KR20170126495A - 침입성 dna 바이러스에 대해 식물 내성을 강화하는 방법 - Google Patents

침입성 dna 바이러스에 대해 식물 내성을 강화하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 하기 단계를 포함하는 DNA 바이러스에 대한 식물 내성을 강화하는 방법을 제공한다: 1) 5'-NX-NGG-3' 또는 5'-CCN-NX-3' 배치 법칙에 부합되는 타겟 서열이 될 서열을 DNA 바이러스의 게놈 서열에서 선택하고, 이 타겟 서열에 역-상보적인 DNA 단편을 합성하는 단계; 2) DNA 단편을 CRISPR/Cas9 뉴클레아제 발현을 위해 사용할 벡터내에 구축하고, 가이드 RNA의 전사 및 Cas9 단백질의 발현을 구현할 수 있는 재조합 벡터를 수득하는 단계; 3) 재조합 벡터를 수여 식물에 도입하는 단계. 본 발명의 방법은, DNA 바이러스의 서열이 공지된, 이중 가닥 DNA 바이러스 및 중간산물로서 이중 가닥 DNA를 이용하는 단일 가닥 DNA 바이러스에 널리 적용할 수 있다.

Description

침입성 DNA 바이러스에 대해 식물 내성을 강화하는 방법
본 발명은 식물 유전자 조작 분야에 속하며, 침입성 DNA 바이러스에 대해 식물의 내성을 향상시키는 방법에 관한 것이다.
DNA 바이러스는 자연계에 광범위하게 존재하고 있으며, 박테리아, 동물 및 식물들에 상당히 많은 수의 숙주를 가지고 있다. 공지된 대부분의 DNA 바이러스들은 심각한 감염성 질병을 야기하며, 그로 인해 경제 작물 및 포유류 (인간 등)에 상당한 손해를 발생시킨다.
예를 들어, 제미니바이러스 (geminivirus)는 단일 가닥 DNA를 가진 식물 바이러스의 한 계열로서, 제미네이트 입자를 가진 유일한 바이러스 타입이다. 이는 단일 가닥 DNA 바이러스들로 구성된 가장 큰 규모의 계열로 알려져 있다. 제미니바이러스의 게놈은 구성 성분이 하나이거나 또는 2개일 수 있으며, 그 크기는 약 2.5-3.1kb이다. 제미니바이러스는 곤충을 통해 전파되며, 이들 대부분은 식물의 체관부를 감염시킨다. 현재, 제미니바이러스는 토마토, 카사바 및 목화 등의 농작물에 막대한 손실을 야기하는 것으로 보고되고 있다. 1991년 - 1992년, 미국 플로리다에서는 제미니 바이러스로 인해 토마토 생산에 1억 4천만 달러의 손해가 발생하였다. 1992년 - 1997년에는, 파키스탄에서 목화 잎 말림 바이러스 (cotton leaf curl virus)로 인해 50억 달러의 손해가 발생하였다. 카사바의 경우, 전세계적으로 매해 10억 파운드의 손해를 입고 있다. 1999년도에는, 과학계에서 제미니바이러스의 유해성을 설명하기 위해, 특별 보고서 "제미니바이러스 심각한 농작물 위협으로서 출현하다"를 발표하였다.
제미니바이러스에 저항하기 위한 통례적인 방법은 대부분 DNA 바이러스의 복제를 차단하거나 또는 이의 병원성 단백질의 발현을 간섭하는데 집중되어 있다. 제미니바이러스의 복제 기전은 비교적 보존되어 있다. 숙주 세포에 침입한 후, 바이러스 DNA에 의해 복제-관련 단백질을 발현한다. 그런 후, 이 단백질이 바이러스 게놈의 복제 오리진에 결합하여, DNA 바이러스의 복제를 개시한다. 제미니바이러스의 단일 가닥 DNA가 숙주 세포 안으로 들어가면, 단일 가닥 DNA에 대한 상보적인 가닥을 합성하여 이중 가닥의 중간 산물 (dsDNA)을 형성하게 된다. 바이러스는 복제-관련 단백질 (Rep)과 복제 인핸서 단백질 (Ren)만 코딩하고 있다. Rep 단백질은 이중 가닥 DNA의 복제 오리진에 결합하여, 보존된 서열 TAATATTAC에 끊어진 부위 (nick)를 만들어, 롤링 서클 복제 (rolling circle replication)를 시작한다. 따라서, 내인성 Rep 단백질과 경쟁하기 위해 전장 또는 부분적인 외인성 Rep 단백질을 도입함으로써, 제미니바이러스의 복제를 저해할 수 있다. 그러나, 이 기법의 사용은 높은 발현성, 숙주 세포의 증식 저해 및 비-보편성과 같은 단점들로 인해 제한적이다. 바이러스의 병원성 단백질 발현을 방해하기 위해 RNAi를 사용함으로써, 바이러스 내성을 달성한다는 또 다른 보고도 있다. 이 기법은 상동성에 의존하기 때문에, 보편적이지 않다. 2005년, 타카시 세라는 징크 핑거 단백질이 이중 가닥 DNA에 특이적으로 결합한다는 사실에 기반한 제미니바이러스의 복제 저해 방법을 개발하였다. BSCTV (beet severe curly top virus)가 모델로서 사용되었다. 이중 가닥 중간산물이 복제 오리진에 결합하는 것에 대해 바이러스 복제 개시 단백질 Rep와 경쟁하도록 외인성 인공 징크 핑거 단백질 (AZP)을 도입하여, 바이러스의 복제를 방지한다. 그러나, 이 방법은 복제 개시 단백질로서 Rep를 가진 제미니바이러스에서만 실현되므로, DNA 바이러스들에 대한 넓은 내성 스펙트럼을 구축할 수 없다.
