KR20180005497A

KR20180005497A - 신호전달 펩타이드에 의한 액포수송벡터 개발

Info

Publication number: KR20180005497A
Application number: KR1020160085689A
Authority: KR
Inventors: 박동준; 윤지희; 이세영; 민지호; 김양훈
Original assignee: 전북대학교산학협력단
Priority date: 2016-07-06
Filing date: 2016-07-06
Publication date: 2018-01-16
Also published as: KR101953950B1

Abstract

본 발명은 액포로 수송되는 것을 특징으로 하는 신호전달 펩타이드의 프라이머 및 이와 작동가능하게 연결된 pYES2에 대한 GFP를 암호화 하는 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터에 관한 것이다.

Description

신호전달 펩타이드에 의한 액포수송벡터 개발{Development of transfer vector for targeting vacuole by signal peptide sequence}

본 발명은 신호전달 단백질이 포함된 재조합 수송벡터 및 수송벡터에 의해 액포 내로 수송된 단백질의 활성과 발현 여부를 확인하기 위한 것으로, 더욱 상세하게는 효모 내에 존재하는 액포 단백질로부터 분리된 신호전달 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질 전환된 재조합 미생물 및 액포 내에서 목적단백질의 발현 유무를 확인함으로써 목적 단백질을 수득하는 방법에 관한 것이다.

현대과학기술에서는 상용화 가능 한 기술들이 무궁무진하게 개발되고 있는 가운데 의약품 및 화장품과 같은 부가가치가 높고, 사람들에게 보급되기 중요한 산업들이 관심을 받고 있다. 분자생물학적인 관점에서 단백질체학 (proteomics)은 수많은 과학자들이 관심을 가지고 있으며 이는 곧 원핵생물 및 진핵생물 모두를 통틀어 연구되어야 하는 중요한 연구라고 말할 수 있다.

생물 내에 존재하는 모든 단백질들은 신호전달체계를 구축하고 있으며 이 들의 수송에 관한 연구가 관심을 받게 되었고 무엇보다 어떠한 신호에 의해 전달되는지 신호전달 펩타이드 (signal peptide sequence)도 1980년 대 이후 다양하게 분석되고 있다. 진핵생물의 대표적인 미생물로 효모(S.cerevisiae)가 분석이 많이 되었으며 주로 다양한 단백질들의 수송에 관여하는 신호전달 펩타이드는 세포소기관인 리소좀(lysosome)이라 불리는 세포소기관에 존재하는 단백질들과 유사성을 보여 주었다. 이는 타겟하는 단백질이 특정한 세포소기관 혹은 세포 밖으로의 수송과 같이 방향성을 결정해주는 요인이라고 볼 수 있으며, 단백질의 이동과 관련된 리소좀 단백질로 예를 들어보게 되면 총 4가지의 이동방법을 들 수 있다. 첫째로, MVB 경로에 관여된 단백질은 무수히 많으며 아직 밝혀지지 않은 단백질도 많이 있고, 이 경로에 의해 수송되는 단백질들은 골지체(golgi apparatus)에서 생성되어 리소좀(lysosome)으로 수송되기 전에 수송소포(transport vesicle)로 불리는 작은 전단 소포에 이동 후, 전해지게 된다. 주로 막 단백질 (membrane protein) 들을 수송하는 것으로 알려져 있다. 다음으로는 ALP pathway로 분류되는 단백질들은 골지체(golgi apparatus)에서 생성된 단백질이 바로 리소좀(lysosome)으로 수송된다. 수송되는 단백질로는 막단백질(membrane protein)들이 알려져 있으며 단백질이 adaptor protein (AP)과의 결합에 의한 수송이 되는 경로이다. 셋째로 CVT pathway에 속하는 단백질들은 세포질(cytosol)에 존재하는 단백질들이 리소좀(lysosome)으로 수송되는 경로를 가지며, 마지막으로 CPY pathway는 수송소포(transport vesicle)에서 리소좀(lysosome)으로 이동하는 단백질들을 말할 수 있다.

이러한 리소좀단백질들은 각기 다른 신호서열(signal sequence)에 의해 이동되는 목적이 다르게 되는데 이중 가장 많은 단백질들이 이동하는 경로가 연구된 것은 CPY pathway 로 알려져 있다. 대표적인 단백질로 Carboxypeptidase Y의 리소좀으로의 수송에 요구되는 단백질들이 포함된 경로를 나타내며, 세포질속에서 리소좀으로 이동되는 vesicle 형태의 수송소포(transport vesicle)이 리소좀(lysosome)으로 이동된다. 주로 이 단계에서는 큰 분자의 단백질도 수송이 가능하기 때문에 중요하게 연구되고 있다.

상기 단백질 수송경로에 따른 수송관련 신호 펩타이드의 선별은 두 가지의 대표적인 리소좀 단백질에서 이루어 졌으며, 이는 단백질의 genomic DNA로부터 신호 펩타이드 서열(signal peptide sequence)를 추출하여 발현벡터에 삽입하여 재조합을 하게 되면 우리가 원하는 단백질을 리소좀으로 수송할 수 있는 기술개발에 응용을 할 수 있다.

