 산물을 인코드하는 것이다. 그러한 표적 유전자는, 이에 제한되지 않으나, cdk2, cdk8, cdk21, cdc25A, 싸이클린 D1, 싸이클린 E, 싸이클린 A 및 cdk4을 포함한다.

예를 들어, 암 세포에서 발현되는 각인 유전자 또는 IGF-1 프로모터 유래의 조절 서열, 안티센스 RNAs 또는 발암유전자 형태의 p53, c-fos, c-jun, Kr-ras 및/또는 Her2/neu의 전사물에 특이적인 리보자임의 제어 하에 발현하는 벡터가 세포에 도입되어 내생 유전자의 발현을 하향조절한다. H19를 발현하고, H19 조절 서열을 활성화하는(또는 IGF-1, IGF-2 P3 또는 P4 프로모터를 특이적으로 활성화하는) 종양 세포가 안티센스 RNA 또는 리보자임 RNA의 발현에 특이적으로 표적화될 수 있다.

안티센스 접근법은 표적 mRNA에 상보적인 올리고뉴클레오티드(mRNA의 경우)의 고안을 수반한다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 상보적 표적 mRNA 전사물에 결합하여 번역을 방지한다. 절대적 상보성이 필요하진 않다. 본원에서 언급되는 RNA의 일부분에 대한 서열 "상보성"은 해당 RNA에 혼성화하여 안정적인 이중가닥을 형성할 수 있을 만큼 충분한 상보성을 가진 서열을 의미한다. 혼성화하는 능력은 상보성 정도 및 안티센스 핵산의 길이의 두 가지 모두에 좌우된다. 일반적으로, 더 긴 혼성화 핵산은 RNA와의 염기 미스매치가 더 많을 수 있고, 여전히 안정적인 이중가닥(또는 경우에 따라서는 삼중가닥)을 형성할 수 있다. 당업자는 이중가닥의 융점을 결정하는 표준 과정으로 용인가능한 미스매치 정도를 정할 수 있다.

표적 메세지의 5' 말단, 예를 들어 5' 비번역 서열까지에 상보적이며, AUG 개시 코돈을 포함하는 올리고뉴클레오티드는 번역 억제에서 가장 효율적으로 작용한다. 그러나, mRNA의 3' 비번역 서열에 상보적인 서열도 최근 mRNA의 번역 억제에 유효한 것으로 나타났다. 일반적으로, 문헌[Wagner, R., Nature 372:333-335 (1994)]를 참조한다. 따라서, 표적 유전자 전사물의 5'- 또는 3'- 비-번역, 비-코딩 영역에 상보적인 올리고뉴클레오티드는 내생 유전자의 번역을 억제하는 안티센스 접근법에 이용될 수 있다. mRNA의 5' 비번역 영역에 상보적인 올리고뉴클레오티드는 AUG 개시 코돈의 상보물을 포함해야 한다. mRNA 코딩 영역에 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오티드는 번역에 덜 효율적인 억제자이나, 본 발명에 따르면 사용될 수 있다. 표적 mRNA의 5', 3' 또는 코딩 영역에 혼성화하도록 고안되었는지 여부는, 안티센스 핵산이 길이에 있어서 적어도 6 뉴클레오티드로 존재해야 하며, 바람직하게는 길이에 있어서 6 개 내지 약 50 개 뉴클레오티드 범위의 올리고뉴클레오티드여야 한다. 예를 들어, 올리고뉴클레오티드는 적어도 10 개 뉴클레오티드, 적어도 17 개 뉴클레오티드, 적어도 25 개 뉴클레오티드 또는 적어도 50 개 뉴클레오티드로 존재한다.

핵심적 표적 유전자를 촉매하여 절단하도록 고안된 리보자임 분자가 또한 표적 mRNA의 번역을 방지하기 위해 이용될 수 있다(예를 들어, 1990년 10월 4일에 공개된 PCT 국제 공보 WO90/11364; 문헌[Sarver et al. Science 247:1222-1225 (1990)] 참조). 리보자임이 암 세포 생장에 필수적인 단백질을 인코드하는 유전자 전사물에 특이적인 경우, 그러한 리보자임은 암 세포 표현형의 역전을 유발할 수 있다. 부위 특이적 인식 서열에서 mRNA를 절단하는 리보자임이 표적 mRNA 파괴에 이용될 수 있는 한편, 해머헤드 리보자임의 이용이 바람직하다. 해머헤드 리보자임은 표적 mRNA와 상보적인 염기쌍을 형성하는 측면 영역에 영향을 받는 위치에서 mRNA를 절단한다. 유일한 필요조건은 표적 mRNA가 하기의 두 염기의 서열을 갖는 것이다: 5'-UG-3'. 해머헤드 리보자임의 구축 및 생산은 당업계에 널리 공지되어 있고, 문헌[Haseloff and Gerlach, Nature, 334:585-591 (1988)]에 더 완전하게 기재되어 있다. 바람직하게, 리보자임은 절단 인식 부위가 표적 mRNA의 5' 말단에 근접하여 위치되는데; 즉, 효율을 증가시키고, 비-관능성 mRNA 전사물의 세포내 축적을 최소화하기 위함이다.

리보자임은 또한 RNA 엔도리보뉴클레아제(이후, "Cech-유형 리보자임"으로 언급), 예를 들어 테트라히메나 테르모필라(Tetrahymena thermophila)에서 자연적으로 발생하는 것(IVS, 또는 L-19 IVS RNA로도 공지됨) 및 Thomas Cech 및 동료들이 집중적으로 기재한 바 있는 것(Zaug et al., Science, 224:574-578 (1984); Zaug and Cech, Science, 231:470-475 (1986); Zaug et al., Nature, 324:429-433 (1986); University Patents Inc.에서 출원한 공개 국제 특허 출원 WO 88/04300; Been and Cech, Cell, 47:207-216 (1986))을 포함한다. 상기 Cech-유형 리보자임은 표적 RNA의 절단이 발생한 후 표적 RNA 서열에 혼성화하는 8 개 염기쌍 활성 부위를 갖는다.

당업계에 공지된 임의의 플라스미드는 본 발명의 방법 및 조성물에 사용될 수 있다. 비제한적 예시로서, 플라스미드 BC-819 및 BC-821(이스라엘의 BioCancell 사)가 사용될 수 있다. 이들 플라스미드는 본원에 전문이 참고문헌으로 포함되는 미국 특허 6,087,164 및 미국 공개 특허 출원 20100256225에 더 상세하게 기재되어 있다.

각인 유전자 발현을 재활성화시키는 세포들이 또한 이종성 유전자에 작동적으로 연결된 그러한 각인 유전자 조절 영역을 포함하는 발현 구축체를 특이적으로 활성화시킬 수 있다. 그러한 세포, 특히 종양 세포는 본 발명의 유전자 치료요법 방법에 적합한 표적이다. 종양 및 세포주 모두에서의 H19, 및 IGF-2 P3 및 P4 특이적 발현은 RNA 분석, 동일계내(in situ) 혼성화 및 리포터 유전자 구축체의 기법을 이용해 결정될 수 있다. 추가로, 활성화된 IGF-1 유전자 발현이 있는 종양 세포는 이종성 유전자의 발현을 지령하는 IGF-1 프로모터를 이용한 유전자 치료요법에서 유사하게 결정 및 표적화될 수 있다.

활성화된 H19 발현이 있는 예시 종양 유형은 하기와 같다:

A. 소아과 고형 종양

1. 윌름 종양(Wilm's tumor)

2. 간모세포종

3. 배아형 횡문근육종

B. 생식세포 종양 및 영양막 종양

1. 고환의 생식세포 종양

2. 난소의 미성숙 기형종

3. 천미 종양

4. 융모암

5. 태반 부위 영양막 종양

C. 상피 성인 종양

1. 방광 암종

2. 간세포 암종

3. 난소 암종

4. 자궁경부 암종

5. 폐 암종

6. 유방 암종

7. 두경부에서의 편평상피암종

8. 식도 암종

9. 갑상선 암종

D. 신경 종양

1. 성상세포종

2. 신경절모세포종

3. 신경아세포종

임의의 이들 암은 본 발명의 방법으로 치료가능하다. 사실, H19 발현을 활성화시키는 임의의 종양은 본 발명의 방법으로 치료될 수 있다. 추가로, IGF-1, 및 IGF-2 P3 및 P4 프로모터를 활성화시키는 종양들은 또한 본 발명의 방법으로 치료가능하다. 예를 들어, IGF-2 P3 및 P4 프로모터는 소아 종양, 예를 들어 윌름 종양, 횡문근육종, 신경아세포종 및 간모세포종에서 활성화된다.

치료요법

본 발명은 또한 암 및 과증식성 질환 치료를 위한 치료요법에 사용하기 위한 이종성 유전자에 작동적으로 연결된 조절 영역을 포함하는 폴리뉴클레오티드의 용도를 포함한다. 치료요법 목적을 위해, 본 발명의 발현 구축체들은 임의의 생물학적으로 유효한 담체, 예를 들어 뉴클레오티드 구축체를 세포 생체내로 유효하게 전달할 수 있는 임의의 제형물 또는 조성물 중에 투여될 수 있다.

바이러스 이동 방법에 추가하여, 동물의 조직에서 원하는 이종성 유전자의 정확한 발현을 유발하기 위해 비-바이러스 방법이 채용될 수 있다. 유전자 이동의 대부분의 비-바이러스 방법들은 거대분자의 흡수 및 세포내 수송을 위한 포유류 세포에 의해 사용되는 정상적 메커니즘에 의존한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 비-바이러스 유전자 전달 시스템은 표적화되는 세포에 의한 대상체 발현 구축물의 흡수를 위한 식작용 경로에 의존한다. 그러한 유형의 예시 유전자 전달 시스템은 예를 들어 폴리플렉스를 포함한다.

폴리플렉스 제형물 및 동결건조화

본원에 기재된 바와 같이, 양이온성 중합체는 핵산, 예를 들어 플라스미드와 조합하여 형질주입 시약으로서 사용되어, 세포 및 조직으로의 효율적 핵산(예를 들어, DNA, shRNA, siRNA, 올리고뉴클레오티드 등) 전달을 중재할 수 있다. 대상 조성물은 핵산이 양이온성 중합체와 복합체를 형성할 때 형성된다.

당업자는 당업계에서 통상적으로 이용되는 기타 다른 첨가제들, 예를 들어 지질, 리포좀, 콜레스테롤, 폴리에틸렌글리콜(PEG), 미셀, 히알루론산, 단백질, 에멀젼화제, 계면활성제, 바이러스 벡터 및/또는 표적화 부분이 또한 본 발명의 조성물에 사용될 수 있음을 알 것이다.

그러나, 일부 구현예에서, 폴리플렉스 제형물(예를 들어, 대상 예비-동결건조 조성물)은 오직 핵산, 양이온성 중합체, 당 및 임의의 완충제만을 포함한다. 대조적으로, 당업계에서 사용되는 기타 다른 제형물은 기타 다른 구성요소들, 예를 들어 히스티딘을 포함한다.

