KR20180006416A - 티로신 키나아제 억제제와 병용하여 egf/egfr 경로를 억제하는 방법 및 조성물 - Google Patents

티로신 키나아제 억제제와 병용하여 egf/egfr 경로를 억제하는 방법 및 조성물 Download PDF

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Abstract

EGF-EGFR 결합(mAb)에 의해 활성화된 경로의 억제를 위해 티로신 키나아제 억제제(TKI)와 항-EGF 항체를 병용하는 유연한 활성 요법을 이러한 치료가 필요한 환자에게 투여하는 것을 포함하는 탈조절된 인간 표피 증식인자 수용체(HER 1/인간 EGFR)에 의해 유도된 암 환자를 치료하는 방법. 항-EGF 항체는 항-EFG인 항체의 투여에 의해 수동적으로 제공되거나 또는 능동 면역화에 의해 생성될 수 있다. 상기 방법은 10∼150mg 범위의 평균 일일 투여에 기초한 연속 요법을 따라 투여된 TKI를 포함하고, 상기 mAb는 1주에 3회, 2회 또는 1회, 2주에 1회, 3주에 1회 또는 한달에 적어도 1회로 반복적으로 치료 유효량을 달성하는 투약 요법에 따른 능동적 또는 수동적 중 어느 하나로 혼합 투여된다.

Description

티로신 키나아제 억제제와 병용하여 EGF/EGFR 경로를 억제하는 방법 및 조성물
본 발명의 실시형태는 특히, 티로신 키나아제 억제제(TKI) 치료에 반응하지 않거나 내성이 생긴 사람에게 있어서의 암 등의 질병 상태를 치료하고 예방하는 방법에 관한 것이다.
비소세포 폐암(NSCLC)은 전세계적으로 암 관련 사망의 주요 원인이고, 치료 및 진단의 최근 발전에도 불구하고 5년 생존율은 ∼16%에 그치고 있다. 이 열악한 결과는 대체로 진단 시에는 후기인 질병 단계, 질병의 강력한 특성 및 전이 정도에 따른 것이다. 현저한 발전이 악성 암세포를 야기하는 게놈 기형을 밝혀내었지만, 현재 이용 가능한 화학 요법은 여전히 만족스럽지 않고, 대다수의 암 진단 환자에 대한 예후가 문제로 남아 있다.
대부분의 화학요법 제제는 악성 표현형의 발달과 관련이 있다고 생각되는 특정 분자 표적에 작용한다. 그러나, 시그널링 경로의 복잡한 네트워크가 세포 증식을 조절하고 대부분의 악성 암이 이러한 경로의 다양한 유전적 기형에 의해 촉진된다. 표준 세포 독성 화학요법에 의한 폐암의 치료가 효력을 위해 최적화되고 있지만, NSCLC 치료법에 대한 보다 최근의 접근법은 NSCLC를 그들의 특유의 종양 유전자 드라이버에 기초한 분자 서브세트로 분류하는 것에 기반한다. NSCLC의 이러한 분자 드라이버는 치료학적으로 특정 종양 유전자에 대한 표적화된 약제에 의해 공격받을 수 있다.
대부분의 종래의 화학요법 약물은 그들의 활동에 있어서 비선택적이었다. 그 것의 적확한 작용 메카니즘은 다양하고 복잡했지만, 일반적으로 대부분의 정상 조직에서보다 악성 종양에서 더욱 일반적인 유사 분열을 행하는 세포를 손상시킴으로서 효력이 발생했다. 표적화된 제제는 암 발생 및 암의 유지에 필요 및 필수적인 단백질, 특히 악성 종양의 무절제한 성장, 혈관 신생, 침윤성 및 전이 특성을 유도하는 효소의 활성화를 조절함으로써 그 효력을 선택하도록 설계된다. 통상, 개선된 차등 활성은 암 환자에 대해 문제가 되는 부작용을 줄여주고, 특히, 오심, 구토 및 골수와 위장관의 세포사를 감소시키고, 종양 세포에 대해서는 효과를 증가시킨다.
암 치료에 있어서 치료적 개입을 위한 유망한 표적 세트는 HER-키나아제 축의 요소를 포함한다. 이들은 예를 들어 전립선, 폐 및 유방의 견고한 상피 종양에서 상위 규제되는 경우가 많고, 아교 모세포종 종양에서도 상위 규제된다. 표피 증식 인자 수용체(EGFR)는 HER-키나아제 축의 요소이고 여러 다른 암 치료법의 개발을 위한 선택의 표적이 되어왔다. 티로신 잔기의 가역적 인산화가 EGFR 경로의 활성화에 요구되므로 EGFR 티로신 키나아제 억제제(EGFR-TKIs)가 이들 치료법 중 하나이다. 즉, EGFR-TKI는 종양 세포 성장 및 분열을 유도하는 세포 시그널링 경로를 유발 및/또는 유지시키는 역할을 하는 세포 표면 수용체를 차단한다. 구체적으로, 상기 억제제는 HER-1로서 언급되는 EGFR 키나아제 도메인을 간섭하는 것으로 여겨진다. 더욱 유망한 EGFR-TKI에는 퀴나졸린, 피리도피리미딘 및 피롤로피리미딘의 3종의 화합물이 있다.
EGFR 특이성 티로신 키나아제 억제제(TKIs)에 대한 임상 연구는 최선의 응답을 가진 서브 세트로서, 기능 획득 EGFR 변종(gain-of-function EGFR mutation)을 지닌 종양의 환자를 식별했음에도 불구하고 많은 NSCLC 환자에게 있어서 표피 증식 인자 수용체(EGFR)가 매우 발현되거나 증폭된다는 것이 확인되었다. 이들 환자는 초기에 EGFR 표적 치료법에 반응하지만, 불행하게도 결국 모두 표적 치료법의 해결하기 어려운 장기간 유효성의 한계로 재발하게 될 것이다. 전반적으로, EGFR 표적 치료법의 진전까지의 평균 시간은 약 8-14개월이다. 환자에게 있어서 EGFR 표적 억제제에 대한 획득 내성의 다수의 메카니즘이 발견되었고 검증되었다.
NSCLC에 대해 임상적으로 사용되는 가장 보편적인 FDA 승인된 TKI 중 2개는 게피트닙(gefitnib: AstraZeneca UK Ltd. 제작; 상품명 IRESSA®); 이하 "IRESSA" 또는 "게피트닙" 및 에를로티닙(erlotinib: Genentech, Inc. 제작; 상품명 TARCEVA®; 이하 "TARCEVA" 또는 에를로티닙); 2개 모두 일부 환자에게서 고무적인 임상 결과를 얻었고 현재 EGFR-mut의 진행성 NSCLC 환자의 1차 치료의 기준으로 사용되고 있다.
이들 화합물을 사용함에 있어서 유의한 한계는 치료받는 사람이 처음 치료에 반응한 후 치료 효과에 내성을 발현하거나 또는 임의의 측정 가능한 정도로도 EGFR-TKI에 반응하지 않을 수 있다는 것이다. 따라서, 상기 화합물은 처음에는 강한 항종양 특성을 발휘할 수 있지만, 암의 치료에서 곧 효능이 감소되거나 전혀 효능이 없을 수 있다. 또한, 종래, 의학적 연구가 상기 내성을 생기게 하는 생체 분자 또는 병리학적 메카니즘을 완전히 증명하지 못했기 때문에, 현재, 이러한 내성을 나타내는 일부 환자는 그들의 질병을 치료하기 위한 치료적 대안이 거의 남아 있지 않다.
EGFR-ATP 결합 친화력을 증가시키는 이차 게이트 키퍼 T790M 돌연변이는 종양이 EGFR 특이성 TKI에 대해 진행되는 환자의 50% 에서 발생한다. 또한, NGCLC 환자의 약 5-15%에 있어서, EGFR 억제제에 의한 치료 후에 MET 증폭이 보고되고 있다. EGFR-T790M 및 MET 증폭된 종양 세포는 EGFR 표적 치료 전에 종양에서 검출될 수 있어, 치료 시에 이들 세포가 선택적으로 강화된다는 것을 시사한다. 또한, EGFR TKI 치료 전에 T790M 또는 증폭된 MET를 HGF 발현으로 검출하는 것은 EGFR 표적 치료에 대한 반응 지속 기간의 감소와 관련된다.
특정 이론에 제한됨이 없이, 돌연변이되지도 않고 증폭되지도 않은 대안적인 수용체 티로신 키나아제가 EGFR 표적 치료에 대한 획득 내성에 기여할 수도 있다고 생각된다. "바이패스 경로(bypass pathways)"라고도 불리는 또 다른 수용체 티로신 키나아제는 EGFR TKI를 포함하는 표적 치료제에 대한 본질적 내성 및 획득 내성 모두의 메카니즘으로서 확인되고 있다. 게이트키퍼 돌연변이의 획득을 통한 내성과 비교하여, 유전자 변형이 없는 뚜렷한 시그널링 경로의 유도를 포함한 획득 내성 메카니즘은 문헌에 거의 기록되어 있지 않다.
수용체-티로신 키나아제 억제제(TKIs)에 의한 치료는 진행성 비소세포 폐암 (NSCLC) 환자에게 있어서, 무진행 생존 기간 및 전체 생존 기간이 개선된다. 그러나, 초기 반응과 유의한 완화에도 불구하고, 2차 내성의 발생은 필연적으로 치료 실패로 이어진다. 게피티닙(gefitinib) 또는 에를로티닙(erlotinip) 등의 티로신 키나아제 억제제의 단일 작용 방식은 일시적인 성공만을 제공할 수 있는 것으로 보인다. 이 내성 문제를 해결하는데 필요한 것은 가까운 장래에 이차적인 EGFR-TKI 내성을 극복하도록 소분자 또는 항체 등의 추가적인 치료제와 TKI의 병용인 것으로 생각된다.
본 발명의 목적은 EGF-EGFR에 의해 활성화된 경로의 억제를 위해 활성 EGF 경로 면역(EGF PTI)과 티로신 키나아제 억제제(TKI)를 병용하기 위한 유연한 활성 요법을 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 탈조절된 인간 표피 증식 인자 수용체(HER/인간 EGFR)에 의해 유도된 암 환자를 치료하는 방법에 관한 것이고, 상기 방법에 있어서, 상기 TKI는 10 내지 50mg 범위의 평균 일일 투여량에 기초한 연속 요법에 따라 투여되고, 상기 EGF PTI는 일주일에 3회, 2회 또는 1회, 2주에 1회, 3주에 1회 또는 적어도 한 달에 1회로 반복되는 치료 유효량을 달성하는 투약 요법에 따라 혼합 투여된다.
본 발명의 다른 목적은 탈조절된 인간 표피 증식 인자 수용체(HER 1/인간 EGFR)에 의해 유도된 비소세포 폐암(NSCLC) 환자를 치료하는 방법에 관한 것이고, 여기서, 상기 환자는 EGFR의 종양 발현 돌연변이형을 갖고, 상기 방법은 티로신 키나아제 억제제(TKI) 및 EGF를 표적으로 하는 능동 면역화를 병용하기 위한 유연한 활성 요법을 그 치료가 필요한 환자에게 투여하는 것을 포함하고, 상기 TKI는 약 10∼150mg 범위의 평균 1일 투여량 및 활성 면역화에 기초한 연속 투약 요법에 따라 투여되고, EGF PTI는 일주일에 3회, 2회 또는 1회, 2주에 1회, 3주에 1회 또는 한달에 적어도 1회로 반복되는 치료 유효량에 따라서 혼합 투여되고, 상기 치료 방법은 TKI 치료에 대한 내성이 생기는 것을 방지한다.
본 발명의 다른 목적은 유효량의 항 EGF 표적 항체를 포함하는 제 1 구획 및 유효량의 TKI를 포함하는 제 2 구획을 포함하는 약제 키트에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 EGF에 대한 면역 반응을 일으키는 유효량의 백신을 포함하는 제 1 구획 및 유효량의 TKI를 포함하는 제 2 구획을 포함하는 약제 키트에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 EGFR에 대한 면역 반응을 일으키는 유효량의 백신을 포함하는 제 1 구획 및 유효량의 TKI를 포함하는 제 2 구획을 포함하는 약제 키트에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 EGF에 대한 면역 반응을 일으키는 백신과의 혼합 투여에 의해 탈조절된 인간 표피 증식 인자 수용체(HER/인간 EGFR)에 의해 유도된 암 환자의 치료 방법에 사용되는 TKI에 관한 것이고, 그 치료가 필요한 환자에게 상기 TKI는 약 10∼150mg 범위의 평균 1일 투여량에 기초한 연속 요법에 따라서 투여되고, EGF에 대한 면역 반응을 일으키는 백신은 1주에 3회, 2회 또는 1회, 2주에 1회, 3주에 1회 또는 한달에 적어도 1회로 반복되는 치료 유효량에 따라서 혼합 투여된다.
본 발명의 또 다른 목적은 EGF에 대해 면역 반응을 일으키는 유효량의 백신을 포함하는 제 1 구획 및 유효량의 TKI를 포함하는 제 2 구획을 포함하는, 탈조절된 인간 표피 증식 인자 수용체(HER/인간 EGFR)에 의해 유도된 암 환자의 치료를 위한 약제 키트의 제조를 위한 TKI의 용도에 관한 것이고, 이러한 치료가 필요한 환자에게 상기 TKI는 약 10∼150mg 범위의 평균 1일 투여량에 기초한 연속 투약 요법에 따라서 투여되고, 상기 백신은 TKI 요법을 개시하기 전에 1주에 3회, 2회 또는 1회, 2주에 1회, 3주에 1회 또는 한달에 적어도 1회로 반복되는 치료 유효량을 평균 주당 투여량의 범위로 하는 투약 요법에 따라서 투여된다.
이하, 본 발명의 실시형태의 비제한적인 예에 의해 언급된 여러 도면을 참조로 하는 상세한 설명으로부터 본 발명은 더욱 상세히 기재되고, 도면의 동일한 참조 번호는 동일한 부분을 나타낸다.
도 1은 EGF/EGFR 경로의 억제 시의 항 EGF를 표시하는 SDS-PAGE-WB(웨스턴 블롯)을 나타낸다.
도 2는 병용 치료가 EGFR 돌연변이 NSCLC 환자에게 유익할 수 있다는 것을 시사하는, 본 발명에 따른 병용 치료가 게피티닙에 의한 STAT3의 활성화를 역전시킨 것을 도시하는 SDS-PAGE WB를 나타낸다.
도 3은 1:2 희석만으로 실험된 항-EGF 항체의 결과를 도시한 SDS-PAGE WB를 나타낸다. 에를로티닙의 농도는 0.5마이크로몰이었다.
도 4는 게피티닙, 항 EGF 항체, 및 게피티닙와 항 EGF 항체의 병용에 의한 치료 후의 EGFR, STAT3 및 ERK1/2의 레벨의 비교를 나타낸다.
도 5a 및 도 5b는 에를로티닙, 항 EGF 항체, 및 에를로티닙와 항 EGF 항체의 조합으로 치료한 후의 EGFR, STAT3 및 ERK1/2의 레벨의 비교를 나타내고, 이는 표 1에 요약되어 있다.
도 6a, 도 6b 및 도 6c는 게피티닙 + 항 EGFR의 병용의 결과를 나타내고, 4개 단백질의 인산화는 억제되었다.
도 7a 및 도 7b는 게피티닙 및 증가된 항 EGF 항체 농도의 병용의 결과를 나타낸다.
도 8a 및 도 8b는 Erk, STAT3 및 EGFR이 대부분 완전히 비활성화된 것을 표시하는 항 EGF 및 게피티닙을 병용한 원시 데이터(raw data)를 나타낸다.