또한 신호 전달 펩타이드에 의해 리소좀으로 이동된 단백질들은 추출되어 그 기능이 유지된 형태의 vacuole 형태로 활용 될 수 있는 평가를 하게 되고, 항균효능 및 목적단백질에 맞는 기능성을 평가 받게 됨으로써 실생활에 응용할 수 있는 범위가 무궁무진 하다는 것이 기술의 핵심일 수 있다. 한 예로, 세포질에만 존재하는 알데하이드계열 물질을 분해하는 단백질이 신호 전달 단백질에 의해서 리소좀으로 수송됨에 따라 리소좀 내에서 더 큰 효율을 발현시켜 다른 carrier를 사용하지 않아도 되는 경우를 볼 수 있다. 이는 목적단백질의 신호 전달 펩타이드와 재조합 된 균주로부터 추출된 리소좀을 축산환경에 살고 있는 환경 유해 물질 관련 질병에 노출되어있는 가축들의 사료로써 개발하게 되면 친환경적인 소재로부터 추출된 사료를 가축에게 적용할 수 있다. 따라서 본 기술이 우리가 원하는 단백질을 원하는 곳으로의 수송 및 방향성을 제시할 수 있는 back bone carrier임을 강조할 수 있다.

이를 해결하기 위해 본 발명자는 진핵세포인 효모 내에 존재하는 액포 단백질로부터 신호전달 펩타이드를 분리해내어 녹색 형광 단백질을 포함하는 벡터에 도입하여 재조합 벡터를 제작하였다. 이 재조합 벡터를 미생물에 형질주입하고 형질전환된 미생물을 이용해 리소좀에서 녹색 형광 단백질이 발현되는 것을 관찰하였다. 즉, 본 발명으로부터 기존에 세포가 가질 수 없는 단백질 또는 세포질에 존재하는 단백질과 결합하여 원하는 세포소기관으로 수송할 수 있는 케리어(carrier)를 개발하였으며, 형광 단백질의 발현 유무를 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 서열번호 5 및 6의 염기서열로 이루어진 신호전달 단백질 PEP4 (Proteinase A)을 암호화하는 염기서열과 액포 내에서 발현 가능한 목적 단백질의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 서열번호 9 및 10의 염기서열로 이루어진 신호전달 단백질 CPY (Carboxypeptide Y)을 암호화하는 염기서열과 액포 내에서 발현 가능한 목적 단백질의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 상기 벡터로 형질주입된 재조합 미생물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 (a) 삽입유전자를 증폭시키는 단계; (b) 상기 증폭된 삽입유전자들을 제한효소로 자르는 단계; (c) 목적 단백질 유전자를 가지는 발현벡터를 상기 제한효소로 자르는 단계; (d) 상기 삽입 유전자와 발현벡터를 클로닝하여 미생물에 형질전환시키는 단계; 및 목적 단백질의 발현 유무를 확인하는 단계를 포함하는 목적 단백질 수득방법을 제공하는 것이다.

그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

따라서, 본 발명은 서열번호 5 및 6의 염기서열로 이루어진 신호전달 단백질 PEP4 (Proteinase A)을 암호화하는 염기서열과 액포 내에서 발현 가능한 목적 단백질의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 9 및 10의 염기서열로 이루어진 신호전달 단백질 CPY (Carboxypeptide Y)을 암호화하는 염기서열과 액포 내에서 발현 가능한 목적 단백질의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터를 제공한다.

상기 본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 PEP4는 목적 단백질 염기서열의 1 내지 76번째 서열에 삽입되는 것일 수 있다.

상기 본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 CPY는 목적 단백질 염기서열의 24 내지 27번째 서열에 삽입되는 것일 수 있다.

상기 본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 신호전달 단백질은 효모 내에 존재하는 액포 단백질로부터 분리된 것일 수 있다.

상기 본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 목적 단백질은 ALD6인 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 벡터로 형질 주입된 재조합 미생물을 제공한다.

또한, 본 발명은 (a) 삽입유전자를 증폭시키는 단계; (b) 상기 증폭된 삽입유전자들을 제한효소로 자르는 단계; (c) 목적 단백질 유전자를 가지는 발현벡터를 상기 제한효소로 자르는 단계; (d) 상기 삽입 유전자와 발현벡터를 클로닝하여 미생물에 형질전환시키는 단계; 및 목적 단백질의 발현 유무를 확인하는 단계를 포함하는 목적 단백질 수득방법을 제공한다.

상기 본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 삽입유전자는 PEP4 또는 CPY인 것일 수 있다.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 본 발명은 액포로 수송되는 것을 특징으로 하는 신호전달 펩타이드 및 녹색 형광 단백질을 코딩하는 유전자가 도입된 벡터에 의하여 제조된 형질도입 미생물을 이용하여 세포소기관에서의 녹색 형광 단백질 발현 유무를 통해 목적단백질의 수송 및 방향성을 제시하고자 한다.