폴리플렉스 제형물에 사용하기 위한 한 가지 예시 양이온성 중합체는 폴리에틸렌이민(PEI)이다(참고문헌으로 포함되는 미국 특허 6,013,240 참조). 예를 들어, 선형 폴리에틸렌이민(in vivo-jetPEI^® Polyplus-transfection S.A.사, 프랑스 소재)이 사용될 수 있다. 상기 in vivo-jetPEI^®는 질소 잔기들로 발현되는 150 mM 용액이다. 대안적으로, 선형 PEI는 시판되어 입수가능한 분지화된 PEI를 가수분해하거나 또는 당업계에 공지된 임의의 기타 다른 방법으로 제조될 수 있다.

당업자는 대상 양이온성 중합체/핵산 조성물 내부에서의 이온 균형이 중요하다는 점을 인식할 것이며, 유효한 세포 진입을 위해서는 대상 조성물이 양이온성이어야 한다는 점을 인식할 것이다. N/P 비율은 핵산 포스페이트 당 양이온성 중합체 중의 질소 잔사의 갯수로 정의된다. 바람직하게는, 생체내 핵산 전달을 위해서는 N/P 비율이 2 내지 10이다(예를 들어, 6 내지 8). N/P 비율의 결정은 당업자의 일상적 재량이다.

대상 핵산-PEI 조성물(예를 들어, 대상 예비-동결건조 조성물)은 PEI, 플라스미드 DNA 및 탄수화물의 혼합 동안 형성되는 나노입자를 포함한다. 혼합시, 양이온성 중합체의 양전하 및 플라스미드의 음전하가 나노입자를 형성한다.

예를 들어, 하기의 임의의 적합한 전달 경로가 이용될 수 있다: 정맥내(IV), 복막내(IP), 종양내, 피하, 국소, 척추강내, 피내, 유리체내, 진피내, 골피질내, 고환내, 동맥내, 방광내(예를 들어, 방광 안), 인트라포틸(intraporteal), 대뇌내, 안구뒤 주입, 비강내 등. 일부 구현예에서, 유전자 전달 비히클이 카테터에 의해 도입될 수 있다(미국 특허 5,328,470 참조). 세포 또는 조직에서의 핵산의 전달은 시험관내, 생체내, 생체외 또는 동일계내에서 시행될 수 있다.

하기 실시예 1에 개요한 바와 같이, 표준 폴리플렉스 형성은 5% 덱스트로오스 용액에 희석시킨 형질주입 시약(예를 들어, in vivo-jetPEI^®)을 5% 덱스트로오스 용액에 희석시킨 DNA 플라스미드(예를 들어, BC-819 플라스미드)에 도입한 후 격한 혼합을 후속하여 실행된다. 대상의 플라스미드/양이온성 중합체 조성물 제조에 대한 상기 표준 공정은 매우 민감하며, 올바른 순서로 수행되지 않으면, 석출을 초래할 공산이 크다. 나아가, 결과로서 수득하게 되는 대상 폴리플렉스 조성물은 불안정할 수 있어서, 실온에서 3 시간 후에는 황화된 색상이 관찰된다. 추가로, 표준 프로토콜을 이용해 제조시, 플라스미드를 형질주입 시약에 첨가하도록 하는 공정을 역전하려는 선행기술의 시도는 나노입자 형성을 제공하지 않았다. 나아가, 그러한 용액들은 마이크로-부피에 국한되며, 동결건조 달성을 위해서는 높은 비율의 동결보호제 대 나노입자를 필요로 한다.

따라서, 대규모 제조를 위해, 그리고 예측가능한 품질 및 재수화시 증가된 안정성을 보장할 대상의 명확하며 안정적인 용액 또는 냉동 건조된 조성물의 장기간 저장을 위해 규모를 키울 수 있는 폴리플렉스 제조 방법이 필요하다.

일부 선행기술 연구에서는 대상 DNA 플라스미드/LPEI 조성물이 고농도(즉, 높은 비율의 탄수화물/DNA 플라스미드 w/w)의 동결건조보호제의 존재 하에 동결될 수 있고, 그들의 최초 품질을 유지할 수 있음을 보여준 바 있다(문헌[Brus et al., Journal of Controlled Release 95:119-131 (2004)] 참조). PEI를 이용하면, 당/DNA의 비율이 7500이면 복합체를 보호하는 것으로 보고된 바 있다. 나아가, 양이온성 지질-DNA(LPEI 아님)은 250의 비율을 필요로 한다. 그러나, Brus외 다수가 이용한 동결건조 공정은 대규모에서는 재현성이 없다. 나아가, 상기 연구에 이용된 고농도의 동결건조보호제는 생체내에서는 용인되지 않을 수 있고, 임상 연구에서 이용하기에 부적당한 최종 산물을 제공할 수 있다.

사실, 본 발명의 발명자들은 놀랍게도 동결건조 공정에서 훨씬 더 낮은 비율의 탄수화물(당) 대 핵산을 이용해 결과물로 탄수화물 대 핵산 비율이 감소된 대상 조성물을 제공하는 것이 가능하다는 것을 발견했다. 이론에 구애됨 없이, 본 발명의 발명자들은 본원에 기재된 대상 조성물의 세 가지 구성요소(DNA, Jet-PEI 및 탄수화물)가 조합되어 용이하게 동결건조될 수 있는 신규 화학물 본체를 형성할 수 있는 것으로 여긴다. 따라서, 훨씬 더 낮은 농도의 탄수화물이 필요하다.

그러한 더 낮은 농도는 생체내 적용에서 더욱 잘 용인된다. 예를 들어, 인간 혈액의 삼투압에 대한 정상적 생리학적 범위는 약 280 mOsmol/L 내지 310 mOsmol/L이며, 글루코오스 중에 제조되는 대상 조성물은 250이고, 방광에서 사용하기 위한 트레할로오스 중 대상 조성물은 280이다. 따라서, 방광용 제조 용액이 약간 고장성이나, 방광내로 투여된다. IV 제제에 대해서는, 그 농도가 300까지의 DNA/트레할로오스 비율로 증가될 것이다.

그러한 연구들은 고부피 폴리플렉스 용액 제조의 도전적 양태를 키워, 상기 목적 달성을 위한 마이크로-믹스(micro-mixer) 시스템 방법(문헌[Kasper et al., European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 77:182-185(2011)] 참조)의 개발이 보고된 바 있다. 그러나, 상기 마이크로-믹스 시스템은 공업적 규모로 하기 위해서는 여전히 규모상향(up-scaling) 개발을 필요로 한다.

하기의 실시예 3은 H19 유전자 조절 서열의 제어 하에 디프테리아 독소 A 사슬(DTA)을 발현하는 비-바이러스 벡터 BC-819, 및 5% 트레할로오스 용액의 존재 하의 in vivo -jetPEI^®로 구성되는 대상 예비-동결건조 조성물의 제조를 기재한다.

BC-819 (H19-DTA로도 공지됨) 및 BC-821 플라스미드(H19-DTA-P4-IGF2로도 공지됨)가 암 세포를 선택적으로 표적화하기 위해 H19(BC-819에 대해) 또는 H19 및 IGF2 P4(BC-821에 대해) 조절 요소의 제어 하에 DTA의 발현을 구동하는 암 치료를 위한 신규 DNA-기반 치료요법의 용도가 선행기술에서 보고된 바 있다(문헌[Ohana et.al., International Journal of Cancer 98(5):645-650 (2002)]; Ohana et al., The Journal of Gene Medicine 7(3):366-374 (2005)); [Abraham et al., The Journal of Urology 180(6):2379-2383 (2008)] 참조). 이러한 치료요법들은 대장에서 간으로의 전이, 방광, 췌장 및 난소암의 치료에서 우수한 결과를 입증했다(문헌[Ohana et al., The Journal of Gene Medicine 7(3):366-374 (2005)]; [Mizrahi et al., Journal of Translational Medicine 7:69 (2009)]; [Ohana et al., Gene Therapy and Molecular Biology 8:181-192 (2004)]; [Scaiewicz et al., Journal of Oncology 178174 (2010)]; [Sorin et al., International Journal of Oncology 39(6):1407-12 (2011)]; [Abraham et al., The Journal of Urology 180(6):2379-2383 (2008)] 참조).

그러한 방광암 임상 시도에서, BC-819는 최종 부피 50 ml의 5% 글루코오스 중의 최종 농도 0.4 mg/ml로 in vivo -jetPEI^®(N/P=6)와의 복합체로서 투여된다.

그러나, 우수한 품질의 대상 조성물 제조는, 구성요소들의 혼합에 대한 엄격한 권고사항 및 상기 농도에서 형성되는 대상 조성물의 상대적 불안정성으로 인해 여전히 도전과제로 남아있다(문헌[Kasper et al., European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 77:182-185(2011)] 참조).

하기 실시예 1 에 기재된 바와 같이, 환자 곁에서 플라스미드 및 PEI 용액을 5% w/v 글루코오스 용액에 따로 희석하고, 이어서 플라스미드 용액에 재빨리 PEI 용액을 첨가했다. 프로토콜에서의 임의의 일탈은 대상 조성물에서 품질의 저하 또는 더욱 나쁜 결과인 석출을 유도할 수도 있다. 따라서, 대상 제제의 조성물은 각 투여량 투여시 고도의 자격을 갖춘 스태프의 관여가 필요하다. 추가로, 결과로서 수득되는 폴리플렉스 용액은 짧은 선반 수명을 갖고 있다.

따라서, 재현가능한 우수한 품질의 폴리플렉스의 투여를 보장할 최적의 길은 약국에서 24 개월 이상의 선반 수명을 가진 즉석용 제품(예를 들어, 대상 동결건조 조성물)을 제공하는 것이다. 해당 제품은 사용 전 물을 이용한 단순 재건을 필요로 한다.

본원에 기재된 방법은, 대상 조성물 용액이, 예를 들어 후속하여 치료 투여량으로 동결건조될 수 있는 트레할로오스 용액 중, 원하는 농도의 고부피로 제조될 수 있도록 한다.

제조 동안 사용되는 최종 트레할로오스 농도는 안정적인 대상 조성물의 형성을 허용하며, 생체내 투여시 용인될 뿐만 아니라 새롭게 제조된 용액인 등장성 환경을 제공한다.

예비-동결건조된 안정적인 대상 조성물 용액의 형성은 성공적 냉동 건조 공정을 보장하기 위해 중요하다.

상기 방법의 이용은 두 구성요소의 혼합 순서를 역전시켜 고부피 폴리플렉스 제제의 기술적 한계를 극복하도록 해 준다. 여기서, 생성물 변경 없이 냉동 건조를 거칠 수 있는 비교적 고농도의 대상 용액의 등장성인 안정적인 예비-동결건조 조성물의 제조가 달성되었다.

상기 방법은 공업적 생산으로 규모를 키울 수 있는 대상 Plasmid-LPEI(선형 PEI) 조성물의 생성에서 통하며, 용이하게 저장될 수 있으며, 환자에게 투여 전 균일하게 제조될 수 있는 안정적인 생성물을 제공할 것이다.

