KR20180001047A - 칠엽수 추출물을 포함하는 조성물 - Google Patents

칠엽수 추출물을 포함하는 조성물 Download PDF

Info

Publication number
KR20180001047A
KR20180001047A KR1020160079591A KR20160079591A KR20180001047A KR 20180001047 A KR20180001047 A KR 20180001047A KR 1020160079591 A KR1020160079591 A KR 1020160079591A KR 20160079591 A KR20160079591 A KR 20160079591A KR 20180001047 A KR20180001047 A KR 20180001047A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
fraction
leaf extract
skin
extract
present
Prior art date
Application number
KR1020160079591A
Other languages
English (en)
Other versions
KR102511527B1 (ko
Inventor
김민영
함종천
이희석
Original Assignee
주식회사 안지오랩
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 주식회사 안지오랩 filed Critical 주식회사 안지오랩
Priority to KR1020160079591A priority Critical patent/KR102511527B1/ko
Publication of KR20180001047A publication Critical patent/KR20180001047A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102511527B1 publication Critical patent/KR102511527B1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/96—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution
    • A61K8/97—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution from algae, fungi, lichens or plants; from derivatives thereof
    • A61K8/9783—Angiosperms [Magnoliophyta]
    • A61K8/9789—Magnoliopsida [dicotyledons]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/96—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution
    • A61K8/97—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution from algae, fungi, lichens or plants; from derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7042—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings
    • A61K31/7048—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having oxygen as a ring hetero atom, e.g. leucoglucosan, hesperidin, erythromycin, nystatin, digitoxin or digoxin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/77—Sapindaceae (Soapberry family), e.g. lychee or soapberry
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin

Abstract

칠엽수 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 콜라겐 생성능을 갖는 화장료 조성물과 MMP 매개 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