또한, 본 발명을 통해 단백질을 수송하는 캐리어(carrier)를 약물 전달체로서 활용할 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 Proteinase A (PEP4)의 DNA sequence와 GFP gene을 포함하는 단백질 발현벡터를 나타내는 것이다.
도 2는 pYES2::PSP::GFP(MBTL-DJ-1)가 만들어지는 과정을 나타내는 것이다.
도 3은 Carboxypeptidase Y (CPY)의 DNA sequence와 GFP gene을 포함하는 단백질 발현벡터를 나타내는 것이다.
도 4는 pYES2::QSP::GFP(MBTL-DJ-2)가 만들어지는 과정을 나타내는 것이다.
도 5은 Proteinase A (PEP4)의 DNA sequence와 ALD6, GFP gene을 포함하는 단백질 발현벡터를 나타내는 것이다.
도 6는 pYES2::PSP::ALD6::GFP(MBTL-DJ-3)가 만들어지는 과정을 나타내는 것이다.
도 7은 Carboxypeptidase Y (CPY)의 DNA sequence와 ALD6, GFP gene을 포함하는 단백질 발현벡터를 나타내는 것이다.
도 8는 pYES2::QSP::ALD6::GFP(MBTL-DJ-4)가 만들어지는 과정을 나타내는 것이다.
도 9는 형광현미경의 분석 결과로써 재조합 효모인 MBTL-DJ-1과 MBTL-DJ-2의 형광발현을 나타낸다.
도 10는 형광현미경의 분석 결과로써 재조합 효모인 MBTL-DJ-3과 MBTL-DJ-4의 형광발현을 나타낸다.
도 11는 MBTL-DJ-3과 MBTL-DJ-4를 배양하여 vacuole을 추출한 뒤 포름알데하이드와 반응시켜 Vibrio fischeri의 발광을 통해 단백질의 수송이 완벽히 이루어졌는지 보여주는 그래프이다.

이하 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

상술한 바와 같이, 종래 신호전달 펩타이드에 대한 관심이 증가하면서, 목적 단백질이 세포소기관 또는 세포 밖으로 수송되는 것에 대한 연구가 계속되고 있는 실정이다. 이에 본 발명자들은 세포소기관으로 목적 단백질을 수송할 수 있는 캐리어 개발 및 형광 단백질의 발현유무를 확인함으로써 상술한 문제의 해결을 모색하였다.

따라서, 본 발명은 서열번호 5 및 6의 아미노산 서열로 이루어진 신호전달 단백질 PEP4 (Proteinase A)을 암호화하는 염기서열과 액포 내에서 발현 가능한 목적 단백질의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 9 및 10의 아미노산 서열로 이루어진 신호전달 단백질 CPY (Carboxypeptide Y)을 암호화하는 염기서열과 액포 내에서 발현 가능한 목적 단백질의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명의 일실시예에서는 도1 및 도3에 나타낸 모식도와 같이 재조합 벡터를 제조하였다.

본 발명자들은 특정 세포소기관 내로 수송되는 신호전달 단백질을 분리하는 과정에서 액포 내로 수송할 수 있는 신호전달 단백질인 PEP4 및 CPY를 진핵생물인 S.cerevisiae s2805로부터 분리하기 위해 신호전달 단백질 각각의 DNA 정보를 NCBI에서 확인하고 신호전달 단백질을 증폭시켜 확보하기 위해 PCR을 수행하였다. 그 결과, PEP4 신호전달 유전자는 228bp의 DNA 단편을 확보하였고, CPY 신호전달 유전자는 103bp의 DNA 단편을 확보하였다.

상기 재조합 벡터는 이미 시판되고 있거나 공지된 일반적인 미생물 발현 벡터를 기본 골격으로 하여 다양한 프로모터와 함께 PEP4 또는 CPY 단백질을 암호화하는 유전자를 순차적으로 작동가능하게 연결한 재조합 발현 벡터일 수 있다.

본 발명에서 상기 용어 "발현벡터"는 본 발명에 따른 서열번호 5 및 6의 아미노산 서열로 이루어진 PEP4 단백질을 암호화하는 염기서열 또는 서열번호 9 및 10의 아미노산 서열로 이루어진 CPY 단백질을 암호화하는 염기서열이 삽입 또는 도입될 수 있는 당분야에 공지된 플라스미드, 코즈미드 벡터, 박테이로파아지 벡터, 바이러스 벡터 또는 기타 매개체를 의미하며, 바람직하게 본 발명의 발현 벡터는 pYES2-GFP일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 서열번호 5 및 6의 염기서열로 이루어진 PEP4 단백질 또는 서열번호 9 및 10의 염기서열로 이루어진 CPY 단백질을 암호화하는 염기서열은 발현 조절 서열에 작동가능하게 연결될 수 있으며, 상기 작동가능하게 연결된 염기서열과 발현 조절 서열은 선택 마커 및 복제 개시점 (replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 발현 벡터 내에 포함될 수 있다. 상기 "작동가능하게 연결(operably linked)"된다는 것은 적절한 분자가 발현 조절 서열에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 발현 조절 서열일 수 있다. "발현 조절 서열(expression control sequence)"이란 특정한 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 조절하는 DNA서열을 의미한다. 이러한 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 암호화하는 서열, 및 전사와 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다.

본 발명에서 상기 PEP4 신호전달 단백질은 목적 단백질 염기서열의 1 내지 76번째 아미노산 서열에 삽입되는 것을 특징으로 하며, 삽입시키기 위하여 제한효소 HindⅢ 및 NotⅠ을 사용하는 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 상기 CPY 신호전달 단백질은 목적 단백질 염기서열의 24 내지 27번째 아미노산 서열에 삽입되는 것을 특징으로 하며, 삽입시키기 위하여 제한효소 NotⅠ 및 EarⅠ을 사용하는 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 상기 신호전달 단백질은 효모 내에 존재하는 액포 단백질로부터 분리된 것임을 특징으로 하며, 상기 용어 "액포"란, 일부 진핵세포가 가지고 있는 막으로 싸인 거대한 세포소기관을 말한다. 아울러, 액포는 영양분, 세포 주변의 부적당한 파편을 감싸거나, 세포에 독이 될 수도 있는 물질을 격리, 팽압이라고 불리는 세포 내의 유체 균형 유지, 또는 세포로부터 부적절한 물질을 배출하는 등의 역할을 할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 벡터로 형질 전환된 재조합 미생물을 제공한다.