표준 폴리플렉스 제조 공정의 한계를 극복하기 위해, 본원에서는 핵산(예를 들어, BC-819 플라스미드), 양이온성 중합체(예를 들어, in vivo -jetPEI^®), 및 탄수화물(예를 들어, 트레할로오스)이 (표준 프로토콜과 비교하여) 역방향 순서로 혼합되는 대상 용액 제조 공정의 예비-동결건조 조성물이 제공된다. 상기 공정은 본원에서 "역방향 공정", "역방향 방법" 및/또는 "역방향 폴리플렉스 제조"로 지칭된다. 그런 방식으로, 플라스미드는 제조된 대상 조성물 용액의 연속 혼합을 동반하여 느린 제어 공정으로 형질주입 시약에 첨가된다. 중요한 점은 예비-동결건조 대상 조성물 용액은 우수한 동결건조 제품을 보장하도록 매우 안정적인 신규 화합물 본체(NCE)를 형성할 핵산, LPEI 및 탄수화물로 이루어진다는 점이다.

결과로서 수득한 동결건조된 대상 조성물은 오직 세 가지 구성요소만을 포함한다: PEI, DNA 플라스미드 및 트레할로오스. 나아가, 대상 조성물은 더 이상 복합체형성 PEI/플라스미드로 정의되지 않는다. 그보다는, 상이한 화학 구조를 가진 무정형 분말이다.

본원에 기재된 역방향 방법에 따라 제조된 대상 조성물은 당업계에 공지된 기타 다른 폴리플렉스 제조 방법을 사용할 때보다 훨씬 더 낮은 탄수화물 대 핵산-중합체 대상 조성물 비율을 갖고 있다.

동결건조는 가열 개재 증발 없는 가용화된 화합물의 탈수 공정이다. 동결건조 공정에서, 용액은 냉동되어 저압 환경에 적용되며, 이러한 환경 하에서는 가용화된 화합물에 손상이 아예 없거나 최소한의 손상만 있은 채 물 승화 공정이 촉진된다.

일단 역방향 프로토콜을 이용해 양이온성 중합체가 핵산과 복합체를 형성하면, 본원에 기재되거나 또는 당업계에 공지된 임의의 동결건조 방법에 따라 동결건조될 수 있다. 본 발명에 앞서, 트레할로오스, 만니톨 또는 수크로오스를 10 ㎍/mL 내지 50 ㎍/mL의 농도로 폴리플렉스에 첨가시, 동결건조 후 효율에서의 감소가 관찰되었다(문헌[Brus et al., Journal of Controlled Release 95 (2004) 119-131] 참조).

대상 동결건조 조성물은 환자에 대한 주사에 앞서 사용 및 재건(예를 들어, DDW을 이용)시까지 동결건조된 형태로 저장될 수 있다. 대상 동결건조 조성물의 선반 수명은 3 개월 초과이다(즉, 3 개월, 4 개월, 5 개월, 6 개월, 7 개월, 8 개월, 9 개월, 10 개월, 11 개월, 12 개월, 13 개월, 14 개월, 15 개월, 16 개월, 17 개월, 18 개월, 19 개월, 20 개월, 21 개월, 22 개월, 23 개월, 24 개월 초과, 또는 그 이상).

재건 후, 대상 조성물의 외양은 역방향 제조 방법에 따라 제조된 새로운 대상 조성물의 것과 유사하며, 석출이 전혀 관찰되지 않는다. 마찬가지로, 재건된 시료는 표준 또는 신규 제조 방법에서 아무런 차이를 보이지 않는다. 중요한 점은, 폴리플렉스 용액 중의 핵산 농도는 동결건조 공정에 의해 영향받지 않는다는 점이다.

선행 기술의 방법으로 제조된 새로운 복합체는 입자 크기가 50 nm 내지 500 nm의 범위이다. 역방향 순서의 예비동결건조 용액의 제조에서는 입자 크기가 40 nm 내지 50 nm의 범위이다. (역방향 순서를 이용한) 동결건조 후 재건된 시료에서는 입자 크기가 80 nm 내지 90 nm의 범위이다. 따라서, 재건 후, 나노입자의 크기는 새로운 대상 조성물의 것에 필적한다. 대조적으로, Kasper 등의 문헌에 기재된 바와 같이, 낮은 DNA 농도 복합체를 위해 마이크로-믹서를 이용해 제조시, 결과로 수득되는 입자는 65 nm 내지 170 nm의 범위이다.

실온에서 3 시간 후, 선행기술의 방법으로 제조된(글루코오스를 이용해 제조) 새로운 대상 조성물은 분해의 징후(즉, 약간 황색화된 색상)를 나타냈다. 대조적으로, 역방향 제조 방법(트레할로오스 중에 예비동결건조된 경우)에 따라 제조된 용액 및 재건된 시료는 눈에 보이는 분해 징후를 나타내지 않았으며, 약간 백색인 유백색을 색상으로 존재했다. 실온에서 24 시간 후, 선행기술의 방법으로 제조된(글루코오스를 이용해 제조) 대상 새로운 조성물은 황색이었고, 역방향 제조 방법(트레할로오스 중에 예비동결건조된 경우)에 따라 제조된 용액 및 재건된 시료는 눈에 보이는 분해 징후를 나타내지 않았으며, 약간 백색인 유백색의 색상으로 남아 있었다.

따라서, 동결건조와 조합한 역방향 제조 방법의 이용은 표준 공정과 연관된 수많은 문제점을 해결할 것이다.

예를 들어, 환자 곁에서, 의학 실무자는 사용 전에 대상 동결건조 조성물을 재건하기 위해 IV 주사용수 중에 동결건조된 분말(동결건조된 대상 조성물)을 녹이기만 하면 되며, 이로써 제조 및 투여를 단순화한다. 나아가, 동결건조된 분말의 수송은 그의 예상되는 개선된 안정성으로 인해 더 용이하다. 추가로, 동결건조된 생성물의 특성은 본래의 함수(즉, 비-동결건조) 플라스미드의 것에 필적한다.

본원에 기재된 역방향 폴리플렉스 제형화 방법(트레할로오스 중 예비-동결건조된 대상 조성물)은 또한 [2012 doctoral thesis of Julia Christina Kasper entitled "Lyophilization of Nucleic Acid Nanoparticles - Formulation Development, Stabilization Mechanisms, and Process Monitoring"]에서 기재한 방법과 상이하다. Kasper는 안정적인 폴리플렉스 용액 제조를 위한 명확한 방법이 필요하다는 점을 인식하여, 폴리플렉스 동결건조 시도 시 통상적으로 관찰되는 나노입자의 응집이 동결건조의 동결 단계 동안 나타난다는 점을 이해하고 있었다.

그러한 논란을 극복하기 위해, Kasper는 폴리플렉스 제조를 위한 상이한 방법을 개발했다. 본원에 기재된 역방향 프로토콜(트레할로오스에서의 예비동결건조)과 비교한 그러한 방법의 개요를 표 1에 제공한다.

	Kasper	역방향 프로토콜
플라스미드	pCMVluc(시판) https:/www.addgene.org/45968/	BC-819(BioCancell 사, 이스라엘)
플라스미드 희석용 완충액	10 mM 히스티딘 완충액 pH 6.0	Tris EDTA pH 8.0
PEI 희석용 완충액	10 mM 히스티딘 완충액 pH 6.0	주사용수(WFI)
PEI	분지화된 PEI의 사내 가수분해	In vivo-jetPEI®
비율 N/P	6	6
제조 부피	0.5 ml	1 l
제조 방법	마이크로 믹서(더 큰 부피에 대해서는 여전히 개발이 필요한 방법)	500 rpm에서 교반하며 3 ml/분 내지5 ml/분의 속도로 트레할로오스 용액에 희석한 플라스미드를 트레할로오스 용액에 희석한 PEI에 첨가

하기의 표 2는 Kasper 폴리플렉스 제법과 동결건조 프로토콜과의 기술적 측면을 본원에 기재된 역방향 폴리플렉스 제법 및 동결건조 방법과 비교한다.

	Kasper	역방향 프로토콜 + 동결건조
플라스미드	pCMVluc (commercial) https:/www.addgene.org/45968/	BC-819(BioCancell 사, 이스라엘)
플라스미드 희석용 완충액	10 mM 히스티딘 완충액 pH 6.0	Tris EDTA pH 8.0
PEI 희석용 완충액	HBG 완충액 pH 7.4(5% 글루코오스 20 mM Hepes) 또는 10 mM 히스티딘 완충액 pH 6.0	WFI
PEI	분지화된 PEI의 사내 가수분해	In vivo-jetPEI®
트레할로오스 첨가	10 mM 히스티딘 완충액 pH 6.0에서 혼합하고, 폴리플렉스에 1:1로 첨가	플라스미드 및 PEI 모두에 5%로 혼합
비율 N/P	6	6
제조 방법	마이크로 믹서(더 큰 부피에 대해서는 여전히 개발이 필요한 방법)	500 rpm에서 교반하며 3 ml/분 내지 5 ml/분의 속도로 트레할로오스 용액에 희석한 플라스미드를 트레할로오스 용액에 희석한 PEI에 첨가
최종 플라스미드 농도	0.1 mg/ml	0.4 mg/ml
최종 용액 부피	5 ml까지 0.5 ml	1 l
용액 DSC 시험	있음	있음
동결건조기	냉동-건조기 Lyostar II, SP Scientific, Stone Ridge USA	냉동 건조기 LyoBeta 25 Telstar spain
안정성	2℃ 내지 8℃, 20℃, 40℃에서 6 주	2℃ 내지 8℃에서 2 주까지

Kasper는 또한 안정적인 대상 조성물의 제법 중요성 및 동결건조 공정에서의 동결 단계의 영향을 기재한다. 하기의 표 3은 Kasper 폴리플렉스 제법 및 Kasper 연구실에서의 동결건조 및 본원에 기재된 역방향 폴리플렉스 제법 및 동결건조 방법의 기술적 측면을 요약한다.

	Kasper	BioCancell
플라스미드	pCMVluc(시판) https:/www.addgene.org/45968/	BC-819(BioCancell사, 이스라엘)
플라스미드 희석용 완충액	10 mM 히스티딘 완충액 pH 6.0	Tris EDTA pH 8.0
PEI 희석용 완충액	10 mM 히스티딘 완충액 pH 6.0	WFI
PEI	분지화된 PEI의 사내 가수분해	Polyplus(시판)
탄수화물 첨가	10 mM 히스티딘 완충액 pH 6.0 중에 혼합되고, 폴리플렉스에 1:1 첨가된 수크로오스	플라스미드 및 PEI와 5%로 혼합된 IV 주사용수 중의 트레할로오스
탄수화물/DNA 비율	1200 내지 14000	125
비율 N/P	6	6
제조 방법	마이크로 믹서(더 큰 부피에 대해서는 여전히 개발이 필요한 방법)	500 rpm에서 교반하며 3 ml/분 내지 5 ml/분의 속도로 트레할로오스 용액에 희석한 플라스미드를 트레할로오스 용액에 희석한 PEI에 첨가
최종 플라스미드 농도	0.01 mg/ml 및 0.05 mg/ml	0.4 mg/ml
최종 용액 부피	0.5 ml	1 l
건조 전 냉동 방법	선반 램프 대 "표준" 감압 ...	선반 램프
선반-램프 냉동 방법에서의 냉동 속도	-1℃ 또는 -5℃/분으로 -45℃까지	-1℃/분으로 -45℃까지
입자 크기	DLS(65 nm 내지 170 nm)	DLS(80 nm 내지 -90 nm)
안정성	2℃ 내지 8℃, 20℃, 40℃에서 6 주	2℃ 내지 8℃에서 2 주까지

Kasper의 문헌에서 언급한 바와 같이, 폴리플렉스의 크기는 동결 건조에 의해 영향받는다: 입자 크기는 수크로오스 대 플라스미드 DNA의 비율이 증가할수록 더 잘 유지된다.