최근, 파지 및 플라스미드와 같은 침입한 이중 가닥 DNA 단편을 특이적으로 제거할 수 있는 후천적인 면역 반응 시스템이 박테리아에 존재하는 것으로 확인되었다. 이러한 면역 시스템은 CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat sequence), tracrRNA (trans-acting CRISPR RNA) 및 Cas 유전자 (CRISPR-associated gene)로 구성된다. 일부 바이러스 DNA 단편을 CRISPR 반복 서열 안에 삽입하여, 이 바이러스 서열을 포함하는 CRISP RNA를 발현시킬 수 있다. 이 바이러스가 세포에 다시 침입하게 되면, CRISP RNA는, tracrRNA의 도움을 받아, Cas 유전자에 의해 코딩된 엔도뉴클레아제가 외인성 이중 가닥 바이러스 DNA를 인지하여 제거하도록 안내하게 된다.
Cas 유전자의 코어 요소들의 서열 차이에 따라, CRISPR/Cas 면역 시스템은 3가지 타입으로 분류할 수 있다: 타입 I, 타입 II 및 타입 III. 타입 I과 III는 이중 가닥 DNA를 절단하는 복합체를 형성하기 위해서는 Cas 유전자에 코딩된 복수의 단백질이 필요하지만, 타입 II는 Cas9 단백질만 필요하다. 그래서, 타입 II CRISPR/Cas 시스템이 가장 널리 사용된다. 최근 연구들에서, crRNA와 tracrRNA를 인공 합성을 통해 sgRNA (single-guide RNA)로 융합시킬 수 있다는 것이 밝혀졌다. 이 sgRNA는 Cas9 엔도뉴클레아제를 타겟 부위의 DNA를 절단하도록 안내할 수 있다.
유사한 CRISPR/Cas 시스템을 진핵생물에 도입시킬 수 있다면, 진핵 생물의 바이러스 내성을 현저하게 개선시킬 수 있을 것이다.
본 발명의 과제는 DNA 바이러스에 대해 개선된 내성을 가진 식물의 제조 방법을 제공하는 것이다.
DNA 바이러스에 대해 개선된 내성을 가진 식물을 제조하는 본 방법은, 구체적으로, 하기 단계들을 포함할 수 있다:
(1) DNA 바이러스의 게놈 서열에서 복수의 타겟 서열을 선택하고; 타겟 서열 각각에 역-상보적인 (reverse-complement) DNA 단편을 설계 및 합성하는 단계:
타겟 서열은 5'-NX-NGG-3' 또는 5'-CCN-NX-3'이며;
N은 A, G, C 및 T 중 어느 하나이고; 14≤X≤30이고; X는 정수이고; NX는 인접하는 X개의 데옥시리보뉴클레오티드를 표시함,
(2) 단계 (1)에서 수득한 수개의 DNA 단편들을, CRISPR/Cas9 뉴클레아제 발현용 벡터로 구축하여, 수개의 재조합 벡터를 수득하는 단계:
상기 재조합 벡터는 가이드 RNA의 전사 및 Cas9 단백질의 발현을 수행할 수 있으며; 가이드 RNA는 crRNA와 tracrRNA 간의 염기 쌍 형성 (base pairing)에 의해 형성된 회문 구조를 가진 RNA이고; crRNA는 상기 DNA 단편으로부터 전사된 RNA 단편을 포함함,
(3) 수개의 재조합 벡터를 수여 식물에 각각 도입하고; 수여 식물에서 DNA 바이러스에 대해 개선된 내성을 가진 식물을 입수하는 단계:
DNA 바이러스는 이중 가닥 DNA 바이러스이거나, 또는 중간산물로서 이중 가닥 DNA를 가지는 단일 가닥 DNA 바이러스이다.
또한, 본 발명은 구체적으로 하기 단계들을 포함하는, DNA 바이러스에 대해 개선된 내성을 가진 식물의 제조 방법을 제공한다:
1) DNA 바이러스의 게놈 서열에서 타겟 서열을 선택하는 단계:
타겟 서열은 5'-NX-NGG-3' 또는 5'-CCN-NX-3'의 서열을 가지며;
N은 A, G, C 및 T 중 임의의 하나이고; 14≤X≤30; X는 정수이고; NX는 인접하는 X개의 데옥시리보뉴클레오티드를 표시함,
2) CRISPR/Cas9 뉴클레아제 발현용 재조합 벡터를 구축하는 단계:
재조합 벡터는 단계 1)의 타겟 서열을 특이적으로 타겟팅하는 가이드 RNA를 전사할 수 있으며, Cas9 단백질을 발현할 수 있음,
3) 수개의 재조합 벡터를 식물에 도입하여, DNA 바이러스에 대해 개선된 내성을 가진 식물을 수득하는 단계.