본 발명의 재조합 벡터는 당업계 공지된 방법을 사용하여 숙주세포에 도입할 수 있다. 숙주세포로의 도입방법은 바람직하게는 염화칼슘법, 미세사출법(microprojectile bombardment), 일렉트로포레이션(electroporation), PEG-매개 융합법(PEG-mediated fusion), 미세주입법(microinjection), 리포좀 매개법(liposome-mediated method) 등 공지의 방법를 이용할 수 있다.

먼저 진핵세포의 액포 내에 존재하는 신호전달과 관련된 펩타이드를 분리한 다음 중합효소 연쇄반응을 이용하여 관련 유전자 부위를 증폭시켜 클로닝하였다. 구체적으로 상기 삽입유전자는 PEP4 또는 CPY 로서, 상기 유전자는 세포질에 존재하는 단백질들이 수송소포(transport vesicle)에 의해 리소좀으로 이동하는 CPT pathway 방식에 따라 이동한다.

본 발명의 재조합 벡터를 만들기 위해 사용되는 상기 제한효소는 HindⅢ, SphlⅠ, NotⅠ, BamHⅠ으로 이루어진 군 중 2종 이상 선택되는 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다

상기에서 목적 단백질은 생산하고자 하는 단백질을 의미하는 용어로서, 특정 단백질로 한정되지 않는다. 또한, 상기 목적 단백질로서 리포터 단백질들이 포함될 수 있는데, 상기 리포터 단백질은 리포터 유전자에 의해 발현되는 단밸질로서 그 존재에 의해서 세포 내에서의 그의 활성을 알려주는 표지 단백질을 의미한다. 본 발명의 일실시예에서는 상기 목적 단백질로 GFP를 사용하였으나, 목적 단백질이 이에 한정되는 것은 아니며, 의료용, 산업용 단백질을 포함하여 액포 내에서 발현될 수 있는 단백질이라면 제한 없이 사용할 수 있다.

상기 본 발명의 일실시예에서, 재조합 효모의 액포 내에 목적 단백질이 발현되는지 여부를 확인해보고자 하였다. 이를 위하여, 상기 목적 단백질 ALD6 염기서열의 24 내지 27번째 아미노산 서열에 신호전달 단백질 CPY 유전자를 삽입한 재조합 벡터로 형질 전환된 재조합 효모를 제조하였다(도 8). 제조된 재조합 효모의 액포를 추출하고 포름알데히드를 농도 별로 처리한 용액에 상기 액포를 첨가하여 포름알데히드 감소 효능을 평가하였다. 그 결과, 재조합 효모의 ALD6가 리소좀으로 수송됨으로써 포름알데히드의 농도가 감소하였음을 확인할 수 있었다(도 11)

이하, 본 발명의 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. Saccharomyces cerevisiae 에 신호전달펩타이드 ( signal peptide sequence )인 PEP4서열(PSP)과 GFP를 함께 포함하는 재조합 벡터의 제작

진핵미생물인 S. cerevisiae s2805를 사용하였고, 신호전달펩타이드(signal peptide sequence)는 NCBI의 genebank (www.ncbi.nlm.nih.gov)로부터 proteinase A (PEP4)의 DNA sequence 확인 후, DNA 서열의 앞 76AA인 신호전달펩타이드를 증폭시켜 확보하기 위하여 서열번호 5 및 서열번호 6을 사용하여 PCR(Polymerase chain reaction)을 수행하였다. 또한 pEGFP-C1 (BD Bioscience Clontech, USA) 벡터로부터 GFP gene을 확보하기 위해 서열번호7 및 서열번호 8을 사용하여 PCR을 통한 증폭으로 유전자를 얻을 수 있었으며, 그 결과는 하기 표 1에 나타낸다. 상기 PCR증폭 산물을 아가로즈 겔(agarose gel)에서 전기영동 하였으며, PEP4 signal peptide gene 은 228 bp의 DNA단편을 얻었고, GFP gene은 711 bp의 단편을 가지는 유전자를 확인하였다.

	프라이머 서열	서열번호
PEP4-F1	5‘- CGC AAG CTT ATG TTC AGC TTG AAA GCA T -3'	5
PEP4-R1	5'- TAT GCG GCC GCT TTC ACT GAA GAA AGG A -3'	6
GFP-F1	5'- AAT GCG GCC GCT GTG AGC AAG GGC GAG GAG -3'	7
GFP-R1	5'- ATT GCA TGC TTA CTT GTA CAG CTC GTC -3'	8

상기 유전자들은 모두 GeneAll PCR DNA purification kit로 정제한 후 사용하였다.