Description

칠엽수 추출물을 포함하는 조성물 {COMPOSITION　OF AN EXTRACT OF HORSE CHESTNUT}
본 발명은 칠엽수 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 콜라겐 생성 촉진용 조성물에 관한 것이다.
콜라겐은 지지조직 및 결합조직의 주요 성분인 천연 섬유질 단백질이며 특히 피부, 건 및 뼈에서 발견된다. 따라서, 콜라겐은 결합조직의 가장 중요한 단백질 중 하나이며 인간의 전체 단백질량의 약 30%를 구성한다. 콜라겐은 그 서열이 긴 섹션 전체에 걸쳐 주기적인 구조를 가지며 3개의 사슬을 포함하는 매우 단단한 헬릭스를 형성하는 소수의 단백질에 속한다. 일반적으로, 개별적인 조직에 따라 그 패턴이 구별되는 구조 및 서열이 상이한 수개의 타입의 콜라겐으로 분류된다. 콜라겐 타입 I은 예를 들면, 주로 뼈, 건, 피부 및 대혈관 및 각막에서 발견되고; 콜라겐 타입 II는 주로 늑연골 및 각질 피부에 존재하고; 마지막으로 콜라겐 타입 III 및 IV는 주요 혈관 및 피부를 형성하고 기저막의 형성에 관여한다.
최근 콜라겐 성분의 중요성을 상업적으로 이용하여, 먹는 콜라겐, 바르는 콜라겐 제품이 많이 나왔으나, 콜라겐을 식품화하여 섭취하는 경우 체내에서 소화 및/또는 흡수되지 못하고 배출되어 콜라겐 식품의 피부 미용이나 노화 방지 효과를 인정하지 않고 있으며, 바르는 콜라겐의 경우 표피의 크기보다 콜라겐의 크기가 커서 진피층에까지 흡수되지 않는 문제가 있었다.
따라서, 콜라겐을 분해한 나노 콜라겐 제품의 개발되거나, 콜라겐 분해효소인 콜라게나제(MMP-1)의 활성을 억제하는 성분을 함유한 제품, 콜라겐의 합성을 촉진하는 성분을 함유하는 제품 등의 콜라겐의 간접 효과를 가진 제품도 콜라겐 제품으로 판매되고 있는 실정이다.
이와 같이 콜라겐의 생성(collagen synthesis) 촉진 및/또는 콜라게나제 기능 억제 활성은 피부의 개선과 관련 질병의 예방 및 치료와 관련하여 꾸준히 연구되고 있었다.
본 발명자들은 효과적인 콜라겐 생성 촉진용 화장료 조성물 및 약학적 조성물을 개발하기 위하여 연구를 진행하던 중 칠엽수 추출물 또는 이의 분획물을 유효 성분으로포함하는 조성물 더욱 구체적으로, 퀘르시트린 및 아프젤린을 유효성분으로 포함하는 칠엽수 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 조성물이 콜라겐 생성을 촉진하고, 콜라게나제의 기능 억제 활성에 효과가 있어 기존에 판매되어 왔던 제품들에 비하여 우수한 효과를 가짐을 확인하였다.
본 발명은 칠엽수 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 콜라겐 생성 촉진용 화장료 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 칠엽수 추출물 또는 이의 분획물을 유효 성분으로 포함하는 콜라겐 생성 촉진능을 갖는 MMP 매개 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 칠엽수를 건조 및 분쇄하는 제1 단계; 분쇄된 칠엽수를 알코올 수용액에 넣고 가열 및 추출하는 제2 단계; 및 상기 추출된 액을 여과 및 농축하는 제3 단계를 포함하는 칠엽수 추출물의 제조 방법을 제공한다.
마지막으로 본 발명은 칠엽수를 건조 및 분쇄하는 제1 단계; 분쇄된 칠엽수를 알코올 수용액에 넣고 가열 및 추출하는 제2 단계; 상기 추출된 액을 여과 및 농축하는 제3 단계; 및 상기 농축된 추출물을 컬럼크로마토그래피를 이용하여 분획하는 제4 단계를 포함하는 칠엽수 추출물 분획물의 제조 방법을 제공한다.
이하, 본 명세서에 대하여 더욱 상세하게 설명한다.
본 발명은 칠엽수 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 콜라겐 생성 촉진용 화장료 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 칠엽수 추출물 또는 이의 분획물을 유효 성분으로 포함하는 콜라겐 생성촉진능을 갖는 MMP 매개 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함" 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 명세서에서 "유효성분"이란 단독으로 목적하는 활성을 나타내거나 또는 그 자체는 활성이 없는 담체와 함께 활성을 나타낼 수 있는 성분을 의미한다.
본 명세서의 “칠엽수(Horse chestnut)”는 칠엽수과(Hippocastanaceae)에 속하며, 컨커 트리(Conker Tree)라고도 불리고, 프랑스에서는 마로니에(marronier)라고도 불린다.
본 발명의 칠엽수 추출물 또는 이의 분획물은 그 잎 또는 종자(사라자)로부터 얻어진다. 구체적으로, 본 발명의 칠엽수잎은 현재 시판되고 있는 잎이나 봄에서 가을에 걸쳐 수확한 잎을 그늘에 말려 사용할 수도 있다. 또한, 보통 칠엽수 건조추출물을 이용할 수도 있으며, 이는 칠엽수 종자로부터 제조되며 트리테르펜 글리코시드(triterpene glycosides), 즉 무수 아에신이 16-20% 함유되어 있는 것을 표준품으로 사용할 수도 있다.
본 발명에 있어서, 칠엽수는 일본산 칠엽수(Aesculus turbinta BLUME), 중국산 칠엽수(Aesculus chinensis Bge 및 Aesculus wilculus Rehd) 및 유럽산 칠엽수(Aesculus hippocastanum L.) 등이 있으나, 이를 한정하지 않는다.
본 발명에서 상기 칠엽수 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 조성물은 콜라겐 생성을 촉진 기능을 갖는다.
피부주름은 노화에 의한 신체 변화 중 하나이며 복잡한 생물학적 과정을 거쳐 일어나는 현상으로 피부 진피층 결합조직의 소실로 인해 피부표면에 골이 생기는 것을 말한다. 이는 피부노화에 의한 2차적인 현상으로 주름형성 완화와 개선을 목적으로 한 항노화 화장품의 개발이 이루어지고 있으며 이를 통해 피부노화 과정을 지연시키고 방지하고자 연구가 진행되고 있다.
피부는 노화됨에 따라 표피의 두께 감소, 피하지방 및 진피층 결합조직의 감소 등의 변화를 나타낸다. 진피 내 결합조직의 감소는 Matrix metalloproteinase (MMP) 효소인 collagenase (MMP-1), gelatinase (MMP-2,-9) 등의 의한 것이며 실제로 노인의 피부에서 이들 효소의 활성 및 발현이 현저히 증가되어 있음이 밝혀졌다.
또한 자외선 노출에 의한 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)의 생성은 피부 세포내의 여러 가지 신호전달체계를 활성화시키며 이를 통해 MMPs의 전사를 조절함으로써 교원섬유와 탄력섬유의 합성을 감소시키고 피부에 주름을 생성시켰다.
자외선에 의한 진피의 조직학적인 손상은 주로 콜라겐 원섬유의 붕괴와 비정상적으로 엘라스틴이 함유된 물질을 축적시키며 생화학적으로는 결합조직의 변화 즉, type I과 type II collagen의 전구체인 전아교질(procollagen)을 감소시키는 결과를 보였다.
본 명세서의 칠엽수 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 조성물의 경우, 콜라겐의 생성을 촉진시키고, 콜라게나제 및 엘라스타제의 활성을 억제하는 효과가 현저히 우수하므로, 본 발명은 피부 주름에 있어 우수한 개선 효과를 제공할 수 있다. 이와 같은 내용은 후술하는 피부 세포에서 콜라겐의 생성 촉진능, 콜라게나제의 활성 억제 정도 및 엘라스타제의 활성 억제 정도를 평가함으로써 본원 발명의 칠엽수 추출물 또는 이의 분획물을 유효 성분으로 포함하는 콜라겐 생성 촉진용 화장료 조성물의 피부 주름 개선 물질의 효력을 뒷받침 할 수 있다.
즉, 본 명세서에서 "콜라겐 생성 촉진용"의 의미는 전술한 바와 같이 콜라겐의 양이 피부 주름 및 피부 보습과 밀접한 상관성을 가지므로, "피부 주름 개선용" 및/또는 "피부 보습용" 효과가 특히 더 우수하다.
본 발명에서 상기 조성물은 MMP 효소 활성 억제능을 더 갖는다.
본 명세서에서 “MMP”란 콜라겐, 프로테오글리칸 및 젤라틴과 같은 거대 생분자들을 분해시킬 수 있는 아연을 함유한 엔도펩티다아제 종류로서 엘라스타제, 콜라게나제, 젤라티나제, 스트로멜리신 및 막형 MMP 등이 있다. 이들은 모두 전구효소(proenzyme)의 형태로 발현된 후 일부분이 자체적으로 잘려나감으로써 활성화된다.
상기 콜라게나제는 MMP-1라고도 불리고, 콜라겐을 기질로 하며 자외선, 산화적 스트레스 등에 의하여 그 발현이 활성화될 경우 피부 탄력 유지력과 수분 보유력을 가진 콜라겐이 분해되어 피부 주름이 발생하고 피부가 건조하고 거칠어지게 되는 것으로 알려져 있으며(J Ginseng Res 31(2):86-92, 2007; Toxicol Appl Pharmacol 195: 298-308, 2004), 산화적 스트레스는 세포막, 단백질, DNA, 효소 등을 손상시키는 등 세포와 조직에 해로운 반응을 일으켜 암 및 동맥경화 등의 질병을 유발하고 MMP-1의 발현을 유도하여 콜라겐 분해를 촉진하는 것으로 알려져 있다(Age 16: 55-58, 1993; Biol. Pharm. Bull. 30: 719-723, 2007).
본 발명의 MMP 효소 활성 억제능을 갖는 칠엽수 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물은 엘라스타제, 콜라게나제의 활성이 저해되어 피부의 주름 개선, 피부의 처짐 개선 및 피부 탄력의 개선 효과를 갖는다.
본 발명의 칠엽수 추출물은 알코올 추출물이다. 상기 알코올은 탄소수 1 내지 4의 알코올일 수 있으며, 메탄올, 에탄올 또는 이들의 혼합물이 바람직할 수 있다. 본 발명의 칠엽수 추출물은 (ALH-L1005) 25% 에탄올 추출물일 수 있다.
또한, 본 발명의 칠엽수 추출물의 분획물은 상기 칠엽수 추출물의 알코올 분획물이다. 또한, 본 발명의 칠엽수 추출물의 분획물은 상기 칠엽수 추출물의 에탄올 분획물이다. 즉 상기 칠엽수 추출물의 분획물은 상기 알코올로 추출된 칠엽수 추출물의 에탄올 분획물이다.
본 발명의 상기 분획물은 상기 칠엽수 추출물의 30%(V/V) 내지 80%(V/V) 에탄올 분획물일 수 있다.
본 발명의 칠엽수 추출물 또는 이의 분획물은 퀘르시트린(quercitrin) 및 아프젤린(afzelin)을 유효성분으로 포함한다.
도 9는 칠엽수 추출물의 분획물의 HPLC(high performance liquid chromatography)그래프를 나타낸 도이다.
본 발명의 칠엽수 추출물 또는 이의 분획물은 상기 퀘르시트린과 상기 아프젤린을 2: 1 내지 30: 1의 중량비로 포함한다. 구체적으로 본 발명의 칠엽수 추출물 또는 이의 분획물은 상기 퀘르시트린과 상기 아프젤린을 2: 1 내지 20: 1의 중량비로 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 칠엽수 추출물 또는 이의 분획물은 상기 퀘르시트린과 상기 아프젤린을 10: 1 내지 10: 3의 중량비로 포함할 수 있다.
본 발명의 칠엽수 추출물의 분획물 내의 상기 퀘르시트린과 상기 아프젤린의 함량은 상기 칠엽수 추출물 내의 상기 퀘르시트린과 상기 아프젤린의 함량보다 2배 이상 많다. 하나의 실시상태에 있어서, 본 발명의 칠엽수 추출물의 분획물 내의 상기 퀘르시트린과 상기 아프젤린의 함량은 상기 칠엽수 추출물 내의 상기 퀘르시트린과 상기 아프젤린의 함량보다 2배 내지 10배 많다.
본 발명의 칠엽수 추출물 내의 상기 퀘르시트린과 상기 아프젤린의 함량은 칠엽수 추출물의 전체 중량을 기준으로 0.05 중량% 내지 5 중량% 포함할 수 있다. 또 하나의 실시상태에 있어서, 본 발명의 칠엽수 추출물 내의 상기 퀘르시트린과 상기 아프젤린의 함량은 칠엽수 추출물의 전체 중량을 기준으로 0.5 중량% 내지 2 중량% 포함할 수 있다.
본 발명의 칠엽수 추출물의 분획물 내의 상기 퀘르시트린과 상기 아프젤린의 함량은 칠엽수 추출물의 분획물 전체 중량을 기준으로 0.2 중량% 내지 30 중량% 포함할 수 있다. 또 하나의 실시상태에 있어서, 본 발명의 칠엽수 추출물의 분획물 내의 상기 퀘르시트린과 상기 아프젤린의 함량은 칠엽수 추출물의 분획물 전체 중량을 기준으로 1 중량% 내지 10 중량% 포함할 수 있다.
본 발명의 칠엽수 추출물 또는 이의 분획물이 상기 퀘르시트린과 아프젤린을 상기 범위 내의 중량비로 포함하는 경우, 콜라겐 생성을 촉진하고, MMP 효소의 활성을 억제하는 효과를 극대화할 수 있다.
본 발명의 칠엽수 추출물의 전체 중량을 기준으로 상기 퀘르시트린의 함량은 1 중량% 내지 5 중량%이고, 아프젤린의 함량은 0 중량% 초과 1 중량% 이하이다. 더욱 구체적으로 본 발명의 칠엽수 추출물의 전체 중량을 기준으로 상기 퀘르시트린의 함량은 1.5 중량% 내지 4.5 중량%이고, 아프젤린의 함량은 0.1 중량% 내지 0.5 중량%이다.
또한, 본 발명의 칠엽수 추출물의 알코올 용출 분획물의 전체 중량을 기준으로 상기 퀘르시트린의 함량은 5 중량% 내지 15 중량%이고, 상기 아프젤린의 함량은 0.3 중량% 내지 5 중량%이다. 더욱 구체적으로 본 발명의 칠엽수 추출물의 알코올 용출 분획물의 전체 중량을 기준으로 상기 퀘르시트린의 함량은 8 중량% 내지 11 중량%이고, 상기 아프젤린의 함량은 0.5 중량% 내지 3 중량%이다.