도 9a 및 도 9b는 "혈청 기아 상태" 및 EGFR 유도 하에 행해진 또 다른 실험에 대한 원시 데이터를 나타낸다. 배양 시간은 2시간이었고 게피티닙의 농도는 0.5μM이었다.
도 10a, 도 10b, 도 10c 및 도 10d는 약물, 0.1 및 0.25μM을 투여받은 환자에게서 관찰된 생리학적 조건에 더욱 상응하는 게피티닙의 농도를 사용하여 행해진 또 다른 일련의 실험에 대한 원시 데이터를 나타낸다.
도 11은 24시간 혈청 기아 및 약물 치료에 의한 게피티닙 + 항 EGF의 병용 실험의 원시 데이터를 나타낸다.
도 12a, 도 12b 및 도 12c는 하우스키핑 단백질(액틴)을 포함하여 총 단백질을 정규화하는 추가 실험에 대한 원시 데이터를 나타내고, 상기 실험 데이터는 ERK의 인산화를 나타내고, EGFR은 항-EGF + 게피티닙의 병용으로 완료되었다.
도 13a 및 도 13b는 "비표준 조건" 하에 에를로티닙 및 항-EGF의 추가 실험에 대한 원시 데이터를 나타낸다. 약물을 포함한 배양 시간은 2시간이었고, 에를로티닙 농도가 1μM이었다.
도 14a 및 도 14b는 "혈청 기아" 하에 에를로티님 및 항 EGF의 추가 실험에 대한 원시 데이터를 나타낸다. 약물을 포함한 인큐베이션 시간은 2시간이었고, 에를로티닙 농도는 1μM이었다.
도 15a 및 도 15b는 "혈청-기아" 조건 하에 실험된 상기 TKI AZD9291과 항-EGF 항체를 사용한 추가 실험에 대한 원시 데이터를 나타낸다.
도 16a 및 도 16b는 PC9 세포에 있어서의 AZD9291 및 항-EGF(Ab1)을 사용한 다른 실험에 대한 원시 데이터를 나타낸다.
도 16c는 광범위한 파라미터 WB 종점을 갖는 단일 및 병용 치료를 테스트한 연산 결과를 나타낸다.
도 17은 약물에 의한 EGFR 및 Erk의 완전한 비활성화를 방지하기 위해 농도가 0.1μM로 감소된 AZD9291 약물을 포함하여 PC9 세포가 24시간 동안 배양된 추가 실험에서의 원시 데이터를 나타낸다.
도 18a 및 도 18b는 2시간 배양 기간 동안 PC9-GR4(T790M 포지티브)에서의 AZD9291(0.2μM AZD9291) 및 항-EGF(Ab1)에 대한 또 다른 실험에서의 원시 데이터를 나타낸다.
도 19a 및 도 19b는 24시간 인큐베이션 기간 동안 PC9-GR4(T790M 포지티브)에서의 AZD9291(0.2μM AZD9291) 및 항-EGF(Ab1)에 대한 또 다른 실험에서의 원시 데이터를 나타낸다.
도 20a 및 도 20b는 항-EGF 항체를 생성하는 본 발명에 따른 융합 단백질의 서열을 나타낸다.
도 21a, 도 21b, 도 21c 및 도 22d는 PC9 세포에 있어서의 게피티닙 및 항-EGF(Abl)에 대한 다른 실험에 있어서의 원시 데이터 및 다른 마커에 대한 효과를 나타낸다.
도 22a, 도 22b, 도 22c 및 도 22d는 다른 마커를 포함하는 PC9 세포에 있어서의 항-EGF Ab1 및 Ab2의 비교를 나타내는 다른 실험에 있어서의 원시 테이터를 나타낸다.
도 23은 야생형 단백질보다 저분자량의 과인산화된 Notch3, Akt 및 STAT-3 밴드의 출현을 나타내는 EGF로 이들을 유도하는 것 대신에 인간 혈청에서 성장된 세포의 원시 데이터를 나타낸다.
도 24는 24시간에서 관찰된 것보다 현저하게 강한, Ab2에 의한 PARP 절단의 강한 유도를 나타낸다.
도 25는 NSCLC H2228 세포에 있어서의 항 EGF가 EGFR/EGF 경로의 활성화, ALK 전위를 억제한다는 것을 나타낸다.
도 26은 수평 경로 억제, EMT에 대한 본 발명에 따른 병용 요법의 영향을 나타낸다.
도 27은 경로 억제에 대한 TKI의 효과를 나타내는 개략도이다.
도 28은 경로 억제에 대한 안티 EGF의 효과를 나타내는 개략도이다.
도 29는 경로 억제에 대한 EGF-PTI 및 TKI의 병용의 효과를 나타내는 개략도이다.
본원에 기재된 기술의 실시형태는 EGFR, Akt 및 ERK1/2의 인산화에 대한 억제 효과를 갖는 생리학적 농도의 항 EGF 항체가 적어도 이들 시그널링 분자에 대한 TKI의 효과만큼 중요하다는 발견에 기초한다. 항 EGF 항체 및 TKI의 병용 치료가 pEGFR, pAkt, pERK1/2 및 pSTAT-3 억제에 대한 추가 효과를 나타낸다는 것이 더 밝혀졌다. 일부 실시형태에 있어서, 이와 같은 항체 또는 그들의 항원-결합 단편은 NSLC를 치료하는 방법에 사용될 수 있다. 본 발명의 범위 내에서, EGF에 대한 면역 반응을 일으키는 백신의 투여에 의해 항 EGF 항체가 생체 내에서 왕성하게 생성될 수 있다는 것이 고려된다. 또한, 본 발명의 범위 내에서 수동 모노크노날 항 EFG 항체가 투여될 수 있다는 것이 고려된다.
편의상, 본 명세서, 실시예 및 첨부된 청구항에서 사용되는 특정 용어가 이하에 정리된다. 다르게 명시되거나 문맥에 내재되어 있지 않는 한, 이하의 용어 및 어구는 후술의 의미를 포함한다. 명백하게 다르게 명시되거나 문맥에서 명백하지 않은 한, 하기의 용어 및 어구는 해당 용어 또는 어구가 관련된 기술 분야에서 얻은 의미를 배제하지 않는다. 본 발명의 범위는 청구 범위에 의해서만 한정되기 때문에 그 정의는 특정 실시형태를 설명하는 것을 돕기 위해 제공되고, 청구된 발명을 한정하고자 하는 것은 아니다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
통상, 본원에 있어서, 용어 "감소하다", "저감된다", "저감된", "저감", "감소" 및 "억제되다"는 모두 기준에 비하여 통계적으로 유의한 양의 감소를 의미하는 것으로 사용된다. 그러나 의심의 여지를 회피하기 위해, 통상 "감소하다", "감소" 또는 "저감된다" 또는 "억제되다"는 기준 레벨과 비교하여 적어도 10% 정도의 감소를 의미하고, 예를 들면, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 예를 들면, 기준 레벨과 비교하여 제공된 개체 또는 매개 변수가 전혀 없거나 또는 제공된 치료가 없는 경우에 비하여 10-99% 감소한 경우까지를 포함한다.
통상, 본원에 사용되는 용어 "증가된", "증가된다" 또는 "강화한다" 또는 "활성화한다"는 모두 정적으로의 유의량에 의한 증가를 의미하기 위해 사용된다; 의심의 여지를 회피하기 위해, "증가된", "증가된다" 또는 "강화한다" 또는 "활성화한다"라는 용어는 기준 레벨과 비교하여 적어도 10% 증가, 예를 들면, 적어도 약 20% 또는 적어도 약 30%, 또는 적어도 약 40%, 또는 적어도 약 50%, 또는 적어도 약 60%, 또는 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 90% 또는 100% 증가 또는 10∼100% 간의 임의의 증가를 포함하거나 또는 기준 레벨과 비교하여 적어도 약 2배, 또는 적어도 약 3배, 또는 적어도 약 4배 또는 적어도 약 5배 또는 적어도 약 10배 또는 2배∼10배 이상의 임의의 증가를 의미한다.
본원에 사용된 용어 "단리된" 또는 "부분적으로 정제된"은 핵산 또는 폴리펩티드인 경우에 있어서, 그 천연원에서 발견되는 것과 동일한 핵산 또는 폴리펩티드와 함께 존재하거나 및/또는 분비된 폴리펩티드의 경우에 있어서 분비되거나 세포에 의해 발현되는 경우에 핵산 또는 폴리펩티드와 존재할 수 있는 적어도 하나의 다른 성분((예를 들면, 핵산 또는 폴리펩티드)으로부터 분리된 핵산 또는 폴리펩티드를 의미한다. 화학적으로 합성된 핵산 또는 폴리펩티드 또는 시험관내 전사/번역을 이용하여 합성된 핵산 또는 폴리펩티드는 "단리된"것으로 간주된다. "정제된" 또는 "실질적으로 정제된"이란 용어는 대상의 핵산 또는 폴리펩티드를 적어도 95중량%, 예를 들면, 적어도 96중량%, 적어도 97중량%, 적어도 98중량%, 적어도 99중량% 이상 단리된 핵산 또는 폴리펩티드를 말한다.
본원에서 사용되는 용어 "단백질" 및 "폴리펩티드"는 인접한 잔기의 알파-아미노 및 카르복시기 사이의 펩티드 결합에 의해 다른 아미노산 잔기에 연결된 일련의 아미노산 잔기를 나타내기 위해 본원에서 동일한 의미로 사용된다. 본원에서 동일한 의미로 사용되는 용어 "단백질" 및 "폴리펩티드"는 사이즈 또는 기능에 관계없이 수식된 아미노산(예를 들면, 인산화, 당화, 글리코실화 등) 및 아미노산 유사체를 포함하는 단백질 아미노산의 폴리머를 의미한다. "단백질" 및 "폴리펩티드"는 비교적 큰 폴리펩티드와 관련하여 사용되는 경우가 많고, 용어 "펩티드"는 작은 폴리펩티드와 관련하여 사용되는 경우가 많지만, 기술 분야에서 이들 용어의 사용은 중복된다. 본원에 있어서, 용어 "단백질" 및 "폴리펩티드"는 인코딩된 유전자 생성물 및 그 단편을 언급하는 경우에 동일한 의미로 사용된다. 따라서, 예시적인 폴리펩티드 또는 단백질은 유전자 생성물, 천연 발생 단백질, 호모로그, 오르토로그, 파라로그, 단편 및 그들의 다른 등가물, 변이체, 단편 및 유사체를 포함한다.
본원에 사용되는 용어 "항체"는 면역글로불린 분자의 가변 영역내의 적어도 하나의 항원 인식 부위를 통해 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 탄수화물, 폴리뉴클레오티드, 리피드 등의 표적을 인식하고 특이적으로 결합하는 임의의 면역글로불린 분자를 포함한다. 본원에서 사용되는 용어는 가장 넓은 의미로 사용되며, 항체가 소망의 생물학적 활성을 나타내는 한, 원형의 폴리클로날 항체, 원형의 모노클로날 항체, 항체 단편(Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편 등), 단일쇄 Fv(scFv) 돌연변이, 적어도 2개의 원형의 항체로 생성된 비특이적 항체 등의 다중 특이적 항체, 항체부를 포함하는 융합 단백질 및 항원 인식 부위를 포함하는 그 밖의 다른 수식된 면역글로불린 분자를 포함한다. 항체는 알파, 델타, 엡실론, 감마 및 뮤로 각각 언급되는 그들의 중쇄 정상 도메인의 식별에 기초한 면역글로불린: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM의 임의의 5개의 주요 부류, 또는 이들의 하위 부류(아이소타입)(예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2)일 수 있다. 여러 종류의 면역글로불린은 다양하고 공지인 서브 유닛 구조 및 3차원 구성을 갖는다. 항체는 예를 들면, 세포 독성, 독소, 방사성 동위 원소 등과 같은 다른 분자와 콘쥬게이팅되거나 또는 네이킹될 수 있다. 항체는 생체 내에서 이들을 능동적으로 생성함으로써 부여될 수 있고, 또는 모노클로날 항체의 수동 투여에 의해 부여될 수 있다.
본원에서 동일한 의미로 사용되는 "폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산"은 임의의 길이의 뉴클레오티드의 폴리머를 의미하고, DNA와 RNA를 포함한다. 상기 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 수식된 뉴클레오티드 또는 염기, 및/또는 그들의 유사체 또는 DNA 또는 RNA 폴리머라아제 또는 합성 반응에 의해 폴리머로 조합될 수 있는 임의의 기질일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 메틸화 뉴클레오티드 및 그들의 유사체 등의 수식된 뉴클레오티드를 포함해도 된다.
"항체"(Ab) 및 "면역글로불린"(Ig)은 동일한 구조적 특성을 갖는 당단백질이다. 항체는 특정 항원에 대한 결합 특이성을 나타내는 반면에, 면역글로불린은 일반적으로 항원 특이성이 결핍된 다른 항체 유사 분자 및 항체를 모두 포함한다. 예를 들면, 후자 종류의 폴리펩티드는 림프계에 의해 낮은 레벨로, 또한 골수종에 의해 증가된 레벨로 생성된다.
용어 "항체" 및 "면역글로불린"은 넓은 의미에서 동일하게 사용될 수 있고, 모노클로날 항체(예를 들면, 전장 또는 원형의 모노클로날 항체), 폴리클로날 항체, 1가, 다가 항체, 다중특이성 항체(예를 들면, 소망의 생물학적 활성을 나타내는 이중 특이성 항체)를 포함하고, 또한 임의의 항체 단편(이하에 상세히 기재된다)를 포함할 수 있다. 항체는 키메라, 인간, 인간화 및/또는 친화성 성숙될 수 있다.
중쇄의 정상 도메인의 아미노산 서열에 따라서, 항체(면역글로불린)가 다른 부류에 할당될 수 있다. 5개의 주요 면역글로불린인 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM의 부류가 있고, 이들 중 몇개는 하위 부류(이소타입), 예를 들면, IgG-1, IgG-2, IgA-1, IgA-2 등으로 더 구분될 수 있다. 다른 부류의 면역글로불린에 상응하는 상기 중쇄 정상 도메인은 α, δ, ε, γ 및 μ라 각각 불린다. 다른 부류의 면역글로불린의 서브유닛 구조 및 3차원 구조는 공지되어 있고, 예를 들면, 일반적으로 Abbas et al. Cellular and Mol. Immunology, 4th ed.(2000)에 기재되어 있다. 항체는 하나 이상의 다른 단백질 또는 펩티드와 상기 항체의 공유 결합 또는 비공유 결합에 의해 형성되는, 보다 큰 융합 분자의 일부일 수 있다.
본원에 있어서, 용어 "전장 항체", "원형 항체" 및 "전체 항체"는 동일한 의미로 사용되고, 실질적으로 원형 형태의 항체를 의미하는 것이고, 이하에 기재된 항체 단편을 의미하는 것은 아니다. 특히, 상기 용어는 상기 Fc 영역을 함유하는 중쇄를 지닌 항체를 의미한다.