실시예 2. Saccharomyces cerevisiae 에 신호전달펩타이드 ( signal peptide sequence )인 QRPL(CAA ²⁴ -AGA-CCG-TTG ²⁷ )서열(QSP)을 삽입한 GFP 재조합 벡터의 제작

진핵미생물인 S. cerevisiae s2805에서 신호전달펩타이드(signal peptide sequence)를 얻기 위하여 Carboxypeptidase Y (CPY)의 DNA정보를 NCBI의 genebank (www.ncbi.nlm.nih.gov)로부터 확인하였으며, GFP DNA sequence에 AA24-AA27에 신호전달펩타이드 인 QRPL(CAA²⁴-AGA-CCG-TTG²⁷)를 삽입시키기 위하여 제한효소를 EarI(New England Biolabs, England)를 사용하였다. 서열번호 10 및 서열번호 11을 사용하여 AA²⁴의 앞부분 DNA를 증폭시켰으며, 서열번호 12 및 서열번호 13으로 AA²⁷의 뒷부분을 각각 PCR로 증폭시켜 얻을 수 있었으며, 그 결과는 하기 표 2에 나타내었다. 상기 PCR증폭 산물을 0.7% 아가로즈 겔(agarose gel)에서 전기영동 하였으며, CPY의 signal peptide gene인 QRPL이 삽입된 앞부분 103 bp의 DNA단편을 얻었고, GFP gene은 673 bp의 단편을 가지는 유전자를 확인하였다.

	프라이머 서열	서열번호
CPY-F1	5‘- TTT AGC GGC CGC ATG GTG AGC AAG GGC GAG -3'	9
CPY-R1	5'- ATA CTC TTC TCA ACG GTC TTT GTA CGT CGC CGT CCA GCT C -3'	10
CPY-F2	5'- TTT CTC TTC TTT GAA CGG CCA CAA GTT CAG C -3'	11
CPY-R2	5'- ATT GCA TGC TTA CTT GTA CAG CTC GTC -3'	12

실시예 3. 신호전달펩타이드 ( signal peptide sequence ) PEP4서열(PSP)과 세포질단백질인 알데하이드 디하이드로지네이즈 6 ( Aldehyde dehydrogenase , ALD6 )가 포함된 재조합 벡터의 제작

상기 실시예 1에서 확보된 proteinase A (PEP4)의 신호전달 펩타이드(signal peptide sequence) DNA sequence를 세포질단백질인 알데하이드 디하이드로지 네이즈 6 (Aldehyde dehydrogenase, ALD6)의 앞에 삽입시켜 보았으며, DNA sequence를 증폭시키기 위하여 서열번호 15 및 서열번호 16을 사용하였으며, 그 결과는 하기 표 3에 나타내었다. 상기 PCR증폭 산물들을 아가로즈 겔(agarose gel)에서 전기영동 하였다.

	프라이머 서열	서열번호
PEP4-F1	5‘- CGC AAG CTT ATG TTC AGC TTG AAA GCA T -3'	5
PEP2-R2	5'- GCT GGA TCC TTC AGT GAA GAA AGG ATG -3'	13
ALD6-F	5'- GGC GGA TCC ATG ACT AAG CTA CAC TTT -3'	14
ALD6-R	5'- GGT GCG GCC GCC AAC TTA ATT CTG ACA -3'	15
GFP-F2	5'- ATT GCG GCC GC GTG AGC AAG GGC GAG G ?3'	16
GFP-R2	5'- GGT GCA TGC CTT GTA CAG CTC ATC CAT ?3'	17

실시예 4. 신호전달펩타이드 ( signal peptide sequence ) QRPL서열(QSP)과 세포질단백질인 알데하이드 디하이드로지네이즈 6 ( Aldehyde dehydrogenase , ALD6 )가 포함된 재조합 벡터의 제작

상기 실시예 2에서 확보된 Carboxypeptidase Y (CPY)의 신호전달펩타이 드(signal peptide sequence)인 QRPL(CAA²⁴-AGA-CCG-TTG²⁷)를 프라이머에 포함시켜 디자인하였으며 이를 사용하여 세포질단백질로 알려진 알데하이드 디하이드로지네이즈 6(Aldehyde dehydrogenase, ALD6)의 AA²⁴-AA²⁷에 삽입시켜 DNA fragment를 만들었다. 이 때, DNA sequence를 증폭시키기 위하여 AA²⁴앞부분은 서열번호 16 및 서열번호 21을 사용하였고, AA²⁷의 뒷부분은 서열번호 22와 서열번호 본 17을 사용하여 PCR증폭을 통한 산물들을 얻었으며, 0.7% 아가로즈 겔(agarose gel)에서 전기영동을 통하여 확인하였다. 그 결과는 하기 표 4에 나타냈다.

	프라이머 서열	서열번호
ALD6-F	5‘- GGC GGA TCC ATG ACT AAG CTA CAC TTT -3'	14
ACPY-R	5'- GCG CTC TTC A CAA CGG TCT TTG CTC GTA TGT CAA -3'	18
ACPY-F	5'- GGC GGA TCC ATG ACT AAG CTA CAC TTT -3'	19
ALD6-R	5'- GGT GCG GCC GCC AAC TTA ATT CTG ACA -3'	15
GFP-F2	5'- ATT GCG GCC GC GTG AGC AAG GGC GAG G ?3'	16
GFP-R2	5'- GGT GCA TGC CTT GTA CAG CTC ATC CAT ?3'	17

실시예 5. 신호전달펩타이드를 삽입한 재조합 backbone 벡터( pYES2 ::PSP:: GFP , pYES2::QSP::GFP, pYES2 ::PSP:: ALD6 :: GFP , pYES :: QSP :: ALD6 :: GFP )의 제조

효모-단백질 발현벡터인 pYES2 (Invitogen, Carlsbad, CA, USA)를 기본 벡터로 사용하여 두 가지 종류의 신호전달펩타이드(signal peptide sequence)를 삽입시킨 pYES2::PSP::GFP, pYES2::QSP::GFP를 제작하였으며, 세포질단백질중의 하나인 알데하이드 디하이드로지네이즈 6 (Aldehyde dehydrogenase, ALD6)를 제작하였고, 그 제작과정은 다음과 같다.

