KR20170116938A - 표준화 파이토케미컬을 가지는 수용성 시디움 구아자바 잎 추출물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 파이토케미컬에 대하여 표준화된 시디움 구아자바 잎 추출물 획득 방법을 개시한다. 획득된 추출물은 물에 고도로 가용성이며 식품 및 음료 제품에서 사용되는, 구체적으로 구이자바린, 사포닌 및 폴리페놀과 같은 표준화 파이토케미컬을 함유한다. 상기 방법은 고도로 정제된 형태의 파이토케미컬을 획득하기 위한 구체적인 여과 방법을 포함한다. 획득된 추출물은 여러 상이한 화합물을 단리하기 위한 생활성 유도된 분별을 거쳐 파이토케미컬 농후 분획이 획득되고 농후 생활성 분획으로부터의 단일 파이토케미컬의 정제 및 단리가 이어진다. 상기 파이토케미컬은 구이자베린으로서 동정되고, 이는 또한 항당뇨 활성을 나타낸다. 시디움 구아자바 잎 추출물은 식품 및 음료 산업에서 유용하고 초콜릿, 캡슐, 및 물 기초의 보충제 음용물과 같은 여러 상이한 제형에서 사용된다.
Description
본 발명은 파이토케미컬을 함유하는 구아바(시디움 구아자바 ) 잎 추출물 제조 방법, 더욱 구체적으로 식품 및 음료 분야에서 유용한 파이토케미컬에 대하여 표준화된 시디움 구아자바 잎 추출물 획득 방법에 관한 것이다.
최근 몇 년 간, 불량한 식습관으로 인하여, 고혈압, 당뇨병, 뇌경색 및 심장병과 같은 생활양식 관련 질환의 발생이 증가했다. 이들 질환의 유행은 나이 든 세대에서 나타날 뿐만 아니라 젊은 세대에서도 나타나며, 심각한 건강 문제를 제기한다. 여러 경우에, 그러한 생활양식 관련 질환은 비만과 밀접하게 관련된 것으로 지적된다. 따라서, 식이의 개선 및 운동을 통한 비만의 치료 및 예방이 생활양식 관련 질환 예방에 중요하다.
비만을 극복하기 위한 여러 식이 조성물이 개시된다. 그러나, 이들 조성물은 적절하게 모니터링되지 않을 경우 추가적인 건강 위험을 유발하는 화합물을 함유한다. 따라서, 천연 파이토케미컬을 함유하는 약초 식물 또는 다른 식물 추출물을 이용하여 이들 질환을 치료하는 것이 바람직하다. 파이토케미컬은 천연 공급원으로부터 입수되고 점점 더 다양한 질환의 치료를 위해 고려되고 있으며 구아바 잎이 그 중 하나이다.
흔히 구아바로 알려진 시디움 구아자바(Psidium guajava)는 도금양과(Myrtaceae family)에 속하고 타이완, 오키나와, 인도 등의 열대 지역에서 자란다. 시디움 구아자바 잎 추출물은 다량의 폴리페놀 물질, 탄닌 물질, 사포닌, 엘라그산 글리코사이드, 플라보노이드 등을 함유한다. 한 연구에서 상기 추출물이 ?-아밀레이즈 억제 활성 및 지질 과산화물의 형성 억제 효과를 나타냄이 밝혀졌다. 이의 의약적 특성으로 인하여, 시디움 구아자바 잎 보충제는 최근 캡슐, 식품 보충제 및 시디움 구아자바 잎차의 형태로 입수 가능하다. 이는 의약품 및 약물의 사용으로 인한 부작용을 피하기 때문에 매우 유리하다.
선행 기술에서 시디움 구아자바 잎 추출물의 단리 및 치료 목적을 위한 추출물의 사용을 위하여 이용 가능한 여러 방법이 존재한다.
발명의 명칭이 "Improved extracts of psidium guajava l., methods for its obtaining and use for the treatment of gastrointestinal disorders"인 PCT 출원 PCT/IB2005/002172는 위장 기능과 연관된 신경계의 기능장애에 관련된 다양한 위장 질환의 치료에 유용한, 구아바 식물, 특히 이의 잎으로부터의 표준화 추출물을 함유하는 식물약제(phytomedicament) 추출 공정을 개시한다. 상기 발명의 임상적으로 평가된 식물약제의 항미생물, 항운동성, 항경련, 항염증, 항산화 및 항분비 특성, 그리고 이의 무독성이, 위장 기능 장애의 치료를 위한 임상에서의 사용을 허용한다. 상기 공정은 여과 기술, 가령 분무 건조된 미세 분말 및 크로마토그래피 분리 기술 이용에 실패한다. 상기 공정은 또한 추출된 파이토화합물(phytocompound) 각각에 대한 분리된 분획 생활성을 연구하기 위하여 생물 검정 유도된 분별을 수행하지 않는다.