"항체 단편"은 원형 항체의 일부만을 포함하고, 상기 부분은 원형 항체에 존재할 때 그 부분과 통상적으로 관련된 기능 중 적어도 하나, 바람직하게는 대부분 또는 전부를 유지하는 것이 바람직하다. 하나의 실시형태에 있어서, 항체 단편은 원형 항체의 항원 결합 부위를 포함하고, 따라서 항원을 결합하는 능력을 유지한다. 다른 실시형태에 있어서, 예를 들면 Fc 영역을 포함하는 항체 단편은 FcRn 결합, 항체 반감기 조절, ADCC 기능 및 상보 결합 등의 원형 항체에 존재하는 경우의 Fc 영역과 일반적으로 연관되는 생물학적 기능 중 적어도 하나를 유지한다. 하나의 실시형태에 있어서, 항체 단편은 원형 항체와 실질적으로 동일한 생체내 반감기를 갖는 1가 항체이다. 예를 들면, 이와 같은 항체 단편은 상기 단편에 대한 생체내 안정성을 부여할 수 있는 Fc 서열과 연결된 항원 결합 암(arm) 상에 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 균질한 항체의 개체군로부터 얻어진 항체를 의미하고, 즉, 개체군을 포함하는 각각의 항체는 소량으로 존재할 수 있는 자연 발생 돌연변이를 제외하고는 본질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 모노클로날 항체는 매우 특이적이고, 단일 항원에 대해 유도된다. 또한, 통상적으로 다른 결정체(에피토프)에 대해 유도된 다른 항체를 포함하는 폴리클로날 항체 제제와는 달리, 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정기에 대해 유도된다.
본원에 있어서, 구체적으로 모노클로날 항체는 소망의 생물학적 활성(U.S. Pat. No. 4,816,567; and Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855 (1984))을 나타내는 한, 상기와 같은 항체의 단편 뿐만 아니라, 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특이적 종에서 유래된 항체 중의 상응하는 서열과 동일하거나 상동하거나 또는 특이적 항체 또는 하위 부류에 속하지만, 쇄의 잔부는 다른 종에서 유래된 항체에서 유래된 항체 중의 상응하는 서열과 동일하거나 또는 상동하거나, 또는 다른 다른 항체 부류 또는 하위 부류에 속하는 "키메라" 항체를 포함한다.
"인간 항체"는 인간에 의해 생성된 항체의 아미노산 서열에 상응하고 및/또는 본원에 개시된 바와 같은 인간 항체를 제조하기 위한 임의의 기술을 사용하여 제조된 아미노산 서열을 갖는 것이다. 구체적으로, 상기 인간 항체의 정의는 비인간 항원 결합 잔기를 포함하는 인간화 항체를 제외한다.
본원에서 사용된 "종양"은 모든 악성 또는 양성의 모든 전암성 및 암성 세포 및 조직을 포함하는 모든 종양 세포 성장 및 증식을 의미한다. "암", "암성", "세포 증식성 장애", "증식성 장애" 및 "종양"이라는 용어는 본원에서 언급된 바와 같이 서로 배타적이지 않다.
용어 "암" 및 "암성"은 일반적으로 비조절된 세포 성장/증식을 특징으로 하는 포유 동물에 있어서의 생리학적 조건을 의미하거나 설명한다. 암의 예로는 상피암, 림프종, 모세포종, 육종 및 백혈병을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 이러한 암의 보다 구체적인 예로는 편평세포암, 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 폐샘암종, 폐편평암종, 복막암, 간세포암, 위장암, 췌장암, 아교 모세포종, 자궁 경부암, 난소암, 간암, 방광암, 헤파토마, 유방암, 대장암, 결장 직장암, 자궁내막암 또는 자궁암, 타액선암, 신장암, 간암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간암종 및 각종 두경부암이 포함된다.
본원에 사용된 "치료"는 치료되는 개인 또는 세포의 자연 경과를 변경하려는 임상적 개입을 의미하며, 예방 또는 임상병리학 과정 중에 행해질 수 있다. 치료의 바람직한 효과는 질병의 발생 또는 재발 방지, 증상의 경감, 질병의 임의의 직접 또는 간접적인 병리학적 결과의 감소, 염증 및/또는 조직/기관 손상의 예방 또는 감소, 질병 진행률의 완화, 질병 상태의 개선 또는 완화, 및 완화 또는 개선된 예후를 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 본 발명의 항체는 질병 또는 장애의 발현을 지연시키는데 사용된다.
"약제 부형제"는 약학 업계에서 일반적으로 사용되는 것들을 의미하며, 특히 "Handbook of excipients"(Raymond C. Rowe, Paul J. Sheskey, Paul J. Weller-4th Edition, 2003)의 전체 내용을 포함한다.
본 발명의 물질/분자의 "치료학적 유효량"은 환자에게 소망의 반응성을 도출해내기 위해 환자의 질병 상태, 연령, 성별 및 체중, 및 물질/분자의 능력과 같은 인자에 따라 달라질 수 있다. 또한, 치료학적으로 유익한 효과가 물질/분자의 임의의 독성 또는 유해한 효과보다 큰 것이 치료학적 유효량이다. "예방적 유효량"은 소망의 예방적 결과를 얻는데 필요한 투여량 및 필요한 기간 동안 효과적인 양을 의미한다. 질병의 초기 단계 또는 초기 단계 이전에 피험체에게 예방 용량이 사용되기 때문에, 상기 예방적 유효량은 치료적 유효량보다 적어도 되는 것이 일반적이지만 필수는 아니다.
"화학 요법제"는 암 치료에 유용한 화합물이다. 화학 요법제의 예로는 티오 테파 및 CYTOXAN® 시클로포스파미드 등의 알킬화제; 부술판, 임프로술판 및 피포술판 등의 알킬술포네이트; 벤조도파, 카르보쿠온(carboquone), 메트레데파(meturedepa) 및 우레데파(uredepa) 등의 아지리딘; 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포라미드, 트리에틸렌티오포스포라미드 및 트리메틸올멜라민을 포함하는 에틸렌이민 및 메틸아멜라민; 아세토게닌(특히, 불라타신 및 불라타시논); 델타-9-테트라히드로칸나비놀(드로나비놀, MARINOL®); 베타-라파콘; 라파콜; 콜키친; 베툴린산; 캄프토테신(합성 유사체 토포테칸(HYCAMTIN®), CPT-11(이리노테칸, CAMPTOSAR®), 아세틸캄프토테신, 스코폴레틴 및 9-아미노캄프토테신을 포함); 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065(그들의 아도젤레신, 카르젤레신 및 비젤레신 합성 유사체를 포함); 포도필로톡신; 포도필린산; 테니포시드; 크립토파이신(특히 크립토파이신 1 및 크립토파이신 8); 돌라스타틴; 듀오카르마이신(합성 유사체, KW-2189 및 CB1-TM1을 포함); 엘레우테로빈; 판크라티스타틴; 사코딕틴; 스폰기스타틴; 클로람부실, 클로르나파진, 클로로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥사이드 하이드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비킨, 페네스터린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스타드 등의 질소 머스타드; 카무스틴, 클로로조톡신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴 및 라님누스틴 등의 니트로스우레아; 에네디인 항생 물질(예를 들면, 칼리케아마이신, 특히 칼리케아마이신 감마 I1 및 칼리케아마이신 오메가 I1(예를 들면, Agnew, Chem Intl, Ed. Engl., 33:183-186(1994) 참조)) 등의 항생 물질; 다이네마이신 A를 포함하는 다이네마이신; 에스페라미신; 또한 니오카지노스타틴 발색단 및 관련 크로모단백질 에네디인 항생 발색단, 아클라시노마이신, 악티노마이신, 안트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카르미노마이신, 카지노필린, 크로모마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 독소루비신(ADRLIMYCIN®. 모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신, 독소루비신 HCl 리포솜 인젝션(DOXIL®) 및 데옥시독소루비신을 포함), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마셀로마이신, 미토마이신 C 등의 미토마이신, 마이코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 푸로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 메토트렉세이트, 겜시타빈 (GEMZAR®), 테가푸르(UFTORAL®), 카페시타빈(XELODA®), 에포틸론 및 5-플루오로우라실(5-FU) 등의 항-대사산물; 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트리메트렉세이트 등의 폴산 유사체; 플루다라빈, 6-머캅토푸린, 티아미프린, 티오구아닌 등의 푸린 유사체; 아시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카모푸르, 사이타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록수리딘 등의 피리미딘 유사체; 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤 등의 안드로겐; 아미노글루테티미드, 미토탄, 트리로스탄 등의 항-아드레날; 폴린산 등의 폴산 보충제; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코사이드; 아미노레불린산; 에닐우라실; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포르니틴; 엘립티늄 아세테이트; 에토글루시드; 갈륨 니트레이트; 하이드록시우레아; 렌티난; 로니다이닌; 마이탄신 및 안사미토신 등의 마이탄시노이드; 미토구아존; 미톡산트론; 모피단몰; 니트라에린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 로속산트론; 2-에틸하이드라지드; 프로카바진; PSK® 다당류 착체(JHS Natural Products, Eugene, Oreg.); 라족산; 리족신; 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센(특히, T-2 톡신, 베라쿠린 A, 로리딘 A 및 안구이딘); 우레탄; 빈데신(ELDSINE®, FILDESIN®); 다카바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노시드('Ara-C'); 티오테파; 탁소이드, 예를 들면, 파클리탁셀(TAXOL®), 파클리탁셀의 알부민 가공 나노입자 제형(ABRASANETM), 및 도테탁셀(TAXOTERE®); 클로란부실; 6-티오구아닌; 머캅토푸린; 메토트렉세이트; 시스플라틴 및 카보플라틴 등의 백금 유사체; 빈블라스틴(VELBAN®); 백금; 에토포시드(VP-16); 이포스파미드; 미톡산트론; 빈크리스틴(ONCOVIN®); 옥살리플라틴; 레우코보빈; 비노렐빈(NAVELBINE®); 노반트론; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 이반드로네이트; 토포이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸로르니틴(DFMO); 레틴산 등의 레티노이드; 이들의 약제학적으로 허용되는 염, 산 또는 유도체; 및 시클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴 및 프레드니솔론의 병용 요법의 약자인 CHOP 및 옥살리플라틴(ELOXATIN™)과 5-FU 및 로이코보빈이 병용되는 치료 요법의 약자인 FOLFOX 등의 2개 이상의 상술의 것의 조합이 포함된다.
"환자 반응"은 (1) 둔화 및 완전한 저지를 포함한 질병 진행의 어느 정도까지의 억제; (2) 질병 에피소드 및/또는 증상의 수의 감소; (3) 병변 크기의 감소; (4) 인접한 말초 기관 및/또는 조직으로의 질병 세포 침윤의 억제(즉, 감소, 둔화 또는 완전 정지); (5) 질병 확산의 억제(즉, 감소, 둔화 또는 완전 정지); (6) 병변의 퇴행 또는 절제를 초래할 수 있는 세포 증식, 침습 또는 전이의 감소; (7) 장애와 관련된 하나 이상의 증상의 어느 정도의 완화; (8) 치료 후 무병(disease-free) 기간의 증가; 및/또는 (9) 치료 후 주어진 시점에서 사망률 감소를 포함한 환자에게 이점을 나타내는 임의의 엔드포인트를 사용하여 평가할 수 있지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.
"조직 또는 세포 샘플"은 피험자 또는 환자의 조직으로부터 얻어진 유사 세포의 집합을 의미한다. 조직 또는 세포 샘플의 공급원은 프레쉬한 냉동 및/또는 보존된 장기 또는 조직 샘플 또는 생검 또는 흡인물으로부터의 고체 조직; 혈액 또는 임의의 혈액 성분; 뇌척수액, 양수, 복막액 또는 간질액 등의 체액; 피험자의 임신 기간 또는 발달 기간 중의 임의의 기간으로부터의 세포일 수 있다. 또한, 상기 조직 샘플은 1차 세포 또는 배양 세포 또는 세포주일 수 있다. 경우에 따라서, 상기 조직 또는 세포 샘플은 질병 조직/기관으로부터 얻어진다. 상기 조직 샘플은 방부제, 항응고제, 완충액, 고정제, 영양제, 항생제 등과 같은 본질적으로 조직과 선천적으로 혼화되지 않는 화합물을 함유해도 된다.
EGFR-TKI 제제
본 발명의 방법은 피험자에게 EGFR-TKI 제제를 투여하는 것을 포함한다. 표피 성장 인자 수용체(EGFR)의 계열은 표피 성장 인자(EGF) 계열의 구성 요소에 반응하여 기능을 결합 및 유도하는 4개의 구조적으로 관련된 세포 표면 수용체 티로신 키나아제를 포함한다. 인간에게 있어서, 이것은 Her-1 및 ErbB1이라고도 알려진 EGFR, Neu 및 ErbB2라고도 하는 Her-2, Her-3(ErbB3) 및 Her4(ErbB4)를 포함한다. ErbB 시그널링의 과다 활성화는 다양한 고형 종양의 발생과 관련이 있다. 따라서, 다양한 추가 실시형태에 있어서, 본 발명은 항-EGF 항체와 에를로티닙뿐만 아니라 게피티닙, 아파티닙, 파니튬마브 및 세툭시맙 등의 다른 EGFR 억제제 및 HER2 억제제, 라파티닙, 퍼투주맙 및 트라스투주맙 등의 HER2 억제제의 병용을 포함한다. 임의의 실시형태에 있어서, 상기 EGFR-TKI는 현재 TARCEVA®라는 상품명으로 판매되고 있는 약의 유효 성분인 에를로티닙이다.
에를로티닙은 티로신 키나아제 억제제이고, N-(3-에티닐페닐)-6,7-비스(2-메 톡시에톡시)-4-퀴나졸린아민이라는 화학명의 퀴나졸린아민이다. 특정 실시형태에 있어서, 상기 에를로티닙은 에를로티닙 하이드로클로라이드이다. 경구 투여를 위한 TARCEVA® 정제는 25mg, 100mg 및 150mg 에를로티닙에 해당하는 에를로티닙 하이드로클로라이드(27.3mg, 109.3mg 및 163.9mg) 및 이하의 비활성성분인 락토오스 모노하이드레이트, 하이프로멜로오스, 히드록시프로필 셀룰로오스, 마그네슘스테아 레이트, 미세결정질 셀룰로오스, 나트륨 스타치 글리콜레이트, 나트륨 라우릴 술페이트 및 티타늄 디옥시드를 함유하는 3종의 투여량으로 시판되어 있다. 또한, 정제는 제품 식별을 위해 FD&C Yellow #6(25mg에만 해당)을 포함한 미량의 색상 첨가물이 함유된다. 상세한 정보는 승인된 약 라벨로부터 얻을 수 있다. NSCLC용 TARCEVA®의 승인된 권장 용량은 150mg/일이고; 췌장암에 대한 승인된 용량은 100 mg/일이다. 필요에 따라서 50mg 감량으로 복용량을 감소할 수 있다.
다른 실시형태에 있어서, 상기 EGFR-TKI제제는 상품명 IRESSA®로 시판되는 약의 유효 성분의 게피티닙이다. 게피티닙은 N-(3-클로로-4-플루오로페닐)-7-메톡시-6-[3-4-모르폴린)프로폭시]의 화학명 4-퀴나졸린아민을 갖는 티로신 키나아제 억제제이다. 임상 처방은 유효 성분인, 락토오스 모노하이드레이트, 미정질 셀룰로오스, 크로스카르멜로오스 나트륨, 포비돈, 나트륨 라우릴 술페이트 및 마그네슘 스테아레이트를 함유하는 250mg 정제로서 제공된다. 단일 요법으로 권장되는 용량은 1일 250mg 1정이다. 더욱 상세한 정보는 승인된 약물 라벨에서 확인할 수 있다.
아파티닙, 파니투무맙 및 세툭시맙 등의 다른 EGFR 억제제뿐만 아니라 라파티닙, 퍼투주맙 및 트라스투주맙 등의 HER2 억제제는 당해 기술분야에서 공지되어 있고, 따라서 당업자는 본 발명과 함께 사용시 요구될 수 있는 그들의 구조, 제형, ?용 및 투여(예를 들면, 승인된 약물 라벨과 같은 공개된 의학적 정보에 기초하여)를 용이하게 알 수 있다.