구체적으로, Kasper는 0.05 mg/ml DNA 용액이 2800 이상의 수크로오스/DNA 비율로 안정화될 수 있음을 교시한다. Kasper에 따르면, 안정화제/DNA의 비율은 완전한 안정화 달성에 중요하다. 중요한 비율이 동결 방법에 좌우된다.

대조적으로, 본원에 기재된 역방향 폴리플렉스, 동결건조 및 재건 방법에서는 입자 응집이 관찰되지 않는다. 추가로, 이러한 방법에서 사용되는 트레할로오스 대 핵산의 비율은 125 및 250이며, 이는 Kasper의 문헌에서 기재된 것보다 훨씬 낮다.

추가로, 본원에 기재된 역방향 방법으로 제조된 예비동결건조 용액은 약 40 nm 내지 50 nm의 범위의 크기를 가진 대상 조성물(예를 들어, 대상 예비-동결건조 조성물 또는 폴리플렉스)을 결과물로 제공한다. 재건 후, 재건된 대상 조성물의 입자 크기는 약 80 nm 내지 90 nm이다. 대조적으로, Kasper의 문헌에서 기재된 마이크로-믹서는 동결건조 전 65 nm 내지 170 nm의 범위의 크기를 가진 폴리플렉스를 결과물로 제공한다. 나아가, Kasper는 동결건조 후 폴리플렉스의 z-직경에서의 근소한 증가를 보고했다. Kasper는 또한 냉동 기간 동안 입자 운동을 피하기에 충분하게 점도가 높은 한 부형제의 선택은 별로 중요하지 않음을 교시한다. 선반 램프 방법은 대상 조성물 냉동을 위해 검토된 임의의 기타 다른 방법보다 스트레스가 덜하다는 점을 교시한다.

따라서, Kasper는 플라스미드 DNA도 siRNA도 제한없이 성공적으로 동결건조되는 것으로 결론내렸다. 예를 들어, 최초의 냉동-해동 연구에서, 입자 크기 유지에는 통상적으로 사용되는 이당류, 수크로오스 또는 트레할로오스의 높은 농도가 필요하며, 이들은 등장성 수준을 훨씬 초과함으로써, 안정화제 대 폴리플렉스(약 4000)의 비율의 중요 전제조건을 나타낸다. 사실, Kasper의 문헌에서, 더 높은 분자량 부형제, 예를 들어 락토수크로오스, 히드록실프로필 베타덱스(HP-b-CD) 또는 포비돈(PVP)이 냉동 및 건조 동안의 낮은 삼투압에서 충분한 입자 안정화에 유익하다. 14% 락토수크로오스, 10% HP-b-CD/6.5% 수크로오스 또는 10% PVP/6.3% 수크로오스가 있는 등장성 제형물을 이용하면, 폴리플렉스 크기는 동결건조시 더욱 잘 보존되고(170 nm 미만), 선행기술에 비교하여 저장이 40℃까지 6 주 넘게 가능하다.

따라서, 락토수크로오스 또는 CD/수크로오스 제형물을 이용함으로써, Kasper는 pDNA/LPEI 폴리플렉스가 크기에 있어 근소한 증가만 있으면서 동결건조될 수 있으며, 생물학적 활성을 유지함을 입증했다.

나아가, Kasper는 또한 대상 조성물 제조를 위해 개발한 마이크로-믹서 기기를 기재한다(Kasper의 상기 2012년도 문헌, 도 4-1 참조). 상기 기기는 LPEI 및 플라스미드 용액을 T-연결자의 접합점에서 혼합하여 5 ml까지의 부피로 대상 Plasmid-LPEI 조성물을 제조하기 위해 이용되었다. 혼합 속도는 주사기를 이용해 용액을 장치 안으로 삽입하여 제어했다.

그러한 방식으로 성공적으로 제조될 수 있던 대상 조성물은 비율 N/P=6(LPEI 질소(N) 대 DNA 포스페이트(P)의 몰비; 표시되는 폴리플렉스 농도는, 시료의 플라스미드 DNA 농도를 지칭함)로 LPEI가 있는 50 ㎍/ml 이하였다. 그러나, 더 높은 농도의 플라스미드 농도 용액으로는(특히, 400 ㎍/ml 용액) 큰 나노입자 크기를 가진 불안정한 대상 조성물을 제공하게 되었다.

나아가, Kasper 방법에서는, 플라스미드 및 LPEI가 모두 pH 6의 10 mM 히스티딘 완충액과 혼합되었으며, 대상 용액의 조성물은 동결건조 공정 동안 그것을 안정화시키기 위한 추가적인 고농도 부형제를 필요로 했다. 구체적으로, Kasper 탄수화물/DNA 비율은 1,200 내지 14,000였다.

대조적으로, 본원에 기재된 역방향 방법은 핀치 패들 터빈(pinch paddle turbine)을 가진 표준 혼합 용기에서 수행된다. 상기 역방향 방법은 재현가능한 우수한 품질을 가진 대규모 폴리플렉스 용액(즉, 예비-동결건조된 대상 조성물)의 제조를 보장하는 한 가지 수단을 제공한다.

구체적으로, 상기 언급된 바와 같이, 혼합 순서는 고품질 예비-동결건조 대상 조성물을 보장하기 위해 중요하다. 여기서, LPEI 용액 및 플라스미드가 각각 5% 트레할로오스 용액과 혼합된다. 이어서, PEI 용액은 혼합 용기에 정치시키고, 혼합하면서 플라스미드 용액을 LPEI에 첨가한다.

놀랍게도, 트레할로오스의 존재 하에 음으로 하전된 플라스미드 용액을 고도의 양으로 하전된 LPEI 용액에 삽입하는 것은 작은 나노입자 크기(50 nm 정도) 및 높은 안정성을 가진 대상 용액의 균질 예비-동결건조 조성물을 제공하게 된다.

그러한 방식으로, 비율 N/P=6(LPEI 질소(N) 대 DNA 포스페이트(P)의 몰비; 표시되는 폴리플렉스 농도는 시료의 플라스미드 DNA 농도를 지칭함)로 in vivo-jetPEI^®와 복합체를 형성한 DNA의 400 ㎍/ml의 농도로 용액 1000 ml을 수득했다. 탄수화물(트레할로오스)/DNA의 비율은 125이다.

이어서, 결과로서 수득한 용액을 100 ml 바이알에 충전시키고 동결건조시켜, 동결건조된 대상 조성물을 제공할 수 있다. 한 가지 비제한적 예시에서, 바이알은 -45℃에서 4 시간 이상 동안의 냉동 단계, 25℃에서의 41 시간 이상, 바람직하게는 80 시간 이상, 더욱더 바람직하게는 140 시간 이상(예를 들어, 41 시간, 50 시간, 60 시간, 70 시간, 80 시간, 90 시간, 100 시간, 110 시간, 120 시간, 130 시간, 또는 140 시간 이상) 동안의 1차 건조 단계, 및 8 시간 이상의 2차 건조 단계를 포함하는 실험실 냉동 건조기 LyoBeta 25℃에서의 냉동 건조 순환을 통과했으며, 두 건조 단계에서 압력은 모두 0.150 mb였다.

당업자는 대상 동결건조 조성물이 재건된 대상 조성물 제공을 위한 임의의 적합한 방법(들)을 이용해 재건될 수 있음을 알 것이다.

지금까지는, Kasper 장치가 우수한 품질(작은 크기 입자, 안정적인 대상 조성물 등)을 갖고 비교적 높은 농도에서 큰 부피로 대상 조성물 용액을 제공하는 것이 불가능했다. 대조적으로, 본원에 기재된 역방향 폴리플렉스 제조 방법은 단순하고, 동결건조 공정을 거치면서 대상 조성물을 보호할 부형제 없이도 비교적 고농도로 고품질의, 안정적인 예비동결건조된 대상 조성물 용액을 제공한다.

치료 종점 및 투여량

당업자는 의학 실무자 또는 환자 관점에서, 암 병태와 관련된 바람직하지 않은 병후들(예를 들어, 통증, 민감성, 체중 감소 등)의 실질적 임의의 완화 또는 예방이 바람직하다는 점을 알 것이다. 추가로, 종양 질량 또는 생장 속도에 있어서의 임의의 감소뿐만 아니라 종양의 병리조직학적 도면에서의 개선이 바람직하다. 따라서, 본원에 사용된 바와 같이, 본원에 사용된 용어 "치료", "치료 용도" 또는 "의학적 용도"는 질환 상태 또는 병후를 해결하거나, 또는 그렇지 않으면 임의의 방식으로 질환 또는 기타 다른 바람직하지 않은 병후들의 진행을 예방, 억제, 지연 또는 역전하는 청구된 조성물의 임의의 모든 용도를 지칭한다.

유효 투여량 및 치료 프로토콜은, 실험 동물에서는 낮은 투여량으로 시작한 후 유효성을 모니터링하면서 투여량을 늘리고, 투여량 처방을 체계적으로 변화시키는 통상적 수단으로 결정될 수 있다. 킬로그램 중량 당 생물활성제의 최대 용인 투여량 또는 MTD를 결정하기 위해 동물 연구, 바람직하게는 포유류 연구가 통상적으로 이용된다. 당업자는 인간을 포함한 기타 다른 종들에 대한 효능 및 독성에 대하여 투여량을 정기적으로 추정한다.

효능의 인간 연구를 수행하기 전에, 환자에서의 임상 제1상 연구가 안전한 투여량 확립에 도움이 된다. 임상의에 의한 주어진 대상에 대한 최적 투여량 결정시 수많은 용인을 고려할 수 있다. 이들 중 우선적인 것은 선택된 이종성 유전자 산물의 독성 및 반감기이다. 추가적인 요인은 환자의 체구, 환자의 연령, 환자의 일반적인 상태, 치료되어야 할 특정한 암 질환, 질환의 중증도, 환자에서 기타 다른 약물의 존재여부, 유전자 산물의 생체내 활성 등을 포함한다. 동물 연구 결과 및 임상 문헌을 고려한 후 시도 투여량을 선택한다.

세포독성제를 인코드하는 이종성 유전자에 작동적으로 연결된 H19 조절 영역 또는 IGF-2 P3 또는 P4 프로모터 영역을 포함하는 아데노바이러스 벡터의 유효 인간 투여량의 예시는 미국 특허 6,087,164에 제공되어 있다.