다만, 상기 칠엽수 추출물 또는 이의 분획물의 퀘르시트린과 아프젤린의 함량은 지역, 연도, 수확 시기에 따라서 변경될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 칠엽수 추출물 또는 칠엽수 추출물의 분획물을 포함하는 화장료 조성물은 피부의 주름 개선, 피부의 탄력 개선 및/또는 피부의 처짐을 개선할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 칠엽수 추출물의 분획물은 콜라겐 생성 촉진능력이 우수하여, 화장료 조성물에 사용하는 것이 더욱 바람직할 수 있다. 본 발명에 있어, 상기 칠엽수 추출물의 에탄올 용출 분획물을 화장료 조성물에 사용하는 경우 더욱 바람직할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 화장료 조성물 전체 중량을 기준으로 상기 칠엽수 추출물 또는 이의 분획물의 함량은 0.005 중량% 내지 20 중량%이다. 또 하나의 실시상태에 있어서, 상기 화장료 조성물 전체 중량을 기준으로 상기 칠엽수 추출물 또는 이의 분획물의 함량은 0.01 중량% 내지 10 중량%이다.
본 발명의 화장료 조성물은 정제수, 향료, 색소, 살균제, 산화방지제, 점도감소제, 점도증가제, 피부유연화제, 피막형성제, 수분증발차단제, 금속이온봉쇄제, 방부제, 산화방지제, 보습제, 점증제, 무기염류, 합성 고분자 물질, 유분, 물, 계면활성제, 알코올 및 킬레이트제로 이루어진 군에서 1 또는 2 이상의 첨가제를 더 포함한다. 상기 첨가제는 당업계에 통용되는 다양한 성분들을 사용할 수 있으며, 이를 한정하지 않는다.
본 발명의 화장료 조성물은 스킨, 에멀전, 에센스 또는 크림의 제형을 갖을 수 있으며, 상기 조성물은 원하는 제형에 따라 전술한 첨가제를 조절할 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 화장료 조성물은 업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 에멀젼, 토너, 에센스, 크림, 아이크림, 팩, 젤, 파우더, 립스틱, 메이크업 베이스, 파운데이션, 로션, 연고, 패취, 미용액, 클렌징폼, 클렌징크림, 클렌징워터, 바디로션, 바디크림, 바디오일, 바디에센스, 샴푸, 린스, 바디세정제, 비누, 및 분무제에서 선택된 제형인 것일 수 있다. 이들 제형의 제조방법은 통상의 화장료 제형의 제조방법에 따라 제조될 수 있다.
본 발명의 조성물을 또한 사람 또는 그 외 동물의 피부에 유효한 양으로 적용하여 피부 탄력을 개선할 수 있다.
여기에서 사용된 "유효한 양"은 연구자, 수의사, 의사 또는 기타 임상의에 의해 생각되는 동물 또는 인간에서 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 활성 성분 또는 조성물의 양을 의미한다. 본 발명의 화장료 조성물의 적용 기간 및 빈도는 원하는 효과에 따라 변화될 것임은 당업자에게 자명하다.
본 명세서의 일 실시상태에 있어서, 상기 화장료 조성물의 제형은 기초 화장품, 메이크업 화장품 또는 바디 화장품의 제형이다.
본 명세서에서 상기 기초화장품 또는 바디화장품의 제형으로 크림, 에센스, 화장수, 팩, 영양크림, 마사지 크림, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 클렌징 오일 및 유액 등이 있으나, 이에 한정하지 않는다.
또한, 본 명세서에서 상기 메이크업 화장품의 제형으로 파운데이션, 메이크업 베이스, 립스틱 아이섀도, 아이라이너, 마스카라, 아이브로우 펜슬 등이 있으나, 이에 한정하지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 칠엽수 추출물은 MMP 효소 활성 억제능이 우수하여 MMP 매개 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물에 사용하는 것이 더욱 바람직하다.
본 발명에 있어서, 상기 약학적 조성물 전체 중량을 기준으로 상기 칠엽수 추출물 또는 이의 분획물의 함량은 0.005 중량% 내지 20 중량%이다. 또 하나의 실시상태에 있어서, 상기 약학적 조성물 전체 중량을 기준으로 상기 칠엽수 추출물 또는 이의 분획물의 함량은 0.01 중량% 내지 10 중량%이다.
또한, 본 발명의 MMP 효소 활성 억제능을 갖는 칠엽수 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물은 MMP 매개 질환의 예방 및 치료의 효능을 가질 수 있다.
상기 MMP 매개 질환으로는 동맥경화증, 알츠하이머 질환, 골질환, 단백뇨증, 복대동맥류 질환, 신경계의 수초탈락 질환, 간경변, 신사구체 질환, 배태막의 미성숙 파열, 염증성 장질환, 치주 질환 또는 노화와 관련된 황반 변성일 수 있다. 바람직하게는 치주 질환이다.
본 명세서에서 상기 "예방"이란 상기 약학적 조성물의 투여로 질환을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다. 또한, 상기 "치료"란 상기 약학적 조성물의 투여로 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 약학적 조성물은 약효를 증가시키지는 않으나 약학적 조성물에 통상 사용되어 냄새, 맛, 시각 등을 향상시킬 수 있는 성분을 추가로 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용 가능한 첨가제를 추가적으로 포함할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 첨가제는 예컨대, 전분, 젤라틴화 전분, 미결정셀룰로오스, 유당, 포비돈, 콜로이달실리콘디옥사이드, 인산수소칼슘, 락토스, 만니톨, 엿, 아라비아고무, 전호화전분, 옥수수전분, 분말셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 오파드라이, 전분글리콜산나트륨, 카르나우바 납, 합성규산알루미늄, 스테아린산, 스테아린산마그네슘, 스테아린산알루미늄, 스테아린산칼슘, 백당, 덱스트로스, 소르비톨 및 탈크 등이 있으나, 이를 한정하지 않는다. 추가로, 상기 약학적 조성물은 단독 사용하거나 기존에 사용된 MMP 매개 질환에 대한 예방 또는 치료 활성을 가지는 물질을 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하고 경구 또는 비경구용의 인체 또는 수의용으로 제형화될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물을 제제화하는 경우 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제 및 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용할 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제 및 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 화합물을 포함하는 약학적 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(Calcium carbonate), 수크로스(Sucrose) 또는 락토오스(Lactose) 및 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘, 스티레이트, 탈크 같은 윤활제를 사용할 수 있다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 및 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물 및 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제 및 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제 및 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜 및 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여할 수 있다. 상기 제형은 주사용 형태(용액, 현탁액 또는 유탁액)로 조제할 수 있고,정제, 캅셀제, 연질캅셀제, 수액제, 과립제, 환제 등 경구용으로 조제하는 것이 가장 바람직하다.
상기 조성물은 칠엽수 추출물 또는 이의 분획물을 캅셀에 부형제 없이 충전하거나 미립된 고체 담체 또는 액체 담체 또는 그 양자와 균일하게 충분히 접촉시켜 제조한다. 그 다음, 필요한 경우 생성물을 바람직한 제제로 성형한다.
이러한 담체 부형제의 예로서 전분, 물, 식염수, 링거액 및 덱스트로스 용액이 있다. 당해 기술 분야에 알려진 적합한 제제는 문헌[Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA]에 개시되어 있는 것을 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 상기 약학적 조성물은 개체에 투여하여 MMP 매개 질환을 예방 또는 치료할 수 있다. 본 발명에서 사용된 용어, "개체"는 MMP 매개 질환을 가지고 있으며, 본 발명의 상기 약학적 조성물을 투여하여 증상이 호전될 수 있는 질환을 가진 인간을 포함한 말, 양, 돼지, 염소, 개 등의 포유동물을 의미하나, 바람직하게는 인간을 의미한다.
본 발명에서 사용된 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 개체에 본 발명의 약학적 조성물을 도입하는 것을 의미한다. 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 경구 또는 비경구 투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물이 표적 세포로 이동할 수 있도록 하는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 칠엽수 추출물 또는 이의 분획물의 단위 투여량은 5㎎ 내지 2g이 바람직하며, 10㎎ 내지 1g이 가장 바람직하다.
또한 환자의 나이와 체중뿐 아니라 혈관신생에 의한 질환의 종류 및 질환의 정도에 따라 용량 및 투여 방법이 달라지기는 하나 일반적으로 0.05 내지 200㎎/㎏체중으로 투여할 수 있으며 1일 1~3회 투여하는 것이 바람직하다.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에서 사용된 용어, 약학적으로 유효한 양은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 체중, 성별, 연령, 건강상태, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명은 칠엽수를 건조 및 분쇄하는 제1 단계; 분쇄된 칠엽수를 알코올 수용액에 넣고 가열 및 추출하는 제2 단계; 및 상기 추출된 액을 여과 및 농축하는 제3 단계를 포함하는 칠엽수 추출물의 제조 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 제2 단계의 알코올 수용액은 탄소수 1 내지 4의 알코올일 수 있으며, 메탄올, 에탄올 또는 이들의 혼합물이 바람직할 수 있다.
본 발명은 제1 단계와 제2 단계 사이에 분쇄된 칠엽수를 초임계 처리하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 초임계 처리는 식물 세포의 비극성 물질을 제거할 수 있고, 식물 세포의 구조적 변화를 초래할 수 있어 이후의 추출 단계를 진행할 때 효율을 증가시킬 수 있다. 상기 초임계 조건은 이산화탄소를 유체로 사용할 수 있으며, 처리 온도, 압력, 및 처리 시간은 당업자가 적절하게 조절할 수 있다.
본 명세서에 있어서, 상기 제2 단계 중 가열은 50 ℃ 내지 65 ℃의 온도 범위에서 수행될 수 있으며, 상기 제2 단계 중 추출은 당업계에서 알려진 추출법 예컨대, 초음파 추출법 또는 환류 추출법을 사용할 수 있으나, 이를 한정하지 않는다.
또한, 본 발명은 칠엽수를 건조 및 분쇄하는 제1 단계; 분쇄된 칠엽수를 알코올 수용액에 넣고 가열 및 추출하는 제2 단계; 상기 추출된 액을 여과 및 농축하는 제3 단계; 및 상기 농축된 추출물을 컬럼크로마토그래피를 이용하여 분획하는 제4 단계를 포함하는 칠엽수 추출물 분획물의 제조 방법을 제공한다.
상기 제1 단계 내지 제 3단계는 전술한 칠엽수 추출물의 제조 방법에 대한 설명과 동일하다.
본 발명에 있어서, 상기 컬럼크로마토그래피를 이용하여 분획하는 제4 단계의 용출액은 물, 알코올 또는 이들의 혼합 용매를 사용한다.
바람직하게는 상기 컬럼크로마토그래피를 이용하여 분획하는 제4 단계의 용출액은 30%(V/V) 내지 80%(V/V)의 알코올 수용액을 사용한다. 바람직하게는 상기 컬럼크로마토그래피를 이용하여 분획하는 제4 단계의 용출액은 50%(V/V) 내지 80%(V/V)의 알코올 수용액을 사용할 수 있다. 더욱 바람직하게는 상기 컬럼크로마토그래피를 이용하여 분획하는 제4 단계의 용출액은 50%(V/V)의 알코올 수용액을 사용한다.
상기 컬럼크로마토그래피를 이용하여 분획하는 제4 단계의 용출액은 30%(V/V) 내지 80%(V/V)의 에탄올 수용액을 사용한다.
상기 농도 범위의 알코올 수용액을 사용하는 경우, 상기 칠엽수 추출물의 분획물은 높은 함량 및 고순도의 퀘르시트린과 아프젤린을 수득할 수 있다. 예들 들면, 본 발명의 상기 칠엽수 추출물의 분획물은 상기 퀘르시트린과 상기 아프젤린을 2: 1 내지 30: 1의 중량비로 포함한다. 구체적으로 본 발명의 칠엽수 추출물 또는 이의 분획물은 상기 퀘르시트린과 상기 아프젤린을 2: 1 내지 20: 1의 중량비로 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 칠엽수 추출물 또는 이의 분획물은 상기 퀘르시트린과 상기 아프젤린을 10: 1 내지 10: 3의 중량비로 포함할 수 있다.
본 발명의 칠엽수 추출물의 분획물 내의 상기 퀘르시트린과 상기 아프젤린의 함량은 상기 칠엽수 추출물 내의 상기 퀘르시트린과 상기 아프젤린의 함량보다 2배 이상 많다. 하나의 실시상태에 있어서, 본 발명의 칠엽수 추출물의 분획물 내의 상기 퀘르시트린과 상기 아프젤린의 함량은 상기 칠엽수 추출물 내의 상기 퀘르시트린과 상기 아프젤린의 함량보다 2배 내지 10배 많다.