발명의 명칭이 "Guava extract"인 PCT 출원 PCT/IB2008/003502는 구아바 열매 추출물의 제조, 단리 및 용도를 개시한다. 상기 추출물은 디펩티딜 펩티데이즈 IV와 관련되거나, 이에 의하여 야기되거나, 이에 의하여 매개되는 질환 또는 병태의 치료에 사용된다. 구아바 추출물은 펠타토사이드 및 구아자베린, 이소퀘세틴을 포함하는 퀘세틴 관련 플라보놀-글리코사이드를 함유한다. 구아바 추출물은 디펩티딜 펩티데이즈 IV의 활성 억제에 효과적이었다.
따라서, 선행 기술의 결점을 고찰하여, 유익한 약리학적 특성을 보유하는 구이자바린, 사포닌 및 폴리페놀과 같은 여러 상이한 파이토케미컬에 대하여 표준화된 수용성 시디움 구아자바 잎 추출물을 제조하는 방법에 대한 요구가 있다.
발명의 요약
본 발명은 선행 기술의 결점을 극복하고 구체적으로 구이자바린, 사포닌 및 폴리페놀과 같은 표준화 파이토케미컬을 함유하는, 시디움 구아자바로부터 얻은 잎 추출물의 추출 방법을 제공한다. 본 발명은 파이토케미컬 농후 분획을 획득하기 위한 추출물의 생활성 유도된 분별에 이어, 농후 생활성 분획으로부터의 단일 파이토케미컬 정제 및 단리를 개시한다. 추출물은 임의의 식품 제품 및 음료 제품에 혼입될 수 있다. 추출 방법은 분무 건조와 같은 여과 기술을 활용하고, 이는 분무 건조된 추출물을 생성하며 분무 건조된 추출물은 분쇄되고 체별되어 균일한 입자 크기 분말이 얻어진다. 분무 건조된 분말은 폴리페놀, 사포닌 및 구이자바린 함유물의 존재에 대하여 분석된다. 여러 상이한 파이토케미컬을 함유하는 추출물은 다양한 산업에 유용하다.
이렇게 획득된 시디움 구아자바 잎 추출물은 품질 및 이의 생물학적 기능성이 매우 안정하다. 이는 고품질의 생활성 폴리페놀, 플라보노이드, 안토시아닌 및 탄닌을 가진다. 시디움 구아자바 잎 추출물은 수성 베이스 또는 물에 용해된 후 높은 안정성을 나타냈다. 생성된 추출물은 높은 용해도 및 더 적은 침전을 나타냈고 여러 상이한 형태, 가령 캡슐, 초콜릿, 수성 음용물, 정제 등의 식품 및 영양 보충제로서, 또한 시디움 구아자바를 함유하는 다른 음료 및 침출차 제조용 원료 또는 중간체로서 유용하다.
도 1은 본 발명의 하나 이상의 구체예에 따른 구이자바린, 퀘세틴 및 이소퀘세틴의 화학적 구조를 나타낸다.
도 2는 시디움 구아자바 잎 추출물의 추출 방법을 도해한다.
도 3은 시디움 구아자바 잎 추출물로부터의 파이토케미컬 단리 방법을 도해한다.
도 2는 시디움 구아자바 잎 추출물의 추출 방법을 도해한다.
도 3은 시디움 구아자바 잎 추출물로부터의 파이토케미컬 단리 방법을 도해한다.
청구된 발명의 주제를 더욱 명확하고 간결하게 설명하기 위하여, 특정 용어에 대한 하기 정의가 제공되며, 이는 하기 기재된 설명에서 사용된다.
용어 "추출물"은 맥락에서 필요한 대로, 본원에 기재된 단리 방법에 의하여, 식물 공급원, 가령 잎으로부터 획득된 구아바 추출물 조성물을 의미한다.
용어 "파이토케미컬"은 식물에서 천연으로 나타나는 화합물, 가령 구이자바린, 사포닌 등을 의미한다.
본 발명은 구아자바린, 퀘세틴 및 이소퀘세틴과 같은 특정한 파이토케미컬에 대하여 표준화된, 고도로 개선된 수용성 시디움 구아자바 잎 추출물을 제공하여 선행 기술의 결점을 극복한다. 이들 파이토케미컬의 화학적 구조가 도 1a, 1b 및 1c에 각각 제공된다. 추출 공정은 고함량의 파이토케미컬을 가지는 추출물을 유발한다.