실시예 5-1. MBTL-DJ-1의 제작

상기 실시예 1에서 증폭한 PEP4유래 signal peptide가 삽입된 GFP gene DNA절편을 HindIII과 SphI으로 절단하여 동일한 제한 부위를 절단한 pYES2 벡터에 삽입함으로써 pYES2::PSP::GFP를 제작하였다.

실시예 5-2. MBTL-DJ-2의 제작

상기 실시예 2에서 CPY유래 signal peptide가 삽입된 GFP gene DNA절편을 NotI과 SphI으로 절단하여 동일한 제한 부위를 절단한 pYES2 벡터에 삽입함으로써 pYES2::QSP::GFP를 제작하였다.

실시예 5-3. MBTL-DJ-3의 제작

상기 실시예 3에서 증폭한 PEP4유래 signal peptide와 세포질단백질인 ALD6을 GFP gene와 함께 합성을 하였으며 각각의 DNA절편을 HindIII, BamHI, NotI, 및 SphI으로 절단하여 동일한 제한 부위를 절단한 pYES2 벡터에 삽입함으로써 pYES2::PSP::ALD6::GFP를 제작하다.

실시예 5-4. MBTL-DJ-4의 제작

상기 실시예 4에서 증폭한 CPY유래 signal peptide와 세포질단백질인 ALD6을 GFP gene와 함께 합성을 하였으며 각각의 DNA절편을 BamHI, NotI, EarI 및 SphI으로 절단하여 동일한 제한 부위를 절단한 pYES2 벡터에 삽입함으로써 pYES2::QSP:: ALD6::GFP를 제작하였다.

비교예. MBTL-DJ-의 제작

pYES2 벡터만을 포함하는 재조합 미생물을 제작하였다.

또한, 상기 실시예 5-1 내지 5-4에서 제조한 벡터 pYES2::PSP::GFP, pYES2::QSP::GFP, pYES2::PSP::ALD6::GFP, pYES::QSP::ALD6::GFP를 효모인 S. cereviaie s2805에 전기천공법 (Electroporation)으로 형질전환 하였으며, SD 고체평판배지에서 얻은 콜로니를 새로운 배지에 옮겨 단일콜로니를 얻었다. DNA Sequencing 방법으로 pYES2::PSP::GFP, pYES2::QSP::GFP, pYES2::PSP::ALD6::GFP, pYES2::QSP::ALD6::GFP에 삽입 된 signal peptide를 포함하고 있는 DNA의 염기서열을 정확히 확인하였다.

실시예 6. 신호전달펩타이드에 의해 vacuole로 수송된 단백질의 발현 확인

상기 실시예 5에서 제조한 재조합 미생물을 SD액체 배지 (Yeast nitrogen base 6.7 g/L , amino acid 5 g/L 및 glucose 20 g/L ) 10 mL에 접종하여 30 ℃, 160 rpm으로 OD값이 0.6-0.8이 될 때까지 진탕 배양하였다. 얻어진 배양액에서 미생물만 남기고 제거한 다음 SG 액체 배지 (Yeast nitrogen base 6.7 g/L , amino acid 5 g/L 및 galactose 20 g/L ) 15mL을 넣어준다. 이렇게 얻어진 배양액 6.67mL (OD값이 0.4가 되도록 계산)을 SG액체 배지 50 mL에 넣어 30 ℃에서 160 rpm으로 10시간 동안 본 배양한 하여 배양을 진행하였다. 배양이 진행된 세포를 리소좀에만 특이적으로 반응하는 LysoTracker를 처리하여 target단백질의 발현정도와 본 단백질이 리소좀 내로 잘 targeting되어 들어가는지 형광현미경으로 관찰한 결과 단백질이 과발현 되는 것을 형광현미경으로 확인하였고, Merged된 모습에서 리소좀 내의 리소좀이 활성화 된 것을 확인하였다. 즉, MBTL-DJ-1과 MBTL-DJ-2의 결과로써 세포가 가지고 있지 않은 단백질인 GFP단백질이 신호전달 펩타이드에 의해 효모의 vacuole로 수송된 것을 확인 할 수 있으며, MBTL-DJ-3과 MBTL-DJ-4의 결과로써 세포질에서 발현되는 단백질인 ALD6단백질이 신호전달 펩타이드에 의해서 효모의 vacuole로 수송된 것을 확인 할 수 있었다.

실시예 7. 신호전달펩타이드에 의해 vacuole로 수송된 알데하이드 디하이드로지네이즈 6 ( Aldehyde dehydrogenase , ALD6 )의 활성비교

상기 실시예 5에서 제조한 재조합 효모(MBTL-DJ-3, MBTL-DJ-4)에서 vacuole을 추출하였으며 이 추출한 vacuole에 의한 포름알데하이드 감소효능을 평가하였고, 그 과정은 다음과 같다.