본 발명의 칠엽수 추출물 내의 상기 퀘르시트린과 상기 아프젤린의 함량은 칠엽수 추출물의 전체 중량을 기준으로 0.05 중량% 내지 5 중량% 포함할 수 있다. 또 하나의 실시상태에 있어서, 본 발명의 칠엽수 추출물 내의 상기 퀘르시트린과 상기 아프젤린의 함량은 칠엽수 추출물의 전체 중량을 기준으로 0.5 중량% 내지 2 중량% 포함할 수 있다.
본 발명의 칠엽수 추출물의 분획물 내의 상기 퀘르시트린과 상기 아프젤린의 함량은 칠엽수 추출물의 분획물 전체 중량을 기준으로 0.2 중량% 내지 30 중량% 포함할 수 있다. 또 하나의 실시상태에 있어서, 본 발명의 칠엽수 추출물의 분획물 내의 상기 퀘르시트린과 상기 아프젤린의 함량은 칠엽수 추출물의 분획물 전체 중량을 기준으로 1 중량% 내지 10 중량% 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에 있어서, 상기 추출된 칠엽수 추출물을 컬럼크로마토그래피를 이용하여 분획하여 칠엽수 추출물 분획물을 제조하는 제4 단계는 물로 1차 용출한 후, 2차로 전술한 알코올 수용액을 이용하여 분획할 수 있다. 이 경우, 칠엽수 추출물에 포함된 변성이 용이한 당이 물로 용출한 분획물에 포함되어 2차로 알코올 수용액으로 용출한 분획물에 당이 포함되는 것을 방지하여 고순도의 유효 성분을 포함하는 칠엽수 추출물을 제공할 수 있다.
본 발명의 콜라겐 생성 촉진능을 갖는 칠엽수 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물은 엘라스타제, 콜라게나제의 활성이 저해되고, 콜라겐 생성이 증가되어, 피부의 주름 개선, 피부의 처짐 개선 및 피부 탄력의 개선 효과를 갖는다.
또한, 본 발명의 콜라겐 생성 촉진능을 갖는 칠엽수 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물은 MMP 매개 질환의 예방 및 치료의 효능을 가질 수 있다.
도 1은 상기 회전법을 이용하여 탄력의 측정 방법을 모식적으로 나타낸 도이다.
도 2 및 3은 제품을 8주간 지속적으로 사용한 후, 피부 주름의 파라미터의 변화를 나타낸 도이다.
도 4는 제품을 8주간 지속적으로 사용한 과정에서 피부 주름을 디지털 및 3D 이미지로 나타낸 도이다.
도 5는 제품을 8주간 지속적으로 사용한 과정에서 피부의 처짐의 변화를 나타낸 도이다.
도 6은 제품을 8주간 사용한 과정에서 피부의 처짐을 측정하기 위하여, 등고선 이미지를 나타낸 도이다.
도 7은 제품을 8주간 지속적으로 사용한 과정에서 피부 탄력의 변화를 나타낸 도이다.
도 8은 제품의 효능에 대한 설문에 대해 긍정적인 평가(%)를 도시한 것이다.
도 9는 칠엽수 추출물의 분획물의 HPLC(high performance liquid chromatography)그래프를 나타낸 도이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
실시예 1. 칠엽수 추출물의 제조
대한민국 대전광역시 도마동과 전민동에서 채집한 칠엽수의 잎을 상온, 그늘에서 건조시킨 후에 분쇄하였다. 분쇄된 잎 20 g 을 25% 에탄올 1,000ml로 2시간 동안 65℃에서 추출하고, 추출액을 여과하였다. 여과액을 농축하여 칠엽수 잎의 조추출물을 34 kg 을 얻었다.
실시예 2. 칠엽수 추출물의 물 용출 분획물(H 2 O frac.)의 제조
실시예 1에서 제조된 칠엽수 추출물 10KG을 물로 용해시켜 시료를 준비하였다. HP20 수지(resin)을 사용하였고, 물을 로딩하여, HP 20 컬럼크로마토그래피를 실시하였다. 분획된 칠엽수 추출물을 동결 건조하여 칠엽수 추출물의 물 용출 분획물(H 2 O frac.)을 수득하였다.
실시예 3. 칠엽수 추출물의 에탄올 용출 분획물(ALH-L1005CI)의 제조
실시예 2에서 칠엽수 추출물의 물 용출 분획물을 수득한 후, 컬럼에 남아있는 성분들을 50(V/V)% 에탄올 수용액을 이용하여 HP20 컬럼크로마토그래피를 시행하여 퀘르시트린과 아프젤린을 포함하는 분획물에 해당하는 에탄올용출 분획물(ALH-L1005CI) 수득하였으며, 상기 수득된 칠엽수 추출물의 분획물을 동결 건조하여 칠엽수 추출물의 분획물을 2.67kg 수득하였으며, 이 분획물의 주요 성분들은 TLC를 통하여 확인하였다.
실시예 4. 형광기질을 사용한 MMP 활성 억제능의 측정.
칠엽수 추출물, 칠엽수 추출물의 물 용출 분획물 및 칠엽수 추출물의 에탄올 용출 분획물(ALH-L1005CI)이 MMP를 억제하는 활성이 증가하였는지를 알아보기 위하여 분광형광계(spectrofluorometer, 퍼킨 엘머 LS50B, 미국)를 이용하여 MMP 효소 활성 억제 정도를 측정하였다.
MMP-1과 MMP-13은 바쿨로바이러스 시스템(baculovirus system)을 이용하여 곤충세포(Sf21 곤충세포)에서 유전공학적으로 제조하였다. 즉, 각각의 cDNA를 포함하는 재조합 바이러스를 박-N-블루 선형 트랜스펙션 키트(Bac-N-Blue linear transfection kit; Invitrogen사, 제품번호 K855-01, 네덜란드)를 이용하여 제조하였으며, 숙주세포로는 Sf21 곤충세포(Invitrogen사, 제품번호 B821-01, 네덜란드)를 사용하였다. 감염된 Sf21 세포를 TNM-FH 배지(Sigma, Cat. No. T1032)에 접종하여 27 ℃에서 72시간 동안 키우고 배지를 수거하여 배지로부터 MMP를 정제하였다. MMP-1과 MMP-13은 SP-세파로즈 컬럼 크로마토그라피(SP-sepharose column chromatography(Pharmacia, Cat. No.17-0729-01))를 이용하여 정제하였으며 용출액으로는 20 mM Tris-Cl, pH 7.0, 5mM CaCl 2 를 이용하였다. 정제한 MMP 효소들은 활성측정에 사용하기 전 1mM APMA(p-아미노페닐 머큐릭 아세테이트)로 활성화시킨 후 사용하였다.
MMP-1과 MMP-13의 기질로는 각각 2,4-디니트로페닐-Pro-Leu-Ala-Leu-Trp-Ala-Arg-OH(서열번호 1, Calbiochem사)와 MCA-Pro-Cha-Gly-Nva-His-Ala-Dpa-NH 2 (서열번호 3, Calbiochem사)를 사용하여 활성을 측정하였다[MCA=메틸 쿠마릴 아미드; Cha=L-시클로헥실알라닌; Nva=L-노르발린; Dpa=3-(2,4-디니트로페닐)-L-2,3-디아미노프로판 산].
2 ㎖의 큐벳에 기질 1 μM을 포함하는 완충용액(50 mM 트리신(pH 7.5), 10 mM CaCl 2 , 200 mM NaCl) 2 ㎖를 넣고, MMP 효소(10 nM)를 넣은 후 분광 형광계를 이용하여 실온에서 2분 간격으로 20분 동안 형광도 변화를 측정하였다(대조군). 이때, 여기파장(excitation wavelength)은 280 nm에서, 방사파장(emission wavelength)은 360 nm에서 측정하였다.
또한, 실시예 1 내지 3에서 제조한 칠엽수 추출물, 칠엽수 추출물의 물 용출 분획물 및 칠엽수 추출물의 에탄올 용출 분획물(ALH-L1005CI)에 의한 MMP 활성 억제정도를 확인하기 위하여 기질을 포함하는 완충용액에 칠엽수 추출물, 칠엽수 추출물의 물 용출 분획물 및 칠엽수 추출물의 에탄올 용출 분획물(ALH-L1005CI)을 25(V/V)% 에탄올에 녹여 여러 농도로 가한 것을 이용하여 동일한 실험을 반복하였다.
　샘플 농도 MMP -1 MMP -13
칠엽수 추출물 0.25ug/ml 24.6 % 34.3 %
0.5ug/ml 41.2 % 56.8 %
1ug/ml 72.5 % 87.4 %
칠엽수 추출물의 물 용출 분획물
(H2O frac.)		 0.25ug/ml 19.8 % 29.5 %
0.5ug/ml 32.5 % 47.1 %
1ug/ml 60.3 % 70.5 %
칠엽수 추출물의 에탄올 용출 분획물
(ALH-L1005CI) 		0.25ug/ml 33.2 % 40.7 %
0.5ug/ml 59.6 % 76.8 %
1ug/ml 88.4 % 94.1 %
상기 표 1의 결과를 보면, 칠엽수 추출물, 칠엽수 추출물의 물용출 분획물 및 칠엽수 추출물의 에탄올 용출 분획물(ALH-L1005CI)은 MMP 효소 활성을 억제하는 것을 확인할 수 있으며, 더욱 구체적으로 칠엽수 추출물과 칠엽수 추출물의 에탄올 용출 분획물(ALH-L1005CI)은 칠엽수 추출물의 물 용출 분획물(H2O frac.)에 비하여, MMP-1과 MMP-13의 활성을 저해능이 동일 농도 기준으로 10-20% 더 높은 것을 확인할 수 있다.
실시예 4. 항산화 억제 측정
실시예 4-1) DPPH Assay
DPPH 8 mg을 메탄올 100ml에 녹여 DPPH 용액을 80ug/ml 농도로 만들어 96well plate에 DPPH 용액 100ul와 증류수(control), 실시예 1 내지 3에서 제조한 칠엽수 추출물 및 칠엽수 추출물의 에탄올 용출 분획물(ALH-L1005CI) 100ul를 혼합한 후 30분간 실온에서 배양하고 ELISA로 514nm에서 흡광도를 측정하였고, 칠엽수 추출물 및 칠엽수 추출물의 분획물에 대한 DPPH의 활성을 측정한 결과를 표 2에 기재하였다.
Absorbance Inhibition %
Control 0.4891
칠엽수 추출물 5ug/ml 0.4331 11.4 %
10ug/ml 0.3818 21.9 %
20ug/ml 0.2705 44.7 %
50ug/ml 0.0979 80.0 %
칠엽수 추출물의 물 용출 분획물
(H2O frac.)		 10ug/ml 0.4132 15.5 %
20ug/ml 0.3132 36.0 %
50ug/ml 0.1096 77.6 %
칠엽수 추출물의 에탄올 용출 분획물
(ALH-L1005CI) 		5ug/ml 0.3887 20.5 %
10ug/ml 0.2749 43.8 %
20ug/ml 0.1045 78.6 %
50ug/ml 0.0916 81.3 %
상기 표 2의 결과를 비교하여 보면, 본원 발명의 칠엽수 추출물, 칠엽수 추출물의 물 용출 분획물 및 칠엽수 추출물의 에탄올 용출 분획물(ALH-L1005CI)이 control에 비하여, DPPH의 항산화 활성을 가짐을 확인할 수 있었다.
실시예 4-2) ABTS Assay
7mM ABTS 5ml과 140mM potassium persulfate 144ul 혼합한 후 빛을 차단하고 실온에서 16시간 동안 방치하여 ABTS mixture를 만든 후 ABTS mixture : H2O를 1 : 44 비율로 희석한 용액 100ul와 증류수(control), 칠엽수 추출물, 칠엽수 추출물의 물 용출 분획물 및 칠엽수 추출물의 에탄올 용출 분획물(ALH-L1005CI)을 100ul를 혼합한 후 6분간 실온에서 배양하고 ELISA로 734nm에서 흡광도를 측정하였고, 칠엽수 추출물, 칠엽수 추출물의 물 용출 분획물 및 칠엽수 추출물의 에탄올 용출 분획물(ALH-L1005CI)에 대한 ABTS의 결과를 표 3에 기재하였다.
Absorbance Inhibition %
Control 0.5852
칠엽수 추출물 5ug/ml 0.4850 17.1 %
10ug/ml 0.4021 31.3 %
20ug/ml 0.2595 55.7 %
50ug/ml 0.0544 90.7 %
칠엽수 추출물의 물 용출 분획물
(H2O frac.)		 5ug/ml 0.5009 14.4 %
10ug/ml 0.4281 26.8 %
20ug/ml 0.2932 49.9 %
50ug/ml 0.0747 87.2 %
칠엽수 추출물의 에탄올 용출 분획물
칠엽수 추출물
(ALH-L1005CI) 		2.5ug/ml 0.4836 17.4 %
5ug/ml 0.4054 30.7 %
10ug/ml 0.2636 55.0 %
20ug/ml 0.0926 84.2 %
50ug/ml 0.0433 92.6 %
상기 표 3의 결과를 비교하여 보면, 본원 발명의 칠엽수 추출물, 칠엽수 추출물의 물 용출 분획물 및 칠엽수 추출물의 에탄올 용출 분획물(ALH-L1005CI)이 control에 비하여, 항산화 활성을 가짐을 확인할 수 있었다.
실시예 5. 칠엽수 추출물의 에탄올 용출 분획물(ALH-L1005CI)에 대한 in vitro 평가 시험
본 실험에서는 실시예 3에서 제조한 칠엽수 추출물의 에탄올 용출 분획물(ALH-L1005CI)을 3차증류수에 녹여서 실험하였다.
- 시험 재료
인체 섬유아세포(Human Dermal Fibroblasts, HDFs)는 Life technologies (USA)에서, Dulbecco`s Modified Eagle`s Medium/F12 Nutrient Mixture Ham (DMEM/F12 3:1), Antibiotic-Antimycotic, Trypsin-EDTA, Phosphate Buffered Saline (PBS), Hank's Balanced Salt Solution (HBSS), Fetal Bovine Serum (FBS)는 Gibco (USA)에서, 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)- 2,5 Diphenyl-2H-tetrazolium Bromide (MTT), Phosphoramidon Disodium Salt, (+)Sodium L-Ascorbate, Epigallocatechin Gallate (EGCG), Sodium Hydroxide (NaOH), N-succinyl-tri-alanyl-p-nitroanilide (STANA), Albumin from Bovine Serum (BSA), Bradford reagent는 Sigma-Aldrich (USA)에서, 1 M Tris-HCl pH 8.0는 Elpis-biotech (Korea)에서, TritonX-100는 Yakuri Pure Chemicals (Japan)에서, Dimethyl Sulfoxide (DMSO)는 Amresco (USA)에서, Procollagen type I peptide EIA kit는 Takara (Japan)에서, Matrix Metalloproteinase-1 (MMP-1) Human ELISA kit는 Abcam (USA)에서 각각 구입하였다.
- 시험 기기