일부 구현예에서, DNA 바이러스는 이중 가닥 DNA 바이러스이거나 또는 중간 산물로서 이중 가닥 DNA를 가지는 단일 가닥 DNA 바이러스이다. CRISPR/Cas9 뉴클레아제 발현용 재조합 벡터는 가이드 RNA를 전사할 수 있으며, Cas9 단백질을 발현할 수 있다. 이 가이드 RNA는 crRNA와 tracrRNA 간의 염기 쌍 형성에 의해 만들어진 회문 구조를 가진 RNA이다.
본 발명의 또 다른 과제는 DNA 바이러스에 대한 식물 내성을 향상시키는 방법을 제공하는 것이다.
DNA 바이러스에 대한 식물 내성을 향상시키는 본 발명의 방법은 구체적으로 하기 단계들을 포함할 수 있다:
（a）하기 단계를 포함하는 방법에 따라 타겟 DNA 단편을 수득하는 단계:
（a1）내성을 나타낼 DNA 바이러스의 게놈 서열에서 복수의 타겟 서열을 선택하고; 타겟 서열에 각각 역-상보적인 DNA 단편을 설계 및 합성하는 단계:
타겟 서열은 5'-NX-NGG-3' 또는 5'-CCN-NX-3'의 서열을 가지며;
N은 A, G, C 및 T 중 어느 하나이고; 14≤X≤30이고; X는 정수이고; NX는 인접하는 X개의 데옥시리보뉴클레오티드를 표시함,
（a2）단계 (a1)에서 수득한 수개의 DNA 단편들을 CRISPR/Cas9 뉴클레아제 발현용 벡터내에 구축하여, 수개의 재조합 벡터를 수득하는 단계:
재조합 벡터는 가이드 RNA의 전사 및 Cas9 단백질의 발현을 수행할 수 있으며; 가이드 RNA는 crRNA와 tracrRNA 간의 염기 쌍 형성에 의해 형성된 회문 구조를 가진 RNA이고; crRNA는 DNA 단편으로부터 전사된 RNA 단편을 포함함,
（a3）수여 식물 (1)들 각각에 수개의 재조합 벡터를 도입하고, 타겟 식물로 지칭되는 DNA 바이러스에 대해 개선된 내성을 가진 식물을 수여 식물 (1)들로부터 입수하는 단계:
타겟 식물에 도입된 재조합 벡터에서 상기 DNA 단편을 타겟 DNA 단편으로서 동정함,
（b）단계 (a2) 및 (a3)에 따라, 상기 타겟 DNA 단편을 CRISPR/Cas9 뉴클레아제 발현용 벡터내에 구축하고, 수득된 재조합 벡터를 수여 식물 (2)에 도입하여, DNA 바이러스에 대한 수여 식물 (2)의 내성을 향상시키는 단계;
DNA 바이러스는 이중 가닥 DNA 바이러스이거나, 또는 중간 산물로서 이중 가닥 DNA를 가지는 단일 가닥 DNA 바이러스이며;
수여 식물 (1) 및 수여 식물 (2)은 서로 동일하거나 또는 상이할 수 있다.
전술한 방법들에서, "DNA 바이러스에 대해 개선된 내성을 가진 식물을 수여 식물 (수여 식물 (1))로부터 수득하는 단계"는 하기 단계들을 포함하는 방법에 의해 달성된다:
（I）단계 (3)에서, 대조군으로서 빈 벡터를 수여 식물 (또는 수여 식물 (1))에 도입하는 단계:
빈 벡터는 DNA 단편이 삽입되지 않은 CRISPR/Cas9 뉴클레아제 발현용 벡터임,
（II）DNA 바이러스 발현용 벡터를, 재조합 벡터를 보유한 복수의 수여 식물 (또는 수여 식물 (1))에 도입하여, 복수의 식물 (A)을 수득하고; DNA 바이러스 발현용 발현 벡터를 빈 벡터를 보유한 수여 식물에 도입하여 식물 (B)를 수득하고; 식물 (A) 및 식물 (B)에서 DNA 바이러스 함량을 검출하고; 식물 (A)에서 식물 (B) 보다 DNA 바이러스 함량이 유의하게 (P<0.05) 낮은 식물을 선별하여, 식물 A'를 수득하는 단계로서; 식물 A'에 해당되는 재조합 벡터를 보유한 수여 식물 (또는 수여 식물 (1))이 DNA 바이러스에 개선된 내성을 가진 식물인, 단계.