상기 실시예 5에서 제조한 재조합 효모(MBTL-DJ-3, MBTL-DJ-4)를 제시된 배양조건으로 진탕 배양하였다. 이후 galactose로 유도된 재조합효모에서 초음파파쇄기로 세포를 분쇄하여 vacoule을 원심분리를 통해 회수하였다.

생물발광(bioluminescence)인 vibrio fischeri를 LB배지에 12시간 내지 15시간 동안 종배양을 하고, 본 배양에서 2시간 내지 3시간을 배양하여 O.D.(Optical Density)값이 0.4내지 0.6가 되게 배양 후에 추출된 효모의 vacuole과 포를알데하이드를 농도별(62.5ppm, 125ppm, 250ppm, 500ppm) 로 처리한 용액에 첨가하여 1시간 내지 1시간30분간 반응을 시키게 되면 이를 통해 포름알데하이드의 감소를 확인 할 수 있다.

이로써 본 발명의 재조합 효모 MBTL-DJ-3과 MBTL-DJ-4의 ALD6가 리소좀으로 수송되었음을 포름알데하이드를 감소시켜 vibrio fischeri에 대한 독성을 나타낼 수 있으며, 이를 Luminometer에서 빛을 내는 정도를 비교함으로써 알 수 있다.

도 11에 나타난 바와 같이, MBTL-DJ-3 및 MBTL-DJ-4의 경우 포름알데하이드의 농도 63ppm 내지 500ppm에서 대조군에 비해 유의적으로 상승한 수준의 결과를 나타냈다. 즉, 포름알데하이드의 농도가 증가함에 따라 대조군의 경우에는 vibrio fischeri 의 생존률이 감소함으로써 Luminescene의 발광정도가 감소하였으나, 재조합 효모인 MBTL-DJ-3 및 MBTL-DJ-4의 경우에는 포름알데하이드 농도 63ppm 내지 125ppm에서는 Luminescene이 다소 감소하거나 오히려 증가하는 결과를 나타냈다. 따라서, 목적 단백질 ALD6가 signal peptide에 의해 효모의 액포 내로 이동함을 확인할 수 있다.