EGFR의 소분자 억제제는 일부 NSCLC 환자에서 임상 반응을 유도하고, 이 반응은 EGFR의 키나아제 도메인에 있어서 돌연변이를 활성화시키는 것과 관련이 있다. 이들 돌연변이 단백질은 인간 상피 세포를 변형시키기에 충분하며 NSCLC 세포주의 생존에 필수적이다. 종양 발생에 대한 돌연변이 EGFR과 그 기여에 의해 유도된 생물학적 변화를 이해하려면 이를 활성화시키는 하류 시그널 형질 도입 경로의 철저한 이해가 요구된다. 시그널 트랜스듀서와 전사 활성제 3(STAT3)는 다수의 인간 암에서 활성이며 세포 주기 진행, 항아폽토시스, 세포 생존 및 혈관 생성에 관여하는 여러 유전자의 전사를 조절하는 발암성 전사 인자이다.
STAT3은 EGF, 백혈병 억제 인자(LIF) 및 다른 사이토킨에 의해 활성이 매개될 수 있는 EGFR, JAK2 및 다른 티로신 키나아제에 의해 활성화될 수 있다. 따라서, STAT3는 많은 시그널링 경로의 수렴 지점이고, 종양 형성 및 종양 전이에 중요한 역할을 한다. STAT3은 다양한 형태의 돌연변이 EGFR에 의해 활성화되고 섬유 아세포 및 인간 폐암 세포에 있어서, 이들 돌연변이의 발암 효과에 기여한다고 생각된다.
리간드 결합 또는 돌연변이에 의한 활성화 후, EGFR은 전사 및 번역 후 메커니즘을 통해 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 시그널 형질 도입 경로의 캐스케이드를 개시한다. 이들 변경을 매개하는 시그널링 경로는 Ras-Raf-미토겐 활성 단백질(MAP) 키나아제(MAPK), 포스포이노시티드 3-키나아제-AKT 및 시그널 트랜스듀서 및 전사 활성제(STAT) 3, 및 STAT5 시그널 형질 도입 경로가 포함된다. STAT계 전사 인자는 보존된 티로신 잔기의 인산화에 의해 활성화되어 이합체 화, 핵전좌 및 DNA 결합을 유도한다. 또한, STAT1, STAT3 및 STAT5는 COOH 말단의 세린 잔기 상에서 인산화된다; 상기 인산화는 이합체화, 핵 전좌 및 DNA 결합에 필요하지 않지만 일부 유전자의 최대 전사 활성에 요구된다고 생각된다.
구조적으로 몇몇 비소세포 폐암 세포주는 활성의 STAT3을 포함하고 있다. 최근에 유전적으로 정의된 시스템에 있어서 STAT3가 여러 EGFR 돌연변이에 의해 활성화되는 것으로 확인되었다. 그러나, 돌연변이 EGFR의 하류에 있는 시그널 형질 도입 경로 중 어느 것이 발암성을 매개하는데 필요한지는 알려지지 않았지만, 광범위한 인간 악성 종양에 있어서의 STAT3의 역할과 다양한 세포 유형에 있어서의 EGF에 의해 활성화된다는 사실을 고려할 때, STAT3은 체세포 돌연변이 EGFR의 발암 효과에 필수적이라고 생각된다. STAT3은 돌연변이 EGFR을 발현하는 섬유 모세포에서뿐만 아니라 자연 발생 EGFR 돌연변이를 갖는 2개의 NSCLS 세포주에서도 활성화되고, 이러한 활성화는 이들 세포의 형질 전환 및 생존에 필요하다고 보고되고 있다.
STAT3의 활성화는 리간드-수용체 상호 작용을 포함하는 경우가 많다. STAT3은 인터페론, EGF, G-CSF 및 인터루킨(IL-6) 패밀리 사이토카인을 포함한 다수의 각종 사이토카인에 의해 활성화될 수 있다. 그들의 동족 수용체에 대한 사이토카인의 결합은 JAKs 인산화, STAT3 이합체화, 핵 전좌, DNA 결합 및 유전자 활성화를 유도한다(12, 13). 또한, STAT3 인산화는 Src 패밀리 키나아제와 같은 세포질 티로신 키나아제에 의해 유도될 수도 있다(14). NSCLC, 유방암 및 두경부암을 포함한 많은 원발성 종양 표본 및 종양 유도 세포주에 있어서, 상승된 EGFR 활성 및 STAT3의 활성이 양의 상관 관계가 있다고 보고되고 있다.
증가된 STAT3 활성은 돌연변이 EGFR을 발현하는 세포주 및 폐선암종에서 확인된다. 특정 이론에 한정되지 않고, STAT3은 돌연변이 EGFR에 의해 요구되고 그것의 하류 표현형 효과에 필수적이라고 생각된다. 섬유 모세포에 있어서 STAT3 기능을 억제하는 것은 돌연변이 EGFR에 의한 형질 전환을 억제한다. 불행하게도, TKI 등의 표적 치료법은 NSCLC 세포주에서의 STAT3 활성을 완전하게 억제할 수 없다.
이전의 연구들은 돌연변이 EGFR이 IL-6의 상향 조절을 통해 gp 130/JAK/STAT3 경로의 활성화를 유도한다고 제시했다. NSCLC 시료에 있어서, IL-6 및 IL-6 수용체 성분 gp80 및 gp130의 종양 발현이 발견되었다(20). 또한 IL-6 및 IL-8 등의 전염증성 사이토카인의 증가된 레벨이 NSCLC 종양 형성 및 예후와 관련된다는 것도 관찰되었다. 이것은 IL-6 및 그 하류 경로가 EGFR 돌연변이를 갖는 NSCLC 환자의 표적이 될 가능성이 있음을 나타낸다. 그러나, NSCLC에서 발암성 EGFR 돌연변이에 의한 IL-6 유도에 대한 메커니즘은 아직 명확하지 않지만; 폐암에 있어서, NF-kB 및 STAT3 시그널링이 IL-6 자기 분비를 조절한다고 생각된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, EGF-EGFR 결합(mAb)에 의해 활성화된 경로의 억제를 위해 본 발명에 따른 티로신 키나아제 억제제(TKI) 및 항-EGF 항체를 병용하는 유연한 활성 요법을 치료가 필요로 한 환자에게 투여함으로써 탈규제된 인간 표피 성장 인자 수용체 1(HER1/인간 EGFR)에 의해 유도된 암 환자를 치료하기 위해 항 EGF 항체가 사용되고, 여기서, 상기 TKI는 약 10∼250mg 범위의 평균 일일 투여량에 기초한 연속 요법에 따라 투여되고, 본 발명에 따른 EGF TPI는 일주일에 3회, 2회 또는 1회, 2주에 1회, 또는 3주에 1회 또는 한달에 적어도 한번 반복되는 치료 유효량을 달성하는 투약 요법에 따라 혼합 투여된다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, EGF에 대한 면역 반응을 일으키는 백신 및 티로신 키나아제 억제제(TKI)를 혼용하는 유연한 활성 요법을 치료가 필요로 하는 환자에게 투여함으로써 탈규제된 인간 표피 성장 인자 수용체(HER1/인간 EGFR)에 의해 유도된 암 환자의 백신화에 의해 항 EGF 항체가 생성되고, 여기서, 상기 TKI는 약 10∼250mg 범위의 평균 일일 투여량에 기초한 연속 요법에 따라 투여되고, 본 발명에 따른 백신은 일주일에 3회, 2회 또는 1회, 2주에 1회, 3주에 1회 또는 한달에 적어도 한번 반복되는 치료 유효량을 달성하는 투약 요법에 따라 혼합 투여된다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, EGFR, Akt 및 ERK1/2의 인산화에 대한 생리학적 농도에서의 항 EGF 항체의 효과는 이들 시그널링 분자에 대한 게피티닙 등의 TKI의 효과만큼이나 현저함이 확인되었다. 게피티닙 등의 TKI 및 항 EGF 항체의 병용 치료가 pEGFR, pAkt, pERK1/2 억제에 대해 예기치 못한 현저한 시너지 효과를 나타내는 것은 본 발명의 범위 내이다. 특정 이론에 한정됨이 없이, 치료에 대한 내성을 얻는 첫 번째 단계로서 간주되는 게피티닙을 EGFR 돌연변이 세포에 투여하면 STAT3의 활성화가 유도되고, 본 발명에 따른 항 EGF 항체의 병용은 이와 같은 활성화를 억제한다고 생각된다.
상술한 바와 같은 게피티닙 및 에를로티닙 등의 기존의 TKI 요법은 EGFR의 활성화를 차단하기 위한 투여량으로 암을 치료하기 위해 매일 요법으로 환자에게 투여하는 것을 필요로 한다. 그러나, 상술한 바와 같이, 상기 치료에 대한 내성이 환자에게 발현되는 경우도 많다. 본 발명은 항-EGF 항체의 능동적 또는 수동적 사용과 병용된 TKI의 투약 요법이 내성 환자에게 그들의 내성을 극복하기 위해 투여되거나 또는 TKI 치료법에 반응하지 않는 환자에게 투여되어 그들의 비반응성을 극복한다(이하, 이들 표시는 암을 가진 사람에 대해 사용될 때, 모두 "내성"이라는 용어에 포함시킨다)는 본 출원인의 놀라운 발견에 기초한다. 이 병용 투약 스케줄은 놀라울 정도로 내성에 효과가 있다. 본 발명의 다른 실시형태는 상기 내성 또는 비반응성에 대한 원인인 것으로 판단되고 있는 본 발명자의 STAT3 대사 경로의 식별에 기초한다.
본 발명의 방법은 NSLC의 치료에 한정되지 않는다. 또는, 본 발명의 방법에 의해 제거된 TKI 내성 및 목적의 생체 분자 경로는 TKI를 사용한 치료가 치료 중인 환자에게 유익한 결과를 가져오는 임의의 질병 상태인 다른 질병 상태의 치료에 적용될 수 있음이 쉽게 이해될 수 있다. "유익한 결과"는 질병 상태의 심각성 감소, 질병 상태의 악화 방지, 질병 상태의 치료 및 환자의 수명이나 기대 수명 연장 등이 포함될 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 이들 질병 상태는 본 발명의 방법으로 임상적으로 영향을 받을 수 있는 임의의 다른 키나아제 또는 EGFR에 의해 조절되거나 또는 이들과 관련될 수 있다.
더욱 구체적으로는, 하기의 실시예에 기재된 발명자의 실험 연구는 EGFR 시그널링 캐스케이드의 효과적인 억제를 입증하는 이들 종양에 대한 분자 연구에 있어서 매일 투약 요법으로의 TKI의 임상 활성을 입증하였다. 상기 실시예는 상기 분자 연구가 다른 모델 시스템에 있어서 관찰된 이들 TKI의 거동을 적절하게 반영했음을 확인했다. 또한, 놀랍게도 본 발명은 수동적으로 투여되거나 또는 이러한 항체를 생산하는 백신의 투여에 의해 능동적으로 생산되는 항-EGF 항체와 병용한 TKI가 분자 모델-종래 TKI 요법에 대한 내성을 증명하는 종양에 있어서도 효과적으로 종양 성장을 억제할 수 있다는 것을 입증한다.
하나의 예시적인 실시형태에 있어서, 전-임상 연구에 사용된 항-EGF 항체는 몬타니드 아쥬반트(Montanide adjuvant)와 함께 제제된 Manufacturing Process Development for an Epidermal Growth Factor-Based Cancer Vaccine, Rodriguez 등(Supplement to Biopharm International October 2008, 그 내용의 전체가 본원에 참고 문헌으로 포함됨)에 의해 기술된 바와 같은 CIMAvax-EGF 백신인 rEGF-rP64k 콘쥬게이트에 의한 면역화에 의해 능동적으로 생성된다. EGF 또는 EGFR에 대한 면역 반응을 생성하는 다른 백신 제제가 사용될 수 있음은 본 발명의 범위 내에서 고려된다. 또한, 다른 성장 인자 또는 그들의 수용체에 대한 면역 반응을 일으키는 백신도 사용될 수 있다는 것이 본 발명의 범위 내에 있다. 특히, 각각의 그 전체 내용이 참조로 포함되는 WO2013/076580 및 WO2014/140894에 개시된 바와 같은 면역원성 단백질은 본 발명에 따른 항-EGF 항체를 생산하는데 사용될 수 있다.
임의의 이론에 제한되는 것을 소망하지 않고, STAT3 대사 경로의 이들 억제가 세포 증식에 관여하는 세포 시그널링 경로의 자극에 요구된다고 생각되고, 또한, 본 발명의 병용 투약 요법에 의해 상기 STAT3의 추가 억제가 상기 세포 시그널링을 억제하거나 또는 하향 조절하는데 효과적이라고 생각된다. 또한, 종래의 TKI 치료에 내성이 있는 환자들에게도 STAT3가 또한 억제되기 때문에 본 발명의 병용 투약 요법에 의해 유익한 항-종양 효과를 얻을 수 있다. 본 발명의 병용 요법은 종래의 TKI 요법이 실패한 질병 상태의 방해와 관련될 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법은 세포 및 분자 레벨에서 종래의 방법과 달리 작용함으로써 TKI 치료에 대한 내성 또는 비반응성을 극복할 수 있다.
특정 실시형태에 있어서, 항-EGF 항체와 TKI의 병용 투약은 종래의 TKI 치료에 내성이 있는 사람에게 있어서, 암, 특히 폐암, 유방암 및 전립선암을 치료하는데 효과적일 수 있다. 본 발명의 방법으로 치료될 수 있는 다른 형태의 암은 위암, 결장 직장암 및 난소암 뿐만 아니라 아교 모세포종 종양을 포함하지만, 이들에 제한되지는 않는다. 이들 각각의 암 형태는 유의한 EGFR 발현을 나타내므로, 본 발명의 방법에 따른 치료를 위한 적당한 표적이 된다.
본 발명의 방법에 따른 사용에 적합한 TKI는 암, 특히 유방암, 폐암 및 전립선암의 치료에 사용하는데 일반적으로 공지된 TKI를 포함할 수 있지만, 이것에 한정되는 것은 아니다. 예를 들면, 상기 TKI는 상술한 바와 같이 IRESSA® 및 TARCEVA®를 포함할 수 있지만, CI 1033(Pfizer Inc. 시판), PKI166(Novartis AG 시판), GW2016(GlaxoSmithKline 시판), EKB569(Wyeth 시판), IMC-C225(ImClone Systems Inc. 및 Bristol-Myers Squibb Co. 시판) 및 이들의 약학적으로 허용되는 염 또는 등가물을 더 포함할 수 있고, 후자의 그룹은 현재 임상 시험 단계의 단계 I 또는 단계 II에 있으며, 이들 모두는 "키나아제 억제제" 또는 "TKI"라는 용어 내에 포함되어 있다.
특히, 몇몇 TKI는 효과적인 항 종양 활성을 갖는 것으로 확인되었고 승인되었거나 임상 시험 중에 있다. 이들의 예로는 Zactima(ZD6474), Iressa®(게피티닙) 및 Tarceva®(에를로티닙), 이메티닙 메실레이트(STI571; Gleevec), 에를로티닙 (OSI-1774; Tarceva®), 카네르티닙(CI 1033), 세막신닙(SU5416), 바탈라닙(PTK787/ZK222584), 소라페닙(BAY 43-9006), 수텐트(SU1 1248) 및 레플루노마이드(SU101)가 포함되지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.