"식물 (B) 보다 DNA 바이러스 함량이 유의하게 낮은 식물을 식물 (A)로부터 선별하는" 단계는, 바람직하게는, 식물 (B) 보다 DNA 바이러스 함량이 유의하게 (P<0.01) 낮은 식물을 식물 (A)로부터 선별하는 단계를 포함하거나, 또는 바람직하게는, 식물 (A)로부터 임의의 질병 표현형을 나타내지 않는 식물을 선별하는 단계를 포함한다.
상기 방법들의 단계 (2) 및 (a2)에서, RNA 단편은 타겟 단편에 상보적으로 결합할 수 있다. 타겟 단편은 이중 가닥 DNA 바이러스의 게놈 서열이거나, 또는 단일 가닥 DNA 바이러스의 이중 가닥 DNA 중간 산물의 서열이며, 이는 단계 (1)에서 서열 "Nx"에 해당된다.
상기 방법의 단계 (b)에서, 수여 식물 (2)에서 재조합 벡터에 의해 가이드 RNA가 전사되고, Cas9 단백질이 발현된다. 가이드 RNA 및 Cas9 단백질에 의해 형성된 CRISPR/Cas9 뉴클레아제는 수여 식물 (2)에서 DNA 바이러스의 복제를 저해할 수 있으며, 따라서 DNA 바이러스에 대한 수여 식물 (2)의 내성을 향상시킬 수 있다. 특히, 가이드 RNA 및 Cas9 단백질에 의해 형성된 CRISPR/Cas9 뉴클레아제는 타겟 단편을 절단하여, 수여 식물 (2)에서 DNA 바이러스의 복제를 저해한다.
본 발명의 구체적인 구현예에서, CRISPR/Cas9 뉴클레아제 발현용 벡터는 pHSN401 벡터이다.
즉, 재조합 벡터는, pHSN401 벡터의 BsaI 사이트 2개 사이에 정방향으로 DNA 단편을 삽입함으로써 수득한, 재조합 플라스미드이다.
본 발명의 특정 구현예에서, X는 20이다.
본 발명의 특정 구현예에서, 식물은 쌍떡잎 식물이다.
본 발명의 특정 구현예에서, 식물은 니코티아나 벤타미아나 (Nicotiana benthamiana) 등의 담배 식물이다.
본 발명의 일 구현예에서, DNA 바이러스는 제미니바이러스이며, 특히 BSCTV (beet severe curly top virus)이다. 즉, 타겟 서열 (표 1)에 따라 설계된 DNA 단편은 표 2에 열거된 서열들 중 임의의 하나이다. 타겟 DNA 단편은 표 2에 열거된 서열들 중 임의의 하나이다 (즉, 서열번호 1-15 중 임의의 하나의 상보적인 서열). 바람직하게는, 타겟 DNA 단편은 V4 및 V9을 제외한 표 2에 열거된 서열들 중 임의의 하나이다 (즉, 서열번호 1-3, 4-8 및 10-15 중 임의의 하나의 서열에 대한 역-상보적인 서열). 더 바람직하게는, 타겟 단편은 V4 또는 V9 (즉, 서열번호 7 및 8의 역-상보적인 서열)이다. 발현 벡터 (즉, 전술한 "DNA 바이러스 발현용 발현 벡터")는 플라스미드 pCambiaBSCTV1.8이다. 플라스미드 pCambiaBSCTV1.8은 다음과 같은 단계들을 포함하는 방법에 의해 수득된다: (a1) 서열번호 16의 DNA 단편을 pCambia1300 벡터의 EcoRI과 BamHI 사이에 정방향으로 삽입하여, 중간 벡터를 수득하는 단계; (a2) 상기 중간 벡터의 EcoRI 사이트에 서열번호 17의 DNA 단편을 삽입하여, 플라스미드 pCambiaBSCTV1.8을 수득하는 단계.
본 발명의 방법은 박테리아의 면역 시스템을 모방한다. 바이러스내 타겟 부위를 특이적으로 인지하는 sgRNA가 식물에서 발현되어, 식물에서 이중 가닥 바이러스 DNA의 Cas9-매개 클리어런스 (Cas9-mediated clearance)를 유도한다. 본 발명에서는, 모델 바이러스로서 BSCTV (beet severe curly top virus)를 사용해, 식물에서 CRISPR/CAS9 시스템에 의한 BSCTV의 효과적인 복제 저해를 최초로 입증하였다. 본 발명의 방법은 단지 바이러스의 게놈 서열에 의존할 뿐이며, 바이러스 유전자의 구체적인 기능에 대해서는 숙지할 필요가 없다. 따라서, 본 방법은 다양한 공지된 이중 가닥 DNA 바이러스 또는 중간 산물로서 이중 가닥 DNA를 가진 단일 가닥 바이러스에 대해 내성을 구축하는데 널리 이용할 수 있다.
도 1은 다양한 담배 식물 그룹들에서 BSCTV의 상대적인 함량을 도시한 것이다. pHSN401 빈 벡터 대조군에서의 BSCTV의 상대적인 함량은 1로 나타낸다. 다른 그룹들에서 BSCTV의 상대적인 함량은 pHSN401 빈 벡터 대조군에 대한 비율로 나타낸다.