Microplate Absorbance Reader는 TECAN (Austria)사의 SUNRISE를 사용하였고 37℃ 반응에는 JSR (Korea)사의 오븐기(JSOF-150)를 사용하였으며 세포배양에는 Thermo사의 CO2 배양기(HERAcell 150i)를 사용하였다.
- 세포주 선택 및 세포 배양
Human Dermal Fibroblasts (HDFs) 세포는 「기능성화장품의 유효성평가를 위한 가이드라인 (II)」의 효력시험자료를 근거로 선택하여 사용하였다. Life technologies (USA)에서 구입한 HDFs는 성인 피부에서 분리한 primary cell로서 Mycoplasma, Hepatitis B, Hepatitis C, HIV- 1, Bacteria, yeast, 그 외 다른 fungi가 검출되지 않았다. HDFs는 배양접시의 바닥에 접종한 후 1% Antibiotic-Antimycotic, 10% FBS를 함유하는 DMEM/F12 3:1 혼합 배지를 첨가하여 37℃, 5% CO2 배양기 내에서 배양하였다.
- 세포 생존률 평가
세포 생존율은 MTT의 원리를 이용하여 분석하였다. HDFs를 24-well plate에 5×104 cells/well의 농도로 접종하여 24시간 배양한 뒤 시험시료를 포함한 새로운 배지(0, 1, 5, 10, 50 ㎍/mL)로 교환한 후 24시간 배양하였다. 24시간 배양 후 0.5% MTT 용액을 각 well에 100 μL씩 첨가하여, 4시간 동안 배양하였다. 배양액을 제거한 다음 DMSO를 500 μL씩을 넣고 10분간 흔들어 준 다음 570 nm에서 흡광도를 측정하여, 표 4에 표시하였다.
Dose
(㎍/mL)		 Mean (%) SD SEM p-value1 Increment
/Decrement (%)
0 100 0.00 0.00 - -
1 98.02 2.35 1.36 0.676 1.98 %▼
5 101.71 2.76 1.59 0.767 1.71 %▲
10 59.41 2.39 1.38 0.000* 40.59 %▼
50 50.12 2.65 1.53 0.000* 49.88 %▼
1 Significant difference at
* p<0.05 compared to vehicle control
세포 생존률을 평가한 결과, 칠엽수 추출물의 에탄올 용출 분획물(ALH-L1005CI)은 5 ㎍/mL까지의 농도에서 세포에 대한 생존율을 감소시키지 않는 것으로 나타났다. 따라서, 본원 발명의 칠엽수 추출물의 에탄올 용출 분획물(ALH-L1005CI)은 인체에 무해하고, 안전성 있는 화장료 조성물 또는 약학적 조성물을 제공할 수 있다.
- 세포 내 콜라겐 생성량 측정
HDFs는 24-well plate에 5×104 cells/well로 접종하여 24시간 배양한 뒤 시험시료(0, 0.625, 1.25, 2.5, 5 ㎍/mL)를 포함한 새로운 배지로 교환하여 24시간 배양하였다. 24시간 배양 후 상층액을 취하여 배지 중 유리된 procollagen의 양을 Procollagen Type I C-Peptide (PIP) ELISA KIT을 이용하여 450 nm 에서 흡광도를 측정하였다. 콜라겐 생성 정도는 총 단백질량 으로 보정하여 평가하였고, 표 5에 그 결과를 기재하였다.
Material Dose
(㎍/mL)		 Mean (㎎/g) SD SEM p-value1 Increment (%)
칠엽수 추출물의 에탄올 용출 분획물(ALH-L1005CI) 0 31.19 3.34 1.93 - -
0.625 33.31 2.04 1.18 0.754 6.80 %▲
1.25 37.85 1.79 1.03 0.044* 21.35 %▲
2.5 43.80 3.49 2.02 0.001* 40.43 %▲
5 46.12 2.63 1.52 0.000* 47.87 %▲
1 Significant difference at
* p<0.05 compared to vehicle control
상기 표 5의 결과를 보면, 칠엽수 추출물의 에탄올 용출 분획물(ALH-L1005CI)은 콜라겐 생성을 촉진시키는 것을 확인할 수 있으며, 특히, 1.25 ㎍/mL 이상의 농도에서 세포 내 콜라겐의 생성을 유의하게 증가시키는 것을 확인할 수 있었다.
- 세포 내 콜라게나제(MMP-1) 활성 억제능 측정
HDFs는 24-well plate에 5×104 cells/well로 접종하여 24시간 배양하였다. 배양 후 콜라게나제의 활성을 유도하기 위하여 HBSS로 교환하여 UVA (6.3 J/cm2)를 조사하고 시험 시료를 포함한 새로운 배지(0, 0.625, 1.25, 2.5, 5 ㎍/mL)로 교환한 후 24시간 배양하였다. 24시간 배양 후 콜라게나제의 활성은 MMP-1 Human ELISA Kit를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. MMP-1 활성은 총 단백질량으로 보정하여 평가하였고, 그 결과를 표 6에 기재하였다.
Material Dose
(㎍/mL)		 Mean (㎎/g) SD SEM p-value1 decrement (%)
칠엽수 추출물의 에탄올 용출 분획물
(ALH-L1005CI)		 0 1202.10 56.20 32.45 - -
0.625 1002.81 15.15 8.74 0.000* 16.58 %▼
1.25 788.95 56.35 32.53 0.000* 34.37 %▼
2.5 585.45 20.69 11.95 0.000* 51.30 %▼
5 597.21 27.61 15.95 0.000* 50.32 %▼
1 Significant difference at
* p<0.05 compared to vehicle control
상기 표 6의 결과를 보면, 칠엽수 추출물의 에탄올 용출 분획물(ALH-L1005CI)은 모든 농도에서 세포 내 콜라겐을 분해하는 효소인 콜라게나제(MMP-1)의 활성을 억제하는 것을 확인할 수 있었다.
- 엘라스타제 활성 억제능 측정
HDFs를 100 mm 배양 접시에 5×104 cells/well로 접종하여 24시간 배양하였다. 배양된 세포는 0.1% Triton X-1000.2 M Tris-HCl (pH 8.0) 용액을 넣어 용해하고 이 세포 용해액을 4℃에서 10,000 rpm 으로 30분간 원심 분리한 후 상층액을 취하여 이를 엘라스타제를 포함하는 효소액으로 사용하였다. 엘라스타제 효소액을 정량하여 96-well plate에 100 ㎍씩 넣고 0.2 M Tris-HCl (pH 8.0)완충액을 넣어 88 μL가 되도록 하였다. 시험시료(0, 0.625, 1.25, 2.5, 5 ㎍ /mL)는 완충액에 희석하여 10 μL씩 첨가하고 엘라스타제의 기질인 STANA 50 mM 용액을 각 well 당 2 μL씩 넣고 상온에서 120분 동안 반응시킨 후, 405 nm에서 흡광도를 측정하여 엘라스타제 활성을 평가하였고,그 결과를 표 7에 기재하였다.
Material Dose
(㎍/mL)		 Mean (㎎/g) SD SEM p-value1 decrement (%)
칠엽수 추출물의 에탄올 용출 분획물
(ALH-L1005CI) 		0 100.00 0.00 0.00 - -
1.25 96.51 1.36 0.79 0.223 3.49 %▼
2.5 96.99 0.88 0.51 0.327 3.01 %▼
5 90.86 4.59 2.65 0.002* 9.14 %▼
1 Significant difference at
* p<0.05 compared to vehicle control
상기 표 7의 결과를 보면, 칠엽수 추출물의 에탄올 용출 분획물(ALH-L1005CI)은 엘라스틴을 분해하는 효소인 엘라스타제의 활성을 억제, 더욱 구체적으로 5 ㎍/mL의 농도에서 엘라스타제의 활성을 유의하게 감소시키는 것을 활인할 수 있었다.
- 단백질 정량
단백질량은 표준용액으로 BSA를 사용하여 Bradford 방법에 따라 정량하였다. BSA는 0, 20, 30, 40 ㎍/mL로 증류수에 단계적으로 희석하고 1 mL의 Bradford reagent에 각 농도의 BSA 용액을 20 μL씩 넣고 5분 간 반응시킨 후 595 nm에서 흡광도를 측정하여 BSA standard curve를 구하였다. 같은 방법으로 24-well plate에 배양한 HDF의 세포 용해액의 흡광도를 측정하고 BSA standard curve를 이용하여 단백질량을 산출하였다.
- 통계 분석
모든 자료는 평균값±표준편차로 표시하였으며, 통계분석은 SPSS® Package Program (IBM, USA)을 사용하여 분석하였다. 표시된 실험 결과는 3번 이상의 독립적인 실험 결과이며 각 군간의 통계적인 유의성은 one-way ANOVA 또는 independent samples t-test로 p<0.05 유의수준에서 검증하였다.
실시예 6. 칠엽수 추출물의 에탄올 용출 분획물(ALH-L1005CI)에 대한 피부 주름, 처짐 및 탄력 개선효과 평가 시험
(1) 실험 방법
본 시험은 병력 조사 및 피부 상태 진단을 통해 시험 목적에 적합한 여성 피험자 20명 이상을 대상으로 칠엽수 추출물의 에탄올 용출 분획물(ALH-L1005CI)을 포함하는 화장료 조성물을 포함하는 시험제품을 사용법에 따라 사용하도록 하였다. 피험자는 연구소를 방문하여 입실하고 20분 동안 항온항습 조건(22±2℃, 50±5%)에서 안정을 취한 후 시험에 참여하도록 하였다.
- 피험자 선정
본 시험은 피험자 선정 기준에 부합하고 제외 기준에 부합하지 않는 여성 피험자 20명을 대상으로 하였다.
- 피험자 선정 기준
다음 기술된 조건에 부합되는 지원자를 시험 대상군으로 선정하였다.
① 시험자의 판단에 따라 눈가 주름이 있는 35~ 55세의 건강한 여성 지원자
② 시험에 앞서 시험의 목적, 내용 등에 대해 충분히 설명을 듣고 자발적으로 서면 동의서에 서명한 지원자
③ 시험 기간 동안 추적 관찰이 가능한 자
- 피험자 제외 기준
다음 기술된 항목에 해당되는 지원자는 시험 대상군에서 제외하였다.
① 임신, 수유 중 또는 6개월 이내에 임신을 계획하고 있는 경우
② 피부질환의 치료를 위해 스테로이드가 함유된 피부외형제를 1개월 이상 사용한 경우
③ 동일한 시험에 참가한 뒤 3개월이 경과되지 않는 경우
④ 민감성, 과민성 피부를 가진 경우
⑤ 시험부위에 홍반, 모세혈관확장 등의 피부 이상 소견이 있는 경우
⑥시험시작 3개월 이내에 시험부위에 동일 또는 유사한 화장품 또는 의약품을 사용한 경우
⑦ 만성 소모성 질환(천식, 당뇨, 고혈압 등)이 있는 경우
⑧ 아토피 피부염을 가지는 경우
⑨ 그 외 주 시험자의 판단으로 시험이 곤란하다고 판단되는 경우
- 제한 사항
① 본 시험제품 이외의 유사한 효능을 가진 기능성 화장품 혹은 의약품과의 혼용은 금하도록 하였다.
② 자외선 차단제는 외출 시 반드시 사용하도록 한다.
③ 본 시험기간 동안에 장시간 햇빛 노출이나 야외활동은 피하도록 한다
- 피험자 수 및 이에 대한 근거
피험자 수는 기능성화장품의 유효성평가를 위한 가이드라인(2003, 2005), 화장품 표시, 광고 실증을 위한 시험방법 가이드라인(2013)에 준하여 20명 이상을 선정하여 시험을 시행하였다.
- 시험 중지 및 탈락 기준
본 시험과정 중 시험 일정을 준수하지 않는 피험자의 경우는 계속적 참여 의사를 물어 중단여부를 결정하였으며, 기타 부작용, 추적관찰 불가능 및 프로토콜을 어기는 일이 발생하였을 때는 시험을 중단토록 하였다.
① 피험자가 임상시험 참여 동의를 철회한 경우
② 시험 중 시험 물질에 의한 부작용이 심각한 경우
③ 갑작스런 사고나 질환의 병발현상으로 시험의 진행이 불가능한 경우
④ 시험제품을 총 사용횟수의 10% 이상 또는 연속 3일 이상 사용하지 않은 경우
⑤ 기타 시험자의 판단에 의해 시험수행에 지장이 있다고 생각되는 경우
- 3차원 이미지를 이용한 피부 주름 측정
피부 주름은 3차원 피부 측정 장치인 PRIMOS® premium (GFMesstechnik GmbH, Germany)을 이용하여 측정하였다. 이 기기는 Digital Micro mirror Devices (DMD)기술을 이용하여 디지털 stripe 투사를 응용한 비접촉식 기기이다. 각 평가시점마다 촬영된 영상이미지는 매칭(matching) 기능을 이용하여 동일한 부위의 변화를 비교, 측정이 가능하다.
본 시험에서는 제품 전과 사용 4주 및 8주 후 시점에서 눈가 주름을 촬영하고, 주름 파라미터(1; Average depth of wrinkles(주름의 평균 깊이), 2; Mean depth biggest wrinkle(가장 큰 주름의 평균 깊이), 3; Max. depth biggest wrinkle(가장 큰 주름의 최대 깊이), 4; Total wrinkle area(전체 주름의 면적), 5; Total wrinkle volume(전체 주름의 부피), 6; Total form factor wrinkles(전체 주름의 폼 팩터, 1에 가까울수록 주름이 개선됨), 7; Total length of wrinkles(전체 주름의 길이), 8; Ra(주름 측정 부위의 전체 평균 거칠기), 9; Ry(최대 높이: 산 높이와 골깊이의 합), 10; Rz (주름 측정 부위를 5 section으로 나눈 뒤, 각 section의 거칠기의 평균값에 대한 평균 거칠기)를 분석하였다.
- 등고선 이미지를 이용한 안면 처짐 평가
안면 처짐은 F-ray (Beyoung, Korea)를 이용하여 측정하였다. 이는 모아레 간섭성을 이용한 3차원 곡면 측정 시스템으로, 특수 제작한 격자무늬 창을 사이에 두고 물체를 향하여 경사지게(30°) 빛을 쪼이면 물체에 의해 변형된 격자 무늬가 기준 격자무늬와 교차됨으로써 모아레 무늬(등고선)가 생성되며, 이 모아레 무늬(등고선)를 통해 안면 및 신체의 구조변화를 확인할 수 있다.
본 시험에서는 제품 사용 전, 사용 4주 및 8주 후 시점에서 안면 측면의 등고선 이미지를 촬영한 후 Image-pro® plus (Media Cybernetics, USA)를 이용하여 뺨 부위 처짐의 각도를 분석하였다.
- 회전법을 이용한 피부 탄력 측정