퀘세틴은 감귤류에서 발견되는 루틴, 구아자베린과 같은 여러 파이토케미컬의 아글리콘 형태이다. 퀘세틴은 여러 초기 염증 과정의 직접 억제로 인한 상당한 항염증 활성을 나타냈다. 예를 들면, 이는 히스타민 및 다른 알레르기 및 염증 매개체의 생성 및 방출 양자 모두를 억제한다. 더욱이, 이는 강력한 항산화 활성 및 비타민 C-절약 작용을 발휘한다.
도 2는 시디움 구아자바 잎 추출물의 추출 방법을 도해한다. 상기 방법 (200)은 건조 및 세척된 시디움 구아자바 잎을 0.2 mm 메쉬를 이용하여 균일한 크기의 조대 분말로 분쇄하는 단계 (201)로 시작한다. 단계 (202)에서, 70℃를 초과하지 않는 온도에서 세 시간 동안 최하부로부터 최상부로의 추출 용매의 연속 순환으로써 조대 분말을 하이드로 알코올로 추출한다. 사용한 하이드로 알코올은 메탄올(70%) 및 물(30%)의 혼합물이고 추출은 원뿔 형상의 스테인리스 강 추출기에서 수행된다. 단계 (203)에서, 약 100 메쉬 크기의 미세 필터 천을 통하여 액체 추출물을 여과한다. 단계 (204)에서, 용매를 완전히 제거하기 위하여 여과된 투명 추출물을 농축하거나 증발시켜 농축된 추출물을 30%의 총 용해된 고체로 조정한다. 단계 (205)에서, 농축된 필터 추출물은 농축물이 침강하도록 4℃에서 12 내지 18 시간 동안 냉침전(cold precipitation)을 거친다. 단계 (206)에서, 침강된 물질을 분리하기 위하여 하이-플로우 필터층을 이용하는 특수 여과에 의하여 농축물을 여과한다. 단계 (207)에서, 농축된 여과액 추출물은 분무 건조를 거친다. 건조기의 온도가 확인되고 연한 갈색 내지 갈색 분말을 얻는 방식으로 설정된다. 단계 (208)에서, 건조되고 분말화된 추출물을 분쇄하고 체별하여 균일 크기의 자유 유동하는 분말을 획득한다. 단계 (209)에서, 추출물을 폴리페놀, 사포닌 및 구이자바린과 같은 파이토케미컬 함량에 대하여 분석 및 표준화한다.
상기 추출 방법은 높은 효능의 시디움 구아자바 추출물을 야기한다. 이용된 방법은 또한 식품 및 음료 용도에 적합한 우수한 제품 제조를 위한 정교한 방법이다. 상기 방법은 또한 고도로 정제된 추출물을 획득하기 위한 특수한 정제 기술을 포함한다.
도 3은 시디움 구아자바 잎 추출물로부터의 파이토케미컬 단리를 도해한다. 이렇게 획득된 시디움 구아자바 잎 추출물은 파이토케미컬을 단리하기 위하여 사용된다. 시디움 구아자바 잎 추출물로부터의 파이토케미컬 단리 방법 (300)은 단계 (301)에서 표준화 시디움 구아자바 잎 추출물을 탈염수에 첨가하고, 클로로폼을 사용하는 분배 액체에 추가로 첨가하여 클로로폼 가용성 분획 및 수성 추출물을 획득하여 시작된다. 단계 (302)에서, 클로로폼 세척된 수성 추출물을 에틸 아세테이트로써 추가로 분배시켜 에틸 아세테이트 가용성 층 및 수성 추출물 층을 획득한다. 단계 (303)에서, 에틸 아세테이트 층을 회전증발기에서 농축하여 건조되고 분말화된 형태의 에틸 아세테이트 층을 획득한다. 단계 (304)에서, 70-200 마이크론의 입자 크기의 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 분말화 형태를 하위분별(sub-fractionating)한다. 단계 (305)에서, 85:15 비율의 클로로폼 및 메탄올로써 기울기 용리에 의하여 분리된 파이토케미컬을 용리한다.
에틸 아세테이트 층은 각각의 분획에 대하여 100:1 내지 85:15 범위의 상이한 클로로폼 및 메틸 알코올의 비율로써 기울기 용리를 이용하는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 거친다. 실리카겔 컬럼 크로마토그래피는 여섯 가지 분획, 즉 94% 클로로폼 및 6% 메탄올을 이용하여 분리된 PGF-1 (시디움 구아자바 분획-1), 93% 클로로폼 및 7% 메탄올을 이용하여 분리된 PGF-2, 91% 클로로폼 및 9% 메탄올을 이용하여 분리된 PGF-3, 88-82% 클로로폼 및 12-18% 메탄올을 이용하여 분리된 PGF-4, 79-0% 클로로폼 및 21-100% 메탄올을 이용하여 분리된 PGF-5 및 에틸 아세테이트 분배된 층인 PGF-6의 분리를 야기한다.