도 2는 다양한 그룹들에서 담배 식물의 표현형을 도시한 것이다. A는 pHSN401 빈 벡터 대조군이고; B는 V7 그룹이고; C는 V8 그룹이고; D는 V4 그룹이다.
하기 실시예들에 적용되는 실험 방법들은 달리 언급되지 않은 한 모두 통례적인 방법이다.
하기 실시예들에 사용되는 재료, 시약은 달리 언급되지 않은 한 모든 상업적으로 구입가능하다.
pHSN401 벡터는 "Hui-Li Xing et al., A CRISPR/Cas9 toolkit for multiplex genome editing in plants. BMC plant biology 2014"에 기술되어 있으며, 중국 과학 학회의 유전학 및 발생생물학 협회로부터 입수할 수 있다.
니코티아나 벤타미아나 (Nicotiana benthamiana)는 "Hai-tao Cui et al., Establishment of a tissue culture and genetic transformation system for Nicotiana benthamiana , Science In Shandong, 2006, Volume 01"에 기술되어 있으며, 중국 과학 학회의 유전학 및 발생생물학 협회로부터 입수할 수 있다.
pCambia1300 벡터는 Youbio Co. Ltd. (CAT.No.: VT1375)에서 입수한다.
아그로박테리움 균주 EHA105는 Youbio Ltd. (CAT.No.: ST1140)에서 입수한다.
실시예 1. 식물의 DNA 바이러스 내성 능력을 향상시키는 방법의 확립
본 실시예에서, BSCTV (beet severe curly top virus)를 내성 대상 DNA 바이러스로서 선정하였고, 담배 (Nicotiana benthamiana)를 BSCTV의 타겟 식물로 사용하여, DNA 바이러스에 대한 식물 내성을 향상시키는 방법을 확립하였다.
BSCTV는 단일 가닥 DNA 바이러스이다. 그러나, 이의 증폭에는 롤링 서클 복제가 요구된다. 먼저, 단일 가닥 바이러스 DNA를 주형으로 사용해 상보적인 가닥을 합성하여, 이중 가닥의 서클 중간산물을 만들다. 그런 후, 이중 가닥의 중간산물에 끊김 (nick)을 만들고, 상보적인 가닥을 주형으로 사용해 단일 가닥 바이러스 DNA를 다량 생산한다. 즉, 이중 가닥의 중간산물은 바이러스 게놈 DNA를 증폭시키는데 중요한 역할을 한다. 본 발명자들은 Cas9이 BSCTV의 이중 가닥 중간산물을 제거하도록 안내하기 위해 바이러스의 이중 가닥 중간산물에 특이적인 수개의 sgRNA를 설계하였다.
I. 쌍떡잎 식물용 Crispr/Cas9 시스템 바이너리 벡터의 구축
1. 차세대 서열분석의 결과를 토대로 BSCTV (beet severe curly top virus)의 구조 맵을 입수하였다 (서열번호 16 및 17).
2. 구조 맵에서 영역을 무작위 선택하여, V 영역으로 명명하였다. 300 bp 길이의 V 영역을 커버링하도록 타겟 단편을 설계하였다 (표 1). 또한, 비-바이러스성 서열로 된 타겟 서열을 대조군으로 사용하였다.
표 1. V 영역 타겟 단편 설계
영역 No. 서열
V V1 TCATTGGATTATCATAGACAAGG（서열번호 1）
V2 ATTATCATAGACAAGGATGTTGG（서열번호 2）
V3 CCTACTAAGTTATCGAGTATATT（서열번호 3）
V4 TGATATTCCCGATAACGGTCAGG（서열번호 4）
V5 CCGTCTACTTATCGTATTCGAAG（서열번호 5）
V6 TTCGAAGAGATATGAACGAGAGG（서열번호 6）
V7 GGTTTATTGTGAAGAAGAAATGG（서열번호 7）
V8 AGAACTCATTTGATGTCTACTGG（서열번호 8）
V9 TGGTACTGGATATGGAGGGAAGG（서열번호 9）
V10 TGGAGGGAAGGAGACTTACAAGG（서열번호 10）
V11 CCTTCAATGCCAAATTACAAGAA（서열번호 11）
V12 CCGATGAATATCAATGTCCGCAA（서열번호 12）
V13 ATCTGAACATGAGGACTATTTGG（서열번호 13）
V14 ACTATTTGGAAAGACACCGGTGG（서열번호 14）
V15 TGGGAAGTATGAAGACGTGAAGG（서열번호 15）
표 1에서 밑줄 친 뉴클레오티드는 PAM 서열이다.