<110> INDUSTRIAL COOPERATION FOUNDATION CHONBUK NATIONAL UNIVERSITY <120> A recombinant vector for expressing, signal protein transformed by the recombinant vector and Biosensor detecting signal peptide sequence <130> 1060573 <160> 23 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 228 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> signal peptide sequence for PEP4 (PSP) <400> 1 atgttcagct tgaaagcatt attgccattg gccttgttgt tggtcagcgc caaccaagtt 60 gctgcaaaag tccacaaggc taaaatttat aaacacgagt tgtccgatga gatgaaagaa 120 gtcactttcg agcaacattt agctcattta ggccaaaagt acttgactca atttgagaaa 180 gctaaccccg aagttgtttt ttctagggag catcctttct tcactgaa 228 <210> 2 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> signal peptide sequence for CPY (QSP) <400> 2 caacggtctt tg 12 <210> 3 <211> 720 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sequence for GFP <400> 3 atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60 ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120 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tttgtgaggt ctcttctgcc 180 accactgaag atgttgaata tgctatcgaa tgtgccgacc gtgctttcca cgacactgaa 240 tgggctaccc aagacccaag agaaagaggc cgtctactaa gtaagttggc tgacgaattg 300 gaaagccaaa ttgacttggt ttcttccatt gaagctttgg acaatggtaa aactttggcc 360 ttagcccgtg gggatgttac cattgcaatc aactgtctaa gagatgctgc tgcctatgcc 420 gacaaagtca acggtagaac aatcaacacc ggtgacggct acatgaactt caccacctta 480 gagccaatcg gtgtctgtgg tcaaattatt ccatggaact ttccaataat gatgttggct 540 tggaagatcg ccccagcatt ggccatgggt aacgtctgta tcttgaaacc cgctgctgtc 600 acacctttaa atgccctata ctttgcttct ttatgtaaga aggttggtat tccagctggt 660 gtcgtcaaca tcgttccagg tcctggtaga actgttggtg ctgctttgac caacgaccca 720 agaatcagaa agctggcttt taccggttct acagaagtcg gtaagagtgt tgctgtcgac 780 tcttctgaat ctaacttgaa gaaaatcact ttggaactag gtggtaagtc cgcccatttg 840 gtctttgacg atgctaacat taagaagact ttaccaaatc tagtaaacgg tattttcaag 900 aacgctggtc aaatttgttc ctctggttct agaatttacg ttcaagaagg tatttacgac 960 gaactattgg ctgctttcaa ggcttacttg gaaaccgaaa tcaaagttgg 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ALD6-R(reverse primer) <400> 15 ggtgcggccg ccaacttaat tctgaca 27 <210> 16 <211> 2268 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GFP-F2(forward primer) <400> 16 ggcggatcca tgactaagct acactttgac actgctgaac cagtcaagat cacacttcca 60 aatggtttga catacgagca aagaccgcca ctcttctttg caaccaaccg gtctattcat 120 taacaacaag tttatgaaag ctcaagacgg taagacctat cccgtcgaag atccttccac 180 tgaaaacacc gtttgtgagg tctcttctgc caccactgaa gatgttgaat atgctatcga 240 atgtgccgac cgtgctttcc acgacactga atgggctacc caagacccaa gagaaagagg 300 ccgtctacta agtaagttgg ctgacgaatt ggaaagccaa attgacttgg tttcttccat 360 tgaagctttg gacaatggta aaactttggc cttagcccgt ggggatgtta ccattgcaat 420 caactgtcta agagatgctg ctgcctatgc cgacaaagtc aacggtagaa caatcaacac 480 cggtgacggc tacatgaact tcaccacctt agagccaatc ggtgtctgtg gtcaaattat 540 tccatggaac tttccaataa tgatgttggc ttggaagatc gccccagcat tggccatggg 600 taacgtctgt atcttgaaac ccgctgctgt cacaccttta aatgccctat actttgcttc 660 tttatgtaag aaggttggta ttccagctgg tgtcgtcaac atcgttccag gtcctggtag 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cgaggagctg ttcaccgggg tggtgcccat cctggtcgag ctggacggcg acgtaaacgg 1620 ccacaagttc agcgtgtccg gcgagggcga gggcgatgcc acctacggca agctgaccct 1680 gaagttcatc tgcaccaccg gcaagctgcc cgtgccctgg cccaccctcg tgaccaccct 1740 gacctacggc gtgcagtgct tcagccgcta ccccgaccac atgaagcagc acgacttctt 1800 caagtccgcc atgcccgaag gctacgtcca ggagcgcacc atcttcttca aggacgacgg 1860 caactacaag acccgcgccg aggtgaagtt cgagggcgac accctggtga accgcatcga 1920 gctgaagggc atcgacttca aggaggacgg caacatcctg gggcacaagc tggagtacaa 1980 ctacaacagc cacaacgtct atatcatggc cgacaagcag aagaacggca tcaaggtgaa 2040 cttcaagatc cgccacaaca tcgaggacgg cagcgtgcag ctcgccgacc actaccagca 2100 gaacaccccc atcggcgacg gccccgtgct gctgcccgac aaccactacc tgagcaccca 2160 gtccgccctg agcaaagacc ccaacgagaa gcgcgatcac atggtcctgc tggagttcgt 2220 gaccgccgcc gggatcactc tcggcatgga cgagctgtac aaggcatg 2268 <210> 17 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GFP-R2(reverse primer) <400> 17 ggtgcatgcc ttgtacagct catccat 27 <210> 18 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACPY-R(reverse primer) <400> 18 gcgctcttca caacggtctt tgctcgtatg tcaa 34 <210> 19 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACPY-F(forward primer) <400> 19 ccactcttct ttgcaaccaa ccggtcta 28 <210> 20 <211> 945 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sequence for PSP::GFP <400> 20 atgttcagct tgaaagcatt attgccattg gccttgttgt tggtcagcgc caaccaagtt 60 gctgcaaaag tccacaaggc taaaatttat aaacacgagt tgtccgatga gatgaaagaa 120 gtcactttcg agcaacattt agctcattta ggccaaaagt acttgactca atttgagaaa 180 gctaaccccg aagttgtttt ttctagggag catcctttct tcactgaagt gagcaagggc 240 gaggagctgt tcaccggggt ggtgcccatc ctggtcgagc tggacggcga cgtaaacggc 300 cacaagttca gcgtgtccgg cgagggcgag ggcgatgcca cctacggcaa gctgaccctg 360 aagttcatct gcaccaccgg caagctgccc gtgccctggc ccaccctcgt gaccaccctg 420 acctacggcg tgcagtgctt cagccgctac cccgaccaca tgaagcagca cgacttcttc 480 aagtccgcca tgcccgaagg ctacgtccag gagcgcacca tcttcttcaa ggacgacggc 540 aactacaaga cccgcgccga 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Claims

서열번호 5 및 6의 염기서열로 이루어진 신호전달 단백질 PEP4 (Proteinase A)을 암호화하는 염기서열과 액포 내에서 발현 가능한 목적 단백질의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
서열번호 9 및 10의 염기서열로 이루어진 신호전달 단백질 CPY (Carboxypeptide Y)을 암호화하는 염기서열과 액포 내에서 발현 가능한 목적 단백질의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
제 1항에 있어서, 상기 PEP4는 목적 단백질 염기서열의 1 내지 76번째 서열에 삽입되는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
제 2항에 있어서, 상기 CPY는 목적 단백질 염기서열의 24 내지 27번째 서열에 삽입되는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 신호전달 단백질은 효모 내에 존재하는 액포 단백질로부터 분리된 것임을 특징으로 하는 재조합 벡터.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 목적 단백질은 ALD6인 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
제 1항 또는 제 2항의 벡터로 형질 전환된 재조합 미생물.
(a) 삽입유전자를 증폭시키는 단계;
(b) 상기 증폭된 삽입유전자들을 제한효소로 자르는 단계;
(c) 목적 단백질 유전자를 가지는 발현벡터를 상기 제한효소로 자르는 단계;
(d) 상기 삽입 유전자와 발현벡터를 클로닝하여 미생물에 형질전환시키는 단계; 및 목적 단백질의 발현 유무를 확인하는 단계를 포함하는 목적 단백질 수득방법.
제 6항에 있어서, 상기 삽입유전자는 PEP4 또는 CPY인 것을 특징으로 하는 목적 단백질 수득방법.