암에 대한 소정의 치료 효능은 숙련된 임상가에 의해 결정될 수 있다. 그러나, 본 발명에 있어서, 예를 들면, 종양의 사인 또는 징후 중 하나 또는 모두가 유익한 방식으로 변경되거나 다른 임상적으로 승인된 증상이 본원에 기재된 바와 같은 약제로 치료한 후 적어도 10% 정도 개선되거나, 향상되기라도 된다면, 치료는 "효과적인 치료"로 간주된다. 또한, 효능은 입원이나 의료 개입의 필요성에 의해 평가될 때, 개인의 실패에 의해 측정되어 악화될 수도 있다. 이러한 지시기를 측정하는 방법은 당업자에게 공지되어 있고 및/또는 본원에 기재되어 있다.
질병의 치료를 위한 유효량은 이를 필요로 하는 포유 동물에 투여될 때, 본원에서 정의된 바와 같이 그 질병에 대한 효과적인 치료를 얻는데 충분한 양을 의미한다. 약제의 효능은 예를 들면, 종양 크기, 종양 질량, 종양 밀도, 혈관 신생, 종양 성장 속도 등과 같은 암의 물리적 지표를 평가함으로써 결정될 수 있다. 또한, 본원에 기재된 항체 또는 그것의 항원-결합 부분 또는 항체 또는 본원에 기재된 항체 또는 그것의 항원-결합 항체를 인코딩하는 핵산을 포함하는 약제로 치료되는 피험체에 있어서, MIC 펩타이드 또는 그의 단편을 순환하는데 있어서의 감소에 의한 약제의 효능이 측정될 수 있다.
본 발명의 실시형태에 대한 설명은 개시된 특정한 형태로 본 발명을 구속하거나 한정하려는 것은 아니다. 본 발명의 특정 실시형태 및 실시예가 설명의 목적으로 본원에 기재되어 있지만, 관련 기술 분야의 당업자가 알 수 있는 바와 같이, 다양한 동등한 수정이 본 발명의 범위 내에서 가능하다. 본원에서 제공된 개시의 교시는 적절하게 다른 절차 또는 방법에 적용될 수 있다. 본원에 기재된 다양한 실시형태가 조합되어 또 다른 실시형태를 제공할 수 있다. 필요에 따라서, 본원의 양태는 상기 문헌의 조성, 기능 및 개념, 및 애플리케이션을 사용하도록 수정되어 본원의 또 다른 실시형태를 제공할 수 있다. 본 발명의 상세한 설명을 고려하여 이러한 변경 및 기타 변경이 본 개시에 대해 행해질 수 있다.
상술한 실시형태 중 임의의 특정 요소는 다른 실시형태의 요소들과 결합되거나 대체될 수 있다. 또한, 본 발명의 특정 실시형태와 관련된 이점이 이들 실시형태와 관련되어 설명되었지만, 다른 실시형태도 이러한 이점을 나타낼 수 있고, 모든 실시형태가 반드시 본 발명의 범위 내에 포함되는 상술한 바와 같은 장점을 반드시 나타낼 필요는 없다.
실시예
본 발명은 하기 실시예에 의해 더욱 설명되지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.
실시예 I: 엔드 포인트로서 WB를 사용하여 EGF/EFGR 경로의 억제에 대한 항 EGF의 평가
목적 : NSCLC 환자의 PC9 세포주에서 EGF-EGFR 결합에 의해 활성화된 경로의 억제에 대하여 게피티닙에 대한 항-EGF 항체의 효과를 비교하기 위함. 동일한 세포주에서 항 EGF와 게피티닙의 병용이 상승 효과를 보일 것인지를 평가하기 위함.
웨스턴 블로팅(WB) 방법으로 활성화를 시험하기 위한 재료 및 방법:
PC9 세포주는 TKI에 민감한 상기 세포주를 생성하는 엑손 19에 있어서의 결실을 가지고 있다. 이것은 1차 TKI 치료를 받는 NSCLC 환자군의 EGFR 돌연변이 세그먼트에 대한 모델을 나타낸다.
이 실험을 위한 모든 조직 배양 물질은 Biological Industries(Kibbutz Beit Haemek, Israel) 또는 Invitrogen(Paisley, Scotland, UK)에서 입수하였다. PC9 세포주는 F. Hoffman-La Roche Ltd(Basel, Switzerland)에 의해 제공되었다. 세포를 10% 태아 소 혈청(FBS), 50μg/mL 페니실린-스트렙토마이신 및 2 mML-글루타민으로 보충된 RPMI 배지에서 유지시켰다. 세포를 37℃에서 5% CO2에 의한 가습 분위기 하에 성장시킨다.
본 프로젝트에 사용된 항-EGF 항체는 상술한 바와 같이 몬타니드 아쥬반트(Ab1)와 함께 제제화된 rEGF-rP64k 콘쥬게이트 CIMAvax-EGF 백신의 4회 면역화를 받은 원숭이의 면역화 연구로부터 유도되었다. 혈청은 멜론(Mellon) 겔에서 처리되어 상보체 등의 오염물을 제거했다. 이 정제는 Scotia, Aberdeen, UK에서 행했졌다. ELISA 역가는 약 1/60000이다.
실험 1 : 전형적인 표준 실험에 있어서, 연구 하의 5개의 T-75 플라스크의 세포주를 약 70% 컨플루언스로 배양하였고, PBS로 2회 세척하고, 무혈청 배지에서 밤새 배양했다. 혈청이 결핍된 세포를 다시 세척하고 이하와 같이 처리했다:
첫번째 실험에 있어서, 항 EGF 희석은 단독 또는 게피티닙과 병용할 때 1 : 20, 1 : 10, 및 1 : 5로 실험되었다. 게피티닙은 약 40 나노몰 배지 농도로 사용되었고, EGF와 항체 또는 게피티닙, 또는 항-EGF와 게피티닙은 혼합되었고, 세포에 첨가되기 전에 약 37℃에서 약 10분 동안 예비 배양되었다. 치료는 약 15분 동안이었다.
실험 2 : 두번째 실험에 있어서, 항-EGF는 1:2 희석으로만 실험되었다. 게피티닙은 0.5마이크로몰의 농도이었다. 상기 실험에 있어서, 치료는 약 2시간까지 지속되었다.
치료 후, 실험 1 및 2에 있어서, 배양액을 PBS로 세척하고 프로테아제 및 포스파타제 억제제-함유 용해 완충액에 용해시켰다. 등량의 단백질을 SDS-PAGE 겔에 놓고 멤브레인으로 옮기고 EGFR, p-EGFR, ERK1/2, p-ERK1/2, Akt, p-Akt, STAT3 및 pSTAT-3에 대한 항체로 블로팅했다. 밴드의 강도는 ImageJ 프로그램을 사용하여 측정하고, 이어서 2단계 표준화에 제공되었다. 우선, 인산화된 밴드의 강도를 동일한 샘플의 전체 단백질에 해당하는 밴드의 강도로 나눈다. 이어서, 상기 값은 동일한 단백질에 대한 EGF-처리된 세포에서 얻어진 값으로 나눠진다. 상기 프로젝트에 사용 된 EGF 및 항-EGF 항체는 몬타니드 아쥬반트와 함께 제제화된 rEGF-rP64k 콘쥬게이트 CIMAvax-EGF 백신의 4회 면역을 받은 원숭이의 면역 연구로부터 유래되었다. 상기 백신 및 얻어진 항-EGF 항체는 비오벤(Bioven, Europe) Ltd, Cruikshank Building North, Aberdeen Biotechnology, Craibstone Aberdeen, U.K. Scotland에 의해 제공되었다. 웨스턴 블로팅을 위한 항체는 Santa Cruz Biotechnologies(Palo Alto, CA)에서 구입했다. 상기 실험 프로젝트의 원시 데이터가 도 1에 반영된다.
실험 1 및 2의 결과(2시간 배양) ::
두 번째 실험의 결과를 이하 제시된 관찰과 함께 도 2에 나타내었다: 도 1에 나타낸 실험 1의 결과는 지속된 배양이 STAT3의 인산화에 중요한 영향을 미친다는 것을 확인하였다. 또한, EGFR, Akt 및 ERK1/2의 인산화에 대한 항 EGF의 영향은 이들 시그널링 분자에 대한 게피티닙의 영향만큼 현저하다는 것이 관찰되었다. 또한, 항 EGF 및 게피티닙의 병용 치료는 pEGFR, pAkt, pERK1/2 억제에 대한 추가적인 효과를 나타내는 것으로 결론지었다. 특정 이론에 구속되지 않고, 치료에 대한 내성을 획득하는 첫 번째 단계로 간주되는 EGFR 돌연변이 세포에 대한 게피티닙 투여는 STAT3의 활성화를 유도한다고 생각된다.
항-EGF에 PC9 세포의 실험적 노출에 기반하여 항-EGF는 STAT3을 활성화시키지는 않지만, 다소 제한된 억제 효과를 갖는 것을 나타낸다. 또한, 예상치 못하게도 도 2를 증거로 하여 병용 치료가 EGFR 돌연변이 NSCLC 환자에게 유익할 수 있다는 것을 암시하는, 상기 병용 치료는 게피티닙에 의한 STAT3의 활성화를 완전히 역전시켰다고 결론지었다.
실험 3: 세 번째 실험에 있어서, 항-EGF는 1:2 희석으로만 시험했다. 에를로티닙의 농도는 0.5마이크로몰이었다. 상기 실험에서, 치료는 약 2시간까지 지속되었다. 치료 후, 배양액을 PBS로 세척하고 프로테아제 및 포스파타제 억제제-함유 용해 완충액에 용해시켰다. 등량의 단백질을 SDS-PAGE 겔에 놓고 멤브레인으로 옮기고 EGFR, p-EGFR, ERK1/2, p-ERK1/2, Akt, p-Akt, STAT3 및 pSTAT-3에 대한 항체로 블로팅되었다. 밴드의 강도는 ImageJ 프로그램을 사용하여 측정하고, 이어서 2단계 표준화에 제공되었다. 우선, 인산화된 밴드의 강도를 동일한 샘플의 전체 단백질에 해당하는 밴드의 강도로 나눈다. 이어서, 상기 값은 동일한 단백질에 대한 EGF-처리된 세포에서 얻어진 값으로 나눠진다. EGF와 항-EGF는 모두 비오벤에 의해 제공되었다. 웨스턴 블로팅을 위한 항체는 Santa Cruz Biotechnologies(Palo Alto, CA)에서 구입했다. 실험 프로젝트에서의 원시 데이터는 도 3에 반영되어 있고, 이하의 표 1에 요약된다.

EGFR
ERK
Akt
STAT-3

대조구 100 100 100 100 0% FBS
EGF 226 90.8 99.4 123
에를로티닙 1μM 14.3 0 0 130
Ab 1/2 0 0.3 5.2 63
에를로티닙 + Ab 0 0 0.3 58
실시예 2: 엔드 포인트로서 WB를 사용하여 EGF/EFGR 경로의 억제에 대한 항 EGF(단일 제제 및 게피티닙과 병용)의 평가
PC9 NSCLC 세포주에 있어서 EGF-EGFR 결합에 의해 활성화된 경로의 억제에 대한 항-EGF 항체 및 게피티닙 및 에를로티닙의 효과를 비교하기 위해 추가의 실험을 행하여 동일한 세포주에 있어서, 항 EGF 및 게피티닙 또는 에를로티닙의 병용이 단일 약제 치료보다 우수한지의 여부를 평가하였다. 본 실험은 T790M 돌연변이를 갖는 게피티닙에 대한 내성이 있는 PC9 세포주(PC9-GR4)에 있어서, EGF-EGFR 결합에 의해 활성화된 경로의 억제에 대한 EGFR T790M 돌연변이 양성 전이성 비소세포 폐암 환자에 대해서 US FDA에 의해 승인된 TAGRISSO™ AstraZeneca(AZD9291) 및 항 EGF 항체의 효과를 비교하고, 동일한 세포주에 있어서, 항 EGF와 AZD9291의 병용이 단일제 치료보다 우수한지의 여부를 평가하기 위해 고안되었다.
웨스턴 블로팅(WB) 방법으로 활성화를 실험하기 위한 재료 및 방법
세포주
본 연구의 수행에 있어서, TKI에 내성이 있는 PC9 유래 세포주가 이용되었다. 부모 PC9는 NSCLC 유래 세포이었고, 이것은 엑손 19에서 15bp의 결실을 갖고 게피티닙과 포티닙에 매우 민감하다(nM 범위에서 IC50). 이들은 1차 TKI 치료를 받은 NSCLC 환자 집단의 EGFR 돌연변이 세그먼트에 대한 모델을 나타낸다. 본 발명자는 2개월에 걸쳐 에를로티닙과 게피티닙의 농도를 증가시키면서 PC9 세포를 처리하였고 게피티닙과 에를로티닙(IC 50 약 5∼10μM)에 내성이 있는 6개 다른 세포주(PC9-ER과 GR1∼GR5)를 얻었다. 환자들과 마찬가지로, 6개 세포주 중 어느 것도 감수성 돌연변이(15bp 결실)를 손실하지 않았지만, 그들 중 2개에 내성 돌연변이 T790M가 존재했다. 이 두 세포주(PC9-GR1 및 GR4)는 T790M EGFR 돌연변이 단백질에도 결합할 수도 있는 Astra Zeneca(AZD9291)에 의해 개발된 신세대 EGFR TKI에 민감하다.
재료
모든 조직 배양 재료는 Biological Industries(Kibbutz Beit Haemek, Israel) 또는 Invitrogen(Paisley, Scotland, UK)에서 입수했다. 상기 PC9 세포주는 그 세포주를 규명한 연구원인 Dr. Mayumi Ono의 허가 하에 F. Hoffman-La Roche Ltd(Basel, Switerland)에 의해 제공되었다. 세포가 10% 소 태아 혈청(FBS), 50μg/mL 페니실린-스트렙토마이신 및 2mM L-글루타민으로 보충된 RPMI 배지에서 배양되고, 37℃에서 5% CO2의 가습 분위기 하에 유지되었다. 비오벤은 항-EGF항체를 제공했다. 이 프로젝트에서 사용된 항-EGF 항체는 몬타니드 아쥬반트와 함께 제제화된 rEGF-rP64k 콘쥬게이트의 4회 면역된 원숭이에 있어서의 면역화 연구에서 유래되었다. 혈청은 멜론 겔에서 처리하여 상보체와 같은 오염물을 제거했다. 이 정화 단계는 Scotia, Aberdeen, UK에서 행해졌다. ELISA 역가는 1/60000이었다. 게피티닙은 Selleck Chemicals(Houston, TX)로부터 구입했다. 웨스턴 블로팅을 위한 EGF 및 항체는 Santa Cruz Biotechnologies(Palo Alto, CA)에서 구입했다.
치료
실험 1 및 2에 있어서, 상기 PC9 세포주의 9개의 T-75 플라스크가 70% 컨플루언스까지 배양되었고, PBS로 2회 세척되었고, 무혈청 배지에서 밤새 배양되었다. 이어서, 혈청이 결핍된 세포를 재세척(x2)한 후 10ng EGF/mL가 함유된 무혈청 배지에서 37℃에서 10분 동안 미리 배양된 항-EGF(단일 약제 및 게피티닙과 병용)로 처리했다. 약물에 의한 세포 배양 시간은 약 10분이었다; 모든 경우에 있어서, 게피티닙 농도는 40nM이었고, 항체 희석은 1/20∼1/2 범위이었다. 이어서, 3종류의 실험이 행해졌다:
A. 혈청 기아: "24시간 혈청 기아"의 실험에 있어서, PC9 세포주의 T-75 플라스크 5개를 혈청 박탈에 제공하고(밤새), 세척하였고(x2), 10ng EGF/mL를 함유한 무혈청 배지에서 37 ℃에서 10분 동안 예비 배양된 항-EGF(단일 약제 및 게피티닙과 병용)로 처리되었다. 약물에 의한 세포 배양 시간은 15분 또는 2시간이었다; 게피티닙을 각종 농도에서 시험하였고, AZD9291 농도는 항상 0.5μM이었고, 에를로티닙 1μM이었고, 항-EGF는 1/2 희석하여 첨가되었다.