3. 스티키 말단 (sticky end)을 가진 단일 가닥 올리고뉴클레오티드들 (표 2)을 단계 2에서 설계한 타겟 단편에 따라 합성하였다. 올리고뉴클레오티드의 어닐링에 의해 형성된 스티키 말단을 가진 이중 가닥 DNA를, pHSN401 벡터의 2개의 BsaI 사이트 사이에 정방향으로 삽입하여, 재조합 플라스미드를 제조하였다. pHSN401 벡터의 BsaI 제한효소 부위 2개 사이에 표 1의 타겟 서열에 대해 역-상보적인 서열을 삽입시킨 파지티브 재조합 플라스미드를 서열분석을 통해 검증하고, pHSN401-sgRNA로 명명하였다. 파지티브 재조합 플라스미드는 해당 타겟 단편에 특이적인 가이드 RNA (sgRNA)를 전사할 수 있으며, Cas9 단백질을 발현할 수 있다.
표 2. V 영역 타겟 단편에 해당되는 올리고뉴클레오티드
영역 No. 서열
V V1 V1F：ATTGTCATTGGATTATCATAGACA
V1R：AAACTGTCTATGATAATCCAATGA
V2 V2F：ATTGATTATCATAGACAAGGATGT
V2R：AAACACATCCTTGTCTATGATAAT
V3 V3F：ATTGAATATACTCGATAACTTAGT
V3R：AAACACTAAGTTATCGAGTATATT
V4 V4F：ATTGTGATATTCCCGATAACGGTC
V4R：AAACGACCGTTATCGGGAATATCA
V5 V5F：ATTGCTTCGAATACGATAAGTAGA
V5R：AAACTCTACTTATCGTATTCGAAG
V6 V6F:ATTGTTCGAAGAGATATGAACGAG
V6R：AAACCTCGTTCATATCTCTTCGAA
V7 V7F:ATTGGGTTTATTGTGAAGAAGAAA
V7R：AAACTTTCTTCTTCACAATAAACC
V8 V8F：ATTGAGAACTCATTTGATGTCTAC
V8R：AAACGTAGACATCAAATGAGTTCT
V9 V9F:ATTGTGGTACTGGATATGGAGGGA
V9R：AAACTCCCTCCATATCCAGTACCA
V10 V10F:ATTGTGGAGGGAAGGAGACTTACA
V10R：AAACTGTAAGTCTCCTTCCCTCCA
V11 V11F：ATTGTTCTTGTAATTTGGCATTGA
V11R:AAACTCAATGCCAAATTACAAGAA
V12 V12F：ATTGTTGCGGACATTGATATTCAT
V12R：AAACATGAATATCAATGTCCGCAA
V13 V13F：ATTGATCTGAACATGAGGACTATT
V13R：AAACAATAGTCCTCATGTTCAGAT
V14 V14F：ATTGACTATTTGGAAAGACACCGG
V14R：AAACCCGGTGTCTTTCCAAATAGT
V15 V15F:ATTGTGGGAAGTATGAAGACGTGA
V15R：AAACTCACGTCTTCATACTTCCCA
II. 담배 트랜지언트 시스템 (transient system)을 이용한 활성형 sgRNA의 스크리닝
본 발명자들은 BSCTV에 내성을 가진 활성 sgRNA를 스크리닝하기 위한 담배 트랜지언트 시스템을 최초로 확립하였다.
1. 담배 식물의 준비
담배 (Nicotiana benthamiana) 종자를 영양 토양에 직접 파종하였다. 2주 후 유식물 (seedling)을 각각 9 x 9 cm2에 옮겨 심었다. 잎 8-9장이 자날 때까지 2주간 유식물을 키웠다. 주입하기 위한 부위로 비슷한 크기의 측면 잎 2개를 선택하였다. 온실에서의 배양 조건: 16h 명 조건 및 8h 암 조건; 온도 24 ℃.
2. 내성 벡터 및 바이러스 접종
BSCTV가 든 pCFH 벡터를 미국 세포주은행 (ATCC, http://www.lgcstandardsatcc.org/，ATCC® Number: PVMC-6™)에서 입수하였다. pCFH 벡터를 EcoRI과 BamHI으로 이중 절단하여 0.8-copy BSCTV 단편 (서열번호 16)을 수득한 다음, 이를 pCambia1300 벡터의 EcoRI과 BamHI 제한효소 사이트 사이에 삽입하였다. 제조된 재조합 플라스미드는 pCambiaBSCTV0.8로 명명하였다. 그런 후, EcoRI으로 절단하여 1-copy BSCTV 단편 (서열번호 17)을 수득하고, 이를 pCambiaBSCTV0.8 벡터의 EcoRI 사이트에 정방향으로 삽입하였다. 제조된 재조합 벡터는 pCambiaBSCTV1.8로 명명하였다. 이 재조합 벡터의 구축 방법은 Chen et al., BSCTV C2 Attenuates the Degradation of SAMDC1 to Suppress DNA Methylation-Mediated Gene Silencing in Arabidopsis. 2011에 기술되어 있다.
바이러스 1.8 카피가 pCambia1300의 백본을 가진 바이너리 벡터에 삽입되었으므로 (1.8 카피는, 바이러스 서열의 0.8 카피 부가가 바이너리 벡터에 통합된 바이러스의 식물에서 서클 산물들을 형성하는데 필수적이라는 것을 의미함), 아그로박테리움 주입 방법을 통해 니코티아나 벤타미이나의 게놈내에 삽입시키면, 바이러스의 자가 복제를 달성할 수 있다.