피부 탄력은 Torquemeter® DTM310 (Diastron, UK)을 이용하였다. 이 측정 기기는 10mNm의 일정한 회전력에, on-time 10초, off-time 10초로 하여 피부를 비틀어서 피부의 탄력을 그래프 및 수치로 나타낸다.
본 시험에서는 제품 사용 전, 사용 2주 및 4주 후 시점에서 뺨 정면부위를 1mm, 3mm의 링을 이용하여 측정한 후 겉탄력과 속탄력의 Ur/Ue값을 분석하였다. Ur/Ue값은 1에 가까울수록 탄력이 좋다는 것을 의미한다.
도 1은 상기 회전법을 이용하여 탄력의 측정 방법을 모식적으로 나타낸 도이다.
- 피험자에 의한 설문 평가
제품의 효능에 관한 설문은 제품 사용 4주 및 8주 후 시점에서 피험자로 하여금 5점 척도(1, 전혀 그렇지 않다; ~ 3, 차이가 없다; ~ 5, 매우 그렇다)로 설문을 작성하도록 하고, 제품 사용성에 관한 설문은 5점 척도(1, 전혀 좋지 않다; ~ 3, 보통이다; ~ 5, 매우 좋다)로 실시하여, 긍정적인 답변(4, 5번)을 분석하였다.
- 피부 안정성 평가
제품 사용 후 각 평가시점에서 문진과 시험자의 관찰을 통해 주관적 피부 자극감과 객관적 피부 자극을 평가하였다.
- 통계 분석
모든 데이터의 통계적 유의성은 SPSS® Package Program (IBM, USA)을 이용하여 분석하였다. 정규성은 첨도 (kurtosis)와 왜도(skewness)를, 사전 동질성은 paired t-test를 통해 검증하였다. 동일 피험자에게서 반복 측정한 데이터에 존재하는 상호의존성(교호작용), 시점 별 전후 변화를 확인하기 위해 반복측정 분산분석법(Repeated Measures ANOVA)을 적용하였으며, 통계학적 유의수준은 p 값이 0.05 미만으로 설정하였다. 증감률은 아래의 식에 따라 계산하였다.
Figure pat00001
(2) 실험 결과
- 피험자 피부 특성
본 시험은 제외기준 및 선정기준에 준하는 42 ~ 53세의 여성 피험자 23명(평균 48.35±3.31세)이 참여하여 시험 종료 시까지 전 과정을 성실히 수행하였다. 피험자의 피부 특성은 설문에 의해 조사되었으며, 분석 결과는 하기 표 8과 같다.
Item Classification Frequency (N) Percentage (%)
피부 타입
(Skin type)		 건성(Dry) 14 60.87 %
중성(Normal) 7 30.43 %
지성(Oily) 0 0.00 %
건지성(Dry and oily) 2 8.70 %
문제성 피부(Problematic) 0 0.00 %
수분 (Hydration) 촉촉(Sufficient) 0 0.00 %
보통(Normal) 16 69.57 %
건조(Deficient) 7 30.43 %
유분 (Sebum) 번들거림(Glossy) 2 8.70 %
보통(Normal) 15 65.22 %
부족(Deficient) 6 26.09 %
표면 상태 (Surface) 부드러움(Smooth) 2 8.70 %
보통(Normal) 20 86.96 %
거침(Rough) 1 4.35 %
두께 (Thickness) 얇은 편(Thin) 10 43.48 %
보통(Normal) 11 47.83 %
두꺼운 편(Thick) 2 8.70 %
자외선 노출 시간 (Duration of UV exposure) 1시간 이내(Less than 1hr) 6 26.09 %
1~3시간(1-3hrs) 17 73.91 %
3시간 이상(More than 3hrs) 0 0.00 %
평균수면시간
(Sleeping hours)		 5시간 이하(Less than 5hrs) 1 4.35 %
5~8시간(5-8hrs) 22 95.65 %
8시간 이상(More than 8hrs) 0 0.00 %
흡연 (Smoking) 안핌(No) 23 100.00 %
10개피 이내
(Less than 10 pieces)		 0 0.00 %
10개피 이상
(More than 10 pieces)		 0 0.00 %
자극 감수성 (Irritability) 예 (Yes) 0 0.00 %
아니오 (No) 23 100.00 %
따가움 감수성 (Stinging) 예 (Yes) 0 0.00 %
아니오 (No) 23 100.00 %
이상반응 경험
(Adverse reaction)		 예 (Yes) 0 0.00 %
아니오 (No) 23 100.00 %
- 3 차원 이미지를 이용한 피부 주름 분석
상기 전술한 3차원 이미지를 이용한 피부 주름 측정한 결과를 표 9에 기재하였다.
Item Week N Mean1 SD p-value2 Decrement (%)
Average depth of wrinkles Before 23 41.15 8.06 - -
4W 23 37.85 7.83 0.001* 8.02 %▼
8W 23 38.29 8.27 0.003* 6.95 %▼
Mean depth biggest wrinkle Before 23 55.70 14.95 - -
4W 23 49.31 13.89 0.004* 11.47 %▼
8W 23 49.36 13.17 0.003* 11.39 %▼
Max. depth biggest wrinkle Before 23 165.36 50.61 - -
4W 23 136.48 40.30 0.000* 17.46 %▼
8W 23 134.59 44.79 0.000* 18.61 %▼
Total wrinkle area Before 23 42.18 6.66 - -
4W 23 42.13 6.71 0.314 0.12 %▼
8W 23 42.15 6.69 0.611 0.08 %▼
Total wrinkle volume Before 23 1.73 0.41 - -
4W 23 1.58 0.35 0.001* 8.69 %▼
8W 23 1.61 0.38 0.003* 7.23 %▼
Total form factor wrinkle Before 23 1.05 0.06 - -
4W 23 1.05 0.05 - -
8W 23 1.05 0.05 0.747 0.41 %△
Total length of wrinkles Before 23 102.13 19.15 - -
4W 23 103.17 18.49 0.547 1.02 %△
8W 23 101.43 20.71 0.631 0.68 %▼
Ra Before 23 20.92 3.94 - -
4W 23 19.50 4.01 0.002* 6.82 %▼
8W 23 19.73 4.13 0.005* 5.68 %▼
Ry Before 23 306.34 65.57 - -
4W 23 285.89 78.94 0.054 6.68 %▼
8W 23 280.60 64.87 0.003* 8.40 %▼
Rz Before 23 246.82 44.08 - -
4W 23 231.89 48.87 0.012* 6.05 %▼
8W 23 231.85 46.14 0.006* 6.07 %▼
1 Decrement of the mean value represents decrease of skin wrinkle (▼).
2 Significantly different at *p<0.05 compared with before treatment.
상기 표 9의 결과를 분석한 결과, 본 발명의 칠엽수 추출물의 에탄올 용출 분획물(ALH-L1005CI)을 포함하는 화장료 조성물의 경우, 피부 주름의 개선에 효과적인 것을 확인할 수 있었으며, 특히 ‘Average depth of wrinkles’, ‘Mean depth biggest wrinkle’, ‘Max. depth biggest wrinkle’, ‘Total wrinkle volume’, ‘Ra’, ‘Rz’ 파라미터가 제품 사용 4주 및 8주 후 시점에서, ‘Ry’ 파라미터가 제품 사용 8주 후 시점에서 유의하게 감소(p<0.05)하였으며, 개선율은 5.69 % 내지 18.61 %임을 확인할 수 있었다.
도 2 및 3은 제품을 8주간 지속적으로 사용한 후, 피부 주름의 파라미터의 변화를 나타낸 도이다.
도 4는 제품을 8주간 지속적으로 사용한 과정에서 피부 주름을 디지털 및 3D 이미지로 나타낸 도이다.
상기 도 2 내지 4의 결과로 보면 본원 발명의 칠엽수 추출물의 에탄올 용출 분획물(ALH-L1005CI)은 피부 주름 개선 면에서 우수한 효과를 나타내는 것을 확인할 수 있다. 이는 본 발명의 칠엽수 추출물의 에탄올 용출 분획물(ALH-L1005CI)이 콜라겐 생성을 촉진하는 기능을 가지고, MMP 효소 활성 억제능을 가짐으로써 나타날 수 있는 효과일 수 있다.
- 등고성 이미지를 이용한 피부 처짐 분석
상기 전술한 방법으로 측정한 등고선 이미지를 이용한 안면 처짐 평가에 대한 결과는 하기 표 10과 같다.
Week N Mean1 SD p-value2 Decrement (%)
Before 23 30.17 3.11 - -
4W 23 29.11 3.56 0.040* 3.50 %▼
8W 23 28.07 3.69 0.003* 6.95 %▼
1 Decrement of the mean value represents improvement of skin sagging on cheek (▼).
2 Significantly different at *p<0.05 compared with before treatment.
상기 표 10과 같이 피부의 처짐을 분석한 결과 피부의 처짐 정도가 개선되는 것을 확인할 수 있다. 특히, 제품 사용 4주후, 8주후 시점에서 유의하게 개선(p<0.05)되었으며, 개선율은 각각 3.50%, 6.95%였다.
도 5는 제품을 8주간 지속적으로 사용한 과정에서 피부의 처짐의 변화를 나타낸 도이다.
도 6은 제품을 8주간 사용한 과정에서 피부의 처짐을 측정하기 위하여, 등고선 이미지를 나타낸 도이다.
- 회전법을 이용한 피부 탄력 분석
상기 전술한 회전법을 이용한 피부 탄력 분석을 측정한 결과는 하기 표 11과 같다.
Classification Week N Mean1 SD p-value2 Increment (%)
Stratum corneum Before 23 0.277 0.022 - -
4W 23 0.282 0.022 0.047* 1.57 %▲
8W 23 0.289 0.026 0.001* 4.08 %▲
Full skin thickness Before 23 0.257 0.024 - -
4W 23 0.262 0.025 0.018* 1.86 %▲
8W 23 0.270 0.027 0.000* 4.91 %▲
1 Increment of the mean value represents increase of skin elasticity (▲).
2 Significantly different at *p<0.05 compared with before treatment.
상기 결과를 분석한 결과, 본원 발명의 칠엽수 추출물의 에탄올 용출 분획물 (ALH-L1005CI)을 포함하는 경우, 겉탄력 및 속탄력이 개선되는 것을 확인할 수 있으며, 구체적으로 제품 사용 후 4주후 및 8 주후 시점에서 유의하게 증가(p<0.05)하였으며, 개선율은 1.57% 내지 4.91%였다.
도 7은 제품을 8주간 지속적으로 사용한 과정에서 피부 탄력의 변화를 나타낸 도이다.
- 설문 평가 분석
하기 내용과 같이 제품의 효능에 대한 피험자에 의한 설문으로 제품을 평가한 결과는 하기 표 12와 같다.
(n=23)
Items 4W 8W
N1 %2 N1 %2
눈가 주름 감소
(Decrease of wrinkle)		 11 47.83 % 18 78.26 %
피부 처짐 개선
(Improvement of skin sagging)		 13 56.52 % 15 65.22 %
피부 탄력 증가
(Improvement of elasticity)		 16 69.57 % 19 82.61 %
피부 촉촉해짐
(Increase of moisture)		 18 78.26 % 20 86.96 %
피부 부드러워짐
(Improvement of softness)		 20 86.96 % 23 100.00 %
피부 상태 개선
(Improvement of skin condition)		 17 73.91 % 20 86.96 %
1 N (Frequency) = Number of positive answers (4, Agree ~ 5, Strongly agree)
2 % (Percentage) = Number of positive answers / Total number of subjects (23) × 100
상기 표의 결과를 보면, 제품 사용 4주 후 시점에서 ‘피부 탄력 증가’, ‘피부 촉촉해짐’, ‘피부 부드러워짐’, ‘피부 상태 개선’ 항목에서 피험자의 69.57 % 내지 86.96 %가, 8주 후 시점에서 모든 항목에서 피험자의 65.22% 내지 100.00%가 긍정적으로 응답하였다.
도 8은 제품의 효능에 대한 설문에 대해 긍정적인 평가 %를 나타낸 도이다.
- 피부 안정성 평가
본 제품을 이용하여 시험을 한 동안 모든 피험자에게서 하기 표 13과 같은 피부 이상반응은 관찰되지 않았다.
(n=23)
증상(Symptom) 4W 8W
주관적 자극감 (Subjective irritation) 가려움(Itching) 0 0
찌르듯이 아픔(Prickling) 0 0
화끈거림(Burning) 0 0
따끔거림(Stinging) 0 0
뻣뻣함(Stiffness) 0 0
당김(Tightening) 0 0
눈이 따갑다(Burning of eyes) 0 0
눈물이 난다(Weeping) 0 0
기타(etc.) 0 0
객관적 자극감 (Objective irritation) 홍반(Erythema) 0 0
부종(Edema) 0 0
인설(Scale) 0 0
구진(Papule) 0 0
기타(etc.) 0 0
총 이상반응 자의 수(Total number of subjects) 0 0
상기의 모든 실험 결과를 종합적으로 고려하여 보았을 때, 본 발명의 칠엽수 추출물 및 칠엽수 추출물의 분획물은 콜라겐 생성능이 확인되었으며, 콜라겐을 분해하거나, 엘라스틴을 분해하는 효소의 활성의 억제능을 가지고 있음을 확인할 수 있었다.
또한, 상기와 같은 칠엽수 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 화장료 조성물의 경우, 피부의 안정성을 가지고 있음과 동시에, 피부의 주름 개선, 피부의 탄력 개선 및/또는 피부의 처짐을 개선할 수 있음을 확인할 수 있다.