대상체에서의 암 병태 치료에서의 사용을 위해, 본 발명은 또한 그의 양태들 중 하나에서 핵산, 양이온성 중합체, 탄수화물(예를 들어, 트레할로오스) 용액을 포함하는 멸균-충전 바이알 또는 앰플(즉, 동결건조된 조성물) 형태의 키트 또는 패키지를 제공한다. 한 구현예에서, 키트는 단위 투여량 또는 다중-투여량 분량으로 동결건조 형태의 본원에 기재된 역방향 방법으로 제조되는 폴리플렉스 용액을 포함하는데, 여기서 패키지는 재건된 대상 조성물 제공을 위한 재건 및 암 치료를 위한 그의 내용물의 용도를 지시하는 라벨을 포함한다.

본원에서 개시되는 주제 대상을 더 잘 이해하고, 그것이 실제 실시될 수 있는 방법을 설명하기 위해, 비제한적 예시로서의 구현예들이 하기와 같은 첨부 도면을 참조하여 기재될 것이다:
도 1a 내지 b는 동결건조 전(예비-동결건조 조성물, 도 1a) 및 재건 후(재건된 것, 도 1b)의 강도를 입증한 검정들의 그래픽 제시이다. Luc 4=강도 없음(기준선; 최대값 발광; 모든 세포가 보임); Comp=통상적 제제의 강도; Rev=본 발명의 신규 제법에 대한 강도; 및 Usual=새로운 조성물.
도 2는 시료의 전기영동 결과를 나타낸다. 레인 1 은 마커이고; 레인 2 는 플라스미드 BC-819이고; 레인 3은 5% 글루코오스 중의 BC-819/in vivo-jetPEI^® 조성물(표준 제제)이고; 레인 4는 트레할로오스 중의 조성물(역방향 프로토콜)이고; 레인 5는 DDW를 이용한 재건 후 동결건조된 조성물(대상 재건 조성물); 및 레인 6은 5% 트레할로오스 중의 BC-819/in vivo-jetPEI^® 조성물이다.
도 3은 본원에 기재된 표준 방법 및 역방향 방법을 모두 이용해 제조된 PEI/BC-819 조성물의 입자들의 부피 대비 크기 분포를 나타내는 그래프이다.
도 4는 본원에 기재된 표준 방법 및 역방향 방법을 모두 이용해 제조된 PEI/BC-819 조성물의 입자들의 제타 퍼텐셜 분포를 나타내는 그래프이다.
도 5는 하기 기재된 실시예 3에 기재된 분광계 시험의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6은 하기 기재된 실시예 3의 방법을 이용한 추가 시료의 전기영동 결과를 제시한다. 레인 1은 래더이고; 레인 2는 BC-819 플라스미드이고; 레인 3은 글루코오스 용액 중의 조성물(표준 프로토콜)이고; 레인 4는 트레할로오스 중의 조성물(역방향 프로토콜)이고; 레인 5는 재수화 후 동결건조된 폴리플렉스(재건된 조성물)이고; 레인 6은 트레할로오스 용액 중의 조성물이다.
도 7a 내지 b는 글루코오스 조성물(도 7a) 및 트레할로오스 조성물(도 7b)의 외양을 나타내는 TEM 도면이다.
도 8은 조성물 석출 후 시료를 나타내는 TEM 도면이다.
도 9a 내지 b는 투과 전자현미경(TEM)의 결과를 나타내는 도면이다.
도 10은 5% 글루코오스 대조군과 비교해 대상 선행기술 조성물 또는 재건된 동결건조 조성물의 3 회 주사 후 누드 마우스에서 HCT-116 세포의 종양 진행을 나타내는 그래프이다.

본 발명을 기재한 바, 하기 실시예는 한정이 아닌 설명의 수단으로 제공된다.

실시예

실시예 1: 현존 폴리플렉스 제조 방법

현존 폴리플렉스 제조 방법에서, 플라스미드(BC-819) 및 양이온성 중합체(PEI)를 두 구성요소로서 따로 공급한다. BC-819(선행기술에서 DTA-H19로 공지되었음)는 4 mg/mL의 농도로 5.3 mL을 포함하는 바이알에 제공되고, 폴리에틸렌이민(PEI)은 150 mM 멸균 용액 2.6 mL을 포함하는 바이알에 제공된다.

실시예 2: 동결건조 프로토콜

본 프로토콜의 목적은 BC-819 플라스미드 및 in vivo -jetPEI^®(폴리에틸렌이민)을 포함하는 대상 동결건조 조성물을 이용한 즉석용품을 제조하는 것이다. 본 프로토콜에서, 관심대상 BC-819/in vivo -jetPEI^®조성물은 실제로 환자의 침대 곁에서 제조되었다.

중요한 점은, 프로토콜 제법에서의 임의의 일탈이 치료 결과에 영향을 줄 수 있는 열악한 대상 조성물 품질을 제공할 수 있다는 사실이다.

이러한 동결건조 대상 조성물의 이용은 치료 품질 일탈 위험을 줄일 것이다.

재료 및 설비:

재료

설비

안전 필수요건

이 과정을 실행할 때 라텍스 또는 니트릴 장갑 및 클린 랩 코트를 반드시 착용해야 한다. 시험에 필요한 일부 물질들은 잠재적으로 생물독성일 수 있으며, 적절하게 처리되어야 한다.

과정:

시험관내 세포 배양에 사용하기 위해 제조되는 모든 용액들은 멸균 조건 하 층류 후드에서 제조되어야 한다.

1. 제조

a. BC-819의 바이알 1 개 및 in vivo-jetPEI^®의 바이알 1 개를 해동한다.

b. 2.5 ml의 BC-819를 10 ml 5% 트레할로오스 용액과 함께 50 ml 폴리프로필렌 관에서 혼합한다.

c. 1.2 ml의 in vivo -jetPEI^®를 11.3 ml 5% 트레할로오스 용액과 125 ml 폴리프로필렌 컵에서 혼합하고, 교반기를 첨가한다.

d. in vivo -jetPEI^®/트레할로오스 용액을 포함하고 있는 컵을 자석 플레이트 상에 놓고 전원을 켠다.

e. BC-819/트레할로오스 용액을 in vivo -jetPEI^®/트레할로오스 용액에 2 ml/분의 속도로 점적한다.

f. 자석 플레이트 상에서 추가로 3 분 동안 대상 조성물이 형성하도록 한다.

g. 용액을 동결건조용 유리용기에 옮긴다.

h. 생성된 대상 조성물을 -20±5℃ 냉동고에 48 시간 동안 옮겨둔다.

i. 병들을 얼음 충전 플라스틱 용기로 옮긴다.

j. 병을 동결건조기에 연결하고, 얼음을 다시 새롭게 넣으면서 72 시간 동안 전원을 켠다.

k. 재건시까지 데시케이터에서 수득한 전원을 유지한다.

2. 25 ml의 이차증류수(DDW)를 첨가해 재건한다. 재건된 용액은 임의의 석출을 나타내지 않는다. 외양은 약간 유백색이다. 재건된 용액은 강도 검정에 대해 체크했다(도 1a 및 1b 참조).

실시예 3: 안정화된 대상 BC819 플라스미드-폴리에틸렌이민 조성물의 개발

재료:

BC-819는 선행기술에 기재된 바와 같이 제조되었으며(문헌[Ohana et al., International Journal of Cancer 98(5) (2002) 645-650]; [Ohana et al., The Journal of Gene Medicine 7(3) (2005) 366-374] 참조), Altheas facilities 사(미국 San Diego 소재)에서 대량으로 제조했다. In vivo-jetPEI^®은 Polyplus 사(프랑스 Strasbourg 소재)에서 구매했다.

100 ml 유리 바이알, 브로모부틸 스토퍼 및 실러는 Schott 사(독일)에서 구매했다.

방법:

소규모 대상 제제의 조성:

TE 완충액 중 5 ml의 4 mg/ml BC-819 용액을 5% 트레할로오스 용액 20 ml에 첨가했다.

2.4 ml의 in vivo-jetPEI^®를 22.6 ml의 5% 트레할로오스 용액에 첨가했다. 이어서, 모든 구성성분들의 완전한 균질화를 위해 교반하면서 플라스미드 용액을 PEI 용액에 첨가했다. 용액을 실온에서 1 시간 미만으로 인큐베이션했다. 이런 방식으로, 비율 N/P=6(LPEI 질소 (N) 대 DNA 포스페이트 (P)의 몰비)로 in vivo-jetPEI^®와 복합체를 형성한 0.4 mg/ml DNA의 용액 50 ml를 수득했다. 표시된 폴리플렉스 농도는 시료의 플라스미드 DNA 농도를 가리킨다.

중간 규모 대상 제제의 조성:

TE 완충액 중 4 mg/ml BC-819 용액 100 ml를 400 ml의 5% 트레할로오스 용액에 첨가했다. 48 ml의 in vivo-jetPEI^®를 452 ml의 5% 트레할로오스 용액에 첨가했다. 이어서, 모든 구성성분들의 완전한 균질화를 위해 교반하면서 플라스미드 용액을 PEI 용액에 첨가했다. 용액을 실온에서 1 시간 미만 동안 인큐베이션했다. 이런 방식으로, 비율 N/P=6(LPEI 질소 (N) 대 DNA 포스페이트 (P)의 몰비)로 in vivo-jetPEI^®와 복합체를 형성한 0.4 mg/ml DNA의 용액 1000 ml를 수득했다. 표시된 폴리플렉스 농도는 시료의 플라스미드 DNA 농도를 가리킨다.

폴리플렉스 용액을 바이알에 충전시키고, 하기 기재된 바와 같이 동결건조시켰다.

용액은 표준 프로토콜의 역순으로 제조했다. 그러한 역방향 폴리플렉스 제조 프로토콜은 임의의 기기 개발을 필요로 하지 않으며, 임의의 공업용 설비에서 용이하게 규모를 키울 수 있다.

동결건조:

대상 용액의 예비-동결건조된 조성물을 상기 기재된 바와 같이 새롭게 제조하여, 냉동 건조 공정용의 100 ml 바이알에 옮겼다.

병 시료들은 4 시간 이상 동안 -45℃에서의 냉동 단계, 및 41 시간 이상 동안 25℃에서의 1차 건조 및 8 시간 이상 동안의 2차 건조 단계(건조는 모두 0.150 mb의 압력 하에)를 포함하는, 실험실 냉동 건조기 LyoBeta 25에서의 냉동 건조 순환을 거쳤다.

입자 크기 결정:

시료들의 z-평균 입자 직경을 Malvern instruments 사(독일 Herrenberg 소재)의 제타사이저(나노-에스)를 이용해 각도 180°로 파장 633 mm으로 25℃(점도, 굴절율)에서 측정했다.

제타 퍼텐셜 결정:

시료들의 제타 퍼텐셜을 Malvern instruments 사(독일 Herrenberg 소재)의 제타사이저(나노-에스)를 이용해 결정했다.

분광계/탁도계:

나노드롭(ThermoScientific nanodrop2000 분광계)을 이용해 시험을 수행했다: 시료를 260 nm에서 체크해 용액 중의 DNA 농도를 평가하고, 600 nm에서는 용액의 탁도를 평가했다.

용액의 스펙트럼을 200 nm 내지 400 nm에서 전개했다(도 5 참조).