아그로박테리움 균주 EHA105를 액체 질소 냉동-해동 방법을 이용해 pHSN401-sgRNA 플라스미드로 형질전환하였다. 단일 콜로니를 취하여, 카나마이신과 리팜피신이 첨가된 LB 배지 1 ml에 접종하여, 밤새 교반하면서 배양하였다. 그런 후, 박테리아는 카나마이신과 리팜피신이 첨가된 LB 5 ml에 접종하여 밤새 교반하면서 배양하였다. 배양물을 3600 rpm으로 10분간 원심분리한 다음 10 mM MgCl2에 재현탁하고, OD600가 1.5이 되도록 희석하였다. 0.1% (v/v) 200 mM 아세토시린곤 (acetosyringone, As)을 첨가하였다. 이 용액을 2시간 동안 그대로 둔 후 미리 준비한 담배 잎 2장에 주입하였다.
2일 후, 아그로박테리움 균주 EHA105를 동일한 방법을 사용해 pCambiaBSCTV1.8 플라스미드로 형질전환하였다. 규모를 증가시킨 배양물을 10mM MgCl2에 현탁하여 OD600=0.5까지 희석한 후 이미 pHSN401-sgRNA 플라스미드가 주입된 2장의 잎에 주입하였다.
pHSN401 플라스미드를 실험에서 대조군으로 사용하였다. 1주 이상의 담배 식물을 각 실험에 사용하였다.
10일 후, 다양한 그룹들에서 담배 식물의 표현형을 기록하였다. 주입한 잎을 샘플로 채취하여, 액체 질소 하에 분말로 분쇄하였다. 각 샘플 100 mg을 취하여 TIANGEN DNA quick Plant System (no centrifuge column)을 사용해 DNA를 추출하였다. 니코티아나 벤타미아나의 PPR (Pentatricopeptide repeat containing protein) 유전자 (Accession number: GO602734)를 내부 표준 물질로 선정하였으며, 적절한 133 bp 단편을 프라이머로 증폭시키기 위한 부위로 선택하였다:
PPR-F: 5'-CTCGGCCAAGAAGATCAACCATAC-3';
PPR-R: 5'-GGTGCTTTATGTGGTTGTAGTTATGC-3'.
BSCTV의 증폭되는 단편은 76bp이며, 프라이머는 다음과 같다:
BSCTV-F: 5'-CAGGGATTTTCGCACAGAGGAAC -3';
BSCTV-R: 5'-GATTCGGTACCAAGTCCACGGG -3'.
qPCR용 시약은 Roche Lightcycler @480 SYBR Green I Master이다. qPCR의 반응 시스템: 2x mix 10㎕; 프라이머 (각각) 1㎕; ddH2O 4㎕; DNA 주형 4㎕.
실험 그룹들에서 담배 식물내 BSCTV 함량을 2-ΔΔCT 방법에 따라 빈 벡터 대조군을 기준으로 계산하였다:
（1）각 그룹의 BSCTV 함량을 표준화하였다:
바이러스 함량=2（CT（내부 PPR ）- CT（ BSCTV ））
（2）대조군을 기준으로 한 실험 그룹들의 바이러스 함량은 바이러스 함량 실험/바이러스 함량대조군이었다. 결과는 엑셀에서 통계학적으로 분석하였다.
각 담배 식물 그룹에서 상대적인 BSCTV 함량을 도 1에 나타내었다. 실험 그룹들에서 상대적인 BSCTV 함량이 pHSN401 대조군 보다 낮다는 것을 알 수 있다. 통계적 분석을 통해, 모든 실험 그룹들이 빈 벡터 대조군과 P<0.01 수준에서 유의한 차이를 보였지만, V4 및 V9은 유의 수준이 P<0.05이었다. pHSN401 대조군에 속하는 담배 식물들은 명확한 BSCTV 감염 증상을 나타내었다. 또한, V4 및 V9 식물 역시 명확한 BSCTC 감염 증상을 나타내었지만, 대조군 식물 보다는 양호하였다. 가장 유의한 차이를 보이는 V7 및 V8 식물들은 정상적인 표현형을 나타내었는 바, 바이러스에 대해 강력한 내성을 발휘하였다. 식물에서 BSCTV의 상대적인 함량은 질병의 표현형과 일치하는 것으로 확인되었다 (대표적인 표현형을 가진 담배 식물을 도 2에 도시함).