분리된 분획은 박층 크로마토그래피(TLC) 및 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 이용하여 정성 분석을 거친다. TLC는 정지상으로서 실리카겔 및 이동상으로서 45:45:10의 비율의 톨루엔, 에틸 아세테이트 및 아세트산을 사용하여 수행된다. 분리된 분획은 또한 HPLC를 거친다. 추가로, 파이토케미컬은 분자량의 결정을 위하여 액체 크로마토그래피-전기분무 이온화-질량 분석법에 의한 정량 분석을 거친다. 최종적으로, 파이토케미컬은 핵자기공명(NMR), 자외선(UV) 및 적외선(IR) 분광 분석에 의하여 화학적으로 특징결정된다. 획득된 파이토케미컬의 순도는 99%이다.
파이토케미컬의 화학적 특징결정은 캄페롤-3-O-글리코사이드, 퀘세틴-3-O-a-L-아라비노피라노사이드 (구이자베린)의 존재를 나타낸다.
상기 공정에 의하여 획득된 구이자베린은 생활성에 대하여, 즉 항당뇨 활성(알파-글루코시데이즈 억제, 알파-아밀레이즈 억제 및 리페이즈 억제)에 대하여 선별된다. 전항온처리(pre-incubation) 혼합물은 80mM 포스페이트 버퍼 pH 7.0, 비히클 버퍼, 양성 대조군, 다양한 농도의 테스트 샘플 및 50μl의 알파-글루코시데이즈를 함유했다. 반응 혼합물이 혼합되고 37℃에서 30 분 동안 전항온처리된다. 기질로서 수크로스가 23.125mM의 최종 농도까지 첨가되고 반응 혼합물이 혼합되고 37℃에서 50 분 동안 항온처리된다. 반응이 2 분 동안 비등수조(boiling water bath)에서 유지시킨 다음 실온까지 냉각시켜 억제된다. 250μl의 글루코스 시약이 50μl의 반응 혼합물에 첨가되고 혼합되고 25℃에서 10 분 동안 항온처리된다. 흡광도가 마이크로-플레이트 판독기에서 510 nm에서 측정된다. 대조 반응이 테스트 샘플 없이 수행된다.
추출물은 알파-글루코시데이즈의 용량-의존성 억제를 나타냈고 따라서 추출물의 항당뇨 활성을 지시한다.
시디움 구아자바 잎 추출물은 초콜릿, 캡슐, 및 물 기초의 보충제 음용물 등과 같은 여러 상이한 형태로 식품 및 음료 분야의 주요 산업에서 유용하다. 추출물은 또한 제약, 화장품, 식의약품(neutraceuticals) 등에서 유용하다.
시디움 구아자바 잎 추출물은 상기 발명으로부터 제조된 구아바 추출물을 함유하는 식품 및 음료 제품, 가령 시디움 구아자바 추출물을 함유하는 초코 화합물 및 폴리페놀 및 플라보노이드를 함유하는 다른 약초 추출물의 제조에 유용하다. 초코 화합물은 두통, 동통, 오심, 작열감 감소에 유용하고 또한 간보호 활성을 나타낸다.
시디움 구아자바 잎 추출물은 또한 다른 약초 추출물, 가령 로사 록스부르기 (Rosa roxburgii) [스위트 체스트넛 로즈 (sweet chestnut rose)], 엥겔헤르디티아 치난시스 (Engelherdtia chinansis ) [ 코키 ( Kohki )] 및 네룸베 누시페라(Nelumbe nucifera)와 조합으로 캡슐로서 제조된다. 캡슐은 간보호 활성, 기침 억제 활성 및 항당뇨 활성을 나타낸다.
앞서 언급한 제형 이외에도, 시디움 구아자바 잎 추출물이 또한 천연 차로서 사용된다. 천연 차는 뽕나무 잎 및 카멜리아 시넨시스 (Camellia sinensis ) 잎과 조합으로 구아바 추출물을 함유한다. 시디움 구아자바 차는 당뇨병의 예방을 돕고 또한 당뇨병 환자의 혈당 수준을 감소시키며, 간보호 활성을 나타낸다. 이는 또한 천연 애피타이저(appetizer) 및 리프레셔(refresher) 역할을 한다.