B. 혈청 기아/약물 치료: "24시간 혈청 기아와 약물 치료" 실험에 있어서 PC9 세포주의 5개의 T-75 플라스크를 동시에 혈청 박탈에 제공하고, 24시간 동안 항체 또는 모두를 게피티닙으로 처리했다. 다음날, 세포는 10ng EGF/mL를 함유하는 무혈청 배지에서 37℃에서 10분간 전배양된 항-EGF(단일 제제 및 게피티닙과 병용)로 처리되었다. 약물을 지닌 세포의 추가 배양 시간은 2시간이었고; 게피티닙은 0.5μM에서 실험되었다; 또한,
C. 비표준 조건: "비표준 조건 하"의 실험에 있어서, PC9(4개 플라스크) 세포는 혈청 기아에 제공되지 않았고 인간 EGF 대신 태아 소 혈청에 의한 활성화가 사용되었다. 그들은 PBS(x2)로 세척되었고, 약물은 10% FBS가 함유된 배지에 첨가되었고, 2시간 동안 배양되었다. 또한, 게피티닙과 AZD9291 농도는 0.5μM이었고, 에를로티닙은 1μM이었고, 항-EGF는 1/2 희석으로 첨가되었다
웨스턴 블로팅
치료 후, 배양물을 PBS로 세척하였고 프로테아제 및 포스파타아제 억제제-함유 용해 완충액에 용해시켰다. 동량의 단백질을 SDS-PAGE 겔 상에 높고, 막으로 옮기고 EGFR, p-EGFR, ERK1/2, p-ERK1/2, Akt, p-Akt, STAT3 및 pSTAT-3에 대한 항체로 블로팅했다. 밴드의 강도는 ImageJ 프로그램을 사용하여 측정한 후, 2단계 표준화에 제공되었다. 우선, 인산화된 밴드의 강도를 동일한 샘플의 총단백질에 상당하는 밴드의 강도로 나눈다. 이어서, 상기 값을 동일한 단백질에 대한 EGF-처리된 세포에서 얻어진 값으로 나누었다.
결과
PC9 세포에 있어서의 게피티닙 및 항 EFG(15분, 40nM 게피티닙)
제 1 실험(인산화 단백질의 정량화 및 웨스턴 블로팅)의 결과는 도 6a, 6b 및 6c에 나타내어진다. 상기 첫번째 실험에 있어서, 게피티닙은 EGFR, Erk 및 Akt 인산화를 억제했지만 STAT3는 활성화되었음이 확인되었다. 상기 비오벤 항-EGF 항체는 EGFR(활성화가 생리학적으로 1/20 및 1/10 희석 정도에서만 활성화되었다. 1/5에서는 활성화가 없었다) 및 Akt를 활성화시키지만 Erk 및 STAT3는 억제하는 것으로 나타났다. 게피티닙 + 항-EGFR의 병용에 있어서, 4개 단백질의 인산화가 억제되었다. 도 6a, 도 6b 및 도 6c에 나타내어진 데이터를 고려하면, 병용 치료는 단일 제제 처리보다 우수하였다.
제 2 실험(15분, 0.5μM 게피티닙)
상기 제 2 실험은 항-EGF 항체의 농도를 높이는 첫번째 실험 결과의 확인으로서 행해졌다. Akt 및 STAT-3의 경우, 게피티닙 단일제 레인에 대한 실험적 문제로 인해 결과를 알 수 없어 정량화가 제시되지 않았다. 제 2 실험은 제 1 실험에 있어서의 EGFR 및 Erk에 대해 얻어진 결과와 도 7a 및 7b에 나타낸 데이터를 고려한 항-EGF + 게피티닙의 병용의 우수성을 확인하였다.
제 3 실험 세트(2시간)
제 3 실험 세트는 2시간의 배양 시간을 사용하여 행해졌다. EGF에 의해 유도되지 않고 혈청이 결핍되지 않은 세포를 갖는 "비표준 조건" 하에 제 1 분석을 행하였다. 약물을 지닌 배양 시간은 이전 실험보다 훨씬 길었고(2 시간), 게피티닙 농도는 0.5μM까지 상승하였다. 게피티닙 단일 약제가 EGFR 및 Erk를 비활성화하였지만 STAT-3는 활성화하였음이 확인되었다. 이들 조건 하에, 상기 비오벤 항-EGF 항체는 Erk, STAT-3 및 EGFR을 다소 적게 비활성화하지만 Akt를 활성화시킨다. 비오벤 항-EGF 항체와 게피티닙을 병용하는 경우, 도 8a 및 8b에 나타낸 데이터를 고려하면, Erk, STAT3 및 EGFR은 거의 완전히 비활성화되었다.
제 3 실험 세트(혈청 기아 조건)
또 다른 실험은 "혈청 기아 상태"와 EGFR 유도 하에 행해졌다. 배양 시간은 2시간이었고, 게피티닙의 농도는 0.5μM이었다(제 3 실험과 동일). 또한, 게피티닙 단일 약제가 EGFR 및 Erk를 비활성화시켰지만 "비표준"조건 하에서는 더욱 강하게 STAT3가 활성화되었음이 명백해졌다. 항-EGF 단일제는 Erk, STAT3, 및 EGFR을 현저하게 비활성화시켰으나 Akt를 활성화시켰다. 항-EGF와 게피티닙을 병용하는 경우, 도 9a 및 9b에 나타낸 데이터를 고려하여, Erk, STAT3 및 EGFR은 거의 완전하게 비활성화되었고 Akt도 유의하게 억제되었다.
상기 약물 0.1 및 0.25μM를 투여받은 환자에게서 관찰된 생리학적 조건에 더욱 상응하는 게피티닙의 농도를 사용하여 2개의 추가 실험을 행했다. 실험에 있어서, 항-EGF는 게피티닙에 의한 STAT3 활성화를 억제하였고, pEGFR에 대한 병용의 시너지 효과가 확인되었다. Akt에 대한 결과(ERK에 대한 결과는 아니다)는 이전의 0.25μM의 경우의 경험과 일치하였고, 0.1μM에 대해서는 도 10a, 도 10b, 도 10c 및 도 10d에 도시된 바와 같이 역전되었다(ERK에 대해서는 일관성이 있지만, Akt에 대해서는 아니다). 이러한 불일치는 실험 상의 오류에서 기인할 수도 있다.
제 4 실험 세트(24시간)
게피티닙 + 항 EGF의 2개의 최종 병용 실험을 24시간 혈청 기아와 약물 치료로 행했다(방법 참조). 제 1 실험(하기 참조)은 부분적으로 실패했고, 몇몇 단백질을 측정할 수 없었다. 그러나, 도 11에 나타낸 바와 같이, 게피티닙, 항-EGF 및 병용에 의한 ERK의 완전한(또는 거의 완전한) 억제가 관찰되었고, 항-EGF에 의한 전체 STAT3의 적당한 하향 조절이 존재하는 것으로 보였다. 이 결과를 확인하기 위해서, 총단백질을 정상화하기 위한 하우스키핑 단백질(액틴)을 포함한 제 2 실험을 행했다. 상기 실험에 있어서, ERK와 EGFR의 인산화는 항-EGF + 게피티닙의 병용으로 완료되었다. 또한, 상기 병용에 있어서, 항-EGF는 STAT3의 게피티닙 유도 활성화를 완전히 역전시켰으며 게피티닙은 Akt의 항 EGF 유도 활성화를 차단했다. 최종적으로, 도 12a, 12b 및 12c에 나타낸 바와 같은 병용 또는 항체의 존재 하에 총 STAT3 레벨의 적당한 하향 조절이 확인되었고, 이하의 표 2에 요약되었다.
pEGFR pSTAT3 pAkt pERK
대조구 100 100 100 100
EGF 125,7 248,4 151,9 144,8
게피티닙 0.5μM 25,5 569,2 72,6 8,1
Ab1/2 0 116,9 118,2 4,9
Ab + 게피티닙 0 75,8 71,9 2,3
PC9 세포에 있어서의 에를로티닙 및 항-EFG
게피티닙에 의해 얻어진 결과를 바탕으로, 본 발명자는 "비표준 조건"과 "혈청 기아" 하에서의 에를로티닙 및 항-EGF에 대한 2개의 추가 실험을 행했다. 약물을 지닌 배양 시간은 2시간이었고 에를로티닙 농도는 1μM이었다. 2개의 실험의 결과는 도 13a 및 도 13b의 비표준 조건에 대해, 및 도 14a 및 도 14b의 "혈청 기아 상태"에 대해 나타내어진다.
그 결과는 게피티닙으로 얻은 것과 일치한다. 에를로티닙 단일제는 EGFR과 Erk를 비활성화시켰지만 STAT3는 활성화시켰다. 항-EGF 단일 제제는 Erk, EGFR 및 STAT3(특히, 도 14a 및 14b에 나타낸 바와 같은 혈청 기아 상태 하에서)를 현저하게 비활성시켰지만, Akt를 활성화시켰다. 항-EGF 및 에를로티닙을 병용하는 경우, Erk, Akt 및 EGFR은 거의 완전히 비활성화되었고 STAT3도 에를로티닙에 의해 처리된 세포에 비해 유의하게 억제되었다. 이러한 에를로티닙 + 항체의 시너지 효과는 혈청 기아와 표준 조건 모두에서 관찰되었다.
PC9 세포에 있어서의 AZD9291 및 항-EGF
또 다른 실험에서, 본 발명자는 민감성 및 내성(T790M) 돌연변이로 EGFR 단백질에 결합할 수 있는 차세대 TKI인 AZD9291을 사용했다. US와 EU에서 판매 승인을 받았고 에를로티닙/게피티닙으로 진행되는 NSCLC 환자를 대상으로 상용화되고 있다. 항-EGF 항체와 AZD9291의 상호 작용은 "혈청-기아 상태"조건 하에서 시험하였고 그 결과는 도 15a 및 도 15b에 나타낸다. 항-EGF 항체는 ERK를 완전히 차단했고 EGFR 인산화도 억제했고, 상기 효과는 2세대 TKI AZD9291만큼 강했다. 또한, 항-EGF 항체는 Akt를 유도했다.
결론
EGFR-돌연변이된 TKI 민감성 PC9 세포에 게피티닙 또는 에를로티닙의 투여는 치료에 대한 내성 획득의 제 1 단계로 여겨지는 STAT3의 활성화가 유도되었다. 2시간 및 24시간 배양의 배양 기간은 혈청 기아 하에서 상기 효과를 매우 증가시켰다.
항-EGF에의 PC9 세포의 노출은 STAT3을 활성화시키지 않는다. 한편, 2시간 및 24시간 배양으로 재현할 수 있으며 더욱 현저한 억제 효과를 갖는 경우도 있다.
항-EGF 단일 제제는 Akt를 활성화시키지만 게피티닙 또는 에를로티닙도 존재하면, 상기 효과가 역전된다. "혈청 기아" 실험 조건 하에, EGFR 및 ERK 1/2인산화에 대한 항-EGF의 효과는 이들 시그널링 분자에 대한 게피티닙 또는 에를로티닙의 효과만큼이나 현저하다. 게피티닙과 항-EGF의 병용 치료는 pEGFR 및 pERK1/2 억제에 대한 추가(명백하게는 상승) 효과를 나타내고, 연구 중인 4개 단백질, 즉 EGFR, ERK, Akt 및 STAT3의 활성화를 차단한다.
예상 밖으로, 상기 병용 치료는 "혈청 기아" 상태와 "비표준" 상태 모두에서 게피티닙 또는 에를로티닙에 의한 STAT-3의 활성화를 재현가능하게 역전시킨다. 게피티닙의 경우에 있어서, 배양 기간이 2시간 또는 24시간까지 연장될 때, 역전이 완료되고, STAT3의 인산화는 비유도된 혈청 기아 세포의 레벨로 떨어진다. 24시간 배양의 경우에 있어서, 항-EGF에 의한 총 STAT3 단백질의 적당한 하향 조절도 관찰되었다.
상기의 모든 결과는 TKI에 대한 내성의 출현을 지연시킬 가능성이 있기 때문에 EGFR 돌연변이 NSCLC 환자에게 있어서 1차 병용 치료가 유익할 수 있음을 시사한다. 항-EGF 항체는 실질적으로 Erk를 차단하고, TKI에 내성이 있는 PC9-유도된 T790M 세포주에 있어서 EGFR 인산화를 부분적으로 억제한다. 단일 요법으로 항-EGF 항체는 제 2 세대 약물 AZD9291만큼 효과적이다.
실시예 3 : 엔드 포인트로서 WB를 사용한 EGF/EGFR 경로의 억제에 대한 항 EGF(단일 제제 및 TKI와의 병용)의 평가
추가 실험에 있어서, PC9 NSCLC 세포주에 있어서 EGF-EGFR 결합에 의해 활성화된 경로의 억제에 대한 AZD9291에 의한 항-EGF 항체(3세대 TKI)의 효과를 비교하기 위해 행했다. 상기 실험은 동일한 세포주에서 항 EGF와 TKI의 병용이 단일 제제 치료보다 우수한지의 여부를 평가하기 위해 고안되었다. 또한, T790M 돌연변이를 지닌 겔피티닙에 내성이 있는 PC9 세포주(PC9-GR4)에 있어서, EGF-EGFR 결합에 의해 활성화된 경로의 억제에 대한 항-EGF 항체 및 AZD9291의 효과를 비교하고, 동일한 세포주에 있어서, 항 EGF와 AZD9291의 병용은 단일 제제 처리보다 우수한지의 여부를 평가하기 위해 고안되었다. 최종적으로, 상기 실험은 PC9 NSCLC 세포주에 있어서, TKI에 대한 내성과 관련된 분자 메카니즘에 대한 항-EGF의 효과를 측정하기 위한 시도이었다.
웨스턴 블로팅(WB) 방법으로 활성을 실험하기 위한 재료 및 방법
세포주
상기한 바와 같이, PC9 세포주는 EGFR의 엑손 19에서 15bp의 결실을 갖고 상기 세포주를 TKI에 민감하게 한다. 그것은 TKI 치료를 받는 NSCLC 환자 집단의 EGFR 돌연변이 세그먼트에 대한 모델을 나타낸다. 이러한 노력의 일환으로, TKI에 내성이 있는 PC9 유래 세포주가 개발되었다. 부모 PC9는 15bp의 결실을 가지며 게피티닙 및 AZD9291(nM 범위로 IC50) 등의 1세대, 2세대 및 3세대 TKI에 매우 민감한 NSCLC 유래 세포이다. PC9 세포는 2개월에 걸쳐 에를로티닙과 게피티닙의 농도를 증가시키면서 처리되었고 게피티닙과 에를로티닙(IC50 약 5-10μM)에 내성이 있는 6개의 다른 세포주(PC9-ER 및 GR1∼GR5)를 얻었다. 환자들과 동일하게, 6 개 세포주 중 어느 것도 민감성 돌연변이(15bp 결실)를 손실하지 않았지만, 그들 중 2개에 내성 돌연변이 T790M가 존재한다. 이 2개의 세포주(PC9-GR1 및 GR4)는 T790M EGFR 돌연변이 단백질에도 결합할 수 있는 Astra Zeneca(AZD9291)가 개발한 신세대의 EGFR TKI에 민감하다.