Claims (15)

  1. 칠엽수 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 콜라겐 생성 촉진용 화장료 조성물.
  2. 칠엽수 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 콜라겐 생성 촉진능을 갖는 MMP 매개 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 칠엽수 추출물 또는 이의 분획물은 퀘르시트린 및 아프젤린을 유효성분으로 포함하는 것인 조성물.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 칠엽수 추출물 또는 이의 분획물은 상기 퀘르시트린과 상기 아프젤린을 2: 1 내지 30: 1의 중량비로 포함하는 것인 조성물.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 조성물은 MMP 효소 활성 억제능을 더 갖는 것인 조성물.
  6. 제2항에 있어서,
    상기 MMP 매개 질환은 동동맥경화증, 알츠하이머 질환, 골질환, 단백뇨증, 복대동맥류 질환, 신경계의 수초탈락 질환, 간경변, 신사구체 질환, 배태막의 미성숙 파열, 염증성 장질환, 치주 질환 또는 노화와 관련된 황반 변성인 것인 MMP 매개 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 칠엽수 추출물은 알코올 추출물인 것인 조성물.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 분획물은 상기 칠엽수 추출물의 에탄올 용출 분획물인 것인 조성물.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 분획물은 상기 칠엽수 추출물의 30%(V/V) 내지 80%(V/V) 에탄올 용출 분획물인 것인 조성물.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 화장료 조성물은 정제수, 향료, 색소, 살균제, 산화방지제, 점도감소제, 점도증가제, 피부유연화제, 피막형성제, 수분증발차단제, 금속이온봉쇄제, 방부제, 산화방지제, 보습제, 점증제, 무기염류, 합성 고분자 물질, 유분, 물, 계면활성제, 알코올 및 킬레이트제로 이루어진 군에서 1 또는 2 이상의 첨가제를 더 포함하는 것인 조성물.
  11. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 조성물의 전체 중량을 기준으로, 상기 칠엽수 추출물 또는 이의 분획물의 함량은 0.005 중량% 내지 20 중량% 인 것인 조성물.
  12. 칠엽수를 건조 및 분쇄하는 제1 단계;
    분쇄된 칠엽수를 알코올 수용액에 넣고 가열 및 추출하는 제2 단계; 및
    상기 추출된 액을 여과 및 농축하는 제3 단계를 포함하는 칠엽수 추출물의 제조 방법.
  13. 칠엽수를 건조 및 분쇄하는 제1 단계;
    분쇄된 칠엽수를 알코올 수용액에 넣고 가열 및 추출하는 제2 단계;
    상기 추출된 액을 여과 및 농축하는 제3 단계; 및
    상기 농축된 추출물을 컬럼크로마토그래피를 이용하여 분획하는 제4 단계를 포함하는 칠엽수 추출물 분획물의 제조 방법.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 컬럼크로마토그래피를 이용하여 분획하는 제4 단계의 용출액은 물, 알코올 또는 이들의 혼합 용매를 사용하는 것인 칠엽수 추출물 분획물의 제조 방법.
  15. 제13항에 있어서,
    상기 컬럼크로마토그래피를 이용하여 분획하는 제4 단계의 용출액은 30%(V/V) 내지 80%(V/V)의 알코올 수용액을 사용하는 것인 칠엽수 추출물 분획물의 제조 방법.
KR1020160079591A 2016-06-24 2016-06-24 칠엽수 추출물을 포함하는 조성물 KR102511527B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020160079591A KR102511527B1 (ko) 2016-06-24 2016-06-24 칠엽수 추출물을 포함하는 조성물