약초 탕제와 같은 시디움 구아자바 잎 추출물의 물 기초의 약초 음용물이 항산화제 및 심장보호제 역할을 한다.
Claims (9)
- 수용성 시디움 구아자바 잎 추출물 제조 방법에 있어서, 다음 단계를 포함하는 방법:
a. 건조 및 세척된 시디움 구아자바 잎을 0.2 mm 메쉬를 이용하여 균일 크기의 조대 분말로 분쇄하는 단계 (201);
b. 70℃를 초과하지 않는 온도에서 3 시간 동안 조대 분말을 하이드로 알코올로 추출하는 단계 (202);
c. 약 100 메쉬 크기의 미세 필터 천을 통하여 액체 추출물을 여과하는 단계 (203);
d. 하이드로 알코올을 완전히 제거하가 위하여 여과된 투명 추출물을 증발시키고 농축된 추출물을 30%의 한 가지 이상의 총 용해된 고체로 조정하는 단계 (204);
e. 농축물이 4℃에서 12 내지 18 시간 동안 냉침전을 거쳐 농축된 필터 추출물이 침강하도록 하는 단계 (205);
f. 침강된 물질을 분리하기 위하여 하이-플로우 필터층을 이용하여 농축물을 여과하는 단계 (206);
g. 여과액 추출물을 분무 건조하여 연한 갈색 내지 갈색 분말을 획득하는 단계 (207);
h. 건조되고 분말화된 추출물을 분쇄하고 체별하여 균일 크기의 자유 유동하는 분말을 획득하는 단계 (208); 및
i. 파이토케미컬의 존재에 대하여 추출물을 분석하는 단계 (209). - 제1항에 있어서, 사용된 하이드로 알코올은 70:30의 비율의 메탄올 및 물의 혼합물인 방법.
- 제1항에 있어서, 파이토케미컬에 대하여 추출물을 분석하는 단계는 폴리페놀, 사포닌 및 구이자바린을 포함하는 방법.
- 제1항에 있어서, 시디움 구아자바 잎 추출물은 초콜릿, 캡슐 및 물 기초의 보충제를 포함하는 하나 이상의 형태로 식품 보충제, 음료 제품, 제약 및 식의약품으로서 유용한 방법.
- 제1항에 있어서, 시디움 구아자바 잎 추출물은 로사 록스부르기 (Rosa roxburgii) [스위트 체스트넛 로즈 (sweet chestnut rose)], 엥겔헤르디티아 치난시스 (Engelherdtia chinansis ) [ 코키 ( Kohki )] 및 네룸베 누시페라(Nelumbe nucifera)를 포함하는 하나 이상의 약초 추출물과 함께 간보호 활성, 기침 억제 활성 및 항당뇨 활성을 나타내는 방법.
- 제1항에 있어서, 시디움 구아자바 잎 추출물은 카멜리아 시넨시스(Camellia sinensis)와 함께 항당뇨 활성을 나타내고 천연 애피타이저(appetizer) 및 리프레셔(refresher) 역할을 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 시디움 구아자바 잎 추출물은 약초 탕제를 포함하는 물 기초의 약초 음용물로서 유용하고 항산화제 및 심장보호제 역할을 하는 방법.
- 시디움 구아자바 잎 추출물로부터의 파이토케미컬 단리 방법에 있어서, 다음 단계를 포함하는 방법:
a. 표준화 잎 추출물을 탈염수 및 클로로폼을 사용하는 분배 액체에 첨가하여 클로로폼 가용성 분획 및 수성 추출물을 획득하는 단계 (301);
b. 클로로폼 세척된 수성 추출물을 에틸 아세테이트로 액체 분배시켜 에틸 아세테이트 가용성 층 및 수성 추출물 층을 획득하는 단계 (302);
c. 에틸 아세테이트 층을 회전증발기에서 증발시켜 건조되고 분말화된 형태의 에틸 아세테이트 층을 획득하는 단계 (303);
d. 70-200 마이크론의 입자 크기의 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 분말화 형태의 에틸 아세테이트 층을 하위분별하는 단계 (304); 및
e. 85:15 비율의 클로로폼 및 메탄올로써 기울기 용리에 의하여 분리된 파이토케미컬을 용리하는 단계 (305). - 제8항에 있어서, 파이토케미컬의 용리는 각각의 분획에 대하여 100:1 내지 85:15 범위의 클로로폼 및 메틸 알코올의 비율로써 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 달성되고 이에 의하여 캄페롤-3-O-글리코사이드 및 구이자베린을 포함하는 하나 이상의 분획이 생성되는 방법.
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