전기영동 겔:

시료를 1% 아가로스 겔에 로오딩하여 1 시간 동안 100 mV에서 전개시켰다. 그러한 시험으로 in vivo-jetPEI^®와 복합체를 형성하지 않거나 임의의 분해가 없는 DNA 플라스미드를 인식한다(도 6 참조).

TEM(형태 및 크기 또는 원자력 현미경):

시료를 Formvar 코팅된 구리 격자계에 흡착시켰다. 격자계를 1%(w/v) 우라닐 아세테이트로 염색하고, 공기-건조시켰다. 시료를 MegaView II CCD 카메라 및 Analysis 버젼 3.0 소프트웨어(SoftImaging System GmbH사, 독일 M star 소재)가 장착된 Tecnai 12 TEM 100kV (Phillips 사, 네덜란드 Eindhoven 소재)로 관찰했다.

시료를 체크해 용액 중 또는 건조된 제품 중 폴리플렉스의 형태를 평가했다.

용액의 pH:

용액의 pH를 pHmeter(스위스 mettler Toledo 사)를 이용해 체크했다.

삼투압측정:

시료의 삼투압측정은 fiske^®micro-osmometer model 201(Advanced Instruments, Inc. Norwood, MA)를 이용해 시험했다.

형질주입:

함수량/ LOD :

생체내 강도 평가:

안정성:

결과:

그의 본래 부피만큼 여과된 이차증류수(DDW)로 재수화시 바로 용해시키고 5 분 동안 인큐베이션한 시료를 후속 시험에 이용했다.

도 3에 나타낸 바와 같이, 동결건조 후 수득되는 본 발명의 조성물은 트레할로오스 또는 글루코오스 용액으로 제조된 새로운 대상 조성물과 유의한 차이를 나타내지 않는다. 새로 제조시, 글루코오스 용액은 50 nm 내지 240 nm의 범위의 크기를 나타냈다.

분광계:

하기 표 9 및 도 5에 나타낸 바와 같이, 재수화 용액 중의 DNA 농도는 트레할로오스 또는 글루코오스 중의 새로운 제조된 용액과 비교시 유의한 차이를 나타내지 않는다.

TEM (형태 및 크기 또는 원자력 현미경):

관찰된 시료는 글루코오스 또는 트레할로오스 중에 제조시 차이를 나타내지 않는다(도 7a 내지 7b 참조). 도 8은 석출 후 시료를 나타낸다.

용액의 pH:

동결건조 이전 또는 이후에 5% 글루코오스 또는 트레할로오스 중에 제조된 모든 시료들은 pH 3.0 정도였다.

삼투압측정:

형질주입:

함수량/ LOD :

첫 번째 순환 후 건조된 제품에서 시험된 함수량은 2.4%였다.

생체내 강도 평가:

안정성:

결론:

결론적으로, 본 연구의 결과들은 상대적으로 높은 농도에서의 BC-819/in vivo-jetPEI^® 폴리플렉스가 공업 규모로 용이하게 이전될 수 있는 기법을 이용해 대규모로 제조될 수 있음을 입증했다.

제조된 본 발명의 대상 조성물의 품질은 추가적인 부형제 없이 BC-819/in vivo-jetPEI^®의 동결건조를 가능케 한다.

예비적인 결과는 동결건조된 폴리플렉스가 본 발명의 조성물의 필요한 특징들을 유지하고, 추가적인 장점들을 갖고 침대 곁에서 제조할 수 있게 해 준다: 5℃에서 2 주 동안 유지한 건조된 제품은 재수화 후 반복가능한 폴리플렉스 크기, 반복가능한 제타 퍼텐셜 및 안정적인 제품을 나타내었다.

따라서, 대상 조성물은 재건을 위한 즉석용 동결건조된 분말로서 임상 연구 분야에 제공될 수 있다. 이러한 신규 제형물은 임상적 용도를 위해 재현가능한 투여를 보장한다.

실시예 4: 상이한 용액들의 안정성 시험

특정한 예정된 시간 간격(즉, 제조/재건 후 1 시간, 3 시간, 3 일, 1 주)으로 상이한 용액들의 안정성 시험을 위한 실험을 완료했다. 구체적으로, 세 가지 복합체 용액(글루코오스 중 5%(선행기술 제제), 새롭게 제조된 트레할로오스 중(예비동결건조물(역 제조 방법)), 및 동결건조물로부터 재건된 트레할로오스 중(10 ml IV 주사용수 중 재건)을 시험하고, 하기 파라미터에 대해 비교했다: 나노사이저 (nanosizer), 제타 퍼텐셜, 삼투압측정기, pH 측정기, 네거티브 염색과 함께 한 투과 전자 현미경(TEM), 나노드롭-DNA 농도, 600 nm에서의 탁도, 및 겔 전기영동.

그러한 시험들에 추가하여, 하기 시험들도 건조시킨 제품 상에서 수행될 것이다: 주사 전자 현미경(SEM), 원자력 현미경(AFM), Karl Fisher, Cryo-TEM, 및 x-선.

외양

선행기술 제제(글루코오스 시료)는 실온에서 3 시간 후 황색으로 변했으며, 예비동결건조물(트레할로오스 중의 역 공정) 및 재건된 동결건조된 제품은 외양에서 변화를 나타내지 않았다.

TEM

투과 전자 현미경(TEM)의 결과들을 도 9a에 제시한다. 첫 번째 중의 세 도면은 상이한 시점에서 표준 제조에 따라 제조된 복합체(소형 암점)를 나타낸다. 1 주 후, 더 적은 암점이 나타났고, 이는 복합체 분해를 나타낼 수 있다.

두 번째 줄의 세 도면은 세 개의 시점에서의 예비-동결건조된 시료(역방향 제조)를 나타낸다. 암점에서의 감소는 관찰되지 않는다.

최종적으로, 마지막의 세 도면은 3 개의 시점에서의 재건품을 나타낸다. 다시금 암점에서의 감소는 관찰되지 않는다.

도 9b는 트레할로오스 중의 침전물 복합체를 제시한다.

pH 측정

하기 표 11는 관찰된 pH 값들의 범위를 나타낸다:

이러한 결과들은 용액들 및 다양한 시간 간격 사이에 pH에 있어서 변화가 없음을 나타낸다.

삼투압( mosm /kg)

삼투압은 액체 유래의 고체 입자들의 농도 평가를 위해 측정된다. 하기 표 12는 관찰된 값의 범위를 나타낸다.

상기 결과들은 트레할로오스 중의 동결건조물 및 신선한 용액 사이에 차이가 전혀 관찰되지 않음을 나타낸다. 글루코오스 중의 복합체는 더 높은 삼투압을 나타낸다. 방광에 투여시 그러한 차이의 영향을 검사하고 이해하기 위한 실험들이 수행될 것이다.

나노크기(d.nm)

DLS 방법은 입자 크기 설정을 위한 구성요소들의 점도 및 굴절율을 고려한다. 하기 표 14는 관찰된 값의 범위(nm)를 나타낸다.

이들 결과들은 각 용액에 대해 입자 크기에 있어서 시간이 경과해도 유의한 변화가 없음을 나타낸다.

제타 퍼텐셜(mV)

제타 퍼텐셜은 콜로이드성 분산액에서의 계면동전위(electrokinetic potential)이며, 계의 안정성의 지표이다. 하기 표 15는 관찰된 값의 범위를 나타낸다.

이들 결과들은 용액이 측정된 기간에 걸쳐 안정성을 나타냈고, 체크한 시료들 사이에 차이가 없음을 나타낸다.

DNA 농도(ng/ml)

하기 표 17은 관찰된 값의 범위를 나타낸다.

이들 결과들은 DNA 농도가 시간이 경과해도 정확한 범위에 잔류함을 나타낸다. 감소는 전혀 관찰되지 않았다.

탁도(세포/ml)

하기의 표 18은 관찰된 값의 범위를 나타낸다(600 nm에서의 흡광도).

시간이 흘러도 용액에서 탁도는 측정불가했다. 추가 실험을 수행하여 탁도를 측정할 것이다.

250 nm 내지 600 nm에서의 스펙트럼

관찰 시간 경과시, 글루코오스에서 제조된 복합체는 380 nm 부근(바이올렛)에서 흡광을 나타냈다. 추가 실험을 수행하여 그러한 흡광을 유발한 잔류 화합물이 무엇인지 결정할 것이다.

실시예 5: 생체내 시험

이백만개의 HCT-116 세포를 무흉샘 누드마우스(athymic nude mice)의 등에 주입했다. 종양이 치료할 크기에 도달할 때, 마우스에게 글루코오스 5% (대조군)에 대비되도록 하여 선행기술 또는 재건된 시료 주입을 3 회 수용하도록 했다. 결과를 도 10에 나타낸다.

Claims (92)