재료
모든 조직 배양 재료는 Biological Industries(Kibbutz Beit Haemek, Israel) 또는 Invitrogen(Paisley, Scotland, UK)에서 입수했다. 상기 PC9 세포주는 그 세포주를 규명한 연구원인 Dr. Mayumi Ono의 허가 하에 F. Hoffman-La Roche Ltd(Basel, Switzerland)에 의해 제공되었다. 세포가 10% 소 태아 혈청(FBS), 50μg/mL 페니실린-스트렙토마이신 및 2mM L-글루타민으로 보충된 RPMI 배지에서 배양되고, 37℃에서 5% CO2의 가습 분위기 하에 유지되었다. 비오벤은 항-EGF항체를 제공했다.
상기 연구에 2종의 항체가 사용되었다:
-Ab1: 상술한 바와 같이, 몬타니아 보조제와 함께 제제화된 rEGF-rP64k CIMAVax-EGF 콘쥬게이트의 4회 면역화를 받은 원숭이에 있어서의 면역화 연구로부터 항-EGF 항체가 유래되었다. 이들은 소위 "Abl" 또는 "비오벤 항-EGF 항체"라 불린다. 혈청은 멜론 겔 상에서 처리하여 상보체 등의 오염물을 제거하였다. 이 정제 단계는 Scotia, Aberdeen, UK에서 행해졌다. 전처리 ELISA 역가는 1/60000이었다. 게피티닙은 Selleck Chemicals(Houston, TX)로부터 구입하였다. 웨스턴 블로팅을 위한 EGF 및 항체는 Santa Cruz Biotechnologies(Palo Alto, CA)에서 구입하였다.
-Ab2: 수식된 CTB 및 EGF 서열을 함유하는 재조합 융합 분자에 의한 토끼의 면역화로부터 항-EGF 항체가 유래되었다. 이들은 소위 "Ab2" 또는 "비오벤 항-EGF2 항체"라 불린다. 수식된 CTB 및 EGF 서열을 함유하는 면역원성 재조합 융합 분자를 서열 1 및 또한, 이하 서열을 갖는 도 20a에 나타내었다(본원에 그 전체를 참조로 포함하는 WO2013/076580에도 기재되어 있음):
서열 1:
Figure pct00001
상기 실험에서 사용되지는 않았지만 추가의 항-EGF 항체는, 서열 2 및 또한, 이하의 서열을 갖는 도 20b(그 전체를 참조로 포함하는 WO2013/076580에도 기재되어 있음)에 나타낸 바와 같이, 수식된 CTB 및 EGF 서열을 함유하는 재조합 융합 분자에 의한 토끼의 면역화로부터 유래될 수 있다.
서열 2:
Figure pct00002
하기 하이브리도마는 European Collection of Cell Cultures, Culture Collections, Public Health England, Porton Down, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG (ECACC)에 기탁되어 있다.
세포주 ECACC 수납 번호 기탁일
서열 2 2016년 3월 15일
서열 1 2016년 3월 17일
상기 기탁은 특허 절차상의 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약(부다페스트 조약)의 조항에 의거하여 작성되었다. 이것은 기탁일로부터 30년 동안 기탁을 유지할 수 있다. 이들 세포주는 부다페스트 조약의 조항에 따라 ATCC가 이용할 수 있으며 Bioven과 ATCC 간의 합의에 따라야하고, 이는 먼저 도래하는 관련 미국 특허의 발행 시 또는 임의의 미국 또는 외국 특허 출원의 공보에 공개 시에 세포주의 영구적이고 제한없는 이용 가능성을 보장하고, 35 USC §122 및 그에 따른 청장의 규칙에 따라 미국 특허 및 상표 청장이 부여한 세포주의 이용 가능성을 보장한다(특히 886 OG 638과 관련하여 37 CFR § 1.14 포함).
혈액은 사전 면역화 몇 수회 면역화 후에 수집되었다. 혈청을 멜론 겔 상에서 정제하여 상보체를 포함한 비면역글로불린을 제거하였다. 상기 정화 단계는 Scotia, Aberdeen, UK에서 행해졌다.
치료
표준 실험에 있어서, PC9 또는 PC9-GR4 세포주의 T-25 플라스크를 혈청 박리에 제공하였고(밤새), 세정하였고(x2), 10ng EGF/mL를 함유하는 무혈청 배지로 37℃에서 10분 동안 예비 배양된 항-EGF(단일 제제 및 게피티닙 또는 AZD9291과의 병용)로 처리되었다. 약물을 지닌 세포의 배양 시간은 2시간 또는 24시간이었다. 게피티닙 또는 AZD9291의 농도를 세포주에 따른 농도에서 시험했다. 5일간의 실험에 있어서, PC9 세포는 혈청 기아에 제공되지 않았지만 사람 혈청과 함께 배양되었다. 이들은 PBS(x2)로 세정되었고, 약물(항-EGF, 게피티닙 또는 병용)이 10% 인간 혈청을 함유하는 배지에 첨가되었고, 5일 동안 배양되었다.
웨스턴 블로팅
처리 후, 배양물을 PBS로 세정하였고 프로테아제 및 포스파타아제 억제제-함유 용해 완충액에 용해시켰다. 동량의 단백질을 SDS-PAGE 겔 상에 높고, 막으로 옮기고 EGFR, p-EGFR, ERK1/2, p-ERK1/2, Akt, p-Akt, STAT3 및 pSTAT-3, Bmil, HES 1, PARP, 절단된 PARP, Notch3, 절단된 Notch3, AXL, pYAP 및 튜블린에 대한 항체로 블로팅했다. 밴드의 강도는 ImageJ 프로그램을 사용하여 측정한 후, 2단계 표준화에 제공되었다. 우선, 인산화된 밴드의 강도를 동일한 샘플의 총단백질에 상당하는 밴드의 강도로 나눈다. 이어서, 상기 값을 동일한 단백질에 대한 EGF-처리된 세포에서 얻어진 값으로 나누었다.
결과
PC9 세포에 있어서의 AZD9291 및 항-EFG(Abl)
제 1 실험(2시간, 0.2μM 게피티닙)
제 1 실험(인산화된 단백질의 웨스턴 블로팅 및 정량화)의 결과는 도 16a 및 16b에 도시된다. 도면에서 알 수 있는 바와 같이, 0.2μM에서 AZD9291에 의한 EGFR, STAT3, Akt 및 Erk의 인산화의 억제가 있었다. 통상적으로, 항체 단일 제제는 pSTAT3 및 pErk를 억제하지만 Akt를 활성화시켰다. 상기 병용은 pEGFR과 pErk의 경우에 있어서, 2개의 약물의 단독 사용에 비해 월등히 우수했다. 또한, 하기 표 3에 요약된 바와 같이, pAkt는 완전히 억제되었고 pSTAT3은 베이스 레벨 이하로 떨어졌다.
pEGFR pSTAT3 pAkt pErK1/2
대조구 100 100 100 100
EGF 101,5 218,1 52,4 60
AZD9291 76,3 146,6 2,9 3,7
Ab1 118 80,4 42,2 34,1
Ab1 + AZD9291 66,4 70,9 0 2,4
제 2 실험(24시간, 0.1μM AZD9291)
추가 실험에 있어서, PC9 세포를 약물과 함께 24시간 동안 배양하였다. 이 보다 긴 배양 시간으로 인하여 AZD9291의 농도는 0.1μM로 감소되어 약물에 의한 EGFR 및 Erk의 완전한 비활성화를 방지하였다. 결과를 도 17에 나타내었다. 항-EGF 항체 단일 제제의 유일한 효과는 사용된 항체의 앨리쿼트의 가능한 비활성화에 대한 우려가 있는 Akt 활성화이었다(주: 그 의심 때문에 상기 웨스턴 블롯은 정량화되지 않았다).
PC9-GR4(T790M 양성)에서의 AZD9291 및 항-EGF1(Ab1)
제 1 실험(2시간, 0.2μM AZD9291)
이 세포주에 있어서, EGF는 Erk, STAT-3 또는 Akt의 인산화에 많은 영향을 미치지 않았으며 pEGFR에 대한 억제 효과도 갖는 것으로 보였다. 2시간 후, AZD9291(0.2μM에서)는 pEGFR를 완전히 차단하였고 부분적으로 pAkt 및 pErk를 차단하였다. pSTAT3에 대한 명확한 자극 효과는 없었다. 항-EGF 항체는 Akt 인산화를 자극하였다(부모 PC9에서와 동일). pSTAT-3 및 pAkt의 경우에 있어서, 두개 제제의 병용은 AZD9291 단일 제제의 범위에 있었고, pEGFR 및 특히 pErk의 경우에서 보다 우수하였다. 도 18a 및 도 18b에 도시되고 표 4에 요약되었다.
pEGFR pSTAT3 pAkt pErK1/2
대조구 100 100 100 100
EGF 51,3 92,7 130,3 190,5
AZD9291 2,5 60 42,7 53,6
Ab1 65,7 147,2 467 195,8
Ab1 + AZ9291 1,6 82,2 172,2 1,5
제 2 실험(24시간, 0.2μM AZD9291)
추가 실험은 24시간 및 AZD9291의 동일 농도(즉, 환자에게서 달성된 생리학적 농도의 범위 내)에서 행해졌다. 3세대 TKI는 EGFR, Akt 및 Erk의 인산화를 억제하였지만, (게피티닙 및 민감한 PC9 세포주의 경우에 있어서의 본 발명자의 관측과 동일하게) STAT3를 명백하게 활성화시켰다. 항-EGF 단일 제제는 pAkt를 자극하였고 다른 마커에 많은 영향을 주지 않는 것으로 보인다. 그러나, 완전한 pEGFR 및 pErk 억제, Akt의 항체 유도된 인산화의 AZD9291에 의한 역전 및 ZSD9291에 의한 상기 STAT3 항체에 의한 차단에 의해 그 병용은 두개의 제제보다 명백하게 우수하였다. 도 19a 및 도 19b에 도시하였고, 표 5에 요약하였다.
EGFR STAT3 Akt ErK1/2
대조구 100 100 100 100
EGF 116,4 150,6 98,5 96,5
AZD9291 138,4 847,5 26,8 20,5
Ab 101 84,9 169 72,5
Ab + AZ9291 0 503,9 63,8 1,6
PC9 세포에서 있어서의 게피티닙 및 항-EGF2(Abl). 추가 마커
STAT3 이외에, 다른 마커와 경로는 EGFR-돌연변이 종양 세포에서의 게피티닙에 대한 내성 발병과 관련이 있다. 예비 분석을 행하여 절단된 Notch3(Notch3의 활성 형태), 포스포르-YAP, Bmil 및 Hesl(줄기 세포 관련) 및 AXL(EMT 전이 관련)을 시험했다. 또한, RART가 조사되어 항체가 아폽토시스를 유도하는지를 측정하였다. 이전 실험에서 얻어진 PC9 세포주의 추출물을 사용하였다. 제 1 실험에 있어서, 24시간에서의 Ab1, 게피티닙 0.5μM 및 상기 언급된 마커의 병용에 대한 효과를 평가 하였다. 상기 항-EGF 항체는 Hes1 및 AXL를 현저하게 하향 조절하였고, Notch 절단 및 YAP 인산화를 억제하였다. 그다지 현저하지 않은 Bmil의 하향 조절도 관찰되었다. 게피티닙에는 이러한 효과가 없었다. PARP 절단에 관해서는 도 21a, 21b, 21c 및 21d에 나타내고, 표 6 및 7에 요약된 바와 같이, 두 약물 모두 24시간 후에 그것을 유도할 수 있었다.
Bmi1 Hes1 PARP 토탈 Notch3 절단 Notch3
대조구 100 100 100 100 100
EGF 113,2 109,3 128 129,7 115,8
게피티닙 100,1 86,5 110 120,8 98,9
Ab 60,1 26,7 70,2 76,7 20,8
Ab + 게피티닙 77,4 22,8 76,4 76,2 22,8
AXL pYAP(Ser397)
Ctrl 100 100
EGF 123,9 80
게피티닙 135,4 137,6
Ab1 12,8 56,6
Ab1 + 게피티닙 15,8 36,4
PC9 세포에 있어서의 항-EFG Ab1 및 Ab2의 비교(추가 마커를 포함)
첫 번째로 24시간 실험에서 Ab1 및 Ab2 단일 제제의 효과를 비교하였다. 두 항체 모두 동일한 방법으로 pAkt를 자극했다. 상기 실험에 있어서, 그들은 pErk에 영향을 미치지 않았다(그러나, EGF는 그것을 유도하는데 실패하였다). STAT-3에 대하여, Ab2는 1/2에서 STAT-3의 EGF-자극된 인산화의 더욱 강한 억제를 유도하였다. pEGFR에 대한 결과는 반복되어야 한다. 또한, 24시간 실험이 대기 중이다. 나머지 마커들과 관련하여, Ab2는 Hes1을 하향 조절하고, Notch3 절단을 차단하고, PARP 절단을 유도하는 것이 더욱 강한 것이 명백하였다. 또한, 도 22a, 도 22b, 도 22c 및 도 22d에 도시되고 표 8 및 9에 요약된 바와 같이, Bmil의 경우에 있어서, 설명할 수 없는 우수한 대역의 출현을 유발시켰다.
pEGFR pSTAT3 pAkt pErK1/2
대조구 100 100 100 100
EGF 91 269,7 119,8 159,2
Ab1-1/5 96,7 432,3 173,2 177,7
Ab1-1/2 210,7 295,7 223,1 170,5
Ab2-1/5 157,6 421,2 177,3 116,9
Ab2-1/2 223,5 140,5 210,6 165,6
대조구 EGF Ab1-1/5 Ab1-1/2 Ab2-1/5 Ab2-1/2
Bmi1 100 104,8 144,4 144,7 106 71,3
Hes1 100 85,9 131,6 92,4 134 37,5
PARP 100 109,9 107,9 98,9 100,2 83,3
절단된 PARP 100 148,7 192,2 129,3 182,9 236,8
Notch 100 208 88,3 41,8 229,7 227,2
절단된 Notch 100 135,6 188,6 61,5 109,2 57,4
결과
상기 실험에서 얻어진 포지티브 결과를 고려하여, 5일 배양 후 2개 항체 단일 제제 및 게피티닙과의 병용의 효과를 평가하였다. 세포는 EGF로 유도하지 않고 인간 혈청에서 성장되었다(방법 참조). 가장 현저한 결과 중 하나는 도 23에 도시된 바와 같이 야생형 단백질보다 낮은 분자량의 과-인산화된 Notch3, Akt 및 STAT-3 밴드의 출현이었다. 이들 밴드는 여러 가지 이유로 유래될 수 있는데, 단백질 분해 분열이 가장 유력하다. 24시간 후에 관찰된 Bmil과 Hesl에 대한 영향은 아직 확인되지 않았다. 한편, 도 24에 도시된 바와 같이 24시간에서 관찰된 것보다 현저하게 강한 Ab2에 의한 PARP 절단의 강한 유도가 있었다(주: 이들 웨스턴 블롯은 엑스트라 밴드의 출현으로 인해 정량화되지 않았다)
결론
EGFR-돌연변이된 TKI 민감성 PC9 세포 및 T790M, EGFR 돌연변이된 AZD9291- 민감성 PC9-GR4에 대한 24시간 동안 AZD9291의 투여는 치료에 대한 내성의 획득에서 제 1 단계로 여겨지는 STAT3의 활성화를 유도한다.
항-EGF(Abl) 단일 제제는 Akt를 활성화하지만, AZD9291도 존재하면 이 효과는 역전된다.
AZD9291 및 항-EGF2(Abl)의 병용 치료는 시험된 두 세포주(PC9, PC9-GR4)에 있어서 연구 중인 4개 단백질(EGFR, ERK, Akt, STAT3)의 활성화를 억제하고, pEGFR 및 pERK1/2 억제에 대한 상승 작용 효과를 나타낸다. 놀랍게도, 병용 치료는 게피티닙 또는 AZD9291에 의한 STAT3의 활성화를 재현 가능하게 역전시킨다.