SEQUENCE LISTING <110> Institute of Genetics and Developmental Biology, Chinese Academy of Sciences <120> Method for improving ability to resist against intrusive DNA viruses of plant <130> GNCLN150347 <150> CN 201510107492.9 <151> 2015-03-12 <160> 17 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 1 tcattggatt atcatagaca agg 23 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 2 attatcatag acaaggatgt tgg 23 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 3 cctactaagt tatcgagtat att 23 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 4 tgatattccc gataacggtc agg 23 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 5 ccgtctactt atcgtattcg aag 23 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 6 ttcgaagaga 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Claims (9)

  1. 하기 단계를 포함하는 DNA 바이러스에 대해 개선된 내성을 가진 식물의 제조 방법:
    (1) 내성을 나타낼 DNA 바이러스의 게놈 서열에서 복수의 타겟 서열을 선정하고; 상기 타겟 서열 각각에 대해 역-상보적인 DNA 단편을 설계 및 합성하는 단계로서,
    상기 타겟 서열은 5'-NX-NGG-3' 또는 5'-CCN-NX-3'의 서열을 가지며,
    N은 A, G, C 및 T 중 하나이고; 14≤X≤30이고; X는 정수이고; NX는 인접하는 X개의 데옥시리보뉴클레오티드를 표시하는, 단계;
    (2) 단계 (1)에서 수득되는 상기 DNA 단편을, CRISPR/Cas9 뉴클레아제 발현용 벡터내에 구축하여, 복수의 재조합 벡터를 수득하는 단계로서,
    상기 재조합 벡터는 가이드 RNA의 전사 및 Cas9 단백질의 발현을 수행할 수 있으며; 상기 가이드 RNA는 crRNA와 tracrRNA 간의 염기 쌍 형성 (base pairing)에 의해 형성된 회문 구조를 가진 RNA이고; 상기 crRNA는 상기 DNA 단편으로부터 전사된 RNA 단편을 포함하는, 단계;
    (3) 상기 재조합 벡터를 수여 식물에 각각 도입하고; 상기 DNA 바이러스에 대해 개선된 내성을 가진 식물을 수여 식물들에서 입수하는 단계로서,
    상기 DNA 바이러스는 이중 가닥 DNA 바이러스이거나, 또는 중간산물로서 이중 가닥 DNA를 가지는 단일 가닥 DNA 바이러스인, 단계.
  2. 하기 단계를 포함하는, 식물의 DNA 바이러스 내성을 향상시키는 방법:
    （a）하기 단계를 포함하는 방법에 따라 타겟 DNA 단편을 수득하는 단계:
    （a1） 내성을 나타낼 DNA 바이러스의 게놈 서열로부터 복수의 타겟 서열을 선정하고; 상기 타겟 서열에 각각 역-상보적인 DNA 단편을 설계 및 합성하며,
    상기 타겟 서열은 5'-NX-NGG-3' 또는 5'-CCN-NX-3'의 서열을 가지며;
    N은 A, G, C 및 T 중 하나이고; 14≤X≤30이고; X는 정수이고; NX는 인접하는 X개의 데옥시리보뉴클레오티드인 단계;
    （a2）단계 (a1)에서 수득되는 상기 DNA 단편을 CRISPR/Cas9 뉴클레아제 발현용 벡터내에 구축하여, 복수의 재조합 벡터를 수득하고,
    상기 재조합 벡터는 가이드 RNA의 전사 및 Cas9 단백질의 발현을 수행할 수 있으며; 상기 가이드 RNA는 crRNA와 tracrRNA 간의 염기 쌍 형성에 의해 형성된 회문 구조를 가진 RNA이고; 상기 crRNA는 상기 DNA 단편으로부터 전사된 RNA 단편을 포함하는, 단계;
    （a3）수여 식물 (1) 각각에 상기 재조합 벡터를 도입하고; 타겟 식물로 지칭되는 DNA 바이러스에 대해 개선된 내성을 가진 식물을 상기 수여 식물 (1)들로부터 입수하며,
    상기 타겟 식물에 도입된 재조합 벡터내 DNA 단편을 타겟 DNA 단편으로 동정하는 단계;
    （b）단계 (a2) 및 (a3)에 따라, 상기 타겟 DNA 단편을 CRISPR/Cas9 뉴클레아제 발현용 벡터내에 구축하고, 수득한 재조합 벡터를 수여 식물 (2)에 도입하여 상기 DNA 바이러스에 대한 수여 식물 (2)의 내성을 향상시키고,
    상기 DNA 바이러스는 이중 가닥 DNA 바이러스이거나, 또는 중간 산물로서 이중 가닥 DNA를 가지는 단일 가닥 DNA 바이러스이며;
    상기 수여 식물 (1) 및 수여 식물 (2)은 서로 동일하거나 또는 상이할 수 있는 단계.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 CRISPR/Cas9 뉴클레아제 발현용 벡터가 pHSN401 벡터인, 방법.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 재조합 백터가 상기 pHSN401 벡터의 BsaI 사이트 2개 사이에 상기 DNA 단편을 삽입함으로써 수득되는 재조합 플라스미드인, 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    X가 20인, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 식물이 외떡잎 식물 또는 쌍떡잎 식물인, 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 쌍떡잎 식물이 담배 식물인, 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 DNA 바이러스가 제미니바이러스 (geminivirus)인, 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 제미니바이러스가 BSCTV (beet severe curly top virus)인, 방법.
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