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020160079591A KR102511527B1 (ko) 2016-06-24 2016-06-24 칠엽수 추출물을 포함하는 조성물

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20180001047A true KR20180001047A (ko) 2018-01-04
KR102511527B1 KR102511527B1 (ko) 2023-03-17

Family

ID=60998163

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020160079591A KR102511527B1 (ko) 2016-06-24 2016-06-24 칠엽수 추출물을 포함하는 조성물

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR102511527B1 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019125058A1 (en) * 2017-12-22 2019-06-27 Angiolab, Inc. Composition comprising a horse chestnut extract

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20080071017A (ko) * 2007-01-29 2008-08-01 주식회사 안지오랩 칠엽수잎 추출물의 제조방법

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20080071017A (ko) * 2007-01-29 2008-08-01 주식회사 안지오랩 칠엽수잎 추출물의 제조방법

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019125058A1 (en) * 2017-12-22 2019-06-27 Angiolab, Inc. Composition comprising a horse chestnut extract

Also Published As

Publication number Publication date
KR102511527B1 (ko) 2023-03-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
TWI381834B (zh) Abnormal protein removal composition
Pham et al. Anti‑wrinkle effect of fermented black ginseng on human fibroblasts
JP2002193738A (ja) 皮膚老化の徴候を処置する組成物における、少なくとも１種のツツジ科植物の少なくとも１種の抽出物の使用
KR101116852B1 (ko) 후박 추출물 또는 이로부터 분리된 ４-ｏ-메틸호노키올을유효성분으로 함유하는 항염, 항알러지 및 주름 개선용조성물
KR20100132511A (ko) 주름을 방지 또는 개선하기 위한 경구, 주사, 피부 외용제 및 미용 방법
KR20040068986A (ko) 줄기 세포 인자의 생산ㆍ방출의 억제에 의한 소양, 피부거칠어짐, 민감성 피부 개선용 및 미백용 약제
KR101922635B1 (ko) 마유 및 새싹 추출물을 함유하는 피부 염증 개선용 화장료 조성물
KR101954773B1 (ko) 낙엽송 부산물로부터 다량의 유효성분을 효과적으로 분리하는 정제 방법 및 이 유효성분을 함유한 조성물
US20200222294A1 (en) Vegfc production promoter
KR101436199B1 (ko) 호데닌을 포함하는 피부 상태 개선용 조성물
KR20140012456A (ko) 아케비아 사포닌-디를 포함하는 피부 상태 개선용 조성물
KR100782600B1 (ko) 디오스게닌 및 디오신을 포함하는 피부 노화 방지용 조성물
JP2014122183A (ja) Ｄｎａ損傷抑制剤
KR101503158B1 (ko) 피부 주름 개선 및 탄력 증진용 화장료 조성물
US10143648B2 (en) Peptide and oside extract of schisandra fruit and improvement in the response of the cutaneous neurosensory system
JP2004107243A (ja) シワ及び／又はたるみ改善用キット
KR101430636B1 (ko) 진세노사이드 Ｒｈ2 및 진세노사이드 Ｒｇ3를 함유하는 기능성 화장료 조성물
KR101922637B1 (ko) 마유 및 애기수영 추출물을 함유하는 피부 미백 및 주름 개선용 화장료 조성물
KR20180001047A (ko) 칠엽수 추출물을 포함하는 조성물
KR100761329B1 (ko) 피부노화 방지 및 주름 생성 억제 효과를 나타내는장생도라지 추출물 및 이로부터 분리된 정제 분획물들을함유하는 피부외용 조성물
KR102144566B1 (ko) 택란 추출물을 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염의 예방 또는 치료용 조성물
JP2012250921A (ja) 紫外線障害抑制剤
KR20150108088A (ko) 능실 추출물을 유효성분으로 함유하는 스트레스 자극에 의한 피부노화 억제 또는 개선용 조성물
JP6375100B2 (ja) 抗老化剤、美白剤、皮膚化粧料および飲食品
KR20180108255A (ko) 파리신 비를 포함하는 화장료 조성물

Legal Events

Date Code Title Description
E902 Notification of reason for refusal
AMND Amendment
E601 Decision to refuse application
X091 Application refused [patent]
AMND Amendment
X701 Decision to grant (after re-examination)
GRNT Written decision to grant