1. 핵산, 양이온성 중합체 및 탄수화물 용액을 함유하는 조성물로서, 상기 핵산 및 양이온성 중합체가 복합체를 형성하며, 탄수화물 대 핵산-중합체 복합체의 w/w 비율이 50 내지 1,000인 조성물.
2. 제1항에 있어서, 예비-동결건조 또는 동결건조된 형태인 조성물.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 복합체는 하나 이상의 핵산 및 하나 이상의 양이온성 중합체를 함유하는 나노입자의 형태인 조성물.
4. 제3항에 있어서, 상기 나노입자 크기는 약 40 nm 내지 약 90 nm인 조성물.
5. 제1항에 있어서, 상기 비율은 500 미만인 조성물.
6. 제1항에 있어서, 상기 비율은 250 미만인 조성물.
7. 제1항에 있어서, 하나 이상의 핵산은 하나 이상의 핵산 함유 물질인 조성물.
8. 제 1 항에 있어서, 상기 핵산은 DNA 또는 RNA인 조성물.
9. 제1항에 있어서, 상기 핵산은 DNA 또는 RNA의 염기 유사체인 조성물.
10. 제1항에 있어서, 염기 유사체는 4-아세틸시토신, 8-히드록시-N6-메틸아데노신, 아지리디닐시토신, 슈도 이소시토신, 5-(카르복시히드록실-메틸)우라실, 5-플루오로우라실, 5-브로모우라실, 5-카르복시메틸아미노메틸-2-티오우라실, 5-카르복시메틸아미노메틸우라실, 디히드로 우라실, 이노신, N6-이소펜테닐아데닌, 1-메틸아데닌, 1-메틸슈도우라실, 1-메틸구아닌, 1-메틸이노신, 2,2-디메틸구아닌, 2-메틸아데닌, 2-메틸 구아닌, 3-메틸시토신, 5-메틸시토신, N6-메틸아데닌, 7-메틸구아닌, 5-메틸아미노메틸우라실, 5-메톡시-아미노메틸-2-티오우라실, 5'-메톡시카르보닐 메틸우라실, 5-메톡시우라실, 2-메틸티오-N6-이소펜테닐아데닌, 우라실-5-옥시아세트산 메틸에스테르, 우라실-5-옥시아세트산, 옥시부톡소신, 슈도우라실, 큐어신(queosine), 2-티오시토신, 5-메틸-2-티오우라실, 2-티오우라실, 4-티오우라실, 5-메틸우라실, 우라실-5-옥시아세트산 및 2,6-디아미노퓨린으로부터 선택되는 조성물.
11. 제1항에 있어서, 상기 핵산은 플라스미드인 조성물.
12. 제11항에 있어서, 상기 플라스미드 핵산은 DNA, shRNA, siRNA 및 올리고뉴클레오티드로부터 선택되는 것인 조성물.
13. 제11항에 있어서, 상기 플라스미드는 H19 조절 서열을 갖고 있는 것인 조성물.
14. 제13항에 있어서, 상기 H19 서열은 H19 프로모터, H19 인핸서, 및 H19 프로모터 및 H19 인핸서의 두 가지 모두로부터 선택되는 것인 조성물.
15. 제14항에 있어서, 상기 H19 조절 서열은 H19 프로모터 및 인핸서를 포함하고, 이종성 서열은 β-갈락토시다아제, 디프테리아 독소, 슈도모나스 독소, 리신, 콜레라 독소, 망막아세포종 유전자, p53, 단순포진 티미딘 키나아제, 대상포진 티미딘 키나아제, 시토신 디아미나아제, 니트로리덕타아제, 시토크롬 p-450 2B1, 티미딘 포스포릴라아제, 퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라아제, 알칼리성 포스파타아제, 카르복시펩티다아제 A 및 G2, 리나마라아제, β-락타마아제 및 잔틴 옥시다아제로부터 선택되는 단백질을 인코드하는 것인 조성물.
16. 제13항에 있어서, 상기 조절 서열은 IGF-2 P4 프로모터 또는 IGF-2 P3 프로모터인 조성물.
17. 제13항에 있어서, 상기 H19 인핸서는 이종성 서열에 대해 3'에 존재하는 것인 조성물.
18. 제17항에 있어서, 상기 이종성 서열은 β-갈락토시다아제; 디프테리아 독소; 슈도모나스 독소; 리신; 콜레라 독소; 망막아세포종 유전자; p53; 단순포진 티미딘 키나아제; 대상포진 티미딘 키나아제; 시토신 디아미나아제; 니트로리덕타아제; 시토크롬 p-450 2B1; 티미딘 포스포릴라아제; 퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라아제; 알칼리성 포스파타아제; 카르복시펩티다아제 A 및 G2; 리나마라아제; β-락타마아제; 잔틴 옥시다아제에 대한 코딩 서열로부터; 및 cdk2, cdk8, cdk21, cdc25A, 싸이클린 D1, 싸이클린 E, 싸이클린 A, cdk4, 발암유전자 형태의 p53, c-fos, c-jun, Kr-ras 및 Her2/neu로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자를 인코딩하는 서열에 특이적으로 혼성화하는 안티센스서열로부터 선택되고, 상기 이종성 서열은 또한 cdk2, cdk8, cdk21, cdc25A, 싸이클린 D1, 싸이클린 E, 싸이클린 A, cdk4, 발암유전자 형태의 p53, c-fos, c-jun, Kr-ras 및 Her2/neu로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자를 인코딩하는 RNA를 특이적으로 절단하는 리보자임을 인코드할 수 있는 것인 조성물.
19. 제1항에 있어서, 하나 이상의 탄수화물은 일반 화학식 (CH₂O)_n을 갖는 화합물이고, 당류, 다당류 및 올리고당류로부터 선택되는 것인 조성물.
20. 제19항에 있어서, 상기 하나 이상의 탄수화물은 단당류, 이당류, 삼당류, 올리고당류 및 다당류로부터 선택되는 것인 조성물.
21. 제20항에 있어서, 상기 하나 이상의 탄수화물은 글리코겐, 셀룰로오스 및 전분으로부터 선택되는 것인 조성물.
22. 제19항에 있어서, 상기 하나 이상의 탄수화물은 단당류로부터 선택되는 것인 조성물.
23. 제22항에 있어서, 상기 단당류는 글루코오스, 프룩토오스, 만노오스, 자일로오스, 아라비노오스 및 갈락토오스로부터 선택되는 것인 조성물.
24. 제19항에 있어서, 상기 하나 이상의 탄수화물은 이당류로부터 선택되는 것인 조성물.
25. 제24항에 있어서, 상기 이당류는 트레할로오스, 수크로오스, 셀로비오스, 말토오스 및 락토오스로부터 선택되는 것인 조성물.
26. 제19항에 있어서, 상기 하나 이상의 탄수화물은 올리고당류로부터 선택되는 것인 조성물.
27. 제26항에 있어서, 상기 올리고당은 라피노오스, 스타키오스 및 말토덱스트린으로부터 선택되는 것인 조성물.
28. 제19항에 있어서, 상기 하나 이상의 탄수화물은 트레할로오스, 글루코오스, 수크로오스, 락토오스, 만니톨, 소르비톨, 라피노오스, PVP 및 덱스트로오스로부터 선택되는 것인 조성물.
29. 제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 탄수화물은 글루코오스 또는 수크로오스가 아닌 것인 조성물.
30. 제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 탄수화물은 단당류 및 이당류로부터 선택되는 것인 조성물.
31. 제1항 또는 제19항 또는 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 탄수화물은 트레할로오스인 조성물.
32. 제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 양이온성 중합체는 친수성 또는 양친매성 양이온 중합체인 조성물.
33. 제32항에 있어서, 상기 양이온성 중합체는 1차, 2차, 3차 및/또는 4차 아민기를 포함하는 중합체로부터 선택되는 것인 조성물.
34. 제33항에 있어서, 상기 하나 이상의 양이온성 중합체는 폴리에틸렌이민, 폴리알릴아민, 폴리에테르아민, 폴리비닐피리딘, 그 위에 양으로 하전된 관능기를 가진 다당류, 폴리아미노산, 폴리-L-히스티딘, 폴리-D-라이신, 폴리-DL-라이신, 폴리-L-라이신, 폴리-e-CBZ-0-라이신, 폴리-e-CBZ-DL-라이신, 폴리-e-CBZ-L-라이신, 폴리-OL-오르니틴, 폴리-L-오르니틴, 폴리-DELTA-CBZ-DL-오르니틴, 폴리-L-아르기닌, 폴리-DL-알라닌-폴리-L-라이신, 폴리(-L-히스티딘, L-글루탐산)-폴리-DL-알라닌-폴리-L-라이신, 폴리(L-페닐알라닌, L-글루탐산)-폴리-DL-알라닌-폴리-L-라이신, 폴리(L-타이로신, L-글루탐산)-폴리-DL-알라닌-폴리-L-라이신, L-아르기닌의 트립토판과의 공중합체, 타이로신, 또는 세린, D-글루탐산의 D-라이신과의 공중합체, L-글루탐산의 라이신과의 공중합체, 오르니틴, 또는 라이신 및 오르니틴의 혼합물 및 폴리-(L-글루탐산)으로부터 선택되는 것인 조성물.
35. 제34항에 있어서, 상기 하나 이상의 양이온성 중합체는 폴리에틸렌이민(PEI)인 조성물.
36. 제35항에 있어서, 상기 하나 이상의 양이온성 중합체는 선형 폴리에틸렌이민(PEI)인 조성물.
37. 제32항에 있어서, PEI의 아민기의 몰 대 핵산의 인산기의 몰의 비율은 2 내지 10인 조성물.
38. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 하나 이상의 핵산 및 하나 이상의 양이온성 중합체 사이에서 복합체 형성을 허용하는 조건 하에 핵산/탄수화물 용액을 양이온성 중합체/탄수화물 용액에 첨가함으로써 제조되는 것인 조성물.
39. 제38항에 있어서, 상기 핵산/탄수화물 용액 및 양이온성 중합체/탄수화물 용액은 따로 독립적으로 제조되는 것인 조성물.
40. 제38항에 있어서, 상기 제조 공정은
    (a) 하나 이상의 핵산 및 하나 이상의 탄수화물의 용액을 수득하는 단계;
    (b) 하나 이상의 양이온성 중합체 및 하나 이상의 탄수화물의 용액을 수득하는 단계;
    (c) 하나 이상의 핵산 및 하나 이상의 양이온성 중합체 사이에서 복합체 형성을 허용하는 조건 하에 핵산/탄수화물 용액을 양이온성 중합체/탄수화물 용액에 첨가하는 단계; 및
    (d) 선택적으로, 조합된 핵산/양이온성 중합체/탄수화물 용액을 동결건조하여 동결건조된 조성물을 형성하는 단계
    를 포함하는 것인 조성물.
41. 제40항에 있어서, 상기 공정은 핵산/탄수화물 용액을 형성하는 단계 및 양이온성 중합체/탄수화물 용액을 형성하는 단계를 추가로 포함하는 것인 조성물.
42. 제40항에 있어서, 상기 공정은
    (a) 일정 분량의 하나 이상의 핵산을 제 1 분량의 하나 이상의 탄수화물과 혼합하여 핵산/탄수화물 용액을 형성하는 단계; 및
    (b) 일정 분량의 하나 이상의 양이온성 중합체를 제 2 분량의 하나 이상의 탄수화물과 혼합하여 양이온성 중합체/탄수화물 용액을 형성하는 단계
    를 추가로 포함하는 것인 조성물.
43. 제38항에 있어서, 상기 핵산/탄수화물 용액의 양이온성 중합체/탄수화물 용액으로의 첨가는 실온에서 실시되는 것인 조성물.
44. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 동결건조되어 있는 조성물.
45. 하나 이상의 핵산, 하나 이상의 양이온성 중합체, 및 하나 이상의 탄수화물을 함유하는 조성물의 제조 방법으로서, 하나 이상의 핵산 및 하나 이상의 양이온성 중합체 사이에서 복합체 형성을 허용하는 조건 하에 핵산/탄수화물 용액을 양이온성 중합체/탄수화물 용액에 첨가하는 단계를 포함하는 방법.
46. 제45항에 있어서, 상기 핵산/탄수화물 용액 및 양이온성 중합체/탄수화물 용액은 각각 따로 독립적으로 제조되는 것인 방법.