병용에 있어서, 항-EGF(Abl)의 첨가는 면역 요법으로서 게피티닙의 효과에 다음과 같은 영향을 미친다 : TKI에 의해 영향을 받지 않는 YAP3을 억제한다; TKI에 의해 영향을 받지 않는 AXL, EMT 마커를 억제한다; TKI에 의해 영향을 받지 않는 Notch3의 절단을 억제한다; TKI에 의해 영향을 받지 않는 암줄기 세포 마커인 HESI를 감소시킨다; 및 PARP 절단을 증가시킨다.
또한, TKI에 항EGF의 첨가는 TKI의 특징 중 하나인 STAT3의 활성화가 역전되지만 내성의 출현과 직접 관련된다.
또한, 항-EGF(Abl) 단일 제제는 TKI에 대한 내성과 관련된 다수의 경로에 영향을 미친다. 24시간에서, 이것은 YAP 인산화, Notch 절단을 억제하고 AXL 및 Hes1을 하향 조절한다. 게피티닙과 항체 모두 PARP 절단(아폽토시스의 마커)을 유도한다.
상기 실험 데이터의 증거는 TKI에 대한 내성의 출현을 지연시킬 가능성이 있기 때문에 EGFR 돌연변이 NSCLC 환자에게 1차 병용 치료가 유익할 수 있다는 이전 연구 결과에 더욱 힘을 더해준다.
pSTAT3 차단, 줄기 세포 마커의 하향 조절 및 아폽토시스 유도의 측면에서, 토끼로부터 유래된 항체(Ab2)는 영장류로부터 유래된 항체(Ab1)보다 우수하거나 적어도 동등하다 .
항체 Ab2는 추가로 해결되어야 하는 현상인 Notch3, STAT3 또는 Akt 등의 몇 가지 주요 단백질의 절단을 유도한다. 문헌으로부터 Caspase 3이 Akt를 절단할 수 있다는 것을 이해한다.
공지되어 있는 바와 같이 NSCLC EGFR 돌연변이 환자에게 1차 TKI에 의한 치료는 전이성 질환의 갑작스런 재발 및 치료에 대한 내성을 야기한다. 현재의 1차 TKI에 대한 내성의 출현과 관련된 파라미터는 종양 세포주, 동물 및 치료 환자로부터 수집한 샘플에서의 연구에서 관찰된 바와 같이, STAT3 및 YAP의 활성화, AXL 및 MET의 증가된 발현을 포함한다.
임의의 특정 이론에 구속됨이 없이, 상기 실시예가 시사하는 바와 같이 TKI + EGF PTI의 병용은 pSTAT3를 파괴하고, Notch3의 단백질 가수분해의 분열 및 그 표적 유전자 HES1는 도 29에 나타낸 바와 같이 상기 병용에 대해 민감한 것으로 나타내어진다. 한편, 도 27에 나타낸 바와 같이, TKI 단독 요법에 의한 pSTAT3, Notch3의 단백질 가수분해의 분열 및 그 표적 유전자 HES1에 대한 효과가 없는 것으로 나타내어진다. 또한, TKI와 EGF PTI의 병용에 의해 TKI 단독 요법으로 상향 조절된 AXL, MET 등의 분자는 억제되는 것에 유의한다. 또한, TKI + EGF PTI에서는 TKI 단독보다 PARP 분열이 더욱 관찰된다. 본 발명에 따른 병용 요법은 초기 EGFR TKI 반응을 향상시키고 내성의 개시를 방지하기 위한 이론적 설계 방법의 미충족 요구에 대한 하나의 접근법을 제안하고, EGFR TKI와 EGF PTI의 병용은 이러한 치료 접근법 중 하나이다.
예시적인 실시형태가 이들 교시를 더욱 설명하기 위해 제시되었지만, 이들 교시가 예시적인 실시형태만으로 한정되지 않는다는 것이 이해되어야 한다.
본 발명이 다양한 실시형태에 관하여 기재되었지만, 이들 교시가 첨부된 청구 범위의 사상 및 범주 내에서 광범위의 추가 및 다른 실시형태들도 가능함을 이해해야 한다.
본 발명은 TKI 및 항-EGF 항체의 상승 작용적인 병용을 나타내는 다양한 실시형태와 관련하여 기술되었지만, 병용 치료가 다양한 화학 치료 요법과 더 조합되어 암의 치료에 있어서의 화학 요법의 치료 효과를 증가시킬 수 있다는 것은 당업자에게 자명할 것이다.
본 명세서는 본 명세서내에 인용된 참고 문헌의 교시의 관점에서 가장 잘 이해된다. 본 명세서내의 실시형태는 본 발명의 실시형태의 대한 예시를 제공하고, 본 발명의 범위를 제한하도록 한정되어서는 안된다. 당업자는 많은 다른 실시형태가 본 발명에 포함된다는 것을 쉽게 알 수 있다. 당업자는 통상의 실험만을 사용하여 본원에 기술된 본 발명의 특정 실시형태에 대한 많은 등가물을 이해할 수 있거나 또는 확인할 수 있다. 이러한 등가물은 하기 첨부된 청구 범위에 포함되는 것으로 의도된다.

Claims (22)

  1. 탈조절된 인간 표피 세포 증식 인자 수용체(HER/인간 EGFR)에 의해 유도된 비소세포 폐암(NSCLC)의 환자를 치료하는 방법으로서,
    상기 환자는 상기 EGFR의 종양 발현 돌연변이형을 갖고,
    상기 방법은 치료를 이러한 필요로 하는 환자에게 티로신 키나아제 억제제(TKI)와 능동 면역 표적화 EGF를 병용하기 위한 유연한 활성 요법을 투여하는 단계를 포함하고,
    상기 방법에 있어서, 상기 TKI는 10∼150mg 범위의 평균 1일 투여량에 기초한 연속 요법에 따라 투여되고, 상기 능동 면역은 1주에 3회, 2회 또는 1회, 2주에 1회, 3주에 1회 또는 한달에 적어도 1회로 반복적으로 치료 유효량에 따라 혼합 투여되는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 TKI는 게피티닙 또는 에를로티닙, 또는 그들의 약학적으로 허용되는 염으로 이루어지는 군에서 선택되고, 상기 EGFR의 종양 발현 돌연변이형을 지닌 환자의 치료를 위해 상기 TKI는 10∼150mg 범위의 평균 1일 투여량에 기초한 연속 요법에 따라 투여되고, 상기 능동 면역 표적화 EGF는 1주에 3회, 2회 또는 1회, 2주에 1회, 3주에 1회 또는 한달에 적어도 1회로 반복적으로 치료 유효량에 따라 혼합 투여되는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 암은 그 전이 형태를 포함하는 NSCLC, HNSCC이고, 상기 TKI는 게피티닙 또는 에를로티닙 또는 그들의 약학적으로 허용되는 염으로 이루어지는 군에서 선택되고, EGFR 돌연변이를 갖는 종양을 지니고 TKI 치료에 대한 내성이 획득된 환자에게 상기 TKI는 10∼150mg 범위의 평균 1일 투여량에 기초한 연속 요법에 따라 투여되고, 상기 EGF 표적화 능동 면역은 1주에 2회 또는 1회, 2주에 1회로 반복적으로 치료 유효량에 따라 혼합 투여되고, 상기 방법은 TKI 치료에 대한 내성의 극복이 얻어지는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 암은 그 전이 형태를 포함하는 NSCLC이고, 상기 TKI는 게피티닙 또는 에를로티닙, 아파티닙, 다코미티닙 또는 그들의 약학적으로 허용되는 염으로 이루어지는 군에서 선택되고, 상기 게피티닙, 에를로티닙, 아파티닙 및 다코미티닙으로 이루어지는 군에서 선택된 TKI에 의한 치료에 대해 획득 내성을 지닌 환자에게 상기 TKI는 10∼150mg 범위의 평균 1일 투여량에 기초한 연속 요법에 따라 투여되고, 상기 능동 면역 표적화 EGF는 1주에 2회 또는 1회 또는 2주에 1회로 반복적으로 치료 유효량에 따라 혼합 투여되는 방법.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 TKI는 EKB-569(펠리티닙), HKI-272(네라티닙), HKI-357, CI-1033, BIBW 2992 및 PF-00299804 또는 그들의 약학적으로 허용되는 염으로 이루어지는 군에서 선택되는 비가역적 티로신 키아니제 억제제인 방법.
  6. 제 17 항에 있어서,
    상기 TKI는 1-(4-(4-(3,4-디클로로-2-플루오로페닐아미노)-7-메톡시퀴나졸린-6-일옥시)피페리딘-1-일)프로프-2-엔-1-온, WZ 3146, WZ 4002 및 WZ 8040 또는 그들의 약학적으로 허용되는 염으로 이루어지는 군에서 선택되는 방법.
  7. 탈조절된 인간 표피 세포 성장 인자 수용제(HER/인간 EGFR)에 의해 유도된 비소세포 폐암 환자를 치료하는 방법으로서,
    상기 환자는 상기 EGFR의 종양 발현 돌연변이형을 갖고,
    상기 방법은 이러한 치료를 필요로 하는 환자에게 티로신 키나아제 억제제(TKI) 및 모노클로날 항-EGF 항체의 수동 투여를 병용하기 위한 유연한 활성 요법을 투여하는 단계를 포함하고,
    상기 방법에 있어서, 상기 TKI는 10∼250mg 범위의 평균 1일 투여량에 기초한 연속 요법에 따라 투여되고, 상기 수동 면역은 1주에 3회, 2회 또는 1회, 2주에 1회, 3주에 1회 또는 한달에 적어도 1회로 반복적으로 치료 유효량에 따라 혼합 투여되는 방법.
  8. 제 7 항에 있어서,
    상기 TKI는 EKB-569(펠리티닙), HKI-272(네라티닙), HKI-357, CI-1033, BIBW 2992 및 PF-00299804 또는 그들의 약학적으로 허용되는 염으로 이루어지는 군에서 선택되는 비가역적 티로신 키나아제 억제제인 방법.
  9. 제 7 항에 있어서,
    상기 TKI는 1-(4-(4-(3,4-디클로로-2-플루오로페닐아미노)-7-메톡시퀴나졸린-6-일옥시)피페리딘-1-일)프로프-2-엔-1-온, WZ 3146, WZ 4002 및 WZ 8040 또는 그들의 약학적으로 허용되는 염으로 이루어지는 군에서 선택되는 방법.
  10. 탈조절된 인간 표피 세포 성장 인자 수용체(HER/인간 EGFR)에 의해 유도된 비소세포 폐암(NSCLC) 환자를 치료하는 방법으로서,
    상기 환자는 상기 EGFR의 종양 발현 돌연변이형을 갖고,
    상기 방법은 이러한 치료를 필요로 하는 환자에게 티로신 키나아제 억제제(TKI) 및 모노클로날 항-EGF 항체의 수동 투여를 병용하기 위한 유연한 활성 요법을 투여하는 단계를 포함하고,
    상기 방법에 있어서, 상기 TKI는 10∼250mg 범위의 평균 1일 투여량에 기초한 연속 요법에 따라 투여되고, 상기 수동 면역은 1주에 3회, 2회 또는 1회, 2주에 1회, 3주에 1회 또는 한달에 적어도 1회로 반복적으로 치료 유효량에 따라 혼합 투여되고,
    상기 방법은 TKI 치료에 대한 내성을 획득하는 것을 방지하는 방법.
  11. 제 10 항에 있어서,
    상기 TKI는 EKB-569(펠리티닙), HKI-272(네라티닙), HKI-357, CI-1033, BIBW 2992 및 PF-00299804 또는 그들의 약학적으로 허용되는 염으로 이루어지는 군에서 선택된 비가역적 티로신 키나아제 억제제인 방법.
  12. 제 10 항에 있어서,
    상기 TKI는 1-(4-(4-(3,4-디클로로-2-플루오로페닐아미노)-7-메톡시퀴나졸린-6-일옥시)피페리딘-1-일)프로프-2-엔-1-온, WZ 3146, WZ 4002 및 WZ 8040 또는 그들의 약학적으로 허용되는 염으로 이루어지는 군에서 선택되는 방법.
  13. 돌연변이 T790M을 포함하는 탈조절된 인간 표피 세포 성장 인자 수용체(HER/인간 EGFR)에 의해 유도된 비소세포 폐암(NSCLC) 환자를 치료하는 방법으로서,
    상기 환자는 상기 EGFR의 종양 발현 돌연변이형을 갖고,
    상기 방법은 이러한 치료를 필요로 하는 환자에게 티로신 키나아제 억제제(TKI) 및 모노클로날 항-EGF 항체의 수동 투여를 병용하기 위한 유연한 활성 요법을 투여하는 단계를 포함하고,
    상기 바법에 있어서, 상기 TKI는 10∼250mg 범위의 평균 1일 투여량에 기초한 연속 요법에 따라 투여되고, 상기 수동 면역은 1주에 3회, 2회 또는 1회, 2주에 1회, 3주에 1회 또는 한달에 적어도 1회로 반복적으로 치료 유효량에 따라 혼합 투여되고,
    상기 TKI의 투여 후에 상기 모노클로날 항-EGFR 항체가 투여되는 방법.
  14. 돌연변이 T790M을 포함하는 탈조절된 인간 표피 세포 성장 인자 수용체(HER1/인간 EGFR)에 의해 유도된 비소세포 폐암(NSCLC) 환자를 치료하는 방법으로서,
    상기 환자는 상기 EGFR의 종양 발현 돌연변이형을 갖고,
    상기 방법은 이러한 치료를 필요로 하는 환자에게 티로신 키나아제 억제제(TKI) 및 EGF 표적화 능동 면역을 병용하기 위한 유연한 활성 요법을 투여하는 단계를 포함하고,
    10∼250mg 범위의 평균 1일 투여량에 기초한 연속 요법의 상기 TKI가 투여 되기 전에, 상기 능동 면역이 1주에 3회, 2회 또는 1회, 2주에 1회, 3주에 1회 또는 한달에 적어도 1회로 반복적으로 치료 유효량에 따라 투여되고,
    상기 방법은 TKI 치료에 대한 내성을 획득하는 것을 방지하는 방법.
  15. EGF 면역원성 단백질을 피험자에게 투여하는 단계를 포함하는 피험자의 NSCLC를 치료하는 방법으로서,
    상기 면역원성 단백질은 STAT3 활성화를 감소시키는 치료학적 양으로 존재하는 방법.
  16. 제 15 항에 있어서,
    상기 EGF 면역원성 단백질은 서열번호 1에 나타내어지는 방법.
  17. 제 15 항에 있어서,
    상기 EGF 면역원성 단백질은 서열번호 2에 나타내어지는 방법.
  18. 제 16 항에 있어서,
    상기 서열 1에 나타내어진 EGF 면역원성 단백질은 TKI와 병용하여 환자에게 투여되는 방법.
  19. 서열번호 1 및 서열번호 2로 이루어지는 군에서 선택되는 서열을 갖는 면역원성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 TKI에 대한 내성을 감소시키는 치료학적 조성물.
  20. 제 20 항에 있어서,
    아쥬반트를 더 포함하는 TKI에 대한 내성을 감소시키는 치료학적 조성물.
  21. 제 21 항에 있어서,
    의약 부형물을 더 포함하는 TKI에 대한 내성을 감소시키는 치료학적 조성물.
  22. 제 22 항에 있어서,
    의약 부형물을 더 포함하고, 상기 면역원성 폴리뉴클레오티드는 EGF/EGFR 경로를 억제하는 TKI에 대한 내성을 감소시키는 치료학적 조성물.
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