47. 제45항에 있어서,
    (a) 하나 이상의 핵산 및 하나 이상의 탄수화물의 용액을 수득하는 단계;
    (b) 하나 이상의 양이온성 중합체 및 하나 이상의 탄수화물의 용액을 수득하는 단계;
    (c) 하나 이상의 핵산 및 하나 이상의 양이온성 중합체 사이에서 복합체 형성을 허용하는 조건 하에 핵산/탄수화물 용액을 양이온성 중합체/탄수화물 용액에 첨가하는 단계; 및
    (d) 선택적으로, 조합된 핵산/양이온성 중합체/탄수화물 용액을 동결건조하여 동결건조된 조성물을 형성하는 단계
    를 포함하는 방법.
48. 제45항에 있어서, 상기 핵산/탄수화물 용액을 형성하는 단계 및 양이온성 중합체/탄수화물 용액을 형성하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
49. 제45항에 있어서,
    (a) 일정 분량의 하나 이상의 핵산을 제 1 분량의 하나 이상의 탄수화물과 혼합하여 핵산/탄수화물 용액을 형성하는 단계; 및
    (b) 일정 분량의 하나 이상의 양이온성 중합체를 제 2 분량의 하나 이상의 탄수화물과 혼합하여 양이온성 중합체/탄수화물 용액을 형성하는 단계
    를 포함하는 방법.
50. 제49항에 있어서, 상기 하나 이상의 핵산 및 하나 이상의 양이온성 중합체 사이의 복합체는 물질 나노입자로 형성되고, 각 나노입자 크기는 나노미터인 방법.
51. 제50항에 있어서, 각 나노입자는 하나 이상의 핵산 및 하나 이상의 양이온성 중합체를 함유하는 것인 방법.
52. 제51항에 있어서, 상기 나노입자의 크기는 약 40 nm 내지 약 90 nm인 방법.
53. 제45항에 있어서, 상기 핵산/탄수화물 용액의 양이온성 중합체/탄수화물 용액으로의 첨가는 실온에서 실시되는 것인 방법.
54. 제53항에 있어서, 상기 첨가는 일정한 속도 및 일정한 혼합 하에 존재하는 것인 방법.
55. 제45항에 있어서, 상기 하나 이상의 탄수화물 대 하나 이상의 핵산의 비율은 1,000 미만 또는 950 미만 또는 900 미만 또는 850 미만 또는 800 미만 또는 750 미만 또는 700 미만 또는 650 미만 또는 600 미만 또는 550 미만 또는 500 미만 또는 450 미만 또는 400 미만 또는 350 미만 또는 300 미만 또는 250 미만 또는 200 미만 또는 150 미만 또는 100 미만인 방법.
56. 제55항에 있어서, 상기 비율은 500 미만인 방법.
57. 제55항에 있어서, 상기 비율은 250 미만인 방법.
58. 제45항에 있어서, 상기 조성물을 동결건조하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
59. 제45항에 있어서, 하나 이상의 핵산은 하나 이상의 핵산 포함 물질인 방법.
60. 제59항에 있어서, 상기 핵산은 DNA 또는 RNA인 방법.
61. 제59항에 있어서, 상기 핵산은 DNA 또는 RNA의 염기 유사체인 방법.
62. 제61항에 있어서, 상기 염기 유사체는 4-아세틸시토신, 8-히드록시-N6-메틸아데노신, 아지리디닐시토신, 슈도이소시토신, 5-(카르복시히드록실-메틸)우라실, 5-플루오로우라실, 5-브로모우라실, 5-카르복시메틸아미노메틸-2-티오우라실, 5-카르복시메틸아미노메틸우라실, 디히드로우라실, 이노신, N6-이소펜테닐아데닌, 1-메틸아데닌, 1-메틸슈도우라실, 1-메틸구아닌, 1-메틸이노신, 2,2-디메틸구아닌, 2-메틸아데닌, 2-메틸구아닌, 3-메틸시토신, 5-메틸시토신, N6-메틸아데닌, 7-메틸구아닌, 5-메틸아미노메틸우라실, 5-메톡시-아미노메틸-2-티오우라실, 5'-메톡시카르보닐메틸우라실, 5-메톡시우라실, 2-메틸티오-N6-이소펜테닐아데닌, 우라실-5-옥시아세트산 메틸에스테르, 우라실-5-옥시아세트산, 옥시부톡소신, 슈도우라실, 큐어신, 2-티오시토신, 5-메틸-2-티오우라실, 2-티오우라실, 4-티오우라실, 5-메틸우라실, 우라실-5-옥시아세트산 및 2,6-디아미노퓨린으로부터 선택되는 것인 방법.
63. 제45항에 있어서, 상기 핵산은 플라스미드인 방법.
64. 제63항에 있어서, 상기 플라스미드 핵산은 DNA, shRNA, siRNA 및 올리고뉴클레오티드로부터 선택되는 것인 방법.
65. 제63항에 있어서, 상기 플라스미드는 H19 조절 서열을 갖고 있는 것인 방법.
66. 제65항에 있어서, 상기 H19 서열은 H19 프로모터, H19 인핸서, 및 H19 프로모터 및 H19 인핸서의 두 가지 모두로부터 선택되는 것인 방법.
67. 제65항에 있어서, 상기 H19 조절 서열은 H19 프로모터 및 인핸서를 포함하고, 상기 이종성 서열이 β-갈락토시다아제, 디프테리아 독소, 슈도모나스 독소, 리신, 콜레라 독소, 망막아세포종 유전자, p53, 단순포진 티미딘 키나아제, 대상포진 티미딘 키나아제, 시토신 디아미나아제, 니트로리덕타아제, 시토크롬 p-450 2B1, 티미딘 포스포릴라아제, 퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라아제, 알칼리성 포스파타아제, 카르복시펩티다아제 A 및 G2, 리나마라아제, β-락타마아제, 및 잔틴 옥시다아제로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질을 인코드하는 것인 방법.
68. 제65항에 있어서, 상기 조절 서열은 IGF-2 P4 프로모터 또는 IGF-2 P3 프로모터인 방법.
69. 제65항에 있어서, 상기 H19 인핸서는 상기 이종성 서열에 대해 3'에 존재하는 것인 방법.
70. 제69항에 있어서, 상기 이종성 서열은 β-갈락토시다아제; 디프테리아 독소; 슈도모나스 독소; 리신; 콜레라 독소; 망막아세포종 유전자; p53; 단순포진 티미딘 키나아제; 대상포진 티미딘 키나아제; 시토신 디아미나아제; 니트로리덕타아제; 시토크롬 p-450 2B1; 티미딘 포스포릴라아제; 퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라아제; 알칼리성 포스파타아제; 카르복시펩티다아제 A 및 G2; 리나마라아제; β-락타마아제; 잔틴 옥시다아제에 대한 코딩 서열; 및 cdk2, cdk8, cdk21, cdc25A, 싸이클린 D1, 싸이클린 E, 싸이클린 A, cdk4, 발암유전자 형태의 p53, c-fos, c-jun, Kr-ras 및 Her2/neu로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자를 인코드하는 서열에 특이적으로 혼성화하는 안티센스 서열로부터 선택되고, 상기 이종성 서열이 또한 cdk2, cdk8, cdk21, cdc25A, 싸이클린 D1, 싸이클린 E, 싸이클린 A, cdk4, 발암유전자 형태의 p53, c-fos, c-jun, Kr-ras 및 Her2/neu로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자를 인코드하는 RNA를 특이적으로 절단하는 리보자임을 인코드할 수 있는 것인 방법.
71. 제45항에 있어서, 하나 이상의 탄수화물은 일반 화학식 (CH₂O)_n을 갖고, 당류, 다당류 및 올리고당류로부터 선택되는 화합물인 방법.
72. 제45항에 있어서, 상기 하나 이상의 탄수화물은 단당류, 이당류, 삼당류, 올리고당류 및 다당류로부터 선택되는 것인 방법.
73. 제72항에 있어서, 상기 하나 이상의 탄수화물은 글리코겐, 셀룰로오스 및 전분으로부터 선택되는 것인 방법.
74. 제45항에 있어서, 상기 하나 이상의 탄수화물은 단당류로부터 선택되는 것인 방법.
75. 제74항에 있어서, 상기 단당류는 글루코오스, 프룩토오스, 만노오스, 자일로오스, 아라비노오스 및 갈락토오스로부터 선택되는 것인 방법.
76. 제45항에 있어서, 상기 하나 이상의 탄수화물은 이당류로부터 선택되는 것인 방법.
77. 제76항에 있어서, 상기 이당류는 트레할로오스, 수크로오스, 셀로비오스, 말토오스 및 락토오스로부터 선택되는 것인 방법.
78. 제45항에 있어서, 상기 하나 이상의 탄수화물은 올리고당류로부터 선택되는 것인 방법.
79. 제78항에 있어서, 상기 올리고당은 라피노오스, 스타키오스 및 말토덱스트린으로부터 선택되는 것인 방법.
80. 제45항에 있어서, 상기 하나 이상의 탄수화물은 트레할로오스, 글루코오스, 수크로오스, 락토오스, 만니톨, 소르비톨, 라피노오스, PVP 및 덱스트로오스로부터 선택되는 것인 방법.
81. 제45항에 있어서, 상기 하나 이상의 탄수화물은 글루코오스 또는 수크로오스가 아닌 것인 방법.
82. 제45항에 있어서, 상기 하나 이상의 탄수화물은 단당류 및 이당류로부터 선택되는 것인 방법.
83. 제82항에 있어서, 상기 하나 이상의 탄수화물은 트레할로오스인 방법.
84. 제45항에 있어서, 상기 하나 이상의 양이온성 중합체는 친수성 또는 양친매성 양이온 중합체인 방법.
85. 제84항에 있어서, 상기 양이온성 중합체는 1차, 2차, 3차 및/또는 4차 아민기를 포함하는 중합체로부터 선택되는 것인 방법.
86. 제85항에 있어서, 상기 하나 이상의 양이온성 중합체는 폴리에틸렌이민, 폴리알릴아민, 폴리에테르아민, 폴리비닐피리딘, 그 위에 양으로 하전된 관능기를 가진 다당류, 폴리아미노산, 폴리-L-히스티딘, 폴리-D-라이신, 폴리-DL-라이신, 폴리-L-라이신, 폴리-e-CBZ-0-라이신, 폴리-e-CBZ-DL-라이신, 폴리-e-CBZ-L-라이신, 폴리-OL-오르니틴, 폴리-L-오르니틴, 폴리-DELTA-CBZ-DL-오르니틴, 폴리-L-아르기닌, 폴리-DL-알라닌-폴리-L-라이신, 폴리(-L-히스티딘, L-글루탐산)-폴리-DL-알라닌-폴리-L-라이신, 폴리(L-페닐알라닌, L-글루탐산)-폴리-DL-알라닌-폴리-L-라이신, 폴리(L-타이로신, L-글루탐산)-폴리-DL-알라닌-폴리-L-라이신, L-아르기닌의 트립토판과의 공중합체, 타이로신, 또는 세린, D-글루탐산의 D-라이신과의 공중합체, L-글루탐산의 라이신과의 공중합체, 오르니틴, 또는 라이신 및 오르니틴의 혼합물 및 폴리-(L-글루탐산)으로부터 선택되는 것인 방법.
87. 제86항에 있어서, 상기 하나 이상의 양이온성 중합체는 폴리에틸렌이민(PEI)인 방법.
88. 제87항에 있어서, 상기 하나 이상의 양이온성 중합체는 선형 폴리에틸렌이민(PEI)인 방법.
89. 제87항에 있어서, 상기 핵산의 인산기의 몰에 대한 PEI의 아민기의 몰 비율은 2 내지 10인 방법.
90. 제45항에 있어서, 상기 하나 이상의 핵산은 플라스미드이고, 상기 하나 이상의 양이온성 중합체는 PEI이고, 상기 하나 이상의 탄수화물은 트레할로오스인 방법.
91. 제90항에 있어서, 상기 하나 이상의 핵산 및 상기 하나 이상의 양이온성 중합체는 복합체를 형성하고, 여기서 탄수화물 대 핵산-중합체 복합체의 w/w 비율은 50 내지 1,000인 방법.
92. 제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 핵산은 플라스미드이고, 상기 하나 이상의 양이온성 중합체는 PEI이고, 상기 하나 이상의 탄수화물은 트레할로오스인 방